Université Aix-Marseille Faculté des Sciences de Luminy - LGBP

Université Aix-Marseille Faculté des Sciences de Luminy
Thèse
Pour obtenir le grade de
Docteur en Biologie de l’Université d’Aix Marseille
Spécialité Biologie Végétale et Biotechnologies
Présentée par Elodie Lanet
Régulations post-transcriptionnelles de
l’expression des gènes :
Approches mécanistiques et Réponses à
l’environnement
Soutenance publique prévue le 4 Décembre 2008 devant la commission d’examen :
Pr. Roberto Bassi
Dr. Carole Caranta
Dr. Thierry Lagrange
Examinateur
Examinateur
Rapporteur
Pr. Christophe Robaglia
Directeur de Thèse
Dr. Véronique Ziegler-Graff Rapporteur
Laboratoire de Génétique et Biophysique des Plantes
UMR6191 CEA-CNRS-Université Aix-Marseille
Faculté des Sciences de Luminy
13009 Marseille

Je souhaite remercier Christophe pour son accueil au laboratoire, son encadrement, son œil bienveillant sur mon
travail, sur l’aventure de la thèse, en évitant les débordements de side-projects. Merci pour les discussions riches.
Je remercie Patrice pour m’avoir permis d’intégrer le labo et pour m’avoir fait confiance, Etienne pour sa
formation tonique et son soutien.
Je remercie les membres de mon jury d’avoir accepté de juger et de discuter mon travail.
Je remercie les membres de mon comité de thèse qui ont pris le temps de discuter et de nous conseiller.
Je remercie Denis, mon parrain de thèse fraîchement nommé pour ses conseils.
Je remercie Olivier et Peter pour leur aide précieuse.
Je remercie Rainer et Nicolas, pour les conseils d’enseignants avisés et pour les bons moments partagés au TP
photosynthèse.
Merci à Stefano pour les bons conseils et les corrections de photosynthésiste.
Merci à Tomas pour les conseils et encouragements sur le projet luz.
Merci aux collègues de Cadarache pour leur aide aussi bien administrative que pour la mise en œuvre
expérimentale des premiers temps.
Je remercie les membres du LGBP, Myriam, Etienne, Cécile, Muriel, Benoît, Ben, Muriel, Christophe, Rainer,
Alessandro, Delphine, Stefano, Francesca, Fabien, Marie-Hélène, Manon, Hany, Maïna, Marie-Anne, Maryse,
Morgane, Rodnay, Lei, Milena, Marie-Hélène, Patrice, Manuela, Nicolas, Anthony.
Merci à Bruce et Toshi pour l’air frais au labo et le temps passé à corriger mon anglais de française.
Je remercie mes collaborateurs privilégiés, pour leur aide précieuse, Rodnay qui m’a transmis le goût des
polysomes, Alessandro luz and rock’n’roll, Maïna pour son aide précieuse et la dynamique que nous avons
trouvé ensemble pour cette dernière année.
Je remercie les filles, Myriam et Cécile, patientes, oreilles et bras tendus durant ces années ;
Je remercie chaleureusement mes collègues les plus proches pour leur soutien, leurs conseils précieux et pour les
bons moments partagés.
Merci à mes proches pour le soutien, pendant la thèse
et puis le soutien de toujours
AlixAmirAnaïkeAnne
Anne-LiseChristineColetteDamienDenisEléa
EmilieFlorianeHenriJean-Philippe
Jean-PioJérômeJoséLaetitiaLaurenceLisel
MaewennManuelMaríaMarianneMartinMartinePatrice
PaulineRaymondSimonStephanThéoXavier
Merci à Jérôme et à mes parents chéris

Argonauta argo
"Mais oui, mais oui, l'école est finie" Sheila

Organismes
Procaryotes
A. aeolicus Aquifex aeolicus
E. coli Escherichia coli
P. syringae Pseudomonas syringae
Eucaryotes
A. thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis
C. elegans Caenorhabditis elegans Nématode
C. reinhardtii Chlamydomonas reinhardtii Chlamydomonas
D. melanogaster Drosophila melanogaster Drosophile
G. intestinalis Giardia intestinalis
H. sapiens Homo sapiens Homme
L. esculentum Lycopersicon esculentum Tomate
M. metraloas Miastor metraloas
O. cuniculus Oryctolagus cuniculus Lapin
P. furiosus Pyrococcus furiosus
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Levure
S. pombe Shizosaccharomyces pombe Levure
T. brucei Trypanosoma brucei
T. thermophyla Tetrahymena thermophila
X. laevis Xenopus laevis
Virus
BWYV Beet western yellows virus Luteovirus
CaMV Cauliflower Mosaic Virus Caulimovirus
CMV Cucumber Mosaic Virus Cucumovirus
PRSV Papaya ring spot virus Potyvirus
PVX Potato virus X Potexvirus
PVY Potato virus Y Potyvirus
TBSV Tomato bushy stunt virus Tombusvirus
TEV Tobacco etch virus Potyvirus
TRV Tobacco rattle virus Tobravirus

Abréviations
ADN Acide DésoxyriboNucléique
ADN-T ADN de transfert d’Agrobacterium tumefaciens
AGO Argonaute
APS Ammonium persulfate
ARN Acide RiboNucléique
ARNdb ARN double brin
ARNm ARN messager
ARNpol ARN polymerase
ARNr ARN ribosomal
ARNt ARN de transfert
ATP Adenosine Tri Phosphate
b-HLH basic helix loop helix
CBC cap binding complex
cDNA complementary DNA
CDS coding sequence
Chl chlorophylle
CHS chalcone synthase
CITE cap independent translation element
CL control light
CR centre réactionnel
Cyt cytochrome
DCL Dicer-like
DCMU 3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea
DO densité optique
DRB dsRNA binding protein
EBG early biosynthetic gene
eIF eukaryotic Initiation Factor
ELIP early light induced protein
Fed ferredoxine
GCG germ cell granules
GCN general control nonderepressible
GEF Guanosine Exchange Factor
GFP Green Fluorescent Protein
GTP Guanosine Tri Phosphate
GUS β-glucuronidase
HL high light
Hsp heat shock protein
IRES Internal Ribosome Entry Site
ITAF IRES trans activation factor
kb kilobase
kDa kiloDalton
LBG late biosynthetic gene
Lhc light harvesting complex
LL low light
MBW complexe MYB/b-HLH/WD40
Mg-Proto magnesium protoporphyrine IX
miARN (ou miR) micro ARN
miRNP miRNA ribonucleoproteic complex
MRE miRNA Recognition Element
NADP nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
nat-siARN natural antisens siARN
NG neuronal granules
NPQ non photochemical quenching
nt nucléotide
ORF Open Reading Frame
PABP Poly-A Binding Protein
PAMP pathogen associated molecular pattern

PAP production of anthocyanin pigment
PB processing bodies
PBS phosphate buffer saline
PCV Packed cell volume
PGE plastid gene expression
PQ plastoquinone
PS photosystème
PTGS Post Transcriptional Gene Silencing
RDR RNA dependent RNA Polymerase
RISC RNA Induced Silencing Complex
RNAi RNA-mediated interference
ROS reactive oxygen species
RT Reverse Transcription
S Svedberg
sARN small ARN
SDS sodium dodecyl sulfate
SG Stress Granules
siARN (ou siR) small interfering ARN
siRNP siRNA ribonucleoproteic complex
sRNP sRNA ribonucleoproteic complex
stARN small temporal ARN
SUC sucrose symporter promoter
TAS précurseur des ta-siARNs
ta-siARN trans acting siARN
TAV transactivator viroplasmin
TBE Tris borate EDTA
Temed NNNN’tetramethyl ethylene diamine
TTG transparent testa glabra
UTR UnTranslated Region
UV ultraviolet
VIGS Virus Induced Gene Silencing
VSR viral suppressor of RNA silencing
wt wild type

SOMMAIRE
INTRODUCTION
I1_REGULATIONS POST­TRANSCRIPTIONNELLES DE L’EXPRESSION DES GENES ..... 4
I. POURQUOI DES REGULATIONS POST­TRANSCRIPTIONNELLES ? ....................... ... 4
II. REGULATIONS TRADUCTIONELLES .................................................................... . ... 5
1. LA TRADUCTION CHEZ LES EUCARYOTES ............................................................................. ..... 6
a. INITIATION DE LA TRADUCTION
b. ELONGATION
c. TERMINAISON
d. POLYSOMES
2. REGULATIONS DE LA TRADUCTION ....................................................................................... ..... 8
a. REGULATIONS GLOBALES
b. REGULATIONS SPECIFIQUES OU L’IMPORTANCE DES SEQUENCES 5’­UTR ET 3’­UTR
III. RNA SILENCING POST­TRANSCRIPTIONNEL ...................................................... ... 14
1. L’IDEE DU RNA SILENCING .................................................................................................... ..... 15
a. UN ARN PEUT SUPPRIMER UN AUTRE ARN
b. LA CO­SUPPRESSION OU POURQUOI LA SUREXPRESSION ÇA NE MARCHE PAS A TOUS LES COUPS
c. PREMIER MICROARN CHEZ C. ELEGANS
d. ARN DOUBLE BRIN ET PETITS ARNS ANTISENS
2. LES GRANDES FAMILLES D’ACTEURS DU RNA SILENCING ....................................................... 16
a. LES RNASES III DICER
b. LES RDR
c. LES PROTEINES ARGONAUTE
3. LA PRODUCTION DES PETITS ARN ....................................................................................... ..... 20
a. MIARNS
b. SIARNS
c. PROPAGATION ET AMPLIFICATION DU RNA SILENCING
d. SPECIFICITE ET REDONDANCE DES PROTEINES DCL CHEZ ARABIDOPSIS
4. LES MODES D’ACTION DES PETITS ARNS .................................................................................. 26
a. RISC, COMPLEXE RIBONUCLEOPROTEIQUE EFFECTEUR DU RNA SILENCING
b. INHIBITION POST­TRANSCRIPTIONNELLE
c. REGULATION DE L’ACTIVITE DES PETITS ARNS
5. LES ROLES DU RNA SILENCING POST‐TRANSCRIPTIONNEL CHEZ LES PLANTES .................. 29
a. DEFENSE CONTRE LES ACIDES NUCLEIQUES INVASIFS
b. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES ENDOGENES
c. REPONSES AUX STRESS BIOTIQUES ET ABIOTIQUES
6. EVOLUTION DU RNA SILENCING ............................................................................................. 34
IV. REGULATIONS POST­TRANSCRIPTIONNELLES DANS L’ESPACE ........................... 35
1. GRANULES A ARN ..................................................................................................................... 36
a. GRANULES A ARN PRESENTES DANS LES CELLULES ANIMALES GERMINALES (GCG)
b. LES GRANULES DE STRESS (SG)
c. LES PROCESSING BODIES (PB)
d. LES GRANULES NEURONAUX (NG)
e. RELATIONS ENTRE LES DIFFERENTES PARTICULES A ARN
2. GRANULES A ARN ET RNA SILENCING ................................................................................... 38
I2_REPONSES A LA LUMIERE 40
I. PHOTOSYNTHESE OXYGENIQUE ............................................................................. 40
1. PHOTOSYNTHESE OXYGENIQUE ............................................................................................... 40
2. LA PHASE CLAIRE DE LA PHOTOSYNTHESE ............................................................................. 41
a. ABSORPTION DE LA LUMIERE ET UTILISATION DE L’ENERGIE LUMINEUSE
b. LES COMPLEXES ANTENNAIRES LHC
3. ORGANISATION SPATIALE DE LA PHASE CLAIRE DANS LE CHLOROPLASTE ......................... 42

II. FORTE LUMIERE = STRESS LUMINEUX .................................................................. 43
1. POURQUOI TROP DE LUMIERE TUE LA PLANTE ...................................................................... 43
2. LE ROLE PROTECTEUR DES CAROTENOÏDES ........................................................................... 43
3. EVOLUTION DE LA SUPERFAMILLE DES LHC ET PHOTOPROTECTION .................................. 44
III. ACCLIMATATION AUX DIFFERENTES CONDITIONS DE LUMIERE .......................... 44
1. REMODELAGE DE L’APPAREIL PHOTOSYNTHETIQUE EN REPONSE A LA LUMIERE ............. 45
a. ACCLIMATATION A LA FORTE LUMIERE
b. ACCLIMATATION A LA FAIBLE LUMIERE
2. ANTHOCYANES ET FORTE LUMIERE ......................................................................................... 47
a. ROLES DES ANTHOCYANES DANS LES TISSUS PHOTOSYNTHETIQUES
b. BIOSYNTHESE DES ANTHOCYANES ET REGULATIONS TRANSCRIPTIONNELLES
3. REGULATIONS POST‐TRANSCRIPTIONNELLES ET ACCLIMATATION A LA LUMIERE ........... 49
IV. ENDOSYMBIOSE ET NECESSITE DE LA SIGNALISATION RETROGRADE ................. 50
I3_MECANISMES DE LA REGULATION TRADUCTIONNELLE GUIDEE PAR LES MIARNS,
PROJET DE REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................... 52
1. INTRODUCTION .......................................................................................................................... 52
2. DISCOVERY OF MIR‐GUIDED TRANSLATIONAL REPRESSION AND THE PHYSICAL ASSOCIATION
OF RNA SILENCING MACHINERY AND TRANSLATIONAL MACHINERY ................................. 52
3. TRANSLATION REGULATION DEPEND ON MRE….NOT TOTALLY RIGHT ............................ 53
4. HOW MIRNAS REPRESS TRANSLATION? ................................................................................ 54
a. INITIATION?
b. ELONGATION
c. IMPORTANCE OF THE PROMOTER
5. ACTIVATION ALSO ...................................................................................................................... 56
6. WHO ARE THE PROTAGONISTS OF MIRNA‐INDUCED TRANSLATIONAL REGULATION? ... 57
a. AGO AND GW182
b. MOV10/ARMITAGE AND RCK/P54
c. EIF6
d. FXR1 AND TRANSLATIONAL INITIATION
e. KATANIN AND THE CYTOSKELETON
7. REVERSIBLE SILENCING IS BETTER .......................................................................................... 58
8. CONCLUSION ............................................................................................................................... 59
RESULTATS
R1_RNA SILENCING ET REGULATIONS TRADUCTIONNELLES, APPROCHE
MECANISTIQUE
I. EVIDENCES BIOCHIMIQUES DE LA REGULATION TRADUCTIONNELLE GUIDEE PAR
LES MIARNS CHEZ ARABIDOPSIS, ARTICLE .......................................................... 62
1. INTRODUCTION .......................................................................................................................... 62
2. RESULTS ...................................................................................................................................... 64
a. FUNCTIONAL AGO1­MIRNPS ARE ASSOCIATED WITH ACTIVE POLYSOMES IN ARABIDOPSIS THALIANA
b. MIRNPS INTERACTIONS WITH POLYSOMES DEPENDS ON RNA
c. MIRNAS ASSOCIATION WITH POLYSOMES IS ASSOCIATED WITH TRANSLATIONAL REPRESSION
3. DISCUSSION ................................................................................................................................ 66
II. DONNEES COMPLEMENTAIRES .............................................................................. 68
1. PHÉNOTYPE ET GENOTYPE D’AGO1­4 ....................................................................................... 68
2. EFFET DE LA MUTATION AGO1‐4 SUR L’ACCUMULATION
DES ARNM CIBLES DES MIARNS .............................................................................................
...................................................................................................................................................... 68
3. CORRELATION ENTRE BLOCAGE DE LA TRADUCTION ET ASSOCIATION DES MIARNS AUX
POLYSOMES ? .............................................................................................................................. 69

III. CONCLUSION ET DISCUSSION ................................................................................. 70
R2._REGULATIONS POST­TRANSCRIPTIONNELLES DE L’EXPRESSION DES GENES ET
REPONSE A LA LUMIERE
I. REGULATIONS TRADUCTIONNELLES DE L’EXPRESSION DES GENES LHC EN REPONSE
A LA LUMIERE ......................................................................................................... 73
1. LA QUANTITE DE LUMIERE MODIFIE FORTEMENT
LE NIVEAU GLOBAL DE TRADUCTION ....................................................................................... 73
2. L’ASSOCIATION DES ARNM LHC AUX POLYSOMES
EST MODULEE PAR L’INTENSITE LUMINEUSE ......................................................................... 74
3. MISE EN EVIDENCE DE REGULATIONS TRADUCTIONNELLES DE L’EXPRESSION DE CERTAINES
LHC............................................................................................................................................... 75
4. LA TRADUCTION CYTOPLASMIQUE COMME CIBLE PRECOCE DE LA SIGNALISATION
RETROGRADE .............................................................................................................................. 76
5. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ............................................................................................. 77
II. UNE NOUVELLE VOIE TAS IMPLIQUEE DANS LA BIOSYNTHESE D’ANTHOCYANES EN
REPONSE A LA FORTE LUMIERE ............................................................................. 80
1. LES MUTANTS AGO1 N’ACCUMULENT PAS D’ANTHOCYANE
EN REPONSE A LA FORTE LUMIERE .......................................................................................... 80
2. PREDICTION DU LOCUS TAS4 ET VOIE DE BIOSYNTHESE DES ANTHOCYANES .................. 80
3. LA VOIE TAS4 EST REGULEE PAR LA FORTE LUMIERE ......................................................... 81
a. DETECTION DU SIR81 PAR NORTHERN BLOT
b. EXPRESSION DES TRANSCRITS NON CODANTS IMPLIQUES DANS LA VOIE DE PRODUCTION DU SIR81
4. RECHERCHE DE CIBLES POTENTIELLES DU SIR81 ................................................................ 83
a. PAP1
b. PAP2
c. MYB113
5. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ............................................................................................. 84
DISCUSSION GENERALE ....................................................................................... 86
MATERIEL ET METHODES .................................................................................. 92
BIBLIOGRAPHIE .................................................................................................... 99
ANNEXES
ANNEXE 1_ IDENTIFICATION D’UN NOUVEAU FACTEUR DE TRANSCRIPTION IMPLIQUE DANS LA
VOIE DE BIOSYNTHESE DES ANTHOCYANES : MYBL2 ............................................................... 110
ANNEXE 2_ CARACTERISATION D’ATGCN2, UNE KINASE D’EIF2 ............................................ 125

L’ensemble des données de la post-génomique a révélé les limites de notre compréhension de
l’expression des gènes. Bien qu’ayant servi un grand nombre de projets, les données de
transcriptome se révèlent insuffisantes. En effet, un grand nombre de régulations posttranscriptionnelles
jouent un rôle important qui demeure assez peu connu.
Au cours de mon travail de thèse, réalisé au Laboratoire de Génétique et Biophysique des
Plantes, je me suis intéressée aux rôles des régulations post-transcriptionnelles de l’expression
des gènes chez Arabidopsis thaliana. Dans une première partie du travail, nous avons mis en
évidence, pour la première fois chez les plantes, l’association des complexes effecteurs du
RNA silencing à la machinerie traductionnelle. Nous avons ensuite caractérisé cette
interaction et le mécanisme de la régulation traductionnelle. En parallèle, dans une seconde
partie du travail, j’ai souhaité mettre en évidence le rôle des régulations posttranscriptionnelles
dans la réponse à l’environnement. Je me suis intéressée à la lumière dont
l’utilisation représente un enjeu majeur chez les organismes photosynthétiques. La lumière en
excès représente un danger mortel pour les plantes qui doivent composer entre la collecte de
la lumière nécessaire à la photosynthèse et la photoprotection. Les régulations posttranscriptionnelles
représentent un avantage certain pour la mise en place de réponses rapides
en cas de variations des conditions environnementales.
Je présenterai une introduction en trois parties : tout d’abord les données bibliographiques
concernant les régulations post-transcriptionnelles, dont une large part sera consacrée à la
description du RNA silencing post-transcriptionnel. Dans une seconde partie seront présentées
les caractéristiques et les enjeux de la réponse à la lumière chez les plantes. Enfin, dans une
troisième partie sera présenté un projet de revue bibliographique concernant les travaux
récents qui visent à caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation
traductionnelle guidée par les miARN chez les animaux et les plantes.
1

INTRODUCTION
I1_Régulations post‐transcriptionnelles
Le dogme de la biologie moléculaire (Figure I1-1) a été établi par Francis H. C. Crick en
1958. «Once information has passed into protein, it cannot get out again… . Information here
means the precise determination of sequence, either on bases in nucleic acid or of amino
acids residues in the protein.”
La molécule d’ADN constitue la source de l’information génétique. Au sein d’une cellule
eucaryote, l’énorme molécule d’ADN est compartimentée dans le noyau. Au cours de la
division cellulaire, elle peut être copiée par réplication afin que l’information génétique soit
transmise à la cellule fille (Figure I1-1). L’information contenue dans la molécule d’ADN est
inscrite en langage acides désoxyribonucléiques. Afin d’être utilisée, cette information est lue
par morceau. Les unités de lecture sur l’ADN sont nommées des gènes. Chaque gène peut être
converti en acide ribonucléiques sous la forme d’un ARN : c’est la transcription. On connaît
trois catégories d’ARN : les ARN messagers (ARNm) qui portent l’information génétique qui
sera convertie en protéines, et deux groupes d’ARN non codants structuraux: les ARN
ribosomaux (ARNr) et les ARN de transfert (ARNt). Les ARN messagers sont exportés du
noyau vers le cytoplasme où le produit final de l’expression des gènes, les protéines, est
synthétisé. En effet, à la sortie du noyau, l’information contenue dans la séquence de l’ARNm
est une nouvelle fois convertie du langage acide ribonucléique en langage acides aminés pour
produire des protéines, c’est la traduction. Les protéines coordonnent l’ensemble des réactions
cellulaires et orchestrent leur propre expression. Les protéines jouent un rôle actif via leur
propriétés enzymatiques mais elles possèdent également des fonctions structurales : elles sont
les protagonistes de la vie cellulaire.
Pour tous les organismes, il y a un temps et un lieu précis pour l’expression de chaque gène en
protéine. Si tous les gènes étaient exprimés en même temps, les cellules seraient des masses
informes de protéines. A l’échelle de l’organisme, les produits de l’expression des gènes
doivent être présents dans certains types cellulaires, à un stade spécifique du développement,
en réponse à différents stimuli environnementaux. Au niveau cellulaire, les gènes doivent être
exprimés au moment approprié du cycle cellulaire en réponse à des conditions variables, par
exemple en réponse à des dommages de l’ADN ou à des carences nutritives.
Les premiers mécanismes de régulation génétique ont été découverts grâce a l’utilisation de
deux systèmes modèles tous deux mis au point à l’Institut Pasteur. Le premier est l’étude de
2

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
l’utilisation du lactose comme source de carbone chez E. coli par Jacques Monod; le second
est le phénomène de lysogénie induite par le bactériophage découvert par André Lwoff, Elie
Wollman et François Jacob. L’étude de la régulation de l’expression des gènes s’est très
largement développée grâce aux biotechnologies et à la possibilité d’exprimer des fragments
d’ADN dans des cellules ou des tissus. Chez les plantes, les premières expériences de
transgénèse ont été effectuées à partir de tissus indifférenciés. A partir de ces cals, des plantes
transgéniques entières sont régénérées sous l’effet d’un cocktail de phytohormones. Grâce à
ces systèmes, de nombreuses études ont montré qu’un gène peut être introduit dans le génome
d’une plante et y être exprimé. Ce système a également permis de mettre à jour l’existence
d’une grande diversité de mécanismes de régulation de l’expression des gènes.
Au niveau moléculaire, la régulation de l’expression des gènes opère a différents niveaux : au
niveau de la transcription, mais aussi après la transcription (Figure I1-2). Au cours des
dernières décennies, l’analyse des régulations transcriptionnelles a été largement accélérée par
l’avènement de systèmes à grande échelle qui permettent d’analyser l’expression de plusieurs
milliers de gènes à la fois. Cependant, on sait aujourd’hui que le transcriptome ne donne accès
qu’à un sous-ensemble des régulations auxquelles l’expression des gènes est soumise. En
effet, une large partie des régulations opère après la transcription au niveau de l’ARN
messager.
3

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
I1_REGULATIONS POST­TRANSCRIPTIONNELLES DE
L’EXPRESSION DES GENES
Les régulations post-transcriptionnelles peuvent opérer au cours de nombreuses étapes telles
que la maturation des ARNm (coiffage, épissage et polyadénylation), le transport
nucléoplasmique, l’efficacité de traduction, la stabilité du transcrit, les modifications posttraductionnelles
ou encore le turn-over des protéines (Figure I1-2).
Malgré leur rôle majeur dans l’expression des gènes, les régulations post-transcriptionnelles
ont été beaucoup moins étudiées que les régulations transcriptionnelles. Cependant, la
découverte du mécanisme de RNA silencing a permis de souligner l’ampleur des régulations
post-transcriptionnelles pour l’expression d’un grand nombre de gènes nucléaires. Les
régulations post-transcriptionnelles sont également très répandues pour la régulation de
l’expression des génomes chloroplastique et mitochondrial. En particulier, l’editing est un
mécanisme courant pour réguler l’expression des ARNm organellaires.
Seront ici détaillées dans une première partie les données concernant les mécanismes de
régulation de la traduction, en focalisant sur les exemples connus chez les plantes. Dans une
seconde partie, sera largement exposé le cas du RNA silencing. Enfin, dans une troisième
partie, seront abordées les données récentes concernant la régulation post-transcriptionnelle
dans l’espace cytoplasmique.
I. POURQUOI DES REGULATIONS POST‐TRANSCRIPTIONNELLES ?
En condition normale, la régulation traductionnelle ne semble pas présenter un grand intérêt
par rapport à la régulation transcriptionnelle. En effet, en terme énergétique, il semble
préférable pour la cellule de ne pas transcrire un gène si elle n’a pas besoin de la protéine
correspondante.
Cependant la régulation post-transcriptionnelle présente l’énorme avantage de pouvoir
rapidement produire une protéine ou, inversement, interrompre sa production. Chez la levure,
on estime que la durée totale nécessaire à l’expression d’un gène, par exemple un gène codant
une protéine ribosomale, est de cent minutes (Warner, 1999). En réponse à un changement
brutal de l’environnement, la cellule peut avoir un besoin rapide de protéines et le fait de
4

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
disposer d’ARNm transcrits prêts à être traduits permet de répondre rapidement au besoin,
sans attendre que la transcription soit activée dans le noyau. Inversement, si la cellule doit
interrompre la production d’une protéine, il est important que cette interruption opère le plus
rapidement possible dans le but de ne pas gaspiller d’énergie. En effet, la traduction et la
fabrication de ribosomes représentent la plus grande dépense énergétique de la cellule
(Warner, 1999). 50% de l’activité de l’ARN polymérase II et 90% de l’activité d’épissage
sont dédiées à la production de protéines ribosomales. Le ratio ARN/ADN peut atteindre
50 :1 dont 80% d’ARNr, 15% d’ARNt et 5% ARNm. Les ribosomes de levure contiennent
5469nts d’ARNr ; on estime que chaque cellule contient environ 200000 ribosomes (Warner,
1999). En réponse à la plupart des stress, le niveau global de traduction est inhibé, permettant
ainsi d’économiser de l’énergie (Lopez-Maury et al., 2008). Cependant la traduction de
certains ARNm est spécifiquement induite afin de favoriser la réponse au stress.
La régulation traductionnelle présente également l’avantage d’être réversible. En effet, on sait
aujourd’hui qu’une dimension spatiale de la régulation post-transcriptionnelle permet de
remobiliser certains ARNm après avoir inhibé momentanément leur traduction en les isolant
physiquement de la machinerie traductionnelle (chapitre I1_IV).
II. REGULATIONS TRADUCTIONNELLES
Le niveau de synthèse protéique dans le cytoplasme est très variable. La traduction est régulée
en réponse à de nombreuses variations physiologiques et environnementales. De nombreux
stress tels que l’hypoxie, la chaleur, ou encore l’infection virale modifient drastiquement la
synthèse protéique. On estime qu’en réponse à un stress, chez des cellules de mammifères, la
traduction de 25% des ARNm est inhibée tandis que la traduction de 25% d’autres ARNm est
induite (Kawai et al., 2004). Cette forte régulation traductionnelle permet de reconfigurer
rapidement le paysage protéique pour répondre aux stress environnementaux. La traduction
est également très régulée au cours du développement. Les mécanismes qui permettent de
réguler finement la traduction en réponse à ces nombreuses variables sont divers et encore peu
connus.
5

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
1. LA TRADUCTION CHEZ LES EUCARYOTES
La traduction est l’étape finale de l’expression des gènes : elle ‘traduit’ l’information
génétique du langage acides nucléiques des ARNm, en langage acides aminés, qui est celui
des protéines. Après la traduction, des modifications post-traductionnelles apportées aux
produits protéiques peuvent encore moduler les fonctions des protéines et ainsi modifier
l’expression des gènes. Les ribosomes sont les acteurs de la traduction. Ces complexes
ribonucleoprotéiques (protéines + ARNr) lient dans le même temps l’ARNm et un ARNt. On
distingue trois étapes qui constituent la traduction : l’initiation, l’élongation et la terminaison.
a. INITIATION DE LA TRADUCTION
La séquence d’événements qui conduit a l’assemblage d’un premier ribosome sur le codon
start constitue l’étape d’initiation de la traduction. On connaît un ensemble de facteurs
d’initiation de la traduction (eIFs). La première étape de l’initiation consiste en la
reconnaissance de la coiffe 5’-methyl-guanosine de l’ARNm par la protéine eIF4E. En plus de
son rôle dans l’initiation de la traduction, la coiffe joue un rôle dans la stabilisation des
ARNm chez les animaux et chez les végétaux. La présence de la coiffe augmente la demi-vie
de l’ARNm. eIF4G reconnaît eIF4E et la protéine PABP, ce qui conduit à la circularisation de
l’ARNm. Les facteurs eIF4A, une hélicase à ARN, et eIF4B, un activateur d’eIF4A, résolvent
les structures secondaires présentent au niveau de la région 5’non traduite de l’ARNm (5’-
UTR pour UnTRanslated). En présence du complexe ternaire (TC) :[eIF2-GTP-ARNtMet], la
petite sous-unité du ribosome 40S lie l’ARNm au voisinage de la coiffe (Figure I1-3)
(Browning, 1996). Le complexe 43S ainsi formé scanne la séquence de l’ARNm de 5’ vers 3’
jusqu'à la rencontre du codon start AUG (sAUG). La grande sous-unité du ribosome 60S est
alors recrutée, eIF2-GDP et les autres facteurs d’initiation sont relargués et ainsi s’achève
l’étape d’initiation de la traduction.
b. ELONGATION
L’ARNt reconnaît des mots de trois acides nucléiques (codons) et les associe a un acide aminé
correspondant. La petite sous-unité du ribosome lie l’ARNt chargé d’un acide aminé et la
grande sous-unité lie les acides aminés entre eux par liaison peptidique au fur et à mesure
qu’il avance sur l’ARNm. Le ribosome avance par translocation d’un codon au suivant. Le
facteur d’élongation eEF1, en hydrolysant le GTP, facilite la translocation du ribosome. Le
facteur eEF1 est recyclé grâce à la GEF (Guanine Exchange Factor) eEF1B.
6

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
c. TERMINAISON
La synthèse protéique s’achève lorsque le ribosome atteint un codon stop (UAA, UAG ou
UGA). Des facteurs de relargage lient le ribosome et induisent une série d’événements qui
conduit à la terminaison de la synthèse protéique. L’ARNt et le ribosome se détachent de
l’ARNm et seront recyclés pour être réutilisés lors d’un nouveau cycle de traduction.
d. POLYSOMES
Au cours de la traduction, les ribosomes se déplacent vers l’extrémité 3’ du messager,
permettant ainsi à d’autres ribosomes d’initier la traduction à leur tour en se liant à l’extrémité
5’. Plusieurs ribosomes peuvent donc traduire simultanément un même ARNm et synthétiser,
de manière décalée dans le temps, la même protéine. L’ARNm en cours de traduction associé
à plusieurs ribosomes est nommé polysome. Les polysomes eucaryotes ressemblent à des
structures ordonnées, telles que des perles (ribosomes) attachées à un fil (ARNm). Des
observations en microscopie électronique à transmission de préparations de Tetrahymena
permettent de distinguer des polysomes de différentes formes : polysomes en cercles,
polysomes en en huit, polysomes linéaires, polysomes en chenilles (Figure I1-4A, B, C)
(Yoshida et al., 1997; Yazaki et al., 2000). La signification biologique de ces différentes
structure n’est pas connue.
On peut purifier les polysomes par ultracentrifugation sur un gradient de saccharose. La
lecture de la densité optique (DO) de l’extrait cytoplasmique fractionné permet d’obtenir un
spectre représentatif de la distribution des complexes ribosomaux dans le gradient en fonction
de leur poids moléculaire (Figure I1-4D). Le pic majoritaire correspond aux monosomes,
c’est-à-dire à l’ensemble des ARNm associés à un ribosome. Les pics suivants, dans les
fractions lourdes du gradient, correspondent aux polysomes.
Le nombre de ribosomes sur un ARNm est variable en fonction des niveaux d’initiation,
d’élongation et de terminaison. Les combinaisons entre les régulations appliquées à chaque
étape de la traduction déterminent la taille des polysomes (Figure I1-5). Plus l’initiation est
rapide et l’élongation lente, plus le polysome est lourd (plus il y a de ribosomes associés à un
ARNm). L’arrêt de la synthèse protéique et le ralentissement de l’élongation peuvent
également conduire dans certains cas à l’accumulation de polysomes (Figure I1-5). Pour cette
raison, la quantification des polysomes ne donne pas directement une mesure du niveau de
traduction, et donc de la quantité de protéine produite.
7

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
Grâce à l’analyse du profil de polysomes et du contenu en ARN de chacune des fractions du
gradient, on peut évaluer le rythme de chacune des étapes de la traduction et mettre en
évidence des régulations traductionnelles.
2. REGULATION DE LA TRADUCTION
Dans le cas de l’expression de nombreux gènes, on observe un découplage entre niveau de
transcription et accumulation des ARNm ou entre niveau d’ARNm et le niveau de protéine.
Ces observations suggèrent que l’expression de ces gènes est régulée posttranscriptionnellement.
Les mécanismes de régulation de la traduction peuvent être classés en deux groupes : les
mécanismes de régulation globale, qui régulent la traduction de l’ensemble des ARNm, et les
mécanismes de régulation spécifiques à un ARNm ou à un sous-ensemble d’ARNm. Les
mécanismes de régulation globale opèrent principalement via des modifications des facteurs
de traduction, tandis que les mécanismes de régulation spécifiques sont le plus souvent guidés
par des structures particulières de l’ARNm, dans ses régions UTR, qui peuvent être reconnues
par des complexes protéiques. Il a récemment été montré que la traduction des ARNm est
largement régulée par RNA silencing, ce mécanisme sera décrit à part, dans le chapitre
suivant.
a. REGULATIONS GLOBALES
i. Régulation de l’initiation
• Les protéines 4E­BP chez les animaux
Chez les animaux la protéine 4E-BP (eIF4E-Binding Protein) séquestre eIF-4E et inhibe ainsi
l’initiation de la traduction. La disponibilité et l’activité de la protéine 4E-BP est utilisée pour
réguler le niveau global de traduction. Les protéines 4E-BP hypo-phosphorylées lient eIF-4E
et empêchent la formation du complexe eIF-4F. Des signaux extracellulaires tels que
l’insuline induisent la phosphorylation de 4E-BP et le relargage d’eIF4E (Gebauer and
Hentze, 2004). On ne connaît pas de protéine 4E-BP chez les végétaux.
• Le complexe iso4F, une particularité des plantes
On connaît deux isoformes du complexe de liaison de la coiffe chez les plantes : eIF4F
(eIF4E+eIF4G), et eIF(iso)4E (eIF(iso)4E+eIF(iso)4G). eIF4F comprend une petite sous-unité
de liaison de la coiffe de 24kDa (eIF4E) et une grande sous-unité de 220kDa (eIF4G). Le
ratio eIF4E/eIF4G est de 4 :1 dans le complexe. Le complexe eIF(iso)4F comprend une petite
sous-unité de liaison de la coiffe de 28kDa (eIF(iso)4E) et une grande sous-unité de 80kDa
8

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
(eIF(iso)4G). Le ratio eIF(iso)4E/eIF(iso)4G est de 1 :1 dans le complexe. Bien que l’affinité
de liaison des deux complexes, eIF4F et eIF(iso)4F, à un oligonucleotide soit augmentée de
vingt fois en présence d’une coiffe en 5’, eIF4F présente une affinité plus grande pour les
coiffes mono-méthylées tandis que iso4F est plus affin pour les coiffes di-méthylées. La
fixation des complexes augmente avec la taille de l’oligonucleotide et la présence de
structures secondaires stabilise le complexe eIF4F tandis qu’elle déstabilise eIF(iso)4F
(Gallie, 1993). Enfin, il semble que le complexe eIF(iso)4F soit capable d’interagir avec le
cytosquelette (Bokros et al., 1995). Ainsi il pourrait favoriser localement la traduction de
certains ARNm dans certaines régions de la cellule.
Le fait que les deux isoformes du complexe eIF4F existent et qu’ils aient des propriétés
différentes suggère qu’ils ont des fonctions différentes in vivo, même si elles restent peu
connues. On sait que les protéines eIF4E et eIF(iso)4E jouent des rôles distincts dans la
résistance à de nombreux virus de plantes (Robaglia and Caranta, 2006).
• Le cas du facteur eIF2
L’étape finale de l’initiation consiste au recrutement de la sous-unité 60S et à la dissociation
du complexe d’initiation après hydrolyse du complexe eIF2-GTP en eIF2-GDP. Pour
régénérer eIF2 avant un nouveau cycle d’initiation, le GDP est remplacé par un GTP grâce à
la GEF eIF2B. Un moyen pour la cellule d’inhiber l’initiation de la traduction est d’empêcher
le recyclage d’eIF2-GDP. La phosphorylation d’eIF2 inhibe la dissociation du complexe
[eIF2-GDP :eIF2B] et limite ainsi l’initiation de la traduction. Chez les métazoaires on
connaît cinq kinases d’eIF2 qui régulent la traduction en fonction des stress
environnementaux (Anderson and Kedersha, 2008) : (i) PKR (protein kinase R) est une kinase
qui répond à l’ARN double brin produit en cas d’infection virale, de chaleur ou de radiations
UV ; (ii) PERK (PKR-like endoplasmic reticulum kinase) est une kinase localisée dans le
reticulum endoplasmique qui est activée en cas d’accumulation de protéines non repliées ; (iii)
HRI (heme-regulated initiation factor 2α kinase), une protéine qui perçoit le stress oxydant ;
(iv) Z-DNA kinase, une enzyme impliquée dans la réponse antivirale ; et (v) GCN2 (general
control nonderepressible), une protéine dont l’activité est sensible à la carence en acides
aminés (Annexe 2).
ii. Elongation et usage des codons
Bien que l’élongation ne soit pas considérée comme une étape limitante de la traduction, les
ribosomes peuvent parfois s’arrêter et s’accumuler au milieu de l’ARNm. Chez les plantes,
9

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
comme chez les autres espèces, il existe un biais dans l’utilisation des acides aminés pour la
synthèse protéique. Certains acides aminés sont plus utilisés que d’autres. L’utilisation de
codons dits rares peut ralentir voire stopper les ribosomes en cours d’élongation. A terme,
l’accumulation de ribosomes à l’arrêt sur l’ARNm peut également conduire à un
ralentissement de l’initiation.
In vitro, la translocation des ribosomes en cours d’élongation est sensible au pH chez des
extraits de pointes racinaires (Gallie, 1993). Ceci a des conséquences importantes sur la
régulation de la traduction en conditions d’hypoxie où le pH cytoplasmique s’acidifie.
Comme dans le cas du couple eIF2-GDP/eIF2B, la régulation du recyclage du GDP dans le
complexe eEF1-GDP par la GEF eEF2B peut moduler la vitesse de l’élongation.
b. REGULATIONS SPECIFIQUES OU L’IMPORTANCE DES SEQUENCES 5’­UTR ET 3’­UTR
La taille des séquences 5’-UTR est très variable, allant de quelques nucléotides à plusieurs
centaines. La taille moyenne des régions 5’-UTR est comprise entre quarante et quatre-vingt
bases et ces régions sont souvent riches en bases AU. De nombreux exemples montrent que la
taille des régions 5’-UTR influence l’efficacité de la traduction, en particulier dans le cas de
génomes viraux. Les régions 3’UTR possèdent des éléments qui permettent la
polyadenylation (chez la plupart des eucaryotes le motif AAUAAA). La présence de la queue
polyA en 3’ de l’ARNm mature, comme la coiffe en 5’, représente un élément essentiel à
l’initiation mais aussi important pour la stabilité de l’ARNm.
i. IRES
Certains ARNm peuvent initier leur traduction de manière indépendante de la coiffe grâce à la
présence de structures particulières dans leur région 5’UTR nommées IRES (Internal
Ribosome Entry Site) qui recrutent directement les ribosomes (Figure I1-6A). Ces éléments,
initialement décrits chez les picornavirus, sont fréquents chez les ARN viraux mais se
retrouvent également chez certains ARNm eucaryotes (3 à 5% des ARNm chez les vertébrés)
(Johannes et al., 1999). La présence d’IRES est défavorable à la traduction dépendante de la
coiffe dans des conditions normales de croissance. Cependant, en réponse à un stress ou dans
des conditions particulières, ces structures permettent à certains ARNm d’échapper à une
inhibition globale de la traduction. La plupart de ces transcrits possédant des IRES codent des
protéines impliquées dans la croissance, la différenciation mais aussi la réponse au stress. Par
exemple, chez le maïs, il a été montré que la traduction du gène ADH1, codant une alcool
10

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
deshydrogenase, est induite en conditions de stress grâce à la présence d’une IRES en 5’-UTR
de l’ARNm (Mardanova et al., 2008a; Mardanova et al., 2008b).
L’activité des IRES dépend de la présence de structures secondaires et tertiaires (pseudoknot),
d’éléments en trans (IRES trans-acting factors ou ITAF), et de la complémentarité de
séquence avec l’ARNr 18S. Les protéines ITAF, le plus souvent des chaperonnes à ARN, sont
exprimées spécifiquement dans certains types cellulaires et pourraient être responsables de
l’expression localisée de certains IRES (Holcik and Sonenberg, 2005).
Chez les virus de plantes, des éléments de séquence en 3’UTR permettent l’initiation de la
traduction des ARN viraux non coiffés en 5’. Ces éléments forment des structures secondaires
complexes qui ont été nommés 3’-CITE (cap-independent translation element) (Miller et al.,
2007).
ii. MICRO­ORF, leaky scanning et reinitiation
La grande majorité des ARNm eucaryotes sont monocistroniques, c’est-à-dire qu’ils ne
codent que pour une seule protéine. Cependant, certains ARNm contiennent plusieurs petites
ORF en amont de leur ORF principale. Certaines particularités de l’ARNm, telles que le
contexte nucléotidique autour du codon d’initiation, les structures secondaires en 5’UTR, ou
encore la taille de l’UTR, peuvent modifier l’efficacité de l’initiation au niveau de l’ORF
principale.
• Contexte de l’AUG
La séquence environnant l’AUG peut modifier l’efficacité de l’initiation de la traduction.
L’analyse de Marilyn Kozak a permis d’établir une séquence consensus du contexte idéal
chez les mammifères : CCRCCAUGG (Kozak, 2002). Chez les plantes le consensus est le
suivant : AACAAUGGC (Futterer and Hohn, 1996). Dans les deux cas, les nucléotides les
plus conservés sont le R-3 (A ou G) et le G+4. Les codons AUG en amont des ORF majeures
(sAUG) se trouvent dans un contexte favorable a l’initiation dans plus de 95% des cas. Ce
pourcentage diminue dans le cas des AUG en amont des micro-ORF (µAUG) qui ne se
trouvent dans un contexte favorable a l’initiation que dans 40 à 60% des cas (Meijer and
Thomas, 2002). La reconnaissance de l’AUG ne dépend pas seulement de la séquence
environnante, les structures secondaires peuvent également modifier l’efficacité de
l’initiation. Il a été montré que la présence d’une structure secondaire 14 nt en aval de l’AUG
favorise l’initiation car la sous-unité ribosomale ralentit et sa probabilité d’interaction avec la
région contenant l’AUG augmente (Kozak, 1990).
11

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
La présence de µORF dans un contexte favorable en 5’ de l’ORF principale suggère que les
ribosomes possèdent des moyens d’outrepasser le bon contexte de la µAUG dans certains cas
afin de traduire l’ORF principale à partir du sAUG. Deux modèles peuvent expliquer que des
ORF puissent être traduites en aval d’un ou plusieurs µORF : leaky scanning, re-initiation, et
saut de ribosomes.
• Leaky scanning
Bien qu’un µAUG puisse être reconnu par l’ensemble des sous-unités ribosomales 40S, une
partie des ribosomes peut le dépasser et continuer a scanner l’ARNm jusqu'à la rencontre d’un
second AUG (Figure I1-6B). Ce mécanisme, nommé leaky scanning, est très répandu pour
l’expression des ARN viraux polycistroniques (Ryabova et al., 2006). Si les deux AUG
conduisent à différentes phases de lecture, les deux protéines produites auront des séquences
différentes et probablement des fonctions différentes dans la cellule. Cette stratégie est
largement utilisée par certains virus et leur permet de minimiser la taille de leur génome tout
en maximisant leur capacité de coder pour plusieurs protéines. Par exemple l’ARNm 35S du
CaMV est responsable de l’expression des six petites ORF en 5’ de l’ORF principale du
génome viral. Ces gènes sont très rapprochés dans le génome, séparés par une ou deux bases
les uns des autres, voire chevauchants.
• Re­initiation
Dans le second cas, a priori plus rare, la sous-unité 40S reste liée à la µAUG, traduit la µORF,
et termine son élongation en se dissociant de l’ARNm. Le complexe d’initiation se reforme
afin de s’associer de nouveau à l’ARNm (Figure I1-6C). La ré-initiation est favorisée par la
petite taille de la µORF, à l’exception du cas du génome viral du CaMV. Afin de pouvoir se
lier au sAUG rapidement, la sous-unité 40S doit lier un nouveau complexe eIF2-GTP-
ARNtMet. Pour cette raison la re-initiation est favorisée par une plus grande distance entre la
µORF et l’ORF principale.
Exemple d’un gène cellulaire contenant des µORF : GCN4
L’exemple le plus étudié de contrôle traductionnel par re-initiation est probablement celui de
l’ARNm GCN4 de levure S. cerevisiae (Hinnebusch, 2005). GCN4 est un facteur de
transcription qui active la transcription de gènes codants pour des enzymes de la voie de
biosynthèse des acides aminés ainsi que d’autres gènes impliqués dans des mécanismes de
réponse au stress. La région 5’UTR de l’ARNm GCN4 contient 590 nt et quatre µORF. La
µORF1 réduit de deux fois l’efficacité de traduction de GCN4 tandis que la µORF4 a un effet
beaucoup plus fort et abolit la quasi-totalité de la traduction de GCN4. Les µORF1 et 4
12

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
suffisent à réguler l’expression de GCN4 de manière identique au contexte sauvage. L’effet
des µORF 2 et 3 est considéré comme négligeable.
En réponse à une carence en acides amines, en glucose, ou à la suite d’un stress, les levures
diminuent leur niveau global de traduction via la phosphorylation d’eIF2 par la kinase GCN2.
Comme décrit dans le paragraphe précédent consacré à eIF2, la phosphorylation de la sousunité
α empêche l’échange du GDP en GTP et de ce fait limite l’initiation de la traduction de
la plupart des ARNm. Cependant, grâce à un mécanisme de re-initiation, la traduction de
GCN4 est possible tandis que la majorité de la synthèse protéique est inhibée.
La plupart des ribosomes s’associent au niveau du µAUG1 et initient la traduction. Bien que
le mécanisme de re-initiation soit très peu efficace, les séquences autour du codon terminateur
de la µORF1 sont favorables et la moitié des ribosomes qui terminent la traduction de la
µORF1 peuvent continuent a scanner l’ARNm et ré-initier à condition d’avoir lier un eiF2-
GTP-ARNtMet. En conditions normales, la plupart des sous-unités 40S sont capables de réinitier
jusqu’au µAUG4. Après la traduction de la µORF4, les ribosomes se dissocient de
l’ARNm sans avoir traduit l’ORF principale codant pour GCN4 (Figure I1-7). La dissociation
des ribosomes est due d’une part à la présence d’un codon Proline rare à la fin de la µORF4,
mais aussi aux 10nt qui suivent le codon stop de la µORF4 avant le sAUG. En réponse à un
stress, la synthèse protéique est inhibée et seule la moitié des sous unités 40S peuvent réinitier
rapidement après la terminaison de la µORF1 pour traduire la µORF4. Ces sous-unités
sont donc disponibles pour initier 150 nt en aval la traduction de l’ORF GCN4 et ainsi activer
les voies de réponse au stress (Figure I1-7).
Régulation en trans de la réinitiation, exemple du TAV du CaMV
L’ORF VI du génome du CaMV code pour un facteur activateur en trans nommé TAV
(transactivator viroplasmin). Le facteur TAV induit la ré-initiation de la traduction de l’ARN
polycistronique entre l’ORFI et l’ORFV (Ryabova et al., 2006). Contrairement à la réinitiation
au niveau de la séquence leader de GCN4, la ré-initiation induite par TAV n’est pas
favorisée par une grande distance entre les ORF. Le TAV est capable d’interagir avec des
protéines de la machinerie traductionnelle de l’hôte telles que la sous-unité 60S ou le facteur
eIF3. Il semble que la protéine eIF4B entre en compétition avec TAV pour la liaison d’eIF3
(Ryabova et al., 2006).
13

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
• Structures secondaires et « saut » de ribosome
Le ribosomal shunt permet aux ribosomes d’éviter une région contenant des éléments
inhibiteurs du scanning tels que des µORFs ou des structures secondaires. Les ribosomes
« sautent » cette portion du leader et reprennent le scanning en aval de l’épingle à cheveux
(Figure I1-6D). Ce mécanisme a été décrit pour l’expression du génome du CaMV, dans le
cas de la séquence leader de l’ORF VII mais il existe également chez certains ARN cellulaires
(Ryabova et al., 2006). Le ribosomal shunt permet de préserver l’accessibilité de certaines
régions régulatrices en évitant qu’elles soient scannées par les ribosomes.
Parmi les régulations post-transcriptionnelles, la découverte du RNA silencing a largement
contribué à la compréhension des mécanismes fins qui gouvernent l’expression des gènes.
L’énorme impact de ce mécanisme sur l’expression des gènes a renouvelé l’étendue des
connaissances sur les régulations post-transcriptionnelles.
III. RNA SILENCING POST‐TRANSCRIPTIONNEL
Le RNA silencing consiste en l’inactivation séquence spécifique de l’expression des gènes au
niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel. Dans les deux cas, cette inactivation est
guidée par de petites molécules d’ARN d’environ 21nt. Le dogme de la biologie moléculaire
suppose que les ARN ont un rôle structural (ARNr, ARNt) ou de porteur d’information
(ARNm) (Figure I1-1). Jacob et Monod avaient prédit dès 1961 l’existence d’une quatrième
espèce d’ARN aux fonctions régulatrices. Ils proposèrent que ces ARN régulateurs se lient
par complémentarité de séquence à un site « opérateur » et qu’ils réguleraient ainsi
l’expression des gènes structuraux au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel (Eddy,
2001). C’est avec la découverte des ribozymes, les ARN aux fonction catalytiques, que le
dogme a été repensé pour la première fois. Avec la découverte du RNA silencing, on entrevoit
désormais un rôle essentiel des ARN comme régulateurs de l’expression des gènes. Depuis
une vingtaine d’années, le RNA silencing est un domaine de recherche très actif dans lequel
les connaissances ne cessent de croître. Bien que nous ayons une idée de plus en plus précise
des mécanismes et des rôles du RNA silencing, il semble évident que nos connaissances sont
encore loin d’être complètes. En particulier, très peu de données sont disponibles concernant
les liens existants entre le RNA silencing et les autres processus cellulaires impliquant l’ARN
tels que la traduction, la dégradation et le stockage des ARNm, ou encore le mouvement intra
et intercellulaire.
14

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
Le RNA silencing régule l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel mais aussi au
niveau transcriptionnel, via la méthylation de l’ADN et le remodelage de la chromatine. Dans
cette partie ne seront décrits que les mécanismes post-transcriptionnels auxquels je me suis
particulièrement intéressée.
1. L’IDEE DU RNA SILENCING
a. UN ARN PEUT SUPPRIMER UN AUTRE ARN
Dès 1985, une équipe allemande a mis en évidence qu’on pouvait éteindre sélectivement
l’expression du gène Krüppel de Drosophile en injectant des ARN antisens complémentaires à
Kr dans les embryons (Rosenberg et al., 1985). Les mécanismes moléculaires, permettant
d’expliquer cette étonnante technique pour produire des mutants sans mutation, sont restés
mystérieux durant de nombreuses années.
b. LA CO­SUPPRESSION OU POURQUOI LA SUREXPRESSION ÇA NE MARCHE PAS A TOUS LES
COUPS
L’extinction post-transcriptionnelle de l’expression de certains gènes a d’abord été mise en
évidence chez les végétaux lors d’expériences de transgénèse. Dans les années 1990, deux
équipes souhaitent obtenir des fleurs plus colorées en surexprimant un gène endogène par des
expériences de transgénèse chez le pétunia (Napoli et al., 1990; van der Krol et al., 1990). Ils
introduisent la séquence codante du gène de la chalcone synthase (CHSA) sous le contrôle
d’un promoteur fort et quasi constitutif 35S. La chalcone synthase est impliquée dans la
production des pigments de type flavonoïdes, responsables de la coloration de la fleur. Les
deux équipes ont simultanément rapporté que chez certains transformants 35S ::CHSA, on
observe un arrêt de la production des flavonoïdes et la dépigmentation totale des fleurs
(Figure I1-8A). La dépigmentation de ces fleurs est due à la perte de l’expression du gène
endogène CHSA et du transgène 35S-CHSA sans changement de leurs taux de transcription.
Cela correspond à la co-suppression qui est une dégradation séquence spécifique des ARNm
produits par le gène endogène et par le transgène. Ce mécanisme a d’abord été nommé Post
Transcriptional Gene Silencing (PTGS).
c. PREMIER MICROARN CHEZ C. ELEGANS
En 1993, le locus non codant lin-4 a été identifié comme étant responsable de la régulation
post-transcriptionnelle de l’expression de LIN-14, un gène impliqué dans le développement
des larves de C.elegans (Lee et al., 1993). Deux petits transcrits non codant lin-4, de 22nt et
61nt, sont complémentaires d’éléments présents en 3’-UTR de l’ARNm LIN-14. Ces petits
15

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
ARNs non codants ont d’abord été nommé stARN (small temporal ARN). En 1999, Olsen et
Ambros montrent que lin-4 régule l’expression de LIN-14 en inhibant la traduction de
l’ARNm (Figure I1-8B). De plus ils montrent que lin-4 et LIN-14 sont associés aux
polysomes (Olsen and Ambros, 1999). Lin-4 est renommé microARN.
d. DOUBLE BRIN ET PETIT ARN ANTISENS
En 1998, la molécule d’ARN double brin a été identifiée, chez les animaux et chez les
végétaux, comme étant a l’origine du RNA silencing. En effet, l’injection d’ARN double brin
exogène suffit a induire le RNA silencing chez C. elegans (Fire et al., 1998) (Figure I1-8C).
Ce premier pas vers la compréhension du mécanisme de RNA silencing permettra à Fire et
Mello de se voir attribuer le prix Nobel de Médecine en 2007. Chez les plantes, différents
stimuli tels que la co-expression d’un transgène sens et d’un transgène antisens, une
construction en orientation inversée répétée ou directement le bombardement de molécules
d’ARN double brin, induisent l’extinction du gène endogène homologue au transgène
(Waterhouse et al., 1998; Klahre et al., 2002). C’est en 1999 que la mise en évidence de
l’accumulation d’ARN antisens de petite taille (20-25nts), chez des plantes transgéniques
ainsi que chez des plantes infectées par un virus à ARN, a permis de comprendre une partie
des mécanismes moléculaires du PTGS (Hamilton and Baulcombe, 1999) (Figure I1-8D).
Presque vingt ans après la découverte des sARNs, les connaissances sur leurs caractéristiques
et leurs rôles ne cessent d’évoluer. Le RNA silencing a captivé le monde scientifique en
amenant de nouveau outils génétiques pour les organismes modèles, en améliorant la
compréhension des mécanismes de régulation de l’expression des gènes, et par l’ouverture de
toutes nouvelles perspectives pour la pharmacologie et les biotechnologies.
2. LES GRANDES FAMILLES D’ACTEURS DU RNA SILENCING
Le schéma général du mécanisme de RNA silencing est très conservé entre les organismes
même s’il existe de nombreuses catégories de sARNs (Figure I1-9). On suppose une origine
ancienne au RNA silencing car des orthologues des acteurs du mécanisme sont présents chez
la plupart des eucaryotes. Le RNA silencing serait donc apparu initialement chez des
eucaryotes unicellulaires qui ont précédé l’acquisition de la multicellularité (Tableau I1-1). La
protéine effectrice du RNA silencing, ARGONAUTE, est même conservée chez les
archaebactéries bien que ce mécanisme de régulation n’ait pas été décrit chez les procaryotes.
Cependant, on connaît quelques exemples de mécanismes de régulation posttranscriptionnelle
de l’expression des gènes guidés par des ARN chez les procaryotes
16

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
(Gottesman, 2005; Duhring et al., 2006; Sorek et al., 2008). Dans cette partie seront
présentées par famille les principales protéines actrices du RNA silencing, des protéines
impliquées dans la biogenèse des sARN, jusqu’aux protéines effectrices du mécanisme
d’inactivation.
a. LES RNASES III DICER
A partir d’un ARN double brin, les protéines Dicer, RNAses III de classe III, produisent par
clivage des duplex de 21nt à 24nt chez les plantes (Figure I1-9). Chacun des deux brins du
duplex est phosphorylé à son extrémité 5’ et portent une extrémité 3’-OH sortante de 2nt.
Les protéines Dicer contiennent un domaine ARN hélicase, un domaine de liaison à l’ARN
double brin et deux domaines RNAse III (Figure I1-10A). De plus, comme les protéines de la
famille Argonaute (voir plus loin), elles contiennent un domaine PAZ de liaison à l’ARN
double brin (MacRae and Doudna, 2007)(Figure I1-10A). La cristallisation de la protéine Dicer
du protozoaire Giardia intestinalis a révélé qu’elle est capable de générer des duplex d’ARN
de taille fixe grâce à une structure qui lui permet de calibrer les ARN. En effet, le domaine
PAZ lie l’ARN double brin à son extrémité et c’est la distance entre le domaine PAZ et les
domaines RNAse qui détermine la taille de l’ARN produit par Dicer (Macrae et al., 2006)
(Figure I1-10A). On connaît quatre protéines Dicer chez Arabidopsis nommées DCL1 à 4
(Dicer-Like) qui produisent chacune des duplex de sARNs de taille déterminée (Tableau I1-1)
(Deleris et al., 2006; Fusaro et al., 2006).
Chez les animaux, les duplex de sARNs sont produits par l’action de deux types de RNAse
III : Drosha et Dicer. Chez les plantes, on ne connaît pas de protéines Drosha et ce sont les
protéines Dicer-like (DCL) seules qui produisent les duplex de sARNs.
i. Les protéines associées à Dicer
Chez les plantes comme chez les animaux, les protéines Dicer s’associent en complexe avec
d’autres protéines capables de lier l’ARN double brin (DRB pour double strand RNA bonding
protein) (Tableau I1-1). Il est également probable que les protéines DRB jouent un rôle dans
l’interaction entre Dicer et les protéines ARGONAUTE. Chez Arabidopsis, la protéine DCL1
est associée à la DRB HYL1 (HYPONASTIC LEAVES 1) ainsi qu’à la protéine SE
(SERRATE) (Han et al., 2004; Dong et al., 2008).
b. LES RDR
L’activité de polymérase à ARN dépendante de l’ARN (RDR) a été découverte chez les
plantes infectées par un virus. Après l’infection, l’activité RDR est élevée du fait de la
17

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
réplication virale qui nécessite une RDR codée par le virus (Ahlquist, 2002). Plus tard, il a été
mis en évidence que, chez certains organismes, il existe également une activité RDR
cellulaire, codée par le noyau, qui permet d’induire le RNA silencing (Wassenegger and
Krczal, 2006). L’activité RDR a d’abord été caractérisée sur des extraits de chou chinois
(Astier-Manifacier and Cornuet, 1971), puis chez la tomate où le gène correspondant à cette
activité (LeRDR1) a pu être cloné (Schiebel et al., 1998). Des cribles génétiques, visant à
identifier des individus ayant perdu la capacité à induire le RNA silencing en réponse a un
transgène sens, ont permis d’isoler des mutants affectés dans l’activité RDR cellulaire chez
Arabidopsis qui ont été nommé sgs2 (suppressor of gene silencing) (Dalmay et al., 2000;
Mourrain et al., 2000). L’activité RDR est présente chez d’autres organismes que les plantes :
chez S. pombe, C. elegans, N. crassa (Tableau I1-1). Chez Arabidopsis, six gènes codant des
RDR ont été identifiés et nommés RDR1 à 6.
i. Reconnaissance des ARNs “aberrants” par les RDR.
Les RDR ont la capacité de produire de l’ARN double brin et donc d’induire le RNA silencing
à partir d’ARN simple brin. De nombreuses études visent a identifier les caractéristiques de
ces ARN, dits aberrants, qui sont reconnus par les RDR. Inversement, on cherche également à
comprendre ce qui protège l’ensemble des ARN cellulaires du RNA silencing. Il a été montré
que la reconnaissance correcte des ARNm par les complexes de maturation et 3’ et par la
machinerie d’épissage sont cruciaux pour la prévention du RNA silencing (Herr et al., 2006).
De plus, la présence de la protéine ABH1 au niveau de la coiffe en 5’ des ARNm pourrait les
protéger du RNA silencing. En absence de coiffe, le complexe EIN5/XRN4 dégrade les
ARNm qui pourraient alors servir de matrice aux RDR cellulaires. Chez le mutant abh1, les
extrémités 5’ des ARNm ne sont plus protégées et de nombreux ARNm sont la cible du RNA
silencing (Gregory et al., 2008). Enfin, les exonucléases XRN2, XRN3 et XRN4 ont été
identifiées comme étant des suppresseurs endogènes du RNA silencing (Gy et al., 2007). Ces
données suggèrent que les RDR disposent de moyens pour différencier les ARN aberrants des
ARNm intacts. Or il a été montré qu’in vitro, une AtRDR6 purifiée n’est pas capable de
différencier un ARN maturé d’un ARN non maturé (Curaba and Chen, 2008). Très
probablement les RDR utilisent des propriétés de leurs partenaires protéiques pour reconnaître
les ARN à répliquer.
ii. Les protéines associées aux RDR
Le plus souvent les RDR sont associées à une ARN hélicase. Chez Arabidopsis, la protéine
RDR6 agirait au niveau d’un complexe contenant SDE3 (silencing defective 3) une ARN
18

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
hélicase, et SGS3 (suppressor of gene silencing 3) dont la fonction reste à élucider (Dalmay et
al., 2001). Les protéines RDR6, SGS3 et SDE3 sont indispensables aux voies de PTGS
initiées par un transgène sens et par des virus à ADN. Par contre, elles ne sont pas
indispensables aux voies du PTGS initiées par des transgènes produisant un ARN antisens,
des transgènes portant une séquence en répétition inversée ou par des virus à ARN, qui codent
leur propre RDR.
c. LES PROTEINES ARGONAUTE, ELEMENTS LES PLUS CONSERVES DU RNA SILENCING
Les protéines de la famille Argonaute (AGO) sont les effecteurs du RNA silencing et elles
sont conservées des bactéries procaryotes (Aquifex Aeolicus) à l’homme. Chez les plantes, la
protéine AGO1 a été mise en évidence suite à l’identification de mutants au fort phénotype
développemental (aspect de céphalopode chez les allèles les plus forts) (Bohmert et al., 1998).
Le nombre de protéines de la famille Argonaute est très variable en fonction des espèces, une
protéine chez S. pombe, jusqu’à plusieurs dizaines chez C. elegans (Tableau I1-1). On
distingue trois groupes de protéines Argonautes (Hutvagner and Simard, 2008):
‐ Les protéines du groupe I liant les miARN et les siARN ; protéines AGO « vraies ».
‐ Les protéines du groupe II liant les piARN ; protéines PIWI.
‐ Les protéines du groupe III, spécialisées dans la liaison des siARNs secondaires qui
n’ont été décrites que chez C. elegans ; protéines SAGO ou WAGO (Yigit et al.,
2006).
Seront décrites dans ce paragraphe les protéines appartenant au premier groupe.
i. Structure des protéines AGO
La famille AGO a été définie sur la base des caractéristiques structurales de trois de ses
membres : la protéine P-Element-induced wimpy testis (PIWI) de Drosophile et les protéines
Argonaute1(AGO1) et Zwille (ZLL) d’Arabidopsis. Les protéines de la famille Argonaute
sont caractérisées par deux domaines protéiques PAZ et PIWI, séparés par un domaine
médian nommé MID (Hutvagner and Simard, 2008). Elles sont aussi nommées protéines PPD
(PAZ PIWI domains) (Figure I1-10B). Le domaine PAZ est un domaine de liaison de l’ARN
double brin (Song et al., 2003). La structure de la protéine AGO de Pyrococcus furiosus, a
révélé que le domaine PIWI porterait, dans certains cas, une activité enzymatique de type
RNAse H qui permet de cliver l’ARNm cible du petit ARN lié à AGO (Song et al., 2004).On
nomme cette acticité enzymatique slicer (Liu et al., 2004) (Figure I1-10B). L’activité slicer
19

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
est corrélée avec la présence d’une triade catalytique DDH dans le domaine PIWI. Mais cette
corrélation n’est pas stricte car l’absence de DDH ne signifie pas toujours l’absence d’activité
slicer et inversement.
ii. Les protéines associées à AGO portent des motifs GW
On commence seulement a comprendre le rôle des protéines riches en motifs GW (répétitions
glycine tryptophane) dans le RNA silencing. La première protéine caractérisée est la GW182
de mammifère qui est strictement localisée au niveau de granules cytoplasmiques (I1_IV). Il a
par la suite été montré qu’elle co-localise avec les partenaires du RNA silencing. On pense
aujourd’hui que le motif GW correspond a un motif de liaison aux protéines de la famille
AGO via le domaine PIWI (El-Shami et al., 2007). Par exemple la protéine AGO1 de S.
pombe interagit avec la protéine Tas3, chez les mammifères les protéines AGO1 et AGO2
interagissent avec GW182, et la protéine AGO4 d’Arabidopsis interagit avec la sous-unité
NRPD1b de l’ARN polymérase IV (Vaucheret, 2008).
3. LA PRODUCTION DES PETITS ARNS
On connaît trois classes de sRNAs chez les eucaryotes. Les différences majeures entre sARNs
se situent au niveau de leur mode de production. Dans cette partie seront détaillés les
mécanismes permettant de produire des duplex de sARNs endogènes à partir des loci d’ADN.
Ne seront pas décrits ici les mécanismes induits par l’introduction de transgène ou par
l’infection virale.
Chez Arabidopsis les voies de RNA silencing sont très diversifiées bien que le schéma global
du mécanisme soit conservé (Figure I1-9). Il semble que la multiplication des acteurs du RNA
silencing ait conduit à la spécialisation de chacun d’eux dans une ou l’autre des voies du RNA
silencing.
a. MIRNAS
Les microARNs (miARNs) sont des ARNs non codants endogènes d’une taille d’environ
21nt. Les précurseurs de miARNs sont codés par des régions intergéniques. Chez
Arabidopsis, ces loci sont notées AtMIR et produisent un seul miARN, tandis que chez les
animaux, les loci MIR contiennent plusieurs miRNAs. L’expression des loci AtMIR est
restreinte a certains types cellulaires (Parizotto et al., 2004; Valoczi et al., 2006). Les loci sont
transcrits par l’ARN polymérase II puis coiffés en 5’ et polyadenylés en 3’(Xie et al., 2005b).
Ces transcrits non codants forment une structure ARN double brin par repliement
intramoléculaire en épingle a cheveux : les pri-miR (Figure I1-11A).
20

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
Chez les animaux, La structure double brin pri-miARN est reconnue par une RNAse Drosha,
associée à Pasha, qui va produire un pre-miARN. Ce dernier est exporté dans le cytoplasme,
via l’exportine 5, où il sera clivé par Dicer pour produire le duplex miRNA/miRNA* de 20 à
24 nt. Le miR* est produit a partir du brin opposé au miR dans la structure tige/boucle. Dans
certain cas, chez la Drosophile, l’action de Drosha est remplacée par un mécanisme de type
épissage (excision d’introns) (Okamura et al., 2007; Ruby et al., 2007). Cependant, même
dans le cas des « miRtrons », la biogenèse des miARNs chez les animaux reste un processus
en deux temps dans deux compartiments cellulaires (noyau et cytoplasme).
Chez les végétaux, c’est DCL1 qui est responsable des deux étapes de clivage du double brin
dans le noyau. La protéine DCL1 forme un complexe actif in vitro avec la DRB HYL1 et la
protéine a doigt de zinc SE (Figure I1-11A) (Dong et al., 2008). La protéine SE ainsi que le
complexe de liaison de la coiffe des ARNm CBC (Cap Binding Complex), composé de
ABH1/CBP80 et CBP20, sont impliqués dans la biogénèse des miARN mais aussi dans le
métabolisme de l’ensemble des ARNm (Gregory et al., 2008; Laubinger et al., 2008). La
protéine SE pourrait être un pont protéique entre le CBC et le spliceosome dans le cas des
ARNm, mais également entre CBC et HYL1/DCL1 dans le cas des pri-miARN. De plus, la
protéine DAWDLE (DLL), qui interagit avec DCL1, serait impliquée dans la production des
miARN (Yu et al., 2008). Les duplex de miARNs sont méthylés par HEN1 (HUA
ENHANCER1) afin qu’il soient protégés contre la polyuridylation et la dégradation (Yu et al.,
2005). Il a récemment été montré qu’une famille d’exoribonucléases est impliquée dans la
dégradation des miARNs matures chez Arabidopsis. Cette famille de protéines a été nommée
Small RNA Degrading Nuclease SDN (Ramachandran and Chen, 2008b). Le transporteur
orthologue de l’Exportine5 a été nommé HASTY (HST) chez Arabidopsis (Park et al., 2005).
Cependant, il semble qu’HST ne soit pas seule responsable de l’export des miARN.
Le rôle essentiel des miRNAs dans le développement des eucaryotes a été largement décrit
(paragraphe suivant). Chez Arabidopsis, les miARNs sont groupés en familles dont les
membres différent d’une ou deux bases dans leur séquence nucléotidique. Les membres de la
famille sont codés par des loci différents mais régulent a priori les mêmes ARNm cibles
(Tableau I1-2).
b. SIARNS
Les small interfering RNAs (siRNAs) sont issus de longs ARN double brin de type
intermoléculaire qui peuvent être produits au cours du cycle de réplication des virus a ARN,
21

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
par des loci endogènes ou par des transposons, le plus souvent grâce a l’action d’une RDR.
Les siARNs peuvent également être produits à partir de structures intramoléculaires formées
par certains ARN viraux (Molnar et al., 2005). Seuls les siARNs impliqués dans les
régulations post-transcriptionnelles seront décrits dans cette partie. Cependant il existe une
grande famille de cis-siARNs ou siARNs chromatiniens, responsables de l’inhibition
transcriptionnelle de certains loci.
i. Trans­siARNs
Les trans-siARNs (ta-siARNs) sont une classe de siRNAs qui a été mise en évidence chez les
plantes suite à l’identification de transcrits non codants dont les produits de clivage
s’accumulent chez le mutant rdr6 (Peragine et al., 2004; Vazquez et al., 2004). Les loci TAS
sont transcrits par une ARN polymérase II. Une région du transcrit TAS est reconnue par un
complexe AGO/miARN qui conduit au clivage du TAS (Figure I1-11B). Chez Arabidopsis,
six loci TAS ont été identifiés ou prédits : TAS1a, 1b, 1c, TAS2, TAS3 et TAS4 (Allen et al.,
2005; Rajagopalan et al., 2006) (Tableau I1-3). Les transcrits TAS1/2 sont reconnus et clivés
par un complexe miR173/AGO1 au niveau de leur extrémité 5’. Dans le cas du TAS3, le
transcrit est reconnu par un complexe miR390/AGO7 au niveau de deux sites en 5’ et en 3’.
Le complexe miR390/AGO7 clive le TAS3 en 3’ mais pas en 5’(Montgomery et al., 2008)
(Figure I1-12). La région clivée est reconnue par l’ARN polymérase RDR6 qui, probablement
associée à SDE3 et SGS3, synthétise le brin ARN complémentaire de l’ARN TAS (Figure I1-
11B). Le double brin ainsi formé est reconnu par DCL4 qui produit séquentiellement des tasiRNAs
de 21 nt. DRB4 et SDE5 interagissent avec DCL4 et jouent un rôle important dans les
voies TAS1/2 et TAS3 (Ramachandran and Chen, 2008a). Le complexe miR390/AGO7
stabilisé en 5’ de l’ARN TAS3 pourrait favoriser la reconnaissance par le complexe RDR6
(Montgomery et al., 2008; Voinnet, 2008). Comme dans le cas des miARNs et des cissiARN,
les duplex de ta-siARNs sont méthylés en 3’ par HEN1 afin d’être stabilisés (Yu et
al., 2005).
ii. Nat­siRNAs
Les nat-siARNs (natural antisens siARN) ont été identifies chez des plantes ayant subi un
stress salin (Borsani et al., 2005). Ils sont produits à partir de transcrits codants partiellement
complémentaires. Les travaux de l’équipe de JK Zhu (Borsani et al., 2005) ont montré qu’en
condition normale, le gène P5CDH est constitutivement transcrit et exprimé. En condition de
stress salin, le gène SRO5 est transcrit sur l’autre brin d’ADN du même locus, pour donner
lieu à un ARN partiellement complémentaire à P5CDH. L’hybridation des deux transcrits
22

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
codants forme un ARN double brin de 760nt qui est clivé par DCL2 pour produire un duplex
de nat-siARN d’une taille de 24nt (Figure I1-11C). Les protéines RDR6, polIVa (ARN
polymérase IV), SGS3 et DCL1 seraient à l’origine de nat-siARNs secondaires d’une taille de
21nt suivant un mécanisme qui n’est pas connu. Cette régulation permet d’éteindre
l’expression de P5CDH, qui code une enzyme du catabolisme de la Proline, afin de mieux
répondre au stress salin.
Un autre nat-siARN de 24nt a été décrit comme étant impliqué dans la réponse aux
pathogènes (Katiyar-Agarwal et al., 2006). L’infection par Pseudomonas syringae induit la
production de nat-siARNs de manière dépendante des protéines polIVa, SGS3 et RDR6.
Cependant la protéine DCL2 ne semble pas être impliquée. Cette voie permet de produire des
nat-siARNs de 22nt qui inhibent l’expression de PPRL, un inhibiteur de la résistance aux
pathogènes. Plus récemment, la même équipe a montré que l’infection par P. syringae induit
la production de longs siARNs de 39 à 41nt (l-siARNs). Ces l-siARNs correspondent à une
région de complémentarité entre deux transcrits et conduisent à l’inhibition de l’expression d’
un autre régulateur négatif de la réponse aux pathogènes. Dans ce contexte, il n’est pas
étonnant que les pathogènes introduisent dans les cellules végétales des inhibiteurs du RNA
silencing afin d’empêcher l’inhibition de ces régulateurs négatifs (Diaz-Pendon and Ding,
2008; Navarro et al., 2008).
Dans le seul cas de nat-siARN décrit jusqu'à présent, les deux transcrits complémentaires sont
codés au niveau du même locus d’ADN (cis-nat-siARNs). On pourrait imaginer que les natsiARN
puissent également être produits a partir de transcrits complémentaires codés au
niveau de deux loci d’ADN ou que des nat-siARNs ne ciblent pas l’inhibition du locus a partir
duquel ils ont été produits (trans-nat-siARN) (Figure I1-11C). Des travaux bio-informatiques
ont permis de prédire des cis-nat-siARN et trans-nat-siARN (Wang et al., 2005; Wang et al.,
2006). Le génome d’Arabidopsis contiendrait plus de 2000 paires de transcrits naturels
antisens.
iii. Endo­siARNs chez les animaux
Des travaux récents ont permis de mettre en évidence l’existence de siARNs endogènes chez
les mouches et les mammifères (Czech et al., 2008; Ghildiyal et al., 2008; Kawamura et al.,
2008; Okamura et al., 2008; Tam et al., 2008; Watanabe et al., 2008). Ces sARNs, nommés
endo-siARNs, sont homologues à des transposons ou à des gènes. Chez les cellules
somatiques de D. melanogaster, bien que la majorité des sARNs soient des miARNs, certains
23

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
ont les caractéristiques des siARNs (equimolarité de brins sens et antisens, taille 21nt,
méthylation en 3’) (Ghildiyal et al., 2008). Les endo-siARNs sont produits souvent à partir de
pseudogènes et ils régulent l’expression de transposons mais aussi de gènes.
c. PROPAGATION ET AMPLIFICATION DU RNA SILENCING
Les siARNs, contrairement aux miARNs, constituent un signal non cellule autonome qui peut
être amplifié.
i. Propagation du signal
Chez les plantes et chez certains invertébrés, le RNA silencing possède une composante
mobile capable de transiter de cellule en cellule et à longue distance, et de déclencher
l’inhibition génique à distance du point d’initiation. Cette composante est spécifique au
siARNs et le RNA silencing guidé par des miARNs est strictement cellule autonome.
• Mouvement à courte distance
Le RNA silencing induit par des siARNs au niveau d’un cellule ou d’un groupe de cellules,
peut s’étendre aux cellules voisines. L’agro-infiltration de tabacs transgéniques exprimant la
GFP avec un transgène GFP conduit à la perte de la fluorescence dans les tissus infiltrés mais
aussi dans les tissus non infiltrés (Palauqui et al., 1997; Voinnet and Baulcombe, 1997). Le
mouvement du signal semble se propager de cellule à cellule via les plasmodesmes (Voinnet
et al., 1998). Des siARNs de 21nt, dont la production dépend de DCL4, RDR2, NRPD1a
(Nuclear RNA polymerase, NRPD1a est une sous-unité de la polIVa) et AGO1, sont
impliqués dans la propagation du signal de RNA silencing de cellule à cellule (Dunoyer et al.,
2007).
• Longue distance
A l’échelle de l’organisme, le signal de RNA silencing peut également se propager via les
vaisseaux du phloème (Voinnet et al., 1998). La première évidence de ce mécanisme a été
fournie par des expériences de greffes réalisées à partir de plants de tabac transformés avec le
gène codant la nitrate réductase (NR) (Palauqui et al., 1996). A longue distance, le signal
mobile se propage toujours des sources vers les puits. Le fait que le signal emprunte les
mêmes voies que les virus et que les produits de la photosynthèse suggère que la transmission
du RNA silencing joue un rôle dans la défense antivirale. On ne connaît pas la nature
moléculaire du signal de RNA silencing à longue distance, mais il semble qu’il ne s’agisse pas
de sARNs. En effet, la transmission systémique du signal n’est pas affectée à partir de
greffons mutants dcl1 ou dcl2dcl3dcl4 (Brosnan et al., 2007). La perception du signal, au
24

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
niveau des organes ‘puits’, semble impliquer la voie du RNA silencing transcriptionnel et
notamment les protéines NRPD1a, RDR2, DCL3 et AGO4. La propagation du signal à longue
distance nécessite l’amplification du signal. Chez les mutants rdr6, il n’y a pas de propagation
systémique, le RNA silencing est restreint à une quinzaine de cellules. Ceci indique que le
mouvement systémique du signal RNA silencing dépend de la protéines RDR6 (Himber et al.,
2003).
ii. Amplification du signal
Chez certains organismes disposant d’une RDR, comme les nématodes ou les plantes, le RNA
silencing peut être amplifié par la multiplication du nombre de sARNs d’une part, mais aussi
par la diversification de ces sARNs, c’est la transitivité (Figure I1-13). La transitivité, mise en
évidence chez les plantes (Voinnet et al., 1998) et chez C. elegans (Sijen et al., 2001),
correspond à la production de siARNs secondaires qui ciblent de nouvelles régions par
rapport au siARNs primaires (Voinnet, 2008). Deux mécanismes pourraient être a l’origine de
la transitivité :
‐ Les sARNs primaires servent d’amorce pour la RDR qui polymérise la séquence
adjacente en 5’ à la séquence ciblée par les sARNs primaires (Moissiard et al., 2007).
‐ Le second mécanisme, amorce indépendant, a été mis en évidence chez des extraits de
germe de blé (Tang et al., 2003) et chez C. elegans (Sijen et al., 2007).
Le mécanisme d’amplification du RNA silencing a été décrit chez C. elegans et dépend d’une
protéine AGO de type III spécifique SAGO ou WAGO (Yigit et al., 2006; Baulcombe, 2007;
Pak and Fire, 2007; Sijen et al., 2007).
d. SPECIFICITE ET REDONDANCE DES PROTEINES DCL CHEZ ARABIDOPSIS
Chez les plantes il existe de nombreux isoformes pour chaque acteur du RNA silencing
(Tableau I1-1). Des études récentes commencent à déterminer la spécificité de chacun des
isoformes et l’éventuelle redondance.
Chez Arabidopsis, il y a quatre isoformes DCL qui sont partiellement redondants. Par
exemple, pour la biogénèse des ta-siARNs, la protéine DCL4, qui produit normalement des
ta-siARN de 21nt, peut-être remplacée par DCL2, qui produit des ta-siARNs de 22nts, ou
DCL3, qui produit des ta-siARNs de 24nt (Gasciolli et al., 2005; Xie et al., 2005a). Dans la
réponse à une infection virale ou dans le cas d’inactivation de transgènes, la protéine DCL2
peut remplacer DCL4 (Deleris et al., 2006; Fusaro et al., 2006). Cependant les ta-siARNs
25

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
produits par DCL2 ou DCL3 ne sont pas fonctionnels car les mutants rdr6 et dcl4 présentent
le même phénotype. Par contre, l’activité DCL1 ne peut pas être remplacée et le mutant nul
dcl1 est létal au stade embryonnaire. D’autre part le triple mutant dcl2dcl3dcl4 n’est pas
affecté dans la production des miARNs (Bouche et al., 2006; Henderson et al., 2006). En
contrepartie, DCL1 est capable de partiellement se substituer aux trois autres DCL.
4. LES MODES D’ACTION DES PETITS ARNS
a. RISC, COMPLEXE RIBONUCLEOPROTEIQUE EFFECTEUR DU RNA SILENCING
i. Formation du complexe RISC
Pour inhiber l’expression du gène cible, un des deux brins du duplex de sARN est incorporé
dans un complexe effecteur du RNA silencing nommé RISC (RNA induced silencing complex)
qui contient toujours une protéine de la famille AGO. Les brins du duplex de siRNAs sont
dissociés par une hélicase ATP-dépendante et le brin dont l’appariement à l’extrémité 5’ était
le moins stable dans le duplex est pris en charge par le complexe RISC (Schwarz et al., 2003).
L’autre brin du duplex de sARNs, nommé brin ‘passager’, est clivé par la protéine AGO chez
la Drosophile et chez l’humain, puis dégradé (Matranga et al., 2005; Rand et al., 2005). Il a
été montré que le brin passager est ensuite dégradé par une RNAse nommé QIP chez N.
crassa (Maiti et al., 2007). Chez Arabidopsis, il semble qu’une famille de nucléases SDN soit
spécialisée dans la dégradation des miARNs (Ramachandran and Chen, 2008b). Cependant,
quand l’instabilité de l’appariement est équivalente en 5’ de chaque brin, chacun des deux
brins peut indépendamment être incorporé dans deux complexes RISC distincts. Le complexe
ribonuléoprotéique RISC, que l’on nomme aussi siRNP ou miRNP, va reconnaître un ARNm
appelé cible portant une séquence complémentaire du siARN
ii. Reconnaissance de l’ARNm cible
Jusqu’à ces derniers mois, les différences que l’on pensait exister entre les mécanismes de
RNA silencing chez les animaux et chez les végétaux permettaient d’établir un certain nombre
de règles sur la reconnaissance ARNm/sARN qui pouvaient influencer la voie d’inhibition
empruntée. Parmi elles, le nombre et la position des MRE (miARN recognition motif) sur
l’ARNm. Chez les végétaux les ARNm présentent le plus souvent un MRE au niveau de la
région codante tandis que chez les animaux plusieurs MRE sont localisés au niveau de la
région 3’-UTR de l’ARNm cible. D’autre part, la complémentarité entre le sARN et sa cible
semblait jouer un rôle important pour l’inhibition. Les miRNAs de plantes présentent le plus
souvent une complémentarité de séquence quasi-parfaite avec leurs ARNm cibles et
entraînent le clivage de ces derniers. Par contre, la grande majorité des miRNAs animaux, qui
26

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
possèdent plusieurs mésappariements avec leurs cibles, bloquent la traduction de l’ARNm
complémentaire. Chez les animaux les miARNs régulent l’expression de plusieurs ARNm
cibles du fait de la complémentarité partielle. On pense que 20 à 30% des transcrits pourraient
être ciblés par des miARNs chez les animaux (Brennecke et al., 2005). De fait, malgré
quelques rares exceptions, il a longtemps été accepté que les miARNs végétaux entrainaient le
clivage de leur ARNm cible tandis que les miARNs animaux bloquent la traduction. On pense
aujourd’hui qu’il n’existe pas de lien strict entre complémentarité ARNm/sARN, position du
MRE et entrée dans une voie de clivage ou de blocage de la traduction. Il a ainsi été montré
que les miARNs ainsi que les siARNs bloquent la traduction chez Arabidopsis (Brodersen et
al., 2008) et sont associés aux polysomes (ce travail) (Projet de revue bibliographique en
partie I3).
Un biais évident a été introduit car seuls les miARNs parfaitement complémentaires à leur
cibles ont été recherchés par bioinformatique chez les végétaux. La majorité des miARNs ont
été identifiés par clonage et séquençage. Cette technique laborieuse présente plusieurs
désavantages, notamment la surreprésentation des cis-siARNs, et d’autre part la méthylation
des miARNs chez les végétaux qui amoindrit l’efficacité du clonage. Il est donc probable que
les populations de miARNs soient imparfaitement décrites chez les plantes.
iii. Spécificité et redondance des protéines AGO
Chez Arabidopsis on connaît dix protéines AGO (Tableau I1-1) qui sont classées en trois
groupes phylogénétiques. Dans le premier groupe on trouve AGO1, AGO5, et AGO10. Dans
le second groupe, AGO4, AGO6, AGO8 et AGO9. Enfin le troisième groupe contient AGO2,
AGO3, et AGO7 (Vaucheret, 2008).
Le rôle d’AGO1 dans la voie des miARNs, ainsi que sont activité slicer, ont été mis évidence
par des études de génétique et de biochimie (Bohmert et al., 1998; Vaucheret et al., 2004;
Baumberger and Baulcombe, 2005). De même, le rôle d’AGO4 et AGO6 dans la voie des cissiARNs
a été décrit (Qi et al., 2006). Des analyses génétiques ont révélé que la protéine
AGO10 aurait des fonctions partiellement redondantes avec AGO1 (Lynn et al., 1999). Il
semble qu’AGO10 soit impliquée dans la régulation traductionnelle (Brodersen et al., 2008).
Deux études récentes ont permis de mettre en évidence les caractéristiques des sARNs qui
déterminent leur liaison spécifique à un isoforme AGO. Il semble que la nature du nucléotide
en 5’ du sARN soit déterminante pour la spécificité de liaison à un isoforme d’AGO (Mi et
al., 2008; Takeda et al., 2008). C’est le domaine MID qui forme une poche qui lie
27

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
spécifiquement l’extrémité 5’ du sARN (Figure I1-10B). Les sARNs de 21nt portant un U en
5’, comme la grande majorité des miARNs, se lie à AGO1. Les sARNs de 21nt portant un A
en 5’, comme la majorité des ta-siARNs, se lie à AGO2. Les sARNs de 24nt qui portent un A
en 5’, les cis-siARNs, se lient à AGO4. Enfin une population de sARNs portant un C en 5’,
produits à partir de régions intergéniques non annotées lie AGO5. Il semble que la protéine
AGO7 ait évolué spécifiquement pour lier miR390 (ou inversement), qui porte un A en 5’
(Montgomery et al., 2008).
Chez les animaux, les protéines AGO semblent également être spécifiquement associés à des
sous-ensembles d’ARNm cibles (Beitzinger et al., 2007).
b. INHIBITION POST­TRANSCRIPTIONELLE
i. Clivage
Une des fins du RNA silencing post-transcriptionnel est le clivage de l’ARNm cible de
l’inactivation (Hammond et al., 2000) (Figure I1-14). Le mécanisme consiste au clivage de
l’ARNm cible complémentaire du sARN à une position entre la dixième et la onzième base à
partir de l’extrémité 5’ du sARN (Elbashir et al., 2001). Le clivage est suivi par la dégradation
de l’ARNm par la machinerie de dégradation des ARNm. L’ensemble des miARNs et siARNs
végétaux peuvent induire le clivage de leur ARNm cible. Un seul miRNA chez les animaux,
miR-196, est connu pour induire le clivage de sa cible, l’ARNm du gène HOXB8 (Yekta et
al., 2004). On a longtemps pensé que cette voie était la voie majoritaire dans le cas des
siARNs endogènes ou artificiels. Cependant des travaux récents on mis en évidence
l’importance de la répression traductionnelle pour l’action de siARNs artificiels chez
Arabidopsis (Brodersen et al., 2008).
ii. Répression de la traduction
Les données bibliographiques concernant les mécanismes de régulation traductionnelle guidés
par les sARNs seront présentés sous la forme d’un projet d’une revue bibliographique dans la
partie I3.
c. REGULATION DE L’ACTIVITE DES SARNS
i. RNA silencing on RNA silencing
L’expression des acteurs principaux de la voie des miARNs est régulée par RNA silencing
afin d’assurer un niveau global correct de miARNs.
Le miR162 régule l’expression du transcrit codant pour DCL1 (Xie et al., 2003). De plus, il a
récemment été prédit qu’un intron du transcrit DCL1 pourrait être à l’origine du miR838
28

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
(Rajagopalan et al., 2006). Les miARNs introniques sont fréquents chez les animaux mais très
rares chez les plantes. Ceci suggère qu’un deuxième niveau de régulation homéostatique
régule l’expression de DCL1. D’autre part, l’ARNm AGO1 est lui-même la cible du complexe
AGO1/miR168 (Vaucheret et al., 2004). Cette boucle de régulation maintien un équilibre
entre miR168 qui conduit au clivage d’AGO1, et AGO1 qui stabilise miR168 (Vaucheret et
al., 2006). Enfin, le miR403 est complémentaire du transcrit AGO2.
ii. Le cas des fausses cibles (mimicry) ou antitargets
Chez les animaux certains ARNm échappent à l’inhibition post-transcriptionnelle du fait du
manque de complémentarité avec le miARN. Ces fausses cibles nommées anti-targets sont le
plus souvent co-exprimées dans les mêmes tissus que les miARN (Stark et al., 2005).
Chez les plantes, il existe également des cibles qui ne peuvent pas être clivées par les miARN.
Il a été montré qu’en réponse à une carence en phosphate, l’ARN non codant IPS1
s’accumule. Cet ARN est complémentaire au miR399 mais résistant au clivage et il permet
donc de titrer le miR399. L’indisponibilité de miR399 pour cliver UBC24/PHO2 permet de
plus traduire le transcrit et d’accumuler la protéine correspondante (Franco-Zorrilla et al.,
2007).
5. LES ROLES DU RNA SILENCING POST‐TRANSCRIPTIONNEL CHEZ LES PLANTES
a. DEFENSE CONTRE ACIDES NUCLEIQUES INVASIFS
i. Transgènes
Comme indiqué en début de chapitre, le RNA silencing a été mis en évidence pour la première
fois lors d’expériences de transgénèse chez le pétunia. Le mécanisme de co-suppresssion
consiste à éteindre l’expression du transgène et celle du gène endogène homologue. De la
même manière, chez C. elegans, la surexpression de la GFP et l’injection d’ARN double brin
GFP conduisent à la baisse de l’accumulation de l’ARNm GFP (Fire et al., 1998).
ii. Virus
Le RNA silencing est très utilisé par les plantes comme mécanisme de défense contre les
infections virales. Le plus ancien indice du rôle du RNA silencing dans la réponse à l’infection
virale date de 1928 où Wingard a mis en évidence le phénomène de ‘recovery’(Wingard,
1928). Des plants de tabac chez qui les premières feuilles sont nécrotiques à cause de
l’infection par le TRV, sont capables de produire de jeunes feuilles indemnes de symptômes
après une deuxième infection par le virus (Figure I1-15A). Les études de virologie ont permis
de beaucoup avancer dans la compréhension des mécanismes de RNA silencing. En 1986, un
29

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
groupe a mis en évidence que la surexpression de protéines de capside virale (CP) chez des
plants de tabac les rend résistants à l’infection virale (Abel et al., 1986). De plus, la
transformation des plantes avec une version non traductible de la protéine virale permet
toujours la résistance au virus (Lindbo and Dougherty, 1992; Smith et al., 1994). Enfin,
l’expression d’un transgène non viral, codant pour la protéine GUS, peut également conduire
à la résistance de la plante si le virus porte dans son génome une portion de la séquence du
transgène non-viral (English et al., 1996).
L’importance des siARNs dans la réponse des plantes face aux infections virales est confirmé
par le fait que de nombreux phytovirus, sinon tous, codent une ou plusieurs protéines capable
d’inhiber la machinerie de RNA silencing endogène (Tableau I1-4). Il y a eu coévolution entre
les stratégies d’infection virales et les mécanismes de défense mis en place par la plante.
L’existence d’inhibiteurs viraux du RNA silencing (VSR pour Viral Suppressor of RNA
silencing) a été mise en évidence lors d’études sur le mécanisme de synergisme. Le
synergisme signifie que la coïnfection d’un potyvirus (TEV) avec un ou plusieurs virus non
apparentés (PVX, CMV, TEV) augmente les symptômes viraux induit par chacun des virus.
De plus, la multiplication du virus non apparenté à la famille des potyvirus est augmentée en
présence du potyvirus. Ce mécanisme a été expliqué au niveau moléculaire par l’identification
de la protéine Hc-Pro, comme étant l’élément codé par le TEV, responsable du synergisme
(Pruss et al., 1997). Des expériences ultérieures, au cours desquelles des plantes exprimant
Hc-Pro ont été croisées avec des plantes co-suppressées pour l’expression de la protéine GUS,
ont permis de démontrer que la protéine Hc-Pro est un VSR (Kasschau and Carrington, 1998).
En effet, les plantes issues du croisement qui expriment le VSR réactivent l’expression du
transgène GUS. De nombreux VSR ont pu être identifiés en utilisant la même approche que
celle décrite précédemment ou un système d’expression transitoire dans lequel les vecteurs
viraux, comme le PVX, sont utiliser pour exprimer les inhibiteurs viraux dans des plantes cosuppressées
(Voinnet et al., 1999). Des VSR ont été mis en évidence chez de nombreux
groupes de virus à ARN ainsi que de virus à ADN (quelques exemples de VSR sont donnés
dans le tableau I1-4).
L’utilisation du RNA silencing comme moyen de lutte contre les infections virales est
conservée entre les espèces (Ding and Voinnet, 2007). Comme chez les plantes, il existe des
VSR codés par des virus animaux (Voinnet, 2005).
30

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
L’utilisation de vecteurs viraux pour induire le RNA silencing a été développée chez les
plantes sous le nom de VIGS (Virus Induced Gene Silencing) (Robertson, 2004).
iii. Transposons et séquences répétées
Le RNA silencing transcriptionnel est utilisé pour maintenir l’intégrité du génome en régulant
les transposons insérés dans le génome chez les plantes mais aussi chez de nombreuses
espèces. Les transposons (TE Transposable Elements) ont été mis en évidence chez les
plantes par Barbara McClintock (Figure I1-15B). Les séquences TE sont méthylées et
associées à des histones modifiées caractéristiques de l’hétérochromatine (H3K9Me2). De
nombreux siARNs sont produits à partir de transposons ou de séquences répétées
pericentromeriques grâce a l’action de l’ARNpolIV. Chez Arabidopsis, la grande majorité des
sARNs clonés correspondent à des éléments transposables. La première mise en évidence
d’un lien existant entre RNA silencing et méthylation des transposons chez les plantes
concerne le transposon AtSN1 qui est démethylé chez le mutant sde4 (Hamilton et al., 2002).
b. REGULATION DE L’EXPRESSION DE GENES ENDOGENES
i. Le rôle des miARNs dans le développement
La preuve du rôle essentiel des miARNs pour le développement des plantes est que les
mutants nuls dcl1 et se, affectés dans la biogénèse des miARNs, ne dépassent pas le stade
embryonnaire (Abel et al., 1986; Jacobsen et al., 1999; Lobbes et al., 2006; Yang et al.,
2006). Les autres mutants d’Arabidopsis affectés dans la voie des miARNs présentent
également des phénotypes développementaux forts.
Par génie génétique, on peut rendre l’ARNm CUC2 résistant au clivage guidé par miR164. La
perte de la régulation de l’expression de CUC2, impliqué dans la mise en place du méristème
apical, entraîne la disparition du méristème apical de façon spectaculaire. Le développement
des plantes mutantes est arrêté avant la formation de la première feuille car elles ne possèdent
plus aucun tissu apical en division (Laufs et al., 2004) (Figure I1-15E). Plus de 70% des
cibles de miARN codent pour des facteurs de transcription impliqués dans le développement
(Tableau I1-2).
ii. Rôle des ta­siARNs
Les trans-siARNs seraient également impliqués dans le développement. On connaît plusieurs
cibles de ta-siARN, parmi elles deux facteurs de transcription ARF (Auxin response factor) et
une PPR (pentricopeptide repeat protein) (Tableau I1-3). Il semble que les ta-siARNs
régulent la transition de la phase juvénile vers la phase adulte (Fahlgren et al., 2006).
31

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
c. REPONSES AUX STRESS BIOTIQUES ET ABIOTIQUES
Bien que le rôle du RNA silencing dans la réponse aux infections virales ait été bien
caractérisé, on commence seulement à mettre en évidence l’importance des régulations
guidées par des sARNs dans la réponse à de nombreux stress biotiques et abiotiques.
i. Infection bactérienne
Le miR393 a été impliqué dans la réponse aux infections bactériennes (Navarro et al., 2006).
En effet la perception par la plante de la flagelline bactérienne (PAMP Pathogen associated
Molecular pattern) induit l’accumulation du miR393 et l’inhibition de l’expression de ses
cibles afin d’améliorer la résistance au pathogène. Le mutant dcl1, qui ne produit plus de
mi393, est hypersensible a l’infection bactérienne (Figure I1-15D).
Récemment, il a été montré que les bactéries pathogènes, tout comme les virus, codent des
protéines capables d’inhiber la machinerie de RNA silencing cellulaire (Navarro et al., 2008).
Comme dans le cas des virus, il y a eu co-évolution entre les mécanismes de défense cellulaire
et la « contre-défense » des pathogènes.
ii. Réponses aux stress abiotiques
La première évidence du rôle des sARNs dans la réponse au stress abiotique a été fournie lors
d’une étude visant à prédire l’existence de nouveaux miARNs et des cibles correspondantes
chez Arabidopsis (Jones-Rhoades and Bartel, 2004). Les résultats de cette étude ont montré
que de nombreuses protéines de réponse aux stress se trouvaient parmi les cibles potentielles
de miARNs. La même année, un autre groupe a publié les résultats de la première expérience
de clonage de sARNs réalisée à partir de plantes exposées à différents stress (Sunkar and Zhu,
2004). Ces travaux ont mis en évidence que l’accumulation de plusieurs miARNs est régulée
en réponse aux stress mais aussi d’identifier de nouveaux siARNs spécifiquement exprimés
dans ces conditions. Ces premières données ont permis d’identifier plusieurs cas de sARNs
impliqués dans la réponse aux stress abiotiques (Borsani et al., 2005; Sunkar et al., 2006).
Plus récemment, une étude basée sur des expériences de puces à ADN a permis d’identifier
quatorze miARNs régulés en réponse au stress (Liu et al., 2008). Parmi eux, miR168,
miR171, et miR396 répondent à tous les stress testés (fortes concentrations salines, froid,
sécheresse).
32

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
• Réponse au froid
La première étude sur les effets de la température sur le RNA silencing été réalisée chez le
tabac. Elle a montré que les mécanismes de RNA silencing induits par l’infection virale ou par
l’introduction d’un transgène sont tous deux inhibés par le froid (Szittya et al., 2003). Ces
résultats ont permis de proposer un mécanisme moléculaire pour les modifications des
interactions plantes/virus en fonction de la température (Szittya et al., 2003). En effet, en
conditions de basse température les symptômes viraux sont plus importants du fait de
l’inhibition du mécanisme de défense de l’hôte, le RNA silencing en l’occurrence. Plus
récemment, une analyse bioinformatique, confirmée par des données expérimentales, a permis
d’identifier huit miARNs dont l’accumulation est induite en réponse au froid (Zhou et al.,
2008) (Figure I1-16). L’analyse des promoteurs des loci AtMIR correspondant a mis en
évidence l’existence d’éléments en cis de réponse au stress au niveau de ces régions (Zhou et
al., 2008).
• Réponse au sel
C’est sur la base des données issues du clonage de sARNs de Sunkar et Zhu (Sunkar and Zhu,
2004) que les premiers nat-siARNs ont été caractérisés. En effet, comme indiqué dans le
paragraphe consacré aux nat-siARNs, c’est en réponse au stress salin que le transcrit P5DCH
est reconnu par des complexes siRNP et clivé afin de permettre l’accumulation de Proline,
importante pour la réponse au stress (Figure I1-16).
• Réponse à la carence en nutriments
Le premier miARN identifié comme étant impliqué dans la réponse aux nutriments est le
miR395, complémentaire aux transcrits APS1, APS3 et APS4 qui codent pour des ATP
sulfurylases chloroplastiques (APS) (Jones-Rhoades and Bartel, 2004). Les APS catalysent
l’étape initiale de l’assimilation du sulfate. En conditions normales de croissance, miR395
n’est pas détecté par northern blot, APS1 s’accumule afin de permettre l’assimilation du
sulfate et la production d’acides aminés soufrés. En carence en sulfate, miR395 s’accumule et
inhibe l’expression d’APS1. Le miR395 régule également l’expression du transcrit AST68, qui
code pour un transporteur de sulfate SULTR2 ;1 (Allen et al., 2005) (Figure I1-16). Le cas du
miR395 est original car ce miARN régule l’expression de gènes de familles différentes
impliqués dans la même voie métabolique.
Le même profil de régulation a été mis en évidence pour la réponse au phosphate (Pi).
miR399 régule l’expression du gène UBC24, qui code pour une enzyme de conjugaison de
l’ubiquitine E2. En conditions de carence en Pi, miR399 s’accumule et inhibe l’expression
33

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
d’UBC24 (Fujii et al., 2005; Chiou et al., 2006) (Figure I1-16). La fonction exacte de cette
régulation pour la réponse à la carence en Pi est cependant restée mystérieuse jusqu’au
clonage du gène PHO2. Le mutant pho2 était connu comme un hyper-accumulateur de Pi au
niveau des racines. Il s’avère que PHO2 est le gène UBC24 (Aung et al., 2006; Bari et al.,
2006). Le mécanisme proposé est donc qu’en conditions normales de croissance,
UBC24/PHO2 est exprimé et régule finement l’assimilation du Pi en guidant les protéines
impliquées vers le protéasome. En réponse à une carence en Pi, miR399 réprime
UBC24/PHO2, permettant ainsi une capacité d’assimilation maximum du nutriment.
Cependant, les cibles d’UBC24/PHO2 n’ont pas été identifiées.
• Réponse au stress oxydant
De nombreuses conditions environnementales, telles que la sécheresse, le froid, la forte
lumière ou la présence de métaux dans le milieu de culture, peuvent conduire à
l’accumulation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS pour reactive oxygen species). Pour
éviter au maximum les dégâts cellulaires causés par les ROS, de nombreuses stratégies antioxydantes
sont mises en place par la plante ; parmi elles, la production de superoxyde
dismutases (SOD). L’expression des SOD est régulée post-transcriptionnellement par le
miR398 (Sunkar et al., 2006) (Figure I1-16). En conditions normales de croissance
l’accumulation de miR398 réprime l’expression des SOD. En réponse au stress oxydant, le
miR398 ne s’accumule plus et les SOD sont exprimées afin de détoxifier les ROS. Il a
récemment été montré que d’autres protéines aux propriétés antioxydantes sont régulées par
des miARNs. En conditions normales, miR397, miR408 et miR857 répriment l’expression
des ARNm codant pour des laccases et plantocyanine (Abdel-Ghany and Pilon, 2008).
• Réponse au sucrose
Il a été montré récemment que contrairement aux conditions oxydantes, le sucrose induit
fortement m’accumulation du miR398 (Dugas and Bartel, 2008) (Figure I1-16). Cette
régulation est maintenue même si on ajoute des facteurs oxydant au milieu sucré. Cette étude
a également suggéré que le miR398 régule l’expression des CSD au niveau traductionnel.
Globalement, le rôle du RNA silencing dans la réponse au stress abiotique est très peu connu.
De nombreuses approches, qui seront abordées en discussion, permettront d’améliorer les
connaissances dans ce domaine.
6. EVOLUTION DU RNA SILENCING
34

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
Le RNA silencing induit par les siARNs est un mécanisme conservé qui est probablement
apparu tôt au cours de l’évolution des eucaryotes. En effet de nombreux eucaryotes
unicellulaires possèdent la machinerie de RNA silencing tels que T. bruceii ou S. pombe. Il
semble que la voie des miARNs soit apparu plus tard au cours de l’évolution. Il a cependant
été montré récemment que l’algue unicellulaire C. reinhardtii code pour un ensemble de
miARNs (Molnar et al., 2007). Certains miARNs sont très conservés parmi les animaux, par
exemple let-7, présent chez les vertébrés, les arthropodes, et les nématodes. De même chez les
plantes terrestres de nombreux miARNs sont conservés. Entre animaux et végétaux, un seul
exemple de « miARN » conservé a été décrit (Arteaga-Vazquez et al., 2006). Il semble que ce
« miARN » ne corresponde en réalité qu’à un siARN chromatinien mal annoté. On pourrait
donc penser que la voie des miARNs soit apparue au cours de deux événements indépendants
chez les végétaux et chez les animaux, à partir de la voie des siARNs présente chez l’ancêtre
commun eucaryote .
Bien que certaines familles de sARNs soient conservées entre différents groupes de plantes
terrestres (angiospermes, gymnospermes, mousses) d’autres ont évolué récemment dans
certains groupes taxonomiques. On pense que l’évolution des miARNs a été lente et on peut
distinguer des miARNs jeunes de miARNs anciens. Il existe un modèle pour l’évolution des
miARNs qui indique certains loci MIR auraient évolué de novo a partir de régions dupliquées
de la cible correspondante (Allen et al., 2004). L’identification de nombreux loci MIR
présentant de fortes similarités avec leurs cibles appuie la validité de ce modèle. Les miR161,
mi163, et miR834, seraient d’après ce modèle de jeunes miARNs. De plus, ils ne sont pas
conservés parmi les végétaux.
IV. REGULATIONS POST‐TRANSCRIPTIONNELLES DANS L’ESPACE
On commence à entrevoir le rôle essentiel que jouent les granules cytoplasmiques dans la
mise en place des régulations post-transcriptionnelles de l’expression des gènes.
Les ARNm matures cytoplasmiques ne sont pas libres mais associés en permanence à un
ensemble de protéines. Ces complexes ribonucléoprotéiques, mRNP (mRNA
ribonucleoproteic complex), ne sont pas tous traduits à un moment donné. Ils oscillent entre
trois états séparés dans l’espace : la traduction, le stockage, et la dégradation (Figure I1-17).
En effet, dans de nombreux cas, des mRNP cytoplasmiques doivent échapper temporairement
ou définitivement à la traduction. Pour ce faire, ils sont empaquetés en granules
35

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
ribonucleoprotéiques, non délimitées par une membrane, nommées granules à ARN. On
différencie plusieurs catégories de granules à ARN en fonction de leur composants protéiques
et du devenir des ARNs empaquetés (traduction ultérieure ou dégradation).
1. GRANULES À ARN
a. LES GRANULES A ARNS PRESENTES DANS LES CELLULES GERMINALES ANIMALES
(GCG)
Ces granules ont été décrites au XIXe siècle après l’observation en microscopie de taches
sombres au niveau d’un des pôles de larves de Miastor metraloas. Ces granules ont par la
suite été observées chez différents organismes tels que le X. laevis, D. melanogaster ou C.
elegans et nommées granules polaires ou GCG (germ cell granules). Ces structures
contiennent des ARNm maternels essentiels à la détermination des cellules germinales de
l’embryon. La formation de ces structures granulaires contenant des protéines impliquées
dans la régulation de la traduction et la dégradation des ARNm, permet de réguler
l’expression des ARNm maternels dans les cellules germinales de l’embryon (Anderson and
Kedersha, 2006).
b. LES GRANULES DE STRESS (SG)
En réponse aux stress, les cellules eucaryotes reprogramment le métabolisme des ARNm afin
de réparer les dommages causés par le stress et de s’adapter aux nouvelles conditions
environnementales. La réponse au stress consiste donc d’une part à inhiber la traduction de
protéines de ménage, et d’autre part à activer la traduction des certaines protéines type
chaperonnes ou enzymes de réparation cellulaire. Des granules à ARN ont été observées pour
la première fois dans le cytoplasme de cellules de tomate ayant subit un choc thermique. Ces
structures renferment les ARNm codant la plupart des protéines cellulaires mais pas d’ARNm
codant les protéines HSP (Heat Schock Protein) (Nover et al., 1989). On a longtemps assimilé
les HSG à des granules de stress (SG). Cependant, chez Arabidopsis, il semble que les HSG
soient distinctes des SG (Weber et al., 2008). Les SGs ont été décrites chez des cellules de
mammifères exposées à divers stress environnementaux (UV, hypoxie…). Après
désassemblage des polysomes, les ARNm sont triés en fonction de leur devenir : traduction
ultérieure ou dégradation. L’assemblage de granules à ARN est la conséquence
morphologique de ce processus de triage sélectif des ARNm (Anderson and Kedersha, 2006).
L’assemblage des SGs est dépendant de l’état de phosphorylation du facteur eIF2α (Kedersha
et al., 2005). Les SGs sont capables de fission, fusion et dispersion (Kedersha et al., 2005). La
36

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
mise en évidence récente de l’existence de SGs chez la levure S. cerevisiae suggère que ces
structures ont été conservées parmi les eucaryotes (Brengues et al., 2005).
c. LES PROCESSING BODIES (PB)
Les P-bodies (PBs), aussi connues sous le nom de DCP bodies ou GW bodies, sont des
granules cytoplasmiques qui contiennent les composants de la machinerie de dégradation des
ARNm chez de nombreux eucaryotes. Tandis que les SGs sont assemblées spécifiquement en
réponse à un stress environnemental, les PBs sont toujours présentes dans le cytoplasme aussi
bien de cellules en conditions physiologiques que stressées. Les PBs ont d’abord été mis en
évidence via l’observation de la distribution ponctuelle de l’exonuclease XRN1 ainsi que des
enzymes de décoiffage des ARNm DCP1/DCP2 dans le cytoplasme (Anderson and Kedersha,
2006). Chez des cellules de mammifères, les PBs contiennent la protéine 4E-BP, et GW182,
une protéine capable de lier les ARNs essentielle au RNA silencing. Le facteur eIF4E et le
complexe inhibiteur de la traduction p54/RCK se trouvent également dans les PBs. Ces
données indiquent que les PBs sont non seulement un lieu de dégradation des ARNm mais
également de contrôle de la traduction.
d. LES GRANULES NEURONAUX (NG)
Les cellules neuronales, extrêmement différenciées, ont mis en place des mécanismes de
transport des ARNm permettant d’initier la synthèse protéique au niveau du corps cellulaire et
de produire une protéine à distance, au niveau du synapse. Les ARNm dont la traduction est
initiée sont empaquetés sous la forme de NGs et transportés le long des filaments d’actine
jusqu’au synapse où la protéine sera finalement produite en réponse à des stimuli exogènes
(Anderson and Kedersha, 2006). Les cellules végétales, comme les neurones, peuvent être très
grandes et communiquent entre elles par les plasmodesmes. Des systèmes homologues aux
NGs pourraient s’avérer utiles chez certains organismes végétaux pour localiser la traduction
des protéines.
En réponse au stress les NGs sont capables d’interagir avec des SGs, ce qui confirme à
nouveau l’existence de relations dynamiques entre les différents types de particules à ARNs.
e. RELATIONS ENTRE LES DIFFERENTES PARTICULES A ARNS
Tandis que les SGs forment des structures très hétérogènes dans leurs tailles et leurs formes,
les PBs sont des particules sphériques uniformes entre elles. Cependant, comme dans le cas
des SGs, le nombre et la taille des PBs augmentent en réponse au stress. Les PBs et les SGs
sont capables d’interagir les unes avec les autres chez des cellules de mammifères en
37

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
condition de stress. Des images de fluorescence en temps réel ont permis de montrer que les
PBs sont mobiles dans le cytoplasme contrairement aux SGs. Il serait possible que le contact
entre PBs et SGs permette l’échange de complexes mRNP en fonction de leur devenir (Marx,
2005). Les relations étroites entre SGs et PBs chez des cellules de mammifères exposées à un
stress confirment le lien dynamique qu’il existe chez la levure entre les processus de
régulation de la traduction et ceux de dégradation des ARNm (Coller and Parker, 2005).
Toutes les particules à ARNs contiennent des ARNs dont la traduction est inhibée. Les
particules de type GCGs ou NGs renferment spécifiquement certains ARNm tandis que les
SGs et PBs peuvent contenir l’ensemble des ARNs cellulaires. Les SGs peuvent contenir la
majorité des ARNm polyadenilés dont la traduction est inhibée en réponse au stress. Les PBs
contiennent les ARNs destinés à être dégradés. Bien que la composition de chacune des
particules à ARN soit différente, de nombreuses protéines sont représentées dans plusieurs
types de particules. Par exemple, la composition en ribosomes des particules à ARN dépend
de la fonction de chacune d’elle : les NGs contiennent les deux sous unités du ribosome car
elles renferment des ARNm en état de « pré-traduction » ; les SGs contiennent une des deux
sous unités du ribosome car elles contiennent des ARNm dont la traduction est inhibée ; enfin
les PBs ne contiennent pas de sous-unité ribosomales car ils renferment majoritairement des
ARNm destinés à être dégradés.
2. GRANULES A ARN ET RNA SILENCING
Les protéines AGO, les miRNAs et leurs ARNm cibles, ainsi que d’autres protéines
impliquées dans le métabolisme des ARN, sont groupés au niveau de granules à ARN (SGs et
PBs) dans le cytoplasme (Eulalio et al., 2007a). Bien que les granules à ARN semblent jouer
un rôle important pour le RNA silencing, elles ne sont pas nécessaires à la fonction des
miARNs (Eulalio et al., 2007b). Chez les mammifères ainsi que chez la levure, les PBs sont le
site du RNA silencing dépendant des miRNAs. On retrouve des protéines AGO dans les PBs
et les ARNm cibles du RNA silencing sont également concentrés au niveau des PBs de
manière dépendante de la présence des miARN complémentaire (Liu et al., 2005). La
formation des PBs est la conséquence et non la cause de la répression traductionnelle par les
miARNs (Eulalio et al., 2007b). Les SGs sont également liées au RNA silencing chez les
cellules de mammifères. En effet, en conditions normales de croissance, la majorité des
protéines Ago sont localisées de manière diffuse dans le cytoplasme. En réponse à un stress,
les protéines Ago s’accumulent au niveau de SGs néoformées(Leung et al., 2006).
38

I1_Régulations post‐transcriptionnelles
Chez les plantes, les granules à ARN ont été décrites très récemment et on ne connaît pas de
lien entre ces particules et le RNA silencing (Weber et al., 2008). Cependant, comme indiqué
dans le paragraphe précédent, plusieurs travaux ont pu mettre un évidence un lien existant
entre le RNA silencing et le métabolisme des ARNm (Gazzani et al., 2004; Xu et al., 2006;
Gy et al., 2007; Gregory et al., 2008).
39

Transcription
Réplication
ADN
Réplication
Traduction
ARN protéine
Figure I1-1. Le dogme de la biologie moléculaire, établi par Francis Crick en 1958.
Chez tous les organismes cellulaires, l’information génétique est stockée sous forme
d’ADN double brin. La conversion de l'ADN (langage acide desoxyribonucléique) en ARN
(langage acide ribonucléique) correspond à la transcription. Certains ARN portent
l’information nécessaire à la fabrication d’une protéine, ce sont les ARN messagers
(ARNm). D’autres ARN participent à la maturation ou à la traduction des ARNm en
protéines (langage acide aminé), ce sont les ARN ribosomaux (ARNr) et les ARN de
transfert (ARNt). L'information portée par les ARNm est traduite en protéines (traduction).
La fléche pointillée rose indique la réaction inverse de la transcription (reverse
transcription).

Régulations
transcriptionnelles
Régulations
post-transcriptionnelles
Régulations
post-traductionnelles
Promoteur Région transcrite
5'-UTR séquence codante (ORF) 3'-UTR
Intron Intron
Exon Exon Exon
5' ATG Ter
3'
noyau
cytoplasme
MeG
MeG
start transcription
Transcription
5' AUG Ter
3'
AUG Ter
Région traduite
AUG Ter
Epissage et maturation
Traduction
AAAAA
Figure I1-2. Schéma général de l’expression des gènes chez les eucaryotes. Le modèle classique du gène
eucaryote est constitué d’une région promotrice, d’un start (+1) de transcription suivi d’une région
transcrite. La région transcrite en pre-ARNm comprend une région codante (ORF Open Reading Frame) qui
commence au niveau d’un codon initiateur AUG et se termine par un codon terminateur. De part et d’autre
de l’ORF se situent des régions transcrites mais non traduites nommées UTR (Untranslated Regions). Le
pre-ARNm est maturé et épissé dans le noyau, c’est-à-dire que les introns sont excisés de la région codante,
la région 5’ est coiffée d’une structure Methyl-Guanosine et la région 3’ est polyadénylée. L’ARNm mature
est exporté du noyau vers le cytoplasme où il est traduit en protéine. Les régulations post-transcriptionnelles
peuvent opérer à tous les niveaux de l’expression des gènes à partir du pre-ARNm, jusqu’à la protéine.
N
C
Transport nucleoplasmique
AAAAA
gène
pre-ARNm
ARNm
protéine

eiF2-GTP
eiF2-GTP
complexe
ternaire
ARNt-Met
Met
AAAAA
PABP
4A
4G
AAAAA
PABP
4E
4A
4G
4E
AAAAA
complexe de
pre-initiation 43S
3
1A
eiF2-GTP
3
1A
eiF2-GTP
Met
Met
ATP
ADP+Pi
ATP
ADP+Pi
3
1A
eiF2-GTP
eiFs
Met
Met
eiF5
eiF2B
(GEF)
eiF2-P
GCN2
eiF2-GDP
GCN4 translation
Figure I1-3. L’initiation de la traduction chez les eucaryotes. La séquence d’événements nécessaires
à l’initiation de la traduction est facilité par de nombreux facteurs protéiques eIFs (eukayotic initiation
factors). L’initiation commence par l’association d’eIF2 avec un ARNt-Met en présence de GTP. Le
complexe ternaire ainsi formé et eIF3 lient une sous-unité ribosomale libre 40S. Le complexe 43S se lie
à la 5’UTR de l’ARNm, préalablement circularisé par le complexe eiF4F, et scanne de 5’ en 3’ jusqu’à la
rencontre du codon AUG. En présence de GTP, la grande sous-unité 60S se lie à la petite et les facteurs
eIF sont relargués. Le complexe eIF2-GTP est recyclé pour un nouveau cycle d’initiation grâce au facteur
eIF2B.

A.
B.
D.
250nm
C
DO 254nm
C
Sedimentation
Polysomes
50nm
8
C.
250nm
250nm
Monosomes
60S
Figure I1-4. Polysomes. A, B, C. Observations en microscopie électronique à transmission de polysomes
de Tetrahymena (Yoshida et al., 1997 ; Yazaki et al., 2000). A. Polysome linéaire, la flèche indique l’ARNm
qui relie les ribosomes entre eux. B et C. Les différentes formes de ribosomes : circulaires (r), en huit (8) ou
en chenille (c). D. Profil spectrophotométrique obtenu à partir d’un fractionnement d’extrait cytoplasmique
sur gradient de saccharose. Le cercle noir représente un ARNm circularisé par un complexe d’initiation de
la traduction (boule noire).
40S

E+
E0
E-
I-
I0
I+
Figure I1-5. Schéma représentant l’effet des combinaisons de régulations traductionnelles sur les
polysomes. I+ : initiation activée ; I- : initiation inhibée ; E+ : élongation accélérée ; E- : élongation
ralentie ; T+ : terminaison activée ; T- : terminaison inhibée. En haut du triangle est représentée la
situation en condition normale : 3 ribosomes par ARNm.
T-
T0
T+
E+
E0
E-

A.
B.
C.
D.
3
Met
1A
eiF2-GTP
3
1A
eiF2-GTP
3
Met
1A
eiF2-GTP
3
Met
1A
eiF2-GTP
Met
µORF
Met
3
Met
1A
eiF2-GTP
Met
eiF2-GTP
µORF 3
µORF1
µORF2
3
Met
1A
eiF2-GTP
ORF
Met
1A
eiF2-GTP
Figure I1-6. Régulations spécifiques de la traduction, importances des régions
5'-UTR. A. IRES Internal Ribosomal Entry Sites. B, C, D. Stratégies pour lire l'ORF
principale lorsqu'elle est précédée par une ou plusieurs microORF (µORF). B. Leaky
scanning, C. Re-initiation, D. Ribosomal shunt.
ORF
ORF
ORF

A. Conditions normales
eiF2-GTP
Met
eiF2-GTP
Met
Met
eiF2-GTP
Met
eiF2-GTP
eiF2-GTP
Met
µORF1 µORF2 µORF3 µORF4
sAUG
B. Carence acides aminés
eiF2-GTP
Met
Met
Met
eiF2-GTP
GCN2
µORF1 µORF2 µORF3 µORF4
sAUG
Met
Met
eiF2-GTP
Met
eiF2-P-GDP
Met
Figure I1-7. Régulation de la traduction de l’ARNm GCN4 en réponse à la carence en acides aminés. En
conditions normales de croissance, la plupart des sous unités 40S sont capables de re-initier jusqu’au µAUG4.
Après la traduction de la µORF4 les ribosomes se dissocient de l’ARNm sans avoir traduit l’ORF principale
codant pour GCN4. En réponse à un stress, la synthèse protéique globale est inhibée par la phosphorylation
d’eiF2α et peu de sous-unités 40S peuvent re-initier après la terminaison de la µORF1 pour traduire la
µORF4. Ces sous-unités sont donc disponibles pour initier la traduction de l’ORF GCN4 et ainsi activer les
voies de réponse au stress.
eiF2B
(GEF)
GCN4
GCN4
eiF2-P

A.
C.
NT 35S::CHSA
i.
protéine GFP
ii.
ARNm MEX3
NI ARN db GFP
NI ARN db MEX3
B.
D.
35S:ACO
Co-suppression
ARNm LIN-14
ARN Lin-4
protéine LIN-14
temps
Figure I1-8. La découverte du RNA silencing. A. Co-suppression du gène CHSA chez le pétunia d’après
Napoli et al., 1990. La fleur de pétunia sauvage (non transformé NT) est de couleur pourpre. Chez les
transformants 35S ::CHSA, les fleurs sont partiellement ou totalement dépigmentées en raison de la perte de
l’expression du gène endogène et du transgène. B. Les miARNs régulent le développement chez C. elegans.
Exemple du miARN lin-4 qui réprime la traduction de l’ARNm LIN-14 après la transition entre le stade
larvaire L1 et le stade L2 ou cours du développement. C. L'importance de la molécule d'ARN double brin
(db). L’injection d’ARN double brin inhibe l’expression des gènes correspondants chez C. elegans, d’après
Fire et al., 1998. i. Perte de la fluorescence de la GFP suite à l’injection d’ARN double brin GFP dans des
larves de nématodes fluorescentes (photo de droite). ii. Perte de l’accumulation des ARNm MEX3 après
injection d’ARN double brin MEX3 dans les larves de nématodes (photo de droite). D. Les petits ARNs
antisens associés à l’inhibition post-transcriptionnelle d’après Hamilton et Baulcombe, 1999. Chez certaines
lignées transformées avec le gène ACO de la tomate sous le contrôle du promoteur 35S, l’ARNm ACO ne
s’accumule plus (T5.2 et T5.3). En parallèle, chez ces lignées co-suppressées, il y a accumulation de petits
ARNs antisens.

protéines associées à
autres protéines associées au
Protéines associées
RNAse III
Dicer RDR ARN helicases RNA silencing Methylase Argonautes
à AGO
Saccharomyces pombe DCR1 AGO1* Tas3
Neurospora crassa
DCR1
DCR2
QDE1 QDE2
DCL1 (21nt) HYL1, SE, DDL RDR1 SDE3 WEX1 (exonuclease) HEN1 AGO1*
DCL2 (22nt) DRB4 RDR2 SGS3 AGO2
DCL3 (24nt) RDR3 SDE4 AGO3
DCL4 (21nt) RDR4 AGO4* NRPD1b
Arabidopsis thaliana
RDR5
RDR6=SGS2=SDE1
AGO5
AGO6
AGO7 (tas3)*
AGO8
AGO9
AGO10
Drosha DGCR8/Pasha RRF-1 DRH1/2 MUT7 (exonuclease) 27 predicted CeAGO proteins!!
DCR1 RDE4 EGO1 MUT14 5AGO, 4PIWI and 18 WAGOs
RRF-3 SMG2 RDE1
ALG1
Ceanorabditis elegans
ALG2
CSR1
PRG1
SAGO1
SAGO2
PPW1
Drosha DGCR8/Pasha Armitage Pimet AGO1 * GW182
DCR1 Loquacious spindleE AGO2 */eiF2C2 TudorSN
Drosophila melanogaster DCR2 R2D2 Rm62 AGO3
Aubergine
Piwi*
Drosha DGCR8/Pasha eiF2C1 (AGO1) GW182
Dicer PACT/TRBP eiF2C2 (AGO2)* TudorSN
Homo sapiens
AGO3
AGO4
and 4 PIWI
Tableau I1-1. Les protéines essentielles au RNA silencing sont conservées parmi les eucaryotes. Six organismes modèles capables de faire du RNA silencing sont
représentés. Les protéines Dicer et Argonautes (AGO) sont toujours présentes. Les astérisques signalent la présence d'acides aminés catalytiques nécessaires à l'activité
slicer des protéines AGO. A noter que les ARN polymérases ARN dépendantes (RDR) sont absentes chez la levure ainsi que chez la Drosophile et les mammifères.

ARN
long ARN double brin
Dicer
petits ARNs regulateurs
AGO
complexe régulateur
AGO
régulation de l'expression d'un gène cible
Figure I1-9. Schéma général de la voie du RNA silencing. Une molécule d’ARN est convertie
en ARN double brin. Ce dernier est ensuite clivé par une RNAse de type III nommée Dicer pour
produire des petits ARNs. L’un des brin du duplex de sARNs est incorporé dans une complexe
protéique qui est toujours composé d’une protéine de la famille Argonaute. Le complexe
ribonucléo-protéique ainsi formé est capable de réguler l’expression des gènes qui contiennent
une région complémentaire au sARN. Les trois flèches au début et à la fin de la voie indiquent
que les mécanismes moléculaires sont très variables au niveau de ces étapes.

A. RNAse III classe III : Protéines Dicer
N hélicase PAZ RNAse RNAse DRB C
B. Protéines Argonaute
N PAZ MID PIWI C
3'
FGADV....YRDG.....YYAHL...
triade catalytique DDH
Mid
P
Figure I1-10. Deux familles de protéines essentielles pour le RNA silencing. A. Les RNAse III classe III
Dicer. A gauche, une représentation schématique des domaines conservés chez les protéines Dicer. A droite, une
représentaion de la structure de la protéine Dicer de Giardia obtenue à partir d'un cristal. La superposition d'une
molécule d'ARN souble brin montre que la distance entre le domaine PAZ et le domaine RNAse determine la
taille du duplex de petits ARNs produit par Dicer. Les flèches jaunes indiquent la position des sites de clivage
(d'après MacRae et Doudna, 2006). B. Les protéines Argonaute (AGO). En partie haute, une représentation
schématiquedes domaines conservés chez les protéines AGO. En partie basse, une représentationde la structure
de la protéine AGO de Pyrococcus obtenue à partir d'un cristal. Le petit ARN et l'ARNm ont été superposés.
Les résidus du site actif sont représentés en rouge (d'après Hutvagner et Simard, 2008).
PAZ
PIWI
5'

pri-miR
pre-miR
A. B. C.
duplex
miR/miR*
MIR
SE
DCL1
HYL1
SE
DCL1
HYL1
HEN1
RNA polymerase II
TAS
AGO1/7
SGS3
RDR6 SDE3?
gene X gene X
RNA polymerase II
DRB4
DCL4
HEN1
ta-siARNs nat-siARNs
DCL2
DRB
HEN1
Figure I1-11. Les voies de production des sARNs impliqués dans le RNA silencing post-transcriptionnel chez
les végétaux. A. voie des miARNs (microARNs), B. Voie des trans-siARNs (trans-small interfering RNAs), C. voie
des nat-siARNs (natural antisens siRNAs). Dans les trois cas, la production d'une molécule d'ARN double brin inter-
(cas des siARNs) ou intra-moléculaire (cas des miARNs) induit le recrutement d'une protéine Dicer-like (DCL) et de
protéines de liaison à l'ARN double brin. Le clivage par DCL produit un duplex de miARNs ou plusieurs duplex de
siARNs.
AGO
SGS3
RDR6 SDE3?
DCL1
DRB
HEN1
gene X

nombre de loci
précurseurs
famille de cibles
nombre de
cibles
nombre de clones
par million de
clones (Illumina)
miR156/157 12 SBP 11 74
miR158 2 PPR 2 100
miR159/319 6 MYB, TCP 12 230736
miR160 3 ARF 3 2426
miR161 1 PPR 20 9878
miR162 2 Dicer 1 393
miR163 1 SAMT 5 3562
miR164 3 NAC 7 502
miR165/miR166 9 HD-ZIPIII 4 1301
miR167 4 ARF 1 18314
miR168 2 ARGONAUTE 7 7867
miR169 14 HAP2 3 1915
miR170/miR171 4 SCL 3 804
miR172 5 AP2 6 4913
miR173 1 TAS1, TAS2 4 9
miR390/miR391 3 TAS3 1 609
miR393 2 F-box 5 10
miR394 2 F-box 1 889
miR395 6 APS, AST 4 41
miR396 2 rhodenase 6 2928
miR397 2 laccase 3 1015
miR398 3 CSD, cytC oxydase 2 234
miR399 6 E2-UBC 2 20
miR400 1 PPR 19 12
miR402 1 ROS1-like 1 4
miR403 1 ARGONAUTE 1 74
miR408 1 laccase, PLC 2 557
miR436
miR444
miR447 3 2-PGK 2 50
miR472 1 CC-NBS-LRR 15 15
miR475
miR476
miR771 1 eiF-2 1 22
miR773 1 MET2 1 186
miR774 1 F-box 5 0
miR775 1 GT 1 190
miR776 1 PK 1 1793
miR777 1 CIP4.1-like 1 7
miR778 1 SUVH 4 5
miR779 1 1 0
miR780 1 CHX 1 90
miR781 1 1 24
miR822 1 ? 74
miR823 1 CMT3 1 31
miR824 1 MADS-box 1 976
miR825 1 ? 141
miR826 1 ? 3
miR827 1 SPX 1 12
miR828 1 MYB, TAS4 2 11
miR829 1 ? 0
miR830 1 ? 5
miR831 1 ? 1
miR832 1 ? 0
miR833 1 ? 3
miR834 1 ? 1
miR835 1 ? 0
miR836 1 ? 0
miR837 1 ? 10
miR838 1 ? 9
miR839 1 ? 131
miR840 1 ? 46
miR841 1 ? 5
miR842 1 JR/MBP 1 9
miR843 1 ? 71
miR844 1 PK 1 11
miR845 2 ? 112
miR846 1 JR/MBP 10 729
miR847 1 ? 47
miR848 1 ? 16
miR849 1 ? 4
miR850 1 ? 1
miR851 1 ? 4
miR852 1 ? 9
miR853 1 ? 0
miR856 1 CHX 1 2
miR857 1 laccase 1 17
miR858 1 MYB 2 9
miR859 1 F-box 35 16
miR860 1 ? 15
miR861 1 ? 5
miR862 1 ? 4
miR863 1 ? 0
miR864 1 ? 59
miR865 1 ? 3
miR866 1 ? 2
miR867 1 ? 81
miR868 1 ? 1
miR869 1 ? 111
miR870 1 ? 3
Tableau I1-2. Familles de microARNs chez
Arabidopsis.

nombre de loci famille des cibles nombre de cibles
nombre de clones par million
de clones (Illumina)
TAS1 3 PPR et autres 29 4380
TAS2 1 PPR 22 9068
TAS3 3 ARF 3 2508
TAS4 1 MYB 3 129
Tableau I1-3. Les quatre loci TAS décrits chez Arabidopsis.
TAS3
AGO7 AGO7 miR390
AAAAA
AGO7
DCL4
DRB4
HEN1
SGS3
RDR6 SDE3?
Figure I1-12. Le double clivage de TAS3 par miR390/AGO7. Le transcrit non codant TAS3
porte deux sites de reconnaissance pour miR390 en 3' et en 5'. Le complexe miR390/AGO7
reconnait les deux sites mais ne clive qu'en 3'.

mécanisme dépendant
d'une amorce
DCL4
DRB4
HEN1
SGS3
RDR6 SDE3?
AGO
AGO
siARNs
primaires
siARNs
secondaires
mécanisme indépendant
d'une amorce
AAAA
DCL4
DRB4
HEN1
SGS3
RDR6 SDE3?
AAAA
Figure I1-13. Amplification du signal de RNA silencing porté par les siARNs, la
transitivité. Deux mécanismes pourraient être à l'origine du phénomène de transitivité : un
mécanisme dépendant d'un siARN primaire qui servirait d'amorce à la polymérase à ARN
(RDR); un mécanisme indépendant d"une amorce dans lequel la RDR reconnaît ses ARNm
cibles en 3', au voisinage de la queue polyadénylée. L'ARN double brin généré est clivé par
DCL4 pour former des siARNs secondaires.

A.
B.
AAAAA
exosome
AGO miARN/siARN
XRN4
AGO miARN/siARN
?
AAAAAA
AAAAAA
Initiation de la traduction Elongation de la traduction
Figure I1-14. Modes d'actions des complexes AGO/sARNs pour l'inhibition
post-transcriptionnelle de l'expression des gènes. A. La protéine AGO est capable de
cliver l'ARNm cible du sARN de part son activité slicer. Les fragments d'ARNm sont
ensuite dégradés par la machinerie du métabolisme des ARN. B. Les complexes miRNP
ou siRNP peuvent bloquer la traduction des ARNm cibles.

A.
D. E.
B.
Figure I1-15. Diversité des fonctions du RNA silencing chez les plantes. A. Défense contre l’infection
virale. Les plants de tabac infectés précocement par le TRV sont « immunisés » lors d’une infection ulterieure
au niveau de jeunes feuilles. D’après Wingard, 1928. B. Régulation de l’expression des transposons. Barbara
McClintock, prix Nobel de médecine 1983 pour la découverte des transposons chez le maïs. C, E. Rôle des
microARNs dans le développement. C. Le mutant phb n’est plus sensible à la régulation par miR166.
L’accumulation de l’ARNm PHB dans les régions abaxiales conduit à la perte de la polarité foliaire d’après
Baulcombe, 2002. E. L'expression d'un ARNm CUC2 resistant au clivage par miR164 conduit à la perte du
meristème apical (plantule de droite). D'après Laufs et al., 2004. D. Rôle du RNA silencing dans la réponse aux
bactéries pathogènes. Plantes infectées par une bactérie pathogène : le mutant dcl1, affecté dans la voie des
miARNs, est hypersensible à l’infection par rapport au sauvage. D’après Navarro et al., 2008.
C.

groupe genre virus suppresseur (VSR) mode d'action références
Cucumovirus CMV 2b local et systémique Brigneti, et al. , 1998
Polerovirus BWYV P0 local Pfeffer et al. , 2002;
ARN (+)
Potexvirus
Potyvirus
PVX
PVY, TEV
P25
Hc-Pro
systémique
local, systémique
Voinnet et al. , 2000
Anandalakshmi et al. ,1998;
Kasschau & Carrington,1998;
Brigneti et al ., 1998.
Tombusvirus TBSV P19 local, systémique Voinnet et al .,1999.
Tableau I1-4. Quelques inhibiteurs viraux du RNA silencing VSR (Viral Suppressor of RNA
silencing).

stress
froid
Stress oxydant
sucrose
sARN
sARN
miR165/miR166
miR169
miR172
miR159/319
miR393
miR396
miR402
protéine ayant un effet négatif
pour la réponse au stress
protéine ayant un effet positif
pour la réponse au stress
HD-ZIPIII
Réponse adaptative à
l'environnement
Figure I1-16. Les premiers exemples qui illustrent le rôle du RNA silencing dans la réponse aux
stress abiotiques .
AP2
F-box
HAP2
MYB/TCP
rhodenase
ROS1-like
miR397 laccase
miR408
miR857
miR398
Floraison précoce
laccase, plantocyanine
laccase
Détoxyfication des ROS
sel nat-siARN P5CDH Accumulation de Proline
carence en S miR395 APS, SULT Accumulation de Soufre
SOD
Arrêt du développement
carence en Pi miR399 UBC24 ? Accumulation de Phosphate

Polysomes
TRADUCTION
Stress Granules
STOCKAGE
mRNPs
cytoplasmiques
P-bodies
DEGRADATION
Figure I1-17. Différents états des mRNP cytoplasmiques et importance des
granules à ARN.

I2_Réponses à la lumière
Dans le cadre de la deuxième partie de mon travail, nous avons souhaité étudier le rôle des
régulations post-transcriptionnelles dans la réponse aux stress environnementaux. En
particulier, nous nous sommes intéressés à la réponse à l’environnement lumineux, qui
représente une constante tout au long de la vie des organismes photosynthétiques.
I2_REPONSES A LA LUMIERE
Les plantes, de part leur mode de vie sessile, sont particulièrement exposées aux conditions
environnementales. L’intensité lumineuse est un facteur crucial pour la croissance des plantes
qui varie énormément dans l’environnement naturel. D’une part en fonction de la position de
l’organisme dans son écosystème (sous la canopée, directement exposé au soleil, en Islande, à
Marseille…), mais également du fait des variations rapides et non prévisibles inhérentes à
l’environnement (soleil/nuages).
Dans cette partie seront introduits les mécanismes de la photosynthèse oxygénique et les
réponses mises en place par les plantes supérieures face aux changement de quantité de
lumière. Enfin l’importance de la communication entre chloroplaste et noyau sera abordée.
I. PHOTOSYNTHESE OXYGENIQUE
L’ensemble de la vie terrestre dépend de l’énergie lumineuse délivrée par le soleil via la
production de composés organiques et de di-oxygène par les organismes photosynthétiques.
La photosynthèse oxygénique est apparue il y a trois milliards d’années, avec l’acquisition par
les cyanobactéries de la capacité de photolyser l’eau en lui arrachant électrons et protons. Ce
sont les cyanobactéries photosynthétiques ancestrales qui ont permis a notre atmosphère de
s’enrichir en di-oxygène.
1. PHOTOSYNTHESE OXYGENIQUE
Pour les plantes vertes, les algues, et les cyanobactéries, la photosynthèse constitue la base de
l’autotrophie. C’est l’eau qui est utilisée comme premier donneur d’électrons pour réduire in
fine le CO2 en hydrates de carbone, particules élémentaires de la biomasse, et générer du
dioxygène suivant la réaction suivante :
nH2O+nCO2+lumière(CH2O)n +nO2
La photosynthèse peut-être divisée en deux phases, qui se déroulent dans deux compartiments
du chloroplaste (Figure I2-1). La phase lumineuse, strictement dépendante de la lumière, au
cours de laquelle les électrons sont transportés à travers les photosystèmes (PSII et PSI) pour
40

I2_Réponses à la lumière
produire de l’ATP et du pouvoir réducteur sous forme de NADPH suivant les réactions
suivantes :
2NADP + +2H2O+lumière2NADPH+O2+2H +
ADP+Pi+énergieATP
La phase carbonique, indépendante de la lumière, permet de réduire le CO2 atmosphérique en
hydrates de carbone grâce à l’utilisation de l’ATP et du NADPH (cycle de Calvin) :
3CO2+9ATP+6NADPHGAP+9ADP+8Pi+6NADP +
Au cours de mon travail, je me suis intéressée à une famille de protéines impliquées dans la
collecte de la lumière au cours de la phase claire de la photosynthèse, qui sera détaillée ciaprès.
2. LA PHASE CLAIRE DE LA PHOTOSYNTHESE
Quatre complexes membranaires (PSII, complexe cytochrome b6/f, PSI et ATP synthase),
enchâssés dans la membrane thylakoïde du chloroplaste, catalysent l’ensemble des processus
de collecte de la lumière, photolyse de l’eau et transport des électrons, qui conduisent à la
conversion de l’énergie lumineuse en énergie chimique sous la forme de molécules
énergétiques et réductrices : ATP et NADPH (Figure I2-2).
La capacité des photosystèmes à capturer et à transmettre l’énergie lumineuse jusqu’au core,
qui contient le centre réactionnel (CR), dépend de complexes protéiques transmembranaires
riches en pigments nommés antennes ou Lhc (Light harvesting complex) (Figure I2-2).
Les pigments sont des molécules colorées dont la fonction est de capturer la lumière afin de
l’utiliser pour la photosynthèse ou pour protéger la plante. Chez les organismes
photosynthétiques on classe les pigments en quatre groupes en fonction de leur structure
chimique :
- les tetrapyrroles, comme les chlorophylles,
- les caroténoïdes comme le β-carotène, aux fonctions photoprotéctrices,
- les composés polyphénoliques, comme les anthocyanes,
- les alcaloïdes, comme les bétalaïnes.
a. ABSORPTION DE LA LUMIERE ET UTILISATION DE L’ENERGIE LUMINEUSE.
Au cours du XXe siècle, la physique quantique a mis en évidence que le rayonnement
lumineux est à la fois ondulatoire et particulaire. Les particules d’énergie lumineuse sont
nommées photon. Chaque photon renferme une quantité d’énergie :
E=hν
41

I2_Réponses à la lumière
Où h est la constante de Planck (6.626*10 -34 J.s -1 ) et ν la fréquence de la radiation (en cycles
par seconde s -1 ).
L’absorption d’un photon par une chlorophylle (Chl) confère au pigment un état énergétique
plus élevé 1 Chl * (Figure I2-4). Les 1 Chl * peuvent se désexciter et retourner un état stable de
basse énergie ou passer par un état de niveau énergétique intermédiaire, l’état triplet. L’état
triplet ( 3 Chl*), a un temps de vie plus long que l’état singulet mais est très réactif, en
particulier au contact de molécules d’O2. Pour se désexciter, le pigment à l’état singulet 1 Chl*
a plusieurs possibilités : dissiper son énergie sous forme de chaleur, émettre de la
fluorescence, passer par un état transitoire triplet ou utiliser son énergie pour la photochimie,
comme dans le cas de la photosynthèse. C’est la rapidité des mécanismes qui favorise l’une
ou l’autre de ces voies de désexcitation. Dans le cas des pigments, l’émission de fluorescence
se passe en un temps de l’ordre de la nanoseconde (10 -9 ), tandis que la voie photochimique est
de l’ordre de la centaine de picosecondes (10 -10 ). La photosynthèse est donc favorisée en
conditions normales.
b. LES COMPLEXES ANTENNAIRES LHC
Les antennes photosynthétiques sont les composants des photosystèmes qui permettent la
capture de la lumière et transmettent l’énergie au centre réactionnel. Les Lhc sont des
complexes protéiques riches en pigments enchâssés dans la membrane thylakoïde (Figure I2-
2). Au sein de l’antenne, un pigment capture l’énergie lumineuse d’un photon et, par
résonnance, cette énergie est transférée de pigment à pigment jusqu’au centre réactionnel.
Pour deux pigments séparés par 1.5 Å, le temps nécessaire au transfert d’énergie est de l’ordre
de la picoseconde.
Les protéines Lhc sont codées par une large famille de gènes nucléaires chez A. thaliana
nommés Lhca et Lhcb, respectivement pour les antennes du PSI et PSII. Chez les plantes
vasculaires, on connaît aujourd’hui six classes de protéines antennes pour le PSI (Lhca1-6) et
six pour le PSII (Lhcb1-6). Les gènes Lhc ont été dupliqués au cours de l’évolution et chaque
antenne peut-être codée par un ou plusieurs gènes (Klimmek et al., 2006; Alboresi et al.,
2008). Les protéines de la famille Lhc ont une structure conservée avec trois hélices
transmembranaires (Figure I2-3).
3. ORGANISATION SPATIALE DE LA PHASE CLAIRE DANS LE CHLOROPLASTE
Les complexes protéiques dans les membranes thylakoïdes sont organisés de manière
asymétrique, ce phénomène est nommé « hétérogénéité latérale ». Le PSI se situe au niveau
de membranes thylakoïdes dites stromales, c’est-a-dire non empilées. Au contraire, le PSII est
42

I2_Réponses à la lumière
principalement localisé au niveau des membranes dites granales, c’est-à-dire au niveau de
membranes thylakoïdes empilées les unes sur les autres (Figure I2-1).
Les membranes thylakoïdes, bien que très organisées, sont extrêmement flexibles en terme de
structure et de fonctions. Les changements conformationnels des protéines membranaires, les
interactions entre les complexes ainsi que les modifications au niveau du contenu protéique
des membranes, permettent de réguler finement la photosynthèse.
II. FORTE LUMIERE = STRESS LUMINEUX
1. POURQUOI TROP DE LUMIERE TUE LA PLANTE
En réponse à la forte intensité lumineuse, très courante dans l’environnement naturel, les
plantes absorbent plus d’énergie qu’elles ne sont capables d’en utiliser pour la photosynthèse.
L’excès de pigments à l’état excité, et l’impossibilité d’emprunter la photosynthèse, déjà
saturée, comme voie de désexcitation conduit à l’accumulation de forme triplet 3 Chl* (Figure
I2-4). On estime que l’énergie de 4% à 25% des photons absorbés au niveau du PSII peut-être
dissipée via la formation de 3 Chl* en fonction des conditions environnementales (Niyogi,
2000). Dans certains cas, ces formes intermédiaires stables transmettent leur énergie à une
molécule de dioxygène pour se désexciter, entrainant ainsi la formation d’oxygène singulet
1
O2*(Figure I2-4). Cet état excité de l’oxygène peut réagir avec de nombreuses molécules
pour former des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui, à leur tour, peuvent oxyder de
nombreux composants cellulaires (protéines, lipides, pigments) et endommager gravement les
cellules.
Bien qu’étant un paramètre essentiel pour la survie des plantes, la lumière en excès peut donc
représenter un danger pour l’organisme. Les plantes ont du mettre au point un ensemble de
réponses dites de photoprotection afin de s’adapter aux conditions de lumière.
2. LE ROLE PROTECTEUR DES CAROTENOÏDES
Les caroténoïdes sont capables d’accepter l’énergie des 3 Chl* ou de 1 O2* et ainsi de prévenir
la formation de ROS en suivant les réactions suivantes :
+ 1 Car
3 Chl*+ 3 O2Chl+ 1 O2*
+ 1 Car
43

I2_Réponses à la lumière
Le caroténoïde se désexcite ensuite en dissipant de la chaleur :
3Car*1Car+chaleur
Parmi les caroténoïdes, la zeaxanthine et la violanxanthine répondent très spécifiquement au
stress et joue un rôle important dans la photoprotection.
3. EVOLUTION DE LA SUPERFAMILLE DES LHC‐LIKE ET PHOTOPROTECTION
Les protéines Lhc jouent un double rôle : d’une part elles sont responsables de la collecte de
la lumière grâce à la liaison de chlorophylles, d’autre part elles sont impliquées dans la
photoprotection de part la liaison de caroténoïdes (Figure I2-5). Parmi les Lhc présentes chez
Arabidopsis, il semble que certaines demeurent plus spécialisées dans la photoprotection que
dans la capture de la lumière (Bassi et al., 1993; Horton and Ruban, 2005).
D’autres protéines sont associées à la superfamille des protéines antennes. Les gènes HLIP de
cyanobactéries ainsi que les gènes Lil2 de plantes codent pour des protéines contenant une
seule hélice transmembranaire que l’on peut considérer comme les ancêtres des Lhc (Horton
and Ruban, 2005). Le gène Lil3, issu d’une duplication, code pour une protéine à deux hélices
transmembranaires. La protéine PsbS, elle, est peut-être issue d’un événement de duplication
supplémentaire car elle possède quatre hélices transmembranaires. Enfin, on pense que les
protéines ELIP ont évolué à partir d’un ancêtre à quatre hélices, après délétion d’une hélice.
On ne sait pas à l’heure actuelle si ces protéines associées à la tolérance au stress sont
capables de lier des chlorophylles. Cependant, il est très possible qu’elles aient acquis la
capacité à lier des caroténoïdes. De plus, l’accumulation des protéines ELIP chez Arabidopsis
a été corrélée avec l’accumulation de xanthophylles (Montane et al., 1998).
On peut penser que les Lhc ont évolué à partir de ces protéines de réponse au stress, en
perdant la liaison a de nombreux caroténoïdes et en acquérant la capacité de lier des
chlorophylles (Figure I2-5). La protéine LHCF de diatomée représente une étape
intermédiaire de cette évolution. Elle lie quelques chlorophylles et toujours de nombreux
caroténoïdes. Il semble que LHCF ait conservé la fonction de photoprotection (elle
s’accumule en réponse au stress) tout en ayant acquis la fonction de collecter la lumière grâce
a la présence de chlorophylles.
III. ACCLIMATATION AUX DIFFERENTES CONDITIONS DE LUMIERE
Les organismes photosynthétiques ont mis en place de nombreux mécanismes de réponses
aux changements de conditions lumineuses. En condition de faible lumière, les complexes des
44

I2_Réponses à la lumière
membranes thylakoïdes doivent collecter et utiliser un maximum d’énergie lumineuse
disponible. Au contraire, en condition de forte lumière, les complexes reçoivent plus
d’énergie qu’ils ne peuvent en utiliser pour la photosynthèse. La plante doit alors mettre en
place un ensemble de réponses pour limiter l’énergie collectée et/ou la dissiper, c’est la
photoprotection.
On différencie les mécanismes de réponses rapides (Horton et al., 2008; Kargul and Barber,
2008) et les mécanismes de réponses à long terme (Walters, 2005; Dietzel et al., 2008), en
fonction du temps requis pour leur mise en place et de la nécessité ou non de synthèse
protéique de novo. L’ensemble des réponses à long terme correspondent à l’acclimatation.
Elles comprennent notamment le remodelage de l’appareil antennaire et la biosynthèse de
pigments photo-protecteurs tels que les anthocyanes. Dans les temps courts, la cellule n’a pas
la possibilité de limiter la quantité d’énergie absorbée en remodelant les antennes. En réponse
à la forte lumière, il est donc nécessaire de dissiper l’énergie en excès sous forme de chaleur,
grâce a la présence de caroténoïdes. En réponse à la faible lumière ou à des variations de la
qualité de la lumière, le déséquilibre entre le niveau d’excitation des deux photosystèmes est
réparé par un mécanisme de réponse rapide qui déplace les Lhc du PSII vers le PSI : la
transition d’état.
Mon travail a plus particulièrement porté sur les régulations mises en place au cours de
l’acclimatation, je n’introduirai donc pas ici les réponses rapides telles que le NPQ (non
photochemical quenching) et la transition d’état. Le NPQ englobe l’ensemble des mécanismes
de dissipation d’énergie sous forme de chaleur. Ces mécanismes sont également importants
pour la réponse au stress à long terme car certains remodelages du système antennaire
pourraient favoriser le NPQ. Ces mécanismes sont encore peu connus mais il semble que
certaines protéines telles que PsbS jouent un rôle important dans la photoprotection à long
terme lors de l’acclimatation à al forte lumière.
1. REMODELLAGE DE L’APPAREIL PHOTOSYNTHETIQUE EN REPONSE A LA LUMIERE
Chez les plantes supérieures, la composition et l’organisation de l’appareil photosynthétique
varient en fonction des conditions environnementales, et tout particulièrement en réponse à
des changements de lumière. Cette réorganisation implique la synthèse de novo de certaines
protéines chloroplastiques mais aussi la dégradation certaines autres. On pense que ces
changements permettent à l’organisme de mieux s’adapter aux conditions de lumière mais on
ne dispose que de très peu de données pour valider cette hypothèse. En réalité, les
45

I2_Réponses à la lumière
mécanismes qui sous-tendent l’acclimatation sont beaucoup moins bien décrits que ceux qui
permettent des réponses rapides au stress lumineux.
Les plantes mettent en place de nombreuses réponses adaptatives non seulement à la lumière,
mais aussi en réponse à de nombreux stress tels que la température, la sécheresse. Chacune de
ces conditions environnementales inhibe partiellement la photosynthèse et donc génère du
stress oxydant. Bien que ne sera développé ici que le cas de l’acclimatation à la lumière, il est
important de garder à l’esprit que de nombreuses voies de signalisation peuvent se croiser
pour donner lieu à l’acclimatation, ce qui peut rendre l’interprétation des données difficile.
a. ACCLIMATATION A LA FORTE LUMIERE
Chez Arabidopsis, on considère que la photosynthèse est saturée à partir de 600-700µE
(Walters, 2005). La croissance en forte lumière entraine un ensemble de réponses qui visent à
augmenter le flux maximum d’énergie convertie par photochimie tout en limitant les photodommages.
En forte lumière, la quantité des complexes protéiques responsables de la phase
lumineuse augmente (PSII et complexe cyt. b6/f, ATP synthase), ainsi que certaines enzymes
de la phase de fixation du carbone (Rubisco). En parallèle, la quantité de LHCII diminue et on
observe une augmentation du ratio Chla/Chlb (Walters, 2005). La croissance en très forte
lumière (>700µE) conduit à une réorganisation des antennes du PSII qui va jusqu’à la forte
diminution des antennes mineures telles que Lhcb6 (Bailey et al., 2001; Ballottari et al.,
2007).
A noter que l’investissement d’énergie dans la synthèse protéique en forte lumière entraine
probablement un baisse de la capacité de l’appareil photosynthétique à répondre aux stress
environnementaux (Lopez-Maury et al., 2008).
b. ACCLIMATATION A LA BASSE LUMIERE
En réponse a la faible lumière, le ratio LHCII/CRII augmente ainsi que la quantité de grana au
niveau des membranes thylakoïdes, permettant ainsi d’optimiser l’utilisation de l’énergie
lumineuse incidente. La croissance en très faible lumière conduit aussi à l’augmentation de la
quantité de PSI (Bailey et al., 2001). Ceci suggère que l’abondance des LHCII augmente la
capture de la lumière et que l’augmentation du ratio PSI/PSII augmente l’efficacité de
l’utilisation de la lumière absorbée. D’autre part, l’augmentation d’antennes capables de lier
des Chlb et xanthophylles, qui absorbent à des longueurs d’ondes différentes des Chla et βcarotène
pourraient permettre d’augmenter, bien que faiblement, la quantité d’énergie
capturée (Walters, 2005).
46

I2_Réponses à la lumière
Enfin, en faible lumière, la baisse de la synthèse de complexes protéiques de la phase claire et
de la phase de fixation du carbone évite l’investissement inutile d’énergie dans la traduction.
L’énergie ainsi que les ressources, en acides aminés principalement, peuvent ainsi être
réinvesties dans d’autres organes de la plante.
2. ANTHOCYANES ET FORTE LUMIERE
Les anthocyanes représentent une classe de flavonoïdes hydrosolubles qui est responsable des
couleurs orange à bleu que l’on retrouve au niveau de nombreux tissus tels que les fleurs, les
fruits, les graines et les feuilles. En réponse à la très forte lumière, les plantes accumulent des
anthocyanes au niveau des feuilles (Figure I2-6).
a. ROLES DES ANTHOCYANES DANS LES TISSUS PHOTOSYNTHETIQUES
Les fonctions des anthocyanes dans la pigmentation des tissus reproducteurs et des graines ont
été largement décrites (Lepiniec et al., 2006). Elles semblent destiner à attirer les animaux
dans le but de polliniser ou de disperser les graines. Cependant la fonction de l’accumulation
transitoire d’anthocyanes dans les tissus photosynthétiques reste peut connue. Le
rougissement des tissus chlorophylliens peut être lié à des processus développementaux ou a
la réponse a l’environnement. Dans le premier cas, les jeunes feuilles peuvent accumuler des
anthocyanes qui disparaissent au cours de la maturation. D’autre part, des feuilles sénescentes
peuvent également accumuler des anthocyanes. Dans le cas de la réponse à l’environnement,
les anthocyanes peuvent s’accumuler au niveau des feuilles en réponse à des blessures, à une
attaque de pathogènes, à une carence nutritive, à l’irradiation par des UV-B ou dans la
réponse à la forte lumière (Steyn et al., 2002; Gould, 2004). C’est à ce dernier cas que je me
suis particulièrement intéressée.
Malgré la mise en place des nombreuses réponses à l’excès de lumière citées précédemment,
il se peut que la plante se trouve débordée par un excès de lumière prolongé. Dans ce cas, les
anthocyanes s’accumulent et jouent le rôle d’un écran solaire qui diminue l’énergie lumineuse
excitatrice au niveau du chloroplaste. Les anthocyanes s’accumulent majoritairement au
niveau de l’épiderme, formant une couche de cellules protectrices. Les anthocyanes peuvent
jouer un double rôle photoprotecteur : d’une part en filtrant la lumière, et d’autre part en
capturant les ROS grâce à leurs fonctions anti-oxydantes.
• Les anthocyanes filtrent la lumière
Les anthocyanes absorbent le vert (520-540nm) et les UV et dans une moindre mesure le bleu
et le rouge. Ainsi l’accumulation d’anthocyanes modifie la quantité et la qualité de la lumière
47

I2_Réponses à la lumière
absorbée au niveau des chloroplastes (Steyn et al., 2002). L’âge et l’épaisseur des feuilles,
ainsi que leur capacité à mettre en place des fonctions photoprotectrices au niveau des
différentes couches cellulaires, doivent déterminer le rôle de l’accumulation des anthocyanes
pour le maintien de la photosynthèse.
• Les anthocyanes sont des antioxydants
Les anthocyanes sont de puissants antioxydants in vitro (Steyn et al., 2002). In vivo, le
pouvoir antioxydant des anthocyanes au niveau des feuilles n’a pas été directement démontré.
Le fait que les anthocyanes soient stockées dans la vacuole, tandis que la majeure source de
ROS est le chloroplaste, interroge sur la localisation intracellulaire de la possible
détoxification. La fonction in vivo des anthocyanes dans la photoprotection demeure délicate à
analyser expérimentalement car elles sont coproduites avec de nombreux produits de leur voie
de biosynthèse qui pourraient être de bons candidats pour la photoprotection. Des analyses
fines de biophysique et de génétique devraient permettre de répondre a ces questions.
b. BIOSYNTHESE DES ANTHOCYANES ET REGULATIONS TRANSCRIPTIONNELLES
La structure chimique de base des anthocyanes est constituée d’une chaine carbonée de type
C6-C3-C6 tricyclique liée à des groupements variables (Figure I2-6B). Les précurseurs
anthocyanidines sont le plus souvent glycosylés pour former les anthocyanes. La couleur des
anthocyanes varie en fonction du pH et de la présence de co-pigments (autres flavonoïdes) ou
de cofacteurs métalliques. In vitro, les anthocyanidines sont rouges et sous leur forme stable à
pH acide, incolores entre pH trois et pH 6, et bleues et instables à pH basique (Tanaka et al.,
2008). La voie de biosynthèse des flavonoïdes, qui se déroule dans le cytoplasme, est bien
caractérisée et conservée parmi les plantes à graines.
Chez la plupart des plantes, l’accumulation des anthocyanes est limitée à certains tissus.
L’activation de la voie de biosynthèse est cellule autonome et est induite par des stimuli
extérieurs tels que la lumière.
Parmi les gènes de la voie de biosynthèse des anthocyanes on distingue deux catégories de
gènes corégulés : les gènes précoces (Early Biosynthetic Genes, EBGs) et les gènes tardifs
(Late Biosynthetic Genes, LBGs) (Figure I2-7) (Lepiniec et al., 2006). On connaît de
nombreux facteurs de transcription impliqués dans la régulation de l’expression de ces gènes
structuraux. En particulier, l’expression des LBGs est régulée par un complexe
transcriptionnel MBW à trois partenaires : une protéine R2R3-MYB, une protéine b-HLH
(basic helix-loop-helix), et une protéine WD40. L’expression des WD40 et b-HLH est
48

I2_Réponses à la lumière
pléiotropique, il semble que ce soit la présence tissu spécifique du facteur R2R3-MYB qui
soit déterminante pour l’activation localisée de la voie. Dans le cas de la biosynthèse des
anthocyanes au niveau de tissus végétatifs, la protéine WD40 dans le complexe MBW est
invariablement TTG1, tandis que l’identité des deux autres partenaires est variable (Figure I2-
7). La formation du complexe MBW actif pour l’activation de la transcription est régulée par
la disponibilité du partenaire b-HLH. En effet il semble que celui-ci puisse être séquestré par
une autre protéine de type R3-MYB, limitant ainsi la formation du complexe à trois
partenaires (Koes et al., 2005) (annexe 1).
3. REGULATIONS POST‐TRANSCRIPTIONNELLES ET ACCLIMATATION A LA LUMIERE
L’acclimatation est un mécanisme complexe qui peut intégrer de nombreux signaux
environnementaux et coordonner la régulation de l’expression de gènes chloroplastiques aussi
bien que nucléaires. Il semble évident que l’acclimatation est finement régulée.
Un certain nombre de données laissent penser que la régulation traductionnelle joue un rôle
dans la réponse à la lumière. La première évidence de l’existence d’une régulation posttranscriptionnelle
impliquée dans l’expression des LHCII provient d’une étude réalisée chez
le tabac qui a montré que l’accumulation des ARNm Lhcb1.2 n’est pas corrélée à celle des
protéines correspondantes (Flachmann and Kuhlbrandt, 1995). Par la suite, un découplage
entre transcription et traduction a également été observé chez des plants de tabac exprimant la
ferrédoxine sous le contrôle d’un promoteur fort 35S. En effet, ces plants transcrivent de
manière constitutive le gène Fed1 mais c’est l’exposition à la lumière qui induit la traduction
des ARNm (Petracek et al., 1997). Le chargement dans les polysomes des ARNm Fed1 est
inhibé par le DCMU, un inhibiteur du transport d’électrons au niveau des complexes
photosynthétiques, ce qui indique que le signal d’activation de la traduction est bien
dépendant de l’activité photosynthétique. La même étude a montré que les ARNm Lhcb
s’accumulent également dans les fractions polysomales en réponse à la lumière. D’autres
transcrits régulés traductionnellement en réponse à la lumière ont également été identifiés
chez le tabac, parmi eux de nombreux ARNm codant pour la machinerie photosynthétique
(Tang et al., 2003). Toujours chez le tabac, un motif présent en 5’-UTR d’un sous-ensemble
d’ARNm a été identifié comme étant responsable de la régulation traductionnelle en réponse à
la lumière (Bhat et al., 2004). Chez l’algue unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii, des
travaux récents ont également permis de mettre en évidence l’importance des régulations
traductionnelles pour l’expression des Lhc ainsi que d’une superoxide dismutase
chloroplastique en réponse à la lumière (McKim and Durnford, 2006). De plus, une protéine
49

I2_Réponses à la lumière
de liaison à l’ARN, NAB1, a est impliquée dans le chargement des ARNm Lhcbm dans les
polysomes (Mussgnug et al., 2005). Enfin chez l’orge, la comparaison d’analyses de
transcriptome et de protéome a révélé que l’expression des antennes photosynthétiques est
régulée post-transcriptionnellement via l’état redox du pool de plastoquinones (PQ) (Frigerio
et al., 2007).
Bien que l’importance des régulations traductionnelles en réponse à la lumière ait été
plusieurs fois mise en évidence chez différents organismes photosynthétiques aucune étude
n’a été réalisée chez A. thaliana (Wobbe et al., 2008).
A travers notre étude, nous avons souhaité mettre en évidence l’existence de régulations
traductionnelles impliquées dans l’expression des antennes Lhc chez Arabidopsis. Nous
souhaitons analyser les régulations impliquées dans l’expression de l’ensemble de la famille
des Lhc et ainsi disposer de données qui amélioreront la compréhension du rôle spécifique de
chaque Lhc dans la collecte de la lumière et la photoprotection. A plus long terme, nous
souhaiterions identifier la nature du signal, provenant du chloroplaste, qui module la
traduction de certains transcrits dans le cytoplasme.
IV. ENDOSYMBIOSE ET NECESSITE DE LA SIGNALISATION
RETROGRADE
Selon la théorie endosymbiotique, les plastes ainsi que les mitochondries ont évolué à partir
de bactéries ayant été internalisées dans une cellule eucaryote primitive. Le génome ancestral
de ces ex-procaryotes, devenus des organelles, contenait l’ensemble de l’information
génétique nécessaire à leur vie autonome (Figure I2-8) (Dyall et al., 2004). Cependant, au
cours de l’évolution, une grande partie des génomes des organelles a été transférée vers le
génome nucléaire. A l’heure actuelle, le génome plastidique des plantes supérieures porte
moins de cent gènes tandis que plus de trois mille protéines chloroplastiques sont codées par
le noyau et importées après avoir été traduites dans le cytoplasme. Afin que la photosynthèse
se déroule dans de bonnes conditions, il est crucial que l’expression des gènes soit finement
co-régulée entre génomes chloroplastiques et nucléaire. En effet, des enzymes clés de la
photosynthèse, telles que la Rubisco, sont composées de sous-unité codées par les deux
génomes. En réponse à des changements d’intensité lumineuse par exemple, il est essentiel
que le chloroplaste envoie au noyau un ensemble de signaux indiquant à celui-ci de réguler
l’expression des gènes codant des protéines chloroplastiques.
50

I2_Réponses à la lumière
L’étude des moyens de communication entre les organelles et le noyau demeure un domaine
de recherche très actif. On distingue la voie antérograde, du noyau vers les organelles, de la
voie rétrograde, des organelles au noyau (Figure I2-8B) (Woodson and Chory, 2008).
L’existence d’une voie de communication du chloroplaste vers le noyau a été mise en
évidence par l’analyse du mutant albostrians d’orge dont les chloroplastes ne se développent
pas. Les cellules qui contiennent les chloroplastes albinos ne transcrivent plus les gènes
nucléaires qui codent pour les protéines de la photosynthèse. Bien que les mécanismes fins de
la communication rétrograde ne soient pas connus, on distingue quatre voies principales en
fonction de la nature des signaux impliqués : un précurseur de chlorophylle le MgprotoporphyrineIX
(Mg-Proto), des signaux générés par l’inhibition de l’expression des gènes
chloroplastiques (PGE), des signaux liés à l’accumulation de ROS, et des signaux redox. Les
deux premières voies, Mg-Proto et PGE, semblent impliquées dans la coordination de
l’expression des génomes chloroplastiques et nucléaires au cours du développement. Les
voies ROS et redox semblent être impliquées respectivement dans la réponse aux stress et à la
lumière (Woodson and Chory, 2008).
Très peu de données sont disponibles concernant la nature de la composante du signal
rétrograde capable de réguler la traduction cytoplasmique (Mussgnug et al., 2005; Frigerio et
al., 2007).
51

H2O
CO2
hυ
Phase lumineuse
(membranes thylakoïdes)
ATP
NADPH
Phase carbonique
(stroma)
Figure I2-1. La photosynthèse oxygénique. Représentation schématique des deux phases de la
photosynthèse oxygénique au sein du chloroplaste. L'énergie lumineuse (hυ) est nécessaire à la
synthèse d'ATP et de NADPH. Cette énergie chimique est ensuite utilisée au cours des réactions de
la phase de fixation du carbone inorganique pour la production de sucres.
O2
granum
CH2O
chloroplaste

A.
B.
stroma
hυ hυ
H2O
lumen
PSII
e-
1/2O2
2H+
+
PQ
membrane thylakoïde
2H+
PQ H2
2H+
b6f
2H+ 2H+
NADP+
PC PC-
PSI
Figure I2-2. La phase lumineuse de la photosynthèse. A. Représentation schématique de l'organisation des
quatre complexes multiprotéiques impliqués dans la chaine de transport d'éléctrons et dans la production d'ATP au
niveau de la membrane thylakoïde. De gauche à droite : le photosystème II (PSII), le complexe du cytochrome b6/f
(b6/f), le photosystème I (PSI), et l'ATP synthase (ATP synth.). Les transporteurs mobiles sont également
représentés : les plastoquinones membranaires (PQ) et les plastocynaines hydrosolubles (PC). En rouge est
représenté le transfert des éléctrons (e-) arrachés à l'eau, en bleu le tranport de protons (H+). B. Représentation des
complexes photosynthétiques. A gauche, le PSI d'après la structure d'Amunts et al., 2007. A droite, une
représentation du PSII (image de S. Caffarri). Les groupes de molecules bordés de vert représentent les complexes
antennaires Lhc.
NADPH
ADP
+Pi
ATP
synth.
ATP

A.
Lhcb5
Lhcb7
Lhcb3
Lhcb2.1-4
Lhcb1.1-5
Lhca3
Lhcb6
Lhcb4.3/Lhcb8
Lhcb4.1
Lhcb4.2
Lhca1
Lhca5
Lhca4
Lhca6
Lhca2
B.
stroma
C
D
N
lumen
membrane thylakoïde
Figure I2-3. Les protéines Lhc. A. Représentation de l'arbre phylogénétique des Lhc d'A. thaliana
adapté à partir d'Alboresi et al., 2008. B. Représentation schématique de la structure des protéines
Lhc. Les rectangles gris représentent les structure en hélices α.
A B
C

A. Conditions environnementales
normales (lumière contrôle)
B. Conditions environnementales
stressantes (forte lumière)
haute énérgie
basse énérgie
haute énérgie
basse énérgie
hυ
hυ
hυ
hυ
hυ hυ
1Chl*
Chl
1Chl*
Chl
Photosynthèse
Photosynthèse
Fluorescence 3Chl*
Chaleur
Fluorescence
Chaleur
3Chl*
1O2*
3O2
1O2*
1
1 O2*
O2*
Figure I2-4. Différentes voies de désexcitation de la chlorophylle. Après absorption de l'énergie d'un
photon, la chloroplylle passe dans un état excité de haute énérgie, l'état singulet (1Chl*). A. En
conditions normales, la voie de désexcitation majoritaire des chlorophylles est la photochimie. B. En
conditions d'apport d'énergie en excès, la photosynthèse est saturée et la chlorophylle se desexcite par
émission de fluorescence ou de chaleur. Dans de nombreux cas, elle passe par un état energétique
intermediaire, l'etat triplet (3Chl*). La chlorophylle triplet est extrement réactive et notamment elle
peut réagir avec des molécules de di-oxygène. Le di-oxygène à l'état singulet est une source de stress
oxydant qui représente un danger mortel pour la plante.
3O2

PHOTOPROTECTION COLLECTE LUMIERE
HLIP ELIP PsbS LHCF Lhcb4 Lhcb6 LHCII
carotenoïdes chlorophylles
Figure I2-5. Illustration de la spécialisation des protéines de la famille Lhc
dans la photoprotection ou la collecte de la lumière.

A.
Figure I2-6. Les anthocyanes. A. Les anthocyanes s'accumulent au niveau des feuilles en
réponse à la forte lumière. B. Structure chimique des anthocyanes. R3 et R5 représentent des
groupements variables.
B.
OH
OH
O +
OH
R5
OH
R3

A.
Phenylalanine 4x coumaroylCoA
B.
anthocyanes
pro
anthocyanidines
CHS
chalcone synthase
chalcone
CHI
chalcone isomerase
flavone
F3H
flavanone-3hydroxylase
F3'H
flavanone-3'hydroxylase
di-hydroflavonol
DFR
di-hydroflavonol reductase
leucoanthocyanidine
LDOX
leucoanthocyanidine oxydase TT18
anthocyanidine
ANR
anthocyanidine reductase BAN
flavan-3-ols
Partenaires MBWs pour la biosynthèse des anthocyanes chez
Arabidopsis
R2R3MYB
bHLH
WD40
MYB75/PAP1, MYB90/PAP2, MYB113, MYB114
GL3, EGL3, TT8
TTG1
gènes précoces
(EBGs)
gènes tardifs
(LBGs)
R2R3MYB/bHLH/WD40
Figure I2-7. Régulation transcriptionnelle de l'expression des gènes structuraux impliqués dans la voie de
biosynthèse des anthocyanes. A. La voie de biosynthèse des anthocyanes nécessite l'action d'un groupe de gènes
dont l'expression est induite précocemment (EBG Early Biogenesis genes) ainsi que d'un groupe de gènes dont
l'expression est induite plus tardivement (LBG Late biogenesis genes). B. La transcription des gènes structuraux
est régulée par trois facteurs de transcription associés en complexe (MYB/bHLH/WD40 MBW). La formation de
ce complexe actif est limitée par la séquestration du partenaire bHLH par un autre facteur MYB. Les facteurs de
transcription impliqués dans la biosynthèse des anthocyanes au niveau des tissus photosynthétiques sont présentés
dans le tableau.
TT4
TT5
TT6
TT7
TT3
bHLH/R3MYB

A.
B.
procaryotes
plantes
plaste
mitochondrie
SIGNAL
noyau
animaux
Signalisation antérograde
600 Ma
Eucaryotes pluricellulaires
1.2 Ga
Endosymbiose d’une cyanobactérie
1.5 Ga
Endosymbiose d'une α-proteobactérie
2.7Ga
Eucaryotes primitifs
~3.5Ga
Photosynthèse
~3.8Ga
Vie
Signalisation rétrograde
noyau
SIGNAL SIGNAL
Figure I2-8. Endosymbiose et signalisation entre noyau et organelles. A. L'endosymbiose
consiste en l'internalisation d'une cellule procaryote dans une cellule eucaryote primitive. Deux
évennements d'endosymbioses consécutives ont conduit à l'apparition des organelles :
mitochondrie et chloroplaste. Au cours de l'évolution une grande partie des génomes organellaires
ont été transférés au noyau. B. La signalisation est nécessaire pour coordonner l'expression de trois
génomes dans la cellule végétale. Nous nous sommes particulièrement interessés aux signaux
rétrogrades générés par le chloroplaste à destination du noyau.

I3_Régulations traductionnelles et RNA silencing
I3_MECANISMES DE LA REGULATION TRADUCTIONNELLE
GUIDEE PAR LES MIARNS, PROJET DE REVUE
BIBLIOGRAPHIQUE.
Various mechanisms for translation repression by miRNAs
1. INTRODUCTION
RNA silencing regulates gene expression in animals, plants and many other eukaryotes
organisms. Post-transcriptional regulation occurs through distinct classes of endogenous small
RNAs (sRNAs). Among them, 21nt microRNAs (miRNAs) are processed from non coding
double strand (ds)RNA precursors by a Dicer-like RNAse (Bartel, 2004). One strand of the
sRNA duplex is loaded into Argonaute (AGO) protein to form a silencing effector complex.
These ribonucleoproteic complexes, also called miRNPs, guide post-transcriptional silencing
of mRNA target by complementarity between sRNA and mRNA at regions termed miRNA
responsive elements (MREs). miRNAs have the capacity to trigger inhibition of expression of
mRNAs to which they bind either by directing endonucleolytic cleavage by Argonaute protein
(slicing), by inhibiting their translation, or by accelerating mRNA decay.
The prevailing model assumes that most plant miRNAs trigger mRNA cleavage while most
animal miRNAs affect gene expression by blocking translation of their target. Two recent
studies challenged this assumption by showing that translational regulation is a common
component of plant RNA silencing pathways. The aim of this review is to sum up current
knowledge about miRNA-guided translational regulation mechanism in animals as well as
recent advances in plants.
2. DISCOVERY OF MIR‐GUIDED TRANSLATIONAL REPRESSION AND THE PHYSICAL
ASSOCIATION OF RNA SILENCING MACHINERY AND TRANSLATIONAL MACHINERY
In animals, miRNA triggered translational blockage was first described in Caenorhabditis
elegans with the demonstration that the LIN-14 mRNA is regulated post-transcriptionally by
another small RNA, lin-4, first named as small temporary RNA. Lin-4, which was then
renamed micro-RNA, was found to be associated with translating polysomes (Olsen and
Ambros, 1999). Similarly, the translation of the C. elegans LIN-28 mRNA is repressed by lin-
4 and both LIN-28 and lin-4 associate with polysomes (Seggerson et al., 2002). Later, let-7
was identified as the second regulatory sRNA targeting heterochronic genes essential in worm
52

I3_Régulations traductionnelles et RNA silencing
development (Reinhart and Bartel, 2002). It appears that 3’-UTR region of LIN-41 is
sufficient to trigger regulation of a reporter gene. So it was suggested that lin-4 and let-7
trigger translational regulation of heterochronic genes expression to coordinate developmental
timing.
Drosophila RISCs co-purify with ribosomes (Hammond et al., 2000; Hammond et al., 2001)
and a fraction of siRNAs associates with polysomes in Trypanosoma brucei (Djikeng et al.,
2003). Furthermore, mammalian miRNPs have been shown to co-sediment with polysomes in
neuronal cell lines (Kim et al., 2004; Nelson et al., 2004). In plants few studies suggest that
RNA silencing in plants may also involve translational control (Aukerman and Sakai, 2003;
Chen, 2004; Lo et al., 2005; Schwab et al., 2005; Arteaga-Vazquez et al., 2006; Gandikota et
al., 2007). The first evidence for a physical link between RNA silencing and translational
machinery was given very recently (this work). In addition, translational repression induced
by plant miRNP was demonstrated by a unbiased forward genetic approach (Brodersen et al.,
2008).
3. TRANSLATION REGULATION DEPEND ON MRE …NOT TOTALLY RIGHT!
At first, miRNAs were thought to induce mRNA decay only when paired with transcripts that
are fully complementary. However, it is now clear that they have the capacity to trigger the
inhibition of expression of a variety of mRNAs to which they bind through perfect or nearperfect
complementarity. Animal mRNAs typically contain several MRE often in their 3’untranslated
region (3’-UTR) that anneal with a non-perfect complementarity to their target.
In these cases RNA silencing affect gene expression by slicing independent pathways. In
contrast in plants, most miRNAs lead to mRNA slicing by interacting with their target mRNA
through a single MRE, usually located in the protein coding region. In addition, plant
miRNAs recognize their targets with a near perfect sequence complementarity at MRE
(Tableau I3-1).
These observations lead to the idea that plant and animal miRNAs act in fundamentally
different ways. It was accepted that animal miRNA induced slicing-independent gene
silencing while plant miRNA trigger mRNA slicing. However, several examples indicate that
translational repression mechanism can occur in plants under particular circumstances.
miR156/157, that were found to repress translation of the SPL3 protein (Gandikota et al.,
2007), recognize MRE located in 3’-UTR of SPL3. Other plant miRNA, such as the miR854
53

I3_Régulations traductionnelles et RNA silencing
family conserved between plant and animals, were found to interact with conserved MRE
located in 3’UTR of target mRNA (Arteaga-Vazquez et al., 2006).
In animal cells, a mRNA containing a single MRE that is only partially complementary is
silenced by a factor of 2-3, whereas mRNAs that contain a fully complementary MRE are
generally silenced by a factor 10-20 (Doench et al., 2003). This indicates that the degree of
complementarity between miRNA and MRE is crucial for efficient slicing. In particular,
downregulation of transcripts is generally most effective when sRNA nucleotides #2-8 (the
seed region) can form canonical base pairs with MRE. and when sRNA have an opportunity
to function additively by bonding to multiple MRE in 3’UTR (Bartel, 2004). It was accepted
that perfect or near-perfect complementarity between plant miRNA and single MRE, usually
located in CDS, enables slicing and excludes a role for translational repression.
All these statements were challenged a first time with the observation that plant miR172 is
able to trigger cleavage of AP2 mRNA as well as translation block via MRE located in coding
sequence with perfect complementary with miR172 (Aukerman and Sakai, 2003; Chen,
2004). In addition, in human HeLa cells, the association of miRNPs with MRE artificially
integrated at any position on a reporter target mRNA is mechanistically sufficient to exert
repression of translation at some step downstream of initiation (Lytle et al., 2007). Finaly, the
discovery that plant miRNAs induce translational repression independently of the degree of
target complementarity or position within mRNA (Brodersen et al., 2008) definitely abrogate
the hypothesis that MRE number and location is the key determinant for translational
repression.
4. HOW MIR REPRESS TRANSLATION?
a. INITIATION?
How miRNPs repress translation remain unclear, although it is now accepted that they exert
their effects through a variety of mechanisms.
First, studies in human cells, have revealed that miRNA targets are shifted to lower molecular
weight polysomes compared to non miRNA-targeted mRNA (Pillai et al., 2005). In addition,
the same study shows that cap-independent translation is not subjected to let-7 repression,
suggesting that miRNPs interfere with recognition of the cap or require cap-recognition to
access to mRNA. Another study suggested that cap-independent translation, under the control
of an internal ribosomal entry site (IRES), may be insensitive to miRNA repression
(Humphreys et al., 2005). Using an in vitro translation system, Sonenberg’s group showed
54

I3_Régulations traductionnelles et RNA silencing
that translation initiation, specifically the m7G cap recognition process, is repressed by
endogenous let-7 miRNAs within the first 15 minutes of mRNA exposure to the mouse cell
extract, when no destabilization of the transcript is observed (Mathonnet et al., 2007). These
results indicate that inhibition of translation initiation is earliest molecular event affected by
miRNAs. In mammals and drosophila, two other groups provided evidences indicating that
miRNAs cause a cap-dependent obstacle to the recruitment of first ribosome on mRNA
(Thermann and Hentze, 2007; Wakiyama et al., 2007). The first one shows that inhibition of
cap-mediated translational initiation is the mechanism of miR2 mediated repression in cell
free system. In addition, they suggest that miRNA-mediated inhibition induces the formation
of miRNP complexes heavier than 80S, which they called pseudo-polsyomes (Thermann and
Hentze, 2007). The second study uses a mammalian cell-free system to recapitulate let-7
miRNA-mediated translational repression. They show that both cap and polyA tail are
required for translational repression, and that let-7 direct deadenylation of mRNA target
probably through recruitment of CAF1-CCR4-NOT complex (Wakiyama et al., 2007) (Figure
I3-1A). This work suggests that let-7 miRNPs, containing AGO and GW182, impairs
circularization of mRNA and thus inhibit translation initiation. Concordant with these results,
a genetic screen for suppressor of silencing in drosophila identified Ge-1, an activator of
decapping (Eulalio et al., 2007b). This indicates that miRNAs promote decapping and the
subsequent mRNA degradation. In addition, this work shows that some miRNAs targets are
stabilized in the absence of active translation, whereas others are nevertheless degraded.
Ortholog of Ge1, VARICOSE, was also identified in Arabidopsis as required for translational
repression by miRNAs (Brodersen et al., 2008).
Recent work has reinforced this hypothesis, describing links between RNA silencing
machinery and eiF4E, an essential translation initiation factor (Kiriakidou et al., 2007).
Within the Mid domain of human AGO proteins, a motif that bears significant similarities to
the m7G cap-binding domain (MC domain) of eiF4E has been identified. Conserved amino
acids residues within MC domain of hAGO2 are required for binding the m7G cap and for
translational repression but not affect the assembly of AGO2 with miRNA or its catalytic
activity. So hAGO2 can repress initiation step of translation by binding to the m7G cap of
mRNA targets, thus competing with recruitment of eiF4E (Figure I3-1B). Other mechanisms,
such as mRNA degradation, subsequently consolidate mRNA silencing. Recently,
biochemical and functional analysis proposed an alternative mechanism implicating
55

I3_Régulations traductionnelles et RNA silencing
translation initiation factor: the anti-initiation factor eiF6 (Chendrimada et al., 2007) (Figure
I3-1C).
b. ELONGATION??
Other studies have suggested that translation inhibition occurs after initiation. As indicated
previously, numerous studies demonstrate that miRNA-targeted mRNA are present in
translating polysomes in animal cells (Olsen and Ambros, 1999; Seggerson et al., 2002;
Maroney et al., 2006; Nottrott et al., 2006; Petersen et al., 2006) as well as in Arabidopsis. In
addition, repressed mRNAs are associated with polysomes that are engaged in translation
elongation, as shown by puromycin sensitivity (Maroney et al., 2006). By using nuclease
sensitivity, this work also shows that miRNAs are associated with polysomes through RNA,
probably by interacting with complementary regions of target mRNAs. Despite reports to the
contrary, translation driven by cap-independent processes (IRES driven) are still repressed by
siRNA (Petersen et al., 2006) as well as miRNA (Lytle et al., 2007). These results also
suggest that repression by siRNA is primarily due to premature termination or co-translational
degradation of nascent peptides (Nottrott et al., 2006; Petersen et al., 2006)(Figure I3-1D, E).
c. IMPORTANCE OF THE PROMOTER
Altogether, these contradictory results are difficult to explain. Some of these discrepancies
may be due to the disparate biological systems and methodologies used in various
laboratories. A recent study resolves this apparent dichotomy by demonstrating that the
promoter used to transcribe the mRNA influences the type of miRNA-mediated translational
repression (Kong et al., 2008). These data establish a link between the nuclear history of an
mRNA and the mechanism of miRNA-mediated translational regulation in the cytoplasm.
5. ACTIVATION ALSO
miRNAs are known to guide gene expression inhibition at post-transcriptionnal level.
Surprisingly, new data indicate that miRNPs can also stimulate translation under certain
conditions (Vasudevan et al., 2007). In proliferating mammalian cells, miR369-3 inhibit
protein synthesis under normal conditions by binding TNF-α mRNA (Vasudevan et al., 2007).
After serum starvation in the growth media, cell-cycle arrest and miR369-3 shift from
repression to activation of TNF-α translation. Thus, a miRNP that inhibit protein synthesis can
have the opposite effect depending on environmental signals. The mechanism by which
miRNP complex activates translation has not yet been determined.
56

I3_Régulations traductionnelles et RNA silencing
6. WHO ARE THE PROTAGONIST OF MIRNA INDUCED TRANSLATIONAL REGULATION?
a. AGO AND GW182
Argonaute is a highly conserved protein family that plays the central effector role in RNA
silencing. Some Ago proteins (AGO1, AGO2, AGO3, AGO4 in humans, and AGO1 in
drosophila) appear capable of mediating both translational repression and accelerated
deadenylation (Liu et al., 2004; Meister et al., 2004; Pillai et al., 2004). As previously
indicated, recent evidence suggests that the repression of translation initiation is in part due to
ability of many Ago proteins to bind mRNA cap structure and sequester it from translation
initiation factor eiF4E (Kiriakidou et al., 2007) (Figure I3-1B). Authors were not able to
identify cap binding motif in plant Ago protein. The first steps of translation initiation are
distinct between plant and animal. In animals, eiF4E can be sequestered by 4E-binding
protein to prevent translation initiation. In plants, no 4E-BP have been identified so far. We
can imagine that in plants Ago proteins do not bind mRNA cap structure but could
sequestered eiF4E.
However, Ago protein may not be the only effector of translational repression. Studies with
drosophila models reveal that although AGO1 is required for translational repression, this
requirement can be bypassed by tethering the RISC-associated protein GW182 directly to
mRNA in cells depleted of AGO1 (Behm-Ansmant et al., 2006). Thus GW182 appears to be
capable of inhibiting translation by an Ago-independent mechanism whose details are
unknown. Consistent with this conclusion, depleting mammalian or drosophila cells from
GW182 (or its paralog TNRC6B) impairs the ability of mi/siRNAs to downregulate gene
expression. (Jakymiw et al., 2005; Liu et al., 2005b; Meister et al., 2005; Rehwinkel et al.,
2005). In arabidopsis, AGO1 and AGO10 have been implicated in translational repression.
AGO1, a major slicer component of plant miRNPs, was found to be associated with
polysomes in Arabidopsis and ago1-27 hypomorphic mutant is specifically affected in
translational repression activity of AGO1 (Brodersen et al., 2008)XXX. Moreover, the closest
paralog of AGO1, AGO10, was also genetically implicated in miRNA guided translational
repression in Arabidopsis (Brodersen et al., 2008). In plants, there is still no evidence of a
GW182 ortholog.
b. MOV10/ARMITAGE AND RCK/P54
MOV10/Armitage, an RNA hélicase, and RCK/p54, homologous to yeast Dhh1, are both
RISC-associated proteins that contribute to translational repression (Coller and Parker, 2005).
Depletion of either of these proteins impairs gene silencing by miRNAs (Wu and Belasco,
57

I3_Régulations traductionnelles et RNA silencing
2008). In addition, MOV10 facilitates siRNA-guided Ago2 cleavage of mRNAs that are
perfectly complementary.
c. EIF6
eiF6 is a ribosome inhibitory protein known to prevent assembly of 80S ribosome. Recent
experiments shows that human miRNP associates with a complex containing MOV10 protein
(a translational repressor), ribosomal big subunit 60S, and eiF6 (Chendrimada et al., 2007).
Depletion of eiF6 in human cells specifically abrogates miRNA-mediated regulation of
mRNA target expression. Similarly in C. elegans, depletion of eiF6 diminishes lin-4 miRNAmediated
repression of LIN-14 and LIN-28. These results highlight an evolutionary conserved
function for ribosome anti-association factor eiF6 in miRNA mediated RNA silencing.
In plants, an eiF6 can be found by sequence homology, but nothing is actually known about
its function.
d. FXR1 AND TRANSLATIONAL INITIATION
FXR1 is an RNA binding protein of mammals homologous to the fragile X mental retardation
protein FMR1/FMRP (Vasudevan and Steitz, 2007; Vasudevan et al., 2007). FXR1 associates
with Ago2 and helps to mediate positive influence on translation under serum starved
conditions. Whereas the interaction of Ago2 with MRE appears to occur in both growtharrested
and proliferating cells, FXR1 has been found to associate with MRE only in cells that
are not growing (Vasudevan et al., 2007).
e. KATANINE ET THE CYTOSKELETON
Interestingly, in arabidospsis, a microtubule metabolism enzyme, KATANIN, was associated
with miRNA-induced translational repression (Brodersen et al., 2008). The mutant ktn1 was
found to overaccumulate miRNA targets at protein level while mRNA level is similar as wildtype.
We can easily imagine that a link between RNA silencing machinery and cytoskeleton
appears to be crucial for directing miRNP targets to RNA granules. In fact, examples in
animals also suggest a link between RNA silencing and cytoskeleton. Drosophila Armitage
protein, miRNP effector complex component, is associated with microtubules.
7. REVERSIBLE SILENCING IS BETTER
A significant fraction of translationally silent mRNAs are found concentrated in cytoplasmic
foci known as processing bodies (PB) and stress granules (SG) (Liu et al., 2005a). These
ribonucleoprotein aggregates, which are sufficiently large to be detected by
immunofluorescence microscopy, also contain high concentrations of miRNAs, RISC-
58

I3_Régulations traductionnelles et RNA silencing
associated proteins, and RNA degradation enzymes (Parker and Sheth, 2007). Three lines of
evidence initially raised the possibility that PB might be important for RNA silencing. First,
P-bodies are devoid of ribosomes (Teixeira et al., 2005). Second, miRNA-dependent
localization of mRNA in PB requires both the miRNA and one or more MRE on mRNA (Liu
et al., 2005a). Third, depleting cells of RISC-associated proteins such as GW182 or RCK
disaggregates PB and impairs miRNA function (Jakymiw et al., 2005; Liu et al., 2005b; Chu
and Rana, 2006). However, these findings do not prove that the ability of miRNAs to direct
targeted mRNAs to PB contributes to translational repression. Indeed, recent evidence
suggests that PB likely plays a less pivotal role, either as graveyards where miRNAassociated
mRNAs that already have been translationally inactivated (possibly deadenylated)
are sent to decompose, or as depots where mRNA transiently repressed by miRNA can be
stored until needed (Bhattacharyya et al., 2006; Chu and Rana, 2006; Eulalio et al., 2007a).
8. CONCLUSION
Recent findings suggest that RNA silencing mechanisms are not so distinct between plant and
animals. Moreover, it has been shown recently that individual miRNA can suppress the
production of hundreds of proteins (Baek et al., 2008; Selbach et al., 2008).
An interesting issue is that of the link between cleavage and translational repression. Possibly
they can be simultaneous pathways or successive pathways. It is reasonable to assume that all
translatable mRNA entering the cytoplasm are circularized by translation initiation complex
and scanned by the ribosome. In addition, ribosomes are the only cytoplasm component able
to “read” mRNA sequence. We can imagine that following ribosomes could be a good way
for a miRNP to find complementary sequence on mRNA target and associate with MRE. In
this case the association of miRNA is just an intermediate step before RNA silencing by first
directing mRNA to RNA granules and then maintaining them in this silenced state them
before degradation.
It is becoming accepted that there are multiple mechanisms of miRNA induced translational
repression. A few studies suggest the existence of more than one mechanism of miRNA
function and may explain conflicting reports regarding the mechanism of silencing by
miRNAs (Eulalio et al., 2007b). In addition, future issues will address topic of target
specificity for the inhibition. Mechanisms of regulation appear to be adapted for each mRNA
target, varying proportion of slicing, mRNA decay, and translational block.
59

position of MRE
number of MRE
complementarity
miRNA:MRE
animal mRNAs plant mRNAs
3'-UTR CDS
several single
near-perfect
perfect
Tableau I3-1. miRNA recognition element (MRE) features are different between most
of plant and animal mRNA. UTR, Untranslated; CDS, coding sequence.

Inhibition of translation initiation
A. inhibition of mRNA circularization
PABP
Inhibition of translation elongation
D. Proteolysis
PABP
4E
4E
AAAAA
CAF1
NOT CCR4
AAAAA
AGO
Met
DCP2
AGO
C. Inhibition of ribosomal subunits joining
AAAAA
PABP
4E
AGO
Met
eiF6
Met
B. Competition for binding cap structure
AAAAA
PABP
4E
E. Premature termination
AAAAA
PABP
Figure I3-1. Proposed mechanisms for miRNA-mediated translation inhibition. Various mechanisms have
been proposed for miRNA-mediated translation inhibition. Among them, it has been proposed that miRNP could
inhibit translation initiation by A. inhibition of mRNA circularization through deadenylation; B. Competition
between eiF4E and AGO for cap structure binding, or C. Inhibition of ribosomal subunit joining through eiF6.
Other mechanisms have been proposed for translation inhibition during elongation step : D. Co-translational
polypeptide degradation or E. Premature termination (ribosomes drop-off).
4E
AGO
AGO
Met

RESULTATS
Parmi les résultats, je présente dans une première partie les données concernant l’approche
mécanistique de la régulation traductionnelle guidée par les miARNs chez Arabidopsis. Dans
cette partie du travail nous nous sommes attachés à mettre en évidence le lien existant entre la
machinerie traductionnelle et le RNA silencing chez les plantes. Pour ce faire nous avons
utilisé un approche majoritairement biochimique. Nous avons ensuite couplé cette approche
avec l’analyse de mutants hypomorphes ago1 et de plantes sur-exprimant la protéine virale 2b
afin de mettre en évidence le blocage de la traduction induit par les complexes miARN/AGO1
chez Arabidopsis.
Dans une seconde partie, je présente les données concernant les régulations posttranscriptionnelles
dans la réponse à l’environnement. En particulier, je me suis intéressée à la
réponse à la lumière chez Arabidopsis. En collaboration avec Alessandro Alboresi, nous
avons mis en évidence l’existence de régulation traductionnelles impliquées dans l’expression
des antennes Lhc en réponse à la lumière. Par la suite, sur la base d’observations
phénotypiques, nous avons mis en évidence l’existence d’une nouvelle voie du RNA silencing,
TAS4, qui est induite en réponse à la forte lumière. Cette voie semble être impliquée dans la
voie de biosynthèse des anthocyanes au niveau des tissus aériens.
A la suite de chacune des parties, j’aborderai les conclusions et perspectives expérimentales à
court terme associées aux données présentées. Enfin, dans une dernière section, je
m’appliquerai à discuter de manière intégrée l’ensemble des données et les perspectives à
long terme.
60

R1_Traduction et RNA silencing chez les plantes
R1_RNA SILENCING ET REGULATIONS TRADUCTIONNELLES,
APPROCHE MECANISTIQUE
Dans cette première partie du travail, nous avons mis en évidence l’existence d’un lien
physique entre la machinerie traductionnelle et les complexes effecteurs du RNA silencing
chez Arabidopsis. Ce travail a été initié au début de mon stage doctoral, avec Etienne
Delannoy, à l’époque post-doc au laboratoire, et Rodnay Sormani, doctorant spécialiste de la
purification de polysomes. Nous avons dans un premier temps pu détecter des miARNs dans
les fractions de polysomes purifiés. Par la suite, nous avons recherché une stratégie qui nous
permettrait de démontrer le lien entre cette association physique et une fonction d’inhibition
traductionnelle des miRNP (complexes effecteurs du RNA silencing, composés au minimum
d’un miARN et d’une protéine AGO). Pour ce faire, nous avons utilisé une approche
génétique, grâce à l’analyse de mutants ago1 hypomorphes ainsi que de plantes sur-exprimant
la protéine virale 2b. La protéine 2b est un inhibiteur viral du RNA silencing codé par le virus
de la mosaïque du concombre (CMV). Il a récemment été montré que la protéine 2b codée par
la souche FNY du CMV est capable d’inhiber l’activité de clivage (slicer) d’AGO1 chez
Arabidopsis (Zhang et al., 2006; Lewsey et al., 2007). Nous y avons vu un outil de choix qui
nous permettrait de découpler l’activité slicer d’AGO1 d’une éventuelle activité de blocage de
la traduction.
Dans un premier temps sera présentée la publication qui compile les données obtenues
concernant le RNA silencing et les régulations traductionnelles. Dans une deuxième partie
seront présentées les données complémentaires obtenues en analysant l’allèle mutant ago1-4.
Ce mutant a été décrit avec les premiers mutants ago1 (Bohmert et al., 1998), cependant
aucune donnée moléculaire n’a été publié par la suite. Nous avons donc caractérisé la
mutation ponctuelle impliquée dans le phénotype d’ago1-4 puis nous avons souhaité utilisé
cet allèle en complément de l’allèle ago1-25, celui-ci caractérisé précédemment (Morel et al.,
2002). L’allèle ago1-4 nous a révélé un phénotype moléculaire original que nous continuons à
analyser à l’heure actuelle.
61

R1_Traduction et RNA silencing chez les plantes
I. EVIDENCES BIOCHIMIQUES DE LA REGULATION
TRADUCTIONNELLE GUIDEE PAR LES MIARNS CHEZ
ARABIDOPSIS, ARTICLE.
Biochemical evidence for translational repression by plant
microRNAs
Elodie Lanet 1,2,3 , Etienne Delannoy 4 , Rodnay Sormani 1,2,3,5 , Peter Brodersen 6 , Patrice
Crété 1,2,3 , Olivier Voinnet 6 and Christophe Robaglia 1,2,3
1
Aix-Marseille Université, Lab Genet Biophys Plantes, Marseille, F-13009, France ; 2
CNRS,
UMR Biol Veget & Microbiol Environ, Marseille, F-13009, France ; 3
CEA, DSV, IBEB,
Marseille, F-13009, France ; 4 Plant Energy Biology, ARC Center of Excellence ; Perth,
Australia ; 5 current address : Unite de Nutrition Azotee des Plantes, INRA, Versailles, France;
6 Institut de Biologie moléculaire des plantes CNRS UPR2357 67084 Strasbourg Cedex
France.
MicroRNAs regulate gene expression post-transcriptionally through RNA silencing, a
mechanism conserved in eukaryotes. Prevailing models entail that most animal miRNAs
affect gene expression by blocking mRNA translation, while most plant miRNAs trigger
mRNA cleavage. Here, using polysomes fractionation in Arabidopsis thaliana, we found
that a portion of mature miRNAs and AGO1 protein are associated with polysomes,
likely through their mRNA target. Accumulation of several distinct miRNA targets at
both the mRNA and protein levels was enhanced in an ago1 hypomorphic mutant. By
contrast, translational repression, but not cleavage, persisted in transgenic plants
expressing the slicing-inhibitor 2b protein from Cucumber mosaic virus. Accordingly,
polysomes association of miR168 was lost in ago1 mutants, but maintained in 2b plants,
indicating that translational repression is correlated with the presence of miRNAs and
AGO1 in polysomes. This work provides direct biochemical evidence for a translational
component in the plant miRNA pathway.
1. INTRODUCTION
RNA silencing regulates gene expression in many eukaryotic organisms through the activity of
distinct classes of endogenous small RNAs (sRNAs). Among them, 19-25bp microRNAs
62

R1_Traduction et RNA silencing chez les plantes
(miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs) are processed from non-coding doublestranded
(ds)RNA precursors by RNAses in the Dicer-like (DCL) family. One strand of the
sRNAs duplex is loaded into an Argonaute (AGO) protein to form a silencing effector
complex. These ribonucleoprotein complexes, also called miRNPs or siRNPs, silence posttranscriptionally
mRNAs targets that are partly or fully complementary to sRNAs. In plants,
most known miRNAs interact with fully or near-fully complementary target mRNAs at a
single site usually located in the protein coding sequence (Bartel, 2004). Plant miRNAs serve
as guides for the Argonaute 1 protein, which cleaves target mRNA owing to its slicer activity
(Baumberger and Baulcombe, 2005). In contrast, animal miRNAs typically anneal with nonperfect
complementarity to their targets. Animal mRNAs contain several miRNA recognition
elements, often in their 3’-untranslated region and silencing occurs through slicer-independent
mechanisms (Carrington and Ambros, 2003; Pillai et al., 2005). In several metazoans,
including Caenorhabditis elegans (Olsen and Ambros, 1999; Seggerson et al., 2002),
Drosophila melanogaster (Hammond et al., 2001) or mammalian cells (Kim et al., 2004;
Nelson et al., 2004), miRNAs and their mRNAs targets have been shown to associate with
polysomes, although the way miRNPs repress translation remains debated (Valencia-Sanchez
et al., 2006; Pillai et al., 2007). In plants, miRNA-guided translational inhibition had been
only documented on few occasions, and these examples were believed to represent rare
exceptions (Aukerman and Sakai, 2003; Chen, 2004; Arteaga-Vazquez et al., 2006;
Gandikota et al., 2007). However, a recent study showed that small RNA-guided translational
inhibition is, in fact, widespread in Arabidopsis, and can be genetically uncoupled from
slicing (Brodersen et al., 2008). Therefore, plant small RNA action at the post-transcriptional
level entails a combination of slicing and translational repression.
Nonetheless, biochemical evidence for interactions between RNA silencing and the translation
machinery is still missing in plants. In this work, we show that several miRNAs are associated
with polysomes. In addition, the AGO1 protein, which is known to confer slicer activity in
plants, is also shown to be associated with polysomes. The comparative analysis of miRNA
target accumulation and translation in ago1 mutant and of FNY-2b transgenic plants, reveals
that translational repression and miRNA polysomal association can be maintained in 2b plants
independently of slicer inhibition, suggesting that distinct AGO1 functions are involved in
cleavage and translational repression and that distinct mRNA are differentially affected by
these activities.
63

2. RESULTS
R1_Traduction et RNA silencing chez les plantes
a. FUNCTIONAL AGO1­MIRNPS ARE ASSOCIATED WITH ACTIVE POLYSOMES IN
ARABIDOPSIS THALIANA.
We first investigated the subcellular distribution of several highly expressed miRNAs
(Backman et al., 2008). Cytoplasmic extracts were prepared from exponentially growing cell
cultures and fractionated by sucrose gradients (Figure R1-1A). The same experiment was also
carried out with young A. thaliana seedlings (Figure R1-1B). RNA blot analysis revealed that
a portion of miR156, miR168, miR171, miR172 and miR160 is found in polysomal fractions
of cultured cells (P, Figure R1-1A) and of seedling extracts (fractions 1 to 3, Figure R1-1B).
A characteristic of translating polysomes is their susceptibility to the amino-acid analogue
puromycin. Indeed, although the level of miRNA association with polysomes versus
monosomes varied between different miRNAs, puromycin treatments efficiently removed
these miRNAs from heavy sucrose gradient fractions, indicating that they are associated with
active polysomes (Figure R1-2). In order to define whether miRNA association with
polysomes correlates with their functional loading into the AGO1 effector complex, we
studied the subcellular localization of miR168*, which is the labile complementary (or
passenger) strand of miRNA168 in the miR/miR* duplex produced by DCL1. In contrast to
miR168, miR168* was only found within light, untranslated fractions (SN, Figure R1-1A),
suggesting that mostly mature miRNAs that are engaged into repressive functions through
their loading into AGO1, are associated with polysomes in A. thaliana. To address if the
translatability of targeted RNAs could influence miRNA association to polysomes, we studied
miR173 and miR390, which respectively target the non-coding TAS1/2 and TAS3 RNA
precursors for cleavage, allowing DCL4-dependent phased processing of trans-acting (ta-
)siRNAs (Allen et al., 2005). We found that miR173 is weakly associated with polysomal
fractions (Figure R1-1B). miR90 is even less associated with polysomes than miR173, with
only a faint signal in monosomal fraction 4 (Figure R1-1B). The difference could be due to
the fact that miR390, unlike miR173 and indeed most miRNAs, is selectively loaded into
AGO7 as opposed to AGO1. Nonetheless, the poor or lack of representation of both miRNAs
in poly- and monosomal fractions suggests that only miRNAs engaged in repression of
translatable RNAs are found significantly associated to polysomes. We then asked whether
the core component of plant miRNPs complexes, the AGO1 protein (Baumberger and
Baulcombe, 2005), is associated with polysomes. AGO1 associates with many miRNAs and
has been implicated in translational inhibition by several miRNAs (Brodersen et al., 2008).
64

R1_Traduction et RNA silencing chez les plantes
Western blot analysis of proteins extracted from six fractions from a sucrose gradient
demonstrated that AGO1 is indeed associated with polysomal fractions (Figure R1-3).
b. MIRNPS INTERACTION WITH POLYSOMES DEPENDS ON RNA
The co-sedimentation of miRNPs with polysomes would be expected either if miRNPs were
able to interact with ribosomes, or if there is a direct interaction of miRNAs with
complementary regions of mRNA targets. To distinguish between these possibilities,
cytoplasmic extracts were digested with micrococcal nuclease. Under these conditions,
ribosomes remain intact, but exposed regions of mRNA are degraded (Maroney et al., 2006).
Upon micrococcal nuclease treatment, polysomes were almost completely degraded, resulting
in a large accumulation of 80S ribosomes (fraction 4, Figure R1-4). Although ribosomeprotected
fragments are expected to co-sediment with the peak of 80S ribosomes, the
sedimentation profile of miRNAs was distinct, as most of these molecules were found near
the top of the gradient after nuclease treatment (Figure R1-4, Nuclease). Therefore these
results suggest that miRNPs association with polysomes depends on nuclease sensitive
regions of RNA, presumably mRNAs undergoing translation elongation.
c. MIRNAS ASSOCIATION WITH POLYSOMES IS ASSOCIATED WITH TRANSLATIONAL
REPRESSION.
To gain insight into the functional significance of an association of plant miRNPs with
polysomes, we examined under what circumstances this association leads to a block of
translation. We used two types of plants with reduced AGO1 activity: the ago1-25 point
mutation mutant and 2b transgenic plants. ago1-25 is a fertile, hypomorphic mutant impaired
in post-transcriptional RNA silencing and virus resistance (Morel et al., 2002). The 2b protein,
coded by the FNY strain of Cucumber Mosaic Virus (CMV), inhibits slicing through physical
interactions with AGO1 but does not prevent loading of small RNA into AGO1 (Zhang et al.,
2006; Lewsey et al., 2007). ago1-25 and 2b transgenic plants were thus analyzed for mRNA
and protein accumulation of three distinct miRNA targets: AGO1, CIP4 and CSD2,
respectively repressed through miR168 (Vaucheret et al., 2004), miR834 (Brodersen et al.,
2008) and miR398 (Sunkar et al., 2006). CSD2 has been recently shown to undergo a
combination of slicing and translational repression by miR398 whereas inhibition of CIP4 by
the Arabidopsis-specific miR834 was proposed to occur nearly exclusively at the protein
level, based on mutant analyses (Brodersen et al., 2008). In both ago1-25 and 2b plants a
significant increase in the accumulation of AGO1 and CSD2 mRNA was observed (Figure
R1-5A) and, as reported, there were little variations in the CIP4 mRNA levels. This effect at
65

R1_Traduction et RNA silencing chez les plantes
the transcript level was expected because of the impaired AGO1 activity exhibited by both
types of plants. By contrast, while protein levels were increased in ago1-25 for all three
targets (Figure R1-5B) they were similar to wild-type levels in the 2b transgenic plants
(Figure R1-5B). These results indicate that, unlike in ago1-25 plants, miRNA-directed
repression of target transcripts is maintained at the translational level independently of slicer
inhibition in the 2b plants. The results also imply that translation inhibition is a component of
miRNA-mediated silencing in wild-type plants and provides further support to the proposal
that CIP4 is an example of a transcript repressed only at the translational level despite
displaying near-perfect complementarity to its regulatory miRNA (Brodersen et al., 2008).
Having established the contrasted effects of 2b transgenic expression and ago1-25 mutation
on miRNA activities, we then examined the partitioning of miRNAs with polysomes in both
types of plants. We found that miR168 association to polysomes is lost in ago1-25 mutants,
which affect both slicing and translational repression (Figure R1-6). By contrast, miR168 was
still associated with polysomes in 2b overexpressing plants, in which only slicing seems
repressed (Figure R1-6). These results indicate that the association of miRNAs with
polysomes correlates with the translational repression state of their target transcripts.
3. DISCUSSION
We have shown that a fraction of several miRNAs is associated with polysomes in
Arabidopsis cell culture and seedlings. This association seems specific for mature miRNAs
because miR168* was only found within non-polysomal, untranslated fractions (Figure R1-
1A). Moreover, the association of miRNAs with polysomes seems to depend upon a
translatable state of target RNA. Hence, miR173, which coordinates the phased processing of
TAS1/2 non coding precursors, is very weakly associated with polysomes (Figure R1-1B)
possibly because TAS1/2 precursors entering the cytoplasm are capped, contain an AUG
codon, and therefore might be transiently recognized by the translational machinery. The case
of miR390 suggests that the AGO7/miR390 complex, dedicated for slicing TAS3 non-coding
RNA precursors, is not associated with polysomes. The majority of the AGO1 protein is
detected within high molecular weight polysomal fractions (Figure R1-3) suggesting that
miRNAs that sediment in low molecular weight fractions of the gradient are not associated
with AGO1 or that they engage together with a small AGO1 fraction into alternative mode of
regulations. In fact, we found that a substantial portion of several miRNA target transcripts
partitions with untranslated fractions in the same manner as miRNA themselves (Figure R1-
7). This suggests that miRNA and their targets might be deployed into multiple effector
66

R1_Traduction et RNA silencing chez les plantes
complexes for distinct types of outputs, possibly allowing subcellular-level regulations of
mRNA stability and translation. Indeed, the cytoplasm contains several compartments that are
not surrounded by membranes and composed of ribonucleoprotein aggregates, including
processing (P)-bodies and stress granules. In animals, some of these complexes are associated
with RNA silencing component (Leung et al., 2006) and in Drosophila, there is evidence that
P-bodies are involved in miRNA-directed target decay through deadenylation and decapping,
while translational repression might operate in a P-body-independent manner (Eulalio et al.,
2007b). In plants, components of the RNA decapping machinery were found involved in RNA
silencing (Gazzani et al., 2004; Gy et al., 2007) and the existence of P-bodies was recently
demonstrated (Xu et al., 2006). It will be thus interesting to investigate which type of
proteins, possibly other members of the large AGO family, are linked to miRNAs and their
mRNA targets in non-polysomal fractions. Interestingly, translationally-repressed yeast
mRNAs sequestered in P-bodies were found to sediment within light sucrose gradient
fractions (Brengues et al., 2005). The contrasted results with 2b transgenic and ago1-25
mutant plants echo those of Brodersen et al. who identified Arabidopsis mutations that
uncouple slicing from translational repression by miRNAs. This raises the important issues
including how slicing might be prevented during AGO1-mediated translational repression and
why some miRNA targets, including the miR834 target CIP4, appear more prone to one
specific type of regulation.
4. ACKNOWLEDGEMENTS
We thank Mathew Lewsey and John Carr for providing 2b overexpressing lines, Hervé
Vaucheret for providing ago1-25 seeds, and Bruce Veit for careful correction of the
manuscript. E.L was supported by a CEA-Région Provence Côte d’Azur doctoral fellowship,
R.S. and E.D. were supported by CEA doctoral and post-doctoral fellowships respectively.
This work was supported by CEA, CNRS, Aix-Marseille University and the Provence Alpes
Côte d’azur région.
67

II. DONNEES COMPLEMENTAIRES
R1_Traduction et RNA silencing chez les plantes
1. PHENOTYPE ET GENOTYPE AGO1­4
Le mutant ago1-4 est identique au mutant ago1-25 au niveau phénotypique (Figure R1-8).
Les deux plantes possèdent les feuilles dentelées en forme de spatules caractéristiques des
mutants ago1. Au niveau moléculaire, nous avons identifié la mutation ago1-4 au niveau du
domaine PIWI de la protéine AGO1 (Figure R1-8B). Une mutation ponctuelle conduit à la
substitution d’une Valine en Alanine en C-terminal de la protéine. Comme dans le cas de
l’allèle ago1-25, la mutation ponctuelle n’affecte pas un acide aminé directement impliqué
dans l’activité catalytique mais au voisinage du site catalytique, ce qui pourrait suggérer que
la conformation du site soit affecté chez ces mutants.
2. EFFET DE LA MUTATION AGO1­4 SUR L’ACCUMULATION DES ARNM CIBLES DE
MIARN
Nous avons analysé l’accumulation de plusieurs cibles de miARN par RT-PCR en temps réel
chez les plantes ago1-4, ago1-25, sauvages (wt), et FNY-2b (Figure R1-9A). Les données
concernant l’accumulation des protéines correspondants à trois cibles de miARN (Figure R1-
9B). ont été comparées aux données de RT-PCR.
Tout d’abord, les données supplémentaires de quantification d’ARNm cibles de miARN
confirment les hypothèses formulées précédemment dans l’article selon lesquelles chaque
cible de miARN semble être affectée différemment par les mutations ago1 ou par la
surexpression de FNY-2b (Figure R1-9A). Ces observations suggèrent que l’inhibition posttranscriptionnelle,
guidée par les miRNPs, ne correspond pas à un seul et même mécanisme
figé qui s’applique à chaque cible. Chez ago1-25, les sept ARNm cibles testés s’accumulent
plus par rapport aux plantes sauvages (Figure R1-9A). Dans le cas des trois protéines testées,
elles d’accumulent également plus chez les mutants ago1-25 que chez les plantes sauvages
(Figure R1-9B). Dans le cas des surexpresseur FNY-2b, nous avons pu observer que certaines
cibles (AGO1, CSD2, ARF17) s’accumulent plus chez les plantes FNY-2b que chez les
plantes sauvages (Figure R1-9A). Cependant cette accumulation n’est pas corrélée avec
l’accumulation des protéines (Figure R1-9B). Une interprétation logique est que des ARNm
cibles de miARN est maintenu chez FNY-2b. Nous avons donc proposé dans l’article présenté
précédemment que la protéine AGO1 possède une fonction de blocage de la traduction, en
68

R1_Traduction et RNA silencing chez les plantes
plus de son activité de clivage, qui est affectée chez ago1-25 mais pas chez FNY-2b. De plus,
nos données suggèrent que les parts respectives du clivage par AGO1 et de l’inhibition
traductionnelle varient pour chaque couple miARN/ARNm cible.
Dans le cas d’ago1-4, seules deux des sept ARNm cibles testées (CSD2 et SPL10)
s’accumulent plus chez le mutant que chez le sauvage (Figure R1-9A). Dans les cinq autres
cas, les ARNm cibles de miARN s’accumulent moins chez ago1-4 que chez les plantes
sauvages. Il semble que le blocage de la traduction soit maintenu chez ago1-4 puisque la
protéine CSD2 s’accumule moins chez ago1-4 par rapport à ago1-25 tandis que l’ARNm
correspondant s’accumule deux fois plus chez ago1-4 que chez ago1-25 (Figure R1-9B). Ces
résultats suggèrent d’une part que chez ago1-4, AGO1 a partiellement conservé ses fonctions
de clivage et de blocage de la traduction, d’autre part, le fait que certains ARNm cibles
s’accumulent moins chez ago1-4 que chez les plantes sauvages suggère qu’ago1-4 pourrait
être affecté dans une fonction d’AGO1 qui régulerait positivement l’accumulation de certains
ARNm cibles de miARNs.
3. CORRELATION ENTRE BLOCAGE DE LA TRADUCTION ET ASSOCIATION DES MIARNS
AUX POLYSOMES ?
Nous avons pu corréler l’activité de blocage de la traduction et la présence du miARN dans
les polysomes pour le cas du miR168. En effet, l’association de miR168 est perdue chez
ago1-25 mais maintenue chez les plantes FNY-2b (Figures R1-9 et R1-10B, C).
A nouveau, le cas d’ago1-4 est plus délicat à analyser. En effet, il semble que miR168 et
miR172 ne soient plus associés aux polysomes chez ago1-4 (Figure R1-10A, B). Par contre,
dans le cas de miR398, il semble, d’après des résultats préliminaires, que le miARN soit
fortement associé aux polysomes chez ago1-4 (Figure R1-10C). Si ce résultat est confirmé,
alors d’une part l’association des miARNs aux polysomes pourraient être un indice clair de
l’inhibition traductionnelle. D’autre part, le fait que l’association des miARNs aux polysomes
varie pour différents miARNs donnerait une indication de la part relative de la régulation
traductionnelle dans l’inhibition post-transcriptionnelle d’un certain couple miARN/mARN
cible.
69

III. CONCLUSION ET DISCUSSION
R1_Traduction et RNA silencing chez les plantes
Aux vues des données récentes, il semble clair qu’il existe un lien étroit entre RNA silencing
et machinerie traductionnelle. En réalité, ce lien est connu de longue date car la protéine
AGO2 de lapin a d’abord été isolée comme un composant potentiel du complexe d’initiation
de la traduction et nommée eIF2C (Zou et al., 1998). C’est chez C. elegans que le lien entre
eiF2C et le RNA silencing a pu être établi par la suite (Tabara et al., 1999). Chez les animaux
le RNA silencing guidé par les miARNs a été défini comme régulant la traduction. Le miARN
let-7, mis en évidence chez C. elegans et très conservé parmi les animaux, inhibe posttranscriptionnellement
l’expression du gène LIN-41 par blocage de la traduction ou
déstabilisation de l’ARNm (Reinhart et al., 2000). Sur la base de ce modèle, la grande
majorité des miRNPs animaux inhibent l’expression de leur ARNm cible de manière
indépendante du clivage. Chez les végétaux la mise en évidence de l’association fonctionnelle
des miRNPs aux polysomes a permis de mettre un terme au clivage idéologique qui opposait
les mécanismes du RNA silencing chez les animaux de ceux observés chez les végétaux. De
plus, un crible génétique a permis de mettre en évidence la fonction de blocage de la
traduction des miRNPs chez les plantes (Brodersen et al., 2008). Cette étude de Brodersen et
al., ainsi que la nôtre, ont pu découpler les fonctions de blocage de la traduction de celles de
clivage du RNA silencing. Dans le premier cas, c’est l’obtention de mutants spécifiquement
affectés dans le RNA silencing traductionnel qui a permis de découpler les deux voies du RNA
silencing. Dans notre cas, c’est l’utilisation d’une protéine virale ciblant l’activité slicer
d’AGO1, mais n’affectant visiblement pas le blocage de la traduction, qui nous a permis de
mettre en évidence la fonction des miRNPs dans les polysomes.
Il reste désormais à caractériser les mécanismes du RNA silencing traductionnel chez les
plantes. Chez les animaux, de nombreuses études ont mis en évidence l’existence de plusieurs
mécanismes, comme il a été détaillé dans la revue bibliographique (partie I3). Cependant, ces
études ont été réalisées majoritairement en utilisant des systèmes in vitro. La mise en évidence
récente de l’importance du promoteur dans la mise en place de la régulation traductionnelle
par les miARNs laisse penser que les études utilisant des systèmes de gènes rapporteurs
doivent être minutieusement validées (Kong et al., 2008). Chez les plantes, la mise en
évidence du rôle d’AGO10 et du cytosquelette dans la régulation de la traduction par les
miARN ouvrent de nouvelles perspectives (Brodersen et al., 2008). Ces résultats sont à mettre
70

R1_Traduction et RNA silencing chez les plantes
en parallèle des données émergeantes sur l’importance des granules à ARN et de la dimension
spatiale de la régulation post-transcriptionnelle (Anderson and Kedersha, 2006). En effet,
l’importance des granules type P-bodies (PB) et granules de stress (SG) pour les mécanismes
de RNA silencing a été mise en évidence chez les animaux (Eulalio et al., 2007a). Il semble
clair que le trafic des ARNm, reconnus pas les complexes miRNPs, entre polysomes et
granules à ARN dépende d’éléments du cytosquelette. La mise en évidence de KATANINE
(KTN) comme suppresseur du RNA silencing traductionnel confirme cette hypothèse
(Brodersen et al., 2008).
71

A.
OD 254nm
miR156
miR160
miR168
miR172
miR168a*
5S rRNA
Sedimentation
Poly. Mono. SN
P M SN
B.
miR168
miR171
miR172
miR173
miR390
Sedimentation
Poly. Mono. SN
1 2 3 4 5 6
Figure R1-1. Functional microRNAs are associated with polysomes in A. thaliana. In the upper
panel A254nm is shown from the heavier (left) to the lighter (right) fractions of the gradient. A.
Cytoplasmic extracts from cultured cells were separated on gradients and fractionated in three
unequal fractions, from the bottom to the top of the gradient : polysomes (P), monosomes (M), and
supernantant (SN). Equal amounts of total RNA extracted from each fraction were analyzed by
northern blot in order to detect small RNAs. B. Cytoplasmic extracts from young seedlings were
separated on gradients and fractionated in six equal fractions of two millilitres, from the bottom to the
top of the gradient respectively fraction 1 to fraction 6. Total RNA extracted form each fraction were
analyzed by northern blot in order to detect small RNAs.

A.
B.
OD 254nm
untreated
puromycin
miR168
Sedimentation
Poly. M+SN
Poly. M+SN
P1
wt1
puromycin
untreated
Figure R1-2. Puromycin treatment dissociates miRNAs from polysomes. Cytoplasmic
extracts were treated with 0.2mg.mL-1 puromycin for 30 minutes before centrifugation on
sucrose gradient. (A) A254nm is shown from the heavier (left) to the lighter (right) fractions
of the gradient. Poly.=Polysomes. M+SN=Monosomes + supernatant. (B) northern blot
detection of miR168 in polysomal vs. in monosomal and supernatant fractions.
OD 254nm
Sedimentation
1 2 3 4 5 6
αAGO1
Total
extract
150kDa
Figure R1-3. AtAGO1 is associated with polysomes. A254nm is shown from the heavier
(left) to the lighter (right) fractions of the gradient. Gradients were fractionated in six equal
fractions of two millilitres; from the bottom to the top of the gradient respectively fraction 1
to fraction 6. Proteins extracted from each fraction were separated by SDS-PAGE
(Coomassie blue staining is shown) and analyzed by western blot using an antibody against
AtAGO1.

Fractions
miR168
miR172
miR173
Sedimentation
Sedimentation
Control Nuclease
1 2 3 4 5 6
80S
1 2 3 4 5 6
Figure R1-4. miRNAs association with polysomes is RNA mediated.
A254nm is shown from the heavier (left) to the lighter (right) fractions of the
gradient. Gradients were fractionated in six equal fractions of two millilitres;
from the bottom to the top of the gradient respectively fraction 1 to fraction 6.
Total RNA extracted from each fraction was analysed by northern blot.
Nuclease treated samples are shown in the left panel and a non-treated control
sample in the right panel
A.
15
10
0
5
0
15
10
5
0
9.74
1.00
AGO1
CSD2
2.18
4.47
10
5
1.00
ago1-25 FNY-2b wt
0.01
ago1-25 FNY-2b wt
15
10
5
0
80S
2.85
CIP4
Figure R1-5. Translational repression of miRNA targets is maintained in FNY-2b plants. (A) Total RNA
extracted from wild-type, FNY-2b and ago1-25 plants were quantified for mRNAs using primers surrounding the
cleavage site. Quantifications were normalized to that of ACTIN2, then to the value of the wild-type plants,
which was set to 1 (except for CSD2 mRNA values were normalized to ago1-25 as wild-type value is null).
Standard errors were calculated from two independent experiments. (B) Total proteins were extracted from fresh
leaves for each sample and separated by SDS-PAGE. Immunodetection of AGO1, CIP4 and CSD2 are shown in
upper panel, Coomassie blue staining is shown in the lower panel.
0.77
1.00
ago1-25 FNY-2b wt
B.
ago1-4
ago1-25
FNY-2b
wt
AGO1
CIP4
CSD2

miR168
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
wt
ago1-25
FNY-2b
ACT2
HP LP M SN
ARF17
HP LP M SN
CSD2
P M SN
Figure R1-6. Association of miR168 with polysomes is lost in ago1-25
hypomorphic mutant but maintained in FNY-2b plants. Gradients were
fractionated in three unequal fractions, from the bottom to the top of the gradient:
polysomes (P), monosomes (M), and supernatant (SN). Equal amounts of RNA
extracted from each fraction were analyzed by northern blot. EtBr staining of 5S rRNA
is shown as loading control.
HP LP M SN
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
AGO1
HP LP M SN
SPL10
HP LP M SN
PPR
HP LP M SN
Figure R1-7. miRNAs targets are less associated with polysomes than mRNA not
known to be targeted by miRNAs. Gradients were fractionated in six equal fractions of
two milliliters; from the bottom to the top of the gradient, respectively fraction 1 to
fraction 6. Fractions 1 and 2 were pooled and presented as Heavy Polysomes (HP).
Fraction 3 and fraction 4 correspond to Light Polysomes (LP) and Monosomes (M)
respectively. Fractions 5 and 6 were pooled (SN). RNA extracted from each fraction was
reverse transcribed and quantified by qPCR using primers surrounding AGO1-miRNP
cleavage site.

A.
B.
ago1-4 ago1-25 wt FNY-2b
At AGO1 1048aa
393 503
678 999
N PAZ
PIWI C
…DRPTIIFGADVTH…IIFYRDGVSE …SIVPPAYYAHLAAFRVRFYME
* *
ago1-25(Gly758Ser) ago1-4(Ala992Val)
Figure R1-8. Caractérisation de l'allèle mutant ago1-4. A. Phénotype des mutants ago1-4 et
ago1-25, des surexpresseurs FNY-2b, et des plantes sauvages (wt) après quatre semaines de croissance
en terre. B. Position des substitutions dans le domaine PIWI responsables des phénotypes ago1-25 et
ago1-4. L'astérisque représente la position de l'acide aminé substitué. Les acides aminés en gras
représentent les acides aminés catalytiques responsables de l'activité slicer.

A.
B.
15
10
5
0
15
10
5
0
15
10
5
0
1.00
SPL10/ACT2
5.81
14.97
0.99
wt ago1-4 ago1-25 FNY-2b
ARF17/ACT2
1.00 0.84
5.17
2.31
wt ago1-4 ago1-25 FNY-2b
1.00 0.67
2.62
1.75
wt ago1-4 ago1-25 FNY-2b
ago1-4
SCL6-IV/ACT2
ago1-25
FNY-2b
wt
15
10
5
0
15
10
5
0
15
10
5
0
AGO1
CIP4
CSD2
1.00
DCL1/ACT2
0.34
2.61
0.87
wt ago1-4 ago1-25 FNY-2b
1.00
AGO1/ACT2
1.00 0.87
CIP4/ACT2
0.10
9.74
2.85
2.18
wt ago1-4 ago1-25 FNY-2b
0.77
wt ago1-4 ago1-25 FNY-2b
15
10
5
0
15
10
5
0
0.01
1.00
CSD2/ACT2
2.20
PPR/ACT2
0.17
1.00
1.72
4.47
wt ago1-4 ago1-25 FNY-2b
0.23
wt ago1-4 ago1-25 FNY-2b
Figure R1-9. Les cibles de miARNs sont différemment affectées chez les mutants ago1-4 et ago1-25. A. Analyse
de l'accumulation des ARNm cibles de miARNs par RT-PCR en temps réel chez les plantes sauvages (wt), ago1-4,
ago1-25 et FNY-2b. Les cibles SPL10 (cible de miR156), AGO1 (cible de miR168), CSD2 (cible de miR398), ARF17
(cible de miR160), DCL1 cible de (miR162), PPR (cible de miR161), SCL6-IV (cible de miR171), et CIP4 (cible de
miR834), ont été amplifiées grâce à des couples d'amorces disposées de part et d'autre du site de clivage par AGO1.
Les données ont été normalisées par rapport à la quantification de l'ACTINE2 puis reportées aux valeurs obtenues pour
les plantes sauvages. Les ecarts-types sont calculés à partir de deux expériences indépendantes. B. Analyse de
l'accumulation de trois protéines correspondant à des cibles de miARN par western blot.

A.
miR172
miR168
C.
wt Col0
ago1-4
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
FNY-2b
ago1 - 4
wt
FNY-2b
ago1 - 4
wt
1 2 3 4 5 6
miR398
miR168
B.
miR168
wt
ago1 -4
FNY -2b
P M SN
Figure R1-10. Association des miARNs mi168 et miR398 avec les polysomes. Détection des miARNs par
northern blot. A, C. Les ARN extraits des six fractions du gradient sont séparés sur un gel de polyacrylamide,
puis transférés sur une membrane de nylon et hybridés avec une sonde complémentaire du miARN. B. Une
quantité égale d'ARN extraits des trois fractions du gradient (1+2+3=P, Polysomes; 4=M, Monosomes,
5+6=SN, supernatent) est séparée sont séparés sur un gel de polyacrylamide, puis transférés sur une membrane
de nylon et hybridés avec une sonde complémentaire du miARN.

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
R2_REGULATIONS POST­TRANSCRIPTIONNELLES DE
L’EXPRESSION DES GENES ET REPONSE A LA LUMIERE
Dans une deuxième partie du travail nous nous sommes appliqués à mettre en évidence le rôle
des régulations post-transcriptionnelles dans la réponse des plantes à leur environnement et en
particulier dans la réponse à la lumière. D’une part, nous avons caractérisé les régulations
traductionnelles impliquées dans l’expression des antennes Lhc en réponse à la lumière. Cette
étude permet de dresser un tableau des régulations mises en places pour chacune des Lhc en
réponse à trois conditions de lumière et au cours du temps. Ces données permettront
d’améliorer la compréhension de la contribution de chaque Lhc dans la collecte de la lumière
et dans la photoprotection. D’autre part, dans le cadre du premier projet, nous avons utilisé
une approche génétique afin d’identifier les mécanismes moléculaires responsables de la
régulation traductionnelle des antennes. Dans le cadre des ces expériences d’exposition de
mutants affectés diverses voies de la régulation post-transcriptionnelles (eiF4E, ago1…) nous
avons mis en évidence que le mutant ago1 n’était plus capable d’accumuler des anthocyanes
en réponse à la forte lumière. Une analyse bibliographique nous a mené à nous intéresser à la
prédiction bioinformatique de l’existence d’une nouvelle voie du RNA silencing, TAS4,
potentiellement impliquée dans la biosynthèse des anthocyanes. Dans une seconde partie sera
présentée la première mise en évidence de l’existence de la voie TAS4 et de son rôle dans la
réponse à la lumière. Nous souhaitons désormais établir un lien direct entre cette voie et la
biosynthèse des anthocyanes.
72

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
I. REGULATIONS TRADUCTIONNELLES DE L’EXPRESSION DES
GENES LHC EN REPONSE A LA LUMIERE
Ce travail sur les régulations post-transcriptionnelles des antennes en réponse à la lumière a
été initié en collaboration avec Alessandro Alboresi, qui était à l’époque post-doc au
laboratoire. Alessandro travaille sur la biochimie et la physiologie des antennes chez
Arabidospsis thaliana et chez Physcomitrella patens (Alboresi et al., 2008). A la fin de
l’année 2006, la publication du travail de McKim et Dunford (McKim and Durnford, 2006)
chez C. reinhardtii nous a mené à nous interroger sur les données disponibles quant aux
éventuelles régulations post-transcriptionnelles de l’expression des Lhc chez Arabidopsis et
sur l’intérêt d’associer nos compétences respectives : analyse des régulations posttranscriptionnelles
et biochimie de la photosynthèse. Nous nous sommes aperçus que les
travaux sur la régulation de l’expression des antennes chez Arabidopsis sont relativement
rares et qu’aucune étude ne traite les régulations traductionnelles. Cependant la comparaison
de des données de transcriptome disponibles (Klimmek et al., 2006; Piippo et al., 2006) ainsi
que des études d’analyse de l’accumulation des antennes dans le chloroplaste en réponse à la
lumière (Bailey et al., 2001; Bailey et al., 2004; Ballottari et al., 2007) nous ont permis
d’établir un plan expérimental.
1. LA QUANTITE DE LUMIERE MODIFIE FORTEMENT LE NIVEAU GLOBAL DE
TRADUCTION
Dans cette partie, nous avons souhaité analyser la composition de l’appareil antennaire (Lhc)
d’Arabidopsis en fonction des conditions environnementales. La mise en œuvre du stress
lumineux consiste à exposer des plantes âgées de quatre semaines à trois intensités
lumineuses : basse lumière (LL, 10 µE m- 2 .s -1 ), lumière contrôle (CL, 100 µE m- 2 .s -1 ), et forte
lumière (HL, 600-800 µE m- 2 .s -1 ). Ces trois conditions d’illumination sont combinées à quatre
temps d’exposition : une heure, trois heures, cinquante et une heures, et quinze jours. On
considère les temps de traitement une heure et trois heures comme des points de réponses
précoces, cinquante et une heures comme un temps pour lequel les réponses sont établies et
stabilisées. Enfin le point quinze jours représente un temps suffisamment tardif pour permettre
aux plantes de s’acclimater aux conditions expérimentales (Ballottari et al., 2007; Wobbe et
73

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
al., 2008). Chaque prélèvement est effectué à midi pour s’affranchir des variations de
l’expression des gènes dues au rythme circadien.
Afin d’analyser l’état traductionnel des plantes exposées aux différentes intensités
lumineuses, nous avons réalisé des fractionnement d’extraits cytoplasmiques sur gradients de
saccharose. Après centrifugation, la lecture de la densité optique (DO) à 254nm donne une
image de la distribution des ribosomes le long du gradient. Sur le spectre obtenu, le pic
majoritaire correspond aux monosomes, c’est-à-dire à l’ensemble des ARNm associés à un
ribosome. Les polysomes sédimentent dans les fractions lourdes du gradient et ils représentent
la population d’ARNm en cours de traduction, associés à plusieurs ribosomes.
A tous les temps de traitement, le spectre DO254nm indique que le niveau global de
traduction est très affecté par la quantité de lumière (Figure R2-1). En particulier, la forte
lumière induit une très forte accumulation de polysomes après trois heures de traitement.
Après quinze jours de traitement par la forte lumière, la quantité de polysomes est revenue à
un niveau équivalent à celui des plantes contrôle, ce qui peut être une indication de
l’acclimatation des plantes à leur nouvel environnement. En condition de faible lumière,
l’accumulation de polysomes est visiblement réduite dès une heure de traitement. Après
quinze jours d’exposition à la faible lumière, la quantité de polysomes demeure très inférieure
à celle des plantes sauvages. De plus, l’apparition du pic 60S, qui correspond à la grande
sous-unité libre du ribosome, indique que l’ensemble de la population des ribosomes n’est pas
mobilisée pour la traduction. En conclusion, ces expériences indiquent clairement que la
quantité de lumière joue un rôle important dans l’accumulation des polysomes et
probablement dans la régulation du niveau global de traduction.
Afin d’analyser plus en détail l’effet de la lumière sur la traduction, nous avons analysé le
chargement de certains ARNm dans les polysomes en fonction du temps et de la quantité de
lumière. Chez Chlamydomonas et chez le tabac, de précédentes études ont suggéré l’existence
de régulations post-transcriptionnelles de l’expression des Lhc en réponse à la lumière (Tang
et al., 2003; Mussgnug et al., 2005; McKim and Durnford, 2006). Nous avons donc focalisé
notre attention sur la famille d’ARNm codant les Lhc. En effet, ces protéines, qui jouent un
rôle clé pour la photosynthèse, sont codées par des gènes nucléaires et traduites dans le
cytoplasme.
2. L’ASSOCIATION DES ARNM LHC AUX POLYSOMES EST MODULEE PAR L’INTENSITE
LUMINEUSE
74

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
Afin d’analyser l’état traductionnel des ARNm Lhc, les ARN extraits de chaque fraction du
gradient de saccharose ont été reverse-transcrits et amplifiés par PCR. L’ARNm codant
l’antenne majeure Lhcb1 est associé aux fractions polysomales (fractions 1-3) dans toutes les
conditions testées (Figure R2-2). Cependant, après une exposition de quinze jours à la forte
lumière, Lhcb1 est moins associé aux polysomes par rapport aux échantillons contrôles. Ce
résultat est cohérent avec les données disponibles dans la littérature qui indiquent que
l’accumulation des antennes majeures LHCII est diminuée après quinze jours de traitement à
la forte lumière (Walters, 2005; Ballottari et al., 2007). Concernant les transcrits codants les
antennes mineures Lhcb5 et Lhcb6, ils demeurent fortement associés aux polysomes après
quinze jours de traitement par la faible lumière. Après traitement à la forte lumière, seul le
transcrit Lhcb5 est toujours associé aux polysomes, tandis que Lhcb6 n’est plus détectable.
Nous avons également testé l’association des transcrits codant l’antenne mineure Lhcb4. Nous
avons utilisé des amorces spécifique permettant de discriminer les transcrits issus de deux
gènes codant pour deux isoformes de l’antenne Lhcb4 : Lhcb4.2 et Lhcb4.3. En condition de
lumière contrôle, Lhcb4.2 semble être préférentiellement associé aux polysomes. Cette
association est encore renforcée pour Lhcb4.2 en réponse à la faible lumière. Au contraire, en
réponse à la forte lumière, c’est Lhcb4.3 qui est associé aux polysomes. Nous avons
également analysé la répartition de l’ARNm ELIP2 (Early Light Induced Protein2), qui code
une protéine antenne spécialisée dans la réponse à la forte lumière. En condition contrôle, le
transcrit ELIP2 n’est pas associé aux polysomes. Après une heure de traitement à la lumière,
forte ou faible lumière, ELIP2 est associé aux polysomes. Après trois heures de traitement à la
forte lumière, ELIP2 est toujours associé aux polysomes. Après quinze jours de traitement à la
forte lumière, ELIP2 n’est plus associée aux polysomes.
En conclusion, ces données confirment que la taille de l’antenne majeure LHCII est réduite en
réponse à la forte lumière. Concernant les antennes mineures du PSII, Lhcb5 et Lhcb6
semblent être particulièrement associés aux polysomes en conditions de basse lumière. Enfin,
cette analyse suggère que les isoformes de Lhcb4 ont des fonctions différentes et ne sont pas
toujours coexprimées. En effet, Lhcb4.2 est fortement associé aux polysomes en condition de
faible lumière, tandis que Lhcb4.3 est associé aux polysomes en conditions de forte lumière.
Cette analyse sera complétée par les données concernant les autres Lhcb ainsi que les Lhca
(antennes du PSI).
3. MISE EN EVIDENCE DE REGULATIONS TRADUCTIONNELLES DE L’EXPRESSION DE
CERTAINES LHC
75

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
Afin de démontrer l’existence d’une régulation traductionnelle, il est nécessaire de mettre en
évidence un découplage entre transcription et traduction. Pour ce faire, on quantifie
l’accumulation d’un transcrit d’intérêt dans les ARN totaux, et on compare ces données à la
quantification du même transcrit dans les ARN polysomaux. Enfin, il est nécessaire de
confirmer l’efficacité de la régulation traductionnelle par l’analyse de l’accumulation des
protéines correspondantes.
Nous avons réalisé cette analyse pour tous les points de la cinétique mais seules les données
obtenues après trois heures de traitement à la lumière seront présentées ici. Concernant
l’accumulation dans les ARN totaux, qui reflète l’activité transcriptionnelle, les transcrits
Lhcb1, Lhcb4.2, et Lhcb6 s’accumulent moins en réponse au traitement par la forte et faible
lumières par rapport aux conditions contrôle (Figure R2-3). Au contraire, l’accumulation des
transcrits Lhcb4.3 et ELIP2 est augmentée en réponse à la forte lumière. Concernant les
données obtenues pour l’accumulation des transcrits dans les ARN polysomaux, on observe
que Lhcb1 est déchargé des polysomes en réponse à la forte lumière ainsi qu’en faible lumière
(Figure R2-3). A nouveau, cette observation est cohérente avec la baisse de la taille des
LHCII en forte lumière. Dans le cas des antennes mineures Lhcb6 et Lhcb4.2, les transcrits
s’accumulent dans les polysomes en réponse à la faible lumière. Ceci suggère que la
traduction des ARNm Lhcb4.2 et Lhcb6 est régulée positivement après trois heures de
traitement à la faible lumière. Inversement, les transcrits Lhcb4.3 et ELIP2 s’accumulent dans
les polysomes en réponse à la forte lumière, ce qui suggère que leur traduction est régulée
positivement après trois heures de traitement à la forte lumière.
En conclusion, d’une part ces données confirment que l’expression des gènes Lhc est
différentiellement régulée en fonction de l’intensité lumineuse. D’autre part, elles apportent la
première preuve de l’existence d’une régulation traductionnelle de l’expression des Lhc en
réponse à la lumière. Enfin, ces analyses semblent confirmer que l’expression des isoformes
Lhcb4.2 et Lhcb4.3 n’est pas co-régulée.
4. LA TRADUCTION CYTOPLASMIQUE COMME CIBLE PRECOCE DE LA SIGNALISATION
RETROGRADE
La signalisation rétrograde correspond à un ensemble de signaux dont la nature reste, pour la
plupart, à découvrir. L’ensemble de ces signaux coordonne le métabolisme du chloroplaste et
l’expression des gènes nucléaires dont les produits sont destinés au chloroplaste (Fernandez
and Strand, 2008; Woodson and Chory, 2008). Dans le paragraphe précédent, l’analyse
76

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
comparée de l’accumulation des transcrits Lhc dans les ARN totaux et dans les ARN
polysomaux a révélé que l’expression de certaines antennes semble être régulée
traductionnellement. Nous nous sommes ensuite intéressés à la cinétique de la mise en place
de ces régulations traductionnelles. En effet, on peut facilement imaginer que les signaux
provenant du chloroplaste, destinés au noyau, passent par le cytoplasme. Il semblerait donc
que la traduction cytoplasmique puisse représenter une cible précoce de la signalisation
rétrograde qui permettrait de réguler très rapidement l’expression des transcrits en réponse à
un changement environnemental perçu par le chloroplaste. Afin de déterminer si la régulation
traductionnelle dans le cytoplasme précède la régulation transcriptionnelle dans le noyau,
nous avons comparé l’accumulation des transcrits Lhc dans les ARN totaux d’une part, et
dans les ARN polysomaux d’autre part, au cours du temps.
Les résultats obtenus pour les transcrits ELIP2 et Lhcb4.3 sont présentés (Figure R2-4). Dans
les deux cas, nous avons pu mettre en évidence que les transcrits s’accumulent dans les ARN
polysomaux dès une heure d’exposition à la forte lumière, tandis que la transcription nucléaire
n’est activée qu’entre trois heures et cinquante et une heures de traitement. Ceci suggère
qu’une composante de la signalisation rétrograde régule la traduction cytoplasmique avant de
réguler la transcription nucléaire dans le cas d’ELIP2 et de Lhcb4.3 (Figure R2-4). Après
quinze jours de traitement à la forte lumière, la transcription est activée et les transcrits sont
déchargés des polysomes.
5. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Tandis que les connaissances sur les mécanismes de la photosynthèse et sur la structure de
l’appareil photosynthétique avancent à grands pas, le domaine de la régulation de l’expression
des gènes de la photosynthèse en réponse à la lumière demeure très peu exploré chez les
plantes terrestres (Dietzel et al., 2008; Horton et al., 2008; Kargul and Barber, 2008). Chez
Arabidopsis, des travaux récents ont mis a disposition des données de transcriptome en
réponse à la lumière (Klimmek et al., 2006; Piippo et al., 2006), ainsi que des données
protéiques (Ballottari et al., 2007). Chez l’orge, une analyse comparé des données de
transcriptome et de protéomique a été réalisée (Frigerio et al., 2007). Le découplage entre ces
deux jeux de données a révélé que l’expression des gènes Lhc est régulée posttranscriptionnellement,
probablement via l’état redox du pool de plastoquinones (PQ)
chloroplastiques (Frigerio et al., 2007). De plus, l’existence de régulations traductionnelles
impliquées dans l’expression des gènes Lhcb a été mise en évidence chez le tabac et chez
Chlamydomonas (Tang et al., 2003; McKim and Durnford, 2006).
77

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
Notre analyse chez Arabidopsis indique que le niveau global de traduction est fortement
régulé par la quantité de lumière. En particulier, elle suggère l’implication de régulations
traductionnelles dans l’expression des gènes Lhc en réponse à la lumière. Le fait que les
transcrits des antennes mineures Lhcb4.2 et Lhcb6 soient déchargées dans les polysomes en
condition de forte lumière suggère que ces protéines sont spécialement impliquées dans la
collecte de la lumière. Au contraire, le chargement dans les polysomes des transcrits Lhcb4.3
et ELIP2 suggère que les antennes correspondantes sont spécialisées dans la photoprotection.
Ces données seront confirmées grâce à la quantification des protéines Lhc dans les différentes
conditions expérimentales (travaux en cours, coll. A. Alboresi).
Il semble clair que les isoformes Lhcb4.2 et Lhcb4.3 ne possèdent pas les mêmes propriétés
au sein du système antennaire du PSII. En effet, si Lhcb4.2 s’accumule en faible lumière,
tandis que Lhcb4.3 s’accumule en forte lumière, on peut penser que la première antenne est
spécialisée dans la capture de la lumière, tandis que la seconde est plus efficace pour la
photoprotection. Dans une étude précédente, il a été proposé de remplacer le nom de Lhcb4.3
par celui de Lhcb8 (Klimmek et al., 2006).
La signalisation entre noyau et organelles est un domaine de recherche très actif. En
particulier il apparaît que les mécanismes de signalisation entre noyau et chloroplastes sont
multiples et complexes (Fernandez and Strand, 2008; Woodson and Chory, 2008). Dans la
dernière partie de ce travail, nos données suggèrent qu’en réponse à la lumière la régulation
traductionnelle cytoplasmique précède la régulation transcriptionnelle dans le noyau. Ceci
signifierait qu’une composante de la signalisation rétrograde serait capable de réguler le
niveau de traduction de certains transcrits. Il a été proposé que l’état redox du pool de PQ
serait impliqué dans la régulation traductionnelle chez l’orge et chez le tabac (Petracek et al.,
1997; Frigerio et al., 2007). Cependant la nature du signal impliqué reste à identifier.
Dans un avenir proche nous allons réaliser l’analyse de l’accumulation des Lhc dans chaque
condition expérimentale afin de confirmer que les régulations de l’expression mises en
évidence sont corrélées à la quantité de protéines. En parallèle, la stratégie mise en place sera
appliquée à l’étude de chaque protéine antenne, celles du PSII ainsi que celles du PSI. Nous
pensons que l’ensemble des ces données d’expression constituera une base de travail utile à la
compréhension des mécanismes de collecte de la lumière, de photoprotection et
d’acclimatation. Enfin, afin de confirmer que les régulations observées sont bien issues d’un
signal en provenance du métabolisme chloroplastique, nous analyserons l’état des régulations
78

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
de l’expression des Lhc après un traitement par un agent de découplage du transport
d’électrons tel que le DCMU. L’étude de la composante de la signalisation rétrograde
impliquée dans la régulation traductionnelle s’inscrit dans un projet à plus long terme. Il
pourra être envisagé d’utiliser des mutants affectés dans une des voies de signalisation, des
mutants gun par exemple (discussion générale).
79

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
II. UNE NOUVELLE VOIE TAS IMPLIQUEE DANS LA BIOSYNTHESE
D’ANTHOCYANES EN REPONSE A LA FORTE LUMIERE.
Après avoir mis en évidence l’existence de régulations post-transcriptionnelles de
l’expression des Lhc en réponse à la forte lumière, nous avons souhaité mettre en évidence les
mécanismes moléculaires impliqués. Nous avons utilisé une approche génétique qui a consisté
à exposer à la forte lumière des plantes mutantes affectées dans la mise en place de certaines
régulations post-transcriptionnelles.
1. LES MUTANTS AGO1 N’ACCUMULENT PAS D’ANTHOCYANES EN REPONSE A LA FORTE
LUMIERE
Nous avons ainsi exposé divers mutants du RNA silencing à la forte lumière pendant quinze
jours et comparé les phénotypes observés à ceux des plantes sauvages. Dans le cas des plantes
sauvages, l’exposition à la forte lumière conduit à l’accumulation d’anthocyanes au niveau
des tissus photosynthétiques (Figure R2-5). Les deux allèles mutants ago1 (ago1-4 et ago1-
25) hypomorphes n’accumulent pas d’anthocyanes après quinze jours d’exposition à la forte
lumière. Ceci indique que les voies du RNA silencing seraient impliquées dans la mise en
place de cette réponse au stress lumineux. Nous avons également testé la réponse du mutant
rdr6-11, affecté dans la production des ta-siARNs. En réponse à la forte lumière, rdr6-11 est
capable de synthétiser des anthocyanes mais pas à un niveau équivalent à celui des plantes
sauvages (Figure R2-5B).
2. PREDICTION DU LOCUS TAS4 ET VOIE DE BIOSYNTHESE DES ANTHOCYANES
Comme indiqué précédemment, à l’heure actuelle trois loci TAS ont été caractérisés chez
Arabidopsis. Les ARNs non codant transcrits à partir du locus TAS sont reconnus et clivés par
des complexes miRNPs contenant un miARN incorporé à une protéine AGO (Allen et al.,
2005). Chacun de ces précurseurs TAS, sous l’action de RDR6 et d’une protéine DCL,
produisent des ta-siARNs impliqués dans la régulation de l’expression de protéines
impliquées dans le développement (Tableau I1-3).
Des analyses bioinformatiques visant à identifier de nouveaux sARNs ont prédit l’existence
d’un nouveau locus précurseur de ta-siARNs nommé TAS4 situé entre les gènes At3g25800 et
At3g25790 (Rajagopalan et al., 2006) (Figure R2-6). Par une nouvelle recherche bioinformatique,
les auteurs ont identifié un site de complémentarité avec le miR828 en 5’ de
80

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
l’ARN TAS4 (Figure R2-6). Des expériences de 5’-RACE ont permis d’identifier des produits
de clivage du TAS4 correspondant à la région de complémentarité avec le miR828
(Rajagopalan et al., 2006). Un seul des ta-siARNs produits à partir du brin complémentaire de
l’ARN TAS4 a pu être identifié par séquençage a haut débit (Illumina), il a été nommé
siARN81(-) (siR81). Trois cibles ont été prédites pour le siR81 : PAP1/MYB75/At1g56650,
PAP2/MYB90/At1g66390, et MYB113/At1g66370 (Figure R2-6B). Chacune de ces cibles
potentielles code un facteur de transcription MYB impliqué dans la voie de biosynthèse des
anthocyanes. Des expériences de 5’-RACE ont permis de détecter les produits de clivage de
PAP2 au correspondant à la région de complémentarité avec le siR81 (Rajagopalan et al.,
2006). Le transcrit MYB113 présente une région de complémentarité avec le siR81 mais aussi
une deuxième région de complémentarité avec le miR828 (Figure R2-6B). Des produits de
clivage ont également pu être détectés pour MYB113 au niveau de la région de
complémentarité avec le miR828 (Rajagopalan et al., 2006).
L’expression des gènes structuraux impliqués dans la phase « tardive » de la voie de
biosynthèse des anthocyanes (Late Biogenesis Genes LBG) est régulée par un complexe
transcriptionnel MBW à trois partenaires : une protéine R2R3-MYB, une protéine b-HLH
(basic helix-loop-helix), et une protéine WD40. Dans le cas de la biosynthèse des anthocyanes
au niveau de tissus végétatifs, la protéine WD40 dans le complexe MBW est invariablement
TTG1, tandis que l’identité des deux autres partenaires est variable (Figure I2-7). Parmi les
quatre candidats MYB potentiels (PAP1, PAP2, MYB113, MYB114), il a été montré que
PAP1 est le partenaire du complexe actif MBW.
3. LA VOIE TAS4 EST REGULEE PAR LA FORTE LUMIERE
a. DETECTION DU SIR81 PAR NORTHERN BLOT
Afin de confirmer les prédictions de Rajagopalan et al, nous avons réalisé une expérience de
northern blot dans le but de détecter le siR81 et le miR828 parmi des ARNs totaux extraits de
plantes exposées aux différentes conditions de lumière. Nous avons pu détecter le siR81
uniquement dans les échantillons extraits de plantes exposées à la forte lumière (HL) (Figure
R2-7). Ce résultat constitue le premier exemple d’un siARN dont l’accumulation est induite
par la forte lumière. Il est probable que le siR81 n’ait pas été détecté précédemment du fait
des conditions environnementales particulières nécessaires à son accumulation. Dans le cas du
miR828 de nouvelles expériences sont en cours pour tenter de le détecter. Sur la même
membrane, nous avons détecté le miR398, cible des superoxydes dismutases, en conditions
81

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
contrôle et forte lumière. Ces résultats montrent que le siR81 existe et qu’il s’accumule en
réponse à la forte lumière. Cette détection constitue donc la première preuve expérimentale de
l’existence du TAS4 et de la régulation de l’accumulation d’un sARN en réponse à la lumière.
Afin de caractériser l’impact de la lumière sur la voie TAS4 nous avons quantifié d’une part
l’accumulation des transcrits non codant TAS4 et AtMIR828, et d’autre part l’accumulation
des cibles potentielles du siR81. Les expériences suivantes ont été réalisées à partir de plantes
sauvages, de mutants rdr6-11 et ago1-25. L’analyse du mutant ago1-4 est en cours, elle
s’avère plus délicate étant donné son phénotype moléculaire original (chapitre précédent).
b. EXPRESSION DES TRANSCRITS NON CODANTS IMPLIQUES DANS LA VOIE DE
PRODUCTION DU SIR81
i. Expression du locus TAS4
Dans le but d’identifier une régulation de la transcription du locus TAS4 par la lumière nous
avons testé l’accumulation du transcrit non codant dans chacune des conditions
expérimentales. Dans le cas des plantes sauvages, les transcrits TAS4 ne s’accumulent qu’en
forte lumière, et particulièrement après quinze jours (Figure R2-8A). Chez le mutant ago1-25
l’accumulation de TAS4 ne semble pas très différente par rapport au sauvage (Figure R2-8B).
Par contre pour le mutant rdr6-11 on observe une très forte accumulation du TAS4 en
condition contrôle après quinze jours (Figure R2-8B). Ceci indique que chez les plantes
sauvages, l’accumulation du transcrit TAS4 est régulée positivement en forte lumière. On peut
aussi envisager que la transcription soit inhibée en condition de lumière contrôle ou de faible
lumière. Sur la base de ces premiers résultats il n’est pas possible de déterminer si la
régulation est transcriptionnelle ou post-transcriptionnelle. Les résultats obtenus pour le
mutant rdr6-11 laissent penser que l’accumulation du TAS4 est fortement dé-réprimée en
condition contrôle après 15 jours. Deux hypothèses pourraient expliquer ces observations :
soit l’absence de RDR6 entraine le blocage de la voie de production des siARNs et
l’accumulation du TAS4 sous sa forme simple brin, soit l’accumulation du TAS4 est ellemême
régulée post-transcriptionnellement par un autre siARN.
ii. Expression du locus MIR828
Nous avons ensuite testé l’accumulation du précurseur MIR828, également impliqué dans la
voie TAS4. Les transcrits MIR828 s’accumulent faiblement et de manière égale dans toutes les
conditions chez les plantes sauvages et ago1-25 (Figure R2-8C). Chez le mutant rdr6-11
l’accumulation de MIR828 est déréprimée en condition contrôle après quinze jours (Figure
R2-8D). L’accumulation du précurseur MIR828 ne semble donc pas être régulée par la
82

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
lumière. Les mutations dans AGO1 ne paraissent pas affecter l’expression du précurseur. La
mutation dans RDR6, quant à elle, affecte l’accumulation de MIR828 en condition contrôle
après quinze jours. Cependant l’existence d’un rôle de RDR6 dans la production des miARN
n’a jamais été décrit.
4. RECHERCHE DES CIBLES POTENTIELLES DU SIR81
Après avoir observé l’expression des transcrits TAS4 et MIR828 tous deux impliqués dans la
production du siR81, on s’intéresse maintenant à l’expression des cibles potentielles du siR81.
Afin de différencier les transcrits entiers des transcrits clivés par les complexes siR81/AGO,
nous avons désigné des amorces de part et d’autre du site de clivage pour chacune des cibles.
a. PAP1
L’expression de PAP1 montre que chez le sauvage les transcrits s’accumulent en forte lumière
et plus fortement après quinze jours (Figure R2-9A). La régulation par la lumière de
l’accumulation de PAP1 ne semble pas être affectée chez le mutant ago1-25 bien que le
niveau d’accumulation soit plus faible que chez le sauvage (Figure R2-9B). Par contre chez le
mutant rdr6-11, PAP1 ne s’accumule plus en forte lumière après quinze jours (Figure R2-9B).
Ces résultats indiquent que PAP1 s’accumule en forte lumière. La mutation rdr6-11 annule
l’induction en forte lumière. Ces données suggère que l’accumulation de PAP1 en forte
lumière dépend des fonctions de RDR6 mais pas de celles d’AGO1 qui sont affectées chez
l’allèle hypomorphe ago1-25. On peut envisager qu’une autre protéine AGO intervient dans
cette voie de régulation.
b. PAP2
Chez les plantes sauvages, le transcrit PAP2 s’accumule en forte lumière et plus fortement
après quinze jours (Figure R2-9C). Dans le cas du mutant ago1-25, la régulation par la
lumière de l’accumulation du transcrit PAP2 est conservée (Figure R2-9C). Bien que les
quantités relatives de transcrit PAP2 soient plus faibles chez le mutant que chez le sauvage
(Figure R2-9D), la réponse du mutant en forte lumière est plus importante que celle du
sauvage (Figure R2-9C). En effet, lorsque l’on s’intéresse aux variations pour chaque
génotype par rapport à sa valeur contrôle (Figure R2-9C), on observe que l’induction de
l’accumulation de PAP2 est deux fois supérieure chez le mutant ago1-25 que chez le sauvage.
Chez rdr6-11 la régulation par la forte lumière est également conservée. Cependant on note
que le transcrit PAP2 s’accumule plus chez rdr6-11 en condition contrôle après quinze jours
par rapport au sauvage. (Figure R2-9C). En conclusion l’expression de PAP2 est régulée
positivement par la forte lumière. La suraccumulation de PAP2 chez ago1-25 en forte lumière
83

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
après quinze jours pourrait indiquer que AGO1 régule négativement l’accumulation de PAP2,
possiblement via le siR81. L’accumulation de PAP2 en lumière contrôle après quinze jours
chez rdr6-11 laisse penser que RDR6 réprime PAP2, peut-être via la voie TAS4.
c. MYB113
Chez les plantes sauvages le transcrit MYB113 s’accumule en forte lumière et plus fortement
après quinze jours. (Figure R2-9E). Chez les mutants la régulation en forte lumière est
conservée mais beaucoup moins importante. Ces résultats indiquent que MYB113 est induit en
forte lumière chez les plantes sauvages. Les mutations ago1-25 et rdr6-11 semblent avoir
partiellement perdu cette induction.
5. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Un bilan des données est présenté sous forme de tableau (Figure R2-10A). Les premiers
résultats obtenus confirment l’implication du RNA silencing dans la voie de biosynthèse des
anthocyanes. En particulier, nous avons montré par RT-PCR quantitative que l’accumulation
du précurseur TAS4 est induite en forte lumière (Figure R2-8A). Ces résultats ont été corrélés
avec la détection par northern blot du siR81 après quinze jours d’exposition à la forte lumière
(Figure R2-7). Concernant les cibles prédites du siR81, nous avons testé l’accumulation des
transcrits PAP1, PAP2, MYB113 dans les différentes conditions. Chez les plantes sauvages,
les cibles s’accumulent en forte lumière après quinze jours (Figure R2-9). L’analyse de
l’accumulation des cibles du siR81 chez les mutants ago1-25 et rdr6-11 a confirmé
l’implication du RNA silencing dans la voie de biosynthèse des anthocyanes. D’après
l’analyse de ces premières données, nous pouvons imaginer un modèle (Figure R2-10). Ce
modèle est constitué de deux voies qui sont activées par la forte lumière. Une première voie
permettrait de réprimer l’expression de PAP2. Les transcrits TAS4 et PAP2 s’accumulent en
forte lumière. Cette régulation est affectée chez les mutants ago1-25 et rdr6-11. L’hypothèse
la plus vraisemblable est que PAP2 soit la cible du siR81 en forte lumière. Une voie seconde
voie permettrait d’activer l’expression de PAP1 et MYB113 en forte lumière, conduisant ainsi
à la synthèse des anthocyanes. Cette seconde voie impliquerait la présence d’un répresseur de
PAP1 et MYB113 car l’expression de ces gènes semble être activée par AGO1 et RDR6 en
forte lumière. Ainsi, en condition contrôle, l’expression de PAP1 et MYB113 serait régulée
négativement par un répresseur qui reste à identifier. En forte lumière, les transcrits PAP1 et
MYB113 s’accumulent pour activer la voie de biosynthèse des anthocyanes.
84

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
Une hypothèse serait que PAP2 soit le répresseur de PAP1 et MYB113. Parmi les quatre
candidats MYB potentiels (PAP1, PAP2, MYB113, MYB114), il a été proposé que PAP1 soit
le partenaire du complexe actif MBW. En effet, les protéines PAP1 et PAP2 présentent 77%
d’identités, et la surexpression de chacune des deux conduit à l’accumulation constitutive
d’anthocyanes chez Arabidopsis et chez le tabac (Borevitz et al., 2000). De plus, chacun des
deux facteurs de transcription est capable de lier les partenaires bHLH dans un système de
double hybride (Zimmermann et al., 2004). Cependant, deux études ont récemment montré
que les contributions de PAP1 et PAP2 au sein du complexe MBW actif sont différentes.
Dans la première étude, des expériences de gène rapporteur ont clairement indiqué que seul
PAP1 est fortement exprimé en conditions de croissance sur milieu sucré (source de stress)
(Gonzalez et al., 2008). D’autre part, l’inhibition de l’expression des R2R3MYB, par un
système de RNA silencing inductible, a permis de montrer que, en absence d’expression de
PAP1, l’accumulation d’anthocyanes est réduite de 85%. Dans le cas de l’inhibition de
l’expression de PAP2, l’accumulation d’anthocyanes n’est pas modifiée par rapport aux
plantes sauvages (Gonzalez et al., 2008). Enfin, la deuxième étude a montré, en utilisant des
lignées de surexpression, que PAP1, et non PAP2, stimule l’expression des gènes structuraux
de la biosynthèse des anthocyanes en réponse à la lumière (Cominelli et al., 2008). Ces
données récentes indiquent que les partenaires R2R3-MYB ne doivent pas intervenir de
manière équivalente pour la formation du complexe MBW actif. Il est connu que la formation
du complexe MBW, qui active la biosynthèse des anthocyanes, est régulée par la disponibilité
du partenaire b-HLH. Ce dernier peut-être séquestré par un facteur de type R3-MYB (Dubos
et al., 2008). Cependant des facteurs de type R2R3-MYB peuvent également réguler
négativement la biosynthèse des anthocyanes (Jin et al., 2000; Park et al., 2008). Bien que
PAP2 appartienne à la famille des R2R3-MYB, ont pourrait imaginer que PAP2 entre en
compétition avec PAP1 pour la formation du complexe actif.
Nous sommes actuellement en train de cribler des lignées T-DNA qui ne produisent plus de
TAS4. Nous allons analyser la réponse de ces lignées à la forte lumière et comparer ces
données avec celles obtenues pour des mutants pap2. Nous souhaitons également étudier la
mise en place de la voie TAS4 et la biosynthèse des anthocyanes chez d’autres mutants
affectés dans les voies du RNA silencing. En particulier, nous souhaiterions utiliser des
mutants affectés dans l’activité d’autres protéines AGO, d’autres protéines RDR, mais aussi
des mutants affectés dans la biogenèse des miARNs tels que des mutants multiples dcl
(dcl2dcl4 ou dcl2dcl3dcl4). Il est intéressant de noter que les double mutants dcl2dcl4 sont
85

R2_Régulations post‐transcriptionnelles et réponses à la lumière
anthocyanées de façon constitutive. Il va sans dire que la caractérisation d’une nouvelle voie
TAS spécialisée dans la réponse à la lumière représente un enjeu important.
86

Forte lumière
Lumière contôle
Faible lumière
DO254nm
1h
51h
polysomes
3h
15j
Figure R2-1. La quantité de lumière modifie le profil de polysomes. Les extraits cytoplasmiques
préparés à partir de plantes exposées à trois quantités de lumière (lumière contrôle CL, lumière forte HL,
lumière faible LL) sont séparés sur un gradient de saccharose par ultracentrifugation. La lecture de la
densité optique à 254nm (DO254nm) donne une image de la distribution des ribosomes le long du gradient.
Les polysomes se trouvent dans les fractions lourdes du gradient (à gauche sur le spectre). L'expérience est
réalisée après une heure, trois heures, cinquante et une heures ou quinze jours de traitement par la lumière.

Lhcb1.2
Lhcb4.2
Lhcb4.3
Lhcb5
Lhcb6
ELIP2
1h 3h 51h 15d
Poly. Poly. Poly. Poly.
Figure R2-2. L'association des ARNm Lhc aux polysomes est modulée par l'intensité
lumineuse. Les ARN extraits de chacune des six fractions du gradient sont reverse transcrits et
amplifiés avec des amorces spécifiques. Les produits d'amplification sont séparés sur gel d'agarose
et colorés au BEt. La répartition des signaux donne une image qualitative de la répartition des
ARNm dans le gradient.
CL
HL
LL

AU
AU
AU
6
4.5
3
1.5
0
total RNA polysomal RNA
CL 1 1
HL 0.18 0.62
LL 0.01
6
4.5
3
1.5
0
6
4.5
3
1.5
0
Lhcb1.2
Lhcb4.3
total RNA polysomal RNA
CL 1 1
Lhcb6
total RNA polysomal RNA
CL 1 1
0.48
HL 1.22 5.18
LL 0.54 1.05
HL 0.35 0.80
LL 0.12 1.98
AU
AU
AU
total RNA polysomal RNA
CL 1 1
HL 0.37 0.37
LL 0.06 2.97
Figure R2_3. L'expression de certaines Lhc est régulée traductionnellement. L'accumulation des
ARNm Lhc est analysée par RT-PCR en temps réel dans les ARN totaux et dans les ARN
polysomaux après trois heures de traitement par trois quantités de lumière (lumière contrôle CL,
forte lumière HL, et faible lumière LL) . Les résultats sont normalisés par rapport à la quantification
des transcrits Actine2. AU: Unités Arbitraires.
6
4.5
3
1.5
0
6
4.5
3
1.5
0
40
30
20
10
0
Lhcb4.2
Lhcb5
total RNA polysomal RNA
CL 1 1
HL 0.48 0.56
LL 0.08 0.78
ELIP2
total RNA polysomal RNA
CL 1 1
HL 5.16 34.86
LL 0.91 0.49

UA
UA
60
45
30
15
0
20
15
10
total ELIP2
1h 3h 51h 15d
CL 1 1 1 1
HL 1.34 5.16 0.18 53.12
LL 1.43 0.91 0 0.37
5
0
total Lhcb4.3
1h 3h 51h 15d
CL 1 1 1 1
HL 1.06 1.22 1.24 18.49
LL 1.67 0.54 0.05 0.01
UA
UA
60
45
30
15
0
20
15
10
polysomal ELIP2
1h 3h 51h 15d
CL 1 1 1 1
HL 7.55 34.86 38.84 0.29
LL 0.69 0.49 0.06 0.03
5
0
polysomal Lhcb4.3
1h 3h 51h 15d
CL 1 1 1 1
HL 1.47 5.18 11.46 0.04
LL 0.50 1.05 0.01 0.01
Figure R2-4. La régulation de la traduction cytoplasmique précède la régulation de la
transcription nucléaire. L'accumulation des ARNm Lhc est analysée par RT-PCR en temps réel
dans les ARN totaux et dans les ARN polysomaux après une heure, trois heures, cinquante et une
heures, et quinze jours de traitement par trois quantités de lumière (lumière cintrôle CL, forte lumière
HL, et faible lumière LL) . Les résultats sont normalisés par rapport à la quantification des transcrits
Actine2. AU: Unités Arbitraires.

A.
B.
relative units of anthocyanins/g fresh
weight of tissue
4
2
0
15
10
5
0
Col0
CL
ago1-4
Col0
HL
ago1-4
Col0 rdr6-11 ago1-25
Anthocyanes
ago1-4 Col0
Col0 rdr6-11 ago1-25
HL
Forte lumière (HL)
Lumière contrôle (CL)
Figure R2-5. Les mutants ago1-4, ago1-25, et rdr6-11 sont affectés dans la biosynthèse des
anthocyanes en réponse à la forte lumière. A. Phénotype des mutants RNA silencing exposés à la
forte lumière (HL) par rapport aux plantes sauvages (Col0). B. Dosage des anthocyanes par
spectrophotométrie.

A.
At3g25790 TAS4
AGO?
5'
miR828
3'
5'
DCL?
DRB?
HEN1?
DCL?
DRB?
HEN1?
siR81(-)
B. PAP1/MYB75 5'-.........AGCCUCGACCUCGAUCCUUCA
DCL?
DRB?
HEN1?
siR81(-) 3'........ACGGAGCUGGAGCUAGGAAGU
PAP2/MYB90 5'-.........AGCCUCGACCUCGAUCCUUCU
siR81(-) 3'........ACGGAGCUGGAGCUAGGAAGU
MYB113 5'-.........AGCCUCGGCCUCGAUCCUUCU
siR81(-) 3'........ACGGAGCUGGAGCUAGGAAGU
MYB113 5'-.........UGGAACACUCAUUUGAGUAAGA
miR828 3'......... ACCUUAUGAGUAAAUUCGUUCU
DCL?
DRB?
HEN1?
DCL?
DRB?
HEN1?
At3g25800
SGS3?
3'
RDR? SDE3?
Figure R2-6. Le locus TAS4, d'après Rajagopalan et al., 2006. A. Voie de production putative des
ta-siARNs à partir du locus TAS4. Le transcrit TAS4 non codant serait reconnu par le miARN828
incorporé dans une protéine Argonaute (AGO). Le transcrit clivé serait reconnu en 3' par un mécanisme
inconnu et le double brin ARN produit sous l'action d'une ARN polymérase ARN dépendante (RDR).
Le double brin est clivé séquentiellement par une protéine Dicer-like (DCL) pour produire les duplex
de 21nt de ta-siARNs dont siR81. B. Le siR81 est partiellement complémentaire à trois facteurs de
transcription impliqués dans la voie de biosynthèse des anthocyanes : PAP1, PAP2 et MYB113. De plus,
le transcrit MYB113 porte également un motif de reconnaissance pour le miR828.

siR81
miR398
A.
C.
UA
UA
120
80
40
0
40
30
20
10
0
3h 51h 15j
CL HL LL CL HL CL HL
Figure R2-7. Le ta-siARN81 ne s'accumule qu'après quinze jours
d'exposition à la forte lumière. Détection par northern blot de siR81 et
miR398 dnas les différentes conditions expérimentales. La coloration au
BEt de l'ARNr est présentée comme témoin de charge.
TAS4
**
wt ago1-25 rdr6-11
C3 1 1 1
H3 8.64 2.95 8.72
L3 0.08 0.39 1.35
CA 0.07 0.81 158.84
HA 70.16 49.95 1988.98
LA 0.64 2.45 0.01
MIR828
wt ago1-25 rdr6-11
C3 1 1 1
H3 0.91 0.77 2.31
L3 0.10 0.40 3.96
CA 0.21 0.89 34.88
HA 0.31 1.34 1.90
LA 0.34 1.14 2.76
B.
D.
UA
UA
5
4
3
2
1
0
8
6
4
2
0
TAS4
C3 H3 L3 CA HA LA
wt 1 1 1 1 1 1
ago1-25 0.24 0.08 1.16 2.83 0.17 0.91
rdr6-11 0.09 0.09 1.55 214.62 2.62 0
MIR828
C3 H3 L3 CA HA LA
wt 1 1 1 1 1 1
ago1-25 0.17 0.14 0.68 0.73 0.73 0.57
rdr6-11 0.04 0.10 1.62 6.98 0.25 0.34
Figure R2-8. La voie TAS4 est régulée par la lumière. Quantification des transcrits précurseurs
TAS4 et MIR828 par RT-PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés par rapport à la
quantification des transcrits ACT2 après trois heures et quinze jours de traitement par les trois
conditions de lumière (lumière contrôle C, forte lumière H, et faible lumière L). Les valeurs sont
exprimées en unités arbitraires (UA). Les astérisques montrent les barres de l'histogramme qui ont
été tronquées. A, C. Quantification des transcrits présentée par génotype et normalisée par rapport
aux données obtenues en lumière contrôle. Cette analyse permet de comparer les variations au sein
de chaque génotype en fonction des conditions de lumière. B, D. Quantification des transcrits
présentée par condition de lumière et normalisée par rapport à la valeur obtenue pour les plantes
sauvages. Cette analyse permet de mieux apprécier les différences entre mutants et sauvages.
*

A. PAP1
B.
120
* *
UA
C. D.
PAP2
UA
E. MYB113
F.
UA
80
40
0
120
80
40
0
40
30
20
10
0
* * *
wt ago1-25 rdr6-11
C3 1 1 1
H3 10.26 34.62 16.04
L3 0.09 0.01 0.01
CA 0.23 8.73 42.88
HA 1681.46 4525.91 1669.65
LA 0.12 2.41 0.10
wt ago1-25 rdr6-11
C3 1 1 1
H3 4.11 0.56 0.79
L3 0.56 0.21
CA 1.71 0.45
HA 23.08 3.29 2.70
LA 1.47
wt ago1-25 rdr6-11
C3 1 1 1
H3 12.47 23.49 186.32
L3 0 0.03 0
CA 0.86 1.51 0.18
HA 112.37 123.77 4.32
LA 0.01 0.08 0.01
0
0
0
0
UA
UA
UA
2
1.5
1
0.5
0
PAP1
C3 H3 L3 CA HA LA
wt 1 1 1 1 1 1
ago1-25 0.08 0.15 1.2 0.14 0.09 0.69
rdr6-11 0.01 0.11 0 0 0 0.01
5
4
3
2
1
0
PAP2
C3 H3 L3 CA HA LA
wt 1 1 1 1 1 1
ago1-25 0.05 0.17 0.01 1.93 0.13 0.98
rdr6-11 0.16 0.25 0.01 30.78 0.16 0.14
5
4
3
2
1
0
MYB113
C3 H3 L3 CA HA LA
wt 1 1 1 1 1 1
ago1-25 1.68 0.23 0.64 0.44 0.24
rdr6-11 0.95 0.18 0 0 0.11
Figure R2-9. Les cibles prédites du siR81 sont régulées par la lumière. Quantification des transcrits
précurseurs TAS4 et MIR828 par RT-PCR en temps réel. Afin de n'amplifier que les transcrits non clivés
par AGO, les amorces de PCR sont désignées de part et d'autre du site de clivage prédit. Les résultats sont
normalisés par rapport à la quantification des transcrits ACT2 après trois heures et quinze jours de
traitement par les trois conditions de lumière (lumière contrôle C, forte lumière H, et faible lumière L).
Les valeurs sont exprimées en unités arbitraires (UA). Les astérisques montrent les barres de
l'histogramme qui ont été tronquées. A, C, E. Quantification des transcrits présentée par génotype et
normalisée par rapport aux données obtenues en lumière contrôle. Cette analyse permet de comparer les
variations au sein de chaque génotype en fonction des conditions de lumière. B, D, F. Quantification des
transcrits présentée par condition de lumière et normalisée par rapport à la valeur obtenue pour les plantes
sauvages. Cette analyse permet de mieux apprécier les différences entre mutants et sauvages.
*
0
0

A.
B.
HL_15j wt ago1-25 rdr6-11
TAS4
MIR828
PAP1
PAP2
MYB113
RDR6
TAS4
siR81
PAP2
AGO1
+
+
+
-
/ /
-
++
++
+ - -
HL
RDR6
AGO1
/
-
/
Répresseur
PAP1
MYB113
anthocyanes
Figure R2-10. La voie TAS4 et biosynthèse d'anthocyanes en réponse à la forte lumière. A. Bilan
des données de PCR en temps réel représentant les quantités relatives d'ARN chez les plantes sauvages
et chez les mutants en réponse à quinze jours de traitement par la forte lumière. B. Proposition de
modèle pour le lien entre la voie TAS4 et la biosynthèse d'anthocyanes, établi sur la base des données
préliminaires.

DISCUSSION GENERALE
Discussion
En près d’un demi-siècle, l’explosion de la biologie moléculaire a révélé l’existence d’un
univers subcellulaire extrêmement complexe et réactif. Ces trente dernières années ont
largement été dédiées à la compréhension des mécanismes de régulation de l’expression des
gènes. En particulier, les régulations transcriptionnelles ont pu être analysées à grande échelle
grâce à l’approche transcriptomique. Le même type d’approches à grande échelle est
désormais appliqué à l’étude des protéines et de leurs interactions complexes. Cependant, les
étapes qui séparent la transcription de l’obtention d’une protéine fonctionnelle s’avèrent être
également largement régulées. La découverte récente du mécanisme de RNA silencing a
révélé à quel point les régulations post-transcriptionnelles sont répandues pour l’expression
des gènes chez les eucaryotes. Le RNA silencing consiste en une inhibition posttranscriptionnelle
de l’expression de certains ARNm sous l’effet de complexes
ribonucléoprotéiques contenant une petite molécule d’ARN non codant complémentaire à une
région de l’ARNm. La reconnaissance par hybridation moléculaire entre le petit ARN (sARN)
et le grand ARN codant (ARNm) conduit à l’inhibition de l’expression de ce dernier par
clivage et/ou par blocage de la traduction. Chez les plantes l’étude du RNA silencing s’est
jusqu’alors limitée à la recherche d’événements de clivage d’ARNm induits par des
complexes sRNP au cours du développement. Malgré les avancées énormes réalisées ces dix
dernières années dans la compréhension du mécanisme, de nombreux aspects restent à
explorer.
MECANISMES DU RNA SILENCING ET TRADUCTION
Une première partie de mon travail a permis de caractériser l’existence de lien physiques entre
les partenaires du RNA silencing et la machinerie traductionnelle. De plus, notre approche
ainsi que celle du groupe d’Olivier Voinnet ont révélé la fonction de régulation de la
traduction des sRNP dans les polysomes (Brodersen et al., 2008). La mise en évidence d’une
large place pour les régulations traductionnelles guidées par les miARNs et les siARNs chez
les végétaux ouvre de nouvelles perspectives. La part du RNA silencing dans les régulations
post-transcriptionnelles va très probablement s’avérer beaucoup plus étendue que ce qui a pu
être mis en évidence jusqu'à aujourd’hui. L’analyse de l’accumulation des ARNm révélant
une quantité constante de transcrits non clivés ne permettra plus de conclure à l’absence de
régulation par RNA silencing. En effet, il sera désormais nécessaire de s’intéresser à
86

l’accumulation des protéines afin de mettre en évidence des cibles de sRNPs. Par exemple, la
régulation de l’expression de CIP4.1 par RNA silencing a été mise en évidence récemment
(Brodersen et al., 2008). Bien que l’accumulation du transcrit CIP4.1 ne soit que peu affectée
chez les mutants du RNA silencing, CIP4.1 est bien la cible de miR834. En effet, miR834
réprime la traduction de CIP4.1 et la protéine CIP4.1 s’accumule chez le mutant ago1-25
tandis qu’elle est indétectable chez les plantes sauvages (Figure R1-5). Dans notre cas, nous
avons pu découpler les fonctions d’AGO1 (clivage et blocage de la traduction) grâce à
l’utilisation de plantes qui surexpriment la protéine virale FNY-2b. Cette protéine inhibe
partiellement l’activité de clivage tandis qu’elle maintient la répression traductionnelle. Dans
le cas des siARNs également il semble que la régulation traductionnelle soit très répandue. Il
a été montré que le blocage de la traduction des transcrits SUL est responsable du phénotype
des plantes transgéniques SUC ::SUL. La perte de la répression traductionnelle entraine la
perte du phénotype des plantes transgéniques SUC ::SUL (Brodersen et al., 2008). Ces
données indiquent que même dans le cas des siARNs dont la production est induite par
transgénèse, le blocage de la traduction est responsable de la majeure part de répression. Il
apparait alors obsolète de se baser sur la quantification des ARNm cibles du RNAi pour juger
de l’efficacité de l’extinction dirigée d’un gène. Il sera probablement nécessaire de développer
des alternatives à l’analyse de l’accumulation des protéines par western blot pour chacune des
cibles de sARNs. S’il est possible d’établir une corrélation entre l’association des sARNs aux
polysomes et l’existence d’une régulation traductionnelle, une possibilité serait de constituer
une banque de sARNs à partir de fractions polysomales purifiées. Cette banque représenterait
le sous-ensemble des sARNs (sinon tous !) capables de réguler traductionnellement
l’expression des gènes cibles. On pourrait alors comparer ces données aux données de
traductome qui permettent d’identifier l’ensemble des gènes régulés traductionnellement dans
une condition. Ainsi on pourrait prédire l’existence de couples sARN/mARN. Concernant la
recherche de nouveaux sARNs par bioinformatique, les études réalisées chez les plantes se
sont jusqu’alors limitées à rechercher des sARNs parfaitement complémentaires à leurs cibles
ARNm. Il sera désormais nécessaire de modifier les paramètres et de rechercher des sARNs
partiellement complémentaires à leurs cibles car on sait que le blocage de la traduction induit
par les sRNPs ne nécessite pas une complémentarité parfaite entre sARN et cible. Chez les
animaux, on pense que chaque miARN est partiellement complémentaire à plusieurs cibles et
donc capable de réguler leur expression. Des études récentes ont permis de montrer que
chaque miARN est capable de réguler finement la traduction d’un grand nombre de cibles
(Grosshans and Filipowicz, 2008).
87

Chez les végétaux, nous avons montré que de nombreux miARNs tels que miR172, miR398,
qui ont été mis en évidence pour leur capacité à induire le clivage de leur ARNm cible, sont
associés aux polysomes et probablement impliqués dans le blocage de la traduction. On peut
alors se poser la question du lien existant entre les deux voies du RNA silencing posttranscriptionnel
: clivage et blocage de la traduction. Est-ce que ces deux voies opèrent en
parallèle, séparées dans l’espace ; ou est-ce que ces deux événements se succèdent dans le
temps ? Une hypothèse serait que l’ensemble des ARNm qui sortent du noyau soient pris en
charge par les ribosomes (Figure D1). Les ribosomes sont les seules particules cytoplasmiques
capables de « lire » la séquence des ARNm, et, si les ribosomes scannent l’ensemble des
ARNm cytoplasmiques, ils représentent les partenaires idéaux pour les complexes miRNPs à
la recherche de leurs ARNm cibles. On pourrait donc imaginer que, par défaut, les complexes
miRNPs s’associent à la machinerie traductionnelle afin d’identifier leurs cibles. La séquence
MRE reconnue, la traduction serait bloquée, peut-être par simple encombrement stérique.
Dans ce cas, on peut penser que la traduction pourrait effectivement être inhibée à toutes les
étapes, ce qui expliquerait les contradictions apparentes entre les résultats obtenus chez les
animaux. Les complexes miRNP transporteraient ensuite leurs cibles vers des granules de
stockage ou de dégradation via le cytosquelette (Figure D1). Dans cette hypothèse où se
trouve le clivage ? Peut-être que certaines granules sont spécialisées et recrutent des
partenaires d’AGO qui favorisent le clivage. Peut-être que le clivage a toujours lieu dans une
plus ou moins grande proportion, mais que la mise en évidence par 5’-RACE des produits de
clivage a introduit un biais dans l’évaluation de la part de cette voie dans le mécanisme de
RNA silencing. Très probablement les avancées dans la compréhension des mécanismes de
RNA silencing traductionnel iront de pair avec les travaux concernant les aspects de la
régulation traductionnelle dans l’espace cellulaire.
Un autre aspect essentiel pour les régulations post-transcriptionnelles peu exploré chez les
plantes est celui de l’importance des granules à ARN et de la non uniformité de l’espace
cytoplasmique. En effet, il s’avère que les ARNm ne sont jamais libres dans le cytoplasme
mais associés de manière dynamique à des complexes protéiques (polysomes, granules de
stockage ou granules de dégradation). Ces structures sont dynamiques et les ARNm transitent
entre elles, via le cytosquelette, en fonction des besoins de la cellule. Chez les animaux il a été
montré que les granules de stockage ainsi que les granules de dégradation contiennent des
protéines AGO ainsi que des sARNs. Il semble que l’association des complexes effecteurs du
RNA silencing sous la forme de ces granules soit la conséquence de la régulation post-
88

transcriptionnelle mise en place. Chez les plantes de telles structures cytoplasmiques
commencent à peine à être caractérisées. Il est probable que ces granules soient, comme dans
le cas des cellules animales, le lieu privilégié pour isoler physiquement les transcrits de la
machinerie traductionnelle de façon temporaire ou définitive (Figure D1). Une vision
dynamique dans l’espace cytoplasmique permet d’ouvrir de toutes nouvelles voies pour la
compréhension des régulations post-transcriptionnelles. On imagine qu’il doit exister un lien
étroit entre les effecteurs du RNA silencing, la machinerie traductionnelle, et le cytosquelette.
Le fait que la Katanine ait été identifiée comme un suppresseur du RNA silencing
traductionnel confirme cette hypothèse. Dans notre cas, nous avons mis en évidence que la
protéine virale 2b découple les activités de clivage et de blocage de la traduction médiées par
la protéine AGO1. On peut s’interroger sur la réalité in vivo de cette fonction de FNY-2b et il
est possible qu’en présence d’autres protéines virales, le virus soit capable d’inhiber
également la composante traductionnelle du RNA silencing de l’hôte. Cependant, on peut
aussi imaginer que le virus puisse ne pas avoir intérêt à contrecarrer l’inhibition
traductionnelle. D’une part, en absence d’activité slicer d’AGO1, le virus n’est peut-être pas
soumis à l’inhibition traductionnelle persistante. D’autre part, si il existe un lien (et il existe)
entre l’inhibition traductionnelle et le réseau de cytosquelette, le virus pourrait avoir intérêt à
maintenir ce lien pour son propre transport via les plasmodesmes.
De nombreux efforts restent à fournir afin de caractériser, au niveau moléculaire, le réseau
d’interactions existant entre le RNA silencing, la traduction, et le cytosquelette. Nous
pourrions envisager par exemple de tester l’efficacité du RNA silencing chez des mutants du
cytosquelette tels que les mutants tonneau.
REGULATIONS POST­TRANSCRIPTIONNELLES ET REPONSES A LA LUMIERE
Dans une seconde partie du travail, nous nous sommes intéressés au rôle des régulations posttranscriptionnelles
dans la réponse au stress lumineux. Bien qu’elles soient probablement très
répandues, les régulations post-transcriptionnelles ont été peu caractérisées en réponse aux
stress abiotiques. En particulier, on commence seulement à entrevoir le rôle des sRNP dans la
réponse à l’environnement. La grande majorité des miARNs et siARNs endogènes connus
chez Arabidopsis ont été impliqués dans le développement. Les banques de sARNs ont été
constituées jusqu’alors à partir de plantes sauvages cultivées en conditions normales de
croissance. Il est désormais indispensable de constituer de nouvelles banques de sARNs dans
les conditions environnementales que l’on étudie. Par exemple dans le cas du TAS4, nous
89

avons montré que l’ARN non codant s’accumule après plus de cinquante et une heures de
traitement par la forte lumière et nous n’avons pu détecter le siARN81 que dans les
échantillons traités quinze jours par la forte lumière.
Il semble clair que de nombreux sARNs restent à identifier : sARNs capables de réguler la
traduction et/ou sARNs produits en réponse à un stress.
Dans un avenir plus ou moins proche, nous allons poursuivre notre travail sur les régulations
post-transcriptionnelles impliquées dans la réponse à la lumière. D’une part en recherchant les
mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation traductionnelle des Lhc. Par exemple,
d’après des données bibliographiques, il semble que la protéine eIF3 soit impliquée dans la
régulation de l’expression de certains partenaires photosynthétiques (Kim et al., 2007).
D’autre part nous souhaiterions analyser la composante de la signalisation rétrograde capable
d’affecter la traduction cytoplasmique. Pour ce faire nous allons utiliser les drogues affectant
spécifiquement l’une ou l’autre des voies de signalisation ainsi que des mutants tels que les
mutants gun (genome uncoupled).
A plus long terme, je souhaiterais développer un travail qui viserait à identifier des sARNs
impliqués dans la régulation de l’expression des Lhc. Des données préliminaires indiquent que
l’ARNm Lhcb1.2 pourrait s’accumuler chez les mutants ago1-25 par rapport aux plantes
sauvages. De plus, dans la bibliographie on trouve de nombreux indices qui suggèrent que
l’expression des Lhc pourrait être régulée par RNA silencing. Les gènes Lhc ont été dupliqués
au cours de l’évolution et on peut trouver des ORF en position inversée répétée chez P. patens
(Alboresi et al., 2008). Les prédictions bioinformatiques de loci pouvant générer les natsiARNs
proposent que les Lhc pourraient générer des nat-siARNs en cis ou en trans (Wang et
al., 2005; Wang et al., 2006). Un des exemples impliquant de petites molécules d’ARN dans
la réponse à l’environnement chez les bactéries est celui de la régulation de l’expression de
IsiA (Iron Induced protein A) chez Synechocystis (Duhring et al., 2006). IsiA est une protéine
de réponse à la carence en fer qui régule l’activité photosynthétique en se liant au PSI. Dans
ce cas, la cyanobactérie (ancêtre du chloroplaste) régule l’expression d’IsiA, grace à un ARN
non codant antisens IsrR. IsrR est transcrit à partir du brin non-codant du locus IsiA, ce qui
rappelle le mécanisme à l’origine des nat-siARNs.
La mise en évidence de sARNs capables de réguler l’expression des gènes Lhc soulève la
question de l’évolution du mécanisme de RNA silencing. En effet, les gènes Lhc sont à
l’origne des gènes procaryotiques exportés du genome chloroplastique vers le noyau. Les
données actuelles laissent penser que le RNA silencing guidé par les siARN est un mécanisme
90

ancien présent chez l’ancêtre unicellulaire commun aux plantes et aux animaux. Chez les
procaryotes, les protéines Argonautes sont conservées. Très peu de données sont disponibles
quant à la fonction de ces protéines de liaison à l’ARN chez les procaryotes. La mise en
évidence de mécanismes de type CRISPR chez les bactéries laisse penser que la molécule
d’ARN pourrait avoir été recrutée très tôt au cours de l’évolution comme moyen ancestral de
réponse à l’environnement.
91

siARNs
ARN non
codant
AGO
AGO
AGO
Transcription
AAA AAA
+MRE -MRE
AGO
ARN
codant
AGO
AGO
noyau
AGO
STRESS
Granules de dégradation (P-bodies) Granules de stockage (Stress granules)
Figure D1. Illustration de l'hypothèse selon laquelle l'association aux ribosomes serait la première
étape à la sortie du noyau pour tous les ARNs. Dans cette hypothèse, les ribosomes seraient responsables
de la reconnaissance et du tri des ARNs dans le cytoplasme. Le complexe effecteur du RNA silencing pourrait
s'associer du ribomes afin de reconnaitre ses cibles parmi les ARNs cytoplasmiques.

MATERIEL ET METHODES
I. MATERIEL VEGETAL
Matériel et Méthodes
1. CULTURE DE CELLULES D’ARABIDOPSIS
La culture de cellules en suspension d’Arabidopsis décrite précédemment (Nicolai et al.,
2006) a été maintenue en milieu stérile contenant un milieu riche MS dilué au demi
(Murashige and Skoog, 1962), 0.5mM kinétine, 0.34mM acide 2,4-dichlorophenoxyacetique,
cocktail de vitamines (4mM acide nicotinique, 1.26µM D-pantothenate de calcium, 2.66mM
Glycine, 150µM thiamine HCl, 110µM acide folique, 0.25mM pyridoxine-HCl, 20µM
biotine, et 28mM myoinositol), et 3% (w/v) saccharose, pH 5.6. Les cellules sont cultivées
dans 100mL de milieu sous agitation 125rpm à 25°C sous 50µE de lumière continue. Tous les
neuf jours, les cellules sont sédimentées par centrifugation 5 minutes à 600g afin de mesurer
la densité cellulaire PCV (Packed Cell Volume). La culture est alors repiquée à 5% PCV dans
100mL final de milieu frais.
2. CULTURE DE PLANTS D’ARABIDOPSIS THALIANA
L’ensemble du travail à été effectué sur Arabidopsis thaliana écotype Columbia (Col-0). Les
graines sont stérilisées sous cloche grâce à une solution de Javel et HCl gazeux 1 :1 (v/v).
Elles sont ensuite semées dans des boîtes de Pétri sur un milieu riche MS dilué au demi
(Murashige and Skoog, 1962), 1% (w/v) saccharose, 0,8% (w/v) agar, 2.5mM MES, pH 5,7.
Afin de synchroniser la germination des graines, les semis sont stratifiés 48h à 4°C. Les boîtes
sont ensuite mises en culture à 22°C, dans des conditions d’illumination de jours courts (8h de
lumière, 16h d’obscurité). Sept jours après la germination, les plantules sont repiquées en
terre et placées en chambres de culture à 22°C, 60% d’humidité dans des conditions
d’illumination de jours courts (8h de lumière, 16h d’obscurité).
92

a. Mutants ago1 et rdr6
Allèle mutant Lésion Position Ecotype Références
ago1-4 EMS Exon 22
(Ala992Val)
ago1-25 EMS Exon 14
(Gly758Ser)
rdr6-11 ADN-T Exon 1
(Arg269Stop)
Col-0 Bomhert et al.,
1998
Col-0 Morel et al., 2002
Col-0 Peragine et al.,
2004
b. Surexpresseurs FNY­2b
Les plantes exprimant la protéine virale FNY-2b ont été décrites précédemment (Lewsey et
al., 2007). Dans le cadre de notre étude nous avons utilisé la lignée 3.13F.
II. METHODES
1. STRESS LUMINEUX
Des plantules âgées d’au moins quatre semaines sont exposées à trois intensités lumineuses :
lumière contrôle (100 µE m- 2 .s -1 ), forte lumière (600-800 µE m- 2 .s -1 ) et faible lumière (10 µE
m- 2 .s -1 ). Ces trois conditions d’illumination sont combinées à quatre temps d’exposition : une
heure, trois heures, cinquante et une heures, et quinze jours. On considère les temps de
traitement une heure et trois heures comme des points de réponses précoces, cinquante et une
heures comme un temps pour lequel les réponses sont établies et stabilisées. Enfin le point
quinze jours représente un temps suffisamment tardif pour permettre aux plantes de
s’acclimater aux conditions expérimentales (Ballottari et al., 2007; Wobbe et al., 2008).
Chaque prélèvement est effectué à midi pour s’affranchir des variations de l’expression des
gènes dues au rythme circadien.
2. NORTHERN BLOT DE PETITS ARNS
a. EXTRACTION DES ARNs TOTAUX
Les ARNs totaux sont extraits du matériel végétal broyé avec 5 mL de tampon d’extraction
(0,1M NaCl, 2% SDS, 50mM TrisHCl pH 9, 10mM EDTA, 20mM β-mercapto-éthanol) par
gramme d’échantillon congelé plus 5mL de phénol et 5mL de chloroforme/alcool isoamylique
(24/1, v/v). Après centrifugation (10 min à 8000g), la phase aqueuse est deux fois ré-extraite
dans 10 mL d’un mélange phénol/chloroforme (5 mL phénol et 5 mL chloroforme). Après la
dernière étape de centrifugation (10 min à 8000g), la phase aqueuse est transférée dans un
nouveau tube contenant 500µL d’acétate de sodium 3M pH 3,1. On ajoute ensuite 15mL
d’éthanol absolu glacial et on laisse précipiter les ARNs 2h à –80°C ou sur la nuit à –20°C.
93

Après centrifugation (30 min à 16000g), on élimine le surnageant et on rince le culot dans
15mL d’éthanol 75% glacial. Le culot d’ARNs totaux est séché à l’air et repris dans de l’eau
milliQ ou dans une solution de 10mM Tris-HCl pH 7, 1mM EDTA. Les ARNs sont conservés
à –20°C ou à –80°C.
b. SEPARATION DES ARNS, TRANSFERT ET HYBRIDATION
Les ARNs totaux (+/- 20µg) sont mélangés à un tampon de charge (8M urée, 0.5% (w/v) bleu
bromophénol, 20% glycérol, 25mM EDTA) en proportion 1/1 puis dénaturés 10 minutes à
70°C. Les échantillons sont ensuite séparés sur un gel de polyacrylamide dénaturant (8M
urée, 0.5x TBE, 15% acrylamide/bisacrylamide (19/1), 0.02% (w/v) APS, 0.1% (v/v) Temed).
La migration est réalisée dans un tampon 0.5x TBE. Après coloration au BEt, les ARNs
séparés sont transférés (transfert semi-sec dans du TBE 0,5x) sur une membrane de nylon
chargée GeneScreen Plus ® (Perkin Elmer). Le transfert est effectué à courant constant (3,3
mA.cm -2 de membrane) sans dépasser 25V pendant 40 minutes. La membrane est fixée aux
UV (1000µJ) puis cuite 1h à 80°C. La membrane est pré-hybridée sur la nuit dans 25mL de
tampon de pré-hybridation à 50°C (SSC 5X, Na2HPO4 20mM pH 7,2, SDS 7%, héparine
0,1% (w/v) et 1mg d’ADN de sperme de saumon dénaturé). Les sondes utilisées sont des
oligonucléotides ADN, complémentaires du petit ARN à détecter. La sonde est marquée avec
125 µCi d’ATP-γ- 32 P (Activité spécifique 6000 Ci.mmole -1 ) grâce à une Poly Nucléotide
Kinase puis hybridée sur la membrane dans le tampon de pré-hybridation. L’hybridation est
effectuée sur la nuit à 50°C. La membrane hybridée est ensuite lavée quatre fois avec 40mL
de tampon de lavage non stringent (3x SSC; 25mM NaH2PO4 pH 7,5; 5% SDS). Tous les
lavages sont effectués à 50°C. La membrane est ensuite exposée directement sur un film autoradiographique
ou sur un écran de Phospho-Imager.
3. RT­PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL
La PCR Quantitative en temps réel consiste à détecter et à mesurer les produits
d’amplification générés à chaque cycle, qui sont directement proportionnels à la quantité
initiale de matrice. Nous avons utilisé le SYBR Green, un fluorophore qui s’intercale
spécifiquement entre les bases de l’ADN double brin, comme moyen de détection des
produits d’amplification.
a. SYNTHESE D’ADN COMPLEMENTAIRE (CDNAS)
Les ARNs destinés à la PCR en temps réel sont extraits grâce au Kit sv RNA isolation system
(Promega). Les ARNs totaux (5µg) sont chauffés 10 min à 70°C avec 40u de Rnasin ®
(Promega) et un oligo poly-d(T) (0.5µg oligo./µg ARN) puis le mélange est refroidi 10 min
94

sur glace. On ajoute la Reverse Transcriptase (25u d’AMV, Promega), son tampon
(concentrations finales 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,5mM
spermidine, 10 mM DTT) et les dNTP (1,4 mM de chaque). L’ensemble est incubé 1h30 à
42°C. On termine ensuite la réaction 1h à 42°C après avoir ajouté à nouveau 25u d’enzyme
afin de s’assurer que la synthèse est complète. Après la RT, les ARNs sont dégradés en
ajoutant dans chaque réaction du KOH (0,13M final) et de l’EDTA (3,3 mM final). Le
mélange est incubé 10 min à 90°C puis le pH est neutralisé en ajoutant Tris-HCl pH 1
(0,115M final) et MgCl2 (5,6mM final).
b. PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL
Les amorces utilisées pour la PCR quantitative en temps réel ont été désignées avec Universal
Probe Library Assay Desingn de Roche®. La sélection des amorces est basée sur un Tm
d’environ 60°C et sur une petite taille de l’amplicon. On ajoute à un mélange réactionnel
(SYBR Green master mix, Biorad® contenant le fluorophore, l’enzyme et le tampon), nos
amorces (600nM final) et les matrices cDNA à différentes dilutions dans un volume final de
50µL. La réaction est réalisée dans un thermocycler équipé d’un système de capture d’image
(icycler®; Biorad). Elle comporte 40 cycles d’amplification (95°C 30 sec /60°C 30 sec).
Chacune des réactions est réalisée en triplicata. Pour analyser les résultats, on établit
arbitrairement une valeur seuil de fluorescence (t = threshold) qui doit se situer dans la phase
exponentielle d’amplification afin de se placer à un moment de la réaction où l’efficacité de la
réaction est optimale. Ainsi pour une même quantité de fluorescence, on détermine le nombre
de cycles d’amplification (Ct pour cycle threshold) réalisés pour chacune des dilutions d’un
échantillon. On établit une courbe standard pour l’un des échantillons que l’on teste à trois
dilutions différentes (1/100, 1/200, 1/400). Ce standard servira à attribuer aux autres
échantillons une quantité arbitraire d’amplicon. Les valeurs obtenues pour chaque gène sont
ensuite normalisées avec les valeurs obtenues pour un gène exprimé de façon constitutive
dans les cellules comme celui codant l’Actine 2 (ACT2).
4. FRACTIONNEMENT CELLULAIRE SUR GRADIENT DE SUCROSE
a. Préparation des gradients de sucrose
Les gradients discontinus contiennent un mélange sucrose/tampon (40mM Tris-HCl pH8.4,
20mM KCl, 10mM MgCl2) qui amène la concentration finale en sucrose de 50% au fond du
tube à 20% en haut du tube. Les gradients sont conservés à -80°C.
95

. FRACTIONNEMENT CELLULAIRE
Le matériel végétal préalablement broyé dans l’azote liquide est repris dans un « tampon
polysomes » (0.1M Tris-HCl pH8.4, 0.05M KCl, 0.025M MgCl2, +/- 2mg.mL -1 EGTA, +/-
100µg.mL -1 Héparine, 0.5% Nonidet P40 (v/v), +/-0.5µg.mL -1 +/-cycloheximide, 0.5µg.mL -1
chloramphénicol). La suspension est centrifugée 5 minutes à 10000g à 4°C. Le supernageant
résultant est déposé au sommet du gradient de sucrose. La séparation s’effectue par
ultracentrifugation à 16000g pendant 2h45 à 4°C dans un rotor SW40 Beckman®. A l’issue
de l’ultracentrifugation, les gradients sont fractionnés de bas en haut et la densité optique à
254nm est lue en continue.
5. ANALYSE DES ARN POLYSOMAUX
a. EXTRACTION DES ARNS POLYSOMAUX
Les ARN sont extraits de chaque fraction du gradient de sucrose par addition de 5µg. mL -1 de
polyacrylamide linéaire, 1mL.mL -1 de GuHCL 8M et 2mL.mL -1 d’isopropanol. Après une nuit
de précipitation à -20°C, les ARN sont précipités par centrifugation 1h00 à 12000g et 4°C.
Les culots rincés et séchés sont repris dans le l’eau et les ARN sont stockés à -40°C.
b. RT­PCR
Les ARN sont reverse transcrits tel qu’il a été décrit précédemment puis amplifiés par PCR
classique ou par PCR en temps réel. Les PCR classiques sont réalisées dans un volume final
de 25µL suivant la réaction suivante : 5µL de cDNAs dilués au 50 e , 5µL de Tampon 5X
Green GoTaq ® Reaction Buffer (Promega©), 1µL de dNTP 10mM (Promega©), 5µL
d’amorces 10µM, 1µL de Go taq® DNA polymérase 100u (5u/µL), (Promega©). On réalise
35 cycles d’amplification (94°C 2 min/ 94°C 30 sec/ 55°C 30 sec /72°C 40 sec). Les
séquences de l’ensemble des oligonucléotides utilisés pour l’amplification par PCR sont
présentées figure 27.
6. ANALYSE DE PROTEINES ET WESTERN BLOT
a. Extraction de protéines à partir de fractions polysomales
Les fractions du gradient de sucrose sont dé-sucrées et concentrées (entre cinquante et cent
fois) par filtration (Vivaspin 20 10kDa Sartorius ®). Les échantillons concentrés sont
mélangés au tampon de charge (120mM TrisHCl pH6.8, 4% (w/v) SDS, 20% (v/v) glycérol,
0.1% (w/v) bleu de bromophénol, 0.2% (v/v) β-mercaptoéthanol) en proportion 1/1 puis
dénaturés 5 minutes à 99°C.
96

. Extraction des protéines totales
Le matériel végétal broyé est repris directement dans le tampon de charge. Les échantillons
sont dénaturés 5 minutes à 99°C puis centrifugés 8 minutes à 13000g afin de sédimenter les
débris.
c. Analyse par western blot
Les protéines sont séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions
dénaturantes. Les gels sont préparés de la façon suivante :
- Gel de concentration : 5% acrylamide/bis-acrylamide 37.5/1, 125mM Tris-HCl pH
6.8, 0.1% SDS
- Gel de séparation : 10 à 15% acrylamide/bis-acrylamide 37.5/1, 375mM Tris-HCl pH
8.8, 0.1% SDS (w/v)
Les gels sont polymérisés par 0.1% (w/v) APS et 0.05% (v/v) Temed.
L’électrophorèse s’effectue dans un tampon de migration TGS (12mM Tris-HCl pH8.3,
96mM glycine, 0.1% (w/v) SDS). Après migration les protéines sont visualisées par
coloration (10% acide acétique (v/v), 25% (v/v) éthanol, 0.125% (w/v) bleu de Coomasie) ou
transférées sur une membrane de nitrocellulose grâce à un courant électrique (1h 100V) dans
un tampon TGS/méthanol (12mM Tris-HCl pH8.3, 96mM glycine, 0.1% (w/v) SDS, 20%
(v/v) méthanol).
Après le transfert, la membrane est bloquée dans un tampon PBST/lait (8mM Na2HPO4,
1.5mM KH2PO4, 2.7mM KCl, 137mM NaCl, 5% lait en poudre, 0.2% (v/v) Tween) pendant
15 minutes à 1h sous agitation à température ambiante. Les hybridations sont réalisées dans la
solution PBST/lait avec les anticorps dilués comme suit :
- αAGO1 1/8000
- αCSD2 1/5000
- αCIP4 1/3000
Après une dizaine d’heures d’hybridation sous agitation à température ambiante, les
membranes sont rincées deux fois avec le tampon PBST/lait puis hybridées avec l’anticorps
secondaire (α-lapin) couplé à la phosphatase alcaline ou à la peroxydase. Après une heure
d’hybridation à température ambiante, les membranes sont rincées deux fois avec le tampon
PBST/lait, une fois avec le PBST, puis équilibrées dans le tampon de détection (100mM Tris-
HCl pH 9.5, 100mM NaCl, 5mM MgCl2). La révélation est effectuée par colorimétrie grâce à
97

un mélange NBT/BCIP dans le cas de la phosphatase, ou une solution TMB stabilisée
Promega ® dans le cas de la peroxydase.
7. DOSAGE DES ANTHOCYANES
200mg d’échantillon préalablement broyé sont repris dans 1mL de méthanol 80%, 0.01M
HCl. Après une nuit d’incubation à 4°C à l’obscurité, les échantillons sont centrifugés et la
DO est mesurée sur le surnageant à 525nm.
98

BIBLIOGRAPHIE
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Annexe 1_AtMYBL2
ANNEXE 1_IDENTIFICATION D’UN NOUVEAU FACTEUR DE
TRANSCRIPTION IMPLIQUE DANS LA VOIE DE BIOSYNTHESE
DES ANTHOCYANES : MYBL2
Collaboration avec l’équipe de Loïc Lepiniec, INRA Versailles.
Dans le cadre de nos travaux sur la voie de biosynthèse des anthocyanes, nous avons été
amenés à collaborer avec Christian Dubos, de l’équipe de Loïc Lepiniec à Versailles. Nos
expériences en cours de réponse au stress lumineux chez Arabidopsis ont permis de proposer
un rôle pour un nouveau facteur de transcription impliqué dans la voie de biosynthèse des
anthocyanes : MYBL2. Ces travaux ont fait l’objet de la publication qui suit.
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Annexe 2_AtGCN2
ANNEXE 2_CARACTERISATION D’ATGCN2, UNE KINASE
D’EIF2
Collaboration avec l’équipe de Jean‐Marc Deragon et Thierry Pélissier, Université de
Perpignan
Chez les mammifères, les levures, ainsi que chez les plantes, l’un des moyens utilisés pour
réguler l’initiation de la traduction est la phosphorylation d’eIF2. En effet, comme indiqué
dans le paragraphe précédent, l’étape finale de l’initiation consiste au recrutement de la sousunité
60S et a la dissociation du complexe d’initiation après hydrolyse du complexe eIF2-GTP
en eIF2-GDP. Pour régénérer eIF2 avant un nouveau cycle d’initiation, le GDP est remplacé
par un GTP grâce à la GEF eIF2B. Un moyen pour la cellule d’inhiber l’initiation de la
traduction est d’empêcher le recyclage d’eIF2-GDP. La phosphorylation d’eIF2 par GCN2
(general control nonderepressible) inhibe la dissociation du complexe [eIF2-GDP :eIF2B] et
limite ainsi l’initiation de la traduction. Chez la levure, la carence en acides amines entraine
l’accumulation d’ARNt libres. Ce signal active GCN2 et ainsi la phosphorylation d’eIF2. La
réduction de la synthèse protéique due a la phosphorylation d’eIF2 inhibe l’expression d’un
grand nombre de gènes. Cependant l’expression d’un gène nommé GCN4 est activée par la
phosphorylation d’eIF2. Bien que très bien caractérisé chez la levure, le clonage d’AtGCN2
n’a été publié qu’en 2003 (Zhang et al., 2003). Le rôle de GCN2 dans la phosphorylation
d’eIF2 a été décrit très récemment chez A. thaliana (Zhang et al., 2008), confirmant
l’existence d’un mécanisme de réponse au stress conservé entre eucaryotes. Chez les
animaux, cinq kinases d’eIF2 ont été décrites et l’activation de chacune d’entre elle répond à
un stress différent (virus, présence d’ARN double brin, stress du reticulum endoplasmique).
Ceci indique que la phosphorylation d’eIF2 est un système de répression de la traduction
globale qui peut-être utilisé en réponse a différents signaux.
Dans le cadre de leur étude de la voie GCN2 chez Arabidopsis, le groupe de JM Deragon
nous a proposé une collaboration afin de caractériser le métabolisme du mutant gcn2 en
réponse à la carence en acides aminées. Cette analyse réalisée avec Sébastien Lageix,
également étudiant en thèse, a donné lieu à une publication qui est présentée dans cette
annexe.
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Figures
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