Cytogénétique moléculaire L'Hybridation In Situ Fluorescente

ROYAUME DU MAROC 

MINISTERE DE LA SANTE 

CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIRE HASSAN II, FES 

Laboratoire Central d’Analyses Médicales 

Post-natal 

Constitutionnel 

Préimplantatoire 

FISH 

Ouldim Karim 

Génétique Médicale 

Prénatal 

Hémopathies malignes

Cytogénétique 

conventionnelle 

Cytogénétique 

moléculaire 

Biologie 

moléculaire 

FISH

Principe de la FISH 

Cytogénétique conventionnelle Biologie moléculaire 

Cytogénétique moléculaire FISH

Plan 

A. Obtention des métaphases : Caryotype 

B. Réalisation d’une Technique FISH sur Suspensions 

Cellulaires 

C. Applications de la FISH: 

I- Post-natal 


II- Prénatal 

III- Préimplantatoire 

IV- Hémopathies malignes

Plan 


B. Réalisation d’une Technique FISH sur Suspensions Cellulaires 


I- Post-natal 


II- Prénatal 

III- Pré-implantatoire 


- bandes T 

- FISH 

Hétérochromatine 

constitutive 

- bandes C 

Euchromatine: 

- bandes Q/G 

- bandes R 

- bandes de réplication 

(BudR) 

Aspect des chromosomes métaphasiques 

Télomère 

Centromère 

Acrocentriques: 

(Groupes D et G) 

Organisateurs nucléolaires: 

- bandes NORs

Caryotype métaphasique en bande R 

46,XY

Plan 



Cellulaires 


I- Post-natal 


II- Prénatal 

III- Pré-implantatoire 


Plan 

A. Réalisation d’une Technique FISH sur Suspensions 

Cellulaires 

1 - Matériel Requis 

2 - Préparation des solutions 

3 – Technique.

Agitateur magnétique 

Bain-Marie 

Balance de précision 

Microcentrifugeuse 

Chronomètres 

Microscope à Epi-Fluorescence 

P 0.5-10μl 

P 10-100μl 

P 100-1000μl 

pH mètre 

Thermomètre calibré 

Agitateur Vortex 

1 - Matériel Requis : 

Platine d’hybridation THERMOBRITE

20X SSC (Sodium chloride, 0.3M sodium citrate, pH 5.3) 

HCl 5N 

20X SSC 

NaOH 1N 

NP40 

2 - Préparation des solutions : 

Tampon de lavage Post-hybridation 1 (2 X SSC / 0.1% NP 40) : 

Tampon de lavage Post-hybridation 2 (0,4X SSC / 0.3% NP 40) : 

NaOH 1N 

NP40 

Tampon de lavage Post-hybridation 2 (0,4X SSC / 0.3% NP 40) : 

NaOH 1N 

NP40 

Ethanol éthylique absolu 

Ethanol 70% 

Ethanol 85% 

Dilutions d’Ethanol :

Solution de 1XPBS pH 7-7.5. 

2XSSC pH 7-7,5 

Pepsine : (protease I) 

DAPI II 

3 – Technique. 

Réactifs nécessaires

Avant de démarrer toute technique, penser à mettre au bain marie les 

solutions utilisées à chaud. Ne pas démarrer les étapes tant que les 

Prétraitement. 


Préparation des lames pour la FISH 

solutions n’ont pas atteint la t° requis 

Traitement à la pepsine. 

Hybridation des échantillons 

Lavages Post-Hybridation 

Placer la lame dans le ThermoBrite




· Immerger les lames dans la solution de 2XSSC à 37°C pendant 30mn. 

· Immerger les lames dans du PBS 1X pendant 1 minute

Placer les lames sur le ThermoBrite à 37°C et recouvrir la section avec la pepsine diluée. 

Laisser incuber entre 10 et 20mn. 

Immerger les lames dans du PBS 1X 2mn. 




Déshydrater les lames dans un gradient d’ETOH 70 , 85, 100% 2mn chaque 

Laisser sécher les lames avant de procéder à l’étape d’Hybridation.

Sortir la sonde (et le tampon d’hybridation) du congélateur et lui (leur) laisser atteindre la t° 

ambiante. 



Hybridation des échantillons. 

Centrifuger la sonde (et le tampon), la (les) vortexer et centrifuger à nouveau 

Si la sonde est prête à l’emploi ignorer le point suivant

Si besoin, préparer la sonde comme suit : 

Mélanger 1μL de sonde 

2 μL d’H2O d. 

7 μL de Tampon d’hybridation 

Bien vortexer et centrifuger 




Déposer 10μL de sonde sur une lamelle.




Prendre la lame échantillon et la retourner sur la lamelle. 

Retourner immédiatement la lame et sceller la lamelle à l’aide de rubber cement.

Placer la lame dans le ThermoBrite et laisser incuber à 37°C pendant environ 5mn avan t de 

Par ex : 


Placer la lame dans le ThermoBrite 

lancer le programme de dénaturation/hybridation. 

Denaturation t° : 73°C / Denaturation time 1mn 

Hybridization t° : 37°C / Hybridization time 20 h 

ThermoBrite



A partir de cette étape, travailler en lumière réduite de manière à préserver les fluorochromes 

des sondes présentes sur les lames. 

A la fin de l’hybridation, sortir les lames du ThermoBrite. 

Retirer le rubber cement SANS RETIRER LA LAMELLE et placer la lame dans la solution de 

lavage 2XSSC/0,1% NP40 à t° ambiante pour faciliter le décollement de la lamelle (qqes 

secondes) (Pour plus de facilité on peut placer deux lames dos à dos). 

Retirer ensuite délicatement les lamelles et transférer les lames dans la solution 

0,4XSSC/0,3% NP40 à 73°C . Agiter rapidement et lancer le chronomètre réglé à 2mn. 

Retirer les lames de la solution à 73°C et effectue r un rinçage à t° ambiante 30s à 1mn. 

Mettre les lames à sécher à l’obscurité et sortir le DAPI du congélateur.

Déposer 10 μL de DAPI sur une lamelle couvre-objet. 

Retourner la lame échantillon sur la lamelle 

Placer les lames à 4°C pendant au moins 5mn 

Lecture sous microscope 


Contre-Coloration des noyaux au DAPI

Plan 



Cellulaires 


I- Postnatal 


II- Prénatal 



Champs d'applications de la FISH 

I- Postnatal 



FISH 

II- Prénatal 


FISH 

I- Postnatal 

Constitutionnel

I- Postnatal 


Sur Métaphase Sur interphase 

Caryotype



Hybridation des échantillons 


L’Hybridation In Situ Fluorescente 

sur métaphase 

La technique 

Placer la lame dans le ThermoBrite 



Contre-Coloration des noyaux au DAPI

FISH : Types de sondes 

Peintures 

– Totales = 1 paire de chromosomes 

– Partielles = seulement une partie 

(ex : un bras, une bande) 

Translocation X; autosome

– d’un locus 

– de plusieurs locus 

• Télomères (TTAGGG) n 

• Centromères (ADN satellite) 


Spécifiques 

Syndrome de la délétion 22q11

• Séquences communes (tous les centromères) 

• Spécifiques d’un centromère 

• Certains centromères ont des structures très proches : 

– 13/21 

– 14/22 


Sondes Centromèrique

Sondes télomèriques 

• Sondes télomèriques aspécifiques (T2AG3) 

• Sondes subtélomèriques 


– Étude d’un télomère 

– De plusieurs télomères 

– De tous les télomères 

Les sondes subtélomériques détectent 

la majorité des anomalies familiales

Chromosome 1 

Chromosome 4 


Sondes télomèriques 

Chromosome 2 

Chromosome 3 

Chromosome 5 Chromosome 6

I- Post-natal 


Sur Métaphase Sur interphase 

Caryotype

• Pas besoin de culture 

EN POSTNATAL 

FISH sur interphase 

• Possible sur n'importe quel type tissulaire 

• Possible sur des tissus conservés en paraffine ou congelés

FISH sur cellules buccales 

22q11 syndrome Détermination du 

sexe 

• Rapidité 

Intérêts : 

• Peu invasif

FISH: Indications en post natal constitutionnel 

• Caractérisation d’un remaniement de novo et/ou complexe faisant intervenir plusieurs 

chromosomes 

• Précision des points de cassure des anomalies de structure 

• Détermination de l’origine des petits chromosomes surnuméraires (marqueurs) 

• Étude de translocations cryptiques et semi-cryptiques 

• Remaniements subtélomériques 

• Évaluation d’un mosaicisme 

• Exploration des gonosomes (recherche du chromosome Y…) 

• Diagnostic des microremaniements 

– Microdélétions + + + 

– Microduplication

Délétion chromosomique 

(

Sondes FISH: postnatal constitutionnel 

Sonde Prader-Willi/Angelman Région (SNRPN)(LSI SNRPN 

SpectrumOrange/CEP 15 (D15Z1) SpectrumGreen/LSI PML SpectrumOrange) 

Sonde Prader-Willi/Angelman Région (D15510)(LSI D15510 

SpectrumOrange/CEP 15 (D15Z1) SpectrumGreen/LSI PML SpectrumOrange) 

Sonde Williams Region (LSI ELN SpectrumOrange/LSI D7S486, D7S522 

SpectrumGreen) 

Sonde SRY Region (LSI SRY (Yp11.3) SpectrumOrange/CEP X SpectrumGreen) 

Sonde DiGeorge Region (N25) (LSI N25 SpectrumOrange/LSI ARSA 


Sonde DiGeorge Region (TUPLE1) (LSI TUPLE1 SpectrumOrange/LSI ARSA 



CHU HASSAN II, FES 

20 tests 

20 tests 

20 tests 

20 tests 

20 tests 

20 tests

Diagnostic des microremaniemments : 

Les syndromes microdélétionnels 

Orientation clinique spécifique 

Aspect facial ? 

Cardiopathie ? 

Phénotype comportemental ? 

Caryotype conventionnel 

FISH: sonde spécifique

Sonde 22q11.2 

Sonde 22q13 

Les syndromes microdélétionnels : 

Syndrome de la délétion 22q11.2 

46, XX ish del (22)(D22S75-)

Sonde DiGeorge Region (TUPLE1) (LSI TUPLE1 SpectrumOrange/LSI ARSA 


22q11.2 LSI TUPLE1 

22q13 LSI LSI ARSA TUPLE1 


CHU HASSAN II, FES

• Dysmorphie (discrète) 90% 

• Cardiopathies (Fallot, IAA,VSD) 75 % 

• Hypocalcémie (39% épilepsies) 60 % 

• Problèmes oto-laryngés 49% 

• Retard de croissance 83 % 

• Déficits immunitaires modérés 66% 

• Retard psychomoteur 68 % 

• Fentes, insuffisance vélaire 41% 

• Difficultés alimentaires 38 % 

• Anomalies rénales 36% 

• Epilepsie 21% 

• Aplasie thymique 17% 

• RCIU 16% 

• Problèmes psychiatriques 9% 

DGCR (DiGeorge chromosomal region) 

Plusieurs gènes: 

TUPPLE1 

CDC45L 

UFD1L 


Syndrome de la délétion 22q11.2 

Fréquence: 1/4 000 ? 

Hétérogénéité clinique + + + 

90% délétion de Novo 

Étude collaborative européenne :Ryan et al;1997 

22q11.2 

22q13 

DGCR 

Vélo-cardio-Facial 

70% 

Syndrome de Di-George 

99% 

Phénotype quasi N 

10% ?


Syndrome de Williams et Beuren 

46,XY,ish del(7)(q11.23q11.23)(ELN-)

Dysmorphie faciale 

Hypoplasie malaire 

Paupières sup. et joues pleines 

Pointe nasale large 

Philtrum long et lisse 

Lèvres inf. éversée 

Dents petites et espacées 

Nez bulbeux avec narines antéversées 

Visage « d’Elfe » 

Iris stellaire 

Phénotype comportemental 

Trouble de la représentation spatio-temporelle 

Sociabilité 

Anxiété +++ 

Cardiopathie congénitale 

Sténose supra valvulaire aortique:97%, 

Autres: SP,SR… 

Autres… 

Hypercalcémie idiopathique: 10% : risque néphrocalcinose + + + 

Retard intellectuel le plus souvent retard modéré à sévère 


Syndrome de Williams et Beuren 

Fréquence: 1/20 000 à 1/25 000 

WBSCR 

« Williams–Beuren Syndrome Critical Region »

46,XX 

LE SYNDROME DE PALLISTER-KILLIAN 

ou la Tétrasomie 12p 

Première observation marocaine 

« FISH sur cellules buccales » 

Image de la FISH réalisée avec la 

sonde centromérique du 

chromosomes 12 (couleur verte) et du 

chromosome 7 (couleur rouge) sur les 

cellules buccales. 

Présence de 3 signaux verts signant la 

présence de 3 centromères pour le 

chromosome 12. 

Schéma illustrant l’aspect des chromosomes 12 normaux 

en métaphase ainsi que l’aspect du chromosome 

surnuméraire : Isochromosome 12 des bras courts des 

chromosomes 12 : i(12p).

Étude des translocations cryptiques : Translocation (4;21) de Novo 

Monosomie 21 

Whole chromosome painting (WCP21) 

4p16.3 LSI WHS 

CEP 4 

Whole chromosome painting (WCP4) 

Translocation (4;21) de Novo avec une délétion de la région critique responsable du syndrome de Wolf- 

Hirschhorn ‘WHSCR : «Wolf-Hirschhorn syndrome critical région»’

Détermination de l’origine des petits chromosomes surnuméraires : 

Tetrasomie 15q11-q13 chez un patient présentant un trouble comportment de type autistique. 

A B 

Metaphases hybridised with WCP15 (A) and with D15S10/PLM (B) 

47,XY,+mar.ish idic(15)(wcp15+, D15Z1 ++, D15S10 ++, PML-) de novo.

Sonde SRY Region (LSI SRY (Yp11.3) SpectrumOrange/CEP X SpectrumGreen) 

LSI SRY (Yp11.3) 

CEP X 


CHU HASSAN II, FES

FISH 

II- Prénatal

En prénatal 

• Amniocytes non cultivés +++ 

• Sang du cordon

Applications en prénatal 

• Suspicion de trisomie 21 

• Echec culture LA 

• Reste un culot de LA 

• Possible aussi sur tissu +++ 

21 

14

Aneuvysion 

Dépistage rapide des 

principales aneuploïdies 

Sur Amniocytes non cultivés 

Résultat en 24-48h 

Sondes spécifique des 

chromosomes X,Y,13,18,21 

46,XY 

47,XY,+13 

47,XY,+18 

47,XY,+21 

18,X,Y 13,21

Probe Name Probe Location Fluorophore 

Vysis CEP 18 18p11.1-q11.1 Alpha Satellite DNA SpectrumAqua TM 

Vysis CEP X Xp11.1-q11.1 Alpha Satellite DNA SpectrumGreen TM 

Vysis CEP Y Yp11.1-q11.1 Alpha Satelite DNA SpectrumOrange TM 

Vysis LSI 13 13q14 SpectrumGreen TM 

Vysis LSI 21 21q22.13-q22.2 SpectrumOrange TM

Amniocentèse 

Amniocytes non cultivés 

En prénatal 

24-48H 

Sondes spécifique des chromosomes X,Y,13,18,21

En prénatal 

Diagnostic des microremaniements 

Syndromes Localisation chromosomique 

Syndrome de la délétion 22q11.2 22q11.2 

Biopsie choriale

FISH 

III- Pré-implantatoire

Faisabilité 

Stratégie 

Deux sondes par bras chromosomique (loci différents) 

Test systématique chez les parents 

DPI (deux blastomères si possible) 

Vérification systématique des embryons déséquilibrés

DPI: procédure lourde ! 

• Consultation pluridisciplinaire 

• Evaluation de la fertilité du couple 

• Evaluation de la faisabilité 

• Stimulation ovarienne 

• Ponction d’ovocytes 

• Fécondation in vitro par “ICSI” (3 à 8) 

• Biopsie de 1 – 2 blastomères à J3 

• DPI: (FISH) 

• Transfert d’embryon (s) à J4 

• Suivi hormonal / échographique 

• Contrôle du résultat du DPI par DPN 

Accouchement: 10 à 15 %

Critères d’éligibilité du DPI chromosomique 

1- Age maternel (réserve ovarienne) 

2- Nombre de grossesses avec déséquilibre 

3- Pas d’enfant normal vivant 

4- Autre indication de FIV 

5- Risque élevé d’anomalie chromosomique à la naissance 

Etude de faisabilité technique envisagée si 4/5 critères

A: hole in zona pellucida made with laser. 

B: removal of first blastomere from embryo. 

C: deposition of blastomere in medium. 

D: removal of second blastomere. 

Cleavage-stage biopsy

Blastomère

Preimplantation genetic diagnosis, THE LANCET • Vol 363 • May 15, 2004

Blastomère monosomique 2q 

Centromère 8 2q37.1 

Centromère 2 

Résultats 

Blastomère équilibré

Champs d'applications de la FISH 

I- Post-natal 



FISH 

II- Prénatal 


IV- Hémopathies malignes : Cytogénétique + FISH 

Diagnostic 

Pronostique 

Thérapeutique 

Suivi 

Apport

IV- Hémopathies malignes : Cytogénétique + FISH 

La cytogénétique hématologique est un outil important pour le clinicien. 

Confirmer /Etablir un diagnostic. 

Elle permet : 

Suivre l’évolution d’un patient (rémission complète, dépistage d’une rechute, 

détection de la maladie résiduelle) 

Evaluer le pronostic 

Adapter le protocole thérapeutique

Les outils du diagnostic génétique: 

Cytogénétique conventionnelle 

Cytogénétique moléculaire : FISH 

Biologie moléculaire 


IV- Hémopathies malignes 

Cytogénétique moléculaire : FISH


Limites de la cytogénétique 

• Faible contingent tumoral 

• Faible prolifération tumorale 

• Qualité des images


FISH 

Objectif de repousser les limites de la cytogénétique 

conventionnelle en utilisant la propriété qu’a l’ADN dénaturé 

de se réassocier avec une séquence complémentaire sur un 

chromosome ou sur un noyau interphasique.

• Syndrome myéloprolifératif chronique : 

t(9;22)-BCR/ABL , autres réarrangements…. 

• Syndrome myélodysplasique : 

Statut des chromosomes 5,7 et 8 .Del5q, autres réarrangements… 

• Syndrome lymphoprolifératif chronique et lymphomes malin non hodgkinien 

(LMNH) : 


Del 13q, trisomie 12, Réarrangement C-MYC, t(11;14)…

• Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) 

– Vysis ETV6 Break Apart FISH Probe Kit 

– Vysis LSI BCR/ABL + 9q34 Tricolor, Dual Fusion Translocation Probe 

– Vysis LSI BCR/ABL Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe 

– Vysis LSI BCR/ABL Dual Color, Single Fusion Translocation Probe 

– Vysis LSI BCR/ABL ES Dual Color Translocation Probe 

– Vysis LSI ETV6(TEL)/RUNX1(AML1) ES Dual Color Translocation Probe Set 

– Vysis LSI IGH/MYC, CEP 8 Tri-color, Dual Fusion Translocation Probe 

– Vysis LSI MYB (6q23) SpectrumAqua Probe 

– Vysis LSI MYC Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe 

– Vysis LSI MLL Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe 

– Vysis LSI p16 (9p21) SpectrumOrange / CEP 9 SpectrumGreen Probe 

– Vysis LSI TCF3/PBX1 Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe 

– Vysis LSI TCR alpha/delta Dual Color Break apart Rearrangement Probe 

• Acute Myelogenous Leukemia (AML) 

– CEP 8 SpectrumOrange Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit 

– Vysis CSF1R/D5S23, D5S721 FISH Probe Kit 

– Vysis D7S486/CEP 7 FISH Probe Kit 


– Vysis D20S108 FISH Probe Kit 


– Vysis LSI AML1/ETO Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe 


– Vysis LSI BCR/ABL Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe, LSI BCR/ABL Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe 


– Vysis LSI BCR/ABL ES Dual Color Translocation Probe 

– Vysis LSI CBFB Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe 

– Vysis LSI EGR1/D5S23, D5S721 Dual Color Probe 

– Vysis LSI MLL Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe 

– Vysis LSI PML/RARA Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe 

– Vysis LSI PML/RARA Dual Color Translocation Probe 

– Vysis LSI RARA Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe

• Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) 


– Vysis LSI ATM (11q22.3) SpectrumOrange Probe 

– Vysis LSI ATM SpectrumOrange/ CEP 11 SpectrumGreen Probe 

– Vysis LSI CCND1 (11q13) Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe 

– Vysis LSI Cyclin D1 (11q13) SpectrumOrange/ CEP 11 SpectrumGreen 

– Vysis LSI D13S25 (13q14.3) SpectrumOrange Probe 


– Vysis LSI D13S319 (13q14.3) SpectrumOrange/ LSI 13q34 SpectrumGreen Probe 

– Vysis LSI IGH/CCND1 Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe 

– Vysis LSI IGH/CCND1 XT Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe 

– Vysis LSI MYB (6q23) SpectrumAqua Probe 

– Vysis LSI p53 (17p13.1) SpectrumOrange Probe 

– Vysis LSI p53 / LSI ATM and LSI D13S319 / LSI 13q34 / CEP 12 Multi-color Probe 

– Vysis LSI TP53 SpectrumOrange/ CEP 17 SpectrumGreen Probe 

• Chronic Myelogenous Leukemia (CML) 


– Vysis LSI 4q12 Tricolor Rearrangement Probe 

– Vysis LSI 9q34 SpectrumAqua Probe 


– Vysis LSI BCR/ABL Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe 


– Vysis LSI BCR/ABL ES Dual Color Translocation Probe

• Multiple Myeloma 

– Vysis LSI (13q34) SpectrumGreen Probe 

– Vysis LSI 13 (RB1) 13q14 SpectrumOrange Probe 





– Vysis LSI D13S319 (13q14.3) SpectrumOrange/ LSI 13q34 SpectrumGreen Probe 

– Vysis LSI D5S23/D5S721, CEP 9, CEP 15 Multi-Color Probe 

– Vysis LSI IGH Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe 



– Vysis LSI IGH/FGFR3 Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe 

– Vysis LSI IGH/MAF Dual Color, Dual Fusion Probe 



• Myelodysplastic Syndrome (MDS) 


– Vysis CSF1R/D5S23, D5S721 FISH Probe Kit 

– Vysis D20S108 FISH Probe Kit 




– Vysis LSI EGR1/D5S23, D5S721 Dual Color Probe

• Non-Hodgkins Lymphoma 

– Vysis LSI ALK Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe 

– Vysis LSI API2/MALT1 t(11;18) (q21;q21) Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe 

– Vysis LSI BCL2 Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe 

– Vysis LSI BCL6 (ABR) Dual Color Break Apart Rearrangement Probe 

– Vysis LSI BCL6 Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe 



– Vysis LSI IGH/BCL2 Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe 



– Vysis LSI IGH Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe 

– Vysis LSI IGH/MALT1 t(14;18) (q32;q21) Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe 

– Vysis LSI IGH/MYC, CEP 8 Tri-color, Dual Fusion Translocation Probe 

– Vysis LSI MALT1 (18q21) Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe 

– Vysis LSI MYC Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe 



• Sex Mismatched Bone-Marrow Transplant Management (+BMT) 

– CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit

Peintures chromosomiques

M-FISH

CGH arrays 

Principe

CGH arrays 

1 Mb

Cytogénétique moléculaire L'Hybridation In Situ Fluorescente

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