these etude des interactions entre une proteine ... - Lionel Tcatchoff

Université de Versailles Saint Quentin
Ecole Doctorale : "Des Génomes Aux Organismes"
THESE
Présentée par
Lionel TCATCHOFF
Pour l’obtention du titre de
Docteur en Biochimie de l’Université de Versailles saint Quentin
ETUDE DES INTERACTIONS ENTRE UNE PROTEINE
HUMAINE DE LIAISON AUX ODORANTS
ET SES PARTENAIRES,
ODORANTS ET RECEPTEURS OLFACTIFS
Composition du jury
Président : Marc NADAL
Rapporteurs : Catherine RONIN
Michael O'DONOHUE
Examinateur : Gilles SICARD
Soutenue le 18 octobre 2007
Directeur de thèse : Jean-Claude PERNOLLET

REMERCIEMENTS
Au terme de ce travail réalisé au laboratoire de Biochimie de l’olfaction et de la
gustation à l’INRA de Jouy-en-Josas, je tiens à remercier Jean-Claude Pernollet qui m’a
permis de réaliser cette thèse dans son équipe, pour la confiance qu’il m’a accordée et sa
disponibilité. Mes plus sincères remerciements vont aussi à Loïc Briand qui a su me montrer
le chemin tout en me laissant suffisamment de liberté. Merci pour le temps qu’il a passé avec
moi lors de nombreuses discussions et l’aide précieuse qu’il m’a accordée pour réaliser cette
thèse.
Ce travail a été réalisé en équipe et je profite de cette page pour remercier ceux qui
m’ont aidé au cours de ces quelques années : Claude Nespoulous, Valérie Bézirard, Claire
Schlegel, Florence Blon, et Jean-Claude Huet. Merci pour votre aide, d’un point de vue
technique et scientifique. Outre les permanents, je tiens à remercier les stagiaires avec qui j’ai
travaillé, Yann Nédelec et Abir Laib Achraf qui ont activement participé à mon travail.
Je souhaite exprimer ma reconnaissance à Marc Nadal, d’une part pour m’avoir fait
confiance pour réaliser des enseignements à l’université, d’autre part pour avoir accepté de
présider le jury de thèse. Mes remerciements s’adressent aussi à Catherine Ronin-Vaisse et
Michael O’Donohue qui ont accepté de lire et d’évaluer ce travail. Je remercie de même
Gilles Sicard qui a bien voulu participer au jury de la thèse.
Parce que l’atmosphère dans laquelle on travaille a souvent un impact sur les résultats,
je voulais témoigner de ma reconnaissance à l’ensemble de l’équipe :
Claude, nos nombreuses discussions, ta rigueur, ta philosophie, ta façon toujours
positive de tourner les choses m’ont énormément aidé. Après avoir beaucoup discuté
randonnées, nous irons peut-être un jour ensemble. Valérie, il est plus facile de travailler dans
la bonne humeur et grâce a toi, ça a été le cas pendant tout ce temps. Ta joie de vivre est un
moteur pour l’ambiance dans le laboratoire et je t’en remercie. Merci aussi pour la relecture
de ce manuscrit. Claire, toujours d’humeur égale, toujours prête à rendre service, je te

emercie pour toute l’aide que tu m’as fournie, et en particulier pour le temps que tu m’as fait
gagner pour l’imagerie calcique. Hélène, je te remercie pour ta bonne humeur, ton soutien et
pour m’avoir permis de découvrir l’enseignement en réalisant un monitorat à l’université.
Bien évidement, mes remerciements vont aussi aux autres membres de l’équipe ; Mariam, en
particulier pour ses conseils et son aide lors de la phase de rédaction ; Florence, notamment
pour son assistance sur certaines manipulations ; Danièle pour sa gentillesse et sa disponibilité,
ainsi que Jean-Claude (Huet), Petro, Marta et Guenhaël.
Les stagiaires de plus ou moins longue durée participent aussi grandement à la vie du
laboratoire. Je tenais à remercier en particulier la bande des daltons, Yann, Sébastien et
Yannick, mais aussi : Abir, Brice, Fallou, Isabelle, Emeline, Floraine, Elodie Mounia, Arnaud
et bien sûr ceux que j’ai oublié…
Je remercie chaleureusement les membres des équipes BIOBAC et PAPPSS pour
notre bon voisinage de ces quelques années. En particulier Céline, Alain et Coralie.
Je remercie en outre ceux qui ont permis quelques moments de détente même au plus
dur de la rédaction, Mickael, Statis, Jasna, Mariam, Liliana, Stéphane, Michal et Karine.
Je remercie évidement les amis qui m’ont été d’un grand soutien aux cours de ces trois
ans, notamment Raphaël, Elodie, Bastien, Pascal, Elizabeth, Jérôme, Ali, Sébastien, Aline
Christophe, Thibaut…
Pour finir, je remercie affectueusement, mes parents et mon frère Ivan pour leur
soutien permanant, leur tolérance et leur confiance.

SOMMAIRE
ABREVIATIONS 1
LISTE DES FIGURES 3
LISTE DES TABLEAUX 5
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 6
PREAMBULE 7
I- PERCEPTION OLFACTIVE 11
1. Le stimulus olfactif : les molécules odorantes 11
2. Physiologie de l’organe olfactif, de la périphérie aux centres nerveux 13
3. Le codage des odeurs 17
3.1. Au niveau de l’épithélium olfactif 17
3.2. Au niveau du bulbe olfactif 19
4. Les récepteurs olfactifs 19
4.1. Aspects génétiques 21
4.2. Classification des récepteurs olfactifs 22
4.3. Aspects structuraux 23
4.4. Fonctionnement des récepteurs olfactifs 24
4.5. Etude de l’activation des RO par les odorants 26
4.6. Etude du site d’interaction RO-Odorant 27
II- LES PROTEINES DE LIAISON AUX ODORANTS 29
1. Propriétés générales des protéines de liaison aux odorants 29
2. Propriétés structurales des OBP 29
3. Propriétés de liaison des OBP 32
4. Les protéines humaines de liaison aux odorants 33
5. Eléments structuraux de la fixation des odorants dans la poche de l’OBP humaine 36
6. Rôles physiologiques des OBP 36
7. Comparaison avec le système olfactif des insectes 38
1. Organisation péricellulaire 38
2. Mécanismes péricellulaires de l’olfaction chez les insectes 39
3. Aspects structuraux des OBP d’insectes 40
4. Aspects fonctionnels 41
III- OBJECTIFS DE CE TRAVAIL 43

CHAPITRE I - APPROCHE STRUCTURALE DES INTERACTIONS OBP - ODORANTS 45
I- ARTICLE 49
II- COMPLEMENTS CONCERNANT L’ARTICLE ET D’AUTRES MUTANTS 58
1. Matériel et méthodes 58
1. Mutagenèse dirigée de hOBP-2A 58
1.1. Vecteur d’expression en levure 58
1.2. Vecteur d’expression en bactérie 58
1.2. Amplifications et purifications de plasmides 59
1.3. Electrophorèse sur gel d’agarose 59
1.4. Mutagenèse dirigée 59
1.4.1. Mutagenèse par PCR d’après la méthode de Ho et al. 59
1.4.1.1. Principe 59
1.4.1.2. Protocole 61
1.4.1.3. Construction des vecteurs d’expression en levure 62
1.4.2. Mutagenèse dirigée adaptée du Kit « Site directed mutagenesis » 63
1.4.2.1. Principe 63
1.4.2.2. Construction du vecteur d’expression de hOBP-2A en bactérie 63
1.4.2.3. Protocole de mutagenèse 64
1.5. Transformations de bactéries 64
1.6. Sélection des clones 65
1.6.1. Test de la présence de l’insert 65
1.6.2. Séquençage 66
1.6.2.1. Principe du séquençage 66
1.6.2.2. Protocole 66
2. Expression des protéines recombinantes 66
2.1. Expression en levure Pichia pastoris 67
2.1.1. Transformation de Pichia pastoris 67
2.1.2. Sélection des clones producteurs d’OBP 67
2.1.3. Electrophorèse dénaturante sur gel de polyacrylamide 67
2.1.4. Production d’OBP recombinantes 68
2.1.5. Purification des OBP recombinantes 68
2.2. Expression en bactérie 69
2.2.1. Expression des protéines de fusion GST-OBP 69
2.2.2. Purification des protéines de fusion 69
2.2.3. Obtention de protéase TEV 70
2.2.4. Purification des OBP 70
3. Caractérisation des OBP recombinantes 71
3.1. Estimation des concentrations protéiques 71
3.2. Séquençage N-terminal 71
3.2.1. Principe du séquençage d’Edman 71
3.2.2. Protocole 72
3.3. Spectrométrie de masse 72

3.3.1. Principe de la spectrométrie de masse MALDI-TOF 72
3.3.2. Mesure de masse totale des protéines 73
3.3.3. Détermination des cartes peptidiques 73
3.3.3.1. Réduction-alkylation 73
3.3.3.2. Digestion par trypsinolyse 74
3.3.3.3. Clivage chimique au bromure de cyanogène (BrCN) 74
3.3.3.4. Analyse MALDI-TOF des peptides 74
3.4. Spectre de fluorescence du tryptophane 75
3.5. Dichroïsme circulaire 75
4. Mesure d’affinité par compétition de sondes fluorescentes 76
4.1. Principe 76
4.2. Protocole 77
4.2.1. Fixation des sondes 77
4.2.2. Compétition de ligands 78
5. Modélisation moléculaire et arrimage moléculaire 78
2. Résultats complémentaires relatifs à l’article 80
1. Mutagenèse dirigée de l’OBP humaine 80
1.1. Mutagenèse article 80
1.2. Nouveaux mutants 80
2. Production des OBP sauvages et mutées 80
2.1. Production en levure Pichia pastoris (Article) 80
2.1.1. Transformation des levures 80
2.1.2. Sélection des clones les plus producteurs 81
2.1.3. Production des protéines recombinantes 82
2.1.4. Purification des OBP recombinantes 84
2.2. Production des OBP en bactérie 84
2.2.1. Production de fusions GST-OBP 84
2.2.2. Purification 87
3.2.1. Production de la protéase TEV 87
3.2.2. Purification des OBP 88
3. Intégrité des protéines produites 89
3.1. Intégrité chimique 89
3.1.1. Séquençage N-terminal 89
3.1.2. Mesure de masse molaire des protéines mutées 90
3.1.3. Validation des mutations par analyse des masses peptidiques 90
3.2. Intégrité structurale 94
3.2.1. Fluorescence du tryptophane 94
3.2.2. Dichroïsme circulaire 95
4. Etude fonctionnelle des mutants 95
4.1. Tests de fixations pour les mutants de l’article 95
4.1.1. Mesure des constantes d’affinité de sondes fluorescentes 95
4.1.2. Déplacement de sondes fluorescentes 99
4.2. Nouveaux mutants 102
5. Modélisation moléculaire et arrimage moléculaire 104
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 106

CHAPITRE II – IMPACT DES OBP SUR LES RECEPTEURS OLFACTIFS 110
I- MATERIEL ET METHODES 115
1. Culture cellulaire 115
2. Imagerie calcique 115
3. Traitement des données 117
4. Production d’OBP humaine 117
1. hOBP-2A fusionné à une queue poly histidine 117
1.1. Construction des plasmides 117
1.2. Production en levure 118
2. Fusion GST 118
II- RESULTATS 119
1. Influence de hOBP-2A sur le niveau d’activation de OR1G1 119
2. Modification du mode de production de hOBP-2A 119
1. Stratégies 119
2. Validation du nouveau mode de production 120
3. Validation de l’approche en VOFA 121
1. Contrôles positifs 121
2. Contrôle négatif 122
3. Effet des OBP sur le seuil d’activation du récepteur OR1G1 122
4. Effet de la concentration en OBP 125
5. Aspect cinétique de l’action de hOBP-2A sur OR1G1 126
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 131
CONCLUSION ET PERSPECTIVES 135
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 139

ABREVIATIONS
ACN Acétonitrile
ADN Acide Désoxyribonucléique
AMPc Adénosine Mono Phosphate Cyclique
ATP Adénosine Tri Phosphate
BMD Milieu de production de protéine pour des levures
BMGY Milieu pour une croissance cellulaire des levures
BMMt Milieu de production de protéine pour des levures
BrCN Bromure de cyanogène
CSP Protéine de liaison aux composés chimiosensoriels ("Chemosensory Protein")
CNG Canal ionique AMPc dépendant ("Cyclic-nucleotide-gated ion channel")
DAUDA Acide 11-(5-(diméthylaminonaphthalenyl-1-sulfonyl)amino)undécanoïque
ddNTP Didéoxynucléotides
dNTP Déoxynucléotides
DTT Dithiothreitol
EDTA Acide éthylène diamino tétra acétique
ExB Tampon d’extraction
GOBP Protéine de liaison aux odorants généraux ("General Odorant Binding Protein")
GST Glutathion S-transférase
GTP Guanosine Tri Phosphate
HEK Cellules embryonnaires de foie
HEPES acide sulfonique n-2-hydroxyéthylpipérazine-n-2-éthane
HH Hanks HEPES
IBMP 2-isobutyl-3-methoxypyrazine
IMAC Chromatographie d’affinité sur colonne de métal immobilisé
IP3 Inositol 1,4,5 triphosphate
IPTG Isopropyl β-D thiogalactoside
LB Luria-Bertani, milieu de culture pour bactéries
LB-LS Milieu de culture pour bactéries a faible teneur en sel ("Luria-Bertani Low Salt")
MALDI Ionisation par désorption laser assistée par matrice
MEM Milieu de culture de cellules de mamifère ("Minimum Essential Medium")
MES Acide 4-Morpholine éthanesulfonique
MeOH Méthanol
1

MUP Protéine majeure de l’urine ("Major Urinary Protein")
NPN N-phényl-1-naphthylamine
OBP Protéine de liaison aux odorants ("Odorant Binding Protein")
PBP Protéine de liaison aux phéromones ("Pheromone Binding Protein")
PCR Réaction de polymérisation en chaîne ("Polymerase Chain Reaction")
pI Point isoélectrique
IP2 Phosphatidyl inositol biphosphate
PITC Isothiocyanate de phényle
PLC Phospholipase C
PVDF Difluorure de polyvinylidène
QAE Ethyl amino quaternaire
RBP Protéine de liaison du rétinol ("Retinol Binding Protein")
RCPG Récepteur couplé aux protéines G
RO Récepteur olfactif
rpm Rotations par minutes
SDS Dodécyl sulfate de sodium
SDS-PAGE Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS
SOB-Mg Milieu de culture pour bactéries (préparation de bactéries chimiocompétentes)
SOC Milieu de culture pour bactéries (après un choc thermique)
TAE Tampon Tris acétate EDTA
TEMED Tetraméthyl-éthylène-diamine
TEV Tobacco etch virus (Nom d’une protéase codée par un virus du tabac)
TFA Acide trifluoro acétique
TOF Temps de vol
Tris Tris(hydroxméthyl)aminométhane
VNO Organe voméro nasal ("Vomeronasal Organ")
VOFA Test fonctionnel en mode vapeur ("Volatile Odorant Functional Assay ")
YNB Source de nutrition minérale et azotée pour les levures ("Yeasty Nitrogen Base ")
YPDS Milieu de culture pour bactéries (après électroporation)
2

1
2
3
4
5
6
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8
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28
29
LISTE DES FIGURES
Quelques exemples d’odorants
Coupe schématique transversale de la cavité olfactive humaine
Organisation de l’épithélium olfactif
Organisation du bulbe olfactif
Représentation schématique des projections du système olfactif dans le
système nerveux central
Représentation schématique du système de codage des odorants
Représentation schématique d’un récepteur couplé aux protéines G
Evolution du nombre de récepteurs olfactifs chez les mammifères
Représentation de la séquence en acides aminés d’un récepteur de souris
Cascade de transduction de récepteurs olfactifs
Modèle moléculaire d’un récepteur olfactif
Alignement de quelques OBP de vertébrés
Représentation de la structure tridimensionnelle des OBP de vertébré
Séquence nucléotidique et protéique de hOBP-2A
Mesure de l’affinité de hOBP-2A en fonction de la taille des acides et des
aldéhydes
Organisation du système olfactif des insectes
Représentation de structures 3D d’OBP d’insectes
Vue en coupe du modèle tridimensionnel de hOBP-2A
Schématisation de la cavité de l’OBP humaine
Principe de la mutagenèse dirigée par PCR selon la méthode de Ho et al.
Représentation schématique des constructions réalisées dans pGAPZα
Représentation schématique des constructions réalisées dans pGEX-2T
Principe de la mesure de l’affinité par déplacement de sonde fluorescente
Criblage des clones de Pichia pastoris
Cinétiques de production des différents mutants
Purification des fusions GST-OBP
Production et purification de protéase TEV
Suivi de purification des OBP produites en bactérie
Carte peptidique de hOBP-2A et hOBP-2A-K82A après trypsinolyse
12
13
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16
16
18
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44
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46
47
48
49
Carte peptidique de hOBP-2A, hOBP-2A-K62A et hOBP-2A-K112A après
clivage au BrCN
Spectres de fluorescence du tryptophane de hOBP-2A et des mutants K62A,
K82A et K112A
Spectres d’émission du NPN, et du DAUDA, effet de hOBP-2A
Fixation du NPN sur hOBP-2A et les mutants K62A, K82A et K112A
Fixation du DAUDA sur hOBP-2A et les mutants K62A, K82A et K112A
Mesures de déplacement du NPN pour divers ligands de hOBP-2A
Intégrité de hOBP-2A et hOBP-2ABac
Fixation du NPN et déplacement par le tridécanal pour hOBP-2ABac
Alignement de quatre lipocalines connues pour interagir avec les aldéhydes et
acides gras
Représentation des interactions entre les OBP et ses partenaires
Représentation schématique du test fonctionnel VOFA
Détournement de la cascade de transduction des récepteurs olfactifs
Contrôles de la viabilité des cellules HEK293 et de leur capacité à répondre
Répartition de l’odorant dans les phases vapeur ou aqueuse au cours du VOFA
avec ou sans OBP
Influence de l’OBP sur la réponse calcique des cellules soumises à différentes
concentrations d’odorant
Influence de la concentration en odorant sur le nombre de cellules activées
avec ou sans OBP
Influence de la concentration en OBP sur le nombre de cellules activées
Cinétiques d’activation du récepteur OR1G1 pour différentes concentrations
en tridécanal
Effet cinétique de l’OBP sur l’activation de OR1G1 à différentes
concentrations de tridécanal
Effet de la concentration en OBP sur la cinétique d’activation du récepteur
OR1G1
93
95
96
97
98
101
102
103
108
111
112
113
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125
126
128
129
130
4

1
2
3
4
LISTE DES TABLEAUX
Séquences des oligonucléotides utilisés lors de la mutagenèse dirigée.
Peptides issus de la digestion trypsique de hOBP-2A et hOBP-2A-K82A
Peptides issus du clivage au BrCN de hOBP-2A, hOBP-2A-K62A et hOBP-
2A-K112A
Constantes d'affinité de différentes familles d'odorants à 8 carbones
61
91
93
99
5

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

PREAMBULE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Toutes les espèces animales possèdent des capacités sensorielles permettant d’assurer
leur survie en interagissant avec leur environnement immédiat. Ces sens leur permettent de
détecter et de caractériser leur milieu, notamment en assurant les fonctions essentielles, telles
la recherche de nourriture, la détection de prédateurs, l’établissement de relations sociales ou
encore la reproduction. L'olfaction est un sens prédominant chez la plupart des animaux qui
s'appuient très largement sur celui-ci pour toutes ces fonctions vitales.
La vie contemporaine de l’homme stimulant majoritairement les sens de l’ouïe ou de
la vue, la perte de ces sens s’avère beaucoup plus handicapante que la simple perte de
l’olfaction (anosmie). L’intérêt immédiat de l’étude de l’audition ou de la vue ainsi que leur
accessibilité par des moyens d’investigation simples expliquent pourquoi les mécanismes de
l’audition ou de la vision sont bien mieux connus que ceux de l’olfaction. Toutefois, au cours
des 30 dernières années, la consommation est venue au centre des préoccupations de la société.
Le secteur agroalimentaire a vu son pouvoir augmenter en même temps que son intérêt pour le
bien être du consommateur. En outre, l’olfaction nous permet de qualifier notre
environnement en fonction d’une valeur hédonique, notamment en permettant l’établissement
des préférences alimentaires, ce qui intéresse particulièrement l’agroalimentaire, la parfumerie
ou la cosmétique. Ces évolutions de la société ont conduit à un regain d’intérêt pour les
mécanismes de perception des odeurs. En effet, étudier le fonctionnement de cette modalité
sensorielle est un enjeu capital, pour comprendre les arcanes de la communication chimique
entre les animaux mais aussi d’un point de vue économique, pour l’industrie agroalimentaire,
ou encore les parfumeurs.
Les premières découvertes ont été réalisées grâce à des techniques
d’électrophysiologie qui ont d’abord permis de mesurer l’activation de l’épithélium olfactif,
siège des premières étapes de la détection des odeurs puis, avec l’évolution des techniques,
directement celle des neurones olfactifs. Ces approches ne permettent toutefois pas d’étudier
les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la détection et la reconnaissance des stimulus
olfactifs. Ainsi jusqu’à la fin des années 1970, le terme de récepteur olfactif désignait les
7

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
neurones olfactifs et la recherche des récepteurs olfactifs au sens pharmacologique progressait
assez peu.
Afin d’identifier les récepteurs olfactifs, une approche pharmacologique classique a
consisté à chercher les sites de fixation de molécules marquées radioactivement sur des
épithélium olfactifs. Cette approche a conduit à l’identification de sites de fixation du
camphre chez le rat et la grenouille (Fesenko et al., 1979). Par la suite, Paolo Pelosi, en
utilisant le 2-isobutyl-3-methoxypyrazine (IBMP) marqué, une des molécules au seuil de
détection le plus bas chez l’homme (odeur de poivron), réussit à démontrer l’existence chez la
vache d’une protéine soluble de faible masse moléculaire capable de lier les odorants, qu’il
nomme OBP pour « Odorant-Binding Protein » (Pelosi et al., 1981, Pelosi et al., 1982). Ces
premières découvertes ont été rapidement suivies par la confirmation de la présence de ces
OBP chez d’autres espèces, notamment le rat (Pevsner et al., 1986), le porc et le lapin (Dal
Monte et al., 1991). Au cours des années 80, il a été montré en particulier une expression
spécifique des OBP au niveau de l’épithélium olfactif (Pevsner et al., 1986). De plus, les
affinités de l’OBP de porc pour des dérivés de la pyrazine sont d’autant plus fortes que les
seuils de détection (chez l’homme) sont bas, suggérant bien un rôle des OBP dans la
perception des odorants (Pevsner et al., 1985).
Au cours des années 80, la communauté scientifique accumule des informations sur le
fonctionnement du système olfactif. Les mammifères possèdent un système olfactif capable
de reconnaître des milliers d’odeurs différentes (Lancet, 1986). Il a été montré que le siège de
cette reconnaissance se trouve au niveau des cils olfactifs. En effet l’ablation spécifique des
cils conduit à une perte de réponse olfactive (Bronshtein et Minor, 1977). L’exposition de cils
olfactifs de rat à des odorants conduit à une stimulation rapide de l’adénylate cyclase puis à
une augmentation de la quantité d’AMPc (Pace et al., 1985, Sklar et al., 1986, Breer et al.,
1990). Certains odorants induisent une augmentation d’inositol triphosphate (Boekhoff et al.,
1990). Par ailleurs, il a été montré l’expression d’une protéine de liaison au GTP (protéine G),
spécifique des neurones olfactifs, appelée Golf (Jones et Reed, 1989) et nécessaire à la réponse
des neurones. D’autres études axées vers la compréhension de la transduction du message
olfactif indiquent que c’est l’ouverture de canaux ioniques activés par l’AMPc qui conduit à
la dépolarisation des neurones (Nakamura et Gold, 1987, Dhallan et al., 1990). Diverses
études des voies de transduction de neuromédiateurs ou de récepteurs aux hormones
8

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
semblaient indiquer que les voies impliquant l’AMPc ou l’inositol triphosphate, ont pour
premier intermédiaire une protéine G. Dans tous les cas décrits, les protéines G sont activées
par un membre d’une large famille de récepteurs nommés récepteurs couplés aux protéines G
(RCPG). Le nombre très élevé de stimulus indique l’implication d’une large famille de
récepteurs conduisant à l’activation de voies spécifiques des RCPG. Les OBP sont des
protéines solubles et malgré les interactions qu’elles présentent avec les odorants, elle
n’apparaissent pas capables de générer de façon directe des variations d’AMPc dans les
neurones, à l’origine du signal nerveux. Ainsi les OBP ne semblaient pas être de bonnes
candidates en tant que récepteur olfactif (RO) qui sont plus probablement des RCPG.
Tirant parti de l’avènement des techniques de biologie moléculaire et notamment de la
« Polymerase Chain Reaction » (PCR), Linda Buck et Richard Axel, ont pu montrer
l’expression spécifique dans l’épithélium olfactif de rat de 18 gènes codant une nouvelle
classe de RCPG, les récepteurs olfactifs (Buck et Axel, 1991). Dans la même étude, ils
montrent l’existence de plus de 200 gènes de cette même famille chez le rat, tout en suggérant
que cette famille pourrait être bien plus importante.
L’équipe de Linda Buck et Richard Axel ainsi que de nombreuses autres ont ensuite
pu s’intéresser aux mécanismes moléculaires de l’olfaction. D’autres récepteurs ont été
découverts au sein de divers organismes, l’activation des récepteurs par des odorants dans des
systèmes hétérologues a rapidement apporté la preuve de leur implication dans l’olfaction
(Raming et al., 1993, Krautwurst et al., 1998). Certains travaux ont permis d’apporter une
meilleure compréhension des mécanismes de codage des odeurs, d’autres des mécanismes de
transduction, ou encore du fonctionnement des récepteurs. Les travaux de Buck et Axel ont
ainsi ouvert la voie de l’étude des récepteurs olfactifs qui, par la suite, se sont révélés former
la plus grande famille de gènes des mammifères avec plus de 1% du génome exprimé pour les
rongeurs. La communauté scientifique a reconnu l’ensemble des travaux des deux chercheurs
en leur décernant le prix Nobel de médecine en 2004.
Même si les récepteurs fonctionnent seuls (Raming et al., 1993, Krautwurst et al.,
1998), les odorants pour les atteindre doivent être solubilisés dans le mucus olfactif, riche en
OBP. Un amphibien modèle, le xénope, possède deux systèmes olfactifs. L’un est aquatique,
9

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
l’autre aérien apparaît à la fin du développement lors de la mise en place de la respiration
aérienne. L’OBP de xénope est exprimée uniquement lorsque se met en place la cavité
olfactive aérienne et est limitée à celle-ci (Millery et al., 2005), ce qui suggère un rôle des
OBP lié à la respiration aérienne. Par ailleurs, ce sont d’un point de vue physiologique les
premières molécules de l’organisme en contact avec les molécules odorantes et leur capacité à
lier ces molécules laisse supposer une fonction de transport des odorants à travers le mucus
olfactif.
En parallèle des recherches sur les vertébrés, il a aussi été montré l’existence chez les
insectes de protéines de liaisons aux odorants. Leur structure est très différente de celles des
OBP de vertébrés mais leur localisation au voisinage des neurones olfactifs et leurs capacités
communes de liaison des odorants laissent supposer des fonctions proches. Kim et ses
collaborateurs ont généré des mutants de drosophile et observé les variations de
comportement face à l’éthanol. Les drosophiles sauvages fuient face à ce composé alors
qu’une souche mutante, est au contraire attirée par l’alcool. La mutation consistait en une
délétion d’un gène unique codant une OBP qu’ils ont nommée LUSH. La réintroduction du
gène de LUSH dans des drosophiles mutées restaure un comportement olfactif de drosophile
sauvage indiquant bien une fonction de l’OBP dans la détection de certains composés (Kim et
al., 1998, Kim et Smith, 2001). Par la suite, il a été montré que LUSH fixait un phtalate, un
composé de plastique contaminant l’alcool (Zhou et al., 2004) ; toutefois, il s’agissait de la
première mise en évidence claire du rôle d’une OBP dans les mécanismes de détection des
odorants. En outre, la poursuite des études de l’équipe de Dean Smith a permis de montrer
que LUSH était nécessaire pour l’activation de neurones spécifiques d’une phéromone (le 11cis-vaccenyl
acétate) impliquée dans le comportement d’agrégation observé chez la
drosophile (Xu et al., 2005, Ha et Smith, 2006).
L’analogie entre les systèmes olfactifs de vertébré et d’insecte permet de s’interroger
sur le positionnement des OBP de vertébrés dans le système de détection des odeurs
comprenant le récepteur olfactif et les odorants. Existe-t-il une triade Odorant-OBP-RO et
quelle est la fonction de l’OBP dans ce cas ?
10

I- PERCEPTION OLFACTIVE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
L’odeur est une sensation résultant de la reconnaissance d’un mélange complexe de
molécules chimiques, les odorants. Cette perception est fondée sur la reconnaissance
stéréochimique des molécules odorantes, c’est à dire que le système olfactif distingue les
molécules en fonction de leurs diverses fonctions chimiques ainsi que de leurs différentes
conformations ou isomères. La première étape de détection des odorants chez les mammifères
s’effectue au sein de l’épithélium olfactif situé dans la partie supérieure de la cavité nasale.
Les odorants pénètrent dans la cavité nasale, traversent le mucus olfactif et se lient
spécifiquement à des récepteurs couplés aux protéines G localisés dans les membranes des
neurones olfactifs sensoriels. L’activation de ces récepteurs induit l’ouverture de canaux
ioniques qui conduit à la dépolarisation de la membrane cellulaire puis à un signal nerveux
qui est ensuite transmis vers le bulbe olfactif. Après un premier traitement de l’information,
celle-ci est relayée vers le cerveau (Reed, 2004).
1. Le stimulus olfactif : les molécules odorantes
On appelle odorant toute molécule pouvant atteindre et stimuler un neurone olfactif
pour générer une sensation olfactive ou odeur. Il s’agit de composés chimiques comportant
seulement 1 ou 2 groupes hydrophiles donc suffisamment volatils pour atteindre l’épithélium
olfactif. Ils sont ainsi généralement hydrophobes et ont une masse inférieure à 350 Da
(Chastrette, 1997). Ces molécules appartiennent à des familles chimiques très variées telles
les alcools, aldéhydes, acides, cétones ; ils peuvent être cycliques ou linéaires (Figure 1).
Même si la structure et les fonctions chimiques d’un odorant peuvent être liées à la sensation
qu’il génère, il est actuellement difficile de prédire l’odeur d’un odorant à partir de sa
structure. Par exemple, des odorants de structures chimiques très différentes comme un alcool
linéaire (octanol), une cétone linéaire (nonan-3-one), une cétone cyclique (S-carvone) ou
encore un alcène linéaire (cis-3-héxénol), ont une note olfactive comparable (herbacée). De
même une note florale a été attribuée au n-nonanal et à l’acétophénone, des composés ayant
des structures et des fonctions très différentes même si la sensation générée est différente
(odeurs de rose et d’oranger respectivement) (Figure 1).
11

Alcools
Octanol
OH
Frais, orange, rose, herbacé
Décanol
Fruité, gras
1-Octène-3-ol
Champignon
Eugénol
Girofle
Cis-3-héxénol
Herbacé
Menthol
C
H 3
CH 3
CH 3
OH
Boisé, menthé, légèrement
camphré
OH
Aldéhydes
Citronellal
CHO
Rosé, citronné, vert boisé,
puissant
n-Nonanal
CHO
Gras, puissant. Floral, frais et
plaisant à forte dilution
Cétones
Nonan-3-one
Acide
O
Herbacée, fruitée
Heptan-2-one
Fromage
Heptanoate d'éthyle
Fruitée, vineuse
Acide octanoïque
O
O
OH
Huile rance, transpiration
Figure 1. Quelques exemples d’odorants
O
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Cycliques
Acétophénone
O
CH 3
Floral (oranger), amandé,
piquant
Anisole
CH 3
Phénolique, anisé, pétrole
O
S-carvone
O
Herbacée, cumin
R-carvone
O
Menthe verte, florale à forte
dilution
C
H 3
β –Ionone
CH 3
*
O
CH 3
Floral (violette), fruité
(framboise), boisé
Indole
N
Animal,
H
fécal, déplaisant,
florale à forte dilution
Les molécules odorantes sont classées en fonction de leurs classes chimiques (aldéhydes,
acides, alcools, cétones) et de leur structure, linéaire ou cyclique. On a indiqué ici le nom
usuel des molécules, leur formule développée ainsi que leur note olfactive (en italique),
c'est-à-dire la sensation perçue en leur présence. Les notes herbacées et fruitées sont
surlignées en vert et jaune pour montrer qu’une note olfactive ne dépend pas
nécessairement de la structure ni de la fonction chimique des odorants.
12

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Par exemple la S-carvone et R-carvone sont deux stéréo-isomères évoquant
respectivement une odeur de cumin et de menthe verte (Laska et Teubner, 1999). Ainsi, la
nature exacte du stimulus porté par l’odorant n’est pas connue. On définit la notion d’odotope
qui correspond à la disposition spatiale relative des éléments moléculaires déterminant l’odeur
d’une classe de molécules. En outre, la quantité d’odorant joue aussi un rôle dans sa
perception. Par exemple, l’indole ayant une note déplaisante (animale, fécale), prend une
odeur florale à plus forte dilution. Dans la nature, une odeur résulte très rarement d’un corps
pur mais est générée par un mélange complexe de molécules odorantes en proportions
variables. Une modification même faible de la composition du mélange peut changer
complètement sa perception. De plus, certains composés inhibent la perception de certains
autres. Toutefois, malgré la complexité des stimulus mis en jeux, les systèmes olfactifs
humain et animaux permettent la différenciation et la reconnaissance de nombreuses
molécules et mélanges (Lehrner et al., 1999).
2. Physiologie de l’organe olfactif, de la périphérie aux centres nerveux
Chez l’homme, les molécules odorantes sont détectées dans la cavité nasale. Les
molécules odorantes pénètrent dans la cavité nasale après une inspiration (voie orthonasale)
ou par la voie rétronasale, c'est-à-dire en remontant de la bouche en passant par les choanes
derrière le pharynx (Figure 2).
Bulbe olfactif
Nerf olfactif
Epithelium olfactif Lame criblée
Cavité nasale
Voie orthonasale
Cornets
Figure 2. Coupe schématique transversale de la cavité olfactive humaine
Les flèches rouge et bleues indiquent le passage de l’air respectivement par la voie
rétronasale par les choanes et la voie orthonasale par le nez. L’air circule dans les cornets
où il est réchauffé avant d’atteindre l’épithélium olfactif, siège de la reconnaissance des
molécules odorantes.
13

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Cette voie rétronasale permet la reconnaissance des molécules libérées lors de la mise
en bouche de nourriture. En effet, l’aliment mastiqué dégage des molécules odorantes qui
agissent sur les neurones olfactifs. La reconnaissance des odorants en provenance de la cavité
buccale explique l’importance de l’olfaction dans la détermination des préférences
alimentaires.
L’épithélium olfactif se situe dans la partie supérieure de la cavité nasale, séparé du
cerveau uniquement par la lame criblée. Il est constitué de cellules de soutien, de
neurorécepteurs, de glandes à mucus, les glandes de Bowman ainsi que d’une couche de
cellules basales (Figure 3).
Lame criblée
Vaisseau sanguin
Lame basale
Cellule basale
Axone
Neurone olfactif
Cellule de soutien
Dendrites
Mucus
Figure 3. Organisation de l’épithélium olfactif
Glande de
Bowman
Cerveau
Cet épithélium est constitué de neurones olfactifs assurant la reconnaissance des odorants,
des cellules basales (cellules souches) assurant le renouvellement des neurones et de
cellules de soutien. Les dendrites des neurones olfactifs baignent dans un mucus aqueux
dans la cavité nasale, alors que leurs axones assurant la transmission du message nerveux
passent la lame criblée pour atteindre le bulbe olfactif. Les glandes de Bowman assurent le
renouvellement du mucus olfactif et des protéines le composant, dont les OBP.
Cavité nasale
Les cellules basales sont des cellules souches non différenciées assurant le
renouvellement constant des neurones olfactifs au cours de la vie (Caggiano et al., 1994). En
effet, si les neurones olfactifs sont les seuls neurones exposés au milieu extérieur, ils font
14

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
aussi partie des rares neurones pouvant être renouvelés. Une fois devenus neurones matures,
les cellules en différentiation migrent vers la surface de l’épithélium et remplacent les
neurones en place qui dégénèrent. Les glandes de Bowman assurent en partie le
renouvellement du mucus olfactif dont le rôle principal est de protéger la muqueuse olfactive.
Le mucus est un mélange aqueux riche en protéines sécrétées, dont environ 47% remplissent
des fonctions de protection (anti-inflammatoire, anti-microbien, inhibiteur de protéases et
anti-oxydant). D’autres fonctions sont représentées plus faiblement telles que le transport, la
régulation ou le métabolisme (Debat et al., 2007).
Les molécules odorantes sont détectées par les neurones olfactifs, des neurones
bipolaires assurant la reconnaissance et la transmission du message olfactif. Les dendrites (ou
cils olfactifs) portent les récepteurs olfactifs ainsi que des canaux ioniques permettant la
détection du signal olfactif. Ils sont recouverts par le mucus olfactif aqueux. L’axone assure la
transmission du message, il passe au travers de la lame criblée, une structure osseuse
recouverte par l’épithélium olfactif puis vers le glomérule situé dans le bulbe olfactif, organe
assurant un premier traitement du message olfactif. Le bulbe olfactif est organisé en couches
concentriques. A la périphérie, on trouve les glomérules, où convergent les axones de
neurones olfactifs qui forment des synapses avec les cellules mitrales constituant une couche
plus interne du bulbe olfactif. Des cellules granulaires, formant la couche interne du bulbe
olfactif, assurent des connexions latérales entre différentes cellules mitrales, et pourraient
permettre une modulation du message olfactif. (Figure 4). Par la suite, au contraire de toute
autre information sensorielle, le message olfactif n’est pas traité par le thalamus mais par le
cortex olfactif primaire (réponses transitoires), l’amygdale (impliquée dans les phénomènes
d’aversion) puis l’hippocampe et le cortex orbito-frontal, sièges de la mémorisation et des
réponses durables (Figure 5).
15

Cellule granulaire
Cellule mitrale
Cellule à panache
Cellule
periglomérulaire
Axones des
neurones olfactifs
Vers le
tractus olfactif
Fibres afférentes
du système
nerveux central
Glomérules
Lame criblée
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Figure 4. Organisation du bulbe olfactif
Les neurones olfactifs projettent leurs
axones à la périphérie du bulbe olfactif
au niveau des glomérules. Les cellules
mitrales transmettent l’information vers le
cortex olfactif après modulation par les
cellules périglomérulaires et les cellules
granulaires (D’après Carleton et al.,
2002).
Figure 5. Représentation schématique des projections du système olfactif dans
le système nerveux central
Les signaux nerveux en provenance de l’épithélium olfactif (1) rejoignent le bulbe olfactif (2).
L’information après un premier traitement est dirigée vers le cortex olfactif primaire (3), qui
assure les réponses transitoires (flairage), et le cortex entorhinal (4). A partir de ce dernier,
le message est transmis au centre de la mémoire, l’hippocampe (6). A partir du cortex
olfactif primaire des informations nerveuses sont transmises à l’amygdale (5) à l’origine des
comportements aversifs et au thalamus (7) qui transmet au cortex orbitofrontal (8), à
l’origine des réponses durables (discrimination, jugement hédonique). Extrait de Zald et
Pardo (2000).
16

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
La physiologie de l’organe olfactif permet de comprendre comment un odorant active
un récepteur puis un neurone. Le cerveau analyse alors le message comme une odeur.
Cependant on est capable de reconnaître et discriminer des milliers d’odeurs différentes ; quel
est le système de codage qui assure la reconnaissance des odorants ?
3. Le codage des odeurs
3.1. Au niveau de l’épithélium olfactif
Chaque neurone n’exprime qu’un seul gène de récepteur olfactif (Strotmann et al.,
1994, Malnic et al., 1999, Serizawa et al., 2000) grâce à un système de répression de
l’expression des autres gènes de RO (Serizawa et al., 2004). De nombreuses équipes ont
montré qu’un récepteur olfactif pouvait être activé par un grand nombre de molécules
odorantes. Une approche consistant à augmenter in vivo la proportion de neurones exprimant
un récepteur olfactif donné a permis de montrer que le récepteur rOR17 de rat répondait à de
nombreux odorants (Zhao et al., 1998). Ce résultat est le premier montrant qu’un récepteur
donné a une spécificité large. Une autre étude sur la souris a permis à l’équipe de Linda Buck
d’identifier 13 récepteurs olfactifs et de caractériser leurs capacités de liaison pour 17
odorants, montrant que chaque récepteur reconnaît plusieurs odorants, mais que chaque
odorant peut se fixer sur plusieurs récepteurs (Malnic et al., 1999). Ces résultats s’accordent
avec les données obtenues lors de mesures d’électrophysiologie montrant que des neurones
olfactifs isolés de rat sont activés par un grand nombre d’odorants (Duchamp-Viret et al.,
1999). Par ailleurs, un odorant étant capable d’activer de nombreux récepteurs, pour chaque
odorant ou mélange d’odorants va correspondre un ensemble de récepteurs activés qui lui est
spécifique et dépend aussi de la présence d’inhibiteurs. La carte d’activation des neurones
étant spécifique de chaque odorant (ou mélange), elle correspond à une carte sensorielle. En
d’autres termes le cerveau peut retrouver l’ensemble des neurones activés et ainsi l’associer à
une odeur (Figure 6).
17

A
A
A
A
A
A
A
A
1 2 3 Odorants
B C D E
B C D E
B C D E
B C D E
B C D E
B C D E
B C D E
B C D E
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Récepteur olfactif
Bulbe olfactif
Différentes cartes d’activation possibles
1 A,B
2 A,C
3 C,E
1+2 A,B,C
1+3 A,B,C,E
2+3 A,C,E
1+2+3 A,B,C,E
Figure 6. Représentation schématique du système de codage des odorants
Un odorant, (1, 2 ou 3) peut activer plusieurs récepteurs olfactifs. Chaque neurone
n’exprimant qu’un seul récepteur, et chaque neurone exprimant le même récepteur se
projetant dans le même glomérule, à l’exclusion des autres, alors la carte d’activation des
récepteurs au niveau de l’épithélium se retrouve au niveau du bulbe olfactif. Cette carte
représentée ici avec des ronds de couleurs pour chaque glomérule activé, peut être
spécifique de chaque odorant ou mélange d’odorants. Adapté de Malnic et al., (1999).
18

3.2. Au niveau du bulbe olfactif
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Les neurones exprimant le même RO sont répartis de façon aléatoire dans une des
quatre zones de l’épithélium olfactif (Ressler et al., 1993). Ces neurones se projettent au
niveau de structures à la périphérie du bulbe olfactif, appelées glomérules. Les neurones
exprimant les mêmes récepteurs se projettent dans les mêmes glomérules (Treloar et al., 2002,
Strotmann et Breer, 2006), ainsi, pour chaque odorant ou mélange d’odorants, il y a un
ensemble unique de glomérules activés (Figure 6). La carte sensorielle d’activation
apparaissant au niveau de l’épithélium olfactif est transmise au niveau du bulbe olfactif. Plus
simplement, à chaque sensation olfactive correspond sur l’épithélium une carte des récepteurs
activés dont on retrouve l’image au niveau des glomérules. De plus, en utilisant un traceur
génétique, l’équipe de Linda Buck a pu mettre en évidence la projection de cette carte
sensorielle sur des neurones spécifiques du cortex olfactif (Zou et al., 2001). Ainsi, la carte
apparaissant au niveau du cortex olfactif résulte des neurones activés et permet la
reconnaissance d’une odeur.
Ce système où un odorant est reconnu par plusieurs récepteurs et où chaque récepteur
reconnaît plusieurs odorants permet la mise en place d’une combinatoire et donc de
discriminer un nombre d’odorants beaucoup plus important qu’il n’existe de récepteurs
olfactifs. De plus, tous les récepteurs activés par un odorant n’ont pas un seuil de réponse
identique (Malnic et al., 1999, Kajiya et al., 2001, Hamana et al., 2003). C’est pourquoi pour
deux concentrations différentes d’odorant, la carte sensorielle des neurones activés est
différente et donc la perception que l’on a de la molécule, l’odeur, paraît différente. Ainsi, on
le voit bien, les récepteurs sont les premiers éléments de la réponse olfactive. C’est leur
fonctionnement qui détermine la reconnaissance de l’odorant. Il est en outre intéressant de
noter qu’un odorant pur et un mélange complexe d’odorants aboutissent tous deux à
l’activation d’une carte sensorielle donc à une sensation olfactive dont on ne peut dire si elle
résulte d’un mélange d’odorants ou d’un composé pur.
4. Les récepteurs olfactifs
19

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Les RO appartiennent à la superfamille de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)
(Buck et Axel, 1991). Il s’agit d’une large famille de récepteurs membranaires capable de
reconnaître et d’effectuer la transduction de signaux extracellulaires aussi variés que des
photons, des odorants, des phéromones, des oses ou des macromolécules. Les RCPG ont été
regroupés en trois classes sur des critères d’homologie de séquence. Les membres d’une
même classe comportent au moins 25 % d’identité. La première classe, la plus abondante
comprenant les récepteurs olfactifs a été séparée en trois familles (a, b ou c). La famille a,
comprenant la rhodopsine et les récepteurs olfactifs, est caractérisée par un domaine
extracellulaire très court (20 à 30 acides aminés). De nombreuses études ont permis la
compréhension de la structure des RCPG de façon indirecte, jusque la publication de la
structure tridimensionnelle de la rhodopsine obtenue par cristallisation (Palczewski et al.,
2000). Cette structure, la seule connue pour les RCPG, a permis de confirmer la présence d’un
ectodomaine N-terminal extracellulaire et de 7 domaines transmembranaires formés
d’enchaînement d’acides aminés hydrophobes. Les 7 domaines transmembranaires repliés en
hélice α forment la structure commune à tous les RCPG (Figure 7).
Boucles cytosoliques
Boucles extracellulaires
Héliceα
Transmembranaire
22-24 a.a. hydrophobes
Figure 7. Représentation schématique d’un récepteur couplé aux protéines G
Schéma d’un RCPG. Ceux-ci comprennent 7 domaines transmembranaires notés TM1-7.
Les boucles extracellulaires et intracellulaires sont notées E1-3 et I1-3. Les boucles
intracellulaires et la partie C-terminale interagissent avec la sous unité α de la protéine G
(appelée Golf dans le cas des récepteurs olfactifs). Pour les RO, la boucle E2 est
particulièrement longue alors que l’extrémité N-terminale est très courte.
20

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
En outre l’analyse de cette structure montre la position du site de liaison au rétinal
entre les 7 domaines transmembranaires. Il a donc été supposé que tous les membres de la
famille 1a, dont les récepteurs olfactifs, ont un site putatif à ce niveau.
4.1. Aspects génétiques
Les RO constituent la plus grande famille multigénique mise en évidence chez les
mammifères avec plus de 1 % du génome chez l’homme, soit 906 gènes pour 322 protéines
fonctionnelles (Glusman et al., 2001). Les récepteurs olfactifs sont très anciens d’un point de
vue de l’évolution. En effet, on les observe chez de nombreux organismes comme les insectes,
les nématodes, les poissons ou les vertébrés. Leur répartition sur l’ensemble des chromosomes
des organismes les plus évolués, exceptés les chromosomes 20 et Y chez l’homme (Rouquier
et al., 2000), indique que leur origine est liée à la duplication d’un gène ancestral commun.
Parmi les primates, les singes de l’ancien monde (les plus évolués) comportent environ 30%
de pseudogènes de RO et l’homme près de 70%. En revanche, les singes du nouveau monde
en ont entre 15 et 20%, ce qui est similaire à ce qui est trouvé chez la souris (Rouquier et al.,
2000, Gilad et al., 2004, Rouquier et Giorgi, 2007). Il a été observé que le singe hurleur, seul
singe du nouveau monde à posséder comme l’homme et les singes de l’ancien monde une
vision en couleur (Gilad et al., 2004), possédait lui aussi un nombre important de pseudogènes.
On pense que l’acquisition d’un caractère comme la vision en couleur a fortement influencé
une baisse de la pression de sélection sur le système olfactif et donc une pseudogénisation
importante pour les organismes ayant acquis la capacité de voir en couleur (Rouquier et
Giorgi, 2007) (Figure 8). On peut aussi noter que l’apparition de la station debout lors de la
spéciation de l’homme a probablement défavorisé le système olfactif en éloignant l’organe
olfactif des sources odorantes, le plus souvent proche du sol (Shepherd, 2004).
21

Apparition de la
vision en couleur
MA 150 130 80 60 35 0
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Figure 8. Evolution du nombre de récepteurs olfactifs chez les mammifères
Représentation d’un arbre phylogénétique indiquant l’échelle de temps por la séparation des
différents groupes en millions d’années (MA). L’apparition de la vision en couleur chez les
vertébrés est indiquée par une flèche. A droite, comparaison du nombre de récepteurs
olfactifs pour chaque espèce (D’après Rouquier et Giorgi, 2007).
4.2. Classification des récepteurs olfactifs
Homme 350
Singes de l’ancien monde ~ 700
Singes du nouveau monde ~ 850
Lémuriens ~ 850
Vache nd
Souris 1000
Chien 1000
Opossum nd
Ornithorynque nd
Les RO humains sont répertoriés dans une base de données nommée HORDE (Human
Olfactory Receptor Data Exploratorium), consultable sur le site
http://bioportal.weizmann.ac.il/HORDE/. Les récepteurs olfactifs humains sont classés en
deux grands groupes, les récepteurs de classes I et II. Les récepteurs de classe I correspondent
aux récepteurs ayant une forte homologie avec les récepteurs olfactifs de poisson alors que
ceux de classe II sont apparus avec la vie aérienne. Les récepteurs sont classés en fonction de
leurs similarités de séquences. Les RO sont organisés en familles et sous-familles, soit des
ensembles de gènes comportant respectivement plus de 40% et plus de 60% d’identité. Par
exemple, le récepteur OR1A2 est le deuxième membre de la sous famille A appartenant à la
famille 1 (Glusman et al., 2000). Une autre base de donnée, ORDB (pour Olfactory Receptor
DataBase) consultable sur le site http://senselab.med.yale.edu/ordb/, répertorie les RO de
diverses espèces dont l’homme (Crasto et al., 2002). La nomenclature utilisée est différente
22

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
de celle de HORDE. Elle indique l’espèce et la localisation chromosomique associées à un
numéro de séquence propre à la base de donnée. Ainsi pour un même récepteur on pourra
avoir deux notations dans la littérature. Par exemple le récepteur OR17-209 utilisé dans
l’étude d’interactions avec une protéine de liaison aux odorants par Matarazzo et al. (2002)
est identique à OR1G1 dont le répertoire de ligands a été établi au laboratoire (Sanz et al.,
2005).
4.3. Aspects structuraux
Les récepteurs olfactifs ainsi que la rhodopsine appartiennent à la sous-famille 1a des
RCPG. Ils comportent un ectodomaine très court, de 20 à 30 acides aminés et fixent des
ligands de petite taille au sein d’une cavité située entre les domaines transmembranaires 3 et 6.
Ils ont une séquence courte, de 300 à 350 acides aminés, sans peptide signal défini. Les RO
possèdent en particulier une très longue boucle extracellulaire de 38-40 acides aminés,
contenant une paire de cystéines très conservées (Zhao et Firestein, 1999). Cette boucle est
beaucoup plus longue que pour tous les autres RCPG et est conservée pour tous les RO
suggérant un rôle important. Il a notamment été suggéré que cette boucle serait un site
potentiel d’interaction avec des partenaires comme les protéines de liaison aux odorants
(OBP). Les récepteurs olfactifs présentent des similarités de séquence de moins de 40 à plus
de 90%. Outre des portions très conservées, en particulier dans les domaines
transmembranaires 2, 6 et 7, ils possèdent des zones hypervariables au sein des domaines
transmembranaires 3, 4 et 5 (Zozulya et al., 2001). Il a été montré par mutagenèse que ces
zones hypervariables étaient impliquées dans l’interaction avec les odorants (Katada et al.,
2005, Abaffy et al., 2007) (Figure 9). Par ailleurs, les séquences conservées interagiraient
avec la machinerie de transduction, commune pour tous les récepteurs olfactifs.
23

souris
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Figure 9. Représentation de la séquence en acides aminés d’un récepteur de
Représentation de la séquence en acides aminés du récepteur de souris mOR-EG. Les
acides aminés en rouge sont situés dans des zones hypervariables alors que ceux en bleu
sont conservés dans la famille des RCPG. Les acides aminés entourés en rose, en jaune et
en noir sont ceux dont la mutation affecte fortement, faiblement ou pas du tout les capacités
de fixation du récepteur (extrait de Katada et al., 2005).
4.4. Fonctionnement des récepteurs olfactifs
Lors de l’activation des RCPG induite par la fixation d’un ligand, le premier
intermédiaire de la cascade de transduction est une protéine G. Il s’agit d’une protéine
trimérique constituée de 3 sous unités nommées α, β et γ. La sous unité α fixe et hydrolyse le
GTP, conduisant à l’activation spécifique d’une voie de signalisation intra cellulaire en
fonction du type de sous unité α. Il en existe quatre familles différentes (αS, αi, αq et α12) qui
donnent le nom des familles de protéines G correspondantes (GS, Gi, Gq et G12). Les
différentes protéines GS activent la voie de l’adénylate cyclase, alors que les Gi l’inhibent. Les
membres de la famille des Gq et G12 permettent respectivement l’activation de la
phospholipase C et des facteurs d’échange de guanine. Pour les récepteurs olfactifs, une
24

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
protéine GS, notée Golf a été décrite comme agissant directement après activation des
récepteurs olfactifs (Jones et Reed, 1989, Ma et Shepherd, 2000, Zheng et al., 2001).
L’activation de la Golf conduit à l’activation de l’adénylate cyclase qui catalyse la formation
d’AMPc. Ce second messager agit sur des canaux AMPc dépendant dont l’ouverture permet
l’entrée de calcium ou de sodium extracellulaire. Cette entrée de cations induit une
dépolarisation de la cellule nerveuse. Une voie plus controversée a été décrite impliquant
l’activation d’une phospholipase C par des protéines Gq (Okada et al., 1994, Boekhoff et al.,
1997, Barry, 2003, Ko et Park, 2006). Cette voie, via le clivage du phosphatidylinositol
biphosphate en inositol triphosphate permet la libération des stocks de calcium du réticulum
endoplasmique, ce qui génère la dépolarisation de la cellule nerveuse (Figure 10).
IP3
PLC
Odorant
Gq
PIP2
Ca 2+
β
γ
R-IP3
Réticulum
endoplasmique
Gq
GTP
RO
Golf
GDP
β
γ
Golf
AC
ATP AMPc
Ca 2+
Na +
Figure 10. Cascade de transduction de récepteurs
olfactifs
L’activation des récepteurs olfactifs exprimés dans la
membrane des neurones olfactifs induit l’activation d’une
protéine Gα (Golf) qui active l’adénylate cyclase (AC).
Cette enzyme catalyse la cyclisation de l’AMPc qui agit
sur un canal AMPc dépendant (CNG) permettant l’entrée
de cations extracellulaires. Cette entrée d’ions dépolarise
la cellule aboutissant à l’influx nerveux. Une autre voie a
été observée impliquant l’activation de la phospholipase
C (PLC) par une protéine Gq. La PLC dégrade le
phosphatydilinositol-4,5-biphosphate (PIP2) en inositol
triphosphate (IP3). L’IP3 agit sur des récepteurs canaux
(R-IP3) qui permettent alors le passage des ions calcium
du réticulum endoplasmique vers le cytoplasme créant
une dépolarisation membranaire.
25

4.5. Etude de l’activation des RO par les odorants
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Des mesures électrophysiologiques sur des neurones isolés ont permis de montrer
qu’un neurone répondait à plusieurs odorants (Duchamp-Viret et al., 1990, Duchamp-Viret et
al., 1999). Les démonstrations de l’expression d’un seul gène de récepteur olfactif par
neurone (Strotmann et al., 1994, Malnic et al., 1999, Serizawa et al., 2000) permettent
d’appliquer ces résultats aux récepteurs olfactifs au sens pharmacologique. Des études des
propriétés de liaisons des récepteurs olfactifs ont été effectuées notamment grâce à la mise au
point de systèmes d’expression hétérologue dans lesquels un gène de récepteur est exprimé
dans une cellule eucaryote qui ne l’exprime pas naturellement, et son activité mise en
évidence par des mesures révélant l’activation de la cascade de transduction. Très peu de
récepteurs olfactifs ont pu être caractérisés de cette façon ; en effet, on se heurte à d’énormes
difficultés, notamment au problème de l’adressage des récepteurs à la membrane.
Les quelques succès sont liés à la fusion du récepteur avec la séquence d’adressage à
la membrane d’un autre RCPG, par exemple la séquence N-terminale de la rhodopsine bovine
(Krautwurst et al., 1998, Hatt et al., 1999, Sanz et al., 2005) ou la coexpression de facteurs
d’adressage (Hague et al., 2004, Saito et al., 2004, Abaffy et al., 2007). En plus du récepteur,
une protéine Gα pouvant être activée par le récepteur olfactif est souvent co-exprimée. Ainsi,
Gα15 et Gα16 ont été utilisées avec succès pour détourner la voie de l’AMPc vers celle de la
phospholipase C. L’utilisation de sondes cytoplasmiques, dont la fluorescence augmente en
même temps que la concentration en calcium, permet de suivre les fluctuations du calcium
intra cytoplasmique liées à l’activation du récepteur. Ainsi, les variations de fluorescence
mesurées sont corrélables avec le niveau d’activation du récepteur olfactif. Ce système dit
d’imagerie calcique a été initialement employé avec succès sur quelques récepteurs de souris
(Krautwurst et al., 1998, Touhara et al., 1999, Kajiya et al., 2001, Gaillard et al., 2002), de rat
(Abaffy et al., 2006) et d’homme. Une autre méthode consiste à doser de façon enzymatique
le taux d’AMPc intra cellulaire (Kajiya et al., 2001).
Chez l’homme, ces méthodes d’imagerie calcique ont permis jusqu'à maintenant
d’étudier et de caractériser les ligands de seulement 7 récepteurs. Ainsi, l’équipe de Hanns
Hatt a montré l’activation du récepteur OR17-40 par l’hélional (Hatt et al., 1999, Wetzel et al.,
1999) ainsi que celle du récepteur OR17-4 par le bourgeonal (Spehr et al., 2003). Le
répertoire de OR17-40 a été établi très récemment (Jacquier et al., 2006). Deux études
26

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
publiées simultanément ont permis de caractériser les récepteurs OR1G1 et OR52D1 dans
l’équipe (Sanz et al., 2005) ainsi que OR17-210 et OR17- 209 (identique à OR1G1) dans
l’équipe de Catherine Ronin (Matarazzo et al., 2005). Les répertoires de OR1A1 et OR1A2
ont aussi été déterminés (Schmiedeberg et al., 2007).
L’étude menée par Sanz et al. présente deux intérêts majeurs. Tout d’abord, les
odorants ont été appliqués seuls et en mélange ce qui a permis de confirmer l’existence de
phénomènes d’antagonisme au niveau des récepteurs olfactifs, déjà montré pour le récepteur
OR17-4 (Spehr et al., 2003, Spehr et al., 2004), au niveau d’un récepteur d’aldéhydes chez le
rat (rORI7) (Araneda et al., 2004), ou encore un récepteur de l’eugénol chez le rat (Oka et al.,
2004). Dans le cas de OR1G1, il a été observé une activation du récepteur par des ligands de 8
à 10 carbones, alors que des ligands de même nature mais plus petits se sont révélés être des
inhibiteurs de l’activation du récepteur. D’autre part, cette étude est la première à utiliser un
mode d’application biomimétique. Contrairement aux autres approches où les odorants sont
solubilisés dans un solvant servant à leur application par mélange liquide-liquide, les odorants
sont présentés en mode vapeur au dessus des cellules exprimant le récepteur étudié et la
protéine Gα16. Ce mode d’application appelé VOFA pour Volatile-Odorant Functionnal assay,
permet la diffusion de l’odorant en mode vapeur en imitant le système olfactif.
4.6. Etude du site d’interaction RO-Odorant
Des alignements de séquences ont permis de déterminer comme on l’a vu des régions
des récepteurs olfactifs conservées et d’autres hypervariables (Zozulya et al., 2001). Ces
régions hypervariables sont considérées comme constituant le site potentiel d’interaction avec
les odorants. En absence de structure tridimensionnelle de récepteur olfactif, des modèles
moléculaires ont été établis à partir de la structure cristallisée de la rhodopsine bovine
(Palczewski et al., 2000). Ces modèles permettent de situer les zones hypervariables à
l’intérieur des 7 hélices transmembranaires, au niveau du site putatif de liaison (Floriano et al.,
2000, Singer, 2000, Man et al., 2004). Par analogie avec d’autre RCPG de la famille 1a et en
comparant les récepteurs de souris mORI7 et de rat rOR17, deux orthologues n’ayant que 15
acides aminés différents et fixant respectivement l’heptanal (Krautwurst et al., 1998) et
l’octanal (Zhao et al., 1998), Krautwurst et ses collaborateurs ont montré qu’une unique
substitution au niveau du site hypothétique inverse les préférences des deux récepteurs,
confirmant le modèle moléculaire de Singer et al. (2000), même si ces données de liaisons ont
27

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
par la suite été contestées pour ces deux récepteurs (Bozza et al., 2002, Gaillard et al., 2002).
Deux études sur des récepteurs de souris ont permis de caractériser les sites de liaisons, par
mutagenèse, confirmant la position du site d’interaction des odorants.
Le site de liaison de l’eugénol sur un récepteur de souris, mOR-EG, a été finement
caractérisé. 33 mutations ponctuelles ont permis de montrer que les résidus impliqués dans la
reconnaissance des odorants sont hydrophobes et que le site d’interaction se situe dans une
cavité entre les domaines transmembranaires 3, 5 et 6 (Katada et al., 2005). Une autre équipe
a montré récemment, toujours par mutagenèse, quels acides aminés sont impliqués dans la
fixation des ligands d’une famille de récepteur de souris (mOR42) (Abaffy et al., 2007)
(Figure 11).
N-terminal
C-terminal
Figure 11. Modèle moléculaire d’un récepteur olfactif
Domaine
extracellulaire
Membrane
Domaine
intracellulaire
Modèle construit par homologie du récepteur de souris mOR42-3 (Abbafy et al., 2006). Le
domaine extracellulaire est orienté vers le haut. Les 7 hélices transmembranaires sont
représentées par des cylindres numérotés en chiffres romains. Les acides aminés dont la
surface moléculaire est symbolisée par des points sont ceux différant du récepteur mOR42-
1. Les résidus dont la mutation affecte la spécificité du récepteur sont indiqués en rouge.
Ceux-ci se trouvent dans le tiers supérieur des hélices, au niveau d’une poche
correspondant au site de liaison. (D’après Abbafy et al., 2006).
28

II- LES PROTEINES DE LIAISON AUX ODORANTS
1. Propriétés générales des protéines de liaison aux odorants
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Lors de la recherche des récepteurs olfactifs, Paolo Pelosi a prouvé que les mucus
olfactifs de bovin, de rat et de lapin possédaient un site de fixation de l’IBMP saturable et
spécifique (Pelosi et al., 1982). Chez la vache, ce site est une protéine homodimèrique de 44
kDa exprimée au niveau de l’épithélium olfactif. Ces protéines, nommées protéines de liaison
aux odorants (OBP pour odorant-binding protein) ont été décrites chez toutes les espèces de
vertébrés étudiées, en particulier la vache, le porc, le lapin, la souris, le rat, le xénope,
l’éléphant et l’homme (Bignetti et al., 1985, Pevsner et al., 1988, Ganni et al., 1997, Garibotti
et al., 1997, Pes et al., 1998, Briand et al., 2000b, Scaloni et al., 2001, Briand et al., 2002,
Lazar et al., 2002, Millery et al., 2005). Les OBP de vertébrés sont sécrétées dans des
concentrations de l’ordre du millimolaire, spécifiquement dans le mucus olfactif au niveau de
l’épithélium olfactif (Steinbrecht, 1998) par les glandes de Bowman (Pevsner et al., 1986)
ainsi que par les glandes nasales latérales. Ce sont des protéines de faible poids moléculaire
(17-20 kDa) et ne possédant habituellement pas de modifications post-traductionnelles.
Différentes sous-types d’OBP ont été décrits chez une même espèce. Ainsi, trois OBP ont été
décrites chez le porc (Scaloni et al., 2001), quatre chez la souris (Utsumi et al., 1999), trois
chez le rat (Löbel et al., 1998) et 8 chez le porc-épic (Felicioli et al., 1993). Ces OBP lient
une grande variété d’odorants de classes chimiques variées avec des constantes de
dissociation de l’ordre du micromolaire.
2. Propriétés structurales des OBP
Les OBP de vertébrés appartiennent à la superfamille structurale des lipocalines
(Flower et al., 2000) qui possèdent peu d’homologie de séquences (entre 10 et 40%), mais
dont la structure tridimensionnelle est très conservée. Les lipocalines possèdent en commun
une hélice α C-terminale et 8 feuillets β antiparallèles formant un calice hydrophobe
constituant un site d’interaction avec des molécules lipophiles. Ces protéines interviennent
dans des processus physiologiques très différents, mais possèdent généralement une fonction
29

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
commune de transporteurs de composés hydrophobes. Par exemple, la rétinol binding protein
(RBP) transporte le rétinol dans le sang (Goodman, 2006). Les OBP comportent comme la
plupart des lipocalines un motif GxW vers la quinzième position formant une hélice 310 courte.
Un autre motif, YxxxYxG, dans le deuxième feuillet β, est lui aussi conservé pour la majorité
des OBP mais pas pour toutes les lipocalines (Tegoni et al., 2000) (Figure 12).
GxW
hOBP-2A -------LSFTLEEEDITGTWYVKAMVVDKDFPED---RRPRKVSPVKVTALG---GGNL 47
RnorOBP2 ------QEAPPDDQEDFSGKWYTKATVCDRNHTDG---KRPMKVFPMTVTALE---GGDL 48
Rpip CQADLPPVMKGLEENKVTGVWYGIAAASNCKQFLQ--MKSDNMPAPVNIYSLN---NGHM 55
RnorOBP3 --EEASFERGNLDVDKLNGDWFSIVVASDKREKIE--ENGSMRVFVQHIDVLE--NSLGF 54
Xlae ---VDIPADPNFTVDNLLGEWTGVAAASNCPLFMK--MKEVMKTEPVTKYWMD---GGNM 52
MmusOBP1b -----------------QGQWKTTAIMADNIDKIE--TSGPLELFVREITCDEGCQKMKV 41
Btau ----AQEEEAEQNLSELSGPWRTVYIGSTNPEKI--QENGPFRTYFRELVFDD--EKGTV 52
Ssrc -----QEPQPEQDPFELSGKWITSYIGSSDLEKIGFTENAPFQVFMRSIEFDD--KESKV 53
MmusOBP1a ---------------AMEGPWKTVAIAADRVDKIE--RGGELRIYCRSLTCEKECKEMKV 43
Emax ----LEEPLLDEYCSEISGTWYTIYEASANIEVLS--ENSPLRGYFRLIKFTCHPDGETL 54
RnorOBP1 -----HHENLDISPSEVNGDWRTLYIVADNVEKVA--EGGSLRAYFQHMECGDECQELKI 53
____________ _______ ___
A B C
YxxxYxG
hOBP-2A EATFTFMREDRCIQKKILMRKTEEPG-KFSAYGGRK-LIYLQELPGTDDYVFYCKDQRRG 105
RnorOBP2 EVRITFRGKGHCHLRRITMHKTDEPG-KYTTFKGKK-TFYTKEIPVKDHYIFYIKGQRHG 106
Rpip KSSTSFQTEKGCQQMDVEMTTVEKGHYKWKMQQGDS--ETIIVATDYDAFLMEFTKIQMG 113
RnorOBP3 TFR--IKENGVCTEFSLVADKTAKDGEYFVEYDGEN--TFTILKTDYDNYVMFHLVNVNN 110
Xlae MCSSKFRTSEGCQERKVTLKEAGKGQ-YTYTELGQS--LMTIIKLTPSLCLEHTTTTMSN 109
MmusOBP1b TFYVFTKQNGQCSLTTVTGYKQEDGKTFKNQYEGEN--NYKLLKATSENLVFYDENVDRA 99
Btau DFYFSVKRDGKWKNVHVKATKQDDGT-YVADYEGQN--VFKIVSLSRTHLVAHNINVDKH 109
Ssrc YLNFFSKENGICEEFSLIGTKQEGNT-YDVNYAGNNKFVFTVSYASETALIISNINVDEE 112
MmusOBP1a TFFTYVNENGQCSLTTITGYLQEDGKTYKTQFQGNN--RYKLVDESPENLTFYSENVDRA 101
Emax LVIFYTKENGTCQLYNKQGQRIDENG-YTTNYEGKV--DFSFIQQAKDFLLIHAFTINKN 111
RnorOBP1 IFN--VKLDSECQTHTVVGQKHEDGR-YTTDYSGRN--YFHVLKKTDDIIFFHNVNVDES 108
___ ______ ____ ______ ____
C D E F G
hOBP-2A GLRYMG---KLVGRNPNTNLEALEEFKKLVQHKGLSEEDIFMPLQTGSCVLEH--- 155
RnorOBP2 KSYLKG---KLVGRDSKDNPEAMEEFKKFVKSKGFREENITVPELLDECVPGSD-- 157
Rpip AEVCVT--VKLFGRKDTLPEDKIKHFEDHIEKVGLKKEQYIRFHTKATCVPK---- 163
RnorOBP3 GETFQL--MELYGRTKDLSSDIKEKFAKLCVAHGITRDNI-IDLTKTDRCLQAR-- 161
Xlae GDVYFD---LKLYKKGAESPKELGQFTKYALSLGLKKENVVFFKKGEKCTFN---- 158
MmusOBP1b SRKTKLLFTYILGKGEALTHEQKERLTELATQKGIPAGN--LRELAHEDTCPE--- 150
Btau GQTTE--LTELFVK-LNVEDEDLEKFWKLTEDKGIDKKNVVNFLENEDHPHPE--- 159
Ssrc GDKTI--MTGLLGKGTDIEDQDLEKFKEVTRENGIPEENIVNFTIIERDDCPAK-- 164
MmusOBP1a DRKTKFTLLFILGHG-PLTSEQKEKFAELAEEKGIPAGN--IREVLITDYCPE--- 151
Emax EEGNVFEVVGALAREKDISEENYQAFLEFAVENGIPKEN--IVKVIDTDTCPETLT 165
RnorOBP1 GKETN--VILVAGKREDLNKAQKQELRKLAEEYNIPNENTQFTHLVPTDTCNQ--- 159
_________ _____________
H Hélice α
Figure 12. Alignement de quelques OBP de vertébrés
La séquence protéique de l’OBP humaine hOBP-2A a été alignée sur diverses OBP de
vertébrés (ClustalW) : les OBP de rat (RnorOBP1, RnorOBP2 et RnorOBP3), l’OBP de
vache (Btau), celle de porc (Ssrc), deux OBP de souris (MmusOBP1a et MmusOBP1b), une
d’éléphant (Emax) ainsi que les OBP de xénope (Xlae) et grenouille (Rpip). Les acides
aminés communs avec hOBP-2A sont surlignés en jaune. Les séquences caractéristiques
des OBP et la position des feuillets β sont indiquées en gras et numérotés de A à F,
respectivement au dessus et en dessous de l’alignement.
30

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Les structures d’une OBP porcine (Vincent et al., 2000) et d’une OBP bovine
(Bianchet et al., 1996, Tegoni et al., 1996), obtenues par cristallographie aux rayons X, ont
révélé que huit feuillets β antiparallèles forment un tonneau délimitant une cavité apolaire
conformément à la famille des lipocalines (Figure 13).
A B
Figure 13. Représentation de la structure tridimensionnelle des OBP de vertébré
(A) Représentation de la structure tridimensionnelle de l’OBP porcine (numéro d’accès PDB :
1A3Y) dont le repliement avec 8 feuillets β antiparallèles formant un tonneau longé par
une hélice α est caractéristique des lipocalines.
(B) Représentation en ruban de l’OBP bovine (numéro d’accès PDB : 1OBP). Les sous
unités de cet homodimère (représentées en bleu et rouge) échangent leur hélice α par un
mécanisme de « domain swapping », phénomène exceptionnel chez les OBP.
Les représentations ont été réalisées avec le logiciel VMD.
Cette cavité a un volume de 500-550 Ǻ 3 et 780 Ǻ 3 pour les OBP bovine et porcine
respectivement. Elles possèdent un à deux ponts disulfure dont l’un, très conservé, forme une
liaison entre le quatrième feuillet β et l’hélice α, stabilisant la portion C-terminale de la
protéine. Le tryptophane du motif GxW présent chez toutes les OBP dans l’hélice 310 est
localisé au fond de la poche hydrophobe. Il n’est généralement pas en contact avec la cavité
ou le solvant.
31

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Certaines OBP ont été décrites comme des monomères telle que l’OBP porcine
(Vincent et al., 2000), d’autres comme des dimères telles l’OBP-1 de rat (Nespoulous et al.,
2004) ou l’OBP bovine (Bianchet et al., 1996). Les OBP dimériques possèdent un site de
fixation dans chacune des sous-unités. Dans le cas exceptionnel de l’OBP bovine, les sous
unités sont associées par échange de leur hélice α le long de la sous unité adjacente. Cette
association par échange de domaine (domain swapping) dû à la perte d’un pont disulfure crée
un troisième site putatif de liaison aux odorants, à l’interface des deux sous unités (Bianchet
et al., 1996, Tegoni et al., 1996, Ikematsu et al., 2005).
Des approches spectroscopiques et de microcalorimétrie ont montré que la structure
tridimensionnelle des OBP pouvait être légèrement modifiée par la fixation de ligands dans la
cavité hydrophobe. Ces modifications conduisent vraisemblablement à rendre inaccessible un
des sites de fixation des odorants pour les OBP dimériques comme l’OBP-1 de rat
(Nespoulous et al., 2004), même si pour l’OBP bovine ou l’OBP porcine aucun changement
significatif de structure n’a été observé par cristallographie sur des complexes odorants-OBP
(Vincent et al., 2000, Vincent et al., 2004).
3. Propriétés de liaison des OBP
Les premières approches ayant permis l’identification des OBP utilisaient des ligands
radioactifs. Ces techniques, malgré leur succès initial, restent problématiques en raison de la
volatilité des molécules marquées et de la nécessité de marquer de nombreux odorants. Par la
suite, la plupart des équipes ont utilisé une méthode de déplacement de sondes fluorescentes.
Cette méthode a notamment permis de déterminer que les OBP porcine et bovine
présentaient une faible spécificité et étaient capable de fixer des ligands très divers
(aliphatiques, aromatiques, terpènes…)(Tegoni et al., 2000). D’autres OBP, comme les OBP
de rat, présentent une plus grande affinité pour une famille chimique donnée. Ainsi, l’OBP-1
de rat fixe préférentiellement les hétérocycles, l’OBP-2 les longues chaînes carbonées des
aldéhydes et des acides gras, alors que l’OBP-3 fixe les cycles saturés ou non. (Löbel et al.,
2002). De même, l’OBP humaine hOBP-2A présente une spécificité proche de celle de
l’OBP-2 de rat, restreinte aux aldéhydes et aux acides aliphatiques (Briand et al., 2002, Löbel
et al., 2002). Des méthodes plus directes, par exemple le titrage calorimétrique isotherme, ont
permis d’étudier l’OBP porcine (Burova et al., 1999) ainsi que les OBP-1 et 3 de rat (Löbel et
32

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
al., 2001, Nespoulous et al., 2004). Toutes les OBP étudiées (chez le porc, le bœuf, le rat et
l’homme) lient les molécules odorantes avec des constantes d’affinité de l’ordre du
micromolaire (Burova et al., 1999, Briand et al., 2002, Löbel et al., 2002, Nespoulous et al.,
2004).
4. Les protéines humaines de liaison aux odorants
Une approche génétique a permis à Lacazette et ses collaborateurs, qui cherchaient des
lipocalines de larme, de montrer l’existence de deux gènes putatifs d’OBP humaine (hOBPIIa
et hOBPIIb) ayant 97,5% d’identité localisés sur le chromosome 9q34 (Lacazette et al., 2000).
Ces deux gènes sont transcrits dans la sphère orale pour hOBPIIa et dans les sphères orale et
génitale pour hOBPIIb. Par une analyse protéomique de prélèvements à différents niveaux de
la cavité olfactive, la présence de fragments protéiques correspondant à l’expression de
hOBPIIa ou hOBPIIb a été montrée spécifiquement dans la partie supérieure de la cavité nasale,
au niveau de l’épithélium olfactif (Briand et al., 2002). Une protéine recombinante
correspondant à hOBPIIa nommée hOBP-2A a été produite en levure Pichia pastoris et
caractérisée. La protéine mature comporte 155 acides aminés pour une masse moléculaire de
17 983 Da. Son point isoélectrique théorique est de 7,9 ce qui est relativement élevé comparé
aux autres OBP qui sont généralement acides. Elle possède en outre un pont disulfure
conservé pour les OBP de vertébrés entre les cystéines 59 et 151 (Figure 14).
33

CTG TCC TTC ACT CTG GAG GAA GAG GAC ATC ACC
L S F T L E E E D I T
1 11
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
GGT ACC TGG TAC GTC AAG GCT ATG GTT GTC GAC AAG GAT TTC CCA
G T W Y V K A M V V D K D F P
12 26
GAG GAT CGT AGA CCT AGA AAG GTC TCC CCT GTT AAG GTC ACC GCT
E D R R P R K V S P V K V T A
27 34 41
CTG GGT GGA GGT AAC CTG GAA GCC ACT TTC ACC TTC ATG CGT GAA
L G G G N L E A T F T F M R E
42 49 51 56
GAC CGT TGT ATT CAG AAG AAG ATC CTG ATG AGA AAG ACT GAG GAA
D R C I Q K K I L M R K T E E
57 62 71
CCT GGA AAG TTC TCT GCC TAC GGT GGA AGA AAG CTG ATT TAC CTG
P G K F S A Y G G R K L I Y L
72 78 82 86
CAG GAG TTG CCT GGA ACC GAC GAT TAC GTT TTC TAC TCT AAG GAC
Q E L P G T D D Y V F Y S K D
87 101
CAA AGA CGT GGT GGA CTG CGT TAC ATG GGT AAG CTG GTT GGA CGT
Q R R G G L R Y M G K L V G R
102 112 114 116
AAC CCA AAC ACC AAC CTG GAG GCC TTG GAA GAG TTC AAG AAG CTG
N P N T N L E A L E E F K K L
117 131
GTC CAA CAC AAG GGT TTG TCC GAG GAA GAC ATC TTC ATG CCA CTG
V Q H K G L S E E D I F M P L
132 146
CAA GCC GGT TCT TGT GTC TTG GAG CAC TAA
Q A G S C V L E H *
147 155
Figure 14. Séquence nucléotidique et protéique de hOBP-2A
Les acides aminés sont numérotés à partir du premier résidu de la protéine mature. Le pont
disulfure est indiqué par une ligne reliant les cystéines 59 et 151. Les résidus mutés au
cours de cette étude, les lysines K62, K82 et K112 les valines V34 et V114, l’alanine A49, la
phénylalanine F51 et la tyrosine Y78 sont indiquées en gras. L'astérisque indique le codon
stop. (D’après Briand et al., 2002)
34

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Des mesures de déplacement de sondes fluorescentes ont été effectuées montrant que
hOBP-2A avait une affinité plus importante pour les aldéhydes à longue chaîne et les acides
gras que pour d’autres familles chimiques. De plus, l’interaction de hOBP-2A avec les acides
gras ou les aldéhydes était d’autant plus forte que la chaîne carbonée était grande avec, pour
les aldéhydes, un maximum atteint pour une chaîne de 11 carbones (Figure 15).
Constante d’affinité (µM -1 )
3
2,5
2
1,5
1
0,5
Aldéhydes
0
6 8 10 12 14 16
Longueur de chaîne (nombre de carbones)
Acides
aliphatiques
Figure 15. Mesure de l’affinité de hOBP-2A en fonction de la taille des acides
gras et des aldéhydes
Les affinités de hOBP-2A pour des ligands aliphatiques sont reportées en fonction de la
taille du ligand, montrant une corrélation taille - affinité pour ces deux classes de ligands, les
aldéhydes (en rouge) et les acides aliphatiques (en bleu) (d’après Briand et al., 2002).
Ce spectre de liaison de hOBP-2A est proche de celui de l’OBP-2 de rat (Löbel et al.,
2002) avec laquelle hOBP-2A possède 45% d’homologie (Briand et al., 2002). Cette
spécificité d’interaction est à opposer avec la fixation d’odorants dans la cavité des OBP
porcine et bovine qui ne semblent pas lier de classe chimique préférentiellement à d’autres.
L’autre variant, hOBP-2B (gène hOBPIIB), ayant 95% d’homologie avec hOBP-2A,
s’exprime aussi dans la cavité nasale (R. Ramoni, communication personnelle). Toutefois les
mesures de fixation des odorants sur cette protéine indiquent que contrairement aux OBP de
rat, les deux variants humains ont des répertoires très similaires (Cristiani, 2005).
35

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
5. Eléments structuraux de la fixation des odorants dans la poche de l’OBP humaine
Les OBP bovine et porcine ont été cristallisées en présence de divers ligands. Ceux-ci
prennent des positions variables dans la cavité, c'est-à-dire que leurs positions n’ont pas révélé
d’interactions spécifiques avec un ou plusieurs acides aminés de la cavité, la plupart des
interactions sont de type hydrophobes et opportunistes (Vincent et al., 2000, Vincent et al.,
2004). En revanche, la spécificité de l’OBP humaine hOBP-2A pour les aldéhydes et les
acides aliphatiques indiquent un mode de fixation différent. Les lysines peuvent former une
liaison hydrogène entre leur fonction amine et la fonction carbonyle des aldéhydes et des
acides gras. Par mutagenèse, Liou et ses collaborateurs ont montré l'importance des lysines
dans l'interaction des acides gras avec des « fatty acid-binding proteins » (Liou et Storch,
2001). De plus, une interaction entre des lysines de la cavité hydrophobe d'une lipocaline, la
β-lactoglobuline et le groupement hydrophile d'un acide gras, l'acide palmitique a été mise en
évidence par co-cristallisation (Cho et al., 1994, Wu et al., 1999, Kontopidis et al., 2002). Le
nombre important de structure de lipocalines résolues, ainsi que leur repliement très conservé,
permettent de modéliser la structure des OBP de façon relativement fiable, même avec des
homologies de séquences faibles (souvent inférieure à 30%). Ainsi, un modèle moléculaire de
hOBP-2A a été établi à partir de la structure de l’allergène équin et a révélé la présence de
trois lysines (K62, K82 et K112) favorables à l’interaction avec des aldéhydes et des acides
aliphatiques. L’une de ces lysines pourrait être impliquée dans la stabilisation des aldéhydes
et des acides gras dans la cavité de hOBP-2A (Briand et al., 2002).
Les structures résolues des OBP bovine et porcine (Vincent et al., 2000, Ramoni et al.,
2002, Vincent et al., 2004) indiquent que la cavité de l’OBP est inaccessible au solvant, ce qui
implique des mouvements au moins de quelques chaînes latérales d’acides aminés pour laisser
entrer les ligands. Une approche spectroscopique ainsi que des études de dynamique
moléculaire ont suggéré l’implication de résidus aromatiques (tyrosine et phénylalanine)
localisés à l’entrée de la cavité. Ces résidus, conservés dans la famille des lipocalines seraient
impliqués dans l’entrée des ligands (Nespoulous et al., 2004, Hajjar et al., 2006, Golebiowski
et al., 2007).
6. Rôles physiologiques des OBP
36

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Jusqu’à ce jour, les OBP ont été découvertes chez tous les animaux aériens chez qui
elles ont été cherchées. Par ailleurs, une OBP de xénope est exprimée de façon concomitante
avec l’apparition de l’olfaction aérienne. Son expression est limitée au système olfactif aérien
et inexistante dans le système olfactif aquatique de cet animal modèle (Millery et al., 2005).
Ces résultats sont des arguments forts en faveur d’un rôle important des OBP de vertébrés
dans l’olfaction.
Le rôle suggéré dès leur découverte était un rôle de transporteur. Les OBP exprimées
en quantité importante dans le mucus olfactif aideraient à solubiliser les ligands hydrophobes
dans le mucus olfactif aqueux. Dans ce cas, les OBP pourraient libérer leur ligand au niveau
du récepteur olfactif ou être reconnues en tant que complexe OBP-Odorant. Les premières
études d’interactions ont montré que l’OBP bovine interagit avec les membranes des
épithéliums olfactif et respiratoire mais pas avec les cils olfactifs, sites d’expression des
récepteurs olfactifs (Boudjelal et al., 1996). Cette étude suggère la fixation d’OBP sur
d’autres sites que les récepteurs olfactifs. Cependant, une étude plus récente montre une
interaction entre une OBP porcine et le récepteur olfactif humain OR17-210 en absence de
ligand avec une constante de dissociation de 9,5 nM (Matarazzo et al., 2002). Ces résultats
sont en accord avec un rôle des OBP dans la détection et peut-être le codage des odeurs
(Matarazzo et al., 2002). Dans le cas où l’OBP agirait comme transducteur, les légers
changements de conformation suggérés par la modélisation (Hajjar et al., 2006) ainsi que
ceux observés expérimentalement (Nespoulous et al., 2004) pourraient expliquer une
reconnaissance différente de l’OBP avec ou sans ligand.
La présence de plusieurs variants dans une même espèce, laisse supposer que les
variants ont un rôle complémentaire de solubilisation des ligands. L’interaction de chaque
variant avec un groupe d’odorants différent suggère une fonction de discrimination des
odorants.
Un autre rôle avancé est celui de la protection. En effet, l’épithélium olfactif est une
zone de contact direct entre le cerveau et le milieu extérieur. Le mucus olfactif qui couvre
l’épithélium contient près de 19% de protéines dont le rôle est de protéger l’épithélium (Debat
et al., 2007). Les OBP, en capturant les molécules odorantes souvent toxiques, pourraient
avoir pour rôle d’empêcher leur action sur la muqueuse olfactive. L’OBP de porc et l’OBP
bovine présentent la propriété d’avoir une bonne affinité pour le 4-hydroxy-2-nonenal qui est
un produit final de dégradation de lipides. De plus, ces OBP ont la capacité d’empêcher les
37

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
dommages causés par ce composé sur des cultures de cellules épithéliales (Grolli et al., 2006).
En plus de cette fonction de détoxication, on peut imaginer les OBP comme des absorbeurs
dont le rôle serait d’empêcher la saturation des récepteurs olfactifs en limitant la quantité
d’odorant l’atteignant.
Une étude publiée récemment indique une diminution de l’ARNm de l’OBP-1 de rat
au niveau de la muqueuse olfactive après un jeûne de 48h suggérant un rôle dans la
physiologie de l’alimentation (Badonnel et al., 2007).
7. Comparaison avec le système olfactif des insectes
1. Organisation péricellulaire
Chez les insectes, la perception des odorants est réalisée au niveau des sensilles
olfactives. Il s’agit d’appendices situés sur les antennes (Figure 16) constitués d’une
extension de cuticule ouverte sur des pores et enfermant les dendrites de un à trois neurones
sensitifs.
Figure 16A. Organisation du système olfactif des insectes
Le siège de la détection des molécules volatiles se trouve notamment au niveau des
antennes. Chez la drosophile, un agrandissement montre les structures impliquées : les
sensilles indiquées par des flèches. La barre d’échelle mesure 0,2 µm (Wilson et al., 2007).
38

Récepteur olfactif
OBP
Cuticule
Neurone
Axone
Figure 16B. Organisation du système olfactif des insectes
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Schéma d’une sensille. Il s’agit d’une extension de cuticule enfermant le dendrite d’un
neurone olfactif. Celui-ci baigne dans la lymphe sensillaire très riche en OBP, en contact
avec l’air extérieur grâce à la présence de pores dans la cuticule (d’après Steinbrecht 1992).
Ce neurone baigne dans la lymphe sensillaire, équivalente au mucus olfactif des
vertébrés, et exprime à sa membrane des récepteurs olfactifs. Ainsi, comme chez les vertébrés,
on observe un obstacle hydrophile entre le récepteur et les odorant volatils et hydrophobes.
Toutefois, il a été découvert dans la lymphe sensillaire de nombreuses espèces, des protéines
de liaison en quantité importante, de l’ordre de 10 mM (Vogt, 1981, Steinbrecht et al., 1995).
Ces protéines ont été découvertes chez le papillon (Bombyx mori) (Steinbrecht et al., 1992,
Steinbrecht et al., 1995), la drosophile (Drosophila melanogaster) (Graham et Davies, 2002),
l’abeille domestique (Apis mellifera) (Danty et al., 1997, Danty et al., 1999) ou encore le
moustique (Anopheles gambiae) (Fox et al., 2001, Vogt et al., 2002)
2. Mécanismes péricellulaires de l’olfaction chez les insectes
Dendrite
Epithélium
Les récepteurs olfactifs d’insectes ont été découverts en premier lieu chez la
drosophile (Clyne et al., 1999, Gao et Chess, 1999). Ces récepteurs sont des récepteurs à 7
domaines transmembranaires couplés aux protéines G mais présentent très peu d’homologie
de séquence avec les récepteurs olfactifs de vertébrés. Ils comportent un domaine N-terminal
intracellulaire et fonctionnent à l’état d’hétérodimères (Benton et al., 2006). Si, chez les
vertébrés terrestres, le nombre de récepteurs olfactifs potentiels est important, les insectes ont
Pore
Lymphe sensillaire
Hémolymphe
39

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
en général un nombre plus faible de récepteurs olfactifs. Il y en a 163 chez l’abeille, 62 chez
la drosophile et 79 chez le moustique (Robertson et Wanner, 2006).
En revanche, le nombre d’OBP est quant à lui très important ainsi l’abeille possède 21
gènes d’OBP (Foret et al., 2007), la drosophile en comprend 51 dont au moins une trentaine
sont exprimés (Hekmat-Scafe et al., 2002), et le moustique en possède plus de 70 (Foret et al.,
2007). Cette diversité est un argument dans le sens d’un rôle de discriminant des OBP au
moins chez les insectes. Par ailleurs, Nardi et al. (2003) ont montré un profil d’expression
spécifique de 6 OBP du papillon Manduca sexta. Chaque OBP étant exprimée dans certaines
sensilles spécifiquement, on peut supposer un rôle de ces OBP dans la discrimination.
3. Aspects structuraux des OBP d’insectes
Hormis la localisation et la capacité des OBP d’insectes à fixer des odorants, ces
dernières divergent complètement des OBP de vertébrés d’un point de vue structural. Ce ne
sont pas des lipocalines et elles ont des structures constituées uniquement d’hélices α. On
distingue trois familles de protéines de liaison aux odorants chez les insectes : les protéines de
liaison aux phéromones (PBP), les OBP liant des odorants généraux (GOBP) et les CSP
(Chemosensory protein) qui lient des composés divers de la communication chimique. Les
PBP et les GOBP sont des petites protéines de 120 à 150 acides aminés. Elles comportent 6
cystéines formant 3 ponts disulfures stabilisant une structure constituée de 6 hélices α
(Sandler et al., 2000). Leurs séquences ont des pourcentages d’identité très variables (entre 6
et 99%). Les CSP sont des protéines plus petites (environ 110 acides aminés) constituées elles
aussi d’hélices α (Lartigue et al., 2002) (Figure 17). Elles ne possèdent que deux ponts
disulfure et fixent un plus grand nombre de ligands que les PBP ou les GOBP.
Certaines PBP et CSP présentent d’importantes modifications de structure en présence
de leurs ligands, notamment la PBP de Bombyx en présence de bombykol (Sandler et al.,
2000). Par ailleurs, la PBP de Bombyx subit d’importantes variations de structure en fonction
du pH (Horst et al., 2001). Il a été suggéré que des différences de pH à proximité des
dendrites des neurones permettent le changement de conformation de la PBP qui relargue
alors son ligand à proximité des récepteurs. En outre, ces modifications de structure
pourraient être nécessaires pour la reconnaissance par un récepteur du complexe OBPphéromone.
Effectivement, l’effet de certaines PBP sur l’activité des récepteurs phéromonaux
40

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
des deux papillons (Bombyx mori et Heliothis virescens) a été démontré (Groβe-Wilde et al.,
2006, Groβe-Wilde et al., 2007).
A B
Figure 17. Représentation de structures 3D d’OBP d’insectes
(A) Représentation de ASP2, une GOBP d’abeille co-cristallisée avec un ligand artéfactuel,
le n-butyl-benzene-sulfonamide, un composé de plastique représenté en rouge
(Lartigue et al., 2004).
(B) Représentation de la CSP de Mamestra brassicae. La couleur de bleu vers rouge
donne l’orientation de N vers C-terminal. (Lartigue et al., 2002).
Les représentations ont été effectuées à l’aide de VMD à partir des fichiers de la base de
donnée PDB : 1TUJ et 1KX8 respectivement pour ASP2 et la CSP de papillon.
4. Aspects fonctionnels
Ainsi, même si les OBP de vertébrés ou d’insectes se révèlent très différentes d’un
point de vue structural, les deux familles de protéines conservent suffisamment d’éléments
communs pour que leurs fonctions puissent être comparées. Kim et ses collaborateurs ont
généré des mutants de drosophile et observé les variations de comportement face à l’éthanol.
Les drosophiles sauvages fuient face à ce composé alors qu’une souche mutante, pour un gène
unique codant une OBP, est au contraire attirée par l’alcool (Kim et al., 1998). La
réintroduction par transgénèse de ce gène, nommé LUSH, restaure le comportement de fuite
41

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
des drosophiles mutantes, ce qui valide l’importance de LUSH dans l’olfaction. Par la suite, il
a été montré que LUSH fixait un phtalate, un composé de plastique contaminant l’alcool,
(Zhou et al., 2004) ; toutefois, il s’agissait de la première mise en évidence claire du rôle
d’une OBP dans les mécanismes de détection des odorants. La poursuite des études de
l’équipe de Dean P. Smith a, par la suite, permis de montrer que LUSH était nécessaire pour
l’activation de neurones spécifiques d’une phéromone (le 11-cis-vaccenyl acétate) impliquée
dans le comportement d’agrégation observé chez cette espèce (Xu et al., 2005, Ha et Smith,
2006).
Un autre exemple de fonction des OBP concerne les fourmis du feu (Solenopsis
invicta). Ces fourmis présentent deux type de colonies : certaines ont une reine unique,
d’autres en ont plusieurs. Ce comportement social est déterminé par un polymorphisme d’un
locus unique, le gène GP-9 qui code une PBP. Les ouvrières possédant un allèle B du gène
GP-9 ne tolèrent qu’une seule reine et éliminent d’éventuelles rivales, contrairement à celles
possédant l’allèle b, probablement moins sensibles à une phéromone de reconnaissance des
reines (Krieger et Ross, 2002). Ces résultats sont cependant à considérer prudemment puisque
le gène GP-9 est exprimé au niveau de l’abdomen et non au niveau des antennes des fourmis
du feu. Une autre étude sur la drosophile a montré par mutagenèse et expression ectopique
l’importance de deux CSP dans l’activation de neurones olfactifs par le CO2 (Jones et al.,
2007).
En outre, Pophof a montré que deux PBP de deux papillons, Antheraea polyphemus et
Bombyx mori pouvaient modifier les réponses électrophysiologiques de certains neurones à la
phéromone qu’elles lient. Cette modification est dépendante de l’espèce, ce qui est en accord
avec une interaction avec un récepteur différent entre les deux espèces (Pophof, 2002, Pophof,
2004). De même, une PBP de B. mori, BmorPBP active un seul récepteur phéromonal sur
deux exprimés dans un système hétérologue (Groβe-Wilde et al., 2006). De façon similaire,
une seule des deux PBP connues de H. virescens (HvirPBP2) affecte fortement la spécificité
du récepteur HR13 (Groβe-Wilde et al., 2007). L’existence de couples spécifiques PBP-
récepteurs chez ces deux insectes montre bien un rôle de discrimination des PBP, suggérant
une fonction dans le codage de la perception chimique.
Ces exemples montrent l’importance fondamentale des OBP d’insectes dans la
détection chimique et, par analogie, on peut supposer que cette fonction dans l’olfaction existe
aussi chez les vertébrés.
42

III- OBJECTIFS DE CE TRAVAIL
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Chez les vertébrés, le système olfactif est comparable à celui des insectes, avec des
récepteurs olfactifs exprimés à la membrane de neurones olfactifs recouverts d’une phase
aqueuse protectrice contenant des protéines de liaison aux odorants. Toutefois, si chez les
insectes, l’importance des OBP dans l’olfaction est clairement démontrée, chez les vertébrés,
le rôle des OBP reste hypothétique. On a vu que les mécanismes de discrimination des
stimulus olfactifs étaient intégrés très tôt, dans le processus olfactif, dès l’interaction entre le
récepteur et l’odorant. Quel rôle peut jouer l’OBP qui, physiologiquement, est en contact avec
les odorants avant le récepteur olfactif ? Dans le contexte actuel de l’olfaction, il parait
important de positionner les OBP dans ce système tripartite : Odorant-OBP-RO. L’objectif de
ce travail était d’apporter des éléments de réponse sur l’implication des OBP de vertébrés
dans l’olfaction.
Diverses études, en particuliers sur les OBP de rat, laissent à penser que les OBP
auraient un rôle dans la discrimination des odorants (Löbel et al., 2002). Chez l’homme, il a
été trouvé un variant d’OBP (hOBP-2A), exprimé au niveau de l’épithélium olfactif, qui
partage une forte homologie de séquence (45%) avec l’OBP2 de rat ainsi qu’une préférence
pour les aldéhydes et les acides aliphatiques (Briand et al., 2002). Les données
cristallographiques obtenues à partir de complexes OBP-ligand pour l’OBP de porc et de
bœuf indiquent une interaction opportuniste de ligands dans la cavité, c'est-à-dire qu’ils n’ont
pas de positionnement privilégié. La spécificité de hOBP-2A dénote un mécanisme original
de stabilisation des ligands dont on a voulu dans un premier temps comprendre les
déterminismes moléculaires. Par ailleurs, on a cherché à comprendre les mécanismes d’entrée
des ligands dans la cavité de l’OBP. En d’autres termes, quels sont les résidus d’acides aminés
impliqués dans la spécificité et dans l’entrée des ligands dans la cavité de hOBP-2A.
Pour répondre à ces questions, on a utilisé une approche de mutagenèse dirigée. Les
mutations ponctuelles ont été sélectionnées à partir de l’analyse de modèles moléculaires. Les
protéines sauvages et mutées ont été produites en système hétérologue chez la levure et
caractérisées. Des mesures de déplacements de sondes fluorescentes ont ensuite permis
d’évaluer l’impact des mutations sur la liaison OBP-Odorant. Les méthodes et les résultats
obtenus sont détaillés dans le premier chapitre de ce travail. Une partie des résultats a donné
43

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
lieu à une publication jointe (Tcatchoff et al., 2006), alors que d’autres résultats sont encore
préliminaires.
Dans la deuxième partie de ce travail, on s’est intéressé au rôle des OBP dans
l’olfaction. Une des fonctions supposée des OBP serait de transporter les molécules odorantes
hydrophobes à travers le mucus hydrophile vers les récepteurs olfactifs, puisqu’il a été montré
l’interaction entre un récepteur olfactif humain et une OBP de porc (Matarazzo et al., 2002).
On s’est donc interrogé sur le rôle des OBP dans le fonctionnement des récepteurs olfactifs.
Un système d’expression fonctionnel des récepteurs olfactifs mis au point au
laboratoire a permis d’établir le répertoire d’un récepteur olfactif humain, OR1G1 (Sanz et al.,
2005). Cette étude a révélé que ce récepteur présentait une préférence pour les aldéhydes. Son
meilleur activateur s’avère être le tridécanal (A. Tromelin et G. Sanz, communication
personnelle), qui est aussi le meilleur ligand de l’OBP humaine. En utilisant le système
biomimétique d’application des odorants en mode vapeur (VOFA) développé au laboratoire
(Sanz et al., 2005), on a voulu déterminer si la présence d’OBP pouvait affecter l’activation
du récepteur OR1G1 par les odorants. Cette approche a nécessité la mise au point d’un
nouveau système de production de l’OBP humaine, en bactérie.
44

CHAPITRE I - APPROCHE STRUCTURALE DES
INTERACTIONS OBP - ODORANTS

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
Les protéines de liaison aux odorants peuvent jouer un rôle clef dans les mécanismes
péricellulaires de l’olfaction. En effet, ce sont potentiellement les premières protéines en
contact avec les odorants au moment où ceux-ci pénètrent dans la cavité nasale. Certains
auteurs ont proposé pour ces protéines une fonction dans la discrimination des odorants, en
particulier chez le rat ou trois OBP ont des spectres de fixation des odorants complémentaires
(Löbel et al., 2002). Une étude réalisée au laboratoire a permis de montrer l’expression de
protéine humaine de liaison aux odorants, au niveau de l’épithélium olfactif (Briand et al.,
2002). Un variant d’OBP humaine, hOBP-2A a été exprimé en levure Pichia pastoris et
caractérisé. Il s’agit d’un monomère de 155 acides aminés comportant un pont disulfure
conservé au sein de la famille des OBP de vertébrés. Il présente en outre la séquence GxW
caractéristique des lipocalines (Figure 9), ainsi qu’un repliement constitué majoritairement de
feuillets β. Des mesures de déplacement de sondes fluorescentes ont permis de montrer qu’il
lie les molécules odorantes de façon réversible et présente une affinité plus grande pour les
aldéhydes et les acides gras aliphatiques comparativement à d’autres classes chimiques. En
outre, l’affinité croît avec la taille des ligands avec, pour les aldéhydes, un maximum pour
l’undécanal (11 carbones) (Figure 12). L’augmentation d'affinité observé pour les aldéhydes
ainsi que l’affinité plus faible des acides gras de taille équivalente, laisse supposer la des
interactions entre le groupe aldéhyde et des résidus du calice de hOBP-2A (Briand et al.,
2002).
Les lysines peuvent jouer un rôle dans les interactions protéines – acides gras ou
protéines – aldéhydes comme cela a notamment été démontré pour la Fatty acid-binding
protein (Liou et Storch, 2001) ou la β-lactoglobuline (Cho et al., 1994, Wu et al., 1999,
Kontopidis et al., 2002). Ainsi, on a supposé que l’interaction entre l’OBP et certains de ses
ligands, pouvait être stabilisée par une liaison entre la fonction aldéhyde et la chaîne latérale
d’une lysine de l’OBP. Or la modélisation moléculaire de hOBP-2A réalisée à partir de la
structure cristallisée de l’allergène équin, a révélé la présence de trois lysines dans sa cavité
hydrophobe, en position 62, 82 et 112 (Figure 18) (Briand et al., 2002). Nous avons voulu
valider l’hypothèse qu’une de ces trois lysines interagissait avec les groupements polaires des
odorants. Les alanines étant des résidus non chargés, de petite taille et modifiant peu la
structure des protéines, dans ce travail on a substitué par mutagenèse dirigée une alanine à
chacune de ces lysines dans trois mutants indépendants. Des comparaisons de constantes
46

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
d’affinité mesurées par compétition de sondes fluorescentes ont permis de suivre l’implication
de ces lysines dans la spécificité d’interaction de hOBP-2A avec les aldéhydes et les acides
gras. Ces résultats ont été publiés (cf. article joint) (Tcatchoff et al., 2006), cependant des
compléments sont apportés dans ce chapitre afin d’aider à mieux comprendre l’approche et
son aboutissement.
Figure 18. Vue en coupe du modèle tridimensionnel de hOBP-2A
La flèche jaune indique l’entrée de la cavité hydrophobe. Les lysines candidates (K62, K82
et K112) comme point d’ancrage des aldéhydes ou des acides gras sont indiquées en rouge.
Le seul tryptophane de la protéine (W14) situé au fond de la cavité est représenté en bleu
(D’après Briand et al., 2002).
A la lumière de ces résultats publiés, nous avons par la suite cherché à mieux
comprendre l’effet de la taille des ligands sur l’interaction avec l’OBP, notamment en
modifiant la spécificité de l’OBP humaine. En effet, la modélisation moléculaire a permis
d’identifier les résidus d’acides aminés ayant une chaîne latérale orientée vers l’intérieur de la
cavité de hOBP-2A. Parmi ceux-ci, les valines en position 34 et 114 ainsi que l’alanine en
position 49 sont situées à une hauteur intermédiaire dans le calice (Figure 19). On a donc
substitué chacun de ces résidus par une lysine, l’objectif étant pour ces mutants d’augmenter
l’affinité envers les petits ligands en ajoutant un point d’ancrage aux aldéhydes dans la cavité.
47

A49
V34
K112
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
V114
W14
Figure 19. Schématisation de la cavité de l’OBP humaine
La lysine 112 (en rouge) réalise une interaction avec l’undécanal symbolisé en vert. Les
résidus en bleu (V34, A49 et V114) sont ceux positionnés à un niveau intermédiaire de la
cavité et orientés vers la cavité. Le tryptophane au fond de la cavité est représenté en
orange.
Les diverses données cristallographiques obtenues sur les OBP indiquent que la cavité
hydrophobe formant le site d’interaction n’est pas accessible au solvant (Vincent et al., 2000,
Ramoni et al., 2002, Vincent et al., 2004). Ainsi, l’entrée du ligand implique nécessairement
des mouvements des résidus d’acides aminés. Il a été montré pour l’OBP-1 de rat que la
tyrosine 82 (et dans une moindre mesure la tyrosine 78) présentait une exposition au solvant
dépendante de la présence de ligands de l’OBP-1 de rat, suggérant une conformation
différente de ces résidus en présence de ligands (Nespoulous et al., 2004). Une étude de
dynamique moléculaire indique que les résidus 78 et 82 de cette OBP sont impliqués dans un
changement de conformation intervenant lors de la liaison entre l’OBP-1 de rat et le thymol
(Hajjar et al., 2006). Cette étude indique en outre l’interaction possible de la phénylalanine en
position 55 lors de l’entrée du thymol dans la cavité hydrophobe. Par ailleurs, le même type
d’approche a montré que la tyrosine 82 de l’OBP de porc était cruciale dans le mécanisme
d’entrée des ligands dans la cavité. Elle constituerait un point d’ancrage du ligand au niveau
de l’entrée de la cavité (Golebiowski et al., 2007). De plus, les tests de fixation de l’OBP de
porc marquée à l’iode radioactive sur deux récepteurs humains indiquent l’importance d’au
moins deux résidus tyrosine dans la liaison avec un des deux récepteurs olfactifs testés
(Matarazzo et al., 2002). L’alignement de différentes OBP, a révélé que la phénylalanine 55
48

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
et la tyrosine 82 de l’OBP de rat étaient très conservées, respectivement en position 51 et 78
chez l’homme (Figure 12), (Article joint, Figure 3C). Cette conservation suggère un
mécanisme commun d’entrée des ligands dans la cavité. Afin de comprendre le mode d’entrée
des ligands dans le calice de hOBP-2A, on a donc voulu vérifier par mutagenèse le rôle de ces
résidus dans l’interaction de hOBP-2A avec ses ligands. On a donc construit des mutants de la
phénylalanine 55 et de la tyrosine 78 en les substituant par des alanines.
Les mutants non publiés (V34K, A49K, V114K, F51A et Y78A) ont été produits
différemment des mutants dont l’étude est publiée (K62A, K82A et K112A). En effet, le
travail réalisé porte d’une part sur les interactions OBP-Odorants et, d’autre part, sur le rôle de
l’OBP sur le fonctionnement des récepteurs olfactifs. Ce dernier aspect est détaillé dans le
deuxième chapitre de ce travail. Des résultats préliminaires inattendus nous ont amené à
modifier la stratégie de production et de purification des protéines. En effet, la production en
levure décrite dans l’article conduit à l’obtention de protéines fonctionnelles pour ce qui est
de la fixation des molécules odorantes, mais non utilisables dans les tests cellulaires ultérieurs.
La purification des OBP humaines recombinantes a été réalisée jusqu’à ce jour dans des
conditions où la protéine peut être co-purifiée avec d’éventuels contaminants (Briand et al.,
2002) (article joint). C’est pourquoi une nouvelle méthode de production des OBP a été mise
au point. Diverses stratégies ont été développées, exposées dans le deuxième chapitre, ayant
pour but d’immobiliser l’OBP sur une colonne d’affinité afin d’éliminer les contaminants par
différents lavages. On a finalement opté pour une production d’OBP en bactérie, fusionnée à
la Glutathion S-transférase (GST) que l’on peut purifier par chromatographie d’affinité.
Les nouveaux mutants devant être produits selon la même stratégie, le détail du
changement de mode de production est donné dans ce chapitre, parallèlement aux
compléments apportés à l’article.
I- ARTICLE
Tcatchoff, L., Nespoulous, C., Pernollet, J-C. and Briand, L. (2006) A single lysyl residue
defines the binding specificity of a human odorant-binding protein for aldehydes FEBS Lett
580, 2102-8.
49

FEBS Letters 580 (2006) 2102–2108
A single lysyl residue defines the binding specificity of a human
odorant-binding protein for aldehydes
Lionel Tcatchoff, Claude Nespoulous, Jean-Claude Pernollet, Loïc Briand *
Biochimie de l’olfaction et de la gustation, Neurobiologie de l’Olfaction et de la Prise Alimentaire, UMR 1197 – INRA-Université Paris XI,
INRA, Domaine de vilvert, Bâtiment 526, F 78352 Jouy-en-Josas Cedex, France
Abstract Odorant-binding proteins (OBPs) are small abundant
soluble proteins belonging to the lipocalin superfamily, which are
thought to carry hydrophobic odorants through aqueous mucus
towards olfactory receptors. Human variant hOBP-2A has been
demonstrated to bind numerous odorants of different chemical
classes with a higher affinity for aldehydes and fatty acids. Three
lysyl residues of the binding pocket (Lys62, Lys82 and Lys112)
have been suggested as candidates for playing such a role. Here,
using site-directed mutagenesis and fluorescent probe displacements,
we show that Lys112 is the major determinant for governing
hOBP-2A specificity towards aldehydes and small carboxylic
acids.
Ó 2006 Federation of European Biochemical Societies. Published
by Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Lipocalin; Olfactory mucus; Olfaction; Odorantbinding
protein
1. Introduction
Odorant-binding proteins (OBPs) are abundant small soluble
proteins secreted in the mucus of a variety of species, from
insects to vertebrates [1] including human beings [2]. Vertebrate
OBPs belong to the lipocalin superfamily. Although lipocalins
display low sequence similarity, they share a conserved
8-stranded b-barrel scaffold, defining a central apolar cavity,
called calyx, whose role is to bind hydrophobic molecules [3].
OBPs reversibly bind odorants with dissociation constants in
the micromolar range and are good candidates for carrying
airborne odorants, which are commonly hydrophobic molecules,
through the aqueous nasal mucus towards olfactory
receptors [4,5]. OBP binding properties, investigated in rat,
demonstrated that the three OBP subtypes are specially tuned
toward distinct chemical classes of odorants [6] suggesting a
role in odorant discrimination. Although OBP physiological
function is not clearly understood in vertebrates, their essential
role in eliciting the behavioural response and odour coding
have been clearly demonstrated in the fruit fly [7].
* Corresponding author. Fax: +33 1 34 65 27 65.
E-mail address: loic.briand@jouy.inra.fr (L. Briand).
Abbreviations: DAUDA, 11-(5-(dimethylaminonaphthalenyl-1-sulfonyl)amino)undecanoic
acid; MALDI, matrix assisted laser desorption
ionization mass spectrometry; NPN, N-phenyl-1-naphthylamine; OBP,
odorant-binding protein; TOF, time of flight
Received 31 January 2006; revised 3 March 2006; accepted 6 March 2006
Available online 15 March 2006
Edited by Hans Eklund
By measuring the displacement of fluorescent probes, we
have previously shown that human recombinant variant
hOBP-2A is able to bind numerous odorants of different chemical
classes with a higher affinity for aldehydes and fatty acids
[2]. We proposed that highest affinity for aldehydes could result
from an interaction between aldehyde function and lateral
chain of a lysyl residue, stabilizing odorant docking. A 3D
model of hOBP-2A suggested that three lysyl residues
(Lys62, Lys82 and Lys112) located in the binding cavity are
good candidates for playing such a role. Here, we report the
comparison of the binding behaviours of the three point mutants
(K62A, K82A and K112A) demonstrating that Lys112
is the major determinant of higher affinity of hOBP-2A for
aldehydes.
2. Materials and methods
2.1. Mutagenesis procedure and production of hOBP-2A and mutants
The coding sequence of wild-type hOBP-2A [2] was amplified by
PCR and inserted in Pichia pastoris expression vector pGAPZaa
allowing to secrete hOBP-2A in the culture medium using the yeast
prepropeptide signal from Saccharomyces cerevisiae a mating-factor
under the control of the constitutive glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
promoter. We have previously reported that recombinant
wild-type hOBP-2A secreted by the yeast P. pastoris showed a variable
alkylation of the single free Cys99 (numbering according to the mature
full-length protein) [2]. In apolipoprotein D, this residue has been removed
by site-directed mutagenesis without a resultant loss of ligand-binding
activity [8]. To create a homogeneous recombinant
hOBP-2A, the codons for the unpaired Cys99 and potentially O-glycosylated
Thr148 were replaced using sequential steps of PCR mutagenesis
by a Ser and Ala codon, respectively. Using fluorescent
probe displacements, we found that double mutation C99S/T148A
did not affect the ligand binding properties of the protein (data not
shown). The C99S/T148A mutant is referred afterwards as hOBP-
2A. Using this construct as a template, lysyl residues in position 62,
82 and 112 were independently substituted for alanine using PCR, generating
K62A, K82A and K112A mutants. Construct DNA sequences
were confirmed by DNA sequencing using an ABI Prism 310 (PE
Biosystens). The expression plasmids were transferred into the P. pastoris
X33 strain through electroporating method. hOBP-2A and
mutants were expressed and purified as described previously [2].
2.2. Protein characterization
SDS–PAGE, N-terminal amino acid sequence, mass spectrometry
and circular dichroism analysis were performed as already described
[2]. To ensure that the lysine mutation was the only alteration of
hOBP-2A, unmodified protein and mutants were submitted to tryptic
digestion and chemical cleavage using cyanogen bromide [2]. In both
conditions, the resulting peptides were analyzed by matrix assisted
laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) mass
spectrometry.
0014-5793/$32.00 Ó 2006 Federation of European Biochemical Societies. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.febslet.2006.03.017

L. Tcatchoff et al. / FEBS Letters 580 (2006) 2102–2108 2103
2.3. Fluorescence-based ligand binding
Fluorophore ligand binding experiments were performed with 2 lM
hOBP-2A solutions in 50 mM K phosphate buffer, pH 7.5, as reported
previously [2]. Briefly, the fluorescent probes were dissolved in 100%
MeOH as 1 mM stock solutions. Successive 1-lL N-phenyl-1-naphthylamine
(NPN) probe aliquots were added to 1 mL of hOBP
solutions. After 3 min incubation time, spectra were recorded at
25 °C using a SFM 25 Kontron fluorometer. The excitation wavelength
of NPN and 11-(5-(dimethylaminonaphthalenyl-1-sulfonyl)amino)
undecanoic acid (DAUDA) were 337 and 345 nm, respectively.
Dissociation constants (K d) were calculated from a plot of fluorescence
intensity versus concentration of free ligand, obtained with a standard
non-linear regression method as previously described [2].
The competitive binding assays were performed with 2 lM of hOBP-
2A solutions using 3 lM of NPN or DAUDA. After addition of competitor
ligands dissolved in 100% MeOH, the fluorescence of probes
was recorded after stabilization of signal (3–4 min). The concentrations
causing fluorescence decay to half-maximal intensity were taken as
IC 50 values. The apparent K diss values were calculated as K diss =
[IC50]/(1 + [L]/Kd) with [L] being the free fluorophore concentration
and Kd the OBP-fluorophore complex dissociation constant. Tryptophan
fluorescence spectra were recorded between 300 and 400 nm
using an excitation wavelength of 285 nm with 2 lM of hOBP-2A
solutions in 50 mM K phosphate buffer, pH 7.5.
2.4. Molecular modelling
Three-dimensional models of hOBP-2A were built as previously described
[9], using 1.8 A ˚ crystal structure of human tear lipocalin [10]
(PDB code 1XKI) except for sequence analysis and pairwise alignments
performed on the EBI (http://www.ebi.ac.uk/) web site. Models
were minimized using DISCOVER and CFF91 force field (InsightII,
Accelrys) and submitted to molecular dynamics simulations in a water
box. Undecanal was built using Biopolymer module (InsighII, Accelrys)
and manually docked inside hOBP-2A pocket before automated
docking using Autodock3 [11]. The tertiary structure predictions of
rat OBP-2, rat OBP-3 were obtained using the modelling server
http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html [12]. Rat
OBP-1 3D model was built as previously described [9].
3. Results
3.1. Production and characterization of hOBP-2A mutants
In order to identify the lysyl residue involved in the higher
affinity of hOBP-2A for aldehydes, three single-mutations
K62A, K82A and K112A were independently introduced into
hOBP-2A using site-directed mutagenesis. Proteins were secreted
using the yeast P. pastoris and purified as already described
[2]. In all the purification steps, recombinant mutants
behaved like hOBP-2A protein. After purification, homogeneous
proteins were obtained as shown by SDS–PAGE
(Fig. 1A), and ascertained by N-terminus sequencing. Typical
purification yields were in the range of 4–8 mg per litre of culture.
In order to test the integrity of hOBP-2A mutants, purified
proteins were submitted to mass spectrometry analysis.
MALDI-TOF mass spectra (Fig. 1B) showed for each protein
a major peak exhibiting a molecular mass of 17732.5, 17732.4
and 17730.3 Da for K62A, K82A and K112A mutants, respectively.
These measured masses were in agreement with molar
masses calculated assuming the replacement of one lysyl residue
for an alanine residue (17727.3 Da). To ensure that the lysine
mutation was the only alteration of hOBP-2A, proteins
were submitted to trypsolysis and the resulting peptides were
analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry. Because trypsin
cleaves Lys-X and Arg-X bonds, substitution of lysine for alanine
knocks out a proteolytic cleavage site and consequently
alters peptidic mass map of hOBP-2A. As expected, trypsinolysis
of hOBP-2A and K82A mutant gave different peptides,
Fig. 1. Recombinant protein characterization of hOBP-2A and
mutants. (A) SDS–PAGE analysis of purified hOBP-2A and mutants.
The lane MM shows mass standards. (B) MALDI-TOF mass spectra
of purified hOBP-2A and mutants. (C) Circular dichroism spectra of
hOBP-2A (solid line), K62A (broken line), K82A (dotted line) and
K112A mutants (half broken and dotted line).
identified as Leu83-Lys100 (2164.09 Da) and Ala82-Lys100
(2235.11 Da), respectively. In each case, measured masses were
in perfect agreement with the calculated value. Because tryptic
peptides containing K62A and K112A substitutions were too
small to be identified using MALDI-TOF mass spectrometry,
the corresponding proteins were submitted to chemical cleav-

2104 L. Tcatchoff et al. / FEBS Letters 580 (2006) 2102–2108
age using cyanogen bromide. The masses of the peptides containing
substitution were in perfect agreement with their theoretical
molecular weights. Peptide Arg55-Met66 mass changed
from 1555.88 Da for hOBP-2A to 1498.82 Da, for K62A and
peptide Gly111-Met144 mass was found to be 3778.88 Da
for K112A mutant instead of 3836.04 Da for hOBP-2A. Taking
together, all these data demonstrated that the mass reduction
of the mutated proteins only originated in lysine–alanine
substitution at expected positions.
Far-UV CD spectra of hOBP-2A and mutants showed that
all proteins were well conformed and had very close secondary
structures (Fig. 1C). The shape of the spectra, i.e., the maximum
and minimum, respectively, at 195 nm and 215 nm, are
typical of a fold with a high content of b-structure, indicating
that mutations did not affect protein folding. Tryptophan fluorescence
spectroscopy is a very sensitive tool for probing structure
and conformational changes of proteins. hOBP-2A
contains a conserved single tryptophan residue (Trp14) located
Fig. 2. NPN and DAUDA fluorescence binding assay. Titration curves of NPN (A) and DAUDA (B) for hOBP-2A (s), K62A (h), K82A (j) and
K112A mutants (d). Fluorescence emission spectra were recorded at 25 °C at 400 and 490 nm for NPN and DAUDA, respectively, with excitation
wavelengths of 337 and 345 nm. Protein concentration was 2 lM. NPN and DAUDA formulas are inserted. Competitive binding assays of NPN (C)
and DAUDA (D) with undecanal. Excitation, emission wavelengths and protein concentrations were as in (A) and (B). Probe concentrations were
3 lM. Fluorescence of probe-protein complexes were assigned to 100% in absence of competitor. Competitive binding assays of NPN (E) and
DAUDA (F) with palmitic acid. Experimental conditions were as above.

L. Tcatchoff et al. / FEBS Letters 580 (2006) 2102–2108 2105
at the very bottom of the binding pocket whose fluorescence is
highly dependent from environmental differences. Tryptophan
fluorescence spectra of each protein were not significantly different
(data not shown), confirming that the mutagenesis of lysyl
residues did not change the three-dimensional
conformation of hOBP-2A.
3.2. NPN and DAUDA titrations
To measure the binding affinities of hOBP-2A and mutants
for odorants, we first measured the ability of these proteins
to bind the fluorescent probe NPN and the fatty acid fluorescent
analog DAUDA, as previously reported [2]. As shown in
Fig. 2A and B, titration of hOBP-2A and mutants with NPN
and DAUDA were saturable with one binding site per monomer.
The dissociation constants for NPN were found to be
comparable with K d values of 2.24 ± 0.77, 3.27 ± 0.77,
3.01 ± 1.66 and 6.78 ± 1.76 lM for hOBP-2A, K62A, K82A
and K112A mutants, respectively. For DAUDA, the dissociation
constants were observed to be also similar with K d values
of 2.91 ± 0.24, 3.02 ± 0.76, 3.29 ± 0.26 and 3.42 ± 1.05 lM for
hOBP-2A, K62A, K82A and K112A mutants, respectively.
3.3. Fluorescent probe displacement by undecanal and palmitic
acid
To evaluate the impact of mutagenesis, we first tested the
ability of the strongest ligands for hOBP-2A (undecanal and
palmitic acid) to displace NPN [2]. As shown in Fig. 2C, for
hOBP-2A, K62A and K82A mutants, the fluorescence intensity
of the hOBP-NPN complexes were severely reduced by
addition of undecanal with Kdiss values of 0.21, 0.27 and
0.28 lM, respectively. Interestingly, only a weak decrease of
NPN fluorescence emission was observed with increasing con-
centration of undecanal for the K112A mutant, which exhibited
a K diss value of 2.52 lM (Table 1). In contrast, palmitic
acid exhibited very similar NPN displacement properties for
all proteins (Fig. 2E) with close Kdiss values clustered between
0.36 and 0.74 lM (Table 1). To confirm these results, we also
determined the ability of undecanal and palmitic acid to displace
DAUDA (Fig. 2D and F). As observed with NPN,
hOBP-2A, K62A and K82A mutants, exhibited similar undecanal
competiting behaviour with Kdiss values of 0.13, 0.30,
and 0.14 lM, respectively. As expected, K112A mutant exhibited
a higher K diss value (1.01 lM), also indicating a lower
affinity for undecanal. In the case of palmitic acid, hOBP-
2A, K62A, K82A and K112 mutants exhibited similar DAU-
DA displacement properties (Fig. 2F) with Kdiss values of
0.17, 0.27, 0.18 and 0.16 lM, respectively. Since all dissociation
constants were comparable whatever the probe used, we
monitored only the displacement of NPN to measure the binding
affinities of mutants for other odorants.
3.4. NPN displacement by aldehydes and aliphatic acids of
increasing size
We investigated the ability of aldehydes of different size
(from 6- to 13-carbon chain length) to displace NPN. As observed
with undecanal, for all aliphatic aldehydes, K62A and
K82A mutants behaved like hOBP-2A. For efficient aldehydes
(from 7- to 13-carbon chain length), these proteins exhibited
also very close Kdiss values for each tested ligand (Table 1).
As expected, K112A mutant exhibited a dramatically decrease
of affinity for efficient aldehydes, with a 3.0- to 17.6-fold increase
of their Kdiss values (Table 1) with a higher impact observed
with nonanal (9-carbon chain length). To investigate
steric hindrance influence on binding properties, we also tested
Table 1
Affinity of ligands for hOBP-2A and mutants
Ligands Kdiss (lM)
hOBP-2A K62A K82A K112A
Aldehydes
Hexanal (C6) 4.42 ± 1.20 5.61 ± 1.50 5.30 ± 1.35 6.97 ± 1.02
Heptanal (C7) 1.16 ± 0.03 1.35 ± 0.25 0.72 ± 0.25 7.00 ± 3.08
Octanal (C8) 0.69 ± 0.15 0.70 ± 0.13 0.54 ± 0.19 3.95 ± 1.67
Nonanal (C9) 0.38 ± 0.06 0.41 ± 0.04 0.22 ± 0.02 6.70 ± 2.82
Decanal (C10) 0.46 ± 0.07 0.26 ± 0.01 0.31 ± 0.01 4.90 ± 1.95
Undecanal (C11) 0.21 ± 0.01 0.27 ± 0.04 0.28 ± 0.07 2.52 ± 0.48
Dodecanal (C12) 0.97 ± 0.24 0.36 ± 0.08 0.34 ± 0.11 2.91 ± 1.20
Tridecanal (C13) 0.17 ± 0.05 0.21 ± 0.04 0.15 ± 0.01 0.63 ± 0.01
Other aldehydes
3-Ethoxy-4-hydroxybenzaldehyde 4.22 ± 1.10 5.57 ± 2.22 5.51 ± 1.64 6.70 ± 0.63
4-Hydroxy-3-methoxy-benzaldehyde 3.67 ± 0.47 4.10 ± 0.35 4.90 ± 0.51 6.62 ± 1.51
Benzaldehyde 3.59 ± 0.36 3.33 ± 0.01 6.46 ± 0.29 4.65 ± 2.85
Paramethoxybenzaldehyde 3.26 ± 0.45 3.49 ± 0.51 5.26 ± 1.99 5.10 ± 3.67
3-Phenyl-2-propenal 1.79 ± 0.29 2.83 ± 0.71 2.10 ± 0.65 4.77 ± 0.32
3,7-Dimethylocta-2,6-dienal 1.15 ± 0.19 1.40 ± 0.23 0.91 ± 0.05 6.93 ± 3.06
Aliphatic acids
Octanoic acid (C8) 5.05 ± 1.52 5.28 ± 1.38 4.34 ± 1.41 6.20 ± 1.33
Nonanoic acid (C9) 2.75 ± 0.27 3.15 ± 0.42 3.52 ± 0.69 5.71 ± 1.35
Decanoic acid (C10) 1.98 ± 0.41 2.68 ± 0.60 2.49 ± 0.73 5.51 ± 1.05
Dodecanic acid (C12) 0.63 ± 0.08 0.49 ± 0.05 0.48 ± 0.02 4.41 ± 2.08
Myristic acid (C14) 0.71 ± 0.24 0.46 ± 0.10 0.92 ± 0.25 1.13 ± 0.54
Palmitic acid (C16) 0.74 ± 0.14 0.59 ± 0.08 0.36 ± 0.01 0.42 ± 0.14
Affinity constants (K diss) are the mean of at least three independent competitive assays against NPN with standard deviation (S.D.). K diss are apparent
dissociation constant obtained by Kdiss = [IC50]/(1 + [L]/Kd) with [L] for the free probe concentration and Kd the measured dissociation constants of
OBP-probe complexes. Experimental procedures were those of Fig. 2.

2106 L. Tcatchoff et al. / FEBS Letters 580 (2006) 2102–2108
structurally diverse aldehydes. As expected, for 3,7-dimethylocta-2,6-dienal
and 3-phenyl-2-propenal, which are the best
NPN competitors of this class of compounds, K62A and
K82A mutants behaved like hOBP-2A, whereas K112A mutant
exhibited a significant decrease of affinity, with K diss values
of 6.93 and 4.77 lM, respectively. For other less efficient
benzenic and heterocyclic aldehydes, all the three mutants be-
haved like hOBP-2A with Kdiss values ranging between 3.26
and 6.70 lM (Table 1).
We also examined the impact of mutations on binding
capacities of hOBP-2A for aliphatic acids of different size
(from 8- to 16-carbon chain length). In the case of fatty acids
with a chain length greater than 12-carbons, hOBP-2A and the
three mutants showed approximately the same ability to dis-
Fig. 3. 3D model of hOBP-2A and sequence comparison of vertebrate OBPs. (A) Ribbon drawing of hOBP-2A model showing Lys62, Lys82 and
Lys112 in the binding pocket. (B) Vertical section of hOBP-2A binding pocket showing Lys112 interacting with undecanal. Undecanal, Lys112 and
Lys82 (stick representation) are coloured according to element type. (C) Amino acid sequence alignment of hOBP-2A with other vertebrate OBPs of
known binding specificity. Amino acids are numbered from the first Leu of the mature sequence of hOBP-2A. OBPs are: hOBP-2A (Swiss-Prot code
Q9NY56), RnorOBP1 (Rat OBP-1; EMBL code Q9QYU9), RnorOBP2 (Rat OBP-2; GenBank code NM173148), RnorOBP3 (Rat OBP-3, GenBank
code NM001033959), SsrcOBP (porcine OBP; EMBL code Q8WMH1), and BtauOBP (Bovine OBP; EMBL code P07435). Amino acid sequences
were aligned based on structural similarities. Residues involved in the binding pocket are represented white on a blue background. Lysyl residues
Lys62, Lys82, Lys112 and conserved lysines in rat OBP-2 sequence are coloured red on yellow background. Residues lining cavity of bovine OBP
(PDB code 10BP) and porcine OBP (PDB code 1A3Y) were defined in [3,22], respectively.

L. Tcatchoff et al. / FEBS Letters 580 (2006) 2102–2108 2107
place NPN, with similar Kdiss values, clustered between 0.36
and 1.13 lM (Table 1). Interestingly, for aliphatic acids from
9- to 12-carbons, while K62A and K82A mutants and
hOBP-2A displayed similar binding properties, K112A was
shown to inefficiently bind these compounds, with K diss values
between 4.41 and 5.71 lM.
3.5. Molecular modelling
In absence of experimental crystallographic data, 3D molecular
modelling of hOBP-2A has been performed using human
tear lipocalin as a template [10] because it exhibits 45.2% sequence
identity and was demonstrated to interact with a broad
array of fatty acids [13]. The final model was selected according
to energetic and geometric criteria and had the initial best
objective function before minimization. When superimposed
with its template, the backbone trace of the hOBP-2A model
displayed a 0.744 A ˚ root mean square deviation on 132 Ca
atoms. The Ramachandran plot indicated that all residues presented
u and w angles in the core of allowed regions and, most
bond lengths and angles were in the range of expected values.
The predicted structure of hOBP-2A exhibited a binding pocket
with a volume of 620 A ˚ 3 (approximate dimension 8 · 13 A ˚ ).
The molecular model of hOBP-2A also revealed that Lys62 is
located at the entrance of the cavity, while residues Lys82 and
Lys112 are situated more deeply inside the binding pocket
(Fig. 3A). Docking experiments gave a set of undecanal positioning,
complementary to the cavity of the binding pocket.
In 90% of undecanal conformations, the aldehyde function
was close to the Lys112 amine function, with a distance between
both groups of 2.24 ± 0.76 A ˚ (Fig. 3B).
4. Discussion
With the aim of determining the molecular parameters guiding
the affinity of hOBP-2A, K62A, K82A and K112A mutants
were generated. Careful analysis on hOBP-2A mutants
indicated that the expected mutations were the only alterations
of hOBP-2A. Competitive binding experiments performed
with aliphatic aldehydes and acids of different size indicated
that Lys62 and Lys82 are not involved in hOBP-2A binding
specificity (Fig. 4). In contrast, they revealed that Lys112 is a
major determinant for the binding of medium size aldehydes
and small aliphatic acids. Moreover, docking experiments con-
firmed that undecanal could be accommodated in hOBP-2A
binding pocket with its aldehyde function forming H-bond
with the amine function of Lys112.
Interestingly, we also observed that hOBP-2A and K112A
mutant exhibited similar capacity to bind tridecanal (13-carbon
chain length) and larger fatty acids (14- and 16-carbon
length), suggesting that these compounds bind onto hOBP-
2A without involvement of Lys112. Hydrophobic interactions
are likely the main forces driving the binding of these compounds.
Because hOBP-2A exhibited an affinity increasing
with the size of aldehydes from 6 to 13 carbons, excepted dodecanal
(12-carbon chain length), which showed a weaker affinity
(Fig. 4 and Table 1), we can speculate that dodecanal is too
large to interact with Lys112, whereas it is too small to make
efficient hydrophobic interactions. Our binding data also revealed
a weaker affinity for benzenic and heterocyclic aldehydes
(Table 1) suggesting a strong correlation between the
bulkiness or the degree of unsaturation of the different aldehydes
and their affinity with hOBP-2A. We can hypothesize
that the rigidity of these aldehydes hampers the interaction
of aldehyde function with the amine function of Lys112.
We were surprised to found that neither Lys62 nor Lys82,
both located at the rim of the calyx, were involved in binding
of aldehydes and aliphatic acids. Indeed, using crystallographic
analysis, bovine b-lactoglobulin has been shown to
interact with palmitic acid within its central cavity, involving
an H-bound between the fatty acid and Lys69, located at the
open entrance of the cavity [14], although these data have been
controversed [15,16]. Using a combinatorial protein design approach,
Skerra and coworkers created artificial lipocalins
called ‘‘anticalins’’ with novel ligand specificities [17,18].
Hence, they showed that residues located within the four loops
at the entrance of the b-barrel have a deep impact on the binding
specificity of the new designed lipocalins. In addition,
a1-microglobulin, which is a plasma lipocalin, has been demonstrated
to carry chromophores covalently attached to three
lysyl residues also near the entrance of the lipocalin pocket
[19]. All these observations are in contrast to our demonstration
that a lysyl residue, buried in the ligand binding pocket,
is involved in the binding specificity of hOBP-2A.
Binding specificities of OBPs have been extensively investigated
in some vertebrates. In rat, 3 OBP subtypes have been
reported to be tuned towards distinct chemical classes of odorants.
Rat OBP-1 preferentially binds heterocyclic compounds
Fig. 4. Relationships between size and Kdiss of aliphatic aldehydes and acids. Dissociation constant resulting from NPN competition experiments
(Table 1) of hOBP-2A (s), K62A (h), K82A (n) and K112A mutants (d) for aldehydes and fatty acids. Data are an average of at least three
independent measurements and the error bars represent the S.D. of the mean derived from the differences between the measurements. For S.D. under
0.2, bars are not visible. Experimental conditions were those of Fig. 2.

2108 L. Tcatchoff et al. / FEBS Letters 580 (2006) 2102–2108
such as pyrazine derivatives and OBP-2 appears to be more
specific for long-chain aliphatic aldehydes and carboxylic
acids, whereas OBP-3 was described to interact strongly with
odorants composed of saturated or unsaturated ring structures
[6]. In contrast, porcine and bovine OBPs were demonstrated
to bind a broad range of odorants belonging to various chemical
classes including aldehydes [20,21]. Crystal structures of
these OBPs complexed with odorant molecules revealed that
odorant molecules, including undecanal, interact in the cavity,
with alternative conformations revealing absence of specific
interactions [3,22]. Alignment of amino acid sequences of
OBPs of known binding specificity revealed that none exhibit
any charged amino acids in their binding pocket (Fig. 3C), except
hOBP-2A and rat OBP-2 which both possess Lys82 and
Lys112 residues. Interestingly, hOBP-2A and rat OBP-2 share
a common narrow binding specificity tuned towards aldehydes
and fatty acids. The conservation of Lys112 is in agreement
with our demonstration of a crucial role of this lysyl residue
in hOBP-2A binding specificity and we can speculate that rat
OBP-2, uses a similar mechanism for aldehyde binding.
Acknowledgements: We thank Y. Nedelec, V. Bézirard, F. Blon and
J.-C. Huet for their technical help. This work was supported in part
by a ‘‘Sesame’’ grant (1652) of the Ile-de-France Region. Mass spectrometry
and Edman sequencing experiments were performed by the
Plateau d’Analyse Protéomique par Séquençage et Spectrométrie de
Masse (INRA, Jouy-en-Josas).
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CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
II- COMPLEMENTS CONCERNANT L’ARTICLE ET D’AUTRES
1. Matériel et méthodes
1. Mutagenèse dirigée de hOBP-2A
MUTANTS
1.1. Vecteur d’expression en levure
Le plasmide pGAPZα (Invitrogen) a été utilisé pour l’expression des OBP sauvage et
mutées (K62A, K82A et K112A) sous le contrôle du promoteur constitutif de la
glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (pGAP). Le plasmide comporte la séquence du
prépropeptide du facteur α de Saccharomyces cerevisiae permettant la sécrétion dans le
milieu de culture de la protéine produite et clivé par KEX2, une protéase endogène. Le
vecteur pGAPZα contient le gène de résistance à la Zéocine TM , placé sous le contrôle de deux
promoteurs permettant l’expression constitutive chez Escherichia coli et Pichia pastoris. Ce
vecteur contient une origine de réplication d’E. coli (ColE1) permettant la propagation du
plasmide en bactérie. Ce plasmide n’est pas répliqué par la levure P. pastoris, l’intégration
dans le génome se fait par recombinaison homologue au niveau du promoteur pGAP.
1.2. Vecteur d’expression en bactérie
Le plasmide pGEX-2T (Amersham Biosciences) a été utilisé pour l’expression de la
protéine sauvage et de la nouvelle série de mutants (V34K, A49K, V114K, F51A et Y78A).
Ce plasmide comporte un gène lac I q permettant de réprimer le promoteur tac inductible à
l’isopropyl β-D thiogalactoside (IPTG). Ce promoteur contrôle l’expression de la Glutathion
S-transférase (GST) fusionnée à la protéine d’intérêt. La GST interagissant de façon
spécifique avec son substrat, le glutathion, cela permet une purification par chromatographie
d’affinité. Un site de clivage à la protéase TEV a été inséré afin de pouvoir par la suite
éliminer la GST. Il s’agit du nom usuel du domaine catalytique de 33,5 kDa d’une protéase
(Nuclear Inclusion a) d’un virus de tabac, tobacco etch virus (TEV). Cette protéase présente
les avantages d’être très spécifique, et de pouvoir être produite facilement au laboratoire en
grande quantité. Son site de clivage se situe entre la glutamine et la glycine (ou sérine) dans la
séquence E-X-X-Y-X-Q-(G/S) (Parks et al., 1994). La séquence la plus couramment
58

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
employée, par exemple pour cliver une étiquette d’affinité d’une protéine produite en système
hétérologue est ENLYFQG (Phan et al., 2002, van den Berg et al., 2006). En outre, la
protéase TEV utilisée comporte une queue de poly-histidines additionnelle permettant de la
purifier sur une colonne de chromatographie d’affinité avec des ions métalliques immobilisés
(IMAC) et de la séparer des autres protéines du milieu.
1.2. Amplifications et purifications de plasmides
La souche DH5α d’E. coli a été utilisée pour les clonages et la propagation des
plasmides. Une culture de 5 mL de milieu LB-LS (bacto-tryptone 10 g/L, extrait de levure 5
g/L, NaCl 5 g/L ajusté à pH 7,5) supplémentée avec de la Zéocine TM à 25 µg/mL ou de
l’ampicilline à 100 µg/mL en fonction du gène de résistance du plasmide à amplifier
(respectivement pGAPZα ou pGEX-2T) a été ensemencée par une colonie de bactéries
transformées par un plasmide et placée en culture à 37°C agitée à 200 rpm pour la nuit. Les
plasmides ont été purifiés en utilisant le kit "QIAprep Spin miniprep" de Qiagen en suivant les
instructions du fournisseur. La purification repose sur une adsorption sélective des acides
nucléiques sur des particules de gel de silice en présence de sels chaotropes permettant une
séparation des constituants cellulaires.
1.3. Electrophorèse sur gel d’agarose
L’ADN plasmidique ou les fragments de PCR ont été analysés par électrophorèses sur
gel d’agarose 1% (m/v) réalisé avec du tampon TAE (Tris 4 M à pH 8,3, acétate de sodium 2
M, EDTA 0,1 mM). Le même tampon a été utilisé pour la migration des échantillons qui sont
déposés additionnés de 1 µL de bleu de dépôt (bleu xylène 10% (p/v) dans du glycérol 50%
(v/v)). Après migration pendant 20 minutes à 100 V, le gel a été placé 30 minutes dans une
solution de bromure d’éthidium à 0,5 µg/mL. Le marqueur de masse moléculaire était le
Smart Ladder (Eurogentec) ou le 2-log DNA Ladder (New England Biolabs) permettant
également une quantification des échantillons déposés.
1.4.1.1. Principe
1.4. Mutagenèse dirigée
1.4.1. Mutagenèse par PCR d’après la méthode de Ho et al.
59

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
La mutagenèse dirigée pour obtenir les mutants K62A, K82A et K112A a été réalisée
par PCR selon la méthode de Ho et al. (1989) (Figure 20). Dans un premier temps, deux PCR
indépendantes permettent d’amplifier la séquence de part et d’autre de la mutation souhaitée.
L’oligonucléotide central porte dans les deux cas une mutation. Les deux produits de PCR
obtenus possèdent donc une portion chevauchante modifiée par rapport à la séquence sauvage.
Ils servent d’amorce lors du premier cycle d’une nouvelle PCR ce qui permet finalement
l’amplification de la séquence complète portant la mutation.
3’
5’Fα α
B-Mut
A-Mut
5’ 3’AOX1 3’
PCR1
5’Fα + A-Mut
AA-Mut
5’Fα
AA-Mut
PCR2
AA-Mut + BB-Mut
5’Fα + 3’AOX1
BB-Mut
Figure 20. Principe de la mutagenèse dirigée par PCR selon la méthode de Ho et al.
Deux premières PCR indépendantes schématisées dans le cadre rouge permettent une
amplification de part et d’autre d’une mutation à générer. Les amorces centrales A-Mut et B-
Mut portent la mutation symbolisée par un carré bleu. Après purification des fragments
obtenus (AA-Mut et BB-Mut), une deuxième PCR décrite dans le cadre bleu regroupant les
produits de la première PCR qui se recouvrent au niveau de la modification de séquence
assurent la formation de la séquence complète portant la mutation. Les amorces des
extrémités (5’Fα et 3’AOX1) permettent d’obtenir la séquence complète de hOBP-2A
contenant la mutation désirée.
5’
PCR1
3’AOX1 + B-Mut
BB-Mut
3’AOX1
60

1.4.1.2. Protocole
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
La première PCR de mutagenèse a été effectuée dans des volumes de 50 µL avec 50
ng de plasmide pGAP-hOBP-2A comme matrice, 20 pmol de chaque amorce (synthétisée par
MWG Biotech), 5 mM de chaque désoxynucléotide (dNTP) (Eurogentec), 0,75 unité de Pfu
polymérase (Promega), 10% (v/v) de tampon Pfu polymérase 10X. Les oligonucléotides sont
décrits dans le tableau 1. Le programme de PCR était composé de 30 cycles comprenant 30
secondes à 94°C, 30 secondes à 55°C et 90 secondes à 72°C.
5'Fα 5’CTATTGCCAGCATTGCTGC3’
3'AOX1 5’GCAAATGGCATTCTGACATCC3’
A-K62A 5’CAGGATCTTAGCCTGAATACAACG3’
B-K62A 5’CGTTGTATTCAGGCT AAG ATC CTG3’
A-K82A 5’GTAAATCAGAGCTCTTCCACCGTA3’
B-K82A 5’TACGGTGGAAGAGCTCTGATTTAC3’
A-K112A 5'ACGTCCAACCAGAGCACCCATGTA3’
B-K112A 5’TACATGGGTGCTCTGGTTGGACGT3’
5'BamHI 5’GCTACCAGGGGGATCCGAAAACCTGTATTTTCAGGGC
GSThOBP-2A CTGTCCTTCACTCTGGAGGAAGAG3’
hOBP2A-V34KFor 5’CAGAGGATCGTAGACCTAGAAAGAAGTCCCCTGTTAAGGTCAC3’
hOBP2A-V34KRev 5’GTGACCTTAACAGGGGACTTCTTTCTAGGTCTACGATCCTCTG3’
hOBP2A-A49KFor 5’CTGGGTGGAGGTAACCTGGAAAAGACTTTCACCTTCATGCG3’
hOBP2A-A49KRev 5’CGCATGAAGGTGAAAGTCTTTTCCAGGTTACCTCCACCCAG3’
hOBP2A-F51AFor 5’GGTAACCTGGAAGCCACTGCCACCTTCATGCGTGAAGA3’
hOBP2A-F51ARev 5’TCTTCACGCATGAAGGTGGCAGTGGCTTCCAGGTTACC3’
hOBP2A-Y78AFor 5’CCTGGAAAGTTCTCTGCCGCCGGTGGAAGAAAGCTGAT3’
hOBP2A-Y78ARev 5’ATCAGCTTTCTTCCACCGGCGGCAGAGAACTTTCCAGG3’
hOBP2A-V114KFor 5’CTGCGTTACATGGGTAAGCTGAAGGGACGTAACCCAAACACCAAC3’
hOBP2A-V114KRev 5’GTTGGTGTTTGGGTTACGTCCCTTCAGCTTACCCATGTAACGCAG3’
hOBP-2A-HT-Nter 5’GTATCTCTCGAGAAAAGACATCATCATCATCATCATCAGCTGTCCT
TCACTCTGGAG3’
hOBP-2A-HT-Cter 5’CGCGGATCCCTTAAGAATATGATGATGATGATGATGGTGCTCCAAGA
CACAAGA3’
Tableau 1. Amorces utilisées lors des mutagenèses par PCR
Séquence nucléotidique des différentes amorces utilisées. Les amorces porteuses des
mutations possèdent des nucléotides modifiés (indiqués en gras) par rapport à la séquence
sauvage de hOBP-2A.
61

5’
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
La taille des fragments obtenus a été vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose. Les
fragments de PCR ont été purifiés après excision des bandes sous ultraviolet en suivant les
instructions du fournisseur du kit "QIAquick gel extract" de Qiagen. La deuxième PCR a été
effectuée dans des volumes de 50 µL avec 1,25 unité de Taq polymérase (Promega), 20
pmoles des amorces 5’Fα et 3’AOX1, 25 mM de MgCl2, 5 mM de chacun des dNTPs, 10%
(v/v) de tampon Taq polymérase 10X ainsi que 40 ng des deux fragments issus de la première
PCR. Le programme de PCR était le même que celui utilisé lors de la première PCR.
1.4.1.3. Construction des vecteurs d’expression en levure
Les fragments issus de la deuxième PCR ainsi que le plasmide pGAPZα ont été
digérés par les enzymes XhoI (Eurogentec) et EcoRI (Eurogentec) à 10 unités/µg d’ADN à
37°C pendant 2 heures. Après purification du plasmide pGAPZα linéarisé et des fragments de
PCR digérés, la ligase du phage T4 (Eurogentec) a été utilisée pour intégrer les séquences
codantes des différentes OBP au niveau du site de restriction XhoI en 5’ et EcoRI en 3’. Elles
ont été insérées en phase avec le peptide de sécrétion ou prépropeptide du facteur α de S.
cerevisiae (Figure 21).
Promoteur
constitutif pGAP
Figure 21. Représentation schématique des constructions réalisées dans
pGAPZα
Les séquences amplifiées après mutagenèse ont été intégrées au niveau des sites de
restriction EcoRI et XhoI. Ainsi, l’expression a été réalisée en utilisant le vecteur pGAPZα,
en phase avec le prépropeptide du facteur α (noté Fα) qui assure la sécrétion de la protéine
dans le milieu de culture.
Les ligations ont été effectuées à 16°C pendant 1 à 4 heures en présence d’une unité de
ligase pour 20 µL de mélange de ligation. Les plasmides créés portent chacun une mutation
des lysines en position 62, 82 et 112 dans la séquence codante de hOBP-2A. Ils ont été
nommés respectivement pGAPZα-hOBP-2A-K62A, pGAPZα-hOBP-2A-K82A et pGAPZα-
hOBP-2A-K112A.
Fα
XhoI
5’Fα
hOBP-2A sauvage ou mutée
TAA
EcoRI
3’AOX1 TT
3’AOX1
62
3’

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
1.4.2. Mutagenèse dirigée adaptée du Kit « Site directed mutagenesis »
1.4.2.1. Principe
La méthode utilisée ici est adaptée du Kit « QuikChange Site directed mutagenesis »
de Stratagène. Dans une première étape, à partir d’un plasmide parental et de deux amorces
complémentaires portant la mutation, on amplifie un plasmide portant la mutation. Une
digestion par l’enzyme de restriction DpnI permet ensuite l’élimination du brin parental,
méthylé au profit du plasmide portant la mutation. Le plasmide muté peut ensuite être
amplifié après transformation dans des cellules compétentes.
1.4.2.2. Construction du vecteur d’expression de hOBP-2A en bactérie
Une PCR a été réalisée dans 50 µL en utilisant 50 ng du plasmide pGAPZα-hOBP-2A
comme matrice, 10 pmol des amorces 3’AOX1 et 5’BamHIGSThOBP-2A, 10 mM de chaque
dNTP, 0,75 unités de Pfu polymérase (Promega) 10% (v/v) de tampon Taq polymérase 10X.
Le programme de PCR était composé de 30 cycles comprenant 10 secondes à 98°C, 30
secondes à 50°C et 30 secondes à 72°C. Cette PCR permet d’ajouter en 5’ de la séquence de
hOBP-2A le site de restriction de l’enzyme de restriction BamHI ainsi que le site de clivage à
la protéase TEV. Les fragments issus de cette PCR ainsi que le plasmide pGEX-2T
(Amersham Biosciences) ont été digérés par les enzymes BamHI et EcoRI (Eurogentec) à 10
unités/µg d’ADN à 37°C pendant 2 heures. Après purification du plasmide pGEX-2T
linéarisé et des fragments de PCR digérés, la ligase du phage T4 (Eurogentec) a été utilisée
pour intégrer les séquences codantes des différentes OBP au niveau du site de restriction
BamHI en 5’ et EcoRI en 3’. Elles ont été insérées en phase avec la séquence de la GST
(Figure 22). Les ligations ont été effectuées à 20°C pendant 2 heures en présence d’une unité
de ligase pour 20 µL de mélange de ligation. Le plasmide obtenu a été nommé pGEX-2ThOBP-2A.
63

5’
Promoteur
Inductible à l’IPTG
GST
BamHI
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
Figure 22. Représentation schématique des constructions réalisées dans pGEX-2T
Après une PCR ayant permis d’intégrer le site de restriction BamHI et la séquence codant le
site de reconnaissance de la protéase TEV en 5’ de la séquence sauvage de hOBP-2A, le
fragment a été inséré au niveau des sites de restriction BamHI et EcoRI, en phase avec la
séquence codante de la GST.
1.4.2.3. Protocole de mutagenèse
Une PCR a été réalisée dans des volumes de 50 µL avec 50 ng de plasmide pGEX-2T-
hOBP-2A comme matrice, 50 pmoles de deux amorces en fonction du mutant à générer
(hOBP2A-V34KFor et hOBP2A-V34KRev, hOBP2A-A49KFor et hOBP2A-A49KRev,
hOBP2A-F51AFor et hOBP2A-F51ARev, hOBP2A-Y78AFor et hOBP2A-Y78ARev ainsi
que hOBP2A-V114KFor et hOBP2A-V114KRev) (synthétisées par MWG Biotech). Les
oligonucléotides sont décrits dans le tableau 1. On a ajouté 10 mM de chaque
désoxynucléotide (dNTP) (Eurogentec), 3 unités de Pfu polymérase (Promega), 10% (v/v) de
tampon Pfu polymérase 10X. Le programme de PCR était composé de 15 cycles comprenant
30 secondes à 95°C, 30 secondes à 58°C et 12 minutes à 72°C. La présence de plasmide
amplifié a été vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose. Le produit de PCR a été digéré
par 40 unités de DpnI (NEB - Ozyme) pendant 2 heures à 37°C. Après digestion, des bactéries
DH5α chimiocompétentes ont été transformés par 5 µL de la réaction. L’amplification et la
purification des plasmides à partir de clones résistants à l’ampicilline ont été effectuées
comme décrit précédemment. Les plasmides générés ont été nommés pGEX-2T-hOBP-2A-
V34K, pGEX-2T-hOBP-2A-A49K, pGEX-2T-hOBP-2A-F51A, pGEX-2T-hOBP-2A-Y78A
et pGEX-2T-hOBP-2A-V114K.
1.5. Transformations de bactéries
Site de clivage à
la protéase TEV
5’BamHIGSThOBP-2A
hOBP-2A sauvage ou mutée
TAA
EcoRI
3’AOX1
64
3’

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
Les souches congelées des bactéries ont été étallées sur boîte SOB-Mg (bacto-tryptone
20 g/L, extrait de levure 5 g/L, NaCl 0,58 g/L, KCl 0,19 g/L). Une culture de 5 mL de LB
liquide a été ensemencée par une colonie isolée à placée la nuit à 37°C avec une agitation à
200 rpm. Une culture de 100 mL a été ensemencé par les 5 mL de préculture et incubée à
37°C à 150 rpm j’usqu’a obtenir une DO à 650 nm de 0,6. La culture est ensuite arrétée en la
laissant 15 min sur glace. La culture a été centrifugée 10 min à 4°C à 700 x g. Le culot
cellulaire a été repris dans 33 mL de tampon RF1 (acétate de potassium 30 mM, chlorure de
potassium 100 mM, chlorure de calcium 10 mM, chlorure de manganèse 50 mM, glycérol
15% (v/v)) et laissé 30 min sur glace. Les cellules ont été centrifugées 10 min à 4°C à 700 x g.
Le culot a été repris dans 8 mL de tampon RF2 (MOPS 10 mM pH 7, chlorure de potassium
10 mM, chlorure de calcium 75 mM, glycérol 15% (v/v)). Après 15 min sur glace, la
suspension cellulaire a été aliquotée, plongée dans l’azote liquide quelques minutes puis
placée à -80°C.
Des bactéries chimiocompétentes (100 µL) de la souche DH5α ont été mélangées à 10
ng à 20 ng de plasmide issu de la réaction de ligation. Après 20 minutes sur glace, les
bactéries ont été soumises à un choc thermique à 42°C pendant 90 secondes puis replacées 5
minutes sur glace. Elles ont ensuite été réchauffées à température ambiante 10 minutes avant
d’être additionnées de 900 µL de SOC (bacto-tryptone 20 g/L, extrait de levure 5 g/L, NaCl
0,58 g/L, KCl 0,19 g/L, MgCl2 et MgSO4 0,02 M et glucose 0,02 M). Après 1 heure
d’incubation à 37°C avec agitation à 200 rpm, 200 µL de bactéries ont été ensemencées sur
boîte de Petri, sur un milieu solide LB-LS (bacto-tryptone 10 g/L, extrait de levure 5 g/L,
NaCl 5 g/L pH 7,5, agar 15 g/L) supplémenté en Zéocine TM (Invitrogen) ou en ampicilline
(Eurobio) suivant le vecteur à des concentrations de 25 et 100 µg/mL respectivement. Les
boîtes de Petri ont été incubées à 37°C pendant la nuit.
1.6. Sélection des clones
1.6.1. Test de la présence de l’insert
Les clones de bactéries ont été testés pour la présence de l’insert par PCR à partir
d’une fraction de colonie bactérienne. Le volume des réactions de PCR était de 20 µL dans les
mêmes conditions que la deuxième PCR de mutagenèse (§1.4.1.2. Page 45). Les amorces
étaient les oligonucléotides 5’Fα et l’oligonucléotide central correspondant au mutant testé
(A-K62AhOBP, A-K82AhOBP, A-K112AhOBP, hOBP2A-V34KRev, hOBP2A-A49KRev,
65

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
hOBP2A-F51ARev, hOBP2A-Y78ARev ou hOBP2A-V114KRev et hOBP2A-V114KRev)
(Tableau 1). Le programme de PCR était identique à la première PCR de la mutagenèse. La
présence de fragments amplifiés a été vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1%.
1.6.2. Séquençage
1.6.2.1. Principe du séquençage
Le séquençage de l’ADN a été effectué au laboratoire selon la méthode "dideoxy chain
terminator" mise au point par Sanger (Sanger et al., 1977). Elle nécessite une PCR en
présence de didéoxynucléotides triphosphates (ddNTP) dépourvus de groupements
hydroxyles en 3’, et qui stoppent l’élongation de la molécule d’ADN par les ADN
polymérases. Les ddNTP utilisés sont marqués chacun avec un fluorophore spécifique. Ainsi,
après dénaturation, lorsque les fragments sont séparés par électrophorèse capillaire, une
analyse automatique par un système laser permet d’identifier le fluorophore terminateur des
fragments dont la taille varie en fonction de la position d’intégration du ddNTP. Ceci permet
d’obtenir la séquence de la portion d’ADN amplifiée.
1.6.2.2. Protocole
Les plasmides d’une colonie positive pour l’insert de hOBP-2A ont été amplifiés
comme décrit précédemment. Ils ont été purifiés en suivant les instructions du fournisseur du
kit "Plasmid minipurification" commercialisé par Qiagen. Une mesure photométrique à 260
nm a permis de quantifier l’ADN plasmidique purifié. Pour 20 µL final, on a utilisé 4 µL de
mélange réactionnel contenant une ADN polymérase et un mélange de dNTP et de ddNTP,
ces derniers étant couplés chacun à un chromophore différent. Une quantité de 1 µg de
plasmide a été utilisée comme matrice et 10 pmol de l’amorce 5’Fα pour les plasmides
pGAPZα et ses dérivés ou 5’pGEX-2T pour les plasmides pGEX-2T. Le programme PCR a
consisté en 25 cycles à 96°C pendant 10 secondes, 50°C pendant 5 secondes et 60°C pendant
4 minutes. Les produits d’extension ont été purifiés par précipitation à l’éthanol. Les
séquences ont été réalisées à l’aide d’un appareil de modèle ABI Prism 310 (PE-Biosystems).
2. Expression des protéines recombinantes
66

2.1. Expression en levure Pichia pastoris
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
2.1.1. Transformation de Pichia pastoris
Environ 5 µg des plasmides d’expression pGAPZα-hOBP-2A-K62A, pGAPZα-
hOBP-2A-K82A, pGAPZα-hOBP-2A-K112A, ont été linéarisés par 10 unités d’enzyme de
restriction BspHI pour 1 µg d’ADN, à 37°C pendant 2 heures. La levure P. pastoris (souche
X33 sauvage) a été transformée par électroporation en suivant les indications du manuel
d’expression de Pichia (version C, Invitrogen) avec un électroporateur GenPulser (Biorad)
réglé à 1500V, 25 µF et 200Ω. Les clones obtenus ont été sélectionnés sur boîtes YPDS
(extrait de levure 10 g/L, peptone 20 g/L, dextrose 2% (v/v), sorbitol 1 M, agar 20 g/L)
supplémentées en Zéocine TM à une concentration de 50 µg/mL.
2.1.2. Sélection des clones producteurs d’OBP
Des précultures de 10 mL de milieu BMGY (10 g/L extrait de levure, 20 g/L de
peptone, tampon phosphate de potassium 0,1 M à pH 6, YNB 1,34% (m/v), 0,4 mg/L biotine
et glycérol 1% (v/v)) ont été ensemencées dans des fioles d’Erlenmeyer de 50 mL par une
colonie d’un clone transformé et mis à incuber à 29°C et 250 rpm. Après 24 heures, les
cultures ont été centrifugées à 700 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Les culots
ont été resuspendus avec 10 mL de milieu BMD (α-lactalbumine 20 g/L, phosphate de
potassium 0,1 M à pH 8, YNB 1,34% (m/v), dextrose 20 g/L, biotine 0,4 mg/L, EDTA 5 mM)
puis replacés à 29°C et 250 rpm. Après 48 heures de production de la protéine d’intérêt, 1 mL
de chaque miniculture a été prélevé et centrifugé 5 minutes à 9000 x g. Une fraction de 50 µL
de surnageant a été séchée sous vide et analysée par électrophorèse dénaturante en présence
de SDS.
2.1.3. Electrophorèse dénaturante sur gel de polyacrylamide
Les échantillons séchés ont été resuspendus avec 15 µL de tampon de dépôt (Tris-HCl
0,3 M à pH 6,8, SDS 3,5% (m/v), glycérol 12% (v/v), dithioérythritol 0,2 M, bleu de
bromophénol 0,04% (m/v)) et soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 12%
en présence de SDS (SDS-PAGE 12%). Le gel de séparation était composé d’acrylamide
12,5% (v/v), bis-acrylamide 0,33% (v/v), Tris-HCl 0,375 M à pH 9, SDS 0,1% (v/v),
TEMED 0,05% (v/v) et persulfate d’ammonium 0,07% (m/v). Le gel de concentration était
composé d’acrylamide 4,2% (v/v), bis-acrylamide 0,11% (v/v), Tris-HCl 0,125 M à pH 6,8,
67

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
SDS 0,1% (v/v), TEMED 0,1% (v/v) et persulfate d’ammonium 0,05% (m/v). La migration a
été effectuée à l’aide du tampon d’électrode (Tris 0,05 M, glycine 0,384 M, SDS 0,1% (m/v)).
Le marqueur de masses moléculaires utilisé était un mélange de marqueurs « low range » et
« polypeptide » (Biorad). La migration a duré 15 minutes à 10 mA avec une tension maximale
réglée à 200 V puis 1 heure à 20 mA avec la même tension maximale. Les gels ont été fixés
45 minutes dans une solution d’éthanol 50% (v/v) acide acétique 10% (v/v), puis colorés dans
du Serva blue G250 à 0,025% (m/v) dans de l’acide acétique 10% (v/v) pendant 1 heure 30
minutes. Les gels ont ensuite été décolorés à l’acide acétique 10% (v/v).
2.1.4. Production d’OBP recombinantes
Une préculture de 10 mL de milieu BMGY tryptone (10 g/L extrait de levure, 20 g/L
de tryptone, phosphate de potassium 0,1 M à pH 6, YNB 1,34% (m/v), 0,4 mg/L biotine,
glycérol 1% (v/v)) a été ensemencée par le clone le plus producteur pour chacune des
protéines. Ces précultures, incubées 24 heures à 29°C et agitées à 250 rpm, ont servi à
inoculer 1 L du même milieu à raison de 1 mL de préculture pour 250 mL de milieu BMGY
tryptone additionné d’antimousse (Antifoam 289, Sigma) dans des erlenmeyers à baffles.
Après 24 heures dans les mêmes conditions, les cultures ont été centrifugées à 700 x g et le
culot resuspendu dans 1 L de milieu BMMt (phosphate de potassium 0,1 M à pH 8, YNB
1,34% (m/v), méthanol 0,5% (v/v), biotine 0,4 mg/L, EDTA 5 mM et tryptone 20 g/L). La
culture a été replacée dans l’incubateur en présence d’antimousse pendant trois jours avec un
ajout de 1,25 mL de MeOH deux fois par jour afin de maintenir une concentration de 0,5%
(v/v).
2.1.5. Purification des OBP recombinantes
Les cultures ont été centrifugées à 6000 x g pendant 30 minutes à 4°C puis le
surnageant a été clarifié par filtration (0,45 µm). Le surnageant de culture a été dialysé contre
de l’eau distillée pendant 2 jours à 4°C dans des tubes de dialyse au seuil de coupure entre 12
et 14 kDa (Spectrapor, VWR). La dialyse a été poursuivie les trois jours suivants contre de
l’acide acétique 0,01% (v/v). Ces conditions permettent la précipitation sélective de l’OBP.
Afin d’obtenir une précipitation du mutant hOBP-2A-K112A produit en plus faible
concentration que les autres protéines recombinantes, le surnageant de culture de ce mutant,
après filtration, a été concentré à 4°C sous azote en cellule de concentration (AMICON) en
68

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
utilisant une membrane au seuil de coupure à 3 kDa, puis dialysé comme les autres. Les
précipités obtenus contenant l’OBP ont été resuspendus dans du tampon phosphate de
potassium 50 mM de pH 7,5 et déposés sur une colonne de chromatographie à échange
d’anion QAE Vydac (300 VHP, 7,5 X 50 mm, Interchim) équilibrée avec du tampon
phosphate de potassium 50 mM de pH 7,5. Le débit était de 1 mL/min et l’absorbance était
mesurée à 278 nm. La fraction non retenue contenant les OBP recombinantes a été fractionnée
en tubes de 0,5 mL et conservés à -20°C.
2.2. Expression en bactérie
2.2.1. Expression des protéines de fusion GST-OBP
Des bactéries E. coli chimiocompétentes (100 µL) de souche Bl21 préparées comme
décrit précédemment pour la souche DH5α ont été transformées avec 0,2 ng des différents
plasmides. Des précultures ont été réalisées à 37°C avec une agitation à 200 rpm pendant la
nuit dans 25 mL de milieu LB additionné d’ampicilline à 100 µg/mL. Des cultures de 1L de
milieu 2xYT (Tryptone 16 g/L, extrait de levure 10g/L, NaCl 5 g/L à pH 7,0) ont été
ensemencées par 10 mL de ces précultures et placées à 37°C avec une agitation de 200 rpm.
Quand la DO atteint 0,5-0,6, on refroidit la culture à 22°C. Lorsque la DO atteint 0,6-0,8, on
réalise l’induction de la production avec 0,5 mM d’IPTG pendant une nuit à 22°C sous
agitation 200 rpm.
2.2.2. Purification des protéines de fusion
Les cultures ont été centrifugées à 4°C pendant 10 minutes à 1500 x g. Les culots
bactériens ont été resuspendus dans 40 mL de tampon d’extraction (ExB) (NaCl 140 mM,
Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1.8 mM, pH 7.5) et soniqués 2 minutes sur glace avec des
impulsions de 2 secondes toutes les 2 secondes. Le lysat obtenu a été centrifugé à 4°C
pendant 30 minutes à 47000 x g et le surnageant contenant les protéines solubles à été passé
sur un filtre 0,22 µm. Cette fraction à été incubée avec 4 mL de résine Glutathione-Uniflow
(Clontech) équilibrée par du tampon ExB pendant 1 h à 4°C avec une agitation douce. La
résine a ensuite été laissée à décanter. Après l’élimination de la fraction non retenue, la résine
a été lavée par 80 mL de tampon ExB, 20 mL d’eau, 20 mL de Triton X-100 1% (v/v), 20 mL
d’eau, 20 mL de MeOH 5% et 20 mL de tampon ExB. Finalement les fusions GST ont été
éluées par 20 mL de glutathion réduit (10 mM dans du tampon ExB).
69

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
2.2.3. Obtention de protéase TEV
Le plasmide pTH24:TEVsh permettant l’expression de la TEV a été fourni par
Berglund (Institut Karolinska, Suède). Le protocole de production et de purification est décrit
par Van den Berg et al. (2006). Il correspond à celui utilisé pour la production des fusions
GST-hOBP-2A avec quelques modifications. La production a été effectuée en bactéries E.
coli de souche Bl21(pLysS). Les phases de croissance et de production se font dans un milieu
2xYT additionné de 100 µg/mL d’ampicilline et 34 µg/mL de chloramphénicol. La
production se fait une nuit à 20°C. Les cellules ont été resuspendues dans un tampon LysB
(Na2HPO4 50 mM, NaCl 300 mM et β-mercaptoéhanol 2 mM) avant d’être lysées comme
dans le cas de la fusion GST-hOBP-2A. Le lysat obtenu a été centrifugé à 4°C pendant 30
minutes à 47000 x g et le surnageant contenant les protéines solubles à été passé sur un filtre
0,22 µm. Cette fraction soluble a été incubée avec 2 mL de résine TALON TM IMAC
(Clontech) contenant du cobalt immobilisé, équilibrée dans un tampon LysB, pendant 1 h à
4°C avec une agitations douce. La résine a ensuite été laissée à décanter. Après avoir éliminé
la fraction non retenue, la résine a été lavée par 10 mL de LysB, 40 mL de tampon de lavage
(Na2HPO4 50 mM, NaCl 300mM, imidazole 20 mM). Finalement la protéase TEV a été éluée
par 10 mL de tampon d’élution (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300mM, imidazole 250 mM).
L’échantillon a été dialysé la nuit à 4°C contre un tampon contenant : NaH2PO4 25 mM, NaCl
200 mM, EDTA 2 mM à pH 8,0, 2 mM DTT et 10% glycérol. La résine IMAC a été
régénérée par passage de 20 mL de tampon MES (20 mM pH 5), 10 mL d’eau, 20 mL
d’EDTA (0,2 M), 20 mL d’eau, 20 mL de CoCl2 (50 mM), 20 mL d’eau, 10 mL NaCl (0,3 M)
et 10 mL d’eau. La colonne a été stockée dans l’éthanol à 20%. Après estimation de la
concentration par spectroscopie d’absorption, la concentration finale de glycérol a été ajustée
à 50% (v/v). La protéase purifiée a été fractionnée et stockée à -80°C.
2.2.4. Purification des OBP
Après avoir purifié les protéines de fusion par chromatographie d’affinité, elles ont été
digérées par la protéase TEV en présence de dithiothréitol (DTT) (1mM) et d’EDTA (0,5
mM), ce qui permet la séparation de la GST et de l’OBP, laissant une glycine additionnelle en
N-terminal de l’OBP. On a utilisé environ 5% (m/m) de protéase TEV par rapport à la fusion.
70

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
Après digestion pendant une nuit à 20°C, les échantillons ont été dialysés trois jours contre 1
L de tampon ExB afin d’éliminer le glutathion réduit, l’EDTA et le DTT incompatibles avec
les colonnes Imac. Les dialyses ont été réalisées à 4°C et le tampon a été changé deux fois par
jour.
La résine Glutathione-Uniflow a été régénérée par deux passages successifs de 20 mL
de tampon TrisHCl 0,1 M, NaCl 0,5 M pH 8,8 puis acétate de sodium 0,1 M, NaCl 0,5 M pH
4,8. Elle a été équilibrée par du tampon ExB et incubée en présence des échantillons
contenant l’OBP humaine (notée hOBP-2ABac) (ou un des mutants V34K, A49K, V114K,
F51A ou Y78A), la GST clivée et la protéase TEV. Après une heure d’incubation à 4°C sous
une agitation modérée et décantation de la résine, la fraction non retenue contenant l’OBP et
la TEV a été collectée. Cette fraction a été incubée pendant 1 h à 4°C sous agitation douce en
présence de résine TALON TM IMAC (Clontech) équilibrée dans un tampon ExB. Après
décantation, la fraction non retenue contenant uniquement l’OBP a été collectée. La
concentration en protéine a été déterminée par spectroscopie d’absorption. Les échantillons
ont ensuite été fractionnés et congelés à -20°C.
3. Caractérisation des OBP recombinantes
3.1. Estimation des concentrations protéiques
Les concentrations en protéines en solution ont été déterminées par spectroscopie UV
en utilisant les coefficients d’extinction molaire moyens de 14245, 36130 et 58790 M -1 .cm -1 à
276 nm pour les OBP (Briand et al., 2002), la TEV et les protéines de fusion respectivement.
3.2. Séquençage N-terminal
3.2.1. Principe du séquençage d’Edman
La séquence des résidus N-terminaux des différentes protéines recombinantes a été
vérifiée par dégradation récurrente selon la méthode d’Edman. Celle-ci repose sur la réaction
de l’isothiocyanate de phényle (PITC) en milieu basique avec la fonction amine libre du
résidu N-terminal de la chaîne polypeptidique. Le passage en milieu acide fragilise la liaison
peptidique entre le dernier acide aminé et l’avant dernier. Cette liaison est hydrolysée par de
l’acide trifluoro acétique (TFA), libérant le groupement NH2 du second acide aminé et un
71

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
acide aminé lié au PITC. Ce composé, libéré de la chaîne polypeptidique fixée par interaction
avec un support de difluorure de polyvinylidène (PVDF), est transformé en un thiohydantoïne
de phényle acide aminé qui est identifié et quantifié par chromatographie liquide haute
performance. Ces étapes sont répétées de façon cyclique pour obtenir la séquence N-terminale
de la protéine.
3.2.2. Protocole
Après électrophorèse SDS-PAGE 12%, les bandes électrophorétiques correspondant
aux différentes OBP ont été excisées. Les fragments de gel séchés sous vide ont été recouverts
par un tampon Tris 0,2 M pH 8,4 SDS 2% pendant 30 minutes à température ambiante. Les
échantillons ont été agités 24 heures à température ambiante en présence d’une membrane de
PVDF (Problott, PE-Biosystems) humidifiée au méthanol et de l’équivalent en eau de 5
volumes de gel. Cette incubation permet le transfert passif des protéines du gel vers la
membrane de PVDF. Les membranes ont ensuite été rincées cinq fois avec une solution de
MeOH 10% dans de l’eau puis le séquençage a été réalisé avec un séquenceur de type 494
Protein Sequencer (Applied-Biosystems) avec les protocoles et réactifs du fabriquant.
3.3. Spectrométrie de masse
3.3.1. Principe de la spectrométrie de masse MALDI-TOF
Lors de l’ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI – pour « Matrix
Assisted Laser Desorption Ionisation »), une irradiation laser permet l’expansion en phase
gazeuse du mélange matrice-protéines co-cristallisé sur une plaque métallique. La matrice, un
acide organique, absorbe l’énergie du laser et la transmet à l’échantillon protéique qui forme
des ions mono- ou multichargés par transfert de protons. Ces ions, principalement
monochargés, sont accélérés dans le vide par une impulsion de haute tension puis volent dans
le vide en absence de champ électrique jusqu’à un détecteur ; la mesure du temps de vol (TOF
pour time of flight) permet de déterminer le rapport masse sur charge des échantillons
atteignant le détecteur.
72

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
3.3.2. Mesure de masse totale des protéines
La mesure de la masse totale des protéines recombinantes a été effectuée afin de
s’assurer de la correspondance avec la masse attendue et notamment détecter la présence
éventuelle de clivages. Un volume de 0,5 mL de chaque protéine purifiée a été dialysé une
nuit à 4°C contre de l’eau distillée. Les échantillons ont été séchés sous vide puis resuspendus
dans de l’eau à une concentration de 10 pmol/µL.
Pour chaque protéine, une fraction de 1 µL a été déposée sur une plaque d’analyse.
Après séchage, ces dépôts ont été recouverts avec 1 µL de matrice à l’acide sinapinique (acide
3,5 diméthoxy-4-hydroxycinnamique) à une concentration de 10 mg/mL dans 50% (v/v) de
TFA à 0,3% (v/v) et 50% (v/v) d’acétronitrile (ACN). Après séchage à l’air, les dépôts ont été
ionisés par un faisceau laser à 337 nm. La tension d’accélération appliquée était de 25 kV et
les spectres ont été enregistrés en mode linéaire. Un échantillon contenant du cytochrome c et
de la trypsine (Sigma) de masses respectives 12361,96 Da et 23464,5 Da a servi à la
calibration externe des mesures.
3.3.3. Détermination des cartes peptidiques
Afin de caractériser finement les protéines mutées, nous avons réalisé les cartes
peptidiques des différentes protéines après digestion trypsique, qui permet un clivage des
liaisons peptidiques en C-terminal des lysines et des arginines, ou un clivage chimique au
bromure de cyanogène (BrCN) qui clive les liaisons peptidiques en C-terminal des
méthionines. Pour les différents mutants, les peptides issus des clivages doivent comporter
des variations de masses prédictibles, ce qui permet de vérifier la mutation.
3.3.3.1. Réduction-alkylation
Une étape de réduction alkylation permet de réduire les ponts disulfures et de bloquer
les cystéines qui pourraient en reformer. Les bandes protéiques colorées au bleu de
Coomassie ont été excisées. Les protéines dans le gel d’électrophorèse ont été réduites par
ajout de 60 µL de dithothréitol 20 mM dans un tampon Tris 0,067 M, chlorure de guanidine 6
M à pH 8,4 et incubées 2 heures à 45°C. Elles ont ensuite été alkylées en remplaçant la
solution par 70 µL d’acrylamide 50 mM dans un tampon Tris 0,067 M, chlorure de guanidine
6 M pH 8,4, et en laissant incuber 1 heure à température ambiante et à l’obscurité.
73

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
L’alkylation a été arrêtée par ajout de 2 % (v/v) de β-mercaptoéthanol pur. Les gels ont
ensuite été lavés trois fois 10 minutes dans 400 µL d’eau avec agitation.
3.3.3.2. Digestion par trypsinolyse
Après réduction alkylation, les fragments de gels électrophorétiques ont été lavés 3
fois 10 minutes dans 200 µL de mélange CH3CN 50% (v/v), 50% (v/v) d’hydrogéno-
carbonate d’ammonium 50 mM, puis séchés 30 minutes sous vide. Les gels ont ensuite été
incubés toute la nuit à 37°C avec 40 µL de NH4HCO3 50 mM additionné de 0,5 µg de
trypsine modifiée (Promega) par réaction. Les réactions ont été arrêtées par ajout de 1 µL de
TFA 5% (v/v).
3.3.3.3. Clivage chimique au bromure de cyanogène (BrCN)
Après réduction-alkylation, les fragments de gels ont été lavés 3 fois 10 minutes dans
200 µL de mélange 50% (v/v) de CH3CN, 50% (v/v) de TFA 70% (v/v), puis séchés 30
minutes sous vide. Ils ont ensuite été incubés 24 heures à température ambiante et à
l’obscurité en présence de 60 µL de BrCN à 20 mg/mL. Les surnageants additionnés de 120
µL d’eau et des deux surnageants de deux lavages avec 40 µL de CH3CN 50% (v/v) de 30
minutes à l’obscurité ont été séchés sous vide. Les échantillons ont été incubés 1 heure en
présence de 10 µL de TFA pur puis séchés sous vide. Finalement, ils ont été repris dans 40 µL
de CH3CN 20% (v/v).
3.3.3.4. Analyse MALDI-TOF des peptides
Une fraction de 1 µL des solutions issues de la digestion trypsique ou du clivage
chimique au BrCN a été déposé sur la plaque MALDI et séché à l’air. Un volume de 1 µL de
matrice, l’acide α cyano 4-hydroxy cinnamique (Aldrich) en solution à une concentration de 5
mg/mL dans 30% de CH3CN avec 0,1% (v/v) de TFA, a été ajouté sur les dépôts. Après
séchage à l’air, les peptides ont été ionisés par un faisceau laser à 337 nm. La tension
d’accélération utilisée était de 20 kV. Les spectres enregistrés en mode reflectron ont été
calibrés en externe pour les clivages au BrCN sur une solution de bradykinine (757,40 Da),
d’angiotensine II humaine (1046,54 Da), d’un fragment 18-39 d’ACTH humaine (2465,20 Da)
74

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
et l’insuline bovine (3494,65 Da). Pour les digestions à la trypsine, les spectres ont été
calibrés en interne sur deux peptides issus de l’autolyse de la trypsine dont le rapport m/z est
connu (2211,10 et 842,51 Da).
3.4. Spectre de fluorescence du tryptophane
Afin d’évaluer l’impact des différentes mutations sur la structure de hOBP-2A, on a
effectué des mesure d’émission de fluorescence de l’unique tryptophane de cette protéine
(Trp-14) avec un spectrofluorimètre SFM 25 Kontron ayant une bande passante de 5 nm pour
l’excitation et l’émission. Après purification, 1 mL de solution protéique à 2 µM a été placé
dans une cuve en quartz de 1 cm. On a enregistré à 25°C les spectres d’émission de
fluorescence des solutions protéiques entre 310 et 400 nm pour une excitation à 285 nm. Afin
de comparer les différentes OBP, chaque spectre a été normalisé pour une émission de
fluorescence de 100% à 330 nm.
3.5. Dichroïsme circulaire
Les solutions d’OBP sauvages et mutées, à des concentration d’environ 10 µM, ont été
placées dans des cuves de trajet optique de 0,05 cm. La mesure a été effectuée sous azote à 3
bars et à un débit de 8 L/min à l’aide d’un spectropolarimètre JASCO J-810. Une ligne de
base a été enregistrée avec un tampon phosphate 50 mM pH 7,5 entre 180 et 260 nm et
soustraite aux spectres obtenus avec les différentes protéines. L’abondance relative des
structures secondaires a été mesurée en utilisant l’algorithme de Deléage et Geourjon
(Deleage et Geourjon, 1993).
75

4. Mesure d’affinité par compétition de sondes fluorescentes
Excitation à
337 nm
4.1. Principe
Excitation à
337 nm
NPN
Excitation à
337 nm
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
Emission à
400 nm
Figure 23. Principe de la mesure de l’affinité par déplacement de sonde
La sonde fluorescente, ici la N-phényl-1-naphthylamine (NPN), émet de la fluorescence à
400 nm quand elle se trouve dans la poche hydrophobe de l’OBP sous une excitation à 337
nm. En présence d’odorant, il y a une compétition avec le NPN pour l’occupation du site de
fixation. On mesure alors une décroissance de la fluorescence qui peut être reliée à l'affinité
pour l’OBP.
Cette mesure repose sur l’utilisation de sondes fluorescentes dont le rendement
quantique de fluorescence est très dépendant de l’environnement. La fluorescence est faible
dans un milieu polaire, mais augmente significativement en milieu hydrophobe. Certaines de
ces sondes lorsqu’elles sont fixées dans la cavité des OBP, présentent alors une fluorescence
caractéristique d’un environnement hydrophobe. La fixation de la sonde dans le site de liaison
de l’OBP peut alors être suivie par mesure de la fluorescence. De plus, les ligands de la
protéine peuvent déplacer la sonde du site de fixation par compétition (Figure 23); des
76

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
mesures de fluorescences pour différentes concentrations de ligand permettent alors de
déterminer une valeur d’IC50, correspondant à la concentration en ligand nécessaire pour faire
diminuer la fluorescence de moitié.
4.2. Protocole
4.2.1. Fixation des sondes
Les expérimentations de fluorescence ont été réalisées dans des cuves en quartz
contenant 1 mL de protéine à 2 µM. Les sondes fluorescentes utilisées était le N-phényl-1-
naphthylamine (NPN - Acros Organics) et l’acide 11-(5-(diméthylaminonaphthalenyl-1sulfonyl)amino)undécanoïque
(DAUDA- Acros Organics). Les sondes ont été préparées dans
100% de MeOH à une concentration de 1 mM. Des ajouts successifs de 1 µL de sondes à
partir de cette solution ont été effectués dans la solution de protéine à 2 µM. Les spectres ont
été enregistrés à 25°C avec un spectrofluorimètre SFM 25 Kontron ayant une bande passante
de 5 nm pour l’excitation et l’émission. Après un temps d’incubation de 4 minutes permettant
d’atteindre un équilibre, la proportion de sonde liée à l’OBP a été déterminée par mesure en
unités arbitraires de la fluorescence émise à 400 nm avec une excitation à 337 nm pour le
NPN et à 490 nm avec une excitation à 345 nm pour le DAUDA. Les constantes de
dissociations (Kd) ont été déterminées avec le logiciel Sigma Plot 4.11 à partir des mesures de
la fluorescence à 400 ou 490 nm, en appliquant une méthode de régression non linéaire.
L’équilibre réactionnel entre la sonde (S) et la protéine (P), en considérant un seul site
de fixation s’écrit P + S PS avec une constante d’affinité Ka = [PS] / (p.s) avec [PS] la
concentration en complexe sonde-OBP, p et s les concentrations en protéine et sonde libre. On
notera P et S les concentrations en protéine et en sonde totale. Soit T le taux de liaison
correspondant au rapport de concentration en protéine liée ([PS]) sur la concentration en
protéine totale (P), T = [PS] / P, d’où [PS] = TP. Alors on a Ka = TP / (p.s). D’après la
conservation de masse P = [PS] + p, d’où p = P – [PS] soit p = P – TP et S = [PS] + s d’où
s = S – TP. Ainsi, Ka
=
T
( 1−T) ( S−TP) d’où l’équation du second degré
T 2 KaP + T ( − KaS − KaP − 1)
+ KaS = 0 dont la seule solution valable physiquement est
77

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
1 ( P+ S)Ka
( P − S)
T
2 Ka 2 ( + −
+ 2( P+ S)
Ka + 1)
=
2PKa
. Si l’on admet que la fluorescence F
mesurée est proportionnelle au taux de liaison entre la sonde et de la protéine, alors
F = F0 – T . (F0 - Fm) avec F la fluorescence relative, F0 la fluorescence pour une quantité
nulle de sonde et Fm la fluorescence maximale. En remplacant T par la formule précédente,
on obtient la formule utilisée pour la régression non linéaire :
1 ( P+ S)Ka
( P − S)
F F0
2 Ka 2
( + − ( + 2( P + S)Ka
+ 1)
)
= −
2PKa
( F0 − Fm)
4.2.2. Compétition de ligands
Les déplacements de sondes fluorescentes ont été réalisés à partir de solutions d’OBP
purifiées à 2 µM, avec 3 µM de NPN ou de DAUDA. Les odorants testés étaient préparés
dans 100% de MeOH à une concentration finale de 1 mM. Ils ont été ajoutés par fractions de
1 µL. Après chaque injection, le mélange était incubé à l’obscurité avec agitation pendant 3
minutes avant enregistrement d’un spectre d’émission entre 500 et 350 nm pour le NPN et
entre 400 et 600 nm pour le DAUDA. Il s’agit d’une compétition, qui permet de déterminer
expérimentalement la valeur de l’IC50 qui correspond à la concentration en compétiteur
induisant une diminution de moitié de la fluorescence à 400 ou 490 nm pour le NPN et le
DAUDA respectivement. Les constantes de dissociation apparentes (Kdiss) ont été calculées
comme décrit par Ramoni et al. (2001) avec la formule Kdiss = IC50 / (1 + [S]/Kd) avec [S] la
concentration en sonde totale et Kd la constante de dissociation du complexe sonde-OBP.
5. Modélisation moléculaire et arrimage moléculaire
Les alignements de séquence ont été exécutés en utilisant les algorithmes BLAST2 et
ClustalW sur le serveur de l'EBI (site Web de http://www.ebi.ac.uk/). Cinquante modèles
tridimensionnels ont été construit avec le logiciel de MODELLER (Sali et Blundell, 1993) en
utilisant la structure cristallographique de la lipocaline de larme humaine comme matrice
(numéro d’accès pdb : 1XKI) (Breustedt et al., 2005). Outre une forte homologie de séquence
(environ 44%), cette lipocaline, dont la fonction exacte n’est pas encore connue, possède de
78

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
même que l’OBP humaine, une bonne affinité pour les aldéhydes et les acides aliphatiques.
La structure cristallisée de la lipocaline de larme à 1.8 Å indique une cavité constituée de
deux lobes. L'énergie des structures et les paramètres géométriques ont été minimisés en
utilisant DISCOVER (InsightII, Accelrys) et les modèles ont été évalués en utilisant
PROCHECK (Laskowski et al., 1993). L’undécanal a été construit avec le module
Biopolymer (InsighII, Accelrys). Le ligand était tout d’abord positionné dans la cavité de
hOBP-2A et la conformation résultante a été employée comme position de départ l'amarrage
automatisé effectué avec Autodock3 (Goodsell et al., 1996).
79

2. Résultats complémentaires relatifs à l’article
1. Mutagenèse dirigée de l’OBP humaine
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
1.1. Mutagenèse article
La mutagenèse dirigée a été réalisée par PCR à partir de la méthode développée par
Ho et al. (1998). Cela a permis l’intégration dans le plasmide pGAPZα de trois séquences
mutées respectivement en position 62, 82 et 112, générant trois vecteurs, pGAPZα-hOBP-2A-
K62A, pGAPZα-hOBP-2A-K82A et pGAPZα-hOBP-2A-K112A. Les séquences mutées de
hOBP-2A ont été placées en phase avec le prépropeptide du facteur α permettant la sécrétion
de la protéine recombinante dans le milieu de culture sous le contrôle du promoteur constitutif
pGAP. Le séquençage des constructions selon la méthode de Sanger a bien révélé les
mutations aux positions attendues pour chacun des mutants ainsi qu’une mutation
surnuméraire silencieuse, donc sans conséquence pour la protéine, pour chacun des mutants
K112A et K82A : pour le mutant K112A, le codon de l’arginine en position 108, (CGT) a été
muté en CGA; pour le mutant K82A, le codon (GCC) en position 77 a été muté en (GCT),
codant aussi pour une alanine.
1.2. Nouveaux mutants
Pour les nouveaux mutants (V34K, A49K, V114K, F51A et Y78A), on a utilisé une
méthode adaptée du Kit Stratagene (QuikChange Site directed mutagenesis). Celle-ci a permis
l’obtention de façon directe des plasmides d’expression des différents mutants à partir du
plasmide pGEX-2T-hOBP-2A construit au préalable. Les plasmides obtenus permettent
l’expression sous le contrôle d’un promoteur inductible à l’IPTG d’une protéine de fusion
GST-hOBP. Le séquençage des constructions selon la méthode de Sanger a confirmé les
mutations aux positions attendues pour chacun des mutants.
2. Production des OBP sauvages et mutées
2.1. Production en levure Pichia pastoris (Article)
2.1.1. Transformation des levures
80

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
Des levures P. pastoris ont été transformées par électroporation avec les plasmides
obtenus. Les clones ayant intégré par recombinaison homologue la cassette d’expression ont
été sélectionnés par résistance à des concentrations croissantes en Zéocine TM (de 10 à 50
µg/mL) sur un milieu YPDS. Les transformations ont permis d’obtenir plus de 100 clones
pour les plasmides pGAPZα-hOBP-2A-K62A et pGAPZα-hOBP-2A-K82A contre une
trentaine pour pGAPZα-hOBP-2A-K112A.
2.1.2. Sélection des clones les plus producteurs
Les clones de K62A, K82A et K112A ont été réisolés et testés pour leur capacité à
produire de l’OBP-2A. En effet, la production peut varier non seulement en fonction du
nombre de copies de transgène intégré mais aussi en fonction des sites d’insertion dans
l’ADN chromosomique. Des tests de production dans des fioles d’Erlenmeyer de 50 mL ont
donc été effectués avec une préculture de 24 heures dans un milieu BMGY (permettant la
croissance des cellules) et une phase de production de 48 heures dans un milieu BMD. Les
milieux de culture contenant les protéines sécrétées par les différents clones ont été analysés
par SDS-PAGE après élimination des cellules par centrifugation. Ces électrophorèses (Figure
24) ont révélé la présence dans le surnageant de culture d’une protéine en quantité variable en
fonction des clones, migrant à environ 20 kDa, masse attendue pour l’OBP humaine. Par
ailleurs, l’électrophorèse a montré la présence de peptides résultant vraisemblablement d’une
dégradation protéolytique migrant à des poids moléculaires entre 4 et 7 kDa.
hOBP-2A-K62A
PM II-1.4 II-1.5 II-1.6 II-1.7 II-1.8 II-2.1 II-2.2 II-2.3 II-2.4
97,4
66,2
45
31
26,6
21,5
16,9
14,4
6,5
3,5
81

hOBP-2A-K82A
PM I-1.1 I-1.2 I-1.3 I-1.4 I-1.5 I-1.6 I-1.7 I-1.8 I-2.1
kDA
97,4
66,2
45
31
26,6
21,5
16,9
14,4
6,5
3,5
hOBP-2A-K112A
PM I-1.1 I-1.2 I-1.3 I-1.4 I-1.5 I-1.7
kDa
97,4
66,2
45
31
26,6
21,5
16,9
14,4
6,5
3,5
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
Figure 24. Criblage des clones de Pichia pastoris
Les électrophorèses effectuées après miniproduction ont permis de détecter un clone pour
chaque mutant dont la production paraissait supérieure aux autres. Ces clones retenus
(respectivement II-1.5, I-1.5 et I-1.5 pour K62A, K82A et K112A) sont indiqués par un cercle
rouge. Pour chaque mutant, plusieurs dizaines de clones ont été testés de la sorte. Les
poids moléculaires sont indiqués à gauche des électrophorèses colorées au bleu de
Coomassie.
2.1.3. Production des protéines recombinantes
Les clones les plus producteurs des protéines mutées hOBP-2A-K62A, hOBP-2A-
K82A et hOBP-2A-K112A (respectivement les clones II.1.5, I.1.5, I.1.7) (Figure 24) ont été
retenus. Ils ont été utilisés pour des productions dans des fioles d’Erlenmeyer de 2 L, selon le
protocole développé au laboratoire pour la protéine sauvage, hOBP-2A (Briand et al., 2002).
La croissance cellulaire a été effectuée dans un milieu BMGY qui a été remplacé dans la
phase de production de protéine par du milieu BMMt, un milieu plus simple facilitant la
purification des protéines. Afin d’optimiser le temps de fermentation, des cinétiques de
82

A
kDa
97,4
66,2
45,0
31,0
26,6
21,5
16,9
14,4
6,5
3,5
kDa
97,4
66,2
45,0
31,0
26,6
21,5
16,9
14,4
6,5
3,5
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
sécrétion ont été réalisées à partir de prélèvements de surnageants de culture et analysés par
SDS-PAGE (Figure 25A).
hOBP-2A K62A K82A
PM 0h 24h 48h 72h kDa PM 0h 24h 48h 72h kDa PM 0h 24h 48h 72h
97,4
66,2
45,0
31,0
26,6
21,5
16,9
14,4
6,5
97,4
66,2
45,0
31,0
26,6
21,5
16,9
14,4
6,5
K112A
PM 0h 24h 48h 72h
3,5
Figure 25A. Cinétiques de production des différents mutants
Les clones retenus présentent tous une accumulation croissante d’OBP au cours du
temps avec un maximum atteint après 72 heures de sécrétion pour le mutant hOBP-2A-
K112A et environ 48 heures pour tous les autres clones. De plus, les électrophorèses ont
révélé que les OBP étaient accumulées en quantité comparable dans le surnageant des cultures
des deux mutants K62A et K82A et de la protéine de sauvage. En revanche pour des raisons
non élucidées, le mutant K112A était produit en plus faible quantité. Des essais ont été
3,5
Electrophorèses SDS-PAGE des surnageants de culture après
0, 24, 48 ou 72 heures de production des différents clones de P.
pastoris produisant l'OBP sauvage ou les mutants K62A, K82A
et K112A.
Les flèches rouges indiquent la protéine d’intérêt (hOBP-2A,
K62A, K82A et K112A). Les poids moléculaires (mélange de
« Low range » et de « polypeptides » - Biorad) sont indiqués à
gauche des électrophorèses colorées au bleu de Coomassie.
83

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
effectués, notamment en remplaçant le milieu BMMt par des milieux enrichis en tryptone lors
de la phase de production. Ces essais n’ont malheureusement pas permis d’augmenter la
production de hOBP-2A-K112A. La présence d’une double bande au poids moléculaire
attendu laisse supposer une protéolyse partielle des deux mutants K62A et K112A ainsi que
de hOBP-2A. Cependant, la protéolyse observée lors de la sélection des clones producteurs
n’a pas été observée pour les productions dans des volumes de 1 L.
2.1.4. Purification des OBP recombinantes
Les protéines mutées ont été purifiées en suivant le protocole décrit pour l’OBP
humaine hOBP-2A (Briand et al., 2002). Les surnageants de culture, après centrifugation et
filtration, ont été dialysés deux jours contre de l’eau osmosée avec une membrane de seuil de
coupure 10-14 kDa. Ceci a permis d’éliminer la majorité des composés de petite taille,
notamment les sels, les pigments et les petits peptides. Une précipitation acide a ensuite
permis d’éliminer le propeptide du facteur α, dont la concentration est très élevée dans le
surnageant. De plus la dénaturation ménagée de la protéine lors de sa précipitation permet de
relarguer des ligands éventuels présents dans la cavité, comme cela a été montré pour la
lipocaline de larme (Gasymov et al., 1998). Les précipités obtenus ont été resuspendus dans
du tampon phosphate de potassium et purifiés par chromatographie d’échange d’anions.
L’analyse des différentes fractions par électrophorèses SDS-PAGE a montré la présence
d’une bande majoritaire à 20 kDa dans la fraction non retenue, alors que la majorité des
contaminants protéiques étaient retenus sur la résine échangeuse d’anions. Toutefois, il faut
noter que si les OBP sauvages et mutées ne sont pas retenues sur la colonne échangeuse
d’anion, alors la purification peut donc être incomplète puisque des contaminants peuvent être
co-purifiés avec l’OBP.
2.2. Production des OBP en bactérie
2.2.1. Production de fusions GST-OBP
Afin d’améliorer la qualité des protéines recombinantes, la protéine sauvage ainsi que
la nouvelle série de mutants ont été produite dans un système hétérologue bactérien, en fusion
avec la GST. Ainsi, la protéine de fusion peut être immobilisée sur une colonne d’affinité et
subir différents lavages favorisant une meilleure purification.
84

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
Des bactéries E. coli de souche Bl21 ont été transformées par les plasmides pGEX-2ThOBP-2A
ou un des plasmides portant les mutations (V34K, A49K, V114K, F51A et Y78A).
Ceux ci ont permis l’expression, induite par l’IPTG, dans le cytoplasme des protéines de
fusion GST-OBP. La fraction soluble après différents temps d’induction a été déposée sur un
gel d’électrophorèses SDS-PAGE (Figure 25B).
kDa
97,4
66,2
45,0
31,0
21,5
14,4
PM 0h 2h 6h 12h
Figure 25B. Cinétiques de production des différents mutants
Electrophorèses SDS-PAGE de la fraction soluble de bactéries E. coli Bl21 transformées
par pGEX-2T-hOBP-2A. Les bactéries ont été lysées après 0, 2 6 ou 12 heures d’induction.
Les flèches rouges indiquent la fusion GST-hOBP-2A. Les poids moléculaires « Low
range » (Biorad) sont indiqués à gauche de l’électrophorèses colorée au bleu de Coomassie.
Cette électrophorèse montre l’accumulation d’une protéine aux alentours de 45 kDa,
ce qui correspond à la masse attendue pour la fusion GST-hOBP-2A (masse réelle : 44,2 kDa).
La GST permet l’immobilisation de la fusion, ce qui nous a permis de réaliser des lavages des
OBP. En effet, lors de productions de lipocalines en levure ou en bactérie, il a été observé la
co-purification de composés hydrophobes se fixant dans le calice ou à la surface de la protéine.
Ces contaminants ont été éliminés avec succès par des méthodes d’extraction au méthanol et
au chloroforme pour l’OBP de porc et la lipocaline de larme (Burova et al., 1999, Burova et
al., 2000). Les lavages en présence de méthanol et de triton X-100 permettent de réaliser une
dénaturation ménagée de la protéine et d’éliminer des contaminants éventuels. Après les
lavages, les protéines de fusion ont été éluées par du glutathion réduit. Les fractions collectées
après chaque étape de purification ont été analysées par électrophorèse SDS-PAGE (Figure
85

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
26). L’élution révèle une protéine unique migrant aux alentours de 45 kDa ce qui correspond
au poids moléculaires de la fusion GST-OBP (sauvage ou mutée).
GST-hOBP-2A GST- hOBP-2A -V34K
kDa PM Lysat NR Lavage Elution kDa PM NR Lysat Elution
97,4
66,2
45,0
31,0
21,5
14,4
GST- hOBP-2A-F51A GST- hOBP-2A-Y78A
kDa PM Lysat NR Lavage Elution kDa PM Lysat NR Lavage Elution
200
97,4
116
97
66,2
66,2
45
45,0
31,0
21,5
200
116
97
66
45
Figure 26. Purification des fusions GST-OBP
Electrophorèses SDS-PAGE des étapes de purification des fusions GST-OBP, pour la
protéine sauvage (GST-hOPB-2A et les mutants GST-hOPB-2A-V34K GST-hOPB-2A -
F51A et GST-hOPB-2A -Y78A). Le lysat contient l’ensemble des protéines solubles des
bactéries. Le puits noté NR correspond à la fraction non retenue sur une colonne de
glutathion immobilisé alors que l’élution correspond aux protéines éluées de cette colonne.
Le lavage correspond à un passage de tampon sur la colonne immobilisant la fusion. Les
marqueurs « Low range » pour GST-hOBP-2A et GST- hOBP-2A-F51A, et « Broad range »
pour GST- hOBP-2A -V34K et GST- hOBP-2A-Y78A sont indiqués à gauche de chaque gel
d’électrophorèse coloré au bleu de Coomassie. Les protéines de fusion sont indiquées
d’une flèche rouge.
31
21,5
14,4
31
6,5
21,5
14,4
86

2.2.2. Purification
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
3.2.1. Production de la protéase TEV
Les fusions GST-OBP comportent un site de clivage à la protéase TEV. Il s’agit d’une
séquence spécifique en acides aminés (ENLYFQG) que la protéase reconnaît et clive au
niveau de la liaison peptidique entre l’acide glutamique et la glycine. Ce clivage permet la
séparation de la GST et de l’OBP (sauvage ou mutée). Cette protéase présente l’avantage de
pouvoir se produire facilement et en assez grande quantité au laboratoire.
La production a été faite en bactérie E. coli souche Bl21(plysS). La protéine
s’accumule sous forme soluble lors de l’induction par l’IPTG. Elle comporte une queue de
polyhistidine en position C-terminale ce qui permet de la purifier sur une colonne de métal
immobilisé. Après élution, on a observé par électrophorèse la présence d’une bande unique
dans l’éluant migrant vers 33 kDa ce qui correspond bien à la masse attendue pour la protéase
TEV (33,5 kDa) (van den Berg et al., 2006) (Figure 27) . La protéase purifiée a été
fractionnée et stockée à -80°C.
kDa PM 0 1h 20h NR Lavage Elution
97,4
66,2
45,0
31,0
21,5
14,4
Figure 27. Production et purification de protéase TEV
TEV
Electrophorèse SDS-PAGE des fractions solubles lors de l’expression de protéase TEV
après induction par l’IPTG (0, 1 et 20 h d’induction). La fraction non retenue sur une colonne
IMAC (NR), le lavage de la colonne par du tampon LysB ainsi que la fraction éluée par 250
mM d’imidazole ont été déposés sur le gel. La protéase TEV est indiquée par une flèche
rouge. Les marqueurs moléculaires sont indiqués à gauche de l’électrophorèse.
87

21,5
14,4
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
3.2.2. Purification des OBP
Après avoir purifié les différentes fusions d’OBP humaine, sauvages et mutées, celleci
ont été digérées par la protéase TEV ce qui permet d’obtenir un mélange GST, OBP, TEV
et éventuellement de la fusion non clivée GST-OBP. On notera hOBP-2ABac la protéine
sauvage produite en bactérie, par opposition à la protéine sauvage hOBP-2A produite en
levure. La protéine hOBP-2ABac comporte une glycine surnuméraire en position N-terminale
par rapport à hOBP-2A. La GST seule ainsi que la TEV ont été éliminées respectivement par
passage sur une colonne de glutathion immobilisé puis sur une colonne IMAC. Les fractions
collectées après chaque étape de purification ont été analysées par électrophorèse SDS-PAGE.
Après clivage, on a bien obtenu trois protéines migrant à environ 33, 27 kDa et 21 kDa, en
accord avec les masses moléculaires respectivement de la fusion GST-hOBP-2A (44,2 kDa),
de la GST (26 kDa) et de la TEV (33,5 kDa) (Figure 28).
hOBP-2ABac Y78A
+TEV +TEV
kDa PM 1h 12h Glutathion IMAC
97,4
66,2
kDa PM Fusion 0 12h Dialyse Glutathion IMAC
200
116
97
66
45,0
Fusion 45
31,0
TEV
GST 31
OBP
21,5
14,4
V114K
+TEV
kDa PM Fusion 0 12h Dialyse Glutathion IMAC
200
116
97
66
45
31
21,5
Fusion
TEV
GST
OBP
Figure 28. Suivi de purification des OBP produites en bactérie
Electrophorèse SDS-PAGE des différentes étapes de purification des fusions GST-hOBP-
2A, GST-Y78A et GST-V114K. Les fusions ont été digérées par la protéase TEV, dialysées,
et les fractions non retenues de passages successifs sur des colonnes de glutathion et de
cobalt immobilisé (IMAC) ont été analysées. Les flèches rouges indiquent les positions des
protéines sur chaque gel. Les masses des marqueurs moléculaires (Low range pour hOBP-
2ABac et Broad range pour Y78A et V114K – Biorad) sont indiquées à gauche des gels
d’électrophorèse colorés au bleu de Coomassie.
Fusion
TEV
GST
OBP
88

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
En ce qui concerne l’OBP humaine produite en bactérie, hOBP-2ABac, on a bien
observé dans un premier temps l’élimination de la GST clivée et de la protéase TEV, lors des
chromatographies d’affinité sur glutathion puis cobalt immobilisé (Figure 28). Cette
production a été utilisée lors des tests concernant le rôle de l’OBP humaine dans le
fonctionnement d’un récepteur olfactif. Cette approche est détaillée dans la deuxième partie
de ce travail. Une fois cette étude terminée une nouvelle série de mutants de l’OBP humaine
ont été construits (V34K, A49K, V114K, F51A et Y78A). A ce stade pour un nouveau lot de
protéine sauvage ainsi que pour les mutants, la purification des OBP produites en bactérie
s’est révélée incomplète. En effet, les électrophorèses (Figure 28) révèlent que les
chromatographies d’affinité n’éliminent pas la GST clivée par la protéase ni cette dernière,
suggérant une altération de la fonctionnalité de la GST au cours de la purification, empêchant
sa fixation sur la colonne d’affinité. Des composés nécessaires au fonctionnement de la
protéase TEV (EDTA, DTT) étant incompatibles avec les chromatographies d’affinité
utilisées ici, on a supposé que ceux-ci pouvaient être en cause dans cette purification
incomplète. Toutefois, malgré une dialyse plus longue après le clivage par la TEV, on n’a pu
pour le moment obtenir d’OBP ayant une pureté satisfaisante, pour hOBP-2ABac ou pour les
mutants.
3. Intégrité des protéines produites
3.1. Intégrité chimique
3.1.1. Séquençage N-terminal
Afin de s’assurer de la présence d’un clivage N-terminal normal, la séquence Nterminale
des protéines produites en levure a été vérifiée. Après électrophorèse SDS-PAGE,
les bandes protéiques révélées au bleu de Coomassie ont été excisées et les protéines
transférées par transfert passif sur des membranes de PVDF. Ces membranes ont servi de
support pour un séquençage N-terminal selon la méthode d’Edman. S’il y avait un clivage
interne de la protéine, deux séquences seraient déterminées simultanément, ce qui ne fut pas
le cas. Pour chacune des protéines mutées, une séquence LSFTLE correspondant aux 6
premiers acides aminés de la séquence de hOBP-2A mature a été obtenue de façon très
majoritaire. Ces résultats montrent d’une part que les protéines n’ont pas subi ni de clivage N-
terminal, d’autre part que le clivage du propeptide du facteur α s’est effectué correctement.
89

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
3.1.2. Mesure de masse molaire des protéines mutées
Afin de vérifier la présence d’un éventuel clivage C-terminal, les masses molaires des
trois protéines mutées et de la protéine sauvage ont été mesurées par spectrométrie de masse
MALDI-TOF. Les masses théoriques attendues étaient de 17784,4 Da pour la protéine
sauvage et de 17727,3 Da pour les trois mutants. Cette différence de masse de 57,1 Da
correspond à la substitution d’une lysine par une alanine. Les spectres obtenus pour hOBP-2A
et hOBP-2A-K62A, hOBP-2A-K82A et hOBP-2A-K112A montrent un pic majoritaire à
17784,6 Da pour la protéine sauvage et à 17732,5, 17732,4 et 17730,3 Da pour chaque mutant,
ce qui correspond aux valeurs attendues (Article joint, 2006, Figure 1B). Aucune protéine
recombinante ne présentait donc de clivage artéfactuel.
3.1.3. Validation des mutations par analyse des masses peptidiques
La trypsine clive les protéines en C-terminal des lysines et des arginines. Ainsi, la
substitution d’une lysine par une alanine pour les mutants élimine un site de digestion par la
trypsine, modifiant la carte peptidique de la protéine mutée qui peut alors être identifiée par
analyse des masses des digestions trypsiques. La liste des fragments peptidiques issus de la
trypsinolyse de hOBP-2A-K82A et de hOBP-2A ainsi que leurs masses monoisotopiques
monochargés théoriques et mesurées par spectrométrie de masse MALDI-TOF sont indiquées
dans le Tableau 2. Les spectres obtenus (Figure 29) ont montré comme attendu un
remplacement de la masse du peptide L83-K100 par celle du peptide A82-K100 de la protéine
mutée en position 82.
La même étude appliquée aux deux mutants hOBP-2A-K62A et hOBP-2A-K112A n’a
pas été concluante. En effet, le mutant hOBP-2A-K62A aurait dû être identifié par la
disparition du peptide C59-K62, remplacé par le peptide C59-K63, alors que le mutant hOBP-
2A-K112A aurait dû être identifié par la disparition des peptides Y109-K112 et L113-R116,
remplacé par le peptide Y109-R116. Cependant tous ces peptides (excepté le Y109-R116)
présentent une masse proche de 500 Da qui correspond à la masse limite sous laquelle les
peptides peuvent ne pas être ionisés correctement par la matrice utilisée, ce qui explique qu’ils
n’aient pu être observés.
90

Peptide
hOBP-2A hOBP-2A-K82A
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
M+H-monoisotopique M+H-monoisotopique
Peptide
Théorique Mesurée
Théorique Mesurée
L1-K17 2031,00 2031,01 L1-K17 2031,00 2031,00
A18-K23 662,35 662,3455 A18-K23 662,35 662,29
D24-R29 778,34 - D24-R29 778,34 -
R30-K32 428,27 428,27 R30-K32 428,27 -
V34-R38 529,34 - V34-R38 529,34 -
V39-R55 1784,90 1784,94 V39-R55 1784,90 1784,91
E56-R58 419,19 - E56-R58 419,19 -
C59-K62 562,30 - C59-K62 562,30 -
I64-R67 532,33 - I64-R67 532,33 -
T69-K74 660,32 - T69-K74 660,32 -
F75-R81 757,36 757,41 F75-R81 757,36 757,36
L83-K100 2164,09 2164,09 A82-K100 2235,12 2235,11
D101-R103 418,21 - D101-R103 418,21 -
G105-R108 402,25 - G105-R108 402,25 -
Y109-K112 498,24 - Y109-K112 498,24 -
L113-R116 444,29 - L113-R116 444,29 -
N117-K129 1518,74 1518,79 N117-K129 1518,74 1518,76
L131-K135 624,38 - L131-K135 624,38 -
G136-H155 2246,05 2246,04 G136-H155 2246,05 2246,03
Tableau 2. Peptides issus de la digestion trypsique de hOBP-2A et hOBP-2A-K82A
Les masses monoisotopiques calculées et mesurées des peptides sont indiquées (en Da).
Les tirets indiquent des masses de peptides non obtenues lors de l’analyse. Le peptide dont
la masse varie entre la protéine sauvage et le mutant hOBP-2A-K82A sont surlignés en
jaune.
91

Intensité (%)
Intensité (%)
2164,09 Da
Masse (Da)
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
hOBP-2A
hOBP-2A-K82A
2235,11 Da
Figure 29. Carte peptidique de hOBP-2A et hOBP-2A-K82A après trypsinolyse
Les pics correspondant aux peptides L83-K100 et A82-K100, spécifiques de la protéine
sauvage et du mutant hOBP-2A-K82A sont entourés en rouge, leurs masses sont indiquées
en italique. La flèche rouge indique l’absence de masse sur le spectre du mutant hOBP-2A-
K82A.
Pour contourner ce problème, le BrCN permettant le clivage des liaisons peptidiques
en position C-terminale des méthionines a été utilisé sur les mutants non validés par
trypsinolyse. En effet, la mutation d’une lysine en alanine induit dans ce cas une modification
de la masse du peptide portant la mutation. Les peptides issus du clivage ainsi que leurs
masses monoisotopiques théoriques et mesurées sont indiqués dans le Tableau 3. Les
spectres de masse obtenus par MALDI-TOF (Figure 30) ont confirmé le remplacement de la
masse de 1555,90 Da pour le peptide R55-M66 sauvage par une masse de 1498,86 Da pour le
92

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
même peptide de la protéine mutée hOBP-2A-K62A. De la même façon, la masse mesurée de
3836,04 Da du peptide sauvage G111-M144 est remplacée par la masse de 3778,88 Da pour
le mutant hOBP-2A-K112A.
Intensité (%)
Intensité (%)
Intensité (%)
1224,45 Da
1224,60 Da
1224,60 Da
1498,86 Da
1555,90 Da
2201,10 Da
2201,10 Da
2201,07 Da
Masse (Da)
hOBP-2A
hOBP-2A-K62A
hOBP-2A-K112A
3836,04 Da
3829,09 Da
3836,04 Da
3829,02 Da
3778,88 Da
3829,01 Da
Figure 30. Carte peptidique de hOBP-2A, hOBP-2A-K62A et hOBP-2A-K112A
après clivage au BrCN
Spectres de masse MALDI-TOF des peptides résultant du clivage chimique au BrCN de
hOBP-2A, hOBP-2A-K62A et hOBP-2A-K112A. Les masses mesurées des peptides R55-
M66 (surlignées en jaune) et G111-M144 (surlignées vert) sont spécifiques respectivement
de la mutation en position 62 et 112.
93

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
hOBP-2A hOBP-2A-K62A hOBP-2A-K112A
Peptide
M+H-monoisotopique
Théorique Mesurée
M+H-monoisotopique
Théorique Mesurée
M+H-monoisotopique
Théorique Mesurée
L1-M19 2185,07 2201,10 2185,07 2201,10 2185,07 2201,07
V20-M54 3829,04 3829,09 3829,04 3829,02 3829,04 3829,01
R55-M66 1555,88 1555,90 1498,82 1498,86 1555,88 -
R67-M110 5140,64 - 5140,64 - 5140,64 -
G111-M144 3836,04 3836,04 3836,04 3836,04 3778,98 3778,88
P145-H155 1224,60 1224,45 1224,60 1224,60 1224,60 1224,60
Tableau 3. Peptides issus du clivage au BrCN de hOBP-2A, hOBP-2A-K62A et
hOBP-2A-K112A
Les masses monoisotopiques calculées et mesurés des peptides sont indiquées. Les tirets
indiquent des masses de peptides non obtenues lors de l’analyse. Les peptides dont la
masse varie en raison de la mutation sont indiqués en jaune hOBP-2A-K62A et en vert pour
hOBP-2A-K112A.
3.2. Intégrité structurale
3.2.1. Fluorescence du tryptophane
Les résidus tryptophanes, lorsqu’ils sont excités à 285 nm, émettent une fluorescence
dont le maximum est fortement dépendant de l’environnement. La mesure de la fluorescence
est donc un outil efficace pour évaluer l’état structural ou les changements de conformation
des protéines, au voisinage de tels résidus. hOBP-2A comprend un unique tryptophane en
position 14 situé au fond du calice, dans un environnement hydrophobe. Les spectres de
fluorescence du tryptophane mesurés sur les différentes protéines indiquent un maximum
d’émission à 330 nm, typique d’un environnement hydrophobe, sans différence significative
entre les protéines sauvages ou mutées. On a ainsi pu en déduire que les mutations
n’affectaient pas significativement le repliement local de hOBP-2A au niveau du tryptophane
(Figure 31).
94

Fluorescence relative (%)
120
100
80
60
40
20
329
0
310 330 350 370 390
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
hOBP-2A
K62A
K82A
K112A
Figure 31. Spectres de fluorescence du tryptophane de hOBP-2A et des mutants
K62A, K82A et K112A
Mesure de la fluorescence entre 300 et 400 nm de solutions protéiques à 2 µM dans un
tampon phosphate 50 mM pH 7,5 lors d’une excitation à 285 nm.
3.2.2. Dichroïsme circulaire
Afin d’évaluer le repliement à un niveau plus global, on a réalisé des spectres de
dichroïsme circulaire des différentes protéines. Ceux-ci présentent un maximum et un
minimum respectivement à 195 et 215 nm, représentatifs d’un repliement contenant
majoritairement des feuillets β (Article joint, Figure 1C). En outre, les spectres obtenus
étaient similaires suggérant que les mutations n’affectent pas le repliement de hOBP-2A.
4. Etude fonctionnelle des mutants
Longueur d’onde (nm)
4.1. Tests de fixations pour les mutants de l’article
4.1.1. Mesure des constantes d’affinité de sondes fluorescentes
L’affinité de sondes se liant à hOBP-2A, le NPN et le DAUDA a été mesurée pour
hOBP-2A et les trois mutants. La figure 32 montre que la fluorescence des deux sondes NPN
et DAUDA varie en fonction de leur environnement. Elle est augmentée en présence d’OBP.
Pour le NPN, le spectre d’émission a un maximum déplacé vers 400 nm, alors que le NPN
seul présente une fluorescence faible avec un maximum vers 450 nm. L’OBP seule ne
95

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
présente pas de fluorescence significative entre 350 et 400 nm pour une excitation à 337 nm.
De même pour le DAUDA, on observe un maximum de fluorescence vers 545 nm dans le
tampon alors que la fluorescence est fortement augmentée en présence d’OBP avec un
maximum décalé vers 480 nm. L’OBP seule ne présente pas de fluorescence significative
entre 350 et 400 nm pour une excitation à 337 nm.
Fluorescence relative (%)
80
60
40
20
NPN DAUDA
0
350 400 450 500
Figure 32. Spectres d’émission du NPN, et du DAUDA, effet de hOBP-2A
Enregistrement des spectres d’émission de la N-phényl-1-naphthylamine (NPN) et de l’acide
11-(5-(diméthylaminonaphthalenyl-1-sulfonyl)amino)undécanoïque (DAUDA) dans le
tampon seul ( ), en présence d’OBP ( ) et fluorescence de hOBP-2A dans le
tampon( ). Les formules développées du NPN et du DAUDA sont indiquées. Les
longueurs d’onde d’excitation des sondes sont respectivement 337 et 345 nm pour le NPN
et le DAUDA.
Les différentes protéines mutées présentent un comportement identique. Les courbes
de titration obtenues (Figure 33) par ajout progressif de sonde dans une solution de protéine
ont permis de calculer les valeurs des constantes de dissociations (Kd) des complexes formés
par le NPN et le DAUDA pour chacune des protéines testées. La valeur du Kd du NPN a été
calculée à 2,24 ± 0,77, 3,27 ± 0,77, 3,01 ± 1,66 et 6,78 ± 1,76 µM pour hOBP-2A, hOBP-2A-
K62A, hOBP-2A-K82A et hOBP-2A-K112A respectivement en utilisant une méthode de
régression non linéaire.
80
60
40
20
0
400 450 500 550 600
Longueur d’onde (nm) Longueur d’onde (nm)
96

Fluorescence relative (%) Fluorescence relative (%)
Fluorescence relative (%)
A
B
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
350 400 450 500 350 400 450 500
350 400 450 500 350 400 450 500
Longueur d’onde (nm) Longueur d’onde (nm)
100
75
50
25
0
hOBP-2A K62A
K82A
0 5 10 15 20 25 30
Concentration en NPN (µM)
K112A
hOBP-2A
K62A
K82A
K112A
Figure 33. Fixation du NPN sur hOBP-2A et les mutants K62A, K82A et K112A
(A) Spectres de fluorescence des différentes protéines à 2 µM pour une excitation à 337
nm et des concentrations croissantes en NPN, de 0 à 30µM (fluorescence croissante).
(B) Courbes de titration du NPN pour les quatre protéines résultant de la mesure de la
fluorescence à 400 nm en fonction de la concentration en NPN.
97

A
Fluorescence relative (%) Fluorescence relative (%) Fluorescence relative (%)
B
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
400 450 500 550 600 400 450 500 550 600
400 450 500 550 600 400 450 500 550 600
100
75
50
25
0
hOBP-2A K62A
K82A K112A
Longueur d’onde (nm) Longueur d’onde (nm)
0 10 20 30
Concentration en NPN (µM)
hOBP-2A
K62A
K82A
K112A
Figure 34. Fixation du DAUDA sur hOBP-2A et les mutants K62A, K82A et K112A
(A) Spectres de fluorescence des différentes protéines à 2 µM pour une excitation à 345
nm et des concentrations croissantes en NPN, de 0 à 30µM (fluorescence croissante).
(B) Courbes de titration du NPN pour les quatre protéines résultant de la mesure de la
fluorescence à 490 nm en fonction de la concentration en NPN.
98

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
Pour le DAUDA (Figure 34), les constantes de dissociations obtenues étaient de 2,91
± 0,24, 3,02 ± 0,76, 3,29 ± 0,26 et 3,42 ± 1,05 µM. Ces valeurs comparables indiquent une
capacité de fixation des deux sondes similaires entre les différentes protéines mutées et la
protéine sauvage (Article joint, Figure 2A-B). En outre, ces valeurs sont aussi comparables à
celles obtenues dans les travaux de Briand et al. (2002), qui étaient de 3,3 ± 1,9 et 1,5 ± 1,3
µM pour le NPN et le DAUDA respectivement. Ainsi, la mutagenèse n’a pas affecté la
fixation des sondes.
4.1.2. Déplacement de sondes fluorescentes
Dans un premier temps, des déplacements des deux sondes fluorescentes (NPN et
DAUDA) ont été réalisés avec les ligands pour lesquels hOBP-2A a révélé la meilleure
affinité : l’undécanal et l’acide palmitique (Briand et al., 2002). Les résultats obtenus
indiquent que seul le mutant de la lysine en position 112 présente une perte importante
d’affinité pour l’undécanal (Article joint, Figure 2 et Tableau 1). Les résultats étant
comparables pour les deux sondes, NPN et DAUDA, les mesures de déplacement ont par la
suite été effectués uniquement pour le NPN.
L’effet des différentes mutations sur la capacité de liaison des ligands de 8 carbones
ayant des fonctions chimiques variables a été vérifié. Le Tableau 4 récapitule les constantes
d’affinité (Ka) obtenues pour hOBP-2A et pour les différents mutants pour les ligands à 8
carbones.
Ligand hOBP-2A K62A K82A K112A
Acide octanoïque
Octanol
Octanone
Octène
Octanal
0,21 ± 0,08
0,31 ± 0,13
0,25 ± 0,00
0,32 ± 0,08
1,48 ± 0,31
0,20 ± 0,06
0,28 ± 0,20
0,20 ± 0,03
0,27 ± 0,00
1,46 ± 0,26
0,25 ± 0,08
0,30 ± 0,06
0,25 ± 0,04
0,40 ± 0,17
1,99 ± 0,58
0,17 ± 0,04
0,13 ± 0,03
0,10 ± 0,00
0,14 ± 0,03
0,28 ± 0,10
Tableau 4. Constantes d'affinité de différentes familles d'odorants à 8 carbones
Mesures des constantes d’affinité (en µM -1 ) de hOBP-2A et des 3 mutants K62A, K82A et
K112A pour 5 odorants de familles chimiques différentes et de même taille, 8 carbones.
Chaque valeur correspond à la moyenne associée à l’écart-type de trois expérimentations
indépendantes.
99

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
Comme attendu, hOBP-2A présente une plus forte affinité pour l’octanal que pour
d’autres ligands de même taille mais avec des fonctions chimiques différentes. Pour les deux
mutants hOBP-2A-K62A et hOBP-2A-K82A, on observe des affinités comparables avec
hOBP-2A pour les différents ligands indiquant que ces mutations n’affectent pas les capacités
de fixation de l’OBP. En revanche l’affinité de hOBP-2A-K112A pour l’octanal est environ 5
fois plus faible que celle de la protéine sauvage pour le même ligand, indiquant que cette
mutation affecte les capacités de liaison de hOBP-2A pour l’octanal.
Afin de tester l’impact de la taille du ligand sur l’affinité de la protéine, des
compétitions avec des ligands linéaires de taille variable comportant une fonction aldéhyde ou
acide ont été effectuées. Ceci a permis de montrer un fort impact de la mutation K112A sur la
liaison des aldéhydes de taille intermédiaire (de 8 à 12 carbones) ainsi que sur les acides
aliphatiques de 9 à 12 carbones. En revanche aucune des mutations effectuées n’affecte la
fixation d’un aldéhyde de grande taille, ni le tridécanal ni les acides aliphatiques supérieurs à
14 carbones (Article joint, Tableau 1) (Figure 35). L’étude précédente sur l’OBP humaine
(Briand et al., 2002) a montré qu’à taille égale les aldéhydes se lient mieux à l’OBP que les
acides aliphatiques. Or les résultats publiés ici montrent pour le tridécanal (13 carbones) une
affinité proche pour le mutant K112A et la protéine sauvage (0,17 et 0,63 µM respectivement),
indiquant que le mode de fixation de ce ligand est indépendant de la lysine en position 112.
Par ailleurs, la liaison des acides de grande taille étant indépendante de cette lysine, on peut
supposer que les mécanismes de fixation des acides aliphatiques de 14 et 16 carbones ainsi
que de l’aldéhyde à 13 carbones sont similaires. L’affinité étant croissante avec la longueur de
chaîne, on peut supposer que seules des interactions de type hydrophobe interviennent dans la
fixation de ces grands ligands.
100

Fluorescence relative (%)
Fluorescence relative (%) Fluorescence relative (%)
A
100
75
50
25
0
100
75
50
B
100
75
50
C
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
25
Acide nonanoïque Acide décanoïque
0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
Concentration en odorant (µM)
25
Hexanal Acide octanoïque Octène Benzaldéhyde
0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
Concentration en odorant (µM)
100
75
50
25
Heptanal Octanal Nonanal Décanal
Undécanal
Tridécanal Acide myristique Acide palmitique
0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
Concentration en odorant (µM)
Acide dodécanoïque
Figure 35. Mesures de déplacement du NPN pour divers ligands de hOBP-2A
Les déplacements ont été mesurés sur des échantillons de 2 µM de protéine et 3 µM de
NPN à 400 nm pour une excitation de 337 nm pour des concentrations d’odorant entre 0 et
20 µM. La fluorescence du complexe OBP-NPN à été normalisée à 100% en absence
d’odorant.
(A) Ensemble de ligands dont la fixation est affectée par la mutation K112A.
(B) Quelques ligands présentant peu de fixation sur les protéines sauvages et mutées.
(C) Ligands ayant une bonne affinité pour hOBP-2A, non affectés par les mutations.
Ref
K62A
K82A
K112A
101

Intensité relative (%)
4.2. Nouveaux mutants
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
La masse molaire du premier lot de la protéine hOBP-2ABac, c'est-à-dire celle où la
GST clivée et la protéase TEV ont bien été éliminées, a été mesurée à 17 803,24 Da par
spectrométrie de masse MALDI-TOF ce qui est en accord avec la masse théorique de 17841,4
Da. Ainsi, cette nouvelle protéine est chimiquement intègre sans clivage artéfactuel (Figure
36) . Le spectre de fluorescence du tryptophane de hOBP-2ABac a été mesuré. Il est
comparable avec celui de la protéine hOBP-2A produite en levure avec un maximum de
fluorescence à 330 nm. Ainsi, le repliement local de hOBP-2A au niveau du tryptophane est
similaire pour ces deux protéines (Figure 36).
A B
100
17803,24 Da
75
50
25
0
10 18
Masse (kDa)
26
Fluorescence relative (%)
120
100
Figure 36. Intégrité de hOBP-2A et hOBP-2ABac
80
60
40
20
hOBP-2A
hOBP-2ABac
329
0
310 330 350 370 390
Longueur d’onde (nm)
(A) Spectre de masse MALDI TOF de hOBP-2ABac purifiée.
(B) Spectre d’émission de fluorescence du tryptophane de hOBP-2A et hOBP-2ABac.
Mesure de la fluorescence entre 310 et 400 nm de solutions protéiques à 2 µM dans du
tampon phosphate 50 mM pH 7,5 lors d’une excitation à 285 nm.
Des tests préliminaires ont montré que l’OBP fixait le NPN avec une constante de
dissociation de 2,58 ± 0,92 µM. Cette valeur est comparable aux valeurs publiées sur l’OBP
produite en levure (3,33 ou 2,24 µM respectivement pour Briand et al. (2002) et Tcatchoff et
al. (2006)). En outre, des mesures de déplacement du NPN ont été effectuées avec le
102

Fluorescence relative (%)
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
tridécanal, le ligand ayant la plus forte affinité pour hOBP-2A. Une constante de dissociation
de 0,37 ± 0,17 µM a été mesurée, ce qui correspond à celle publiée (0,17 µM) (Tcatchoff et
al., 2006) (Figure 37).
A B
350 400 450 500
Longueur d’onde (nm)
Fluorescence relative (%)
C
100
75
50
25
0
100
75
50
25
0
0 5 10 15 20
Concentration en NPN (µM)
0 2 4 6 8 10
Concentration en odorant (µM)
Figure 37. Fixation du NPN et déplacement par le tridécanal pour hOBP-2ABac
(A) Spectres de fluorescence des différentes protéines à 2 µM pour une excitation à 337
nm et des concentrations croissantes en NPN, de 0 à 20 µM.
(B) Courbe de titration du NPN résultant de la mesure de la fluorescence à 400 nm en
fonction de la concentration en NPN.
(C) Mesures de déplacement du NPN par le tridécanal. Le déplacement a été mesuré sur
un échantillon de 2 µM de protéine et 3 µM de NPN à 400 nm pour une excitation de
337 nm pour des concentrations d’odorant entre 0 et 10 µM. La fluorescence du
complexe OBP-NPN à été normalisée à 100% en absence d’odorant.
103

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
Ces résultats ont montré que la protéine était fonctionnelle, c'est-à-dire que ces
propriétés sont identiques à celles de la protéine produite en levure. Par ailleurs, on a pu
réaliser l’étude du rôle de l’OBP sur la fonctionnalité des récepteurs olfactifs puisque
l’incubation de hOBP-2ABac ne produit pas de réponses artefactuelles des cellules exprimant
OR1G1 (voir Chapitre II). Ceci suggère que les éventuels contaminants ont bien été éliminés
lors de la purification. Après la construction des nouveaux mutants (V34K, A49K, V114K,
F51A et Y78A) dans le plasmide pGEX-2T, on n’a obtenu d’OBP mutée ou sauvage qu’en
mélange avec la GST. Le mélange de protéine n’a donc pas permis de tester l’impact des
mutations sur l’affinité de l’OBP humaine.
5. Modélisation moléculaire et arrimage moléculaire
Lors de la première étude sur hOBP-2A (Briand et al., 2002), le modèle ayant permis
de déterminer la position des résidus lysines dans la cavité de hOBP-2A avait été réalisé à
partir de la structure de l’allergène équin (Lascombe et al., 2000). Cependant la structure
cristallisée de la lipocaline de larme humaine, dont l’homologie de séquence avec hOBP-2A
est supérieure, a été publiée entre temps avec une résolution de 1,8 Å (Breustedt et al., 2005)
(code d’accès PDB : 1KKI). En effet, parmi les membres de la superfamille des lipocalines
dont la structure 3D est connue, la lipocaline de larme humaine comprend 44% d’identité avec
hOBP-2A. Cinquante modèles dérivés des coordonnées de cette lipocaline ont été générés.
Après un premier criblage des modèles produits selon des critères énergiques et géométriques,
un ensemble de dix modèles ont été présélectionnés et le modèle choisi final était celui avec le
plus faible niveau énergétique. Le diagramme de Ramachandran du modèle indique que tous
les résidus présentent des angles ϕ et ψ dans la gamme des valeurs autorisées. La cavité de
hOBP-2A se compose d'une cavité principale (dimension approximative 7x15 Å) additionné
d’un lobe latéral (diamètre 5 Å) pour un volume total de 541 Å 3 . La lysine 62 est située audessus
de la cavité et les lysines 82 et 112 à l'intérieur la molécule, leur groupe amine étant
orienté à l’intérieur de la cavité, comme 6 autres modèles parmi les 10 présélectionnés.
104

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
L'amarrage automatisé a donné un ensemble de conformations de l’undécanal dans la
cavité de hOBP-2A. Au sein des conformations les plus stables, il a été observé que le groupe
aldéhyde de l’undécanal était dans 90% des cas orienté vers la fonction amine de la lysine 112.
La distance entre l'oxygène de l'undécanal et l'hydrogène de l'amine était de 2.24 ± 0.76 Å, ce
qui est compatible avec la formation d’une liaison hydrogène entre ces deux fonctions
(Article joint, Figure 3B). Les résultats expérimentaux étant en accord avec les résultats de
modélisation, on peut considérer que la position des trois lysines dans le modèle est validée,
ce qui conforte les observations réalisées sur le modèle.
105

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
Les spécificités de hOBP-2A et de l’OBP-2 de rat, qui reconnaissent spécifiquement
les aldéhydes et les acides aliphatiques, présentent l’intérêt d’être relativement originales au
sein de la famille des OBP. Ainsi, dans un premier temps, nous nous sommes intéressé à
l’aspect biochimique de la spécificité de hOBP-2A. Le travail présenté ici avait pour objectif
de démontrer l’implication de certains acides aminés dans la spécificité d’interaction d’une
protéine humaine de liaison aux odorants, hOBP-2A, avec les aldéhydes et les acides
carboxyliques à longue chaîne. Le rôle clef des lysines dans ce type d’interaction a été décrit
dans la littérature, c’est pourquoi ces résidus ont été ciblés lors de notre étude. Par mutagenèse
dirigée, chacune des trois lysines sélectionnées d’après un premier modèle moléculaire (K62,
K82 et K112) a été substituée par une alanine, conduisant à l’obtention de 3 trois mutants
indépendants de hOBP-2A. Les constructions ont été effectuées dans un plasmide permettant
la sécrétion dans le milieu de culture par la levure P. pastoris. Les protéines produites ont été
purifiées et finement caractérisées par spectrométrie de masse et séquençage N-terminal.
Nous avons montré que les acides aminés K62 et K82 situés à l’entrée du calice ont un
faible impact sur la fixation des ligands. Ces résultats s’opposent à ceux décrits pour d’autres
lipocalines, qui soulignent l’importance des résidus des boucles dans la fixation des ligands.
Ainsi, Korndorfer et ses collaborateurs ont montré par mutagenèse l’importance des boucles
situées à l’entrée du calice dans l’interaction de ligands avec une lipocaline d’insecte la
« bilin-binding protein » (Korndorfer et al., 2003). Par des études cristallographiques, il a été
montré que la β-lactoglobuline bovine présentait une interaction avec l’acide palmitique par
l’intermédiaire de deux lysines (K60 et K69) situées elles aussi dans des boucles à l’entrée du
calice de la β-lactoglobuline (Wu et al., 1999). En revanche, la mutation de la lysine 112
affecte la fixation de certains ligands de l’OBP humaine. Les composés testés sur l’OBP
humaine ont pu être séparés en trois groupes :
- ceux à faible affinité ne comportant pas de fonction aldéhyde ou acide, les aldéhydes
cycliques, les petits aldéhydes et acides linéaires (respectivement 6 et 8 carbones).
- une catégorie de ligands ayant une bonne affinité, aldéhydes et acides linéaires entre 7
et 11 carbones dont la fixation est fortement affectée par la mutation K112A
106

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
- une autre série de ligands ayant une forte affinité, ligands à longue chaîne, 13 carbones
pour les aldéhydes et supérieurs à 14 carbones pour les acides aliphatiques, dont la
fixation n’est pas affectée par la mutation K112A.
Ainsi, on a pu mettre en évidence deux modes d’interaction des ligands dans la cavité
de hOBP-2A. Le premier ferait intervenir une liaison hydrogène entre la lysine en position
112 et la fonction aldéhyde des ligands de taille intermédiaire. Le second n’implique pas la
lysine 112. Il a été observé que hOBP-2A présente une affinité croissante pour les aldéhydes
de 6 à 13 carbones, excepté pour le dodécanal (12 carbones) qui présente une affinité plus
faible pour hOBP-2A (Briand et al., 2002) (article joint). On peut supposer que ce ligand est
trop encombrant pour interagir avec la lysine 112, sa fonction aldéhyde se positionne trop loin
de la lysine 112 pour créer une interaction. Il est encore trop petit pour interagir au même titre
que le tridécanal (aldéhyde de 13 carbones) ou les acides aliphatiques de 14 et 16 carbones.
Ainsi les interactions stabilisant les ligands de grandes tailles sont probablement des
interactions de type hydrophobe telles celles décrites pour les OBP de porc ou de bœuf où les
ligands prennent des positions opportunistes dans le site d’interaction (Vincent et al., 2000,
Vincent et al., 2004). On pourra envisager par la suite de vérifier ces hypothèses sur les
interactions ligands OBP en établissant des structures tridimensionnelles de hOBP-2A cocristallisée
avec des ligands, acides ou aldéhydes ayant des longueurs de chaîne variables.
Dans un second temps, à la lumière des résultats obtenus dans cette première partie, on
a commencé une étude sur le mode d’entrée et de stabilisation des ligands dans la cavité
hydrophobe de hOBP-2A. Pour cela, diverses mutations ont été envisagées. Une première
série de mutants (V34K, A49K, V114K) a été construite pour lesquels une lysine a été placée
au milieu de la cavité de hOBP-2A. L’objectif étant de mieux appréhender la question de la
taille dans la cavité de l’OBP. En effet pour ces mutants, la lysine étant dans une position
intermédiaire, on a supposé que la mutation pouvait augmenter l’affinité pour des ligands
(aldéhydes ou acides) de petite taille. Par ailleurs, des études de modélisation du trajet
d’entrée des ligands des OBP de porc et de rat ont montré l’implication de résidus très
conservés à l’entrée du calice de ces OBP (Hajjar et al., 2006, Golebiowski et al., 2007). Un
alignement (Article joint, Figure 3C) montre la conservation de ces résidus, chez l’homme,
la phénylalanine 51 et la tyrosine 78. De plus, la modélisation moléculaire révèle l’orientation
de ces résidus vers la cavité. Ainsi, ces deux résidus ont été substitués par des alanines dans
deux mutants indépendants (F51A et Y78A), afin de vérifier leur rôle dans l’interaction de
107

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
hOBP-2A avec ses ligands. Toutefois, cette approche n’a pu être menée à son terme. En effet,
les protéines produites à ce stade n’étaient pas suffisamment pures pour être testées en
fluorescence. Afin de valider nos hypothèses, il faudra résoudre le problème de la copurification
de la GST avec l’OBP. Si la résine ne retient plus la GST, on pourra envisager la
chromatographie d’exclusion, la GST et l’OBP ayant des masses différentes (45 kDa pour la
GST sous sa forme dimérique et 17,8 kDa pour hOBP-2A).
hOBP-2A .......... .......... LSFTLEE..E DITGTWYVKA
OBP-2 de rat MKSRLLTVLL LGLMAVLKAQ EAPPDDQ..E DFSGKWYTKA
Lipocaline de larme MKP.LLLAVS LGLIAALQAH HLLASDEEIQ DVSGTWYLKA
β-Lactoglobuline .......... .....LIVTQ TMKGLDI..Q KVAGTWYSLA
hOBP-2A MVVDKDFPED RR..PRKVSP VKVTALGGGN LEATFTFMRE
OBP-2 de rat TVCDRNHTDG KR..PMKVFP MTVTALEGGD LEVRITFRGK
Lipocaline de larme MTVDREFPEM NL..ES.VTP MTLTTLEGGN LEAKVTMLIS
β-Lactoglobuline MAASDISLLD AQSAPLRVYV EELKPTPEGD LEILLQKWEN
62 82
hOBP-2A DRCIQKKILM RKTEEPGKFS AYGG.RKLIY LQELPGTDDY
OBP-2 de rat GHCHLRRITM HKTDEPGKYT TFKG.KKTFY TKE.PVKDHY
Lipocaline de larme GRCQEVKAVL EKTDEPGKYT ADGG.KHVAY IIRSHVKDHY
β-Lactoglobuline GECAQKKIIA EKTKIPAVFK IDALNENKVL VLDTDYKKYL
112
hOBP-2A VFYSKDQRRG GLRYMGKLVG RNPNTNLEAL EEFKKLVQHK
OBP-2 de rat IFYIKGQRHG KSYLKGKLVG RDSKDNPEAM EEFKKFVKSK
Lipocaline de larme IFYCEGELHG KPVRGVKLVG RDPKNNLEAL EDFEKAAGAR
β-Lactoglobuline LFCMENSAEP EQSLACQCLV RTPEVDDEAL EKFDKALKAL
hOBP-2A GLSEEDIFMP LQAGSCVLEH .
OBP-2 de rat GFREENITVP ELLDECVPGS D
Lipocaline de larme GLSTESILIP RQSETCSPGS D
β-Lactoglobuline PMHIRLSFNP TQLEEQCHI. .
Figure 38. Alignement de quatre lipocalines connues pour interagir avec les
aldéhydes et acides gras
Alignement de hOBP-2A, l’OBP-2 de rat, lipocaline humaine de larme et de la β-
lactoglobuline bovine. Les résidus conservés par rapport à la séquence de l’OBP humaine
hOBP-2A sont surlignés en bleu. Les lysines 62, 82 et 112 de hOBP-2A ainsi que les lysines
correspondantes des autres protéines sont surlignées en jaune.
Trois autres lipocalines ont été décrites comme interagissant préférentiellement avec
les aldéhydes et les acides gras : l’OBP-2 de rat (Löbel et al., 2002), la lipocaline humaine de
larme (Gasymov et al., 2002) et la β-lactoglobuline bovine (Wu et al., 1999). Un alignement
108

CHAPITRE I – INTERACTIONS OBP-ODORANTS
de ces différentes lipocalines montre la conservation de la lysine 112 (Figure 38) pour la
lipocaline de larme et l’OBP-2 de rat. Ainsi, on peut supposer un mode de fixation des
aldéhydes comparable pour ces lipocalines. En revanche elle n’est pas conservée pour la β-
lactoglobuline qui fixe des acides aliphatiques à l’aide de lysines à l’entrée de la cavité
hydrophobe.
Les données de Löbel et al. (2002) indiquent que chacun des 3 sous types d’OBP de
rat possède un profil de liaison spécifique. Ces résultats, ainsi que l’existence de différents
sous types pour chaque espèce (Utsumi et al., 1999, Löbel et al., 2001, Scaloni et al., 2001)
laissent supposer que les OBP auraient un rôle de discrimination des odorants. Des mesures
d’interaction entre récepteurs olfactifs humains et une OBP de porc indique que l’OBP
interagit avec un des deux récepteurs testés. On peut donc émettre l’hypothèse d’un système
combinatoire faisant intervenir les sous types d’OBP sur certains récepteurs en fonction des
odorants mis en présence de l’organe olfactif. Des résultats obtenus chez l’insecte sont en
accord avec ces hypothèses (Groβe-Wilde et al., 2006, Groβe-Wilde et al., 2007).
Cependant, chez l’homme, un autre variant d’OBP à été mis en évidence (R. Ramoni,
communication personnelle). Ce variant, hOBP-2B, possède 95% d’homologie avec hOBP-
2A (dont la lysine 112 conservée) ce qui explique sa spécificité très proche de celle de hOBP-
2A (Cristiani 2005). Ainsi chez l’homme, le rôle discriminatoire des OBP est peu probable
même si on peut émettre l’hypothèse que ces deux OBP interviennent dans la discrimination
des aldéhydes pour lesquels l’homme a des seuils de détection faibles, parfois meilleurs que
ceux du chien ou du rat (Laska et al., 2000). Ce rôle pourrait être lié à une fonction de
transporteur des odorants dont l’étude est développée dans le deuxième chapitre.
109

CHAPITRE II – IMPACT DES OBP SUR LES RECEPTEURS
OLFACTIFS

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
Les mécanismes de l’olfaction mettent en jeu les trois partenaires, Odorant, RO et
OBP dont les interactions restent à élucider. Certains auteurs ont mis en évidence des relations
entre ces composés. Ainsi, l’activation des récepteurs olfactifs par des odorants a été mise en
évidence dans divers systèmes d’expression en absence de protéine de liaison (Raming et al.,
1993 ; Krautwurst et al., 1998, Hatt et al., 1999, Sanz et al., 2005). Par ailleurs, les OBP lient
les odorants avec des constantes de l’ordre du micromolaire, (Tegoni et al., 2000, Briand et
al., 2002, Löbel et al., 2002). Matarazzo et al. ont montré une interaction de l’OBP de porc et
du récepteur humain (OR17-210) avec une constante de dissociation de 9,5 nM, en absence de
ligand. Cette forte affinité ainsi que la présence d’OBP en forte concentration dans le mucus
suggèrent l’existence d’un complexe OBP-RO présent au niveau des cils olfactifs avant
l’activation par un odorant (Figure 39).
Figure 39. Représentation des interactions entre les OBP et ses partenaires
Les cadres bleus et jaunes schématisent les positions respectives du mucus olfactif et de la
membrane des neurones ofactifs exprimant les récepteurs olfactifs (RO). Les ordres de
grandeur des constantes de dissociation sont indiqués en rouge sur les flèches pleines
quand l’interaction est démontrée. Les pointillés indiquent des interactions hypothétiques
entre les partenaires ou des complexes démontrés.
Cette interaction semble dépendre du récepteur puisque la même OBP de porc ne se
fixe pas sur un autre récepteur humain, OR17-209. Ainsi les auteurs ont proposé un modèle
selon lequel les OBP seraient fixées sur certains récepteurs en absence de ligand. Parmi les
rôles évoqués pour les OBP, les données de liaison aux récepteurs semblent en accord avec
des fonctions de détoxication ou de désensibilisation des récepteurs déjà proposées
111

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
(Matarazzo et al., 2002). La formation d’un complexe odorant-OBP-RO reste toutefois à
démontrer dans le cas d’un rôle des OBP dans la transduction du signal. En effet, l’approche
employée par Matarazzo et al. ne permet pas d’évaluer l’impact de la présence d’OBP de porc
sur le fonctionnement du récepteur olfactif OR17-210 auquel elle est fixée.
Afin d’étudier le rôle fonctionnel des OBP dans le transport des odorants hydrophobes
vers les RO, on a cherché quel pouvait être l’impact de l’OBP sur l’activation des récepteurs
olfactifs. Un système d’application des odorants en mode vapeur mis au point au laboratoire a
permis d’établir le répertoire de deux récepteurs olfactifs humains, OR1G1 et OR52D1 (Sanz
et al., 2005). Dans cette étude, les odorants ont été appliqués en mode volatile. L’odorant est
libéré dans l’atmosphère par évaporation d’une goutte qui n’entre pas directement en contact
avec le milieu de culture des cellules HEK293co-exprimant le récepteur olfactif et la protéine
Gα16. Ce test appelé VOFA pour « Volatile Odorant Functionnal Assay » permet la libération
sous forme volatile de l’odorant dans le puit clos (Figure 40).
Figure 40. Représentation schématique du test fonctionnel VOFA
Les cellules HEK293 cultivées sur une plaque 96 puits sont chargées avec la sonde
fluorescente Fluo4 et couvertes par 60 µL (environ 1,8 mm) de tampon HH contenant ou
non de l’OBP. Une goutte de 1 µL d’odorant dilué dans du méthanol est déposée avec une
seringue Hamilton de 10 µL sous le plastique transparent couvrant le puits (goutte
pendante). Le méthanol et l’odorant s’évaporent dans l’espace de tête du puits conduisant à
une activation progressive des cellules suivie par un microscope à épifluorescence et
enregistrée par une caméra digitale.
112

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
L’odorant active progressivement les récepteurs, induisant une cascade de transduction
impliquant la protéine Gα16 et la voie de l’IP3, conduisant à la libération de calcium
intracellulaire. Ainsi, la voie classique d’activation des récepteurs olfactifs, impliquant une
protéine Gs (Golf) et activant la voie de l’adénylate cyclase, est détournée. Une sonde
fluorescente cytoplasmique, le Fluo-4, émet une fluorescence dont l’intensité varie en
fonction de la présence de calcium. Ainsi en chargeant les cellules exprimant les récepteurs et
la protéine Gα16 avec du Fluo-4, on peut suivre de façon indirecte l’activation du récepteur par
les odorants (Figure 41).
IP3
PLC
G α16
PIP2
Ca2+ Ca2+ R-IP3
Reticulum
endoplasmique
Ca2+ Ca2+ Odorant
β G α16
γ
GTP
GDP
Fluo-4
RO
Figure 41. Détournement de la cascade de transduction des récepteurs olfactifs
L’activation des récepteurs olfactifs exprimés dans la membrane des cellules HEK 293 induit
l’activation de la protéine Gα16 cotransfectée avec le récepteur OR1G1 qui active la
phospholipase C (PLC). La PLC dégrade le phosphatydilnositol-4,5-bisphosphate (PIP2) en
inositol triphosphate (IP3). L’IP3 agit sur des récepteurs canaux (R-IP3) qui permettent alors
la libération du calcium dans le cytoplasme. Les cations calcium sont fixés par la sonde
fluorescente Fluo4 qui émet de la fluorescence rapportant l’activation du récepteur.
113

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
En mesurant les variations de fluorescence au cours du temps lors de l’activation par
un odorant, on peut quantifier la capacité de l’odorant à activer le récepteur olfactif. Le mode
d’application en VOFA peut être considéré comme biomimétique puisque la monocouche de
cellules exprimant le récepteur est recouverte d’une couche de tampon hydrophile assimilable
au mucus olfactif que l’odorant hydrophobe doit atteindre pour jouer son rôle d’activateur.
Le récepteur OR1G1 présente un niveau d’activation plus important que le récepteur
OR52D1 (Sanz et al., 2005). La poursuite de son étude dans l’équipe a montré une forte
activation par le tridécanal (Sanz et al., Soumis). Ainsi, dans ces conditions biomimétiques
quel peut-être l’impact de la présence d’OBP humaine pour qui le tridécanal s’est aussi révélé
être le ligand ayant la plus forte affinité (Kdiss = 0,17µM) (Tcatchoff et al., 2006) ?
L’utilisation d’un ligand commun de l’OBP humaine et du récepteur olfactif humain OR1G1
devrait nous permettre de comprendre, en s’approchant au mieux des conditions
physiologiques, le rôle de l’OBP dans l’olfaction. Par ailleurs, le tridécanal est le ligand de
OR1G1 le plus hydrophobe, donc celui pour lequel l’effet de l’OBP devrait être le plus grand.
Ainsi, pour le tridécanal, la réponse calcique des cellules exprimant le récepteur devrait être
augmentée en présence d’OBP dans le cas où l’OBP aurait un rôle de transducteur ou de
transporteur puisque dans ce cas elle aiderait à solubiliser le tridécanal et à traverser la
barrière hydrophile du tampon. Si, au contraire, le rôle de l’OBP est de désactiver les
récepteurs ou de protéger l’épithélium, elle devrait piéger les molécules odorantes tout en
diminuant la réponse calcique des cellules exprimant le récepteur en présence d’OBP.
114

1. Culture cellulaire
I- MATERIEL ET METHODES
CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
Des cellules HEK293 ont été transformées de façon stable avec les plasmides
pcDNA3.1/HygroG16 et pCMVRhoTagOR1G1 comme décrits précédemment (Sanz et al.,
2005). Ces plasmides permettent l’expression respectivement de la sous unité Gα16 et du
récepteur OR1G1 sous une forme chimérique comportant les 36 acides aminés N-terminaux
de la rhodopsine bovine, favorisant l’adressage du récepteur à la membrane ainsi que les 10
acides aminés de l’épitope c-myc permettant une reconnaissance des récepteurs par des
anticorps.
Les cellules HEK293 exprimant de façon stable la sous unité Gα16 et OR1G1 ont été
cultivées dans du MEM (Minimum Essential Medium) (GIBCO, Invitrogen Corporation)
supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (Eurobio), 2 mM L-Glutamine (GIBCO), des
acides aminés non essentiels de Eagle (Eurobio), ainsi que les antibiotiques hygromycine et
néomycine (Sigma) respectivement à 300 µg/mL et 1 mg/mL. Les cultures ont été réalisées à
37°C dans un incubateur humidifié sous 5% de CO2.
2. Imagerie calcique
Les cellules ont été ensemencées dans une plaque 96 puits (µClear) traitées à la polylysine
à une densité de 1x10 5 cellules par puits dans un volume de 100 µL. Vingt-quatre
heures après l’ensemencement, les cellules ont été lavées une fois avec une solution saline de
tampon Hanks (Eurobio) supplémenté par de l’HEPES (acide sulfonique n-2hydroxyéthylpipérazine-n-2-éthane)
20 mM à pH 7,2 (tampon Hanks Hépès ou HH). Pour ce
lavage, 60 µL du milieu de culture ont été prélevés, 100 µL de HH ajoutés puis éliminés. Les
cellules ont ensuite été incubées 30 minutes à 37°C avec 2,5 µM du précurseur de la sonde
calcium dépendante, l’acétoxyméthyl ester de Fluo-4 (Molecular Probes) dans un milieu HH
additionné de 0,025% (m/v) d’acide pluronique et de 1% (m/v) d’albumine sérique bovine
(volume dans le puit de 140 µL). Un nouveau rinçage a été réalisé afin d’éliminer la sonde en
excès : 100 µL de tampon ont été retirés de chaque puits, 100 µL de HH ajoutés puis a
nouveau éliminés. On a ensuite ajouté 20 µL de HH ou de HH contenant de l’OBP à une
115

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
concentration déterminée, de façon à obtenir un volume final de 60 µL. Les cellules ont
ensuite été incubées 10 minutes à 37°C puis 10 minutes à 28°C à l’obscurité. L’imagerie
calcique a été réalisée à 28°C en utilisant un microscope inversé à épifluorescence (CK40
Olympus) équipé d’une caméra numérique (ORCA-ER, Hamamatsu Photonics). Les tests
d’activation ont été réalisés en utilisant la technique de VOFA qui permet de stimuler les
cellules avec des odorants en phase vapeur (Sanz et al., 2005). Les puits contenant les cellules
incubées en présence ou non d’OBP ont été recouverts d’un film adhésif transparent
préalablement ventilé afin d’éliminer les molécules volatiles contaminantes. Les odorants ont
été dilués dans du méthanol 100% à des concentrations allant de 1 à 100 µM. Le film
plastique à été percé avec une pointe de seringue et 1 µL d’odorant a été déposé avec une
seringue Hamilton de 10 µL dans la partie supérieure des puits avant de reboucher le trou
dans le film adhésif avec de la graisse inodore (Viewesal, Greiner Bio-one). Le méthanol
s’évapore librement dans le puits conduisant à une activation progressive des cellules.
La capacité des cellules à produire une réponse calcique (témoin positif) a été évaluée
en appliquant de l’ATP à 100 µM qui stimule un récepteur purinergique intrinsèque aux
cellules HEK293. Ce récepteur active la voie de l’IP3 par des protéines G endogènes
conduisant à la libération de calcium intracellulaire. De même, la proportion de cellules
exprimant la protéine Gα16 a été évaluée par analyse de la réponse calcique d’un récepteur β2adrénergique
endogène activé par 10 µM d’isoprotérénol et couplé à cette protéine G
(Krautwurst et al., 1998). Les odorants ont été testés sur une lignée cellulaire de HEK293
transfectées avec le plasmide pcDNA3.1/HygroG16 seul. Ce témoin négatif permet de vérifier
l’absence de réponse en absence de récepteur olfactif. De plus on s’est assuré que les
concentrations d’odorant utilisées n’ont pas d’impact sur les cellules HEK293. En appliquant
du MeOH 100% en VOFA, on a vérifié qu’il n’induisait pas de réponses calciques sur les
cellules HEK293 exprimant le récepteur OR1G1 et la protéine Gα16.
Les variations de fluorescence ont été enregistrées pour une excitation de 485 nm et à
une longueur d’onde d’émission de 510 nm, à un grossissement de 10x, ce qui permet de voir
environ 400 cellules dans le champ. Juste après l’introduction de l’odorant, une image est
enregistrée toutes les secondes pendant 10 minutes. Le logiciel SimplePCI (Hamamatsu,
Compix) a été utilisé pour l’acquisition et le traitement des données.
116

3. Traitement des données
CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
Les films obtenus permettent de sélectionner visuellement les cellules ayant une
réponse calcique lors de l’expérimentation. Pour chaque cellule isolée, le signal calcique a été
exprimé comme une variation de fluorescence au cours du temps : ∆F/F = (F-F0)/F0 avec F
l’intensité de fluorescence à un instant et F0 l’intensité avant stimulation. On n’a compté
comme cellules activées que les celles présentant une variation de fluorescence supérieure à
deux fois la fluorescence initiale (Sanz et al., 2005). Deux approches ont été menées en
parallèle sur les enregistrements : tout d’abord en comptant le nombre de cellules activées
dans chaque condition, ce qui permet d’évaluer le niveau d’activation du récepteur. En effet,
les amplitudes de variation de fluorescence sont corrélées au nombre de cellules activée (Li et
al., 2002, Sanz et al., 2005). Par ailleurs, l’absence de réponse synchrone empêche de mesurer
la variation moyenne de fluorescence sur le puit. On a ensuite réalisé des cinétiques des
activations, en comptant le nombre de cellules activées dans un intervalle de temps au cours
de l’enregistrement.
4. Production d’OBP humaine
Les résultats des premières expérimentations de VOFA avec hOBP-2A produite en
levure ont conduit à émettre l’hypothèse d’une copurification de la protéine avec des
composés générant des flux calciques lors de l’incubation avec les cellules HEK293
exprimant le récepteur OR1G1 et la protéine Gα16. Des constructions ont donc été réalisées
afin de produire de l’OBP comportant une étiquette qui permette de l’immobiliser lors d’une
chromatographie d’affinité. Après fixation sur un support, la protéine peut être lavée par
divers solutions ou détergents faibles qui permettent de séparer la protéine et les molécules
éventuellement associées.
1. hOBP-2A fusionné à une queue poly histidine
1.1. Construction des plasmides
Dans un premier temps, on a envisagé de produire l’OBP en levure fusionnée à une
queue de poly histidines, en position N ou en C-terminale. Deux PCR ont été réalisées dans
117

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
50 µL en utilisant 50 ng du plasmide pGAPZα-hOBP-2A comme matrice, 10 pmol des
amorces 3’AOX1 et hOBP-2A-HT-Nter ou 5’Fα et hOBP-2A-HT-Cter (Tableau 1), 10 mM
de chaque dNTP, 0,75 unités de Pfu polymérase (Promega) 10% (v/v) de tampon Taq
polymérase 10X. Le programme de PCR était composé de 30 cycles comprenant 10 secondes
à 98°C, 30 secondes à 50°C et 30 secondes à 72°C. Ces deux PCR permettent d’ajouter six
histidines respectivement en position N et C-terminale de la séquence de hOBP-2A. Les
fragments issus de ces PCR ainsi que le plasmide pGAPZα-hOBP-2A ont été digérés par les
enzymes XhoI et EcoRI (Eurogentec) à 10 unités/µg d’ADN à 37°C pendant 2 heures. Après
purification du plasmide pGAPZα linéarisé et des fragments de PCR digérés, la ligase du
phage T4 (Eurogentec) a été utilisée pour intégrer les séquences codantes des différentes OBP
au niveau du site de restriction XhoI en 5’ et EcoRI en 3’. Elles ont été insérées en phase avec
la séquence du prépropeptide du facteur α. Les ligations ont été effectuées à 20°C pendant 2
heures en présence d’une unité de ligase pour 20 µL de mélange de ligation. Les plasmides
obtenus ont été nommés pGAPZα-hOBP-2AHT-Cter et pGAPZα-hOBP-2AHT-Nter.
1.2. Production en levure
Les plasmides construits permettent la production en levure P. pastoris de hOBP-2A
fusionnée à une queue de poly histidine en position N ou C-terminale. La transformation des
levures et la sélection de clones producteurs ont été réalisées comme décrit dans la première
partie de ce travail.
2. Fusion GST
Un autre mode de production a été mis en place, déjà détaillé dans le chapitre I.
Brièvement, la production de protéines de fusion GST-hOBP-2A a été réalisée en bactérie
sous forme soluble. La fusion GST permet une purification par chromatographie d’affinité sur
du glutathion immobilisé. Après divers lavages permettant l’élimination de composés pouvant
s’associer à la protéine, la fusion est clivée par la protéase TEV dont le site spécifique a été
intégré entre les séquences de la GST et de l’OBP. Après élimination de la GST et de la TEV
comportant une queue poly histidine, par chromatographies d’affinité sur du glutathion et du
cobalt immobilisé respectivement, on obtient une protéine purifiée nommée hOBP-2ABac.
118

II- RESULTATS
1. Influence de hOBP-2A sur le niveau d’activation de OR1G1
CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
Lors de premières expériences, on a pu observer que l’application d’OBP humaine
hOBP-2A produite en levure Pichia pastoris conduisait à des réponses anormales des cellules
exprimant OR1G1. Les mesures de fluorescence suivant les flux calciques montraient des
oscillations importantes alors qu’aucun ligand n’était appliqué, pour des concentrations
d’OBP variant entre 2 et 20 µM. Toutefois, ces oscillations sont absentes quand l’OBP est
incubée en présence de cellules HEK293 exprimant uniquement la protéine Gα16 ainsi que lors
d’incubation en présence du mutant K112A de hOBP-2A. Or ce mutant étudié précédemment
(Tcatchoff et al., 2006) avait révélé une perte de capacité de fixation pour certains composés,
interagissant avec l’OBP sauvage, a savoir des aldéhydes et des acides aliphatiques. La
purification des OBP humaines produites en levure Pichia pastoris étant réalisée dans des
conditions où la protéine peut être co-purifiée avec d’éventuels contaminants (Briand et al.,
2002) (Tcatchoff et al., 2006), on peut émettre l’hypothèse que certains composés issus de la
levure peuvent être co-purifiés avec la forme sauvage de l’OBP et non avec la forme mutée et
activer le récepteur OR1G1 de façon atypique. Ce type de co-purification a déjà été montré
dans le cas d’expression d’autres protéines par la levure Pichia pastoris. Par exemple, de
l’ergostérol a été identifié lors de la production d’élicitines (protéines mycéliennes) dans le
même système (Boissy et al., 1999). En outre, étant donnée la sensibilité importante des
récepteurs olfactifs, on peut supposer que même à l’état de trace, des composés peuvent
induire l’activation des récepteurs olfactifs. On a donc voulu améliorer la pureté de l’OBP
humaine utilisée en introduisant une étape de purification par affinité. Cette étape permet
d’immobiliser la protéine sur une colonne et de réaliser divers lavages qui permettent
d’éliminer les contaminants issus de la production.
2. Modification du mode de production de hOBP-2A
1. Stratégies
119

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
Les constructions permettant une production en levure P. pastoris avec une queue de
polyhistidines en position N ou C-terminale n’ont pas permis d’obtenir de clone producteur
d’OBP malgré des tests sur plus de 50 clones pour chacune des constructions. Des cas de
toxicité et de faible production ont déjà été décrits lors de productions en levure de protéines
associées à une queue de poly histidines en position N-terminale (Muraki, 2006). La conduite
en parallèle d’une stratégie de production en bactérie semblant plus prometteuse nous a amené
à abandonner la voie de la production en levure.
Les résultats obtenus lors de la production en bactérie sont détaillés dans le premier
chapitre. Brièvement : l’OBP humaine a été produite en fusion avec la GST qui assure
l’immobilisation sur une colonne de glutathion, ce qui permet de réaliser une dénaturation
ménagée de la protéine et d’éliminer des contaminants éventuels. La purification après clivage
par la protéase TEV a permis d’obtenir une protéine nommée hOBP-2ABac migrant à la taille
attendue sur électrophorèse dénaturante (Figure 28).
2. Validation du nouveau mode de production
Le spectre de masse réalisé par spectrométrie de masse MALDI-TOF indique une
masse de 17803,24 Da ce qui correspond à la masse attendue (17841,4 Da), révélant l’absence
de protéolyse. Cette protéine a un spectre de fluorescence du tryptophane comparable à celui
de l’OBP produite en levure indiquant un repliement similaire de ces protéines dans les deux
modes de production (Figure 36). Par ailleurs, des mesures de fixation du NPN ont été
réalisées, ce qui a permis d’obtenir une constante de dissociation de 2,58 ± 0,92 µM. Cette
valeur est comparable aux valeurs publiées sur l’OBP produite en levure (3,33 ou 2,24 µM
respectivement pour Briand et al. (2002) et Tcatchoff et al. (2006) (publication jointe). En
outre des mesures de déplacement du NPN ont été effectuées avec le tridécanal, le ligand
ayant la plus forte affinité pour hOBP-2A. Une constante de dissociation de 0,37 ± 0,17 µM a
été mesurée proche de celle obtenue pour l’OBP humaine produite en levure P. pastoris (0,17
µM) (publication jointe) (Figure 37). Ces résultats ont montré que la protéine était
fonctionnelle et utilisable pour l’étude du rôle de l’OBP sur la fonctionnalité des récepteurs
olfactifs. Les premiers tests d’imagerie calcique à diverses concentrations d’OBP ont montré
que hOBP-2ABac ne présentait pas les artefacts observés avec hOBP-2A produite en levure.
En effet, la fluorescence des cellules incubées en présence de cette OBP ne varie pas en
120

∆F/F0
80
40
0
120
80
40
0
80
40
CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
absence de ligand, comme c’était le cas lors de l’incubation en présence de l’OBP humaine
produite en levure.
3. Validation de l’approche en VOFA
1. Contrôles positifs
Dans un premier temps, la capacité des cellules HEK293 à générer des réponses
calciques a été testée par mesure de l’activation calcique en présence d’ATP. L’ATP agit sur
un récepteur purinergique intrinsèque aux cellules HEK293, couplé à l’IP3 et activant la
libération de calcium par le réticulum endoplasmique. On a pu observer comme cela a été
montré précédemment (Sanz et al., 2005), que près de 90% des cellules observées au
microscope présentent une réponse calcique (Figure 42) lors d’une stimulation avec de l’ATP.
Le champ du microscope couvrant environ 400 cellules, on considère les observations comme
représentatives de l’activité des cellules dans le puits.
A - Isoprotérénol
B - ATP
C - Méthanol
0
0 200 400
Temps (s)
600
Figure 42. Contrôles de la viabilité des cellules
HEK293 et de leur capacité à répondre
Mesures des variations de fluorescence de cellules
HEK293 exprimant le récepteur OR1G1 et la sous-unité
Gα16 en présence d’isoprotérénol 10 µM (A), d’ATP 100
µM (B) ou de 1 µL de méthanol 100% appliqué en mode
vapeur (C). Les réponses calciques ont été enregistrées
pendant 10 minutes, excepté pour l’isoprotérénol
enregistré pendant 3 minutes. Les tracés sont présentés
en variation d’intensité de fluorescence (∆F/F0) et
correspondent à l’enregistrement de 10 cellules ayant
une réponse représentative. Pour l’isoprotérénol et l’ATP,
environ 90% des cellules montrent une réponse calcique
alors que le méthanol n’induit de réponse que pour une
dizaine de cellules sur 400 cellules dans un champ du
microscope.
121

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
Dans les cellules HEK293, il a été montré que l’activation de la voie calcique par
certains RO pouvait dépendre de la cotransfection de la sous unité Gα16 (Krautwurst et al.,
1998), ce qui est notamment le cas pour OR1G1 (Sanz et al., 2005). Des récepteurs
adrénergiques endogènes sont couplés à des protéines Gα exprimées par les cellules HEK293.
L’expression hétérologue de la protéine Gα16 est vérifiée par la mesure des réponses calciques
en présence de l’isoprotérénol, un agoniste de ces récepteurs. Au cours de notre étude on a pu
observer que 90% des cellules répondant à l’ATP répondent aussi à l’isoprotérénol ce qui
indique qu’une majorité des cellules expriment cette sous unité de protéine G et que les
cellules sont donc capables de générer des réponses calciques par la voie de l’IP3.
2. Contrôle négatif
On s’est assuré que le méthanol solubilisant les odorants n’induisait pas de réponse
calcique des cellules HEK293 exprimant OR1G1 et la protéine Gα16. En effet, lorsque il est
appliqué en mode vapeur au dessus des cellules exprimant les récepteurs olfactifs il n’y a pas
de réponses calciques de celles-ci, en présence ou en absence d’OBP (Figure 42). Seulement
une dizaine de cellules sont activées dans un champ comprenant approximativement 400
cellules, ce qui indique que les fluctuations de calcium intracellulaire observées par la suite
sont bien dues à l’application d’odorant dans le puits.
3. Effet des OBP sur le seuil d’activation du récepteur OR1G1
On a fait l’hypothèse que la présence d’OBP dans le mucus olfactif favorise
l’activation des récepteurs olfactifs. En effet, l’équilibre entre les deux phases, vapeur ou
liquide, peut être déplacé vers la phase soluble du fait de la présence d’OBP. Ainsi, dans un
espace fermé avec une quantité d’odorant fixée, la fraction d’odorant en solution est plus
importante quand la solution contient de l’OBP (Figure 43). Il a été montré que deux
lipocalines en solution, l’OBP de rat et l’aphrodisine de hamster, étaient capable de fixer des
ligands dans une phase gazeuse lors de tests de liaisons (Briand et al., 2000a, Briand et al.,
2000b, Briand et al., 2004). Sur la base de ce raisonnement, on peut poser l’hypothèse que
l’OBP facilite l’accès de l’odorant aux récepteurs en le solubilisant. Afin de le vérifier, on a
effectué des enregistrements des variations de l’activité calcique des cellules exprimant
OR1G1 en présence de concentrations croissantes de tridécanal (1, 10 et 100 µM), avec ou
122

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
sans OBP (2 µM). Chez l’homme, une étude protéomique du mucus (Debat et al., 2007)
semble indiquer que la concentration en OBP est plus faible que pour d’autres mammifères où
elle est de l’ordre du millimolaire (Pevsner et al., 1986, Lazar et al., 2002). De plus, l’étude
des interactions entre l’OBP de porc et le récepteur OR17-210 a permis de calculer une
constante de dissociation de l’ordre du nanomolaire, indiquant le fonctionnement possible de
l’OBP à des concentrations de l’ordre du micromolaire. C’est pourquoi les mesures réalisées
ici ont été effectuées avec des concentrations en OBP de cet ordre de grandeur.
Figure 43. Répartition de l’odorant dans les phases vapeur ou aqueuse au cours
du VOFA avec ou sans OBP
Les cellules HEK293 cultivées sur une plaque 96 puits sont chargées avec la sonde
fluorescente Fluo4 et couvertes par 60µL de tampon HH contenant ou non de l’OBP.
L’odorant s’évapore dans le puits et un équilibre se crée entre les deux phases, vapeur ou
aqueuse. En présence d’OBP (à droite), l’OBP, en fixant une partie des molécules
odorantes en solution, déplace l’équilibre, augmentant la proportion d’odorant dans la phase
liquide.
En absence d’OBP, on a pu observer comme déjà décrit (Sanz et al., 2005) que
l’intensité de la réponse calcique des cellules augmente avec la dose d’odorant appliquée, ce
qui correspond à une réponse dose dépendante du récepteur OR1G1 au tridécanal. De plus, la
réponse est d’autant plus précoce que la dose d’odorant est forte. On a observé des réponses
calciques similaires des cellules dans les mêmes conditions en présence de 2 µM de hOBP-2A
(Figure 44).
123

∆F/F0
100
75
50
25
0
100
75
50
25
0
100
75
50
25
0
Sans hOBP-2ABac
1 µM 1 µM
10 µM 10 µM
100 µM 100 µM
0 200 400 600
Temps (s)
CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
Avec hOBP-2ABac 2µM
0 200 400 600
Temps (s)
Figure 44. Influence de l’OBP sur la réponse calcique des cellules soumises à
différentes concentrations d’odorant
Mesure des variations de fluorescence de cellules HEK293 exprimant le récepteur OR1G1
et la sous unité Gα16 en présence de quantités croissantes de tridécanal (1, 10 et 100 µM)
en absence (à gauche) et en présence de hOBP-2ABac (à droite). Les réponses calciques
ont été enregistrées pendant 10 minutes. Les courbes représentent les variations d’intensité
de fluorescence (∆F/F0) de 10 cellules ayant une réponse calcique représentative.
Le comptage des cellules activées résumé dans la figure 45, montre que le nombre de
cellules activées augmente avec la concentration en tridécanal de la même manière en
présence ou en absence d’OBP. Le nombre de cellules activées est similaire avec et sans OBP
quelle que soit la concentration en ligand (1, 10 ou 100 µM). Ainsi, la présence de hOBP-2A
n’affecte pas, dans nos conditions le seuil de réponse du récepteur OR1G1 au tridécanal.
124

Nombre de cellules
activées
100
75
50
25
0
9 3
MeOH 1µM 10µM 100µM
CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
Sans OBP
Avec OBP
Figure 45. Influence de la concentration en odorant sur le nombre de cellules
activées avec ou sans hOBP-2ABac
Décompte du nombre de cellules activées en présence de quantités croissantes de
tridécanal (0, 1, 10 et 100 µM) avec ou sans hOBP-2ABac (2µM). Dans un champ du
microscope (grossissement x10) comptabilisant environ 400 cellules, une cellule a été
considérée comme activée si, au cours des 10 minutes d’enregistrement, la fluorescence
observée augmente au moins de deux fois par rapport à la fluorescence initiale. Les barres
verticales indiquent les écarts-types obtenus. Le nombre d’enregistrements analysés est
indiqué au dessus de chaque barre de l’histogramme.
4. Effet de la concentration en OBP
3
On a voulu vérifier si un accroissement de la concentration d’OBP pouvait avoir un
impact sur l’activité calcique des cellules exprimant OR1G1. On a donc effectué des
enregistrements de 10 minutes en imagerie calcique des cellules exprimant le récepteur en
présence de concentrations variables de hOBP-2ABac et pour une même concentration de
tridécanal (10 µM). Pour des concentrations d’OBP entre 2 et 17 µM, on a obtenu entre 18 et
29 cellules qui répondent contre 32 pour une activation en absence d’OBP. Le nombre de
cellules répondant à cette dose de tridécanal n’est donc pas modifié significativement quelle
que soit la quantité de hOBP-2A (Figure 46). Ainsi hOBP-2ABac ne semble pas avoir un effet
sur l’intensité de l’activation du récepteur OR1G1 pour les concentrations de tridécanal
testées.
2
17
10
2
2
125

Nombre de cellules
activées
60
40
20
0
17
CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
0 µM
2 µM
4 µM
8 µM
17 µM
Figure 46. Influence de la concentration en OBP sur le nombre de cellules
activées
Décompte du nombre de cellules activées en présence de quantités croissantes de hOBP-
2ABac pour une application de 10 µM de tridécanal en VOFA. Les cellules sont
comptabilisées de la même façon que pour la figure 45. Les différentes concentrations de
hOBP-2A sont indiquées à droite du graphique. Les barres verticales indiquent les écart
types obtenus. Le nombre d’enregistrements analysés pour chaque concentration en OBP
est indiqué au dessus de chaque barre de l’histogramme.
On a observé que des cellules répondent plusieurs fois en présence d’odorant lors d’un
enregistrement de dix minutes. Ces réponses multiples sont interprétées comme une
désactivation des récepteurs puis une réactivation conduisant à des réponses calciques
successives. Une des fonctions proposées pour les OBP est d’empêcher leur saturation pour
permettre leur éventuelle réactivation (Pelosi, 1996). On a donc cherché si la présence d’OBP
affectait le nombre de cellules présentant des réponses multiples. Lors des 17 enregistrements
de l’activation des cellules exprimant OR1G1 par 10 µM de tridécanal, on a pu observer que
16 ± 11% des cellules activées répondent plus d’une fois à l’odorant. En présence d’OBP à 2,
4, 8 et 17µM, respectivement 12 ± 7%, 13 ± 2%, 6 ± 8% et 14 ± 12% des cellules activées
ont montré une réponse multiple, indiquant que l’OBP humaine ne semble pas agir sur la
désensibilisation ou la réactivation du récepteur olfactif OR1G1.
5. Aspect cinétique de l’action de hOBP-2A sur OR1G1
10
2
Le nombre de cellules activées restant inchangé en fonction de la présence ou non
d’OBP humaine, on s’est demandé s’il ne pouvait pas y avoir une variation d’ordre cinétique,
c'est-à-dire une réponse plus (ou moins) rapide des cellules incubées en présence d’OBP. En
6
5
126

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
effet, si l’OBP déplace l’équilibre entre la phase vapeur et la phase aqueuse (Figure 43), alors
les odorants atteignent plus rapidement les récepteurs qui répondent donc plus vite. On a donc
effectué le rapport du nombre de cellules activées à différents intervalles de temps sur le
nombre total de cellules activées dans un champ du microscope pendant 10 minutes pour des
activations avec 10 µM de tridécanal. Cela permet d’observer l’augmentation progressive du
nombre de cellules s’activant en présence d’odorant au cours de l’enregistrement. Cette
augmentation déjà observée pour les ligands de OR1G1 (Sanz et al., 2005) est liée à la
solubilisation progressive de l’odorant atteignant progressivement les récepteurs à la surface
des cellules.
En comparant les cinétiques d’activation pour des concentrations en tridécanal de 1,
10 et 100 µM, on observe bien que les cellules répondent plus tôt en présence de
concentration croissante en odorant, c'est-à-dire que l’activation intervient d’autant plus tôt
que la concentration en odorant est forte (Figure 47). Les profils cinétiques restent similaires
en présence d’OBP à 2µM.
127

Pourcentage de cellules activées (%)
Pourcentage de cellules activées (%)
60
50
40
30
20
10
60
50
40
30
20
10
0
0
2
A
3
0 à 100 100 à 200 200 à 300 300 à 400 400 à 500 500 à 600
B
17 2
10
2
Sans OBP
Avec OBP
Temps (s)
0 à 100 100 à 200 200 à 300 300 à 400 400 à 500 500 à 600
Temps (s)
CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
Tridécanal
1 µM
10 µM
100 µM
Tridécanal
1 µM
10 µM
100 µM
Figure 47. Cinétiques d’activation du récepteur OR1G1 pour différentes
concentrations en tridécanal
Pourcentage de cellules activées dans un intervalle de temps (en secondes) par rapport au
nombre total de cellules activées au cours d’enregistrements de 10 minutes, sans (A) ou
avec hOBP-2ABac (2µM) (B). Les cellules exprimant OR1G1 ont été activées par 1, 10 ou
100 µM de tridécanal appliqué en VOFA. Les barres verticales indiquent les écarts-types
obtenus. Le nombre d’enregistrements analysés est indiqué au dessus des barres de
l’histogramme, au niveau du premier intervalle de temps pour chaque concentration en
odorant.
On a ensuite voulu comparer les proportions de cellules activées en fonction du temps
avec et sans OBP à 2µM. Pour les trois concentration en ligand testées (1, 10 et 100µM), on
128

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
observe que la proportion de cellules activées est comparable avec et sans OBP pour tous les
intervalles de temps (Figure 48).
Pourcentage de cellules
activées (%)
Pourcentage de cellules
activées (%)
Pourcentage de cellules
activées (%)
60
50
40
30
20
10
0
60
50
40
30
20
10
0
60
50
40
30
20
10
0
A
3
B
1 µM Tridécanal
0 à 100 100 à 200 200 à 300 300 à 400 400 à 500 500 à 600
17
2
10 µM Tridécanal
0 à 100 100 à 200 200 à 300 300 à 400 400 à 500 500 à 600
C
3
2
2
100 µM Tridécanal
0 à 100 100 à 200 200 à 300 300 à 400 400 à 500 500 à 600
Temps (s)
Sans OBP
Avec OBP
Sans OBP
Avec OBP
Sans OBP
Avec OBP
Figure 48. Effet cinétique de l’OBP sur l’activation de OR1G1 à différentes
concentrations de tridécanal
Pourcentage de cellules activées dans un intervalle de temps (en secondes) par rapport au
nombre total de cellules activées au cours d’enregistrements de 10 minutes, en absence ou
en présence de hOBP-2ABac (2 µM). Les cellules exprimant OR1G1 sont activées par 1, 10
ou 100 µM de tridécanal, respectivement (A), (B) et (C). Les barres verticales indiquent les
écarts-types obtenus. Le nombre d’enregistrements analysés pour chaque condition est
indiqué au dessus des barres de l’histogramme, au niveau du premier intervalle de temps.
129

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
Ainsi, à 2µM, l’hOBP-2ABac n’induit pas de variation dans la précocité de la réponse
de OR1G1 au tridécanal. Cet aspect cinétique a été vérifié pour diverses concentrations en
OBP (4, 8 et 17µM). Pour chaque intervalle de temps, la proportion de cellules activées est
comparable quelle que soit la concentration en hOBP-2ABac (Figure 49) . Ces résultats
indiquent que l’OBP n’a pas d’impact cinétique sur l’activation du récepteur OR1G1 pour les
concentrations en tridécanal testées.
Pourcentage de cellules activées (%)
60
50
40
30
20
10
0
17
10
5
6
2
0 à 100 100 à 200 200 à 300 300 à 400 400 à 500 500 à 600
Temps (s)
OBP 0 µM
OBP 2 µM
OBP 4 µM
OBP 8 µM
OBP 17 µM
Figure 49. Effet de la concentration en OBP sur la cinétique d’activation du
récepteur OR1G1
Pourcentage de cellules activées dans un intervalle de temps (en secondes) par rapport au
nombre total de cellules activées par 10 µM de tridécanal au cours d’enregistrement de 10
minutes, pour différentes concentration de hOBP-2ABac. Les barres verticales indiquent les
écart types obtenus. Le nombre d’enregistrements analysés est indiqué au dessus des
barres de l’histogramme, au niveau du premier intervalle de temps.
130

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
Un des rôles supposés des OBP est de prendre en charge les odorants et les convoyer
vers les récepteurs olfactifs (Pelosi, 1996). Ainsi, l’OBP interviendrait comme transporteur
des odorants hydrophobes en les solubilisant dans le mucus hydrophile. Une autre fonction
associée serait d’empêcher la saturation des récepteurs olfactifs en piégeant les molécules
odorantes. L’OBP aurait en outre un rôle de transducteur du signal olfactif dans le cas ou
certains récepteurs pourraient reconnaître les complexes OBP-odorant ou l’odorant seul
relargué par l’OBP à son niveau.
Dans un système d’imagerie calcique où l’odorant est appliqué en mode vapeur
(VOFA), ce qui a permis de déterminer le répertoire d’interaction du récepteur OR1G1 (Sanz
et al., 2005), on s’est demandé quel pouvait être l’impact de la présence d’OBP humaine
hOBP-2A sur la fonctionnalité du récepteur OR1G1. Cette approche présente l’avantage de
mimer les conditions physiologiques auxquelles le système olfactif est soumis. En effet, les
OBP sont présentes dans un tampon qui, à l’instar du mucus olfactif, couvre les cellules qui
expriment le récepteur olfactif.
Dans un premier temps il a fallu changer le mode de production de hOBP-2A. La
production en bactérie a permis d’obtenir une protéine bien conformée et fonctionnelle. Cette
protéine ne génère pas de réponse des cellules exprimant le récepteur OR1G1 en absence de
ligand indiquant qu’elle n’est pas contaminée par des composés co-purifiés comme celle
produite en levure. Les mesures d’activation en présence et en absence de hOBP-2ABac
produite en bactérie ont permis de montrer qu’elle n’a pas d’impact sur l’activation du
récepteur OR1G1 par le tridécanal : le seuil d’activation n’est pas modifié par la présence
d’OBP à diverses concentrations. La concentration en OBP dans le mucus humain n’est pas
connue. Toutefois une approche de protéomique réalisée au laboratoire (Debat et al., 2007)
suggère des concentrations relativement faibles comparées aux valeurs de l’ordre du
millimolaire chez d’autres mammifères (Getchell et al., 1984). Les concentrations testées,
entre 2 et 17 µM, sont normalement suffisantes pour envisager une interaction comme dans le
cas de l’OBP de porc et le récepteur OR-17-210 (Matarazzo et al., 2002). De plus, nous
n’avons pas observé de modification de l’intensité ou de la cinétique des réponses en présence
d’OBP. En outre, hOBP-2A n’affecte pas la désensibilisation ou la réactivation du récepteur
olfactif OR1G1 dans les conditions testées. Ainsi, nous avons montré que l’OBP humaine,
131

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
dans notre système et pour les conditions testées, n’avait pas d’effet sur la réponse du
récepteur OR1G1. Il faut noter cependant que l’épaisseur de tampon utilisée est d’environ 1,8
mm soit près de 60 fois plus que le mucus olfactif dont l’épaisseur a été estimée à 30 µm
(Getchell et al., 1984). L’aspect biomimétique du système est donc relativement
limité d’autant que cette épaisseur de tampon ne peut pas être diminuée. En effet, lors de la
préparation des cellules, le volume dans le puits est au minimum à 40 µL, volume sous lequel
les cellules affleurent à la surface du ménisque formé au fond du puits. Si les cellules sont
asséchées au cours des lavages, les réponses calciques sont perturbées. Chez le rat,
l’activation des glomérules olfactifs est fortement accrue en absence de mucus olfactif,
indiquant que le mucus olfactif et ses constituants jouent un rôle important dans la régulation
de la réponse olfactive in vivo (Oka et al., 2006). Or le mucus olfactif est très différent du
tampon utilisé dans notre étude, à la fois en terme de composition et de viscosité. Il contient
de nombreuses protéines parmi lesquelles, chez l’homme, 19 % ont un rôle de protection de
l’épithélium (Debat et al., 2007). On peut ainsi imaginer que les OBP (ou d’autres protéines
du mucus olfactif) captent les odorants, empêchant leur accès aux récepteurs olfactifs.
L’utilisation d’une OBP de porc marquée à l’iode radioactif a permis à Matarazzo et al.
(2002) de déterminer, en absence de ligand, une constante de dissociation de l’OBP pour le
récepteur humain OR17-210 de 9,5 nM. Les auteurs ont proposé un modèle selon lequel
l’OBP est fixée au récepteur en absence d’odorant et intervient en facilitant l’accès de
l’odorant au récepteur. Ces résultats vont dans le sens d’un rôle de l’OBP dans la transduction
du message porté par la molécule odorante, ce qui n’exclut pas un rôle de transporteur de
l’odorant. L’approche développée dans notre étude consistait à étudier l’effet fonctionnel sur
OR1G1 d’une OBP capable de fixer les mêmes ligands que ce récepteur. On sait que le
récepteur OR1G1 (encore nommé OR17-209) n’interagit pas avec l’OBP de porc (Matarazzo
et al., 2002). Dans ce cas où le rôle de l’OBP est de transporter, ou de solubiliser l’odorant,
une interaction entre le récepteur et l’OBP n’est pas nécessaire. En dépit du très faible nombre
de récepteurs testés, on peut supposer qu’il existe deux classes de récepteurs, pouvant
interagir ou non avec les OBP (Matarazzo et al., 2002). De plus, si dans les conditions de
notre d’étude il n’a pas été mis en évidence d’impact de l’OBP humaine hOBP-2A sur le
fonctionnement du récepteur OR1G1, on ne peut exclure une interaction avec d’autres
récepteurs olfactifs. Par ailleurs, un seul ligand a été testé alors que OR1G1 est activé par
différents ligands (Sanz et al., 2005), ces autres ligands peuvent avoir une action altérée sur la
132

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
fonction de OR1G1 en présence d’OBP. Afin de vérifier ces hypothèses, on peut envisager de
tester d’autres récepteurs olfactifs humains. En particulier, le récepteur OR17-210 qui
interagit avec l’OBP de porc semble être un bon candidat à l’interaction avec l’OBP humaine.
Ce récepteur est en outre capable de lier les cétones (Matarazzo et al., 2005). Cette différence
de répertoire de fixation de OR17-210 et de l’OBP humaine conduit à émettre l’hypothèse que
les OBP pourraient agir en modifiant le répertoire des récepteurs, peut-être en favorisant les
faibles agonistes. L’étude de ce récepteur et ses interactions avec l’OBP devrait donc être
menée en parallèle au niveau fonctionnel et biochimique. Le niveau fonctionnel peut être
étudié par exemple en utilisant la méthode VOFA développée ici afin de savoir si l’OBP
humaine modifie les propriétés de liaison du récepteur. Des résultats préliminaires obtenus par
l’équipe de Catherine Ronin (communication personnelle) en utilisant hOBP-2A produite en
levure montrent de façon encourageante une interaction entre cette OBP et le récepteur OR17-
210. De plus la réponse calcique de ce récepteur à ses deux ligands (ionone et acétophénone)
(Matarazzo et al., 2005) est diminuée en présence d’OBP humaine. Par ailleurs, le répertoire
d’un autre récepteur olfactif (OR52D1) a été décrit au laboratoire (Sanz et al., 2005). Ce
récepteur présente une légère affinité pour les aldéhydes et les acides de taille intermédiaires
(entre 8 et 10 carbones). On peut donc se demander si l’OBP pourrait agir sur le
fonctionnement de ce récepteur en augmentant son activation pour ces ligands.
Le champ d’investigation développé ici est relativement restreint puisqu’il part de
l’idée d’une action de l’OBP sur les récepteurs olfactifs. Le système d’expression
fonctionnelle choisi exclut donc toute possibilité d’identification d’autres partenaires dans le
processus impliquant les récepteurs olfactifs et les OBP. Il a déjà été montré une interaction
spécifique de l’OBP bovine avec les membranes des épithéliums olfactif et respiratoire, mais
pas avec les cils olfactifs, sites d’expression des récepteurs olfactifs (Boudjelal et al., 1996).
Cette étude suggère la fixation d’OBP sur d’autres sites que les récepteurs olfactifs. On ne
peut donc pas exclure d’autres récepteurs pour l’OBP. Ainsi, des récepteurs de lipocalines ont
été mis en évidence, notamment la Megaline, ce récepteur cytoplasmique de 600 kDa
intervenant dans la réabsorption de protéines de l’urine au niveau du rein. Elle est en
particulier capable de fixer spécifiquement la RBP, la protéine de liaison de la vitamine D,
l’α-microglobuline et l’OBP1a de souris (Leheste et al., 1999). Le récepteur de la lipocaline
de larme, a lui aussi été identifié. Il s’agit d’un récepteur à 9 domaines transmembranaires
appelé LIMR qui permet l’internalisation de la lipocaline de larme et sa prise en charge dans
le système de dégradation intracellulaire (Wojnar et al., 2001, Wojnar et al., 2003). Il est
133

CHAPITRE II– IMPACT D’UNE OBP SUR UN RO
important de souligner que l’OBP humaine et la lipocaline de larme présentent 40%
d’homologie ce qui est relativement important dans cette famille de protéine. On peut donc se
demander si le récepteur de la lipocaline de larme peut lier l’OBP humaine. Afin d’identifier
les couples OBP-récepteur, des méthodes moins restrictives devront être envisagées. D’autres
organismes modèles, comme le rat, peuvent permettre à partir d’épithélium olfactif isolé, des
approches de co-immunoprécipitation. Ce type d’approche a permis de montrer l’interaction
entre un récepteur de l’organe voméronasal de souris et des protéines du complexe majeur
d’histocompatibilité (Loconto et al., 2003). De même, Saito et al. (2004) ont montré
l’importance d’une famille de protéines membranaires dans l’adressage des récepteurs
olfactifs à la membrane. L’approche ayant permis l’identification du récepteur de la RBP
(STRA6) (Kawaguchi et al., 2007) apparaît aussi intéressante : la liaison chimique du
récepteur et de la RBP, induite après incubation avec un composé photo-réactif liant les
protéines a permis par western blot de mettre en évidence les complexes RBP-récepteur en
vue d’une identification ; l’aspect fonctionnel pouvant être abordé dans des tests ultérieurs.
Un dernier aspect qui n’a pas été étudié ici est la fonction de discrimination des OBP
fortement suggérée pour les trois OBP de rat (Löbel et al., 2002). En effet, les OBP de rat ont
des spectres de fixations des odorants complémentaires, chacune fixant préférentiellement
certaines classes chimiques. L’hypothèse de l’existence de couples OBP-RO spécifiques a été
conforté par les mesures de fixation différentes de l’OBP de porc sur deux récepteurs
différents (Matarazzo et al., 2002). Toutefois, chez l’homme, il existe deux gènes d’OBP
(Lacazette et al., 2000) et le deuxième variant d’OBP nommé hOBP-2B présente un spectre
de fixation des odorant très proche de hOBP-2A (Cristiani, 2005). Ainsi le rôle
discriminatoire des OBP pour les odorants semble compromis chez l’homme. Cet aspect
pourrait être exploré plus en détail chez le rat pour lequel les ligands de quelques récepteurs
commencent à être connus (Zhao et al., 1998, Araneda et al., 2004, Oka et al., 2004, Abaffy
et al., 2006). Ainsi, à partir du modèle rat, s’ouvrent de nombreuses possibilités de
combinaison entre les récepteurs et les différentes OBP. De plus, le modèle rat permet aussi
des approches électrophysiologiques, impossibles chez l’homme. Ces méthodes ont
notamment permis d’élucider les mécanismes de codage du signal olfactif en déterminant le
fait qu’un neurone (et donc un récepteur olfactif) répond à plusieurs odorants (Duchamp-Viret
et al., 1999). On peut ainsi se demander quel peut être l’impact des OBP sur la réponse des
neurones en présence des différentes OBP.
134

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
L’objectif de ce travail était d’apporter des éléments de réponse sur l’implication des
OBP de vertébrés dans l’olfaction. Un variant d’OBP humaine, hOBP-2A, étudié au
laboratoire, présente une spécificité d’interaction avec les aldéhydes et les acides aliphatiques
(Briand et al., 2002). Cette spécificité restreinte est à opposer avec celle plus large des OBP
de porc et de bœuf. Par mutagenèse dirigée et mesures de déplacement de sondes
fluorescentes, on a montré dans cette étude l’importance fondamentale de la lysine en position
112 dans la fixation des aldéhydes et des acides aliphatiques de taille intermédiaire.
Chez le rat les trois OBP ont des répertoires complémentaires, suggérant une fonction
de discrimination pour les OBP (Löbel et al., 2002). Toutefois cela ne semble pas être le cas
pour les OBP humaines. En effet, un autre variant, hOBP-2B, étudié au laboratoire présente
un répertoire de fixation des odorants similaire à hOBP-2A (Cristiani 2005). Les aldéhydes
étant des composés pour lesquels l’homme présente des seuils de perception bas (Laska et
Teubner, 1999), on peut supposer que les OBP transportent spécifiquement ces composés vers
certains récepteurs olfactifs, améliorant la perception que l’on a de ces composés par rapport à
d’autres non fixés par ces OBP.
Dans la deuxième partie de ce travail, on s’est intéressé aux rôles potentiels des OBP
sur l’activation d’un récepteur olfactif, OR1G1, dont le répertoire inclut des ligands de hOBP-
2A (Briand et al., 2002, Sanz et al., 2005). Le système d’imagerie calcique associé a une
application des odorants en mode vapeur (VOFA) ayant servi à la caractérisation du
répertoire de OR1G1 a été utilisé en présence ou en absence d’OBP humaine. Cette approche
biomimétique n’a toutefois pas permis de montrer un impact de l’OBP humaine sur
l’activation du récepteur OR1G1 par le tridécanal. Ni le seuil, ni la cinétique d’activation de
OR1G1 ne sont affectés par la présence d’OBP. Les limites de notre système ont été discuté
précédemment, notamment le fait de n’avoir utilisé qu’un seul récepteur et un seul odorant.
Toutefois, une approche identique d’imagerie calcique chez les insectes a montré qu’un
récepteur de phéromone de papillon (Bombyx mori) BmOR-1 était activé en présence de
bombykol solubilisé dans du DMSO ou en présence de PBP (Groβe-Wilde et al., 2006). Par
ailleurs chez un autre papillon (Heliothis virescens), une famille de récepteurs aux composés
phéromonaux a été identifiée dont HR13, HR14 et HR16. Une seule des deux PBP connues de
H. virescens (HvirPBP2) affecte fortement la spécificité du récepteur HR13, exprimé dans un
136

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
système hétérologue, alors qu’elle n’a pas d’effets sur les autres récepteurs (Groβe-Wilde et
al., 2007). Ainsi, chez l’insecte, les PBP agissent bien comme des transporteurs des composés
hydrophobes vers les récepteurs. En outre, la spécificité des couples HR13-HvirPBP2 et
BmOR-1-BmorPBP montre bien un rôle de discrimination de la PBP, suggérant une fonction
des OBP dans le codage de la perception chimique. Par ailleurs, il a été montré par
inactivation de gène qu’une OBP de drosophile, LUSH est impliqué dans la perception
chimique (Kim et al., 1998, Kim et Smith 2001). Cette OBP est exprimée spécifiquement
dans certaines sensilles olfactives (Shanbhag et al., 2001). Son rôle est de diminuer l’activité
des neurones de ces sensilles en présence de phéromone d’agrégation (11-cis vaccenyl acetate)
(Xu et al., 2005) dont le récepteur a été identifié et est lui aussi exprimé au niveau de ces
sensilles (Ha et Smith 2006).
En outre, les études de Groβe-Wilde et al. (2006 et 2007) montrent la faisabilité de
notre approche. En effet le système d’expression hétérologue des récepteurs olfactifs a été
utilisé de façon très similaire dans notre étude. Nous avons choisi d’appliquer les odorants en
mode vapeur et non en solution en présence ou non de protéine de liaison comme Groβe-
Wilde et ses collaborateurs (2006 et 2007). Leurs travaux ont été réalisés avec des
concentrations de PBP relativement faible (1 µM), on peut donc s’interroger sur l’effet des
PBP à des concentrations croissantes puisque les sensilles peuvent contenir jusqu’a 10 mM de
PBP, chez Bombyx mori (Steinbrecht et al., 1995). De plus, l’application en solution ne
permet pas d’analyse cinétique sur le rôle des PBP dans l’activation des récepteurs.
Parmi les rôles proposés pour les OBP de vertébrés, certains n’ont pas été étudiés ici.
Celui de transducteur, notamment, nécessite de connaître au préalable le couple OBP-RO. Des
résultats préliminaires obtenus sur le récepteur OR17-210 et l’OBP humaine dans l’équipe de
Catherine Ronin (Communication personnelle), indiquent une interaction entre ces deux
partenaires. Il apparaît donc nécessaire à ce stade de répondre à deux questions. Dans un
premier temps, quel est l’effet fonctionnel de l’OBP sur le récepteur OR17-210 qui fixe des
cétones contrairement à hOBP-2A (Matarazzo et al., 2005) ? Dans un deuxième temps, il
faudra caractériser le site d’interaction entre l’OBP et le récepteur. Les récepteurs olfactifs se
distinguent des autres RCPG par la présence d’une boucle extracellulaire de grande taille (40
acides aminés environ) qui relie les domaines transmembranaires 4 et 5. Cette boucle
137

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
renferme des motifs très conservés qui ont été suggérés comme étant un site putatif
d’interaction avec les OBP. Des approches de mutagenèse dirigée associées à des mesures
d’interactions réalisées par des approches biochimiques (co-précipitation) ou cellulaire (colocalisation,
mesure de FRET « Fluorescence Resonance Energy Transfert ») pourront
permettre de valider l’implication de cette boucle dans l’interaction avec les OBP.
Le rôle de protection a été avancé pour l’OBP bovine et porcine, capables de protéger
une couche de cellules en culture contre un composé aldéhyde toxique, le 4-hydroxy-2nonenal
(Grolli et al., 2006). On peut se demander s’il en est de même pour l’OBP humaine,
d’autant plus que deux autres lipocalines, la lipocaline 2 et la lipocaline de larme présentant
20 et 45% d’homologie avec l’OBP humaine ont toutes deux des activités antimicrobiennes
(Flo et al., 2004, Fluckinger et al., 2004). En outre, les aldéhydes étant des composés
généralement toxiques pour les cellules, le répertoire de l’OBP humaine paraît bien adapté à
cette fonction. Par ailleurs, chez l’homme, 19 % des protéines du mucus olfactif ont un rôle de
protection de l’épithélium (Debat et al., 2007). Cette fonction de protection est essentielle
puisque l’épithélium constitue une voie d’entrée directe de molécules toxiques vers le cerveau.
138

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RESUME
Les molécules odorantes, généralement hydrophobes, activent les récepteurs olfactifs
exprimés à la membrane des neurones sensitifs recouverts d’une couche de mucus hydrophile. Il a
été proposé que des protéines liant les odorants, les OBP pour « Odorant-Binding Protein » présentes
dans le mucus olfactif transportaient les odorants à travers le mucus olfactif vers les récepteurs
olfactifs. On s’est intéressé dans ce travail à un variant humain de protéine de liaison aux odorants,
hOBP-2A qui présente une spécificité de liaison pour les aldéhydes et les acides aliphatiques. Par une
approche de mutagenèse dirigée, on a voulu définir les déterminants biochimiques de cette spécificité
ainsi que les mécanismes d’entrée des ligands dans la cavité. On a ainsi pu montrer le rôle
fondamental dans la fixation de certains aldéhydes et acides aliphatiques d’une lysine (en position 112)
situé dans la cavité hydrophobe de hOBP-2A. L’expression fonctionnelle d’un récepteur olfactif,
OR1G1, a montré son activation par des composés se liant à hOBP-2A. Le rôle putatif de transporteur
des OBP a été évalué en réalisant une étude comparative de l’activation de OR1G1 avec et sans OBP.
Celle-ci a révélé que hOBP-2A n’avait pas d’impact sur l’activité du récepteur OR1G1. On ne peut
toutefois pas exclure l’existence d’autres triades odorant-récepteur-OBP, ainsi que la possibilité que
les OBP interviennent dans d’autres processus biologiques.
Mots clés :
Lipocaline, Mutagenèse dirigée, OBP, Odorant, Olfaction, Récepteur olfactif
ABSTRACT
Odorant molecules, generally hydrophobic, activate the olfactory receptors embedded in the
membrane of sensitive neurons which are covered with an aqueous layer of mucus. It was proposed
that odorant-binding proteins, named OBP, secreted in the olfactory mucus, transport hydrophobic
odorants through olfactory mucus towards the olfactory receptors. In this work we studied a human
OBP variant, hOBP-2A, which has a narrow specificity for aliphatic aldehydes and acids. Using site
directed mutagenesis, we wanted to define the biochemical determinants of this specificity as well as
the mechanisms of ligand entrance in the cavity. We thus have demonstrated the fundamental role of
a lysin (in position 112) located in the hydrophobic cavity of hOBP-2A in the interaction with some
aldehydes and aliphatic acids. The functional expression of an olfactory receptor, OR1G1, revealed an
activation of this receptor by some compounds that bind to hOBP-2A. The putative role of odorants
transport by the OBP was evaluated by making a comparative study of the activation of OR1G1 with
and without hOBP-2A. This study revealed that hOBP-2A did not have impact on OR1G1 activity. One
cannot however exclude the existence of other odorant-receptor-OBP complexes, as well as the
possibility that the OBP is involved in other biological processes.
Keywords :
Lipocalin, OBP, Odorant, Olfaction, Olfactory receptor, Site-directed mutagenesis