NGAL Rapid ELISA Kit

NGAL Rapid ELISA Kit
Schematische Übersicht über das Testverfahren
30 min bei
RT inkubieren
15 min bei RT
im Dunkeln
inkubieren
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Reagenzien auf RT bringen
Patientenproben verdünnen
50 µL HRP-konjugierter NGAL-Antikörper
+
50 µL Standard oder verdünnte Probe
100 µL TMB-Substrat
100 µL Stopplösung
Bei 450 nm messen
Waschen x 3
AUSWERTUNG
Zur Auswertung sollten die auf den Etiketten der
Standards und dem QC-Zertifikat angegebenen
genauen Werte der Standards benutzt werden.
Als Grundlage dient die Konstruktion einer
Standardkurve. Dazu wird für den jeweiligen NGAL
Rapid Standard der Mittelwert der doppelt bestimmten
Extinktionswerte auf der y-Achse gegen die
entsprechende NGAL-Konzentration (in ng/mL) auf
der x-Achse aufgetragen. Die Standardkurve muss
mit den Validierungsbedingungen übereinstimmen.
Die NGAL-Konzentration einer verdünnten Probe
wird dann durch die Identifizierung des Punktes
auf der Kurve, der dem Mittelwert der doppelt
bestimmten Extinktionswerte der verdünnten Probe
entspricht, und dem Ablesen der diesem Punkt
entsprechenden Konzentration (in ng/mL) auf der
x-Achse bestimmt. Die NGAL-Konzentration in der
unverdünnten Probe erhält man durch die Multiplikation
dieses Resultats mit dem Probenverdünnungsfaktor.
Dieses Verfahren kann unter Anwendung von
Graphpapier mit linearen x- und y-Achsen von Hand
durchgeführt werden. Durch die Punkte kann eine
stetige Kurve gezeichnet werden, angrenzende
Punkte können aber auch durch gerade Linien
verbunden werden. Die letztere Vorgehensweise
könnte zu geringfügigen Überbewertungen von
Konzentrations-werten zwischen zwei Punkten
führen, falls die Kurve leicht konvex nach links
verläuft, was typischerweise der Fall ist. Auch wenn
die Kurve ungefähr einer geraden Linie entsprechen
kann, ist es sowohl praktisch als auch theoretisch
inkorrekt, eine Ausgleichsgerade zu berechnen
und zu zeichnen und von dieser die Ergebnisse
abzulesen.
Die Analyse kann ebenso mit einem Softwareprogramm
für ein ELISA-Platten-Lesegerät
durchgeführt werden, sofern das Programm mit
Kurvenanpassungsmethoden ausgestattet ist. Die
Methode der Wahl ist die Kurvenanpassung mit
Hilfe eines Vier-Parameter-Modells (4-parameter
logistic curve fitting) mit linearen x- und y-Achsen.
Verdünnte Proben mit einer durchschnittlichen
Extinktion, die größer als die für den NGAL Rapid
Standard 6 oder kleiner als die für den NGAL
Rapid Standard 2 ist, befinden sich außerhalb des
Testbereichs. Ihre Konzentrationen sollten als >A
ng/mL beziehungsweise (A x Verdünnungsfaktor) ng/mL beziehungsweise
1,5 sein. Die mittlere Extinktion eines
NGAL Rapid Standards sollte größer sein als die
des vorhergehenden NGAL Rapid Standards,
beispielsweise Extinktion(NGAL Rapid Standard 6)
> Extinktion(NGAL Rapid Standard 5). Bei Auftragung
der Ergebnisse auf lineare Achsen sollte die
Kurve leicht konvex nach links verlaufen.
Aus dem Rahmen fallende Punkte für einzelne
Standards: Für einen oder mehrere individuelle
Standards können abweichende Extinktionsmessungen
auftreten. Es kann vorkommen, dass
einer oder beide der Doppelwerte aus dem Rahmen
fallen oder dass der Mittelwert der Duplikate aus
dem Rahmen fällt. Dieser Fehler ist signifikant,
wenn er die zufrieden stellende Kurvenanpassung
mittels des Vier-Parameter-Modells beeinträchtigt,
wodurch die Kurve sich aufgrund des abweichenden
Wertes von anderen Standardpunkten entfernt,
obwohl diese eigentlich korrekt sind. Die korrekte
Übereinstimmung zwischen den Standardpunkten
und der angepassten Kurve sollte immer überprüft
werden, bevor hieraus berechnete Konzentrationen
akzeptiert werden. Eine schlecht angepasste
Kurve kommt auch durch eine große Summe der
Abweichungsquadrate zum Ausdruck. Falls nur
ein Standard betroffen ist, und es sich dabei nicht
um den höchsten Standard handelt, sind zwei
Vorgehensweisen möglich:
i) Ein einzelner fehlerhafter Wert oder fehlerhaftes
Resultat einer Doppelbestimmung sollte von der
Kurve ausgeschlossen und für die übrigen Resultate
mit dem Vier-Parameter-Modell eine neue Kurve
erstellt werden. Wenn eine akzeptable Kurve ermittelt
NGAL Rapid ELISA Kit
wurde, können mit ihrer Hilfe vorläufige Konzentrations-bestimmungen
vorgenommen werden.
ii) Falls auf diese Weise keine akzeptable
Anpassung erzielt werden kann, die Kurve
ansonsten jedoch konsistent ist, können vorläufige
Resultate anhand gerader Linien oder einer
einfachen Kubische-Spline-Anpassung zwischen
den Mittelwerten der Duplikate unter Ausschluss
des fehlerhaften Punktes bestimmt werden.
Falls zwei oder mehr Standards betroffen sind,
sollte der Test wiederholt werden.
Ein abweichendes Ergebnis für einen
einzelnen Standard kann durch Anwenderfehler
oder durch einen verdorbenen Standard
verursacht werden. Falls beide Doppelwerte in
aufeinander folgenden Tests durchweg aus dem
Rahmen fallen, ist der Standard fehlerhaft und
sollte verworfen werden.
RÜCKVERFOLGBARKEIT
DER STANDARDWERTE
Die NGAL-Konzentration von verdünntem Standardmaterial
wurde vom Rigshospitalet in Kopenhagen,
Dänemark, durch einen ELISA-Vergleich mit
einer gereinigten Zubereitung an rekombinantem
humanen NGAL quantifiziert.
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Das Ergebnis eines erhöhten NGAL-Wertes im Urin,
Plasma oder Serum allein kann nicht als Hinweis
auf eine bestimmte Pathologie betrachtet werden.
Wie in der Einführung dargelegt, gibt es verschiedene
unabhängige Pathologien, die mit erhöhten
NGAL-Werten im Urin oder Plasma verbunden
sind. Ärzte müssen die Signifikanz eines erhöhten
NGAL-Wertes im Lichte der individuellen klinischen
Charakteristika eines Patienten deuten.
Die Möglichkeit, über die NGAL-Urin- und
Plasmaspiegel ein vermutlich durch eine Nierenschädigung
verursachtes akutes Nieren-versagen
zu diagnostizieren, wurde an einer Reihe von 60
aufeinander folgenden Patienten bestimmt, die in
eine nicht spezialisierte Intensivstation aufgenommen
wurden, und die nach anderen Kriterien auf An-
oder Abwesenheit von Zeichen für Nierenversagen
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