L3 BCPV - Biologie Intégrative des Interactions Plante Microbe ...

L3 BCPV
Daniel Wipf
Professeur Daniel Wipf
Professeur
UMR INRA 1088/CNRS 5184/ Université de Bourgogne
UMR INRA Plante-Microbe-Environnement
1088/CNRS 5184/ Université de Bourgogne
Plante-Microbe-Environnement
Bureau 414
17 rue Bureau de Sully 414
BP 17 86510 rue de Sully
21065 DIJON BP 86510 Cedex
21065 France DIJON Cedex
France
Daniel.Wipf@dijon.inra.fr
Daniel.Wipf@dijon.inra.fr

Hormone
• La notion d’hormone (du grec hormao:
exciter; le terme fait son apparition en 1905)
s’applique à des substances organiques
biologiquement actives et fait intervenir 3
idées essentielles : "
• 1. activité à de très faibles concentrations
(aucun rôle énergétique ni nutritif) "
• 2. synthèse par l’organisme lui-même "
• 3. transport du site de synthèse au site
d’action où elle influence spécifiquement des
cellules cibles. "

Animal vs végétal
• messagers chimiques pour
communication entre cellules
• quatre catégories :
– Protéines
– Petits peptides
– Dérivés d’acides aminés
– Stéroïdes
• synthèse : cellules sécrétrice
• cible : protéines spécifiques = les
récepteurs
• transport = sang
• agissent [faible]
• von Sachs (1832-1897) : existence
messager(s) chimique(s)
responsables formation et croissance
des organes des plantes (hypothèse)
• = messagers chimiques
• synthétisées certaines parties
organes
• utilisation autres organes
• Transport: xylème, phloème, cellule à
cellule?
• 6 catégories : action à faible dose (η
→ µM)
– Auxines
– Gibberellines
– Cytokinines
– Ethylène
– Acide abscissique
– Brassinostéroïdes

Phytohormones
• Il existe aussi des molécules mimant les
actions des hormones :
– acide jasmonique,
– acide salicylique,
– polypeptide systémine
– strigolactones
Pseudohormones
(résistances aux
pathogènes et
aux herbivores)

Les auxines
• Hormones de croissance
indispensables (pas de mutant
viable)
- auxine
+ auxine
coléoptile est un organe transitoire lors de la germination
• Structure chimique simple : noyau
indole ⇒ facile à synthétiser
• formes libres biologiquement actives,
formes liées non
N
H
Auxines naturelles
CH 2 COOH
3-acide acétique-indole
Toutes les plantes
N
H
OCH 2 COOH
Cl
Cl
(CH 2 ) 3 COOH
2,4-dichloro-
phenoxyacetic acid
Cl
N
H
CH 2 COOH
3-acide acétique-
4-chloro-indole
pois
3-acide butyrique-
Indole
Moutarde, maïs
Auxines synthétiques
Cl
COOH
OMe
Cl
2-methoxy-3,6-
dichlorobenzoic acid

Biosynthèse des auxines
• 2 possibilités
– Tryptophane
– Chorismate
• Auxine ressemble au
tryptophane = intermédiaire
• Multiples voies de biosynthèse utilisant le tryptophane
– IPA (indole-3-pyruvic acid)
– TAM (tryptamine)
– IAN (indole-3-acetonitrile)
– IAM (indole-3-acetamine)
N
H
CH 2 COOH
N
H
NH 2
COOH

Trp monooxygénase
N
H
O
NH 2
Acetamide-3-indole (IAM)
IAM hydroxylase
NOH
N
H
Acétaldoxime-3-indole
N
N
H
Acétonitrile-3-indole (IAN)
Nitrilase
Trp
N
H
N
H
NH 2
Trp monooxygénase
COOH
Déshydrogénase
COOH
Acide acétique-3-indole
O
N
H
Acide pyruvique-3-indole (IPA)
Décarboxylase
O
N
H
Acétaldéhyde-3-indole
COOH
Décarboxylase
Amine oxidase
N
H
Tryptamine (TAM)
• Multiples voies
– IAN (indole-3-acetonitrile)
– IPA (indole-3-pyruvic acid)
– TAM (tryptamine)
– IAM (indole-3-acetamine)
NH 2

IPA TAM IAN
Voie la plus courante + - -
Tomate + + -
Brassicacae, Poaceae,
Musaceae
Cucurbitaceae,
Solanaceae, Fabaceae,
Rosaceae
- - +
nitrilase
• Voie IAM permet production auxine par bactéries pathogènes
⇒ induction modifications morphologiques chez plantes hôtes;
existe chez certaines plantes telles qu’arabidopsis

• Expérience
– Incubation avec Tryptophane marqué
– Résultat ?
– IAA* ne reflète pas IAA total
• Autre voie avec indole-3-glycérol phosphate
• Confirmation : mutant orp (orange pericarp)
maïs

Anthranilase
synthase
Anthranilase
transférase
Anthranilase
isomérase
Chorismate
Anthranilate
5-phosphoribosylanthranilate
1-(o-carboxyphenylamino)-
1-deoxyribulose 5-P
IGP
synthase
N
H
Trp
synthase
trp3
Sérine +
Trp
synthase
trp2
N
H
OH
OH
Indole-3-glyceral-P (IGP)
N
H
NH 2
Trp
CH 2 OP
COOH
?
• 2 possibilités
– Tryptophane
– Chorismate
Enzyme hypothétique
Trp aminotransférase
COOH
N
N
H
Acétonitrile-3-indole (IAN)
O
N
H
Acide pyruvique-3-indole (IPA)
Nitrilase
N
H
COOH
Acide acétique-3-indole (IAA)

Mutant orp
- grains de différentes couleurs
Anthranilase
synthase
Anthranilase
transférase
Anthranilase
isomérase
Chorismate
Anthranilate
5-phosphoribosylanthranilate
1-(o-carboxyphenylamino)-
1-deoxyribulose 5-P
IGP
synthase
N
H
Trp
synthase
trp3
Sérine +
- 50 x + IAA que WT X
Trp
synthase
trp2
N
H
OH
OH
Indole-3-glyceral-P (IGP)
N
H
NH 2
Trp
CH 2 OP
COOH

• 2 possibilités
– Tryptophane
– Chorismate
• Relations entre
les deux voies ?
Anthranilase
synthase
Anthranilase
transférase
Anthranilase
isomérase
N
H
Trp
synthase
trp3
• Type voie peut varier d’un organe à un autre ou en fonction
stade développement (carotte)
– Début du développement : voie dépendante du tryptophane
– Lorsque l’axe racine-tige est établi : voie indépendante du tryptophane
Synthase
Sérine +
Trp
synthase
trp2
Trp
N
H
OH
N
H
OH
NH 2
CH 2 OP
COOH
N
H
COOH
Acide acétique-3-indole

• Deux formes auxines
– Libres = actives
– Liées = inactives
• Formes liées = auxine +
molécule conjuguée
– Faible MM
• Glucose
• Myo-inositol
• Aspartate
– Haut MM
• Glucanes
• Glycoprotéines
• Conjugaison = signal de
dégradation
• Dégradation via le
catabolisme
Auxine
Conjugaison
Auxine conjuguée
Catabolism
Produit de dégradation
OH
OH
O
CH 2 OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
N
OH
O

Lieu de synthèse des auxines
• Expérience : introduction construction
promoteur sensible auxine + gène
rapporteur codant pour la synthèse d’un
produit coloré (β-glucuronidase)
Auxine
promoteur
sensible aux
auxine
Plasmide Ti
glucuronidase
Glucuronidase
Substrat
incolore
Produit
bleu
⇒ synthèse glucuronidase si auxine produite

• synthèse glucuronidase si
auxines produites dans
cellules
Exemple : hydatodes
(cellules de type glandes
intervenant dans la
guttation) + gradient long
différenciation tissus
vasculaires
• Conclusions : Synthèse
tissus forte croissance
– méristème de tige
– jeunes feuilles
– fruits
– germinations
Primordium foliaire
D’Arabidopsis thaliana

• Localisation subcellulaire
:
– Feuille
• chloroplastes : 30 %
(tabac)
• cytoplasme : 70 %
• Cytoplasme : formes
libres et conjuguées
• Chloroplaste : formes
libres
• Régulation quantité
dans chloroplastes via
équilibre entre les 2
compartiments +
dégradation dans
cytoplasme
Cytoplasme
Chloroplaste
Auxines libres
Auxines libres
Auxines
conjuguées
Dégradation

Le transport des auxines
• 2 modes
– Polarisé
– Non polarisé
• Expérience

• Le transport unidirectionnel
– haut vers bas
– est polarisé
• Indépendant de la gravité
• Mouvement : méristème caulinaire
vers racine mais aussi dans celle-ci
vers sa pointe (2-8 mm)
• Vitesse = 5 – 20 cm/h
– + rapide que la diffusion
– - rapide que transport phloème
• Ne sont transportées que les
auxines biologiquement actives ⇒
récepteur
Racines
adventives

Comment ça marche ?
• Définitions :
– Sortie = exportation
– Entrée = importation
• Nécessite énergie
• Sensible
– O 2
– inhibiteurs métaboliques
• Demande des transporteurs
spécifiques
Cellule 1
Auxine
Cellule 2

L’exportation
pH cytoplasme = 7,2 ⇒
IAA- pH parois = 5
⇒ ΔpH et ΔE
Transporteur : Pin1
(protéine membranaire)
Transport utilise ΔE
WT
PIN1 -

• Protéines PIN ne restent
pas continuellement ds
partie basale MP !
• Recyclage continuel car si
utilisation inhibiteur
adressage protéine du
Golgi vers MP,
observation vésicules

L’importation
• pH parois = 5
Conséquences
– 50 % (IAAH) traverse la
membrane plasmique
– 50 % ne passe pas ⇒
transport actif (perméase) =
cotransport auxine/H +
• L’ATPase de la membrane
plasmique excrète des
protons dans la paroie
cellulaire (pH ~ 5)

• 2 modes
– Polarisé
– Non polarisé
• Feuille mature → reste plante
via phloème (≈ 1 m/h)
– Important division cellules cambiales
– Accumulation callose
– Formation racines latérales
• Pointes racines vers méristème :
via protoxylème
• Questions
– Comment se partagent les 2 modes de transport
– Interactions (synergie ?) entre les transports : oui
• Transport non polaire → transport apolaire dans tissus immatures
caulinaires

Résumé
• Deux sources possibles : Tryptophane ou
indole-3-glycérol phosphate
• Formes libres (actives) ou liées (inactives)
• Rôle de la forme ionique important pour
transport
• Deux types de transport : polarisé ou non
polarisé

Les gibbérellines
• Avant 1930 : observation initiale
• 1930 : isolement et cristallisation (Japon)
• 1955 : caractérisation (champignon)
• 1958 : isolement du haricot
• Grande famille de composés (> 125).
Seules quelques sont actives
• Définition chimique (ent-kaurène)
• Impliquées principalement dans :
– Croissance de la racine
– Croissance de la tige
3
A
1
10
7
B C
20
11
12
9
814
13
D
15 16
dwarf
+ hormones
CH 2
WT

Biosynthèse des gibbérellines
• Structure de base : diterpènes
tétracycliques = juxtaposition 4
isoprène
• Compartimentation cellulaire et
tissulaire
– (chloro)plaste
– réticulum endoplasmique
– cytoplasme
• Contrôle à différents niveaux
– génétique
– stade de développement
– environnement
• Formes libres sont actives
G
3
2
P
1

ieu de synthèse des gibbérellines
• Expérience
– construction promoteur gène GAox (=
dernière enzyme de la voie de
biosynthèse) + gène luciférase
(enzyme luciole) est particulièrement
abondante dans les jeunes tissus se
développant activement:
– Transforme A. thaliana et mesure
expression gène
• Résultat
– particulièrement abondante ds jeunes
tissus se développant activement :
bourgeons, feuilles, bourgeon apical

Transport des gibbérellines
• Gibbérellines actives et intermédiaires
• Celles qui sont synthétisées
– dans la plantules via le phloème
– dans la racine via le xylème

Les cytokinines
• Observation initiale : 1913 - G Haberlandt (Autriche) :
Cellule arrête de se diviser si signal nécessaire pour
initiation de la division absent ⇒ démontre existence
substance polaire ds tissus plantes vasculaires (par ex.
exudats, lait de coco) stimulant division cellulaire
• 1940-1950 - F Skoog (USA) : découvre cytokinines par
essais et erreurs avec nb substances dont bases
l’ADN. Découverte de la kinétine (= produit
dégradation ADN par la chaleur).
• Division cellulaire induite par molécules simples

• 1973 – Letham : isolement
1ère cytokinine naturelle =
zéatine (ds albumen graines
immatures de maïs)
• Conformation moléculaire
importante pour activité
CH 2 OH
C
H 3
• Petite famille de composés
H
C
CH 2 OH
C
H 2
C
H 3
H
C
N
C
H 2
N N
Zéatine
zéatine isomérase
N H
C
H 3
N
Purine CH2OH C
H2
trans = forme active cis
H3C H C 3
H
C
N
N
H
iP
H
C
C
H 2
N
O CH2
N
N H
N N
Purine
Purine
N
N H
N

• Molécules faciles à
synthétiser ⇒
– analogues de
synthèse
– antagonistes de
synthèse
• Existent sous forme
libres (actives) ou
conjugées (inactives)
• Formes libres
ubiquistes ds règne
végétal (algues,
mousses, fougères,
plantes supérieures)
N
C
H 2
N H
N
N
H
N
Benzyladénine
C
H 3
C
H 3
C
H
C
H 2
N
C
H 2
N H
N
N
H
N
3-méthyl-7-(3-methylamino)
pyrazolo[4,3-D]-pyrimidine
N
H
O
N
H
N,N'-diphénylurée

• Actions :
– Induction division cellulaire
– Accélération formation bourgeons et
racines
– Retarde sénescence feuilles
– Accélération expansion cotylédons
dicotylédones
• Rôles uniquement
démontrés chez les plantes
supérieures
• Hormone de croissance
indispensable pour vitalité
(⇒ pas de mutant viable)
WT
CKX

Biosynthèse
• complexe car implique autres voies biosynthèse. Ex :
structure chaînes latérales
= combinaison isoprènes
Enzymes bactéries ds
cellules plantes
diP O
Enzymes plantes ds
cellules plantes
P
P
P
P
N
O
N
O
NH 2
N
NH 2
N
O
N
N
N
N
O
OH OH
• Existe des OHinhibiteurs
OH métaboliques
OH OH
Zéatine
P
P
P
P
N
HN
O
N
HN
O
N
N
N
N
O
OH OH
O
N
N
P
P
P
N
HN
O
P
N
N
HN
O
N
N
N
O
OH OH
OH
O
N
N
OH OH
OH
H
C
H N C
H2
N
N
N
iP
N
HO
HN
N
N
H
O
N
N
OH OH
CH 3
CH 3
OH
N
HN
N
N
N
H
trans-zéatin
N
OH
N
N
N N
H
Zéatine
OH

Lieu de synthèse et transport
• Sur la base des exudats : via le xylème (hypothèse de
Haberlandt sur nature chimique)
• Principalement dans méristème apical des racines
• Synthèse dans les jeunes embryons, feuilles embryonnaires,
jeunes fruits
MAIS ….

• Racine mutant tabac qui sur-produit des
cytokinines
– Greffe sur une tige non mutante : aucun effet
– Bourgeons racines latérales
• Développement moins rapide
• Moins rapidement senescent
Greffon : + auxine
Pied : WT
Quel(s) rôle(s) réel(s)
cytokinines ‘racinaires’ dans plante ?
Greffon : WT
Pied : + auxine

L’éthylène
• Observation initiale – 19 ème siècle
Arbres près lampadaires perdent
+ de feuilles que autres

• 1901 – D. Neljibov (étudiant licence - Russie) :
découverte triple réponse chez plantes étiolées
– Réduction élongation de la plantule
– Augmentation croissance latérale
– Croissance horizontale anormale
Triple réponse disparaît si plantes poussent à obscurité
+ l’air libre ; identification de l’éthylène comme agent
influençant physiologie des plantes
• 1910 – H.H. Cousins
une substance gazeuse émise autre organisme
(Penicilium) influence physiologie plante à distance
(oranges → bananes)
• 1934 – R. Gane : isole l’éthylène ‘naturel’
Mutant
etr1
(insensible
C 2 H 4 )
H H
H H
Ethylène

H
O 2
2
C
H C 3 S
Biosynthèse
O
1
O
acide alpha-céto
gamma-méthyltiobutyrique
O
OH OH
OPO 3 H-
5'-méthylhio ribose-1P
NH 3 +
Méthionine
3
4
S ATP ADP + Pi
CH3
ADP
Cycle de Yang
O
HO
O
HO
ATP
NH 3 +
S +
SAM
CH 3
CH 2
O
adénine
H 2
C
H C 3 S
5'-méthylthio
adénosine
H2 C
H C 3 S
5'-méthylthio ribose
O
OH OH
O
adénine
OH
OH OH
H2 C
C
H 2
NH 3 +
COO-
H2 C
1/2
C COO-
H2 N-malonyl ACA
adénine
• Précurseur : méthionine
• Recyclage du soufre
O 2
NH 3 +
• Demande de l’énergie (ATP)
• Demande de l’oxygène
• Régulation
Malonyl
H H
H H
Ethylène
CO2 HCN

Lieu de synthèse et transport
• Peut être produit par toutes les
parties des plantes
• Les régions les plus actives sont :
– Méristèmes
– Nœuds
• Production est fonction du stade
de développement de celui-ci
• Accélération de la production:
– Maturation des fruits
– Abscission des feuilles
– Sénescence des fleurs
– Blessures
– Stress

• Transport sous forme gazeuse : l’éthylène diffuse
aisément dans les espaces entre les cellules
• Hormone ubiquiste dans le règne végétal
(cyanobactéries, hépatiques, mousses, fougères,
plantes supérieures)

L’acide abscissique
• Observation initiale : les graines ne germent pas =
dormance
• Isolement d’une substance extraite en automne de feuilles
d’érable : la dormine
• La dormine est chimiquement identique à la substance qui
provoque le détachement des fruits de coton : l’abscissine
• Nouveau nom : l’acide abscissique
C
H 3
CH 3
OH
O CH 3
CH 3
Acide abscissique
COOH

• Observation initiale : les graines ne
germent pas = dormance
• Mutant VP14 maïs incapable de
synthétiser l’acide abscissique
⇒ grains germent sur l’épi

• Hormone ubiquiste chez plantes vasculaires
• Existe chez mousses et chez certains champignons (=
métabolite secondaire)
• Conformation spatiale définit activité
C
H 3
CH 3
OH
O CH 3
CH 3
COOH
(S)-cis-acide abscissique
Forme naturelle active
C
H 3
O
CH 3
OH
CH 3
CH 3
COOH
(R)-cis-acide abscissique
Forme naturelle inactive

Biosynthèse
• voie de biosynthèse
caroténoïdes
• Activation synthèse de cisnéoxanthine
par les stress
hydriques
• Contrôles
– Conjugaison : forme libre
(active) et conjugées (inactives)
– Catabolisme : oxydation
HO
HO
OH
O
O
O 2
HO
O
O
O
Isopentenyl diphosphate
OPP
OPP
Farnesyl diphosphate
OH
OH
HO
O
OH
xanthoxal
CHO
Zéaxanthine
OH
OH
trans-violaxanthine
9'-cis-néoxanthine
aldéhyde d'acide abscissique
CHO
acide abscissique
COOH

Synthèse et transport
• Cellules ayant chloroplastes ou amyloplastes
• Transite à la fois par le phloème (et le xylème)

Les brassinostéroïdes
• Observation initiale – 1968
Japon : purification de 3 substances
de Distylium (hp). Substances
induisant l’inclinaison des feuilles
• 1979 : isolation 1er brassinostéroïde
(brassinoline)
• Hormone ubiquiste (algues,
fougères, plantes supérieures). Pas
détectée chez microorganismes
HO
HO
Brassinolide
H
O
O
HO
OH
OH

Biosynthèse
Cycloarténol
HO
A B
C
D
HO
HO
Cycloaudenol
A B
HO
A B
C
D
A B
C
D
C
C
D
24-méthylène
cycloarténol
• Départ : dérivé du
squalène →
cycloarténol
• Plusieurs précurseurs
possibles

Résumé et conclusions
• Plantes synthétisent 6 familles de molécules agissant à
très faibles concentrations sur physiologie
– Auxines
– Gibbérellines
– Cytokinines
– Ethylène
– Acide abscisique
– Brassinosteroïdes
• Voies biosynthèse restent à élucider + modes
transport et action(s)

Résumé et conclusions
Auxines Cytokinines Gibbérellines Éthylène Acide
abscissique
• stimulation de
la croissance,
• stimulation de
l'élongation
cellulaire,
• régulation de la
division et de la
différenciation
cellulaire,
• messager des
réponses
géotropiques et
phototropiques,
• régulation de
l'abscission,
• stimulation de
rhizogène
adventive
• stimulation de
la division
cellulaire,
• régulation de la
différenciation
cellulaire, des
bourgeons et
des racines
• grandissement
des cellules
foliaires,
• inhibition de la
sénescence des
feuilles
• élongation des
entrenœuds
(forte stimulation
chez les
mutants nains),
• montaison des
plantes en
rosette,
• levée de
dormance des
graines et des
bourgeons,
• régulation de
l'utilisation des
réserves lors de
la germination
• perturbation de
l'élongation
cellulaire,
• perturbation
des réponses
géotropiques,
• accélération de
la sénescence
foliaire et de la
maturation des
fruits,
• stimulation de
l'abscission
• effet inhibiteur
général de la
croissance
cellulaire,
• régulation de la
dormance des
bourgeons et
des graines,
• régulation de
l'abscission des
feuilles, des
fleurs et des
fruits,
• régulation du
fonctionnement
des stomates en
situation de
stress
Actions pléiotropes + synergies + antagonismes
Brassinostér
oides
• Augmentation
vitesse
élongation tige
• Croissance
tube pollénique
• Déroulement
feuilles
monocotylées
• Activation des
pompes à
protons
• Réorientation
des microfibres
de cellulose

Types d’organogénèse contrôlés par équilibre
AUXINES CYTOKININES
rhizogénèse sur boutures
embryogénèse
rhizogénèse sur cals
callogénèse (dicot.)
bourgeonnement adventif
bourgeonnement axillaire

Phase asymbiotique
Formation du PPA
Facteur Strigolactones
de ramification
Racine
Strigolactones
Facteurs Myc
Racine
Phase pré-symbiotique
Racine
Colonisation de la racine
Racine
Formation de l’hyphopode
Racine
Formation des arbuscules
Akiyama et al. 2005; Besserer et al. 2006; Gomez-Roldan et al. 2008

Structures

Les strigolactones
Rôles
10 -14 M
Stimulation des champignons MA
Strigolactones
10 -10 M
Germination graines de
plantes parasites
10 -8 M
Contrôle de la
ramification de la tige
Reyes-Prieto
Umehara
et al., 2007
et al. 2008; Gomez-Roldan et al. 2008; Cook et al. 1966; Akiyama http://tolweb.org/tree/
et al. 2005; Besserer et al. 2006