Master en Pharmacie Travail Personnel de Recherche

Master en Pharmacie
Travail Personnel de Recherche
La liaison aux protéines plasmatiques modifie-t-elle la
perméabilité gastro-intestinale passive mimée par des modèles
pampa ?
présenté à la
Faculté des sciences de
L’Université de Genève
par
SOL Marine
Unité de recherche Directeur de l’unité
Pharmacochimie P. A Carrupt
Autres responsables
Alban Bujard et Sophie Martel
Genève
2013

Remerciements :
Pour commencer, je tiens à remercier :
Le professeur P. A. Carrupt pour m’avoir permis de réaliser ce travail de Master au sein des
laboratoires de Pharmacochimie de l’université.
Alban Bujard pour m’avoir guidée tout au long de ce travail, pour son aide précieuse, ses
conseils, ses solutions et sa disponibilité.
Docteur Sophie Martel pour ses précieux conseils et le temps qu’elle m’a accordé.
Enfin, un merci particulier à Charlotte et Céline pour leur accueil chaleureux au sein du
bureau ainsi que leurs conseils.

Résumé
Ce travail de master a pour objectif d'évaluer l'influence de la liaison aux protéines plasmatiques sur la
perméabilité gastro-intestinale de composés pharmaceutiques en utilisant les techniques PAMPA
(Parallel Artificial Membrane Permeability Assay).
La PAMPA utilisée est celle avec une membrane en hexadecane. Les paramètres ont dû être
légèrement adaptés pour permettre l’utilisation de l'albumine de sérum humain (HSA). L’albumine est
placée dans les compartiments accepteurs de la PAMPA et l'analyse se fait par HPLC-UV.
Ce test a permis pour la première fois de mettre en évidence une constante de dissociation (Kd) vis-à-
vis de l’albumine en un seul point de comparaison et d’apporter également des informations
concernant la perméabilité passive gastro-intestinale de composé. L’utilisation d’un modèle
mathématique intégrant les équations de bases de la perméabilité fut nécessaire pour l’obtention des
Kd. Une bonne corrélation a été obtenue en comparant les Kd obtenus avec ceux de la littérature. Cette
méthode a également permis de démontrer que plus la constante de dissociation est petite, plus le
passage de composé dans le compartiment accepteur est grand, à cause de l’influence de HSA sur le
gradient de concentration. La perméabilité est régulée par le gradient de concentration comme indiqué
dans les lois de Fick.
L’utilisation de la PAMPA permet un criblage à haut débit ainsi qu’une partielle automatisation.
Cependant uniquement les ligands ayant une forte perméabilité sont potentiellement utilisables pour
déterminer une possible constante de dissociation dû au fait que l’albumine est placée dans le
compartiment accepteur. Cette technique semble permettre également une adaptation rapide à d’autres
protéines pouvant être manipulées facilement.

Table des matières
1 Introduction .................................................................................................. 1
1.1 Barrière gastro-intestinale ....................................................................................... 1
1.2 Prédiction de la perméabilité membranaire .......................................................... 3
1.3 Albumine ................................................................................................................... 6
1.4 But de ce travail ........................................................................................................ 8
2 Notions théoriques ........................................................................................ 9
2.1 PAMPA sans albumine ............................................................................................ 9
2.1.1 Modèle sans rétention membranaire ................................................................................ 10
2.1.2 Modèle avec rétention membranaire ............................................................................... 10
2.2 Pampa en présence d’albumine ............................................................................ 11
3 Matériel et méthodes .................................................................................. 13
3.1 Réactifs .................................................................................................................... 13
3.2 Conditions analytiques ........................................................................................... 15
3.3 Mesure de la perméabilité ..................................................................................... 15
3.4 Visualisation numérique avec le modèle mathématiques ................................... 17
4 Résultats et discussion ................................................................................ 18
4.1 Partie numérique .................................................................................................... 18
4.1.1 Cinétique de perméabilité en l’absence d’HSA ............................................................... 18
4.1.2 Cinétique de perméabilité avec HSA ............................................................................... 19
4.2 Partie expérimentale .............................................................................................. 25
4.2.1 PAMPA sans HSA ........................................................................................................... 25
4.2.1 PAMPA avec HSA .......................................................................................................... 27
4.2.1 Kd obtenus comparés aux Kd de la littérature .................................................................. 31
4.2.2 Influence de HSA sur la concentration en ligand dans le compartiment donneur ........... 32
5 Conclusion et perspectives ......................................................................... 34
6 Bibliographie ............................................................................................... 36

1 Introduction
La recherche de médicaments est un processus complexe et long puisqu’il faut environ 12 à 20 ans
pour découvrir une nouvelle entité chimique (NECs) et obtenir son autorisation de mise sur le marché.
La principale source d’élimination des NECs est due à une mauvaise pharmacocinétique, de ce fait, il
est important d’étudier les propriétés pharmacochimiques des composés aussi tôt que possible dans le
processus de recherche du médicament, plus précisément, avant l’entrée dans la phase d’optimisation
du composé chef de file 1,2 . En effet, les paramètres d’absorption, de distribution, de métabolisation et
d’excrétion (ADME) contrôlés par les propriétés physicochimiques du composé jouent un rôle
primordial pour l'efficacité des NECs. De cette manière, seulement les composés aux propriétés
pharmacocinétiques adéquates et ayant un grand potentiel sont sélectionnés pour la suite du processus
de développement du médicament 2 .
Lorsque les médicaments sont administrés oralement, l’absorption gastro-intestinale est un des
facteurs clés pour la biodisponibilité. Leur absorption dépend majoritairement de leur capacité à passer
la barrière gastro-intestinale 3 . La biodisponibilité dépend également de la solubilité du composé ainsi
que de sa fixation aux protéines plasmatiques 4 . La mesure de la solubilité et la prédiction de la
perméabilité des NECs sont simples à réaliser mais en ce qui concerne l’évaluation de la fixation aux
protéines plasmatiques de la molécule, cela s’avère plus complexe.
1.1 Barrière gastro-intestinale
Le tractus gastro-intestinal se compose de l’estomac, du duodénum, du jéjunum, de l’iléon et du colon.
La gamme de pH dans ces différentes régions est étendue : elle va d’un pH de 1 à 2 pour un individu à
jeun au niveau de l’estomac et augmente progressivement pour atteindre un pH de 7 à 8 au début du
colon 5 .L’absorption a principalement lieu dans le duodénum et dans le jéjunum proximal, dans cette
zone, le pH vaut environ 6 à jeun et varie entre 4.5 et 5.5 après un repas 6 .
Le tube gastro-intestinal est bordé par une muqueuse intestinale formant des villosités permettant ainsi
d’augmenter la surface d’échange et donc les capacités d’absorption. Cependant, cette muqueuse
représente une première barrière à l’entrée de substance dans l’organisme.
La muqueuse gastro-intestinale est composée de cellules épithéliales reposant sur une lame basale.
Ce tissu épithélial permet de réduire l’infection par des pathogènes en bloquant l’entrée de ces derniers
et joue également un rôle dans le système immunitaire en sécrétant du mucus et des peptides anti-
microbiens 7 . En dessous de cette dernière se trouve du tissu conjonctif contenant des capillaires
sanguins par lesquels les substances absorbées pourront être distribuées à l’organisme 6 .
Page 1

Les cellules de cette muqueuse sont polarisées 8 de telle façon que la membrane apicale est en contact
avec la lumière du tube digestif et comporte des microvillosités (augmentant encore la surface
d’échange). La membrane basolatérale quant à elle est en contact avec les capillaires sanguins 6 .
Des jonctions serrées séparent les cellules, elles sont formées par des protéines telles que les claudines
ou occludines. Elles forment une barrière pour la diffusion paracellulaire et régulent le passage des
ions, de l’eau et de différentes macromolécules 9 . Contrairement aux jonctions serrées se trouvant dans
la barrière hémato-encéphalique, ces dernières permettent néanmoins le passage paracellulaire bien
qu’il soit diminué et forment ainsi la principale barrière du tractus gastro-intestinale 10 . Différents
mécanismes de transport à travers la barrière intestinale ont été identifiés. Il existe deux types de
transports passifs : le transport paracellulaire (entre les cellules) et le transport transcellulaire (à travers
les cellules) (figure 1). Le transport paracellulaire est limité aux petites molécules généralement plutôt
hydrophiles. Le transport transcellulaire peut être passif ou mettre en jeu des protéines de transport.
Le transport passif fonctionne grâce à un gradient de concentration et n’utilise pas d’énergie. Il dépend
grandement des propriétés physicochimiques du soluté. Le transport impliquant des protéines est dit
facilité ou actif. Dans le premier cas seuls un gradient de concentration et une protéine de transport
sont nécessaires, alors que le transport actif se fait, à l’encontre du gradient de concentration. Le
transport actif primaire utilise de l’énergie chimique, notamment l’hydrolyse de l’ATP (adénosine
triphosphate) alors que le transport actif secondaire se fait grâce à un gradient électrochimique. Ce
transport actif peut être dans les deux sens, c’est-à-dire dans le sens de l’influx ou de l’efflux. Les
plus grosses molécules telles que les peptides, protéines ou encore virus peuvent être transportées par
endocytose ou exocytose.
Figure 1 : Différents mécanismes de passage à travers une membrane
Page 2

1.2 Prédiction de la perméabilité membranaire
Plusieurs propriétés moléculaires gouvernent les phénomènes de perméabilité, et ainsi gouvernent le
processus d’absorption passive 1 . Le coefficient de partage (log P), le coefficient de distribution (log
D), le poids moléculaire, l’état d’ionisation (pKa) et la capacité à former des liaisons hydrogène sont
des propriétés moléculaires indispensables à analyser pour avoir une idée du profil ADME du
composé. Selon les règles de Lipinski, souvent appelées « rule of five », une substance sera peu
absorbée si : « sa masse moléculaire est supérieure à 500 Daltons, si elle possède plus de cinq
donneurs de liaisons hydrogène, si elle possède plus de dix accepteurs de liaisons hydrogène et si sa
valeur de log P est supérieure à cinq » 11 .
Concernant l’étude de la perméabilité, il est possible d’avoir recours à des études in-vitro, notamment
les modèles de culture cellulaire comme les monocouches de cellules Caco-2 immobilisées provenant
de cellules cancéreuses du colon ; ou encore à des études in-situ étudiant directement la perfusion
intestinale d’un rat anesthésié 4 et permettant l’étude du métabolisme intestinal. Enfin, des méthodes
in-vivo peuvent être utilisées et consistent en l’étude de différents paramètres pharmaco-cinétiques lors
d’administration de substances par différentes voies directement chez l’animal 4, 12 . Ces dernières sont
plus complexes et coûteuses mais reflète mieux la situation humaine.
Très tôt dans le processus de recherche et développement du médicament, plusieurs techniques in vitro
simples et peu couteuses sont utilisées pour prédire la perméabilité passive de la barrière intestinale.
Le passage passif est prépondérant dans de nombreux cas, lorsque les molécules ne possèdent pas de
transporteurs. L’utilisation du coefficient de partage dans octanol/eau pour la description de la
perméation membranaire est controversée à cause des différences observées avec les coefficients de
partage dans octanol/eau et membrane/eau 3 .
La prédiction expérimentale de la perméabilité peut également se faire en observant la répartition au
sein de liposomes, ou grâce à des méthodes chromatographiques telles que l’immobilisation de
membranes artificielles (IAM) ou de l’utilisation de micelles dans la phase mobile (BMC :
Biopartitioning Micellar Chromatography). Plus récemment la technique PAMPA (Parallel Artificial
Membrane Permeability Assay) a permis également de prédire le transport passif d’un soluté à travers
diverses membranes biologiques. Cette technique est de nos jours implémentée dans de très
nombreuses industries pharmaceutiques de par son faible cout d’utilisation et sont très haut débit, deux
paramètres importants dans les premiers stades de la recherche de nouveaux médicaments. 4 .
La technique PAMPA permet de fournir des informations relatives à la perméabilité membranaire
passive pour un grand nombre de composés 3 . Elle utilise une membrane artificielle pour mimer les
propriétés physicochimiques de la bicouche de phospholipides formant la membrane cellulaire. Elle
étudie la perméabilité passive transcellulaire. Cette méthode est en effet très utile puisqu’elle est
Page 3

automatisable, reproductible, peu coûteuse et permet un débit d’analyse élevé 13 . De plus, elle permet
d’établir le profil de perméabilité en fonction du pH 1 . Cependant elle ne permet actuellement pas
l’étude du transport actif ou du passage paracellulaire, ni du métabolisme 1,4 .
La membrane artificielle sépare un compartiment accepteur d'un compartiment donneur (figure 2).
Au temps zéro une concentration connue de composé à tester se trouve dans le compartiment donneur.
Les composés vont diffuser selon le gradient de concentration vers le compartiment accepteur.
Après un temps d'incubation déterminé, les compartiments donneur et accepteur sont désassemblés et
la concentration dans ces derniers est mesurée puis comparée à la concentration initiale se trouvant
dans le compartiment donneur à temps zéro (voir partie 2.1 notion théorique pour les calculs).
Figure 2 : Schéma de la technique PAMPA
Page 4

Il existe différents modèles PAMPA selon si l’absorption gastro-intestinale, cérébrale ou cutanée veut
être mimée. Certains de ces modèles sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous :
Tableau 1 : Principaux modèles PAMPA
Nom de l’essai Milieu mimé Composition Type de filtre 4 Référence
BBB-PAMPA
Barrière hémato-
encéphalique
PAMPA-Skin Barrière cutanée
Skin-PAMPA Barrière cutanée
Egg lecithin PAMPA
HDM-PAMPA
Barrière gastro-
intestinale
Barrière gastro-
intestinale
lipides polaires de
cerveau porcin
70% de silicone et 30%
IPM
(isopropylmyristate)
Silicone- certramides
synthetiques-acide
stearique-cholesterol
10 % de lecithine d’œuf
plus du cholesterol
PVDF
(polyvinylidene
fluoride)
PVDF
PVDF
hexadecane Polycarbonate
En ce qui concerne le modèle mimant le milieu gastro-intestinal, des variations sur les essais avec la
lécithine peuvent être rencontrées en fonction de la qualité des phospholipides et de la bonne
formation de la bicouche 1 . L’utilisation de l’hexadecane permet une préparation plus facile due à
l’absence de phospholipides et également une détermination du coefficient de perméation effective
plus fiable.
L’équipe de Faller 1 a travaillé sur les membranes en hexadecane et a montré qu’à un pH de 6.8, une
bonne corrélation était observée entre le pourcentage d’absorption humain in vivo et une perméabilité
effective (log Pe) mesurée sur HDM-PAMPA. Toutefois Pour certains composés le log Pe mesuré
menait à une sous-estimation de la fraction absorbée. Afin de mieux mimer l’environnement gastro-
intestinal, les mesures du log Pe de chaque composé ont été réalisées à différents pH : 4 ; 6 ; 6,8 et 8 et
la valeur de perméabilité obtenue la plus élevée pour chacun des composés a été prise en compte. Les
résultats obtenus avec cette deuxième méthode montrent une meilleure corrélation entre la
perméabilité effective et le pourcentage absorbé in vivo 13 .
13
14
15
4
1 , 4
Page 5

1.3 Albumine
L’Albumine de sérum humain (HSA) est une protéine plasmatique produite par le foie. Elle est
présente en grande quantité dans le sang, en effet elle représente environ 60% des protéines
plasmatiques (figure 3).
Figure 3 : Principales protéines plasmatiques humaines 16
L’albumine humaine est intègre et active à pH physiologique (7.4). Au laboratoire, une augmentation
de température, de solvant organique ainsi qu’un fort changement de pH peuvent causer une
dénaturation de cette dernière et donc une perte d’activité 17 .
Elle est majoritairement chargée négativement à pH physiologique 18 et est soluble dans l’eau ainsi que
dans les solutions faiblement concentrées en sel.
L’albumine remplit de nombreuses fonctions au sein de l’organisme, elle stabilise l’environnement
sanguin en maintenant la pression oncotique et en stabilisant le pH grâce à son rôle de tampon 19 . Elle
permet le transport de nombreuses substances dont les hormones thyroïdiennes, les acides gras, la
bilirubine, le tryptophane ainsi que de nombreux médicaments. Elle a également des fonctions
protectives notamment antioxydantes pour la bilirubine. Enfin, elle a des effets sur certains
métabolismes dont celui des lipides et permet une réserve en acides aminés 19, 20 .
Une déficience en albumine est souvent associée à des hépatites virales, une malnutrition, de l’arthrite
rhumatoïde, des carcinomes, des diabètes, des maladies rénales ou des infections sévères 21 . Cela peut
engendrer des problèmes hépatiques, le plus souvent une cirrhose.
Lors du processus de distribution du médicament au sein de l’organisme, la substance active peut se
lier plus ou moins fortement aux protéines plasmatiques et cette interaction est réversible, sauf pour
certains cas rares, notamment avec l’aspirine ou cette dernière est irréversible. Il est à noter que
seulement la fraction libre est à même de traverser les membranes cellulaires et d’atteindre la cible
thérapeutique 22 . Une substance active complexée à l'albumine aura donc une concentration active plus
faible que sa concentration totale, de ce fait, l’albumine joue le rôle de réservoir. Il est à noter que le
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composé sous forme complexée aura tout de même un effet, bien que celui-ci soit différent de la forme
active.
Les molécules anioniques par rapport aux molécules cationiques se lient préférentiellement à
l’albumine 23 .
Deux sites de liaisons ont été caractérisés, les ligands du site Sudlow I sont de volumineux anions
hétérocycliques comme la Warfarin et les ligands du site Sudlow II sont généralement des molécules
aromatiques pouvant être neutre, ou de type anionique, comme le Diazepam 23 .
Cependant certaines molécules sous forme cationiques peuvent également se lier à l’albumine 19, 23 .
La connaissance de l’affinité d’un potentiel médicament avec l’albumine est donc un paramètre très
important pour le devenir de celui-ci puisqu’elle impacte fortement notamment sur sa biodisponibilité.
C’est pourquoi de nombreuse méthode ont été développées pour prédire cette affinité le plus tôt
possible dans le processus de recherche du médicament. Parmi ces méthodes, il y a par exemple, la
dialyse qui est la méthode de référence, l’ultrafiltration ou encore l’ électrophorèse 19 . La dialyse est
une méthode simple est bon marché consistant en deux compartiments, le premier contenant les
protéines seules et le second contenant les produits testés. Les deux compartiments sont séparés par
une membrane semi perméable qui permet la séparation des composés en fonction de leur poids et de
leur taille de façon à ce que les complexes ligand-protéine ne puissent pas traverser cette dernière. En
mesurant la fraction libre restante en composés testés dans le second compartiment, il est possible de
déduire le pourcentage de produit s’étant lié aux protéines. Cette méthode permet de travailler avec
des plaques 96 puits mais le débit d’analyse reste lent car pour quantifier l’affinité il faut attendre
l’état d’équilibre. De plus de nombreuses liaisons non spécifiques ainsi que des variations de volumes
peuvent entraver l’expérience.
L’ultrafiltration utilise une méthode assez similaire, il s’agit d’une alternative plus rapide grâce à
l’application d’une pression. Elle présente les mêmes inconvénients que la dialyse ainsi que des
problèmes d’obstruction de filtre et de perturbation de l’équilibre qui peuvent survenir.
En ce qui concerne l’électrophorèse capillaire, elle permet un débit d’analyse modéré voir élevé, le
développement de la méthode est rapide et simple et ne nécessite pas d’échantillon pur. Cependant un
manque de sensibilité est observé et des adsorptions sur les parois du capillaire sont possibles.
Aucune des méthodes permettant de mesurer la liaison entre un composé et une protéine ne permet un
haut débit d’analyse à coûts raisonnables, ce qui est pourtant un paramètre important pour les études
effectuées tôt dans le processus de recherche du médicament. C’est pourquoi la technique PAMPA
serait intéressante, de plus elle permet l’utilisation de plaque 96 puits et cette méthode présente peu de
désavantage d’un point de vue pratique, mis à part la nécessité de travailler avec des réactifs très purs
si une détection UV est réalisée directement 24 . Enfin, de nombreuses études ont été effectuées avec les
différentes méthodes permettant de mesurer les constantes d’affinité des composés avec des protéines,
Page 7

mais qu’une seule étude n’a été réalisée avec la méthode PAMPA, c’est pourquoi il semble pertinent
de se pencher sur ce sujet.
1.4 But de ce travail
La présente étude consiste à déterminer de quelle façon la liaison à l’albumine influence la
perméabilité gastro-intestinale passive de certaines substances, mimée par un modèle PAMPA. Ce qui
permettrait de mettre en place une méthode rapide permettant à la fois d’obtenir des informations sur
le passage passif de NCEs et en même temps sur leur affinité potentielle avec l’albumine. Pour ce faire
des tests PAMPA avec et sans albumine dans le compartiment accepteur pour une série de composés
connus ont été effectués.
Les équilibres mis en jeux dans la PAMPA avec HSA sont schématisés ci-dessous 22 (figure 4) :
Figure 4 : Equilibres chimiques dans le PAMPA avec HSA
Page 8

2 Notions théoriques
Plusieurs équations dérivés de la première loi de Fick sont nécessaires pour l’interprétation de
PAMPA, afin d’obtenir les informations relatives à la perméabilité apparente ou effective, au bilan de
masse et au pourcentage de passage 25 (1). Un recouvrement non complet du bilan de masse sera
entièrement attribué à de la rétention membranaire bien qu’il n’est pas possible de différencier cette
rétention membranaire d’une adsorption non spécifique sur le matériel polymérique constituant les
puits.
Le pourcentage de passage correspond au rapport entre la concentration en composé dans le
compartiment accepteur au temps (t) et la concentration en composé dans le compartiment donneur au
temps (t = 0).
Pourcentage de passage =
*100 (1)
CD, CA: concentrations de composé respectivement dans les compartiments donneur et accepteurs
[mol/cm 3 ]
t : temps [s]
2.1 PAMPA sans albumine
Les molécules diffusent au travers d’une membrane perméable grâce au gradient de concentration du
milieu le plus concentré vers le moins concentré. Ce phénomène se produit jusqu’à ce que l’état
d’équilibre soit atteint, c’est-à-dire lorsque la concentration en composé est la même des deux côtés de
la membrane. Lors d’une expérience PAMPA, une seule mesure est effectuée à un temps t pour tous
les composés (« end-point measurement »). De ce fait, la valeur de perméabilité mesurée dépend de la
vitesse de perméabilité du composé et du temps d’incubation afin d’atteindre l’équilibre. Le passage
maximal des composés vers le compartiment accepteur est de 50%, puisqu’à partir de cette valeur,
l’équilibre est atteint et il n’y a plus de gradient de concentration.
La loi de Fick décrit cette cinétique de premier ordre et permet de calculer la vitesse de diffusion des
molécules à travers la membrane au temps (t). Cette vitesse est proportionnelle au gradient de
concentration des molécules entre les deux compartiments :
Où J (t) : vitesse de diffusion à travers la membrane par unité de temps [mol.s -1 ]
D : Coefficient de diffusion du composé à travers la membrane [m 2 .s -1 ]
S : Surface de la membrane [m 2 ]
E : Epaisseur de la membrane [m]
(2)
Page 9

2.1.1 Modèle sans rétention membranaire
Dans l’annexe 1 se situe les équations différentielles intermédiaires nécessaires à l’obtention de la
perméabilité apparente sans tenir compte d’une possible rétention membranaire (Pa)
Lorsque la rétention membranaire est négligeable, la perméabilité dite apparente (Pa) peut être calculée
suivant l’équation suivante :
Pa : perméabilité apparente du composé [cm/s]
A = aire de la membrane [cm 2 ]
VA, D = volume du compartiment accepteur ou donneur [cm 3 ]
La fraction du volume du compartiment donneur par rapport au volume du compartiment
accepteur est noté rv :
rv =
Les différentes expériences réalisées avec les membranes en hexadecane sur support polycarbonate
montrent qu’elles n’entrainent normalement pas de rétention membranaire, cette dernière équation
peut donc être utilisée. Cependant cela n’exclut pas d’éventuelles adsorptions non spécifiques.
2.1.2 Modèle avec rétention membranaire
Sur certains types de membranes artificielles, les molécules (souvent les plus lipophiles) peuvent être
retenues dans la membrane, il est alors nécessaire de corriger la perméabilité apparente par le facteur
de rétention membranaire.
Les équations intermédiaires se trouvent en annexe 2. On parlera de perméabilité effective (Pe) qui est
calculée grâce à l’équation suivante :
Pe : coefficient de perméabilité effective [cm/s]
τLAG: temps de saturation de la membrane [s]
RM : représente la rétention membranaire
Si le pourcentage de molécules retenues dans la membrane est négligeable, alors Pa = Pe.
(3)
(4)
(5)
Page 10

2.2 Pampa en présence d’albumine
L’article de Faller 22 a évalué la possibilité de déterminer la constante de dissociation en mettant de
l’albumine dans le compartiment donneur. Les équations ont été reprises en appliquant
numériquement l’impact de l’albumine au niveau du compartiment accepteur.
Les équations de la concentration en composé dans les compartiments donneur et accepteur, en
fonction du temps, sans albumine sont rappelées ci-dessous :
Donneur :
Accepteur :
L’influence de la formation ou dissociation du complexe ligand-HSA est décrite ci-dessous selon les
micro-constantes permettant de définir numériquement : la constante de dissociation (Ka) et la
constante de dissociation (Kd):
Où P représente la protéine (HSA) et L le ligand.
kon : vitesse de formation du complexe ligand-HSA [s]
koff : vitesse de dissociation de complexe ligand-HSA [s]
(6)
(7)
(8)
[M -1 ] (9)
[M] (10)
La quantité de HSA et de complexe ligand-HSA dans l’accepteur au cours du temps peuvent être
calculées de la façon suivante :
(11)
(12)
Page 11

Il faut prendre en compte, dans le compartiment accepteur, l’influence de la formation ou dissociation
du complexe ligand-HSA dans l’équation (7) qui devient l’équation (13). L’explication des différents
thermes de l’équation est visible en annexe 3.
Pour comprendre l’effet de chaque variable (CA, CD, HSA, Complex) qui peut entrainer une variation
de la perméabilité à travers le temps, il faut utiliser les équations différentielles (6) et (13).
(13)
Page 12

3 Matériel et méthodes
3.1 Réactifs
Les composés étudiés ont été obtenus de chez Sigma ou Fluka.
Leurs structures sont exposées dans la figure 5.
HO
N
Alprenolol
Caféine
O
Coumarine
Cl
Cl
N
O
O
NH
N
N
Diclofenac
H
N
OH
O
O
OH
O
OH
N
N
Amitryptiline
O
N
Carbamazepine
N
NH 2
NH
Desipramine
N
Imipramine
Cl
NH
Bupropion
Chlorpromazine
O
Cl
N
N
N
O
S
Diazepam
Ketoprofen
N
Cl
O
OH
O
Page 13

HN
O
N
Lidocaine
O
H
N
Phenytoïne
Propafenone
H
NH
O
NH OH
O
N
O
O
OH
Quinine
N
Metoprolol
Piroxicam
Propranolol
Verapamil
Figure 5 : Structures des composés étudiés
Le DMSO a été acheté à Fisher Chemical avec une pureté de 99.7 %
O
O
O
L’Hexane et l’Hexadecane ont été obtenus chez Fluka avec une pureté de ≥ 99 %
O
NH
N HO
HO
N
H
N
Nifedipine
Promazine
Quinidine
Warfarin
Le tampon Phosphate à pH 7.4 a été réalisé avec KH2PO4 à 0.014 M et Na2HPO4 à 0.054 M 22 , tous
deux provenant également de chez Fluka avec une pureté ≥ 99 %, selon les explications en annexe 4.
O
O
N
N
O
OH
S
O
NH
O
O
O
HN
- O
O
N +
O
N N
O
H
N
HO
O
HO
H
O
O
O
S
O
N
Page 14

L’albumine de sérum humain (HSA), sans acide gras libre vient de chez Sigma et son numéro de lot
est 42H9313.
3.2 Conditions analytiques
La quantification dans les différents compartiments a été effectuée avec une HPLC La Chrome Elite
munie d’un autosampler L 2200, d’une pompe L-2130 et d’un détecteur UV L-2400 (Hitachi, Tokyo,
Japon). La colonne séparative utilisée est une colonne Discovery® RP amide C16 (50 x 4.6 mm,
5µm) (Supelco, Bellefonte, USA).
Les analyses sont réalisées à un débit de 1 mL/min en mode isocratique et le four est chauffé à 30°C.
Cinq compositions différentes de phases mobiles ont été utilisées selon les composés, afin d’optimiser
le temps d’analyse, de façon à ce que le temps de rétention des composés ne dépasse pas 5 minutes et
de façon à ce que ces derniers soient séparés du DMSO puisque lors de l’étude de la perméabilité, les
composés sont en présence de DMSO 1%.
Les différentes compositions de phase mobile retenues sont les suivantes : 60% de méthanol et 40%
d’acide formique à 0.1%, 45% de méthanol et 55% d’acide formique à 0.1%, 30% de méthanol et 70%
d’acide formique à 0.1%, 15% de méthanol et 85% d’acide formique à 0.1% et enfin 4% de méthanol
et 96% d’acide formique à 0.1%.
L’acide formique à 0.1% a préalablement été filtré avec un filtre en nitrocellulose 0.22 µm
(GSWP04700, Millipore AG, Volketswil, Suisse).
Une méthode a ainsi été créée pour chacun des produits à analyser en tenant compte de leur longueur
d’onde pour avoir une absorbance maximale, de la meilleure composition de la phase mobile pour
chaque composé et de leur temps de rétention. Le détail de ces méthodes est présenté en annexe 5.
3.3 Mesure de la perméabilité
Des solutions stock de 20 mM des composés à tester dissous dans du DMSO (Diméthylsulfoxide) sont
préparées et conservées au réfrigérateur. Le détail des calculs pour préparer ces solutions est donné en
annexe 4.
Le compartiment donneur est constitué d’une plaque 96-puits munie de filtres en polycarbonates (PC)
(Multiscreen Millipore MPC4NTR10, Millipore AG, Volketswil, Suisse). Ces filtres ont une épaisseur
de 10 µm une porosité de 5 à 20 % et la taille des pores est de 0.4 µm.
La surface disponible correspond à la surface des filtres multipliée par la porosité maximale des filtres
Soit :
Surface disponible = 0.24*0.2 = 0.048 cm 2 (16)
Page 15

Le volume à utiliser est obtenu en multipliant la surface par l’épaisseur des filtres :
Volume = 0.00048*0.0001 = 0.048 µL (17)
3 mL d’un mélange de 150 µL d’hexadecane et de 2.85 mL d’hexane sont préparés puis 15 µl de cette
solution sont ajoutés dans chaque puits avec un robot pipeteur (Bio-tek instrument, Inc, Luzern,
Suisse) contrôlé grâce au logiciel Precision 2000 (Bio-tek instrument, Inc, Luzern, Suisse). La plaque
est laissée sous la chapelle, à température ambiante sous agitation (75 rpm) afin que l’hexane
s’évapore.
La solution destinée au compartiment accepteur est faite du tampon phosphate à pH 7.4 avec 1% de
DMSO (pour les tests sans albumine) et additionné de 100 µM d’albumine de sérum humain (pour les
tests avec albumine) 22 . Les calculs pour préparer les solutions sont présentés en annexe 4. 280 µL de
solution sont dispensés avec le robot pipeteur dans chaque puits d’une plaque 96 puits en téflon®
(Millipore MSSACCEPTOR) (partie inférieure du sandwich PAMPA).
Les solutions destinées aux compartiments donneurs sont préparées à base des solutions stocks qui
sont ensuite diluées dans le même tampon phosphate à pH 7.4 et sont alors à une concentration de 50
µM en présence de DMSO 1%. Les calculs pour préparer les solutions sont présentés en annexe 4.
Cette solution est également utilisée pour obtenir notre référence à temps 0 qui équivaux à la
concentration dans le donneur à temps zéro.
Le compartiment donneur est déposée sur la plaque en Teflon® (compartiment accepteur) puis 280 µl
de solution tampon contenant les produits à testés sont dispensés avec le robot pipeteur dans chacun
des puits. Chaque composé est testé en quadruplat. Un exemple de remplissage des plaques est
présenté en annexe 6.
Le sandwich ainsi formé est incubé à température ambiante et agité à 75 rpm pendant un certain laps
de temps. Après le temps d'incubation voulu, les compartiments donneurs et accepteurs sont séparés et
la quantité de produit restant dans le compartiment donneur ainsi que celle qui a atteint le
compartiment accepteur sont déterminées par HPLC puis le coefficient de perméabilité effective, la
rétention membranaire et le pourcentage de passage sont calculés pour chacun des composés testés.
Dans le but de vérifier l’intégrité de la membrane, de l’Ethidium bromide est ajouté à différents
emplacements de la plaque 96 puits. Ce composé comporte un azote quaternaire, il est donc chargé
Page 16

quelque soit le pH et ne passe par conséquent théoriquement pas la membrane artificielle. Si ce témoin
est retrouvé dans le compartiment accepteur, alors la membrane est détériorée.
Les différentes étapes sont résumées sur la figure 6 ci-dessous :
Figure 6 : Résumé des étapes d’une PAMPA
3.4 Visualisation numérique avec le modèle mathématiques
Afin de simuler l’évolution des différentes concentrations en produit au sein des compartiments
donneurs et accepteurs au cours du temps, les paramètres suivants sont appliqués au modèle
mathématique : Log Pe = -3.5, koff = 1 s -1 , A = 0.048 cm 2 , CD(t=0sec) = 50 µM, HSA(t=0sec)=100 µM, VM =
0.75 µl, VA = 0.28 µl et VD = 0.28 µl. Pour visualiser la situation sans albumine, un koff de 0 s -1 est
appliqué.
Page 17

4 Résultats et discussion
4.1 Partie numérique
Pour visualiser le comportement des différentes concentrations de produit dans les compartiments
donneurs et accepteurs en présence ou non d’albumine au cours du temps dans une PAMPA, le
programme PTC Mathcad Prime 2.0 Student Edition a été utilisé pour créer un modèle numérique
avec les équations différentielles (6) et (13) :
Ces équations sont nécessaires pour l’interprétation d’une PAMPA contenant de l’albumine dans les
compartiments accepteurs. Ce modèle permet de simuler les cinétiques de disparition et d’apparition
de produit dans les différents compartiments en fonction du temps avec différentes conditions (i.e. :
concentration de départ, concentration finale dans chaque compartiment, log Pe, concentration en
HSA, constante de dissociation). Il est alors possible de tracer une courbe théorique de perméabilité
selon les paramètres appliqués.
4.1.1 Cinétique de perméabilité en l’absence d’HSA
La figure ci-dessous illustre l’effet sur la concentration dans le compartiment donneur de différents
composés ayant différents log Pe. Ce sont ces conditions sur 4-5 heures qui ont permis à l’équipe de
Faller de faire corréler des valeurs de log Pe à des pourcentages d’absorption gastro-intestinale
humaine 22 .
(6)
(13)
Page 18

[Ligand] donneur
5.010 -5
4.510 -5
4.010 -5
3.510 -5
3.010 -5
2.510 -5
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000
Temps [seconde]
Figure 7 : Effet de différents log Pe à travers le temps. Le temps d’analyse pour calculer le logPe est
de 4 heures. Les courbes sont illustrées selon les log Pe suivant : Metoprolol (5.01), Warfarin (4.72),
Diclofenac (4.34), Propranolol (3.89) et Diazepam (3.73) (respectivement courbes A, B, C, D et E)
Ces courbes ont été obtenues avec des valeurs expérimentales de log Pe obtenues après 4 heures. Les
cinétiques de perméabilité ont été simulées jusqu’à environ 19 heures grâce au modèle numérique.
Avec ce modèle numérique, il est intéressant de voir que pour atteindre l’équilibre du système (c’est-à-
dire pour avoir une concentration équivalente dans le compartiment accepteur et compartiment
donneur), il faut attendre 27 heures par exemple avec le diazepam qui a un log Pe de 3.73 et jusqu’à 22
jours (528 heures) avec le metoprolol qui a un log Pe de 5.01. Ceci ne prend pas en compte une
éventuelle dégradation de la membrane au cours du temps.
4.1.2 Cinétique de perméabilité avec HSA
L’impact de l'albumine mise dans le compartiment accepteur sur la concentration de composé libre
(figure 8) et de complexe ligand-HSA (figure 9) dans le compartiment accepteur, ainsi que sur la
concentration de ligand libre dans le compartiment donneur (figure 10) lors d’une expérience PAMPA
a été simulé. Ces simulations, sur 4 heures, ont été effectuées pour des ligands de différentes affinités
avec l’HSA, avec un log Pe de -3.5, les autres paramètres restant inchangés. Les valeurs de Kd choisies
sont comprises entre 0.1 M et 0.00001 M. L’impact de l’albumine est observée en analysant la
différence qu’il y a entre une courbe numérique sans albumine et des courbes numériques avec
albumine.
A
B
C
D
E
Page 19

[ligand sous forme libre] accepteur
2.010 -5
1.510 -5
1.010 -5
5.010 -6
Sans HSA ; A
B
E
0
0 5000 10000 15000
Temps [s]
Figure 8 : Variation de la concentration du ligand sous forme libre dans le compartiment accepteur
en fonction du Kd. Les courbes A, B, C, D, E sont respectivement réalisées avec les constantes
suivantes : Kd= 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001 et 0.00001 M.
La constante de dissociation définit la capacité d’un complexe formé entre l’albumine et un ligand à se
dissocier. Une faible constante de dissociation devrait entrainer en solution une augmentation de la
forme complexée vis-à-vis de la forme libre du ligand. La figure 8 ci-dessus montre effectivement
qu’il y a de moins en moins de forme libre dans le compartiment accepteur pour des composés ayant
une grande affinité avec l’HSA.
[Complexe] accepeteur
2.010 -5
1.510 -5
1.010 -5
5.010 -6
0
Sans HSA ; A ; B
0 5000 10000 15000
Temps [s]
Figure 9 : Variation de la concentration en complexe dans le compartiment accepteur en fonction du
Kd. Les courbes A, B, C, D et E sont respectivement réalisées avec les constantes suivantes : Kd= 0.1,
0.01, 0.001, 0.0001 et 0.00001M.
E
D
C
C
D
Page 20

La figure 9 montre effectivement que plus le Kd est élevé, moins il y aura de complexe formé entre
l’albumine et le composé. Ceci entrainera une plus grande concentration en composé libre en solution
vis-à-vis de la forme complexée.
L’impact de la constante de dissociation a été également observé au niveau du compartiment donneur.
Le graphique suivant montre l’influence du Kd sur la diminution en concentration d’un ligand sous
forme libre dans le compartiment donneur. L’albumine ne traverse pas la membrane artificielle et reste
par conséquent dans le compartiment accepteur (figure 10). (Voir chapitre 4.2.1.)
[ligand sous forme libre] donneur
6.010 -5
4.010 -5
2.010 -5
0
0 5000 10000 15000
Temps [s]
Sans HSA ; A ; B ; C
D
E
Figure 10 : Variation de la concentration en ligand dans le compartiment donneur en fonction du Kd.
Les courbes A, B, C, D et E sont respectivement réalisées avec les constantes suivantes : Kd= 0.1,
0.01, 0.001, 0.0001 et 0.00001M.
Dans le compartiment donneur, la concentration de ligand sous forme libre varie très peu en fonction
du Kd. Cependant, il est quand même visible que plus le Kd est faible, plus la concentration en ligand
dans le compartiment diminue par rapport à la courbe sans albumine. En effet la formation de
complexe dans le compartiment accepteur déplace l’équilibre de la PAMPA, ce qui permet de
maintenir un certain gradient de concentration et d’augmenter la proportion de soluté qui passe du
compartiment donneur vers le compartiment accepteur.
Page 21

Enfin, l’influence de la micro-constante koff a été étudiée. Les valeurs de koff choisies sont comprises
entre 0 s -1 et 0.00001 s -1 . Les autres paramètres restent constants (log Pe = -3.5 et log Kd = -3.5 M).
Le graphique qui suit montre les variations obtenues dans le compartiment donneur pour différents
koff :
[ligand sous forme libre] donneur
6.010 -5
4.010 -5
2.010 -5
C D E
B
Sans HSA ; A
0
0 5000 10000 15000
Temps [s]
Figure 11 : Variation de la concentration en ligand dans le compartiment donneur en fonction du koff.
Les courbes A, B, C, D et E sont respectivement réalisées avec les constantes suivantes : koff = 0.1,
0.01, 0.001, 0.0001 et 0.00001 s -1 .
Le koff représente la vitesse à laquelle le complexe HSA-ligand va se dissocier. La concentration en
ligand dans le compartiment donneur reste presque inchangée lorsque le koff varie. Une légère
différence en concentration est observée avec des valeurs de koff très faible. Ceci est normal car
l’équilibre dans le compartiment accepteur tend vraiment plus du côté complexe (ligand-HSA), donc
le gradient de concentration du ligand sous forme libre est légèrement plus fort avec des koff faibles.
Page 22

Pour finir, la figure 12 ci-dessous représente la différence de concentration dans le compartiment
donneur en comparant la situation sans albumine et avec albumine obtenue avec le modèle
mathématique :
[ligand sous forme libre] donneur
5.010 -5
4.010 -5
3.010 -5
2.010 -5
1.010 -5
A sans HSA
A avec HSA
C sans HSA
C avec HSA
B sans HSA
B avec HSA
0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000
Temps [s]
Figure 12 : Représentation graphique avec le modèle mathématique des courbes avec différents log
Pe : -3.5 (A), -4.2(B) et -5 (C). Un log Kd de -4M est appliqué avec les trois différentes perméabilités
et tous les autres paramètres sont équivalents.
[ligand sous forme libre] donneur
1.010 -5
8.010 -6
6.010 -6
4.010 -6
2.010 -6
0
0 50000 100000 150000
Temps [s]
Figure 13 : différence de concentration entre les courbes avec et sans HSA pour les différents log Pe :
-3.5 (A), -4.2(B) et -5 (C).
Les figures ci-dessus (figure 12 et figure 13) donnent les valeurs de la différence de concentration,
avec et sans HSA, dans le compartiment donneur au cours du temps pour 3 différents log Pe.
Numériquement, pour un ligand avec une bonne perméabilité (log Pe = -3.5), on obtient après 4 heures
A
B
C
Page 23

une différence de concentration d’environ 1.4 μM, et respectivement pour 8, 16 et 40 heures on obtient
3.5 μM, 6 μM et 8 μM. Avec un log Pe de -4.2 on obtient des différences de concentration de 0.08 μM,
0.3 μM, 1 μM et 3.5 μM et avec un log Pe de -5 la différence est d’environ 0.0018 μM, 0.009 μM,
0.033 μM et 0.2 μM pour respectivement 4, 8, 16 et 40 heures.
Pour les composés avec une forte perméabilité (log Pe de -3.5), une différence au niveau de leur
concentration dans le compartiment donneur entre la situation avec et sans HSA pourra être observée
au bout de 4 heures. Pour ceux possédant un log Pe plus faible, il sera nécessaire d’attendre plus
longtemps afin de pouvoir observer une différence.
Ceci implique que le choix du temps d’incubation va être primordial. De ce fait, un temps d’analyse de
16h sera choisi pour la partie expérimentale pour les composés ayant un log Pe compris entre -3.5 et -4
environ.
Le modèle mathématique permet d’anticiper les résultats d’une expérience. Il a permis de montrer que
d’une façon générale, sans HSA, plus la perméabilité d’un composé est grande, plus la différence de
concentration de ce dernier au sein d’un compartiment va varier rapidement. En effet, la concentration
dans le compartiment donneur va rapidement diminuer pendant que celle du compartiment accepteur
se verra augmentée.
De ce fait, pour les composés ayant un log Pe faible, le temps d’incubation de la PAMPA devra être
augmenté afin que le changement de concentration dans un compartiment soit quantifiable.
Le modèle met également en évidence l’influence de HSA lorsque cette dernière est placée dans le
compartiment accepteur. Plus la constante de dissociation d’un composé avec HSA est petite, plus ce
dernier se trouvera sous forme complexée avec la protéine et donc plus l’effet de HSA sera
observable. La concentration en composé sous forme libre sera alors d’autant plus diminuée au cours
du temps que le Kd est petit et inversement pour la concentration en complexe qui se verra augmentée
dans le compartiment accepteur. De ce fait, la concentration en composé dans le compartiment
donneur sera quant à elle d’autant plus diminuée au cours du temps que le Kd est petit. En effet,
comme la protéine ainsi que les complexes formés se trouvent dans le compartiment accepteur et ne
peuvent passer la membrane, la partie de ligand se trouvant sous forme complexée n’entrera pas dans
l’équilibre régissant le gradient de concentration qui sera alors maintenu dans la direction du
compartiment accepteur selon une grande force.
En ce qui concerne le koff n’a qu’une faible influence sur la différence de concentration lorsque le
composé est en présence ou non de HSA. Celle-ci reste presque inchangée bien qu’il soit notable que
plus le koff est petit, plus la différence de concentration augmente. Cela s’explique par le fait qu’un
Page 24

faible koff signifie que le composé mettra longtemps à se séparer de HSA et restera donc plus
longtemps sous sa forme complexée, rendant alors le gradient de concentration un peu plus fort.
Enfin, il a été vu que lorsque les composés ont une constante de dissociation intermédiaire (log Kd = -4
M), le modèle montre que pour les composés ayant une bonne perméabilité (log Pe= -3.5), un temps
d’incubation de 4 heures permet d’observer une diminution de 1.4 μM alors que pour les composés
avec log Pe de -4.2, une incubation de 16 heures est nécessaire pour observer une différence de 1 μM.
Concernant les composés très faiblement perméables (log Pe = -5), 110 heures doivent s’écouler afin
d’observer une diminution de concentration de 1μM. De ce fait, si le log Pe de chacun des composés
est connu, il est donc possible grâce au modèle mathématique de prédire le temps d'incubation optimal
de la PAMPA afin de pouvoir observer une différence de concentration en composés dans l’un des
compartiments lorsque ces derniers sont en présence et en absence de HSA.
Le modèle a donc permis de voir les tendances et ainsi les résultats qui peuvent être obtenus
expérimentalement pour chaque composé. D’après les simulations faites avec le modèle, il a été décidé
pour les composés ayant un log Pe situé environ entre -3.5 et -4 d’incuber la PAMPA pendant 16
heures afin de bien voir les différences de concentrations avec et sans HSA.
Enfin, le modèle numérique devrait permettre d’estimer le Kd d’un composé vis-à-vis de l’albumine si
la différence de concentration avec et sans HSA est observable. D’où l’intérêt de sélectionner des
composés ayant une bonne perméabilité (log Pe entre -3.5 et -4). Pour cela, les données expérimentales
nécessaires sont : le log Pe sans HSA d’un composé et la concentration final en ligand dans le
compartiment donneur d’une PAMPA avec HSA.
La partie expérimentale permettra donc d’obtenir des informations sur la perméabilité passive des
composés sans HSA puis en ajoutant l’albumine, il sera alors possible de déterminer un Kd et
finalement de vérifier l’influence de ce dernier, plus il sera petit, plus la différence de concentration en
présence et en absence d’HSA devrait être grande.
4.2 Partie expérimentale
4.2.1 PAMPA sans HSA
Le modèle mathématique montre numériquement que plus un composé à une forte perméabilité, plus il
est possible d’observer une constante de dissociation s’il y a une interaction ligand HSA. Ainsi l’étude
c’est tourné sur des ligands à forte perméabilité à travers une membrane à base d’hexadecane. Pour
définir ce genre de ligand, une première expérience HDM-PAMPA sans albumine été effectuée.
Comme l’a fait Faller et son équipe 1 , cette expérience permettra de mettre en relation le pourcentage
d’absorption gastro-intestinal des composés testés avec leur perméabilité, c’est-à-dire avec leur valeur
Page 25

de log Pe obtenu par test PAMPA sans ajouter de l’albumine dans le compartiment accepteur. Etant
donné que ces valeurs de perméabilité sans HSA sont nécessaires pour la suite des expériences, le
protocole initialement publié a été adapté en prévision de l’utilisation de la HSA dans la suite du
travail.
Les principales différences expérimentales entre les deux protocoles sont résumées dans le tableau 2 :
Conditions expérimentales Faller et al. 1
protocole
adapté
pH
6,8
4 ; 6; 6.8 et 8
7,4
% DMSO 5 1
Tableau 2 : Différences entre les conditions de cette expérience et celle réalisée par Faller et al.
Lors de son second test, Faller réalise différentes expériences avec différents pH afin de mimer au
mieux le milieu gastro-intestinal et prend en compte la valeur de perméabilité obtenue la plus élevée.
L’effet du pH peut avoir une influence car il est connu qu’un composé sous forme neutre aura plus
d’affinité pour les milieux lipophiles contrairement aux formes ionisées dont l’affinité est plus grande
pour les milieux aqueux. De cette façon, le pH à une grande importance quant à la vitesse de
perméabilité d’un composé à travers les membranes biologiques. En effet, celles-ci étant lipophiles, les
composés sous forme neutre auront un passage favorisé 26 .
Néanmoins, les molécules testées sont principalement des bases faibles (voir partie 3.1), elles sont
toutes ionisées à pH 7.4 et leur pourcentage d’ionisation ne varie presque pas à pH 6.8 et varie peu que
l’on soit à pH 4, 6 ou 8 comme présenté en annexe 7. Le fait que le pH utilisé soit différent de celui
utilisé par l’équipe de Faller n’a donc pas un impact significatif sur les valeurs de perméabilité
obtenues pour les composés utilisés.
Enfin, la quantité de DMSO utilisée diffère également. Le DMSO permet de solubiliser les composés,
mais peu aussi augmenter la perméabilité de ces derniers. Or, cela est sans conséquence comme le
montre les différents tests réalisés dans l’article de Balimane 27 .
Les réflexions faites précédemment permettent d’établir une relation entre le pourcentage d’absorption
gastro-intestinale de 20 composés avec leur log Pe à partir de l’annexe 8 (figure 14). Ces composés ont
tous une bonne absorption gastro-intestinale selon la littérature. Ce paramètre étant important selon les
observations faites dans le chapitre 4.1.2.
Page 26

% d'absorption gastro-intestinal
150
100
50
Faible perméabilité
Grande perméabilité
0
-6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 -3.5 -3.0
Log Pe (4h)
Figure 14: La relation entre le pourcentage d’absorption gastro-intestinale des composés avec leur
28, 29
log Pe. Les pourcentages d’absorption ont été obtenus de différentes sources
La figure 14 montre que les composés en noirs sont ceux ayant une bonne perméabilité passive et étant
bien absorbés dans le milieu gastro-intestinal. Ces composés seront ceux testés avec HSA par la suite.
En revanche le composé représenté en vert a une grande perméabilité passive mais est peu absorbé au
niveau gastro-intestinal. Ce composé est l’amitriptyline et cela semble être dû à des protéines d’efflux,
notamment la glycoprotéine P 30 , réduisant ainsi son absorption gastro-intestinale.
Enfin, les composés représentés en rouge, le ketoprofen, la caféine, le piroxicam, la warfarin, le
metoprolol et le diclofenac sont ceux qui ont une faible perméabilité passive sur HDM-PAMPA mais
qui sont néanmoins très bien absorbés selon les données in vivo. Cela est certainement dû au fait
qu’elles sont activement transportées au niveau du tube gastro-intestinal. En effet le ketoprofen montre
une certaine affinité avec les transporteurs du glucose (GluT 1) 31 , ainsi qu’avec les transporteurs des
acides monocarboxyliques (MCT1) 32 . La caféine semble utiliser les transporteurs des purines 33 . Le
piroxicam utiliserait les transporteurs humains des anions organiques (hOAT 1,3 et 4) 34 et le
metoprolol quant à lui peut utiliser les transporteurs de cations organiques présents dans les reins et le
petit intestin (OCT 2) 35 .
4.2.1 PAMPA avec HSA
Afin d’évaluer l’effet de l’albumine dans le compartiment accepteur d’une PAMPA, il a fallu s’assurer
que l’albumine située dans le compartiment accepteur ne passe pas la membrane et ne se retrouve
donc jamais dans le compartiment donneur.
La figure 15 représente un chromatogramme d’un compartiment donneur (A) et d’un compartiment
accepteur (B), obtenus pour un blanc après 16 heures d’incubation. C’était une des premières choses à
Page 27

vérifier, il ne fallait pas que la membrane hexadecane 1 soit perméable à l’HSA sous sa forme libre ou
complexée. Si tel était le cas, il aurait été difficile voire impossible de déterminer un Kd.
Figure 15 : Chromatogramme d’un compartiment donneur (A) et accepteur (B) d’une PAMPA avec
HSA, en absence de ligand
La figure 15 montre, pour le chromatogramme A, un pic observé à 0.75 min qui correspond au DMSO
(présent à 1% dans la solution). Au niveau du chromatogramme B, ce pic est bien retrouvé au sein du
compartiment accepteur ainsi qu’un second pic visible à 0.4 min. Ce dernier pic ne peut correspondre
qu’à l’albumine, ce qui démontre bien que HSA ne passe pas la membrane hexadecane et reste
toujours dans le compartiment accepteur tant que la membrane est intègre comme en accord avec la
littérature 22 .
Ensuite, il a été remarqué que lors de l’analyse par HPLC-UV, seul le ligand sous sa forme libre était
détecté. La forme complexée entre le ligand et l’albumine n’est jamais visible dans le compartiment
accepteur. Lors de la quantification de ligand par HPLC-UV, une perte de produit devrait être
observée dans le rapport du bilan de masse, due à la formation de complexe. Cependant, aucune perte
de masse importante n’est observée, il est probable qu’une dissociation du complexe ait eu lieu,
certainement due à une dégradation de HSA lors de l’analyse HPLC-UV. En effet, la phase mobile
utilisée est à base de solvant organique (méthanol) et d’acide formique 0.1% à pH 2 et il est connu de
la littérature que HSA est très sensible aux solvants organiques et se dénature irréversiblement lorsque
Page 28

le pH ne se situe plus entre 5-8 36 . Cependant, aucunes autres phases mobiles testées n’a permis de
garder la liaison ligand- HSA conservant ainsi la forme complexée.
Il a donc été décidé d’observer la variation de concentration en soluté au sein du compartiment
donneur en présence et en absence d’HSA. Pour cela il a fallu corriger les valeurs expérimentales
obtenues comme détaillé dans l’annexe 9.
Le modèle mathématique a permis d’établir que pour des composés ayant un log Pe compris entre
environ -3.5 et -4, un temps d’incubation de 16 heures est optimal pour pouvoir observer une
différence de concentration dans le compartiment donneur en présence et en absence d’HSA si le
ligand a une affinité envers HSA (figure 12 et figure 13). De ce fait, l’obtention du Kd avec HSA d’un
composé ayant une perméabilité élevée est montré avec l’exemple du propafenone (log Pe = 3.93) sur
la figure 16. Cette figure montre des courbes tracées par le modèle numérique avec les valeurs
expérimentales obtenues du propafenone.
La courbe en rouge représente une simulation numérique de l’évolution de la concentration dans le
compartiment donneur au cours du temps pour le log Pe (équation 4) expérimentale du propafenone
sans HSA.
La croix violette représente la concentration dans le donneur après 16 heures d’incubation du même
composé en présence d’albumine dans l’accepteur, elle est calculée comme présenté dans l’annexe 9.
Enfin, la courbe verte représente l’évolution de la concentration au cours du temps avec HSA simulée
par le modèle en gardant la même valeur de log Pe que la courbe rouge puisque la valeur de
perméabilité est un caractère propre à chaque composé et ne varie donc théoriquement pas.
Afin de déterminer le Kd, une variation de celui-ci est appliquée sur le modèle numérique avec les
données expérimentales. Dès que la courbe verte entre en intersection avec la croix violette on obtient
la constante de dissociation. Il représente une contrainte nécessaire pour faire varier la courbe verte sur
la croix violette. La détermination de la constante de dissociation se fait donc en un point de
comparaison au temps t. Cela est une nouveauté par rapport aux méthodes existantes pour la
détermination des constantes d’affinité qui nécessitent plusieurs points afin d’obtenir une cinétique.
Page 29

[ligand sous forme libre] donneur
5e-005
4e-005
3e-005
2e-005
1e-005
0
0 20000 40000
Temps [s]
60000 80000
Figure 16 : simulation de l’évolution de la concentration en propafenone dans le compartiment
donneur au cours du temps. La courbe verte représente la simulation avec HSA, la rouge sans HSA,
les deux sont obtenues à partir du log Pe expérimental sans HSA. La croix violette représente la
concentration après 16h d’incubation en présence de HSA du propafenone obtenue
expérimentalement.
Pour le propafenone, la différence de concentration dans le compartiment donneur lorsque ce composé
est en absence et en présence de HSA est de l’ordre de 5µM environ et un Kd peut être déterminé.
En ce qui concerne un composé ayant une perméabilité plus faible, par exemple le salicylamide ayant
un log Pe de -4.29, la différence de concentration dans le compartiment donneur entre la situation avec
et sans albumine après 16h d’incubation est présentée ci-dessous (figure 17).
[ligand sous forme libre] donneur
5e-005
4e-005
3e-005
2e-005
1e-005
0
0 20000 40000
temps [s]
60000 80000
Figure 17 : simulation de l’évolution de la concentration en propafenone dans le compartiment
donneur au cours du temps. La courbe verte représente la simulation avec HSA, la rouge sans HSA,
les deux sont obtenues à partir du log Pe expérimental sans HSA. La croix violette représente la
concentration après 16h d’incubation en présence de HSA du salicylamide obtenue
expérimentalement.
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Il est visible que pour ce composé de moyenne perméabilité, aucune différence de concentrations entre
la situation avec et sans HSA n’est observé. Il n’est donc pas possible de déterminer le Kd.
Les résultats expérimentaux corrèlent donc avec les prédictions numériques en ce qui concerne le fait
qu’il est nécessaire d’avoir des log Pe inférieurs à environ -4 pour pouvoir observer une différence de
concentrations après 16 heures d’incubation.
Pour les composés de moyenne perméabilité, ayant des log Pe compris entre -4 et -4.5, comme le
salicylamide, des PAMPA avec des temps d’incubation de 40 heures ont été réalisées. Cependant
aucune différence de concentration n’a été observée avec et sans HSA, comme présenté en annexe 10.
Ces résultats confirment ce qui a été montré avec les (figure 12 et figure 13) du chapitre 4.1.2. Il aurait
fallu augmenter encore le temps d’incubation mais par soucis d’intégration de la membrane et pour
des raisons pratiques, cela n’a pas été testé.
4.2.1 Kd obtenus comparés aux Kd de la littérature
Ensuite, les Kd obtenus avec le modèle sont comparés au Kd trouvés dans la littérature 37, 38, 39, 40 (figure
18), un tableau des valeurs obtenues se trouve en annexe 11.
- log K d obtenu avec le modèle
4,3
4,1
3,9
3,7
3,5
3,3
3,1
2,9
2,7
y = 0,4465x + 1,7947
R² = 0,8159
2,5
2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5
- log K d de la littérature
Figure 18 : Kd obtenus avec le modèle en fonction des Kd trouvés dans la littérature. Les points en
bleu sont ceux pour lesquels les valeurs obtenues avec le modèle corrèlent bien avec les valeurs de la
littérature, les points rouges sont ceux pour lesquels aucune corrélation n’est observée.
Cette comparaison a pu être réalisée seulement sur onze composés car il a été difficile de trouver des
composés ayant un log Pe compris entre -3.5 et -4, il faut également que les composés ne précipitent
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pas, que leur Ka ou Kd soient disponibles dans la littérature et de plus il faut que ces derniers soient
UV-visibles.
Pour les composés sur lesquels l’expérience a pu être réalisée, il est visible que le modèle donne une
assez bonne prédiction pour la valeur des coefficients de dissociation des composés avec HSA lorsque
la concentration dans le compartiment donneur après 16h d’incubation en présence de HSA est connue
ainsi que le log Pe. En effet les valeurs de Kd obtenues corrèlent assez bien aux Kd de la littérature
puisque le coefficient de variation est de 0.82. Cependant, pour un seul composé représenté par un
point rouge, le Kd obtenu ne correspond pas avec le Kd de la littérature, il n’a donc pas été pris en
compte pour calculer le coefficient de variation. Il est possible de conclure que l’utilisation de la
PAMPA peut permettre d’obtenir une bonne estimation des constantes de dissociation ligand-HSA.
4.2.2 Influence de HSA sur la concentration en ligand dans le compartiment donneur
Enfin, l’influence du Kd des composés sur la variation de concentration en ligand dans le
compartiment donneur en présence et en absence d’albumine dans l’accepteur a été étudiée. Cette
étude a été faite afin de voir si l’albumine étant une protéine plasmatique a une influence sur la
perméabilité observée par les modèles PAMPA. Les résultats sont regroupés sur le graphique ci-
dessous (figure 19) et un tableau des valeurs obtenues se trouve en annexe 12.
[ligand sans HSA] - [ligand avec HSA]
8
7
6
5
4
3
2
1
0
y = 5,2879x - 15,554
R² = 0,8589
3 3,2 3,4 3,6 3,8 4 4,2 4,4
- Log Kd [M] obtenus avec le modèle
Figure 19 : Différence de concentrations entre la situation sans et avec HSA dans le compartiment
donneur pour chaque composé, après 16h d’incubation, en fonction des –log Kd obtenus avec le
modèle numérique.
Ces composés ont tous une grande perméabilité et il a donc été possible d’observer des différences de
concentration entre la situation sans et avec albumine après 16h d’incubation. La valeur du Kd est
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quantifiable, si la différence de concentration sans HSA et avec HSA est positive. Cela signifie que la
concentration dans le compartiment donneur avec HSA est inférieure à la concentration sans HSA
après 16h d’incubation. Il y a donc eu plus de passage vers le compartiment accepteur en présence de
HSA. De plus ces différences de concentrations sont corrélées avec les –log Kd des composés (figure
19).
Comme vu dans la partie numérique, chapitre 4.1.2, plus le Kd est petit, c’est à dire plus le –log Kd est
grand, plus la différence de concentration dans le donneur entre l’expérience en absence et en présence
de HSA est grande. Cela s’explique par le fait que le Kd représente la capacité d’un complexe ligand-
HSA à se dissocier, si il est petit, le complexe se dissociera très peu et il y aura donc d’avantage de
composé sous forme complexée avec HSA. Ce complexe étant dans le compartiment accepteur et ne
pouvant pas traverser la membrane, la concentration de ligand libre disponible dans le compartiment
accepteur diminue. L’équilibre de passage de la forme libre du ligand dans une PAMPA est donc
déplacé (figure 4). C’est pour cela que le passage des composés est augmenté en présence de HSA et
peut dépasser 50% de composé dans le compartiment accepteur. De ce fait, la concentration en
composé est diminuée dans le compartiment donneur. D’après la première loi de Fick (équation 2), la
perméabilité est intrinsèque à un composé donc elle est constante, même en présence d’HSA. C’est
donc l’équilibre de passage qui change dû à la formation de complexe dans l’accepteur. Cela se
répercute sur le gradient de concentration qui garde une certaine force.
Page 33

5 Conclusion et perspectives
Il est important de pouvoir mesurer la perméabilité des composés tôt dans le processus de recherche
des médicaments. La méthode PAMPA consistant en un compartiment donneur et un compartiment
accepteur séparés par une membrane synthétique, étudie le passage transcellulaire passif. Cette
méthode est intéressante car elle est automatisable, reproductible, peu coûteuse et surtout, elle permet
un débit d’analyse élevé. Cependant elle ne permet actuellement pas l’étude du transport actif ou du
passage paracellulaire, ni du métabolisme.
La problématique de ce sujet est d’évaluer l’influence de la liaison aux protéines plasmatiques sur la
perméabilité gastro-intestinale mimée par un modèle PAMPA. L’effet de l’albumine a été observé à
travers le modèle HDM PAMPA adapté pour contenir de l’albumine dans les compartiments
accepteurs afin de pouvoir mesurer la constante de dissociation des composés vis-à-vis d’HSA avec un
haut débit d’analyse.
Pour créer un modèle mathématique permettant d’anticiper les résultats d’une expérience et ainsi
choisir les conditions expérimentales optimales pour chaque composé, les équations de perméabilité
ont été reprises en appliquant numériquement l’impact de l’albumine au niveau du compartiment
accepteur (équations 6 et 13).
Le modèle montre que plus la constante de dissociation (Kd) du composé avec HSA est petite, plus la
différence de concentration dans la situation sans et avec HSA sera visible. Le koff quant à lui n'a
qu'une faible influence. De plus, le modèle a permis de montrer que pour observer une interaction
entre un ligand et l’albumine dans un modèle PAMPA, il fallait que le composé, interagisse avec
l’albumine, qu’il ait une perméabilité (log Pe) d’environ -3.5 à -4 et un temps d’incubation de 16
heures est nécessaire.
Les expériences PAMPA ont permis d’obtenir des informations sur la perméabilité des composés et
ont également permis de vérifier les observations numériques. En effet, plus le Kd est petit, plus la
différence de passage est grande entre une PAMPA sans ou avec HSA. Cela s'explique par le fait que
le complexe ligand-HSA ne peut pas traverser la membrane et la partie de ligand se trouvant sous
forme complexée n’entrera pas dans l’équilibre régissant le gradient de concentration qui sera alors
maintenu dans la direction du compartiment accepteur selon une certaine force.
Si la différence de concentration en composé sans et avec HSA est observable, alors le Kd peut être
déterminé. De ce fait, il a été possible de déterminer le Kd de certains composés avec HSA. En
comparant les Kd obtenus avec les Kd de la littérature, un coefficient de corrélation de 0.82 a été
obtenu. Le modèle semble être fiable pour mesurer l'affinité des composés avec HSA et cela peut se
faire à haut débit grâce à la méthode PAMPA.
En conclusion, sachant que le modèle PAMPA permet de prédire la perméabilité intestinale des
composés, en ajoutant de l’ HSA dans le compartiment accepteur, ce travail a permis d’évaluer
Page 34

également leur affinité potentielle avec l’albumine. Le tout est adapté à un criblage haut débit grâce à
la PAMPA.
A cela s’ajoute le fait que le modèle mis au point est le seul modèle actuel permettant de trouver des
valeurs de constantes d’association avec HSA avec 1 seul point de comparaison. Dans la littérature, les
méthodes permettant la détermination de constante de dissociation nécessite plusieurs points pour
obtenir une cinétique. La membrane utilisée dans un modèle PAMPA permet de créer cette cinétique
nécessaire à la détermination des constantes de dissociation et d’association.
Ce test comporte cependant certaines limites. Seulement les composés avec une bonne perméabilité
sur membrane hexadecane sont susceptibles de fournir des informations et le mode iso-pH autre que
7.4 semble être compromis dû à la présence d’albumine.
Pour étoffer cette recherche, il serait intéressant de faire cette étude sur d’avantage de composés afin
de pouvoir avoir une plus grande bibliothèque de résultats. Il serait également enrichissant de voir si
les mêmes variations sont observées avec d’autres protéines plasmatiques et si l’influence sur le
gradient de concentration lorsque deux protéines sont mises ensembles est cumulatif.
Enfin, étant donné que les variations de concentrations sont observables que sur les composés ayant
une perméabilité élevée, il pourrait être envisageable de changer la membrane afin d’améliorer la
perméabilité des composés et ainsi pouvoir en étudier d’avantage. Cependant en faisant cela, les
informations sur la perméabilité gastro-intestinale seraient perdues.
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