Mutations, mutagénèse(1) et amélioration des plantes - SAF ...

Mutations, mutagénèse (1) et
amélioration des plantes
Alain CADIC
I.R. INRA Hon.
(1) Ecriture conforme aux recommandations de la commission générale de terminologie et de néologie

Définitions courantes:
Mutation : Modification aléatoire de la composition ou de l’organisation des chaînes
d’ADN
Mutagénèse : Application de méthodes visant à produire des mutations
Définitions très synthétiques
Mais :
De quoi s'agit-il ?
ne permettent pas de déceler les causes des mutations et leurs manifestations
ni d'appréhender les méthodes et techniques qui peuvent les induire artificiellement
Sujet traité
Évolution des concepts et des techniques en
relation avec l'évolution des connaissances
A.Cadic, Colloque AFBV, Paris, 4 Otobre 2012 2

Panorama en forme de plan
√ Le 19 ième siècle et avant........... : La période des hybrideurs
De l'exploitation des mutants naturels aux balbutiements de
l'amélioration des plantes
√ La première moitié du 20 ième siècle : La période des améliorateurs et
des cytogénéticiens
L'envol de l'amélioration des plantes et le développement de la mutagénèse
√ La seconde moitié du 20 ième siècle et après ….. : l'ère des
biologistes cellulaires et moléculaires, celle des biotechnologies
Vers les perfectionnements de la mutagénèse : de l'aléatoire au ciblé
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Le 19 ième siècle et avant........... : La période des hybrideurs
La période des hybrideurs s'ouvre en 1719 Th.Fairchild hybride des oeillets
(pollen=vecteur), 25 ans après la mise en évidence de la sexualité chez les
végétaux par R.J Camerer en 1694
C.Zirkle (1935) The beginnings of plant hybridization., Univ. Pennsylv. Press, 231 pages.
H.F.Roberts (1929) Plant Hybridization before Mendel., Princeton Univ. Press, 374 pages.
Le 19 ième siècle est aussi celui de l'introduction massive de plantes nouvelles
Pour les praticiens (surtout horticulteurs) : moyen de créer de la nouveauté
Pour les scientifiques : interrogations sur la notion d'espèce et la fixité
C'est dans ce contexte que Darwin en 1859 et Mendel en 1865 publient leurs
travaux
Cette période va s'achever au début du 20 ième siècle (Congrès des hybrideurs
de Londres en 1906) et l'amélioration des plantes va s'imposer
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Le terme 'mutation' a été proposé pour la première fois en biologie par Hugo
de Vries (1848-1935) après observation de descendances d’œnothères
Entre 1901 et 1903 il publie “La théorie de la mutation – Essai et observations
sur l'origine des espèces dans le règne végétal”
Pour de Vries, les mutations sont responsables de
l'apparition de nouvelles espèces
La mutation est vue comme un changement brusque
des caractères héréditaires.
Les mécanismes sous-jacents sont inconnus.
Hugo de Vries
Wikimedia Commons
(Public Domain)
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Amélioration des plantes et sélection
L'utilisation des mutations spontanées
Les mutations spontanées sont responsables de la diversité des espèces
végétales actuelles.
Au cours du temps, l'homme a utilisé les mutants favorables au fur et à
mesure de leur apparition (en particulier les 'sports' identifiés dès le 17 ième
siècle).
Cette phase se poursuit de nos jours pour nombre d'espèces (horticoles en
particulier – caractères faciles à reconnaitre)
Kingsbury N., (2009) Hybrid : The history and science of plant breeding. Univ. Chicago press., 493 pages.
Il est illusoire de vouloir dresser une liste des mutations spontanées qui
ont été intégrées au processus de sélection et d'amélioration des plantes.
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Quelques illustrations serviront à en démontrer la réalité.
Mutations de couleur et de forme de l'inflorescence du Chou-fleur : de l'inflorescence
du chou sauvage, lâche, à fleurs jaunes vers le chou fleur à inflorescence compacte de
couleur blanche puis les inflorescences colorées orangées et mauves et enfin les types
brocoli et romanesco
Mutations chez le pêcher :
- pêche à peau duveteuse et noyau non adhérent
- pavie à peau duveteuse et noyau adhérent
- brugnon à peau lisse et noyau adhérent
- nectarine à peau lisse et noyau non adhérent
- déclinaison en fruit aplati (pêche et nectarine plate)
- déclinaison en chair jaune ou blanche
Mutations chez la bettrave : semence monogerme dérivée de semence trigerme:
Mutations de couleur du feuillage : hêtre, noisetier, pommier, berberis
Mutations de nanisme chez les céréales : blé, riz, ...
Mutation de port et de remontée de floraison chez le rosier
Mutation de port et de type de floraison chez la tomate
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Mutants spontanés de la variété de pomme 'Elstar'
Elstar Elshof
Daliter Valstar
Photos INRA-Angers
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La première moitié du 20 ième siècle :
La période des améliorateurs et des cytogénéticiens
La nature des mutations ne va être appréhendée qu'après les travaux de
T.H.Morgan (1866-1945) sur la drosophile. (théorie de la saltation)
En particulier grâce aux travaux de H.J.Müller (1890-1967) et à l'utilisation
des rayons X [Prix Nobel en 1946]
A ceux de L.J.Stadler (1896-1954) sur l'effet des rayons X sur l'orge
(1928) ou des rayons UV sur le maïs (1936)
Puis à ceux de Ch.Auerbach (1899-1994) sur les effets du gaz moutarde
dans les années 40 et à la découverte des effets de la colchicine dans les
années 30.
Pour Ch.Auerbach :
la mutation est un changement héréditaire de la qualité, de la quantité
et de l'arrangement des gènes.
Auerbach, Ch. (1976) Mutation research. - Problems, results and perspectives. 504 pages.
London, Chapman and Hall
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De l'ensemble de ces travaux on retient classiquement :
Que les mutations affectent les chromosomes par substitution, par
des remaniements structurels ou par duplication du génome
Que les mutations spontanées et les mutations induites par des
traitements mutagènes sont de même nature
Que les traitements mutagènes sont la source de variations exploitables
en amélioration des plantes par application de traitements chimiques ou
physiques
Et que les traitements mutagènes opèrent le plus souvent de manière
aléatoire et que la détection des mutants peut être difficile
Pour maximiser leur effet, il a fallu développer des stratégies d'application.
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Amélioration des plantes et sélection
Mutagenèse induite …. avec un peu de retard
La première variété :
Un mutant 'chlorina' de la variété de tabac 'Kanari' au milieu des années 30.
On cite également une variété de tulipe 'Faraday' mise au commerce en 1949.
A.M.van Harten (1998) Mutation breeding. Theory and practical applications. Cambridge Univ. Press, 355 pages.
Une revue récente fait le point sur l'emploi de la mutagénèse induite :
Pathirana R., (2011) Plant mutation breeding in agriculture. In Plant sciences reviews. CAB Reviews, D.
Hemming Ed., Chap. 9, pages 107-126
Dans la base IAEA (Agence Internationale de l'Energie Atomique), en septembre 2012
http://mvgs.iaea.org/AboutMutantVarities.aspx:
3220 variétés sont recensées dont :
Plantes ornementales diverses : 719 (22,1%) dont chrysanthème :288, rose : 86, ….
Plantes agricoles : 2501 (77,9%) dont riz :816, orge :309, blé :285, soja : 170, maïs :
100, arachide : 72, coton :46, ...
La Chine représente 25,5%, le Japon 14,9%, l'Inde 10,3%, …. France 1,2%
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Par continent :
Asie : 1941 soit 60,3%
Europe : 952 soit 29,6%
Amérique : 250 soit 7,8%
Afrique : 67 soit 2,1%
Oceanie : 10 soit 0,3%
Données de septembre 2012
Un constat : la diminution générale du nombre de mutants induits,
particulièrement en Europe
Dans le monde Sur le continent européen
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La mutagenèse 'classique' a généré un nombre considérable de mutants utilisés
directement comme variétés (souvent chez les plantes à multiplication végétative) ou
comme géniteurs chez les plantes à multiplication sexuée).
A titre d'exemple, on peut citer :
- la perte de sensibilité à la longueur du jour chez le riz, le coton ou le ricin
- la perte de dominance apicale chez le mélilot officinal
- l'altération du développement chez les céréales
- la modification (+ et -) de l'aptitude à noduler de plusieurs légumineuses
- la composition biochimique du grain des céréales ou des cotylédons de plantes
oléagineuses
- l'amélioration de la résistance à certaines maladies chez l'orge (Oïdium), du blé
(rouilles) ou du riz (pyriculariose)
- l'induction d'autofertilité chez les arbres fruitiers (cerisier)
- les modifications de couleur, port, précocité de floraison chez de nombreuses
espèces ornementales
- ….
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Cependant, la désaffection a plusieurs causes :
- la possibilité de trouver dans les ressources génétiques existantes les allèles convoités
- l'effet aléatoire de la mutagénèse conventionnelle qui impose de travailler sur des
populations 'mutagénisées' importantes
- le fait de générer souvent des mutants délétères ou de faire muter des gènes à effets
pléïotropiques
- la nécessité d'induire la déchimérisation chez les espèces à multiplication végétative
- le développement de nouvelles technologies (transgénèse disponible dès 1983)
- …..
La mutagénèse conventionnelle est un outil disponible qui a sa place dans la panoplie du
sélectionneur mais dont l'emploi doit être raisonné en fonction des objectifs de
sélection, de la biologie de l'espèce, de la variabilité disponible et de ses possibilités
d'utilisation
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Quelques exemples :
Témoin : liane de 4-5 mètres et
mutant représenté à la même
échelle
Lonicera japonica:
Forme compacte à grandes fleurs
Mutant : hauteur de 0,70 m.
Photos : A.Cadic, INRA-Angers
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Photos : A.Cadic, INRA-Angers
Forsythia : Mutant de forme de fleurs, de
vigueur, à feuillage panaché
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‘Courdijau’ GOLDEN PEEP ®
Photos :
A.Cadic, INRA-Angers
‘Courtasol’ MAREE D’OR ®
‘Courtasol’ MAREE D’OR ®
Variétés de Forsythia issues de la descendance d'un mutant autofertile
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Le doublement des génomes : quelques applications
Polyploïdie a été utilisée :
- pour créer des variétés nouvelles, par exemple les Tétranémones ®
- pour créer des géniteurs tétraploïdes employés pour :
* créer des hybrides triploïdes stériles ex : Hibiscus, Weigela, pastèque
* réaliser des croisements d'introgression entre espèces cultivées
diploïdes et des espèces apparentées tétraploïdes
- pour restaurer la fertilité d'hybrides interspécifiques ex: Triticale, lis
- pour assurer le retour à l'état diploïde de plantules haploïdes (haploïdes doublés)
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Une application particulière des radiations
ionisantes sur pollen : les haploïdes
Revue :
Dunwell, J.M., (2010) Haploids in flowering plants :
origin and exploitation., Plant Biotechnology journal,
8, pp. 377-424
Premier résultat :
Triticum monococcum par Katayama en 1934
Traitement de pollen aux rayons X pendant 30
minutes (40kVolts, 2milliamp)
Technique courante :
Rayons gamma à forte dose
2500 Gy pour le melon
200 à 500 Gy pour le pommier
500 Gy pour le rosier
500 à 1500 Gy pour le kiwi
Intérêts :
Emploi d'haploïdes doublés en sélection
Analyses cytogénétiques
Cartographie et analyse génétique
Séquençage
Hybridation dihaploïdes X diploïdes
Espèce (*) Année
T. monococcum 1934
Petunia 1943
Lilium 1951
Capsicum 1951, 1954, 1960
Zea mays 1951, 1976
Nicotiana 1964
Cucumis (melon) 1987, 2003, 2008
Malus 1988, 1991, 1994
Pyrus 1993, 2004
Allium (oignon) 1993
Rosa 1994, 2005
Cucumis (concombre) 1994, 1999, 2005
Actinidia (kiwi) 1997
Rubus (ronce) 1998
Cucurbita pepo 2002
Helianthus (tournesol) 1997, 2004, 2005
Citrus (mandarine) 2007
D'après Dunwell J.M. (2010)
19
(*) les contributions françaises sont soulignées

La seconde moitié du 20 ième siècle et après ….. : l'ère des biologistes
cellulaires et moléculaires, celle des biotechnologies
Début des années 50 : Découverte des éléments mobiles chez le maïs par
B.McClintock [Prix Nobel 1983]
Photo : A.Cadic, INRA-Angers
Panachures sur fleurons de Dahlia
provoquées par des éléments mobiles
Ces éléments transposables sont
responsables de l'apparition de
mutants.
Leur découverte apporte une
information nouvelle sur l'origine et
la nature des mutations.
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1953 : Structure de l'ADN par Watson et Crick [Prix Nobel 1962]
1960 : découverte du code génétique par F. Crick, M.Nirenberg et S.Ochoa
1962 : mise au point du milieu M-S de culture in-vitro alors que la totipotence
cellulaire (Haberlandt en 1902), les phytohormones (F.W Went en
1926) et l'intérêt en physiologie de la culture in-vitro (Ph.White et
R.Gautheret dans les années 30) sont connus
1965 : Enzymes de restriction par W. Arber, H. Smith et D. Nathan [Prix
Nobel 1978]
1974 : Caractérisation du plasmide de A.tumefaciens par J.Schell et M. van
Montagu
1978 : fusion de protoplastes par G. Melchers
1978 : mise au point de la mutagénèse dirigée par M.Smith (1932-2000),
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1983 : production de la première plante transgénique (tabac)
1992 : invention de la PCR par M.Smith (1932-2000) avec
K.M.Mullis [Prix Nobel 1993]
1998 : découverte des RNA interférents par A.Fire et C. Mello [Prix
Nobel 2006]
2000 : séquençage du génome d'Arabidopsis
2012 : le génome de nombreuses espèces végétales a été séquencé ou est en
voie de l'être (tomate, pomme de terre, vigne, pommier, concombre,
peuplier, … (CoGePedia http://genomevolution.org/wiki/index.php/Sequenced_plant_genomes)
La connaissance de plus en plus fine des génomes, du fonctionnement des
gènes, de leur régulation ouvre la voie à de nouvelles possibilités
d'application en amélioration des plantes
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Un exemple d'amélioration de la technique : l'apport de la biologie cellulaire
Les biotechnologies ont permis quelques développements nouveaux chez les espèces à
multiplication végétative chez lesquelles les organes divers sont traités (bourgeons,
bulbes, tubercules).
● Les méristèmes partiellement détruits se reconstituent. La formation de chimères est
souvent la règle.
● Classiquement, la multiplication des pousses issues des
méristèmes irradiés sont multipliés en prenant en compte la
phyllotaxie des espèces.
● Maintenant, chaque fois que possible, on va traiter des
tissus différenciés (feuilles, tiges, pétales, racines, …), puis
régénérer des plantes par néoformation ou embryogénèse
somatique en faisant l'hypothèse que les plantes régénérées
proviennent d’une seule cellule.
Exemple de régénération
sur Cytisus scoparius
Photo SCIAM-INRA Angers
Méristème de Forsythia sp.
La technique put également être employée pour
provoquer la déchimérisation
23

Un nouvel essor grâce au développement de la génétique inverse :
du gène vers le phénotype par le TILLING
TILLING : Acronyme pour Targeting Induced Local Lesions in Genomes
C.M.McCallum, L.Comai, E.A. Greene etS.Henikoff (2000)
Plant Physiology June 2000 vol. 123 no. 2 439-442
Principe : générer de nombreux mutants ponctuels par traitement au MSE et employer
les techniques de biologie moléculaire pour repérer les mutants d'un gène
d'intérêt connu
Espèces cultivées concernées (autres que Arabidopsis, Medicago et Brachypodium) :
P.Sikora et al. (2012) Mutagenesis as a tool in plant genetics, functional genomics and breeding. Int. J. Plant
genomics, doi:10.1155/2011/314829
Pois, Colza, Tomate, Lotier, Blé tendre et Blé dur, Riz, Soja, Sorgho, Melon, Avoine,
Tournesol, Maïs, Arachide
En cours à l'IAEA : Manioc, Bananier 3n (multiplication végétative)
Exemple d'application : blé avec teneur en amidon plus élevée
Slade, A.J. Et al. (2012) Development of high amylose wheat through TILLING. BMC Plant biology 2012, 12:69
Avantages : pas de mise au point de culture in-vitro ou de transgénèse
Inconvénients : Le gène cible doit être connu
Evolution vers l'écotilling et le délétion tilling
24

Evolution vers la mutagénèse d'insertion
Transgénèse : la première application
A.Gallais et A. Ricroh (2006) Plantes transgéniques. Faits et enjeux., Ed. Quae, 284 pages
Y. Chupeau (2006) Le transfert de gènes chez les plantes. Mise en perspective. Le sélectionneur français (57):3-24
En dehors des espèces majeures, pas moins de 114 genres de 51 familles angiospermes
ornementales (incluant les graminées à gazon) et médicinales ont fourni des plantes
transformées exprimant le transgène introduit
A. Cadic (2008) Transgresser la barrière des espèces pour améliorer les végétaux d'ornement. In Actes du colloque
de Dijon 31/01-03/02 2007 'Peut-on classer le vivant ? Linné et la systématique aujourd'hui.
Les principales évolutions de la technique vont vers :
- l'emploi de promoteurs inductibles soit par des composés définis soit par des
conditions externes précises (agression parasitaire, conditions climatiques, …). Le
contrôle peut être spatial (tissu ou organe spécifique) et quantitatif.
-la suppression des marqueurs de sélection par l'emploi de recombinases
Zuo J., (2001) Chemical-regulated, site-specific DNA excision in transgenic plants. Nat. Biotechnol.
19(2):157-161.
- l'emploi de gènes appartenant à l'espèce ou d'une espèce compatible en
croisement (cisgénèse), voire, de plus, avec des analogues du T-DNA venant du riz
ou d'Arabidopsis (intragénèse)
25

- la cisgénèse : le 'cisgène' provient de l'espèce elle même ou d'une espèce
proche compatible en croisement et il est inchangé
(H.J. Schouten et al. (2006) Cisgenic plants are similar to tyraditionally bred plants :
international regulations for genetically modified organisms should be altered to exempt
cisgenesis., EMBO Rep. 7(8):750-753.)
Actuellement en essai pour la résistance au Phytophthora de la pomme de
terre et à la tavelure du pommier aux Pays-Bas.
-l'intragénèse est identique à la cisgénèse, si ce n'est que le gène inséré
peut être une nouvelle combinaison de fragments d'ADN de l'espèce ou
d'une espèche compatible en croisement
(C.M. Rommens, (2007) Intragenic crop improvement: combining the benefits of traditional
breeding and genetic engineering. J. Agric. Food Chem. 55:4281-4288)
Actuellement, des essais au champ sont en cours pour la réduction
d'amylose chez la pomme de terre
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Les nouvelles techniques de mutagénèse et de mutagénèse d'insertion
Lusser M. et al. (2011) New plant breeding techniques. State of the art and
prospects for commercial development. JRC Scientific and technical reports.
EUR 24760 EN., 219 pages.
Objectif principal :
Prévoir les éventuelles modifications de la législation concernant les OGM (2001/18/EC)
Techniques à considérer comme techniques de mutagenèse (sans insertion in-fine) :
- Nucléases à doigt de zinc (ZFN-1 et ZFN-2)
- Mutagénèse dirigée à l'aide d'oligonucléotides
- reverse breeding
- agro-infiltration (hors agro-infiltration par trempage d'inflorescences)
-Méthylation de l'ADN par action d'ARN (RdDM)
Techniques de mutagénèse d'insertion :
- Cisgénèse et Intragénèse
- Agro-infiltration par inflorescences
- Nucléases à doigt de zinc (ZFN-3 avec insertion)
A.Cadic, Colloque AFBV, Paris, 4 Otobre 2012 27

Conclusion
La sélection conduite depuis les débuts de l'agriculture a permis, de manière
inconsciente, l'accumulation de gènes ou d'allèles favorables conduisant à des
génotypes et des phénotypes utiles.
Les mutations naturelles apparues au cours de l'évolution ont été employées de
manière inconsciente ; celles qui se manifestent actuellement le sont également
lorsque leur utilité est confirmée.
Depuis un peu plus d'un siècle, l'amélioration des plantes, procédé cumulatif,
s'est toujours efforcée de réunir des gènes d'intérêt en limitant le fardeau
inutile de ceux auxquels ils pouvaient être associés.
A partir des années 50, la mutagénèse conventionnelle est apparue comme une
solution possible de modifier certains caractères sans altérer le contenu de
génomes patiemment élaborés.
A partir des années 80, la mutagénèse d'insertion, et au premier rang la
transgénèse, a été rapidement perçue comme plus attractive malgré son
caractère également aléatoire.
Les nouvelles techniques de mutagénèse (avec ou sans insertion) développées
depuis moins de 15 ans devraient assez rapidement trouver des applications en
amélioration des plantes.
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Depuis les années 70/80, les notions de mutant et de mutagénèse ont évolué :
La mutation était restreinte aux modifications endogènes (substitutions, accidents
chromosomiques, altérations par transpositions)
La notion élargie intègre le transfert d'information (modification et/ou régulation) par
apport exogène
La mutagénèse était limitée à l'emploi de substances chimiques ou d'agents physiques
Elle est désormais étendue à l'emploi d'agents 'biologiques'
Les définitions étendues suivantes sont proposées :
Mutation : Modification brusque, héréditaire, spontanée ou induite par des
procédés physiques, chimiques ou biologiques, du nombre, de la nature,
de la structure ou de l’organisation des gènes dans les génomes des
noyaux cellulaires ou des organites cytoplasmiques
Mutagénèse : Méthode de création de variabilité génétique induisant des
mutations par l'emploi d'agents chimiques, physiques ou biologiques de
manière aléatoire ou ciblée
A.Cadic, Colloque AFBV, Paris, 4 Otobre 2012 29

Merci de votre
attention
A.Cadic, Colloque AFBV, Paris, 4 Otobre 2012 30