Les innombrables aspects des anticorps antinucléaires en IFI ...

Les innombrables aspects des
anticorps antinucléaires en IFI :
quelle leçon en tirer au moment
du dépistage
Docteur Alain Chevailler
Laboratoire d’immunologie et d’allergologie
U 892
CHU Angers
-BIOFORMA "Les auto-anticorps anti-nucléaires:
dépistage, identification et signification"
-21 et 22 octobre 2010
-Revue Francophone des Laboratoires 2006, 384 : 51-58

Gammapathies monoclonales à
activité auto-anticorps
auto anticorps : de
l’immunofluorescence indirecte
comme technique de dépistage
Docteur Alain Chevailler
Laboratoire d’immunologie et d’allergologie
U 892
CHU Angers

VL
VH
F(ab)
CL
CH1
CH2
CH3
F(ab’) 2
Fc
CH2
CH3
Structure du monomère d’IgG1
CH1
Rodney Porter Gérard Edelman
VH
CL
VL
Prix Nobel
Médecine
1972

IMMUNOGLOBULINE
MONOCLONALE
• production d'un d'un
clone de lymphocyte
• Soit H 2L2, , soit L, soit H plus rarement
• caractérisation : homogénéité :
– charge :
Électrophorèse (pic)
– isotypie :
immunoélectrophorèse
(sang et urines, IES et IEU)
immunofixation (IFx IFx)

Gammapathie monoclonale
• Une des anomalies
biologiques les plus
fréquentes
• > 50 ans : 3 %
• > 70 ans : 7 %
• RA Kyle, 2007

MGUS
monoclonal gammopathy of undetermined significance
• 55 %
• Définition :
• Pic < 30 g/L
• Plasmocytose médullaire < 10 %
• Pas d’atteinte osseuse,
d’organomégalie, d’insuffisance
rénale, d’hypercalcémie

Signes cliniques
• Prolifération lymphocytaire
– Signes osseux (lyse, fracture,
hypercalcémie)
– Envahissement médullaire (cytopénie)
– Compression médullaire
• Immunoglobuline monoclonale
– Syndrome d’hyperviscosité
– Cryoglobulinémie
– Dépôt (amylose, MDCL)
– (Auto)-anticorps
(Auto) anticorps

AUTO-ANTICORPS AUTO ANTICORPS NATURELS
• Physiologiques : Avraméas, Avraméas,
Dighiero
• lymphocytes B CD5+
• antigènes :
– solubles : transferrine, thyroglobuline, etc ...
– intra-cellulaires
intra cellulaires : actine, myosine, tubuline, ADN, ...
• gènes germinaux non mutés
– Ac présents chez souris axéniques
– pas de maturation d'affinité (mutation, sélection par antigène) antigène)
– répertoire limité, conservé (sélection positive)
• rôle :
– épuration ? (blocage par interaction Id-anti Id anti-Id Id)
– immunité naturelle : opsonisation pathogènes

Preuve : F(ab ’) 2
Myélome IgG1k
ASLO très élevés :
- sérum
- IgG purifiées
- F(ab ’) 2
IFD moelle :
- γ rouge
- SLO-FITC
Gammapathie monoclonale à
activité (auto)-anticorps
(auto) anticorps
Photo : Daniel Hurez

Auto-anticorps
Auto anticorps monoclonaux
les plus fréquents
• Maladie des agglutinines froides
– Antigène polysaccharidique Ii
• Cryoglobulinémie de type 2 (facteur rhumatoïde
monoclonaux)
– Antigène : fragment Fc des immunoglobulines
• Neuropathie avec anticorps IgM anti-MAG anti MAG
- Antigène : myéline associated glycoprotéine

Tableau I : activités autoanticorps les plus fréquemment associées avec les
gammapathies monoclonales
Globules rouges (I ou i) [9]
Protéines plasmatiques
IgG (facteur rhumatoïde) [24]
β lipoprotéines [15, 36, 49]
albumine [43]
α2macroglobuline [20, 38]
transferrine [43]
facteur VIII [43]
facteur von Willebrand [23]
inhibiteur de la C1 estérase [8]
thyroglobuline [48, 50]
Myelin associated glycoprotein (MAG) [16]
gangliosides [17]
Sulfatides [6]
Héparane sulfate [37]
Phospholipides [44]
Anticoagulant [47]
Actine [11]
Tubuline [11]
Myosine [10]
Vimentine [10]
Muscle lisse [25, 34, 40]
Antigènes nucléaires
ADN [18, 46]
SSA, SSB [4]
Sm, RNP [1, 46]
Histones [43]

Activités auto-anticorps
auto anticorps monoclonales
• Stone et al
al (Semin Semin oncol 2003, 30, 318) 318
– Que MGUS IgM (172)
– 71 % activité auto-anticorps
auto anticorps
• 43 % : glycoprotéines, glycolipides,
• oligosaccharides, glycosaminoglycans
• 12 % : glycoprotéines, gangliosides (neuropathies)
• 11 % : antigènes nucléaires
al (An An NY Acad Sci, Sci,
2007,1107, 206) 206)
• Carlizzi et al
– 1/3 des MGUS (tout isotype): isotype):
activité auto-
anticorps
– Un seul patient signes cliniques en rapport

Apport de l’IFI l’ IFI pour la détection des
gammapathies monoclonales
• Auto-anticorps
Auto anticorps monoclonal :
– Titre élevé
historique, mais pas le plus fréquent
– Spécificité restreinte
Aspect incomplet en comparaison à
la réponse polyclonale

Réponse auto-immune
auto immune
• Polyclonale : anti-a anti a + anti-b anti b + anti-c anti
• Monoclonale : anti-a anti
a
Auto-antigène
c
b

Réponse anti-muscles lisses polyclonale (estomac de rat)
Conjugué : anti-GAMkl FITC
Photo : G Renier

Réponse anti-muscles lisses monoclonale, IgM kappa (estomac de rat)
Conjugué : anti-GAMkl FITC
Photo : G Renier
B

Suspicion d’auto d’ auto-anticorps anticorps monoclonal
• IFI avec anti-sérums anti sérums anti-chaînes anti chaînes lourdes
et anti-chaînes anti chaînes légères
– Monotypie : même aspect avec une seule
chaîne lourde et une seule chaîne légère
• IEP/IFx IEP/ IFx :
– Seuil de sensibilité :
100 fois moindre qu’IFI qu’ IFI

• IEP/IFx IEP/ IFx :
Suspicion d’auto d’ auto-anticorps anticorps
monoclonal : résultat
– Ig monoclonale de même H et L qu’en IFI :
auto-anticorps
auto anticorps monoclonal
– Pas d’Ig d’ Ig monoclonale détectable : auto-
anticorps monotypique
– Ig monoclonale d’un autre isotype que celui
de l’IFI l’ IFI : 2 clones

Gammapathie monoclonale à
activité (auto)-anticorps
(auto) anticorps
G Renier Congrès Eur Immunol 2003
• 3282 demandes d ’auto auto-anticorps anticorps / 1 an (2002)
• 68 suspicions
– (aspect inhabituel, fort titre)
• 32 (1%) mcl Ig (15 connues, 17 découvertes)
– 22 IgM
– 8 IgG
– 2 IgM + IgG
– Importance du conjugué :
Anti-GAM Anti GAMκλ κλ

Poursuite de l’étude :
BACHY B, BURBAN M, FOUSSARD C, BEAUVILLAIN C, JEANNIN P, DELNESTE DELNESTE
Y, RENIER G, CHEVAILLER A. Gammapathies
monoclonales à activité auto-anticorps
auto anticorps : de l'immunofluorescence indirecte comme technique de dépistage. dépistage.
5ème colloque GEAI2008. GEAI2008.
Revue Francophone des Laboratoires 2008, 404bis : 29-35 29 35
• Janvier 2002 – décembre 2006
• Environ 12000 demandes d’auto d’ auto-anticorps anticorps
– 73 cas (0,61 %)
– Sex-ratio Sex ratio (homme/femme) : 33/40 (45%,
55%)
– Âge moyen : 62,2 ans
• Femme : 60 ans (21-97) (21 97)
• Homme : 63,5 ans (9-94) (9 94)

Résultats
• 44 auto-anticorps
auto anticorps monoclonaux
• 27 auto-anticorps
auto anticorps monotypiques
• 2 (externes) : pas assez de sérum
pour IEP

Tableau II : auto-anticorps monoclonaux
isotype inconnue Connue sans
renseignement
10 inconnues sur 44
Majorité IgM (30 / 44)
Connue avec
renseignement
IgM κ 6 6 15 27
IgM λ 1 1 1 3
IgG κ 3 1 1 5
IgG λ 0 3 0 3
IgM κ κ + + IgM λ 0 1 2 3
IgG κ κ + + IgM λ 0 0 1 1
IgG κ κ + + IgM κ 0 1 0 1
IgGκ κ + + IgGλ λ + + IgMλ 0 0 1 1
total 10 13 21 44
total

10 ont un 2ème clone détectable par IEP, dont 1 connu
Tableau III : auto-anticorps monotypiques
isotype inconnue connue total
IgM κ 6 0 6
IgM λ 3 0 3
IgG κ 9 0 9
IgG λ 6 1 7
IgM κ κ + + IgM λ 1 0 1
IgGκ κ + + IgGλ λ 1 0 1
total 26 1 27

Tableau IV : aspect de fluorescence des gammapathies monoclonales à
activité auto-anticorps
aspect pourcentage
Cytoplasme autre que cytosquelette 44,1
Cytosquelette Muscle lisse 19,1
Cytosquelette non muscle lisse 6
Nucléaire 13,2
autres 17,6
Aspect : > 50% cytoplasme

Tableau V : pathologies associées
pathologies Nombre (pourcentage)
hématologiques 32 (60,4%)
infectieuses 4 (7,5%)
Auto-immunes 5 (9,5%)
rhumatologiques 2 (3,7%)
autres 10 (18,9%)
total 53 (100 %)

Tableau VI : diagnostic selon la connaissance préalablement à l'IFI ou non de
l'immunoglobuline monoclonale
pathologie Immunoglobuline
monoclonale connue
waldenström 13 1
lymphome 4 0
MGUS 1 4
LAM 0 2
Simpson Golabi 0 1
PR 1 0
Hodgkin 0 1
infection 0 1
SAPL 0 1
total 19 11
MGUS : gammapthie monoclonale de signification indéterminée
LAM : leucémie aiguë
PR : polyarthrite rhumatoïde
SAPL : syndrome des anti-phospholipides
Immunoglobuline
monoclonale inconnue

Etude prospective
• Etude sur 100 patients
• Janvier 2010, une semaine et demi
• IFI avec spécifiques : HEp-2 et 3 tissus
• 22 résultats positifs : 22 %
- 1 Anticorps monoclonal
- 21 Anticorps monotypiques

épartition
substrat total ♂ ♀ MCl MTY Gλ Gκ Mλ Mκ Aκ
HEp-2 9 3 6 0 9 2 0 4 3 0
3T 13 4 9 1 12 3 4 0 5 1
total 22 7 15 1 21 5 4 4 8 1

Cas clinique n°1
• Homme, né le 7 décembre 1937
• Février 1997 : opération rétrécissement aortique,
découverte MGUS IgM lambda
• Avril 2006 : paresthésies distales des membres sans
anti-MAG anti MAG
• Janvier 2007 : diagnostic de Maladie de Waldenström
(envahissement médullaire lymphoplasmocytaire 50 %);
modification de l’IEP

Immunoélectrophorèse
de janvier 2007
Janvier 2007
Avril 2006
IFx après immunoprécipitation par
A B
Anti-kappa Anti-lambda

Sérologie auto-immune
auto immune
• Absence d’anticorps anti-MAG anti MAG
• Présence d’anticorps anti-sulphatides
anti sulphatides (dot M +
G)
• Anticorps anti-muscles anti muscles lisses
de spécificité anti-actine anti actine
de titre élevé (1/40000)
Spécificité µ lambda

B
Immunofluorescence indirecte sur cellules HEp-2
du sérum dilué au 100ème (40X)
Substrat : cellules HEp-2, µ
A
Substrat : cellules HEp-2, anti-lambda
Parfaitement négatif avec anti-γ, anti-α et anti-k

Immunofluorescence indirecte sur cellules HEp-2 de la
fraction IgM purifée 100ème (40X)
A B
C
A : Courbe obtenue par Gel filtration du sérum présentant les différentes fractions en fonction de la DO à 280 nm
B : Analyse de la fraction 34 par immunofixation, permettant de confirmer qu'il s'agit de l'IgMλ .
C et D : IFI sur cellules HEp-2 en utilisant un conjugué anti-λ (C) et un conjugué anti-μ (D)
retrouvant l'aspect anti-actine
Avec les anti-sérums anti-γ, anti-α et anti-κ la fluorescence est négative
D

Inhibition
• Disparition de la fluorescence
– Du sérum
– De la fraction purifiée
• Avec actine F

Cas clinique n°2 : garçon, né le 21/02/1997
• Syndrome de Simpson
Golabi
– Xq 26 : Mutation gène
glypican 3 (mutation faux
sens dans l’exon 3) :
mutation maternelle
– Association devant doigts
courts,hexadactylie,
philtrum long, haute
stature, viscéromégalie,
macroglossie et hernie
inguinale
• Déficit immunitaire non
classé
– AHAI : 6 épisodes de 4 à 8
ans
– IgG 2 def
– Hyperplasie lymphoïde
entre 3 et 9 ans
– Découverte d’une IgM
lambda anti-cytosquelette :
en avril 2005 (IES et
dosages normaux en juillet
2004)

Conclusion
• Intérêt de pratiquer la recherche des auto-anticorps
auto anticorps et
des immunoglobulines monoclonales dans le même
laboratoire
• Connaître possibilité auto-anticorps
auto anticorps monoclonal/typique :
aspect inhabituel d’IFI d’ IFI
• Intérêt de l’IFI l’ IFI : dépistage plus précoce des MGUS

• Benjamin Bachy
• Mélanie Burban
• Cécile Robineau
• Pascale Jeannin
• Céline Beauvillain
• Gilles Renier
• Yves Delneste
Remerciements
U892
• Rachel Boivinet
• Catherine Daniel
• Christine Deau
• Anne-Marie-Royer
Et les cliniciens du CHU
hématologistes adultes et enfant
Et des CH extérieurs