Crassostrea gigas - EFOR

Séminaire EFOR, Paris, 25 et 26 janvier 2010
Du gène à la fonction :
développement d’outils fonctionnels
chez l’huître Crassostrea gigas
UMR Physiologie et Ecophysiologie des Mollusques Marins, Ifremer
Brest / Université de Caen - Basse Normandie
LEMAR, UMR CNRS/UBO/IRD, Institut Universitaire Européen de la
Mer, Brest

Crassostrea Crassostrea gigas gigas : :
un modèle émergent
• L’huître creuse japonaise
• Originaire d’Asie, répartition actuelle mondiale
• Importance économique majeure : seconde
production aquacole mondiale (> 4 millions de
tonnes/an)
Production (t)
1 6 0 0 0 0
1 4 0 0 0 0
1 2 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0
8 0 0 0 0
6 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
0
1900
1910
C . a n g u l a t a
1920
1930
W W II
• Invasive dans certaines zones côtières
1940
1950
A n n é e s
O . e d u l i s
1960
C . g i g a s
1970
1980
1990

Métazoaires
Eumétazoaires
Spongiaires
Bilatériens
Deutérostomiens
Protostomiens
Lophotrochozoaires
Cténophores
Cnidaires
Crassostrea Crassostrea gigas gigas
Echinodermes, Urochordés, Céphalochordés,
Vertébrés : Poissons, Amphibiens,
Mammifères, Oiseaux, Reptiles, Chéloniens
Ecdysozoaires
Eponges calcaires, Démosponges,
Eponges exactinellides
Onychophores, Onychophores, Tardigrades,
Tardigrades,
Arthropodes, Nématodes,
Kinorhynches, Locifères
Phoronidiens
Brachiopodes
Annélides
Siponcles
Mollusques
Némertes
Plathelminthes
Entoproctes
Rotifères
• Lophotrochozoaire, mollusque bivalve
• Absence de “génome de référence”
phylogénétiquement proche
• Vit fixée au substrat, en milieu marin
et estuarien
• Filtreur, se nourrit de phytoplancton
Skeletonema Chaetoceros Tetraselmis
T. isochrysis

Le génome de C. C. gigas gigas
2n = 20 chromosomes
taille du genome ~824 Mb
Parmi les + petits génomes de mollusques connus
Forts taux de polymorphisme et d’hétérozygotie
1 SNP tous les 60/40 bp dans les régions codantes/non-
codantes (Sauvage et al., Gene 2007)

Propriétés du modèle
Grande variabilité phénotypique
Développement embryonnaire invariant
Fécondation externe
Une génération par an
Taux de fécondité élevé
Cycle de reproduction et élevage larvaire maîtrisés et
reproductibles en écloserie
Structures d’élevage lourdes et coûteuses

Naissain
(2-3 cm)
Larve
métamorphosée
(Qq mm)
Cycle de Vie
Huître adulte
(~ 8 cm)
Phase
benthique
FIXATION
METAMORPHOSE
FECONDATION
EXTERNE
Larve
véligère
7-14 jours
(~ 200 µm)
Ovocyte
(50 µm)
Phase
planctonique
GASTRULATION
Gastrula
~ 7h
Larve D
~ 24h-48 h
(~ 70 µm)
Larve
trocophore
~ 16h-24h

• Physiologie :
Les thématiques de recherche
Espèce aquacole _ espèce
sentinelle de l’environnement
– Reproduction : maîtrise du cycle de
reproduction
– Bioénergétique : allocation des flux
d’énergie et de matière aux différents
compartiments de l’organisme
– Immunité, réponse au stress :
fonctionnement du système immunitaire
inné

Les thématiques de recherche
• Pathologie : relations hôtes-pathogènes
Herpes virus
OsHV-1
• Génétique : amélioration génétique par sélection
(toujours limitée), Recherche de QTLs pour des
caractères d’intérêt, Phylogéographie

Ressources génomiques disponibles
Production massive d’ESTs
56 268 ESTs
Database dédiée publique
31 952 gènes uniques
http://www.sigenae.org
croissantes
Séquençage du génome en cours (Chine)
100X, illumina, problèmes d ’assemblage des séquences
Assigner une fonction à un gène : enjeu
majeur pour la recherche chez les mollusques
marins

Définir le rôle d’un gène
• Relation polymorphisme – fonction
• Endocrinologie inverse
Ligands synthétiques
ou extraits naturels
fractionnés
• Pharmacologie
• Mutagenèse
• Knock down
Activation du
récepteur :
réponse cellulaire
Identification du(des) ligand(s) capable(s) d’activer le récepteur

RNAi in in vivo vivo :
Une nouvelle approche pour la
génomique fonctionnelle
chez C. C. gigas gigas

Oyster vasa-like gene,
1 er marqueur spécifique des
cellules germinales
Transmission maternelle des
ARNm, détermination des PGCs
dès stade embryonnaire
Stock de cell. germinales souches
GSCs, source annuelle de cellules
germinales
Oyster vasa vasa-like like gene
ARNm Oyvlg
Ovocyte
2-cellules
4-cellules
Séquence et profil d’expression bien connus
Morula
Blastula
Fabioux et al., 2004a, b BBRC
Gastrula
Adulte
Inactivation chez d’autres espèces avec phénotype knock down visible
Véligère
Méthodes de mesure de l’invalidation disponibles (qPCR, western blot…)

Les choix techniques
• dsRNA > 500 bp
• Injection directe dans la gonade des adultes
(20-100µg/ind)
• Plusieurs injections successives
• Fenêtre temporelle d’injection critique
Biolistique
Elèctroporation
Injection
Lipofection

Inhibition rate
(%)
Oyvlg mRNA level
OYVLG protein level
Inhibition de oyvlg oyvlg
7
6
5
4
3
2
1
0
120
100
80
60
40
20
Inhibition rate
(%)
OYVLG
0
Oyvlg mRNA level
*
control 100.1 100.2 100.3 100.4 100.5
/ 0% 82% 73% 47% 29%
OYVLG Protein level
control 100.1 100.2 100.3 100.4 100.5
/ 20% 100% 100% 95% 15%
*
* *
Fabioux et al., 2009, FEBS Journal
Jusqu’à 82%
d’inhibition du taux
d’ARNm Oyvlg
Reduction du taux de
protéine OYVLG jusqu’à
un niveau indétectable

Femelle
Male
Gt
Gt
Contrôle 100µg dsRNA
CT
Défaut de prolifération des cellules germinales et méiose
prématurément stoppée
Inhibition du développement de la gonade
H
CT
CT
Fabioux et al., 2009, FEBS Journal

Démonstration du rôle de Oyvlg dans la gamétogénèse:
prolifération des cellules germinales souches et gonies
Première démonstration de RNAi chez l’huître
A disposition: d’un modèle de laboratoire stérile
• D’autres gènes
Perspectives
• RNAi sur embryons par lipofection
• RNAi «en routine » pour nos études en physiologie

MERCI DE VOTRE
ATTENTION