Principes du dosage par étalonnage interne

Principes du dosage par étalonnage interne 1
Principes du dosage par étalonnage interne
Lors d’un étalonnage, il arrive fréquemment que la réponse du détecteur ne soit pas
parfaitement proportionnelle à la concentration de l’analyte cible, sur la gamme de concentration
choisie. C’est le cas notamment lorsque la détection se fait par spectrométrie de masse. La figure cidessous
présente une comparaison de droites d’étalonnage obtenues pour une même molécule en
utilisant deux types de détection.
Intensité MS
250
200
150
100
50
0
ETALONNAGE EXTERNE : comparaison UV / MS
Métabolite de l'Astemizole
0 20 40 60 80 100
Concentration (µM)
MS
UV (275 nm)
L’étalonnage interne, reposant sur l’ajout, dans les solutions étalon et échantillon, d’une
molécule servant de référence, permet de corriger cet écart à la linéarité.
Lorsque l’étalon interne est ajouté avant que ne soient mises en œuvre les différentes étapes
de traitement de l’échantillon, cette technique permet en outre de s’affranchir des pertes inhérentes
à toute préparation d’un échantillon.
Principe général
Le dosage par étalonnage interne repose sur l’ajout en quantité parfaitement connue et unique, dans
toutes les solutions étalon et tous les échantillons, d’une molécule qui sert de référence durant les
phases de l’analyse. Le dosage, plutôt que d’être fait de façon absolue à partir d’une droite
d’étalonnage de l’analyte cible (étalonnage externe), se fait de façon relative par rapport à cette
molécule de référence, appelée étalon interne.
L’étalon interne doit présenter les propriétés suivantes :
• Ne pas se trouver dans l’échantillon
• Etre distinguable des analytes cibles
• Avoir des propriétés physiques et chimiques proches
Lors de l’analyse, les éventuelles variations d’intensité (instrumentales, erreur de prises
d’échantillon, dilutions, etc…) dans la détection des analytes sont également observées pour les
étalons internes puisque ces molécules se comportent de la même façon. En travaillant avec le
rapport des deux signaux (analyte et étalon interne), il est alors possible de s’affranchir de ces
variations.
25
20
15
10
5
0
Intensité UV

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Par ailleurs, si l’échantillon a subi un traitement préalable à l’analyse, les pertes en analyte et
en étalon interne sont également les mêmes. Il est alors possible, grâce à cette technique, de
déterminer la concentration en analyte dans l’échantillon brut, c’est-à-dire avant traitement.
R < 100 %
Échantillon initial
Traitements
Q i A
Fraction contenant l’analyte
Étalons internes de dosage (EID)
Qi EID connue
Étalons internes de contrôle
de récupération (EICR)
QEICR connue
Q f A , Qf EID
Ce que l’on cherche…
Ce que l’on mesure…
Q i A = quantité de l’Analyte à doser dans l’échantillon initial (c’est ce que l’on cherche à déterminer)
Q i EID = quantité d’étalons internes de dosage introduite dans l’échantillon avant extraction
Q f A = quantité de l’Analyte dans la fraction
Q f EID = quantité d’EID dans la fraction
Q i EICR = quantité d’étalons internes de contrôle de récupération introduite dans l’échantillon avant analyse
En analyse chimique, la réponse d’un détecteur peut être considérée comme linéaire sur une
plage de valeurs suffisamment petite. On peut alors écrire la relation : I = α . Q
x x x
C’est-à-dire que l’intensité du signal est proportionnelle à la quantité de produit introduite. α
est le coefficient de réponse (coefficient d’extinction molaire, coefficient d’ionisation, etc…). Il est
caractéristique de chaque molécule et représente son comportement vis-à-vis de l’appareillage.
On peut appliquer cette relation aux composés présents dans la solution à doser, l’analyte et
son EID :
⎧I
A = α A. QA
⎨
⎩I
= α . Q
EID EID EID
I A α A Q
I A
A QA
donc = . ⇔ = CrA
/ EID.
avec Cr /
I α Q
I Q
EID EID EID
EID EID
A EID
α A =
α
CrA/EID est alors défini comme le coefficient de réponse de l’analyte par rapport à l’étalon interne
qui va permettre son dosage. Contrairement au coefficient de réponse de l’analyte, Cr ne dépend
plus des variations instrumentales.
I
Etalon 1
Etalon 2
α A = 10, α EID = 5 Cr = 2
α A = 9, α EID = 4,5 Cr = 2 10 % de variation instrumentale
Etalon 3 α A = 8,1, α EID = 4,05 Cr = 2 10 % de variation instrumentale
ETALONNAGE EXTERNE ETALONNAGE INTERNE
Q
I A/I EID
Cr
Q A /Q EID
EID

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Détermination de la quantité initiale en analyte (Q i A)
On peut écrire la relation suivante :
I Q I Q r1
. . .
I Q I Q r
f i
A = CrA / EID
A
f ⇔ A = CrA
/ EID
A
i
EID EID EID EID
avec r1 et r2 rendement de récupération de l’analyte et de son EID.
Or, dans le principe même du dosage par étalonnage interne, on suppose que les étalons
internes se comportent comme les analytes que l’on souhaite doser, et en particulier lors des
différents traitements que l’on fait subir à l’échantillon initial : c’est-à-dire que l’on suppose qu’ils
subissent les mêmes pertes, i.e. r1 = r2 = r.
On en déduit la relation suivante :
I Q
= ⇔
I Q
A CrA
/ EID. i
A
i
EID EID
2
1 I
Q = . . Q
i A i
A
CrA / EID I EID
EID
IA, IEID : intensités mesurées
CrA/EID : calculé précédemment
Q i EID : quantité connue introduite avant traitement de l’échantillon
Calcul des rendements de récupération
On ne peut pas déterminer les rendements d’extraction des analytes directement à partir des
EID. En effet, ces derniers étant déposés sur l’échantillon avant extraction, ils subissent les mêmes
pertes que les analytes. On introduit donc un nouvel étalon interne, appelé Etalon Interne de
Contrôle de Récupération (EICR). C’est par l’intermédiaire de ce dernier, introduit en quantité
connue juste avant l'analyse, qu’il est possible d’accéder aux recouvrements de chaque analyte.
Conformément à ce qui a été fait précédemment, nous pouvons écrire :
or
f r
Q EID . Q
100
I α Q
I = .
A α Q
EID EID
f
EID
EICR EICR EICR
i EID
= où r est le rendement de recouvrement
i
i
I EID α EID QEID r
QEICR α EID QEID r
on en déduit que = . . ⇔ = . .
I α Q 100
I α I 100
EICR EICR EICR
EICR EICR EID
Nous avons vu précédemment qu’il existe une relation linéaire entre l’intensité d’un signal et la
quantité d’un analyte correspondant :

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i
I A α A Q
Q α Q
A = .
⇔ = .
i
I α Q
I α I
EID EID EID
On peut donc remplacer, et on obtient :
i
QEICR α EID α A QA r
= . . .
I α α I 100
EICR EICR EID HAP
Q I
r = × × ×
EICR A
100 i
I EICR QA CrA
/ EICR
1
i i
EID A A
EID EID HAP
Il est alors possible de calculer le rendement de récupération d’un analyte lors des phases de
traitement de l’échantillon.