Cours de D. Belin, notes de cours

Notes de génétique moléculaire, cours de Dominique Belin
Cahier 1 : Les bactéries, leurs bactériophages et leurs croissances
Dans les années 30, l'utilisation des micro-organismes a posé les bases de la biologie
moléculaire.
• Les champignons: Neurospora
• Les bactéries: Escherichia coli
• Les bactériophages: T4 et λ (lambda)
• Les levures: Saccharomyces cerevisiae (voir plus loin dans le cours) et
Schizosaccharomyces pombe
La génétique moléculaire étudie la nature du matériel génétique, c'est à dire sa propagation, sa
variation et son expression. Elle essaye de mettre en évidence le lien entre le support de
l'hérédité et le phénotype.
Escherichia coli:
Le temps de génération est, en conditions optimales (milieu riche, 37°C), 20 minutes (20')
• Génome: 4.639.168 pb (1 chr. circulaire)
• ~4173 gènes organisme génétiquement haploide
• Le temps de réplication du génome est de 40' (1000 -
2000nt/sec)
• La vitesse de transcription est de 60nt/sec
• La vitesse de traduction est de 20 acides aminés/ sec
(20aa/sec)
• => Donc la transcription et la traduction vont à
la même vitesse (couplage !!)
Pour E. coli, le type sauvage (organisme prototrophe) peut pousser sur un milieu minimum et
complètement synthétique. Il lui faut:
• des sels
• du phosphate
• de l'ammonium (source d'azote)
• des traces de métaux
• une source de carbone (nous allons voir l'utilisation de mutations dans l'opéron lac
dans la troisième partie du cours)
La vitesse de croissance dépend de la source de carbone: Glucose de préférence, lactose,
maltose, arabinose…
La température de croissance peut varier de 20°C à 42°C, avec un optimum à 37°C.
Escherichia coli est sensible aux antibiotiques.
La base de la génétique est la possibilité d'obtenir des variations et d'isoler des mutants :
1

• des mutants nutritionnels (auxotrophe): par exemple: leu - , trp - , his - (donc ces souches
ont besoin de ces acides aminés)
• des mutants d'utilisation de sucre: par exemple lac - → Fermentation
• des mutants ne poussant pas toutes les températures: température sensible (ts),
cryosensibles (cs)
• des mutants résistants aux antibiotiques: par exemple Amp R
La croissance des bactéries et des bactériophages
Escherichia coli est génétiquement haploïde (exceptions voir plus tard). La souche sauvage
est prototrophe.
La croissance des bactéries se reflète par une augmentation de la masse cellulaire dans le
milieu de culture et ainsi d'une augmentation de la turbidité (mais attention, la turbidité
dépend de la taille des particules et de leur nombre).
Une colonie est un clone: un ensemble d'organismes génétiquement identiques (jusqu'à preuve
du contraire...). Ainsi le nombre de colonies nous permet de mesurer le nombre de cellules (au
temps 0) qui donnent lieu à une descendance. Au cours du temps il est donc possible de
mesurer le taux de croissance car les divisions sont asynchrones et la croissance apparaît
continue:
Nt = No2 t/tg
tg = t1/2 = temps de génération
Il y a 3 phases de croissance : Le lag (latence), la phase exponentielle et le plateau = G0
Ceci dépend aussi de la phase de croissance des cellules:
Le bactériophage
Graphiques semi-logarithmiques
On étale beaucoup (10 6 - 10 8 ) bactéries sur une boîte. Cela donne quoi? Un tapis de bactéries
(gazon), parce que toutes les cellules vont faire des micro-colonies confluentes. Mais parfois
il y a une zone claire dans la boîte:
2

Une plaque, une plage ou une zone de lyse ou d'inhibition de croissance. Cette zone est dûe à
des phages!
Avec les fibres de la queue, le phage s'attache sur des
"récepteurs" sur la bactérie. Selon les phages, se sont des protéines bactériennes différentes
(OmpC pour T4, LamB pour le phage λ). C'est donc l'interaction entre des protéines du phage
et la protéine de surface de la bactérie qui determine la spécificité. La tête contient l'ADN.
Croissance du phage T4: “one-step growth”
• Infection avec une multiplicité de
1 phage / 10 bactéries, en moyenne
(moi = 0.1)
• Etalement à différents temps
sur un gazon bactérien
• Latence: 1 bactérie infectée va lyser
sur la boîte, libérer sa progéniture et
faire une plaque par cycles successifs
• Après 40 min, les bactéries infectées
ont lysé, et chaque phage libéré
donne une plaque
Centres infectieux=bactéries infectées + phages
libres
3

Cahier 2 : Les mutants T4 et la carte génétique
Les mutants du bactériophage T4
Prenons un phage sauvage (wild type): a + b + h + r + e + 23 + (les lettres et chiffres représentent des
gènes). Normalement les plaques sont légèrement troubles, mais à une rare fréquence (environ
1/1000) apparaissent des plaques grandes et claires:
Les plaques des phages sauvages (r + ) sont petites et troubles.
Les plaques du mutant (r - ) sont grandes et claires. Les plaques claires
et grandes sont dues à une lyse rapide. Les mutant sont nommés: r =
rapide
Nous allons isoler d’autres mutants, pour mieux connaître le phage. Ici nous allons d'abord
isoler des bactéries qui ne permettent pas au phage de se multiplier et donc de causer la lyse
de la bactérie (mutations dans le génome bactérien). Ensuite nous allons isoler des mutants du
phage (mutations dans le génome du phage), qui pourront de nouveau pousser sur cette
"nouvelle" bactérie (hôte). La colonie qui pousse ne permet donc plus la reproduction du
phage et ne lyse pas. Appelons la B/4 ou T4 R
Si maintenant la souche B/4 est étalée sur une boîte de petri et infectée avec 10 7 - 10 8 de
phages T4, avec un peu de chance vous observez une plaque, due à une mutation dans le
génome du phage. Ce phage est capable de pousser sur son nouveau hôte: c'est un mutant h.(h
= host range). L'interaction entre phage et bactérie est en fait une interaction entre recepteur et
fibres de phage.
En fait, nous observons ici une relation mutant - suppresseur. La mutation suppresseur du
phage permet à ce dernier de se multiplier malgré la mutation primaire dans la cellule hôte.
Cet interaction génétique peut être très spécifique. Un autre mutant B/4 ne permettra pas
forcément à ce mutant h de pousser. On parle de suppression allèle spécifique.
4

La carte génétique du bactériophage T4
Pour localiser les mutations et les gènes correspondants sur une carte génétique, il faut donc
croiser les phages par infection d'une bactérie avec les deux types de phages (moi?).
D’après les fréquences de recombinaison, on en déduit qu’il y a au moins 3 gènes et que pour
que les distances soient respectées, le génome du bactériophage doit être circulaire !!! C’est
parodoxale au vu de la photo du chromosome linéaire de T4.
On l’explique par 3 points :
• un capside contient 102% d'ADN, 100% étant la longueur du génome
• L'ADN répliqué dans la cellule fait plusieurs génomes en longueur,
• Les génomes sont décalés.
En effet, nous parlons d'une molécule, mais nous regardons toute une population de phages!
Reprenons l'exemple de l'infection d'une bactérie avec des phages r et des phages r + .
Si vous infectez une bactérie avec 5 phages r + et 5 phages r , après 10' vous regardez les
centre infectieux, qu'est- ce que vous observez?
Des plaques "mottled" (panaché):Stent and Calendar, 12-1
Si vous attendez la fin du cycle de reproduction, qu'est-ce que vous verrez?
Essentiellement des r + et des r. Mais donc aussi 2% de plaques mottled.
Il y a redondance terminale du génome empaqueté! Et l'ADN est présent dans la cellule qui
produit des phages en forme de concatemère et introduit dans le capside du phage selon le
principe "tête pleine". (Vous verrez plus tard un autre mode d'empaquetage).
Après recombinaison entre deux génomes de phages différents, cette redondance crée une
hétérozygotie partielle
5

Cahier 3 : Les mutants RII et la structure fine du gène
Les mutants rII
Benzer a utilisé encore une autre souche d'Escherichia coli:, la souche K, qui portait un autre
phage, le phage lambda (λ): K(λ). Lorsqu'il a infecté cette souche avec du phage T4 rII, le
lendemain il n a pas vu de plaque. Il a répété l'expérience et a observé la même chose.
rI rII rIII
E. coli B + + +
E. coli K(λ) + - +
Le phénotype sur K(λ) permet de sélectionner de très rares r + résultant d’une recombinaison
(croisement) ou d’une réversion.
Les fréquences :
• Taux de mutation r+ vers rII: ~0.3-1 x 10-3
• Taux de recombinaison: > 10-6
• Taux de réversion des mutants rII:
10-3 à 10-8 (mutants ponctuels)
< 10-10 (délétions; environ 10% des mutants rII spontanés)
• Première définition d’une délétion (perte d’ADN)
attention: certaines délétions peuvent “réverter”
voir plus loin dans le cours
Maintenant nous allons utiliser la souche K(λ) pour analyser des croisements. Avant et après
un croisement nous allons observer la croissance des phage sur les deux types de souches:
Donc seulement les recombinants type
sauvage vont pousser sur K(λ).
Comment isoler des phages sauvages à partir de phages rII? Soit par réversion, soit par
recombinaison. La fréquence de recombinaison augmente avec la distance entre deux
mutations. Il est donc possible d'établir une carte génétique. Mais attention, la fréquence de
recombinaison et la distance entre deux mutations n'est pas strictement linéaire! Pour des
marqueurs très éloignés, la fréquence est 50%, donc comme deux marqueur non-liés. Dans
6

certains régions d'un génome, la fréquence de recombinaison est plus basse que dans d'autre
régions.
Pour faire une carte génétique, il faut isoler beaucoup de mutants! Ensuite nous allons les
croiser entre eux, pour déterminer la fréquence de recombinaison
Avec n mutants indépendants, il faut : (n 2 +n)/2 croisements!!! Cela nous fait donc pour 1000
mutants: 500'500 croisements, une tâche impossible!!!
Il faut donc arriver à diviser le génome en plusieurs parties et de placer les mutations dans
certaines sections pour éviter de croiser tous les mutants entre eux:
En utilisant des délétions il est possible de grouper les mutants: chaque délétion représente un
mutant qui ne peut pas recombiner pour donner un type sauvage avec plusieurs autres mutants
qui recombinent entre eux.
Définition d'une délétion en terme génétique:
• ne reverse pas (il y a néanmoins des exceptions)
• ne recombine pas avec aux moins deux mutants qui recombinent entre eux.
Ce qui est en
noir
représente
l’ADN
manquant
dans chaque
délétion!
Del 1241
Garde A1 perd
de A2 à B
Del J3 garde
A1 et A2, perd
A3 à B
Mutant DAP56
(dans A2)
r +
X
NON
OUI
recombinants
r +
7

Benzer définit 7 segments et 47 sous-segments :
• Les mutants ponctuels qui recombinent entre eux (à une fréquence > taux de
réversion) définissent des sites distincts
• Les mutants qui ne recombinent pas entre eux sont attribués, provisoirement, au même
site.
• L’ordre des sites dans le sous-segment, et leur distance, ne sont pas déterminés
• La taille d’un segment est arbitrairement définie par le nombre de sites identifiés
Maintenant la question de Monsieur Benzer était:
• Combien de particules élémentaires (cela correspondrait à quoi d'après vous?)
• Est-ce que tous les sites sont équivalents? Est-ce que la probabilité de mutations est
partout pareille, ou comment est la topographie du gène ?
Voici les mutations qu’il a
analysées :
C.f cours pour + de détails
Chaque carré représente un mutant
rII d'origine indépendante
Est-ce que ce sont les mêmes
mutants? Est-ce que la fréquence
de recombinaison est plus grande
que le taux de réversion ?
Si on compte les mutants, il y a sur 1612 mutants, 517 mutants à un endroit et 292 mutants à
un deuxième endroit. Donc la probabilité n'est pas uniforme. Il a des points chauds, des hot
spots. En regardant la distribution du nombre de mutations par site, on s’aperçoit qu’elle suit
une loi de poisson ! Donc on peut calculer la probabilité d’avoir un certain nombre de
mutations par site grâce à cette formule : Pn = (m n e -m ) / n! où m =moyenne.
8

Cahier 4 : Test de Complémentation
On cherche combien il y a de gènes pour 1 phénotype et si 2 mutants le présentant mutent
pour le même gène. Diffère de la recombinaison car donne celle-ci donne une distance et pas
la fonction. La complémentation permet à un organisme avec deux génomes défectifs de se
reproduire. On ne peut observer la complémentation que dans le cas de mutations récessives
et dans des conditions restrictives.
Si le résultat du test est négatif, il est parfois nécessaire de faire un contrôle en cis pour
exclure une toxicité combinée des 2 allèles mutants.
Exemple :
La délétion r1585 couvre à la fois les sites
rIIA et rIIB mais elle est fonctionnellement
rIIA - /rIIB +
Récapitulation: A quoi sert le test de complémentation?
• La complémentation nous dit, si deux mutations sont dans le même cistron
• La recombinaison nous donne une distance entre deux mutations. Elles peuvent être
dans le même cistron ou dans deux cistrons.
Elle nous fournit une réponse, combien de protéines pour un certain phénotype (nombre
minimal, exacte ou maximal?)
Exception de α-complémentation dans LacZ
L'opéron lac: Les mutants lac - ne sont pas capables d'utiliser le lactose. L'opéron consiste en
trois cistrons, Z, Y et A. Si vous prenez une mutation au début de lacZ ou une petite délétion,
vous trouverez la complémentation avec des mutations plus distales. On parle de la
complémentation intragénique. La complémentation intragénique peut augmenter
artificiellement le nombre de gènes d’un locus
Malgré la présence d'une délétion (acides aminés 12-42) dans le cistron lacZ d'un mutant
(ΔM15) et un mutant qui ne code que pour une petite portion de la β-galactosidase (149
acides aminés sur 1021), la souche est phénotypiquement LacZ + et une activité de βgalactosidase
peut être mesurée. Cette complémentation, qu'on appelle aussi la
complémentation α, était à l'origine de beaucoup de plasmides utilisés pour le clônage dans la
biologie moléculaire. C.F cours 4 dia 9
Une autre exception: Les mutations polaires
Revenons à une mutation dans lacZ. Cette mutation est tout au début du gène LacZ. Malgré le
fait que la mutation soit dans le cistron lacZ, la souche est aussi phénotypiquement lacY - .
9

C'est un effet polaire de la mutation lacZ sur les cistrons plus en aval. Dans ce cas, cela
s'explique par une instabilité accrue de l'ARNm.
Cahier 5 : Le problème du code, l’origine des mutations et les mutations
spontanées
Le problème du code
Il y a quatre bases et 20 acides aminés standard = 3 bases/a.a. Le code est non chevauchant
Ceci était trouvé avec:
• analyse des séquences connues :> 256 possibilités (max = 400)
• Mutants TMV (ac nitreux): 1 seul acide aminé changé pour chaque mutant
• Mutants globine: 1 seul acide aminé changé
On sait maintenant que le code est constitué de groupes de trois bases, les codons, lus à partir
d'un point fixe (codons initial AUG).
Mutations du code :
• Revertant vrai: même séquence d’ADN que le wt (« grand-parent »)
• Revertant « presque vrai »: GAG → UAG → CAG
• Pseudorevertant: phénotype wt mais la mutation original est toujours présente (et peut
être isolée par croisement)
• 2ème mutation est un suppresseur intragénique ou extragénique
• Le suppresseur isolé peut avoir un phénotype mutant mais ce n’est pas obligatoire
Les suppresseurs intragéniques:
Comment vous pouvez distinguer entre les deux? Ils sont tous les deux phénotypiquement wt.
Par croisement avec le vrai parent (wt). Dans le cas d'un revertant vrai, vous n'aurez que des
types sauvages. Dans le cas du pseudorevertant, vous pouvez séparer les deux mutations.
Les recombinants rII sont de nouveau croisé
avec FC0:
• pas de recombinants dans le cas de la
mutation FC0 (reisolée !)
10

• recombinaison avec FCO indique donc la présence d'une mutation suppresseur (ici
FC7)
Pour prouver que le code est à 3(n) nucléotides on fait une étude statistique :
FC0: mutant de signe + (arbitraire), Les suppresseurs de FC0: mutant de signe - (arbitraire)
Les suppresseurs des suppresseurs de FC0 mutant de signe +
Toutes les combinaisons + + et - - sont rII
La plupart des combinaisons + - sont type sauvage
Des combinaisons +++ et --- sont r+
Si le code est à 3 bases, il n’y a que 2 types de mutants de cadre de lecture (FC0 et FC7).
Si le code est à 6: FC0 est forcément +/- 2 bases, et FC7 -/+ 2 bases, il devrait exister des
mutants de cadre (+1, +3 et +5)
Ces mutants ne devraient supprimer aucun mutant + (FC0 et ses petits enfants) ni aucun
mutant - (FC7, FC9… et leurs petits enfants)
Il y a donc évidence expérimentale en faveur d’un code à 3 : 6 mutants rII dans rIIB1,
indépendants de FC0, sont tous les 6 de signe + ou de signe –
Mutations
Il y a quatre modes de changements du génome:
• Mutations
• Recombinaison
• Réarrangements chromosomiques; cancer des cellules du sang (pourquoi?)
• Transposition (voir deuxième partie)
Les délétions
Les mutations ponctuelles
• insertions et délétions de 1 à 4 bases: mutations frameshift (qui changent le cadre de la
lecture)
• substitutions de bases: transitions ou transversions
Les mutations frameshift (changement du cadre de lecture) (bégaiement). C'est l’addition ou
la déletion de bases. C'est pendant la polymérisation qu'il y erreur.
Exemples:
• Locus rII du phage T4→ Points chauds = répétition de A
• Gène APC → mutation silencieuse : GAA ATA AAC et dans la variation GAA AAA
AAC
• Gène LacI → les répétitions CTGG donnent lieu à des insertions (amplification de
triplets; vers le haut) ou des déletions (vers le bas)
11

Substitutions spontanées de bases
La fréquence des erreurs de réplication est de 10 -7 - 10 -10 /bp/génération. Donc la réplication
est très fidèle et fait peu d'erreurs.
C’est principalement la DNA polymérase a une activité exonucléase 3'->5', qui corrige les
erreurs, parce que l'appariment des bases n'est pas suffisant pour garantir cette fidélité.
T4 DNA polymérase mutation mutateur: peu d'activité d'exonucléase
T4 DNA polymérase mutation antimutateur: beaucoup d'activité d'exonucléase
Les transitions spontanées: mécanismes indépendants de la réplication
• Une forme rare de la cytosine, l’imino-cytosine, s'associe avec adénine au lieu de guanine,
impossible à réparer
• Une forme énol rare de la guanine s'associe avec thymine, considérée comme normale par
la poly donc pas réparée
L'analyse du gène lacI a démontré des points chauds de
transition
Sur 15 sites où il est possible de créer des mutations amber
par transition GC->AT, les 4 sites à fréquence élevée sont
des méthyl-C
12

Cahier 6 : Mutagenèse, mutagènes et spectre de mutations
Mutagènes
Agents physiques :
• UV -> pyrimidine photodimer, forme des cycle à 4 en ajoutant des liaisons H entre 2
pyrimidine adjacentes = pré-mutations car ont lieu avant réplication.
• X-ray -> cassure de l'ADN, réparation fautive
Agents intercalants :
• Le bromure d'ethidium (BET) est utilisé au labo pour visualiser l'ADN sous UV→
PCR
• Profavine : induit des mutations du type FC0
Modifications de bases :
• Modification par hydroxylamine
(NH2OH) : transition GC → AT
• Acide nitreux : C devient U par
déamination et donc va s'apparier
avec A; A va devenir Hypoxanthine,
qui va s'apparier avec C, et non pas
avec T.
2 transitions : GC ↔ AT
Agents akylants :
• EMS, nitrosoguanidine, nitrosamines
Les mutations induites par l'EMS, ne sont
que des transitions (G->A, A->G)!!
Analogues de base :
13

• 5-bromouracil
• 2-aminopurine, protonation de 2-AP:
Spectre de mutations
Les spectres sont différents selon les mutagènes utilisés et les mutations ne sont pas les
mêmes.
Exemples :
• Mutants de LacI :
Les mutations spontanées sont toujours là, mais noyées dans les mutations induites par la
mutagenèse!!
• Mutants de rII :
isolats
~1600
~800
2AP: 90 mutants
hot spot
spontané (6A)
sites
251
+53
14

Le spectre des réversions induites par un mutagène peut donner une indication sur la
nature de la mutation première:
proflavine 2-AP, 5-BU HA
Ins/del + - -
transversion - - -
transition GC->AT - + +
transition AT-> GC - + -
La réversion des mutations peut être utilisée dans l'analyse de mutagènes potentiels:
Test d'AMES
Dans le test de Bruce Ames, un extrait de foie de souris est incubé avec un carcinogène
potentiel et ensuite rajouté à une culture de Salmonella auxotrophe pour histidine (his - ),
comprenant des mutants frameshift, des transversions et des transitions. Si le carcinogène
induit des mutations, il est possible de trouver une fréquence plus élevée de réversion his - ->
his + . Cela permet de voir si un pro-mutagène est métabolisé en agent mutagène.
Mutagène
sur un disque de
papier buvard
Gradient de concentration
du mutagène (diffusion):
-trop près du disque, dose léthale
-trop loin du disque, dose inefficace
Sans mutagène:
revertants spontanés
15

Les mutants non-sens et les ARNt suppresseur
Mutants non-sens
La séquence est lue par groupes de 3 bases à partir d’un point fixe (codon start),le code
génétique n’est pas entièrement dégénéré,les codons stop ne spécifient pas d’acide aminé et
provoquent la terminaison de la traduction
Il en existe 3 : code standard: UAG (ambre), UAA (ochre) et UGA (opal)
Evidences génétiques des codons stop (non sens) :
Il existe des mutations réversibles pour 2-
AP dans rIIB1, une région non-essentielle
où on n'attend pas de mutations faux sens.
Utilisation de mutations dans rIIA et la
déletion D1589 (qui ne fait pas de rIIA
fonctionnel)
L'utilisation des différentes souches E. coli
K(λ) a permis d'étudier les mutants rII
portant un codon stop:
rII rII ambre rII del,fs
K(λ) + - -
K(λ) suam + + -
B + - +
Dans les souches suam, le codon non-sens
code pour un acide aminé
Différents suppresseurs de codons nonsens
insèrent différents acides aminés:
suam: suI = sérine, suII = glutamine, suIII = tyrosine, etc…
suoc: suD= sérine, suE = glutamine, etc...
Donc, les mutants rII ne poussent pas sur K(λ), comme prévu. Mais dans certaines souches
K(λ) il y a croissance de l'un ou l'autre phage rII. Ce sont des mutants ambivalents. Ce sont
des souches suppresseurs.
Illustration :Les codons liés au codon ambre (UAG)
Protéines produites dans des souches suam
Protéines codées par des révertants de mutants ambre
Selon les schémas ci-dessous, sur tous les 20 aa, il n'y a que 7 (8 codons) qui peuvent donner
un codon UAG par une substitution de base
Les différentes transitions possibles autour d'un codon stop. Les différentes transversions
possibles autour d'un codon stop.
16
mutants rIIA
révertibles par
2AP
combinés avec
r1589

La suppression des codons stop par des ARNt mutés
Le code génétique est déterminé par le génome de l’organisme: tRNAs, aminoacyl-tRNA
synthases, facteurs de terminaison…
Le code peut être modifié par:
• suppresseurs de non-sens: suam, suoc, suop
• mutateurs: tRNA modifiés proquant des faux-sens (révélés par leur effet sur mutD)
• su + : suppresseur extragénique supprimant une classe de mutants, aussi bien dans rII
que dans phoA ou lacZ.
• tRNA muté dans l’anticodon lit un codon non-sens
Illustration du wobble :
Codon stop
UAG
Souche wt (su0) Souche suam
tRNAtyr mineur
anticodon AUG5’
codons 5’UAU
UAC
L'utilisation de mutagènes pour induire les revertants a aidé à déterminer la séquence
des codons stops:
• Hydroxylamine, n'a pas d'effet sur la reversion:
rIIambre --> r +
rIIochre --> r +
Donc, il n'y a pas de G/C!! Ou, les G/C sont liés à d'autre codons stop par une transition
• Mutants d'une souche rIIochre isolés sur K(λ) su + am
Mutation
de l’anticodon
AUC5’
17

La réversion et la pseudoreversion en rIIam sont induit par 2-AP, mais la fréquence reste la
même après un traitement Hydroxylamine. Donc une transition suffit. Donc:
les codons amber et ochre ont deux bases identiques
le codon amber a un G/C
le codon ochre a un A/U
• Mutagenèse HA induit rIIoc et rIIam: il y a donc au moins un A ou au moins un U!!
• le gène r + est nécessaire avant la réplication car les effets sont différents sur le brin m
et le brin c
==>> donc il y a un U et un A dans un codon amber!!
amber => U et A et (G ou C)
ochre => U et A et (A ou U)
on sait aujourd'hui que:
N97 : UGG -> UAG
EM84: CAG -> UAG
18

Cahier 8 : Le développement des phages T4, T7 et λ ; le test de fluctuation
Développement des phages
T4 :
• Premier organisme où tous les gènes essentiels sont identifiés (1961)
• Type sauvage pousse à 30° et 42°, sur des souches su0 et su+am
• Mutagenèse, collection de mutants ts et am, les am ne poussent que sur une souche
su + am, les ts ne poussent qu’à 30°
• Classer les mutants par gène (complémentation)
• Localiser les mutants sur la carte
• Etudes fonctionnelles: génétique du développement
Les études fonctionnelles se fondent sur:
• synthèse de l'ADN: dna + , dna -
• synthèse d'antigènes de fibres
• particules de phages en microscopie électronique => têtes, queues, particules entières
Il est donc possible de classer les mutations et de leurs accorder une "fonction", et à l'aide de
tests quantitatifs de recombinaison de les placer sur la carte génétique :
am ADN Ag Tête Queue Virion
43 no no no no no
33 + no no no no
23 + + no + no
19 + + + no no
34am
34ts
+
+
no
+
Carte de T4 :
(+)
(+)
(+)
(+)
+
+
-Gènes précoces, nécessaires pour la réplication
-Sans réplication (gp43 = DNA polymérase), pas d’expression
des gènes tardifs
-Un gène régulateur au moins (nouveau σ et
coactivateurs dont gp33)
-Synthèse et assemblage indépendant des structures
La morphogenèse du phage T4: Si la synthèse des différentes composantes est
indépendante, on devait donc pouvoir assembler des phages dans un tube à essai? On isole des
particules sans fibres (infection dans des conditions non-permissives avec un mutant 34am), et
un lysat contenant des fibres (mutant 23 - )
19

Assemblage in vitro:
Phage T7 :
Dégradation de l’ADN cellulaire nouvelle RNA polymérase. Contrairement à la polymérase
de la bactérie, cette polymérase à ARN est résistante à l'antibiotique rifampicin.
Et en synthèse de protéines cela se présente ainsi:
Phage λ :
Le phage λ n'utilise pas une autre polymérase à ARN, mais change le processus de
terminaison de la transcription en produisant des protéines anti-terminateurs, N et Q. Le
mode d'action de N implique une liaison de l'ARN et ressemble à celui de la protéine TAT du
virus HIV.
20

Le test de fluctuation
Quand on voit apparaître des mutants sur un milieu sélectif, il faut se poser la question si les
mutations sont induites par la sélection (présence de phage, absence d'acide aminé, présence
d'un antibiotique) ou si c'est des changement du matériel génétique qui se produisent
spontanément en cours de temps au hasard et indépendamment de l'agent sélectif. Pour
distinguer entre les deux, Salvador Luria et Max Delbrück ont développé le test de
fluctuation (variation).
Pour cela nous étalons des bactéries sur des boîtes contenant un excès de phages T1. Nous
allons voir la fréquence des résistants (Ton R ).
Si c'est une adaptation, nous attendons quelques cellules qui vont s'adapter (devenir résistant
au phage T1) et donner lieu à des colonies:
Si c'est un événement spontané, nous attendons ceci:
On va comparer le résultat de cette expérience avec une culture que vous avez partagé en 20
avant d'étaler. Vous verrez moins de variation. Le test de fluctuation est une comparaison de
la variance et de la moyenne dans un échantillon de n cultures:
Taux de mutation = probabilité de
mutation/réplication, déterminé à partir des cultures
sans mutant (classe P0)
Fréquence de mutants = nb de mutants /nb total de
cellules, déterminé avec des cultures contenant bcp de
mutants
La fréquence augmente à chaque génération
21

Fréquences de mutants :
• Fréquence mesure les mutations, qui donnent naissance à des mutants, ET les
descendants de ces mutants
• Pour simplifier, assumons une population synchronisée
• Les wt et les mutants se divisent à la même vitesse
• On part d’un inoculum petit, sans mutant
• Le taux de réversion est égal ou < que le taux de mutation
Nouveaux mutants apparaissent à génération g : ∆mg = a x Ng / 2
(nouvelles mutations) nb de divisions pour avoir N cellules = N /2
Nouveaux mutants à génération précédente (g-1): ∆mg-1 = a x Ng / 4
= ∆mg / 2
Nb total de mutations à génération g :
Σ ∆m = ∆mg+ Dmg/2 + ∆mg/4 + ∆mg/8….. ~2 ∆mg = a x Ng
Nb total de mutants: ∆mg + ∆mg + ∆mg + ∆mg ….. = g x a x N/2
Plus tard, en 1952, Joshua et Esther Lederberg ont confirmé cette hypothèse par la méthode
de "replica plating". Ils ont étalé des bactéries sur un milieu non-sélectif et ensuite répliqué les
colonies sur milieu sélectif. Comme attendu pour des mutations spontanées, on a pu ainsi
isoler des mutants qui n'avaient jamais vu l'agent sélectif.
Le réétalement de Newcombe pour montrer que les
mutations préexistent la sélection: Plus la culture pousse,
plus la taille des clones mutants augmente et plus il y a
des clones mutants provenant d'événements mutationnels
indépendants.
22