Les chloroplastes - culturebiotech

Introduction
Notion de plastes et chloroplastes
Les chloroplastes
!! Les bactéries les + avancées sont les cyanobactéries (provenant de bactéries photosynthétiques primitives),
elles utilisent les e - issus de l’eau et l’énergie du soleil pour convertir le CO2 en matière organique.
Les végétaux et les algues qui se sont développés bien plus tard ont des organites intracellulaires spécialisés
permettant de réaliser cette photosynthèse.
Ces organites = chloroplastes, membres de la famille des plastes.
!! Caractéristiques communes des plastes = multiples copies du même génome. Présence d’une enveloppe
composée de 2 membranes concentriques.
Les plastes se sont développés à partir de PROTOPLASTES, petits organites des cellules immatures des
méristèmes végétaux. Voir TP.
Si la plante est dans le noir, les plastes évoluent dans les cellules différenciées en ETIOPLATES contenant un
précurseur jaune de la chlorophylle, si elles sont exposées à la lumière, les étioplastes se transforment en
CHLOROPLASTES en transformant ces précurseurs en chlorophylle et en synthétisant de nombreux
pigments membranaires, enzymes photosynthétiques et composants de la chaîne de transport des électrons ;
Autres plastes: les Leucoploastes dont les amyloplastes qui accumulent l’amidon dans les tissus de réserve =
plastes de réserve. Ex : dans la pomme de terre…
A noter que les végétaux n’utilisent les plastes pas que pour faire de la photosynthèse ou en tant qu’organites de
réserve mais aussi dans ces compartiments peut être compartimentées certaines voies métaboliques comme la
synthèse des purines et pyrimidines, des acides aminés et synthèse des acides gras (attention : dans la cellule
Eucaryote animale, cela se fait dans le cytoplasme, et la dégradation des acides gras dans la mitochondrie).
I) Methodes d’étude (le chloroplaste : un bon modèle)
a) L’isolement des chloroplastes

Observation :
Fraction brute de chloroplastes isolés observés en contraste de phase.
Les chloroplastes intacts pourvus de leur enveloppe apparaissent brillants.
Les chloroplastes "cassés" dépourvus de leur enveloppe apparaissent sombres.
! La séparation des chloroplastes intacts et "cassés" peut se faire sur le principe suivant, en utilisant leur
différence de densité.
Chloroplastes cassés: Ils ont perdu leur intégrité. Chloroplastes intacts
Leur ultrastructure est semblable à celle qu'ils avaient "in situ".
b) Fractionnement des chloroplastes
Séparation des thylacoïdes granaires à partir de chloroplastes isolés. Le granum conserve sa forme.
Seuls les thylacoïdes externes, dont une face n'est pas accolée, se vésicularisent.

Le chloroplaste est observable en microscopie photonique "in vivo" (observation vitale), mais sa structure ne
peut être détaillée. La structure du chloroplaste a été par contre, très finement analysée en microscopie
électronique à transmission sur sections ultrafines. Cette technique est simplement topographique. Il est
nécessaire d'utiliser d'autres techniques complémentaires pour préciser la localisation des différents éléments
fonctionnels.
c) Ultrastructure
! Cryofracture et cryodécapage
La technique de cryofracture permet de mettre en évidence les particules protéiques contenues dans la
membrane.
! La cryofracture consiste à geler un échantillon dans l'azote liquide ( -170°C), puis dans une enceinte sous
vide à casser cet échantillon avec une lame ; la fracture passe par des régions de moindre résistance, c'est à dire
au milieu de la double couche lipidique des membranes,
! vaporiser avec un angle un métal lourd qui va se déposer de manière dissymétrique (ombrage) selon le
relief de la section (un métal lourd est opaque aux électrons),
! vaporiser du carbone sur toute la surface. Celui-ci constitue donc un moulage de la surface englobant le
dépôt de métal,
- réchauffer l'ensemble et nettoyer pour enlever l'échantillon biologique,
Le schéma ci-dessous permet de définir les différents types d'hémimembranes :
E : face exoplasmique (vers la lumière du thylacoïde) ;
P : face protoplasmique (vers le stroma) ;
F : fracture ;
s : stack (thylacoïdes accolés) ;
u : unstack (thylacoïdes non accolés). Microphotographie d'une portion de chloroplaste de chlamydomonas
obtenue par cryofracture. On distingue les faces protoplasmique et exoplasmique des thylacoïdes accolés
(EFs et PFs) et non accolés (EFu et PFu).

! Contraste négatif
ou coloration négative est réalisé en déposant une goutte de phospho-tungstène sur une préparation biologique.
Le tungstène est un métal lourd donc, opaque aux électrons. Les structures de l'objet biologique non colorées
apparaissent alors en clair sur un fond sombre. Cette technique a permis de mettre en évidence des structures
de petite taille (virus, molécules protéiques, ADN, etc..). Appliquée à une suspension de chloroplastes éclatés,
elle permet de préciser quelques éléments de structure.
Une vue générale obtenue par cette technique confirme visuellement l'existence de thylacoïdes empilés en
forme de disques aplatis.
étalement de disques granaires on observe les ATP-synthases sur les bords d’un
thylacoïde et sur la surface de celui-ci.
! Immunocytochimie
Après fractionnement et isolement des chloroplastes, des fractions purifiées de certains constituants protéiques
des photosystèmes sont obtenues. Elles sont injectées à des lapins et les anticorps obtenus (anti-protéine de PSI
et anti-protéine de PSII) sont marqués par des billes d'or opaques aux électrons. Des sections ultrafines de
chloroplastes d'épinard sont traitées par ces anticorps marqués.
Ac anti PS II

II) Structure et ultrastructure
1) Localisation
Toutes les parties vertes de la plante contiennent des chloroplastes : on en trouve dans les feuilles (surtout), +
rarement tiges, fruits…
Structure schématique d'une feuille de Dicotylédones :
La nervure médiane, très en relief comme chez beaucoup de dicotylédones contient principalement des tissus
conducteurs de la sève brute (xylème) et de la sève élaborée (phloème). Ces tissus sont protégés par des tissus
de soutien. De part et d'autre de cette nervure, le limbe est formé par du parenchyme palissadique (face
supérieure) et du parenchyme lacuneux (face inférieure). La feuille est protégée des pertes d'eau par deux
épidermes, recouverts d'une cuticule imperméable. Les échanges de gaz sont assurés par les stomates.
Structure schématique d'une feuille de Monocotylédones :
La feuille de Monotylédones est le plus souvent caractérisée par la présence de nervures parallèles et de taille
sensiblement équivalente. La feuille étant souvent verticale (Graminées, Liliacées, etc.) il n'y a pas de
distinction nette entre les deux sortes de parenchymes
Le parenchyme chlorophyllien, lieu de la photosynthèse, est mis en relation dans la feuille vers l'extérieur
(échanges gazeux) par les stomates et vers l'intérieur (apport d'eau et de sels minéraux et transport des
assimilats) par les nervures.

2) Structure :
Schéma d’une cellule chlorophylienne :
- Une membrane externe très perméable
- Une membrane interne peu perméable avec des transporteurs membranaires (attention : pas de crêtes et pas
de chaîne de transport d’électrons).
- Un espace intermembranaire
! L’ensemble constitue une enveloppe
! Intérieur du chloroplaste = Stroma équivalent de la matrice mitochondriale.
Dans ce stroma, on y trouve les enzymes du métabolisme surtout pour le cycle de calvin, leur propre génôme,
plastoribosomes, ADN, ARN spécifiques du chloroplaste.
Présence d’une troisième membrane: membrane thylacoïde, qui forme un ensemble de sacs aplatis discoïdes,
les thylacoïdes, parallèles à l’axe en longueur du chloroplaste. La lumière de chaque thylacoïde est connectée à
celle des autres définissant ainsi un 3 ème compartiment interne appelé espace thylacoïde.
! Les thylacoïdes s’empilent pour former des grana.