Transfert des produits phyto.... - SympoScience

Mise au point et validation d’une méthode
d’analyse multirésidus de pesticides sur
substrats d’origine végétale
1. Présentation du laboratoire DEFITRACES
Le laboratoire dans lequel cette méthode à été développée est
DEFITRACES
150 rue pré-magne
69126 Brindas ( France)
Ce laboratoire créé en février 1992 par Mr ANDING, aujourd’hui encore son
directeur, a immédiatement orienté son activité vers la détermination de résidus de
pesticides dans les végétaux. Le deuxième objectif majeur de cette structure était
également d’obtenir la conformité de Bonnes pratiques de Laboratoire en moins
d’un an. Elle a brillamment réussi dans cet objectif de qualité puisque depuis le 15
février 1993 ce label « BPL » n’a jamais été remis en cause.
Les principaux clients ont été et sont encore de grands groupes fabricants de
produits phytosanitaires désireux de réaliser des dossiers d’homologation. De ce
fait les analyses majoritairement confiées à DEFITRACES consistent en la
détermination d’une matière active ( et éventuellement d’un métabolite ) sur une
matrice végétale ( « études monorésidus de pesticides »).
Depuis quelques années les objectifs de cette structure se sont orientés vers
l’analyse multirésidus de pesticides sur des substrats d’origine végétale. Afin de
finaliser mon cursus en formation continue au CNAM, à travers un mémoire, j’ai été
amené à développer et valider cette méthode multirédus dont je vous décrit le
résumé ci-dessous.
2. Validation d’une méthode multirésidus de pesticides
2.1 Généralités
Une méthode d’analyse multirésidus de pesticides se doit d’être la plus générale
possible et adaptable à un maximum de substances actives. L’objectif d’une telle
méthode est régulièrement de pouvoir quantifier les résidus de pesticides à
hauteur des limites maximales résiduelles (LMR) autorisées. Le manque de
sélectivité de ce genre de méthode comparativement aux méthodes spécifiques ne
permet pas généralement d’atteindre des niveaux de limites de quantification
inférieur à 0.050 mg/Kg.
17

De plus l’étude bibliographique menée sur ce sujet a mis en évidence une difficulté
majeure : réussir le dosage en une seule et même méthode des pesticides
appartenant à des familles chimiques différentes.
De ce fait toutes les méthodes multirésidus sont décrites pour une famille chimique
ou un ensemble de famille chimiques.
Il est donc impératif de définir concrètement les objectifs précis de la méthode
avant d’envisager son développement et sa validation. Dans le cadre de notre
laboratoire nous nous sommes intéressés à la liste des substances actives
décrites dans la Pharmacopee Européenne. Cette liste est essentiellement
composée par des pesticides de la famille des organohalogénés, des
organophosphorés, des dithiocarbamates et des pyréthrinoides.
2.2 Listes des pesticides sélectionnés
Pour la validation de notre méthode d’analyse nous avons cherché à quantifier les
résidus d’une cinquantaine de pesticides de la famille des organo-alogénés, des
organophosphorés, des organo-zotés, des phtalimides et des pyréthrinoides sur la
tomate. Ce substrat correspond à un cas simple compte tenu de la quantité en eau
naturelle contenue par cette matrice (95 % eau dans les tomates).
18

LISTE DES 54 SUBSTANCES ACTIVES SELECTIONNEES POUR LA
VALIDATION
MATIERES ACTIVES
PHAR
MAC
OPEE
EURO
PEEN
NE
MATIERES ACTIVES
PHAR
MAC
OPEE
EURO
PEEN
NE
MATIERES ACTIVES
DICHLORVOS ** X DICHLOFLUANIDE* ENDOSULFAN-béta* X
ETHOPROPHOS** ALDRINE* X 2-4’DDT* X
Alpha-HCH* X MALATHION** X 4-4’DDD* X
HEXACHLORO X CHLOPYRIPHOS** X ETHION** X
BENZENE*
DIMETHOATE** FENTHION** ENDRINE ALDEHYDE*
QUINTOZENE* X PARATHION ETHYL** X CARBOPHENOTHION**
Delta-HCH* X PIRIMIPHOS ETHYL** X ENDOSULFAN SULFATE* X
PHAR
MAC
OPEE
EURO
PEEN
NE
Beta-HCH* X HEPTACHLOR X 4-4’DDT* X
EPOXYDE*
FONOFOS** X TOLYLFLUANIDE* CAPTAFOL*
DIAZINON** X CHLORFENVINPHOS** X PHOSMET**
LINDANE
X CAPTAN* IPRODIONE*
(Gamma-HCH)*
CHOLRPYRIPHOS X FOLPET* BROMOPROPYLATE* X
METHYL**
HEPTACHLOR* X METHIDATHION** X PHOSALONE** X
VINCHLOZOLINE* ENDOSULFAN-alpha* X AZINPHOS METHYL** X
PARATHION METHYL** X CHLORDANE* X PERMETHRINE°° X
ALACHLOR* X DIELDRINE* X CYPERMETHRINE°° X
FENCHLORPHOS** 4-4’DDE* X FENVALERATE°° X
PIRIMIPHOS METHYL** X ENDRINE* X DELTAMETHRINE°° X
(*) 30 ORGANOHALOGENES ET/OU ORGANOAZOTES, (**) 20
ORGANOPHOSPHORES, ET (°°) 4 PYRETHRINOIDES DE SYNTHESE
2.3 Schéma descriptif de la méthode validée
Une étude bibliographique préalable a permis de mettre en évidence un schéma
de méthode d’analyse très souvent employé. C’est d’ailleurs sur ce modèle qu’a
été construit la méthode multirésidus S19. Cette méthode applicable à 400
matières actives est une des plus générale qui soit validée à ce jour. Le schéma de
la méthode d’analyse que nous avons validé est le suivant :
19

Prise d’essai (PE) en Kg variable suivant le substrat.
Extraction par un mélange eau/acétone (rapport constant 100/200).
⇓
Partage liquide-liquide entre l’eau, l’acétone, et un mélange de
cyclohexane/acétate d’éthyle ( 50/50).
Evaporation (température < 32°C)et dissolution dans un volume exact,
VR1, du mélange cyclohexane/acétate d’éthyle (50/50) = Extrait A.
⇓
Purification d’une partie aliquote, VR2, de l’extrait A par perméation de
gel. Utiliser le mélange cyclohexane/acétate d’éthyle (50/50)
à un débit de 5 mL/min.
Evaporation et dissolution dans 5 mL du mélange acétonitrile/toluène
(75/25) = Extrait B.
⇓
Purification de l’extrait B sur colonne chromotographique
ENVI-CARB (2 g) avec 100 mL du mélange éluant
Acétonitrile/toluène (75/25).
Evaporation et dissolution dans un volume exact, VR3,
d’acétone = Extrait C.
⇓
Analyse et quantification en mg/L (C mg/L) d’un échantillon de l’extrait C
par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de
masse (Trappe d’ions, MSD).
Les résidus en mg/Kg (C mg/Kg) présents dans le substrat seront déterminés à
partir de la formule de calcul suivante :
C mg/L * VR3*VR1
C mk/Kg = ------------------------------
PE * VR2
20

2.4 Résultats de la validation de méthode sur la tomate
Afin de valider notre méthode d’analyse nous avons analysé plusieurs échantillons.
Deux fois un échantillon non traité , quatre fois l’échantillon non traité chargé 20
µg/Kg (0.020 mg/Kg) en chacune des 54 substances actives et enfin quatre fois
l’échantillon non traité chargé 200 µg/Kg (0.20 mg/Kg) en chacune des 54
substances actives.
Les résultats d’analyses obtenus sont présentés ci-dessous.
Teneur de charge
MATIERE
ACTIVE
0,020
(4)
% de récupération, teneurs de charge en mg/Kg , moyennes et écarts types
0,020
(5)
0,020
(6)
0,020
(7)
Moyenne
et écart
type
0,20
(8)
0,20
(9)
0,20
(10)
0,20
(11)
Moyenne
et écart
type
DICHLORVOS 101 104 105 106 104±2 99 108 101 95 101±5 0,10
ETHOPROPHOS 107 111 113 108 110±2 107 106 92 96 100±7 0,010
Alpha-HCH 106 94 79 84 91±12 75 99 86 77 84±11 ND
HEXACHLORO 90 83 60 72 76±11 81 85 70 72 77±6 1,0
BENZENE
DIMETHOATE / / / / / 94 109 108 101 103±7 1,0
QUINTOZENE 110 88 70 103 93±17 86 88 81 82 84±3 ND
Delta-HCH 109 99 78 84 93±12 89 90 81 76 84±7 ND
Beta-HCH 108 84 65 94 88±18 86 94 80 75 84±8 ND
FONOFOS 102 84 70 83 85±13 87 93 79 78 84±6 ND
DIAZINON 104 86 90 88 92±8 83 96 81 83 86±7 0,020
LINDANE 108 110 110 117 111±4 108 106 102 100 104±4 0,050
(Gamma-HCH)
CHOLRPYRIPHO 110 93 99 94 99±8 93 100 89 88 93±5 0,50
S METHYL
HEPTACHLOR 103 80 67 81 83±15 86 85 78 80 82±4 0,010
VINCHLOZOLINE 101 86 90 85 91±6 87 97 83 78 86±8 3,0
PARATHION 104 107 110 106 107±3 87 94 81 81 86±6 0,20
METHYL
ALACHLOR 103 87 81 87 90±9 89 94 84 84 88±5 ND
FENCHLORPHO 107 85 95 86 93±10 93 101 89 87 93±6 0,010
S
PIRIMIPHOS 110 82 84 87 91±13 88 93 86 80 87±5 0,050
METHYL
DICHLOFLUANID 111 109 101 103 106±5 98 105 92 91 97±6 5,0
E
ALDRINE 99 77 63 82 80±15 84 80 79 77 80±3 0,010
MALATHION 109 101 109 105 88±16 91 102 90 91 94±6 3,00
CHLOPYRIPHOS 110 84 74 82 76±10 86 94 82 81 86±5 0,50
FENTHION 90 75 67 72 107±4 72 90 82 73 79±8 0,02
PARATHION 110 104 111 104 80±11 88 89 81 79 84±5 0,50
PIRIMIPHOS 95 71 83 70 97±10 85 93 80 75 83±8 0,010
ETHYL
HEPTACHLOR 96 77 67 78 104±2 88 94 78 80 85±7 0,010
EPOXYDE
TOLYLFLUANIDE 109 99 84 95 104±2 90 98 86 89 91±5 ND
LMR
ND : Non Défini
/, / : Hors tolérances
21

Résultats de l’expérimentation (suite)
Teneur de charge
MATIERE ACTIVE
% de récupération, teneurs de charge en mg/Kg, moyennes et écarts types
0,020
(4)
0,020
(5)
0,020
(6)
0,020
(7)
Moyen
ne et
écart
type
0,20
(8)
0,20
(9)
0,20
(10)
0,20
(11)
Moyen
ne et
écart
type
CHLORFENVINPHOS 111 109 111 110 110±1 90 96 90 89 91±3 ND
CAPTAN 111 85 112 87 99±15 92 92 87 87 90±3 3,0
FOLPET 109 103 110 96 105±6 89 92 85 85 88±3 3,0
METHIDATHION 110 107 115 111 111±3 93 104 92 93 96±7 0,020
ENDOSULFAN-alpha 99 70 68 65 76±14 96 89 75 75 84±11 0,050
CHLORDANE 108 78 62 65 78±21 89 91 77 76 83±8 0,10
DIELDRINE 91 69 71 79 78±9 82 88 80 83 83±3 0,010
4-4’DDE 89 69 64 72 74±11 85 87 79 79 83±4 0,050
ENDRINE 93 82 62 91 82±14 77 86 80 83 82±3 0,010
ENDOSULFAN-beta 91 77 63 86 79±12 87 93 84 81 86±5 0,050
2-4’DDT 64 70 60 72 67±6 88 90 85 81 86±4 0,050
4-4’DDD 102 79 76 81 85±12 89 90 81 84 86±4 0,050
ETHION 99 81 71 85 84±12 86 88 83 82 85±3 0,10
ENDRINE ALDEHYDE 44 18 6 32 / 31 44 50 51 / ND
CARBOPHENOTHION 95 83 88 82 87±5 87 88 82 81 85±3 ND
LMR
ENDOSULFAN
SULFATE
102 108 69 85 91±15 89 104 94 95 96±6 0,050
4-4’DDT 98 80 63 81 81±12 89 89 79 84 85±4 0,050
CAPTAFOL / / / / / 117 142 123 137 / 0,020
PHOSMET 173 143 140 140 / 87 102 92 99 95±7 ND
IPRODIONE 182 154 210 160 / 95 103 92 99 97±5 5,0
BROMOPROPYLATE 109 91 72 93 91±15 86 87 82 82 84±3 1,0
PHOSALONE 105 104 111 101 105±4 92 97 87 93 92±4 1,0
AZINPHOS METHYL 185 157 160 161 / 85 104 91 101 95±9 0,50
PERMETHRINE 84 99 83 88 89±7 85 82 79 84 83±3 0,50
CYPERMETHRINE 96 117 88 81 96±16 97 76 87 97 89±10 0,50
FENVALERATE 95 119 100 95 102±11 78 94 75 77 81±9 1,0
DELTAMETHRINE 112 105 112 110 110±3 82 83 81 81 82±1 0,20
ND : Non Défini
/, / : Hors tolérances
22

2.5 Résultats de la validation de méthode sur divers substrats
% de récupération pour chaque extrait chargé
DEF 9- DEF 9- DEF 9-382/3 DEF 9-006/2
364/4 364/5
(laitue) (blé)
(poire) (poire)
Teneur de charge
0,20 0,20 LMR 0,20 LMR 0,50 LMR
MATIERE ACTIVE
DICHLORVOS / / 0,10 / 0,10 / 2,0
ETHOPROPHOS 107 91 ND 109 0,010 110 ND
Alpha-HCH 94 97 1,0 99 ND 93 0,020
HEXACHLORO BENZENE 94 69 1,0 83 0,050 / ND
DIMETHOATE 110 88 1,0 88 1,0 105 ND
QUINTOZENE 108 110 ND 109 0,050 90 ND
Delta-HCH 93 93 1,0 93 ND 79 0,020
Beta-HCH 93 101 1,0 100 ND 88 0,020
FONOFOS 85 97 ND 94 ND 81 ND
DIAZINON 92 105 0,50 100 0 ,020 87 ND
LINDANE (Gamma-HCH) 110 108 1,0 109 2,0 97 0,10
CHOLRPYRIPHOS 93 104 0,50 103 0,050 74 2,0
METHYL
HEPTACHLOR 83 94 0,010 95 0,010 80 0,010
VINCHLOZOLINE 86 97 1,0 95 5,0 80 0,050
PARATHION METHYL 96 104 0,20 96 0,20 89 0,050
ALACHLOR 90 100 ND 96 ND 83 ND
FENCHLORPHOS 92 100 0,010 99 0,010 85 ND
PIRIMIPHOS METHYL 83 94 0,050 95 0,050 84 5,0
DICHLOFLUANIDE 93 104 5,0 96 10,0 75 ND
ALDRINE 83 91 0,010 93 0,010 77 0,010
MALATHION 98 106 0,50 101 3,0 91 8,0
CHLOPYRIPHOS 87 96 0,50 96 0,050 79 0,20
FENTHION 85 88 1,0 75 0,020 77 ND
PARATHION 91 96 0,50 90 0,50 85 ND
PIRIMIPHOS ETHYL 86 96 0,010 96 0,010 83 ND
HEPTACHLOR EPOXYDE 83 95 0,010 94 0,010 79 0,010
TOLYLFLUANIDE 92 102 2,0 96 ND 76 ND
23

Résultats de l’expérimentation (suite) POIRE, LAITUE, ET BLE
% de récupération pour chaque extrait chargé
DEF 9- DEF 9- DEF 9-382/3 DEF 9-006/2
364/4 364/5
(laitue)
(blé)
(poire) (poire)
Teneur de charge 0,20 0,20 LMR 0,20 LMR 0,50 LMR
MATIERE ACTIVE
CHLORFENVINPHOS 104 110 0,050 104 ND 97 0,50
CAPTAN 93 102 3,0 95 0,10 77 ND
FOLPET 102 107 3,0 102 2,0 92 ND
METHIDATHION 109 108 0,30 106 0,020 107 0 ,020
ENDOSULFAN-alpha 87 100 1,0 71 1,0 84 0,10
CHLORDANE 102 87 0,010 83 0,10 93 0,020
DIELDRINE 76 86 0,010 90 0,010 78 0,010
4-4’DDE 83 93 0,050 94 ND 78 0,050
ENDRINE 86 80 0,010 101 0,010 84 0,010
ENDOSULFAN-beta 102 108 1,0 104 1,0 95 0,10
2-4’DDT 88 98 0,050 99 0,050 83 0,050
4-4’DDD 86 97 0,050 99 ND 80 0,050
ETHION 92 102 0,50 101 0,10 87 0,20
ENDRINE ALDEHYDE 63 79 ND 54 ND 60 ND
CARBOPHENOTHION 94 103 ND 102 ND 97 ND
ENDOSULFAN
99 113 1,0 109 1,0 92 0,10
SULFATE
4-4’DDT 87 98 0,050 98 ND 84 0,050
CAPTAFOL 146 101 0,020 105 0,020 128 0,050
PHOSMET 109 109 2,0 108 ND 74 ND
IPRODIONE 96 104 10,0 105 10,0 87 0,50
BROMOPROPYLATE 90 99 2,0 98 1,0 85 ND
PHOSALONE 94 107 2,0 104 1,0 / ND
AZINPHOS METHYL 97 109 0,50 101 ND 96 ND
PERMETHRINE 90 100 0,50 101 2,0 96 ND
CYPERMETHRINE 94 106 1,0 104 2,0 106 2,0
FENVALERATE 88 103 1,0 100 0,050 97 0,050
DELTAMETHRINE 99 107 0,10 105 0,50 97 1,0
Conclusion
L’ensemble des résultats décrits ci-dessus sont représentatifs de l’efficacité de
notre méthode. Celle-ci a été validée sur la tomate à des teneurs très faibles de
l’ordre de 20 ppb et vérifiée sur la laitue, la poire et le blé à des teneurs de l’ordre
de 200 à 500 ppb.
24

Compte tenu des nombreuses étapes de préparation cette méthode est délicate,
longue, et difficilement rentable et applicable à des analyses de routine ou de
contrôle. Cependant s’appuyant sur l’ensemble de ces résultats et sur les
dernières méthodes multirésidus développées il est possible d’entrevoir des
simplifications allant dans le sens d’une plus grande rapidité et rentabilité de la
méthode.
En effet des appareils analytiques utilisant la spectrométrie de masse de second
ordre, GC/MS/MS, permettent l’injection d’analytes de purification moyenne. De
même de nouvelles techniques de préparation plus rapide, plus simple et moins
consommatrices de solvants telles que l’extraction assistée par micro-ondes et
accélérée par solvant sont des sources d’innovations à développer.
L’ensemble de ces réflexions est révélateur sur la nécessité de considérer une
méthode multirésidus comme étant en permanence en évolution et en optimisation
et ceci afin de continuellement répondre aux exigences des méthodes de contrôle.
25