Catherine Serres (1), Michel Gohar (2), Didier ... - SympoScience

Évaluation du risque toxicologique des OGM
Commission du génie biomoléculaire
Effet de la toxine Cry 1Ab sur le mouvement
des spermatozoïdes humains
Catherine Serres (1), Michel Gohar (2), Didier Lereclus (2), Pierre Jouannet (1),
Marc Fellous (3)
(1) Laboratoire d’histologie-embryologie, biologie de la reproduction
Faculté de médecine Cochin-Port-Royal, EA 1752 Paris
(2) Unité génétique microbienne et environnement, INRA
La Minière, 78285 Guyancourt cedex
(3) INSERM U 361, équipe E 0021
Hôpital Cochin, pavillon Baudelocque, 123 boulevard de Port-Royal 75014 Paris
Introduction
Parmi les protéines insecticides produites par les OGM, il y a les toxines de Bacillus thuringiensis, des
protéines crystal (CRY) réparties en différentes familles (Cry 1,Cry 2, Cry 3.) et sous-familles
(Cry 1A, Cry 1B, Cry 1C) en fonction de leur degré d’identité (Crickmore et al., 1998). Ces protéines
exercent un effet toxique sur les larves d’insectes avec des DL50 (doses létales pour 50 % d’une
population donnée) généralement comprises entre 10 et 100 ng, selon les toxines et les espèces
d’insectes. Quand elles sont ingérées, ces toxines se fixent sur les membranes des cellules épithéliales
intestinales, par l’intermédiaire de récepteurs de type aminopeptidase ou de type cadhérine (Schnepf et
al., 1998 ; Gomez et al., 2001 ; Meng et al., 2001 ; Lee et al., 2000). Elles s'insèrent dans les
membranes et forment des pores, exerçant alors une activité de canal ionique peu sélectif, susceptible
de modifier la perméabilité membranaire des cellules (Alcantara et al., 2001). Ainsi, Cry 1C est
capable d’induire un efflux de potassium au niveau de la membrane plasmique de cellules d’insecte
Sf9 en culture (Guilhard et al., 2000).
Dans le but de savoir si ces toxines peuvent être nocives pour l'homme et en particulier pour la
fonction reproductrice, nous avons testé, in vitro, l'effet de la toxine Cry 1Ab, sur le spermatozoïde
humain. La toxine Cry 1Ab est la plus fréquemment trouvée dans les préparations de biopesticides à
base de B. thuringiensis, et c’est aussi la plus utilisée pour la construction de plantes transgéniques
résistantes aux insectes. Nous avons choisi de mesurer l'impact de cette toxine sur la mobilité du
spermatozoïde dans la mesure où cette fonction spermatique est sensible aux modifications ioniques
intracellulaires (Jouannet et Serres, 1995), du type de celles potentiellement produites par les toxines
Cry.
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Matériels et méthode
Nous avons utilisé la toxine Cry 1Ab à partir d’une solution stock pure à 99 % contenant 1 µg/µl de
toxine dans 20 mM Na 2 CO 3 + 2 mM EGTA, pH 10. Le contrôle utilisé était de la protoxine Cry 1Ab
pure à 98 %, contaminée à 0,7 % par de la toxine activée, stockée à la même concentration que la
toxine.
Les spermatozoïdes provenaient de trois donneurs différents (deux éjaculats par donneur). La sélection
des spermatozoïdes mobiles a été effectuée à travers un gradient de Percoll à deux couches (47,5 % et
95 %) centrifugé à 300 g durant 20 minutes. Le culot des spermatozoïdes mobiles a été lavé et
suspendu dans le milieu HTF + 1 % BSA à la concentration de 15.10 6 cellules/ml.
Le schéma expérimental a consisté à incuber, à température ambiante, les spermatozoïdes avec
différentes doses de toxine ou protoxine (10 ng, 50 ng, 100 ng, 500 ng et 1000 ng) dans un volume
final de 200 µl. Après des temps variables d’incubation (1 heure, 4 heures et 24 heures), la mobilité
des cellules était analysée à l’aide d’un appareil semi automatique de mesure du mouvement (IVOS
Hamilton Thorn Research). La trajectoire des spermatozoïdes ayant une allure pseudosinusoïdale, nous
avons mesuré la vitesse de progression linéaire (VSL, en µm/s), la vitesse du déplacement sinusoïdal
de la tête des spermatozoïdes (VCL, en µm/s), la linéarité des trajectoires (LIN = VSL/VCL) et la
largeur des trajectoires (ALH, en µm). Par ailleurs, nous avons calculé le pourcentage de cellules
progressives (VSL > 10µm/s). Les mesures étaient effectuées sur un minimum de cent cellules
progressives. Les valeurs moyennes obtenues dans les incubations avec toxine ont été comparées à
celles obtenues dans les incubations avec protoxine, et les résultats ont été exprimés en pourcentage
par rapport au contrôle protoxine. Nous avons considéré comme significatives les différences de plus
(effet stimulant) ou moins (effet inhibiteur) 10 % par rapport au contrôle.
Résultats et discussion
Nous avons réalisé six incubations indépendantes correspondant aux deux éjaculats de chacun des trois
spermes. Dans un premier temps, nous avons comparé, pour chacun des donneurs, les résultats obtenus
avec les spermatozoïdes provenant des deux éjaculats. Nous avons constaté l’existence d’une
variabilité intra-individuelle des effets de la toxine sur les paramètres du mouvement spermatique.
Ceci est illustré par la figure 1 qui montre, par exemple, qu’un effet stimulant de la toxine (après
4 heures d’incubation aux doses 10 – 100 ng) constaté sur les spermatozoïdes provenant de l’éjaculat 1
n’est pas reproduit avec le deuxième éjaculat.
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Éjaculat n° 1 Éjaculat n° 2
Dose de Cry 1Ab (ng)
Les spermatozoïdes humains provenant de deux éjaculats d’un même donneur ont été incubés, pendant 1heure (♦), 4 heures
(■) et 24 heures (▲) en présence de différentes doses (10 à 1000 ng) de toxine ou protoxine comme contrôle. Différents
paramètres du mouvement (VSL et VCL, en µm/s ; ALH, en µm ; LIN = VSL/VCL) et le pourcentage de cellules mobiles
ont été mesurés. Les valeurs des paramètres dans les incubations avec toxine sont exprimées en pourcentage de la valeur de
ces mêmes paramètres dans les incubations contrôles.
Figure 1. Effet de la toxine Cry 1Ab sur le mouvement des spermatozoïdes humains : variabilité intraindividuelle.
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Dose de Cry 1Ab (ng)
Les spermatozoïdes humains provenant de trois donneurs différents ont été incubés, pendant 1heure (♦), 4 heures (■) et 24
heures (▲) en présence de différentes doses (10 à 1000 ng) de toxine ou protoxine comme contrôle. Différents paramètres
du mouvement (VSL et VCL, en µm/s ; ALH, en µm ; LIN = VSL/VCL ) et le pourcentage de cellules mobiles ont été
mesurés. Les valeurs des paramètres dans les incubations avec toxine sont exprimées en pourcentage de la valeur de ces
mêmes paramètres dans les incubations contrôles.
Figure 2. Effet de la toxine Cry 1Ab sur le mouvement des spermatozoïdes humains : variabilité inter
individuelle.
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Pour atténuer la variabilité individuelle, nous avons fait la moyenne des mesures des deux éjaculats
d’un même sperme, puis comparé ensuite ces valeurs moyennes entre trois spermes différents
(cf. figure 2). Le plus souvent, quels que soient la dose et le temps d’incubation, les valeurs des
paramètres spermatiques restent dans une fourchette de plus ou moins 10 % des valeurs contrôles,
traduisant le fait que, globalement, la toxine n’a pas d’effet significatif sur le mouvement des
spermatozoïdes.
Dans les quelques conditions expérimentales où il existe un effet significatif, celui-ci n’est pas
reproduit dans les trois spermes : ainsi, le paramètre ALH est diminué dans les incubations du
sperme 1 après 4 et 24 heures d’incubation, mais pas dans les spermes 2 et 3. Il arrive même, mais
rarement, que les effets observés soient inverses selon les spermes : la toxine exerce sur le paramètre
VSL un effet plutôt inhibiteur pour le sperme 1 et plutôt stimulant pour le sperme 2. Ainsi il existerait
aussi une variabilité interindividuelle des effets de la toxine sur les spermatozoïdes humains.
L’hétérogénéité des spermatozoïdes éjaculés est bien connue dans l’espèce humaine et repose en partie
sur un état de maturation différent des gamètes au sein d’un même éjaculat. Sachant cela, et à moins
d’un effet drastique de la toxine Cry 1Ab sur les spermatozoïdes – ce qui n’est pas observé ici –, des
effets plus subtiles, observables en fonction de l’état de maturation cellulaire, sont difficiles à mettre
en évidence. À cela s’ajoute aussi le fait qu’il peut exister une susceptibilité à la toxine différente selon
les individus. Ces considérations expliquent sans doute la variabilité des quelques effets significatifs de
la toxine constatés dans cette étude.
Conclusions
Les modifications des paramètres du mouvement induites par la toxine Cry 1Ab sont peu significatives
(< 10 % de la valeur contrôle), quels que soient les doses testées de toxine et le temps d’incubation.
Les quelques effets significatifs de la toxine sont rares et non reproductibles d’un éjaculat à l’autre
d’un même sperme et entre des spermes de différents donneurs, traduisant une variabilité intra et
interspermatique. Nous en concluons que, dans nos conditions expérimentales, il n’y a pas d’effet in
vitro significatif de la toxine Cry 1Ab sur la mobilité des spermatozoïdes humains.
Références
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Paris, les 27 et 28 septembre 2002 126

Évaluation du risque toxicologique des OGM
Commission du génie biomoléculaire
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Paris, les 27 et 28 septembre 2002 127