104001 OXOID LEAFLET V2:91693_OXOID LEAFLET

eingetaucht wird. Verschließen Sie nach Gebrauch die Tropffläschen sorgfältig, um die Reagenzien vor
Kontamination und Austrocknung zu schützen. Legen Sie die Testpackung nach Gebrauch zurück in den
Kühlschrank oder Kühlraum.
Probenmaterial
Für den Test können Kolonien von nachfolgend aufgeführten Nährböden eingesetzt werden.
Es sollten frische Kulturen nach einer Bebrütung von 18-24 Stunden verwendet werden, jedoch können auch 24-
48 Stunden alte Kolonien getestet werden, sofern dies zum Erhalt ausreichender Mengen an Koloniematerial
notwendig sein sollte. Die in dieser Packungsbeilage aufgeführten Daten zur Leistungscharakteristik wurden mit
nachstehenden Medien und im Rahmen der FDA-Zulassung des Tests erhoben.
Columbia-Agar mit Schafblut
Mueller-Hinton-Agar
Caseinpepton-Sojamehlpepton-(CASO)-Agar mit Schafblut
Interne Daten zeigen, daß der Test ebenso mit S. aureus Kolonien von Columbia-Agar mit Pferdeblut,
Caseinpepton-Sojamehlpepton-(CASO)-Agar mit Pferdeblut, DST und Isosensitest-Agar durchgeführt werden
kann. Diese Medien sind in Europa, nicht aber den USA gebräuchlich und somit wurden sie nicht in den
Untersuchungen zu den in Abschnitt „Leistungsmerkmale“ aufgeführten Daten eingesetzt.
Besondere Hinweise:
Der PBP2 / -Latex-Test sollte nur mit Staphylokokken-Spezies durchgeführt werden. Ein Koagulase- oder ähnlicher
Test muss durchgeführt werden, um die Identität des Isolates als S. aureus oder andere Staphylokokken-Spezies
festzustellen.
Herstellen des Inokulums:
Im Falle von S. aureus kann der Test direkt mit einzelnen Kolonien einer Primärplatte oder gegebenenfalls
Subkultur durchgeführt werden, sofern ausreichendes Wachstum vorliegt. Eine Beeinflußung des Tests durch
Wachstum von Begleitflora auf diesen Platten konnte bisher nicht beobachtet werden.
Bei koagulasenegativen Staphylokokken muß vor Durchführung des Tests eine ausreichende Produktion des
PBP2 / induziert werden.
1. Herstellen einer Suspension mit McFarland-Standard von 1 und Ausstrich auf Caseinpepton-Sojamehlpepton-
(CASO)-Agar mit Schafblut, Columbia-Agar mit Schafblut oder Mueller-Hinton-Agar. Alternativ können die
Platten auch mit mehreren Einzelkolonien in vier Quadranten ausgestrichen werden.
2. Auflegen eines Oxacillin-Testblättchens (1µg) an einer Position, an der rasenförmiges Bakterienwachstum
erwartet werden kann.
3. Inkubation bei 37°C für mindestens 24 aber nicht mehr als 48 Stunden.
Achtung: um falsch-negative Ergebnisse zu vermeiden, kann der Test erst durchgeführt werden, wenn
ausreichend Koloniematerial vorhanden ist. Für den Test immer Kolonien verwenden, die nahe um das
Testblättchen gewachsen sind.
DURCHFÜHRUNG
Extraktionsverfahren
1. Jeweils 4 Tropfen Extraktionsreagenz 1 in ein Reaktionsgefäß geben.
2. Für den Test sollten ungefähr 1,5 x 10 9 (3-5µl) Zellen verwendet werden. Hierfür mit einer sterilen, 5µl Impföse
so viel verdächtiges Koloniematerial vom Nährboden abnehmen, daß der Ring („Loop“) der Impföse gefüllt ist.
Alternativ eine sterile 1µl Impföse verwenden, mit der 3 Portionen verdächtiges Koloniematerial (der Ring der
Impföse sollte jeweils gefüllt sein) abgenommen werden. Koloniematerial im Extraktionsreagenz homogen
suspendieren.
3. Reaktionsgefäß in einem kochenden Wasserbad oder Heizblock (ÜBER 95°C) für 3 Minuten inkubieren.
4. Reaktionsgefäß aus dem Wasserbad oder Heizblock nehmen und auf Raumtemperatur abkühlen.
5. 1 Tropfen Extraktionsreagenz 2 zufügen und gut mischen.
6. Ansatz für 5 Minuten bei 1.500 g zentri-fugieren. Dies entspricht 3.000 rpm bei einem Rotor-Radius von 15cm
oder 4.500 rpm bei einem Radius des Rotors von 4,5cm). Den Überstand für den Test einsetzen.
Agglutinationsverfahren
1. Je zu untersuchender Probe werden 2 Felder einer Reaktionskarte benötigt. Ein Feld ist zur Durchführung des
Tests, das zweite für die Durchführung der Negativ-Kontrolle erforderlich. Felder bitte entsprechend beschriften
(z.B. TEST und KONTROLLE).
2. Je 50µl Überstand aus dem Reaktionsgefäß entnehmen und auf je ein Feld der Reaktionskarte auftragen. 1
Tropfen Latex-Testreagenz (DR901) auf das mit TEST beschriftete Feld auftropfen. Überstand und Latex-
Testreagenz mit einem Rührstäbchen gut mischen.
3. 1 Tropfen Latex-Kontrollreagenz (DR902) auf das mit KONTROLLE beschriftete Feld auftropfen. Überstand und
Latex-Kontrollreagenz mit einem neuen Rührstäbchen gut mischen.
4. Die Reaktionskarte vorsichtig schwenken und auf Agglutination innerhalb von 3 Minuten prüfen. Dazu keine
Vergrößerungshilfe benutzen.
5. Reaktionskarte in einem geeigneten Desinfektionsmittel entsorgen.
AUSWERTUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Agglutination des Latex-Testreagenz aber nicht des PBP2 / -Positiv
Kontrollreagenz innerhalb 3 Minuten MRSA oder MR-KNS
Keine Agglutination in beiden Reagenzien PBP2 / -Negativ
Innerhalb 3 Minuten MSSA oder MS-KNS
Agglutination mit dem Kontrollreagenz innerhalb 3 Minuten Nicht auswertbar
Anmerkung: Negative Reaktionen können gelegentlich leicht feinkörnig oder fädig erscheinen. In diesen Fällen
sollte das Aufklaren des Hintergrundes als Entscheidungskriterium herangezogen werden. Ein opaker Hintergrund
weist auf eine negative Reaktion, ein Aufklaren des Hintergrundes auf eine positive Reaktion hin.
TESTBESCHRÄNKUNGEN
1. Nicht auswertbare Ergebnisse sollten mit einem frischen Extrakt erneut getestet werden. Tritt erneut eine nicht
auswertbare Reaktion auf, muss die Methicillin-Resistenz mit einer anderen Methode bestimmt werden.
2. Eine nicht ausreichende Menge an Koloniematerial kann zu einem falsch-negativen Ergebnis führen. In diesem
Fall sollte der Test mit ausreichend Koloniematerial wiederholt werden.
3. Richtig-positive Ergebnisse zeigen im allgemeinen einen starken Reaktionsausfall. Falsch-positive Ergebnisse
wurden bislang selten beobachtet und wiesen generell eher schwache Reaktionen auf. Solche
Reaktionsausfälle können durch einen erneuten Test einer frischen Kultur verifiziert werden.
4. S. aureus mit einer Überproduktion an PBP’s (MODSA) und Borderline-resistente Stämme von S. aureus
(BORSA) besitzen kein PBP2 / und reagieren nicht mit diesem Test.
5. Manche Stämme weisen eine low-level Methicillin-Resistenz bzw. geringe Mengen an PBP2 / auf und können
falsch-negative Ergebnisse zeigen.
6. Bedingt durch die Einschränkungen der Spezifität und Sensitivität der CLSI- Methode zur
Empfindlichkeitsprüfung koagulasenegativer Staphylokokken 9 , insbesondere für Stämme die nicht der Spezies
S. epidermidis angehören, können die Ergebnisse des PBP2 / -Latex-Tests von denen der Standard-
Empfindlichkeitsprüfung abweichen. Stämme mit einer MHK ≥ 0.5µg/ml sollten unabhängig vom PBP2 / -
Ergebnis als Methicillin-resistent angesehen werden.
LEISTUNGSMERKMALE
1. Der PBP2 / -Latex-Test wurde in 4 unterschiedlichen Laboratorien mit frischen klinischen Isolaten von S. aureus
evaluiert. 201 Isolate wurden mit der NCCLS-Methode und dem Oxoid PBP2 / -Latex-Test von 3
unterschiedlichen Medien getestet. Eine schwach falsch-positive Latexagglutination (negativ bei erneuter
Testung) wurde mit Caseinpepton-Sojamehlpepton-(CASO)-Agar mit Schafblut beobachtet. Alle positiven
Reaktion waren deutlich, bis auf 3 schwache (aber positive) Reaktionen von Mueller-Hinton-Agar.
Die Sensitivität des Latex-Tests bezüglich der Detektion von MRSA betrug 100% auf allen getesteten Medien.
Die Sensitivität betrug 99% für Caseinpepton-Sojamehlpepton-(CASO)-Agar mit Schafblut und 100% für die
übrigen Medien.
Ergebnisse der Untersuchung von 201 klinischen Isolaten von S. aureus in 4 Laboratorien:
MRSA BORSA A MSSA
Anzahl getesteter Stämme 68 3 130
Wachstum auf Oxacillin Salt Agar (NCCLS) 68 0 0
MHK ≥ 4µg/ml (NCCLS) 68 0 0
Positiver Latex Test von CASO Agar mit Blut 68 0 1 (1) B
Positiver Latex Test von Columbia Agar mit Blut 68 0 0
Positiver Latex Test von Mueller-Hinton-Agar 68 (3) B 0 0
A MHK betrug 2µg/ml und mecA war negativ
B Anzahl der schwachen Reaktionen in Klammern
2. Untersuchung von S. aureus Stämmen in 3 geographisch unterschiedlichen Regionen:
Drei Laboratorien untersuchten zuvor gesammelte Stämme von S. aureus und verglichen die Ergebnisse des
PBP2 / -Latex-Test mit den NCCLS-Methoden zur Bestimmung von MRSA. Insgesamt wurden 724 Stämme von
Caseinpepton-Sojamehlpepton-(CASO)-Agar mit Schafblut getestet. Die Sensitivität und Spezifität des Oxoid
PBP2 / -Latex-Test betrug 98,5% und 100%. Die Sensitivitäten der Agar-Screen und MHK-Methode betrugen
98,7% und 99,2% während die Spezifitäten mit 90,0% und 88,7% ermittelt wurden.
Zusätzlich wurden 2 MODSA-Stämme untersucht. Beide erbrachten ein negatives Ergebnis mit dem Latex-Test.
3. Untersuchung von koagulasenegativen Staphylokokken:
Zwei Laboratorien testeten koagulasenegative Staphylokokken auf PBP2 / nach Induktion mit Oxacillin-
Testblättchen. Ein Labor testete 115 Methicillin-resistente und 45 Methicillin-sensible Stämme inklusive 58
frischer klinischer Isolate. Die Sensitivität betrug 96,5% von Caseinpepton-Sojamehlpepton-(CASO)-Agar mit
Schafblut und 95,6% von Mueller-Hinton-Agar. Die Spezifität betrug 100% von Caseinpepton-Sojamehlpepton-
(CASO)-Agar mit Schafblut und 98% von Mueller-Hinton-Agar. Ein ausreichendes Inokulum war schwieriger
von Mueller-Hinton-Agar zu erhalten. Das zweite Labor testete 212 Methicillin-resistente und 203 Methicillin-
sensible Stämme mit einer Sensitivität von 99,5% und einer Spezifität von 99,5% von Columbia-Agar mit
Schafblut.
4. Reproduzierbarkeit:
10 verschiedene, gut charakterisierte S. aureus Stämme (3 MRSA, 3 MSSA, 3 BORSA und 1 MODSA) wurden
an 3 Laboratorien in verschiedenen Regionen verschickt. Hierbei erhielt jedes Labor jeden Stamm 5 Mal als
codiertes, anonymisiertes Isolat. Alle 150 Ergebnisse erbrachten das erwartete Resultat für 100%
Reproduzierbarkeit. Die 3 mecA-positiven Stämme ergaben bei jedem Test ein positives Ergebnis (45/45
Tests). Die 3 MSSA sowie die 3 BORSA ergaben bei jedem Test ein negatives Ergebnis (90/90 Tests). Der
MODSA Stamm mit einer MHK von 16µg/ml Oxacillin ergab jedesmal das erwartete negative Ergebnis mit dem
Oxoid Latex Test (15/15 Tests).
FR
TEST LATEX (PLP2 / ) Test au latex pour la détection des Protéines Liant la
Pénicilline (PLP2 / )
DR0900
Ce kit détecte les PLP2 / (ou PBP2a) 7 sur les isolats de Staphylococcus pour l’identification des Staphylococcus
aureus résistants à la pénicilline (SARM) et pour les staphylocoques coagulase négative méticilline résistant.
PRINCIPE DU TEST
Les Staphylocoques sont une cause majeure d’infections nosocomiales et communautaires dans le monde 2 . Dans
un grand nombre d’institutions, environ 25% à 50% des souches de S. aureus et 75% des staphylocoques
coagulase négative (CoNS) sont résistants à la méticilline 12 . Les SARM sont à considérer particulièrement dans la
mesure où certaines souches épidémiques disséminent facilement et colonisent les patients. Le traitement de
choix des souches sensibles est une pénicilline résistant aux pénicillinases, car les ‚-lactamines diffusent
facilement dans le corps humain, présentent peu d’effets secondaires et ne sélectionnent pas de souches
vancomycine résistantes. Une identification précise de la résistance à la méticilline est donc nécessaire.
Les souches de S. aureus de sensibilité réduite aux pénicillines sont classées comme suit:
ii(i) S. aureus méticilline résistant (SARM), produisant une PLP2 / d’affinité réduite pour les pénicillines et codée
par le gène MecA 3,6 ,
i(ii) S. aureus résistant «border-line» à la méticilline (BORSA), résistance généralement considérée comme étant
du à une hyperproduction de ‚-lactamase de classe A 10 , et
(iii) des souches porteuses de PLPs modifiées avec une capacité de liaison aux pénicilllines modifiée ou une
hyperproduction de PLPs (MODSA) 1,2 . Les MODSA ont rarement été isolés et leur réponse clinique aux ‚-
lactamines n’est pas encore bien connue. En clinique, à de rares exceptions près, la présence de PLP2 / est
responsable de la résistance à la méticillline pour le traitement des infections à S. aureus et CoNS 2,6 .
Le phénotype de résistance à la méticilline peut être hétérogène, rendant le diagnostic difficile par les méthodes
conventionnelles d’antibiogramme. La précision de ces méthodes est altérée par la taille de l’inoculum, le temps
et la température d’incubation, le milieu, le pH, la concentration en sel et d’autres facteurs 8,9 . De plus, ces
méthodes de culture nécessitent 24 heures d’incubation pour des résultats fiables. Les CoNS produisent souvent
des quantités moindres de PLP2 / et nécessitent une induction préalable par exposition à une pénicilline, de façon
à produire une quantité suffisante de PLP2 / pour être détectée 2,3,12 .
La mise en évidence du gène MecA est considérée comme le gold standard dans la détermination de la
résistance à la méticilline, mais cette méthode nécessité du temps et reste onéreuse 1,6 . Le latex PLP2 / a
l’avantage d’être une méthode directe et rapide de détection de la protéine PLP2 / avec un temps de manipulation
réduit. Cette méthode peut parfois être plus précise que la détection du gène MecA, car il n’y a pas de risque
d’avoir des faux positifs avec les souches possédant le gène MecA mais incapables de produire la protéine. De
plus, le test ne détecte pas les souches qui sont hyperproductrices de ‚-lactamases ou de PLPs.
Le test OXOID PLP2 / a été évalué dans le monde entier démontrant une excellente sensibilité et spécificité 4,5,11 .
Les particules de latex sensibilisées avec un anticorps monoclonal contre les PLP2 / vont réagir spécifiquement
avec les staphylocoques résistant à la méticillline et provoquer une agglutination visible à l’œil nu.
COMPOSITION DU COFFRET
DR0901 Latex sensibilisé par un anticorps monoclonal dirigé contre les PLP2 / .
DR0902 Latex de contrôle sensibilisé par un anticorps monoclonal de la même sous-classe d’Ig Gne montrant
aucune réactivité avec les protéines de S. aureus.
DR0903 Réactif d’extraction 1
DR0904 Réactif d’extraction 2
Cartes test
Sticks
Notice
Matériel nécessaire mais non fourni
● Micropipettes et embouts (50µl)
● Oeses (5µl ou 1µl)
● Bain-marie bouillant ou bloc chauffant
● Centrifugeuse (1500g)
● Microtubes à centrifuger
● Désinfectant de laboratoire
PRÉCAUTIONS
Pour diagnostic in vitro uniquement.
Le temps de chauffage est de 3 minutes. Un chauffage au-delà de 5 minutes peut conduire à une baisse de
sensibilité. Un chauffage inférieur à 1 minute peut conduire à des agglutinations non spécifiques.
Quand on prélève le surnageant après centrifugation pour effectuer le test, éviter de prélever des particules au
fond du tube. Ceci pourrait conduire à des agglutinations non spécifiques.
Bien mélanger les réactifs au latex de façon à obtenir une suspension homogène. Les réactifs contiennent
0.095% d’azide de sodium comme conservateur. L’azide de sodium est toxique et peut réagir avec la tuyauterie
en plomb ou en cuivre pour former des azotures métalliques hautement explosifs. Pour prévenir une accumulation
dans la tuyauterie, éliminer avec un grand volume d'eau.
Les échantillons peuvent contenir des germes pathogènes : manipuler avec précaution. La procédure d’extraction
peut ne pas tuer les germes, donc l’extrait doit être manipulé avec les mêmes précautions.
Les réactifs d’extraction 1 et 2 contiennent un composant légèrement irritant et un acide faible. Eviter le contact
direct en portant des vêtements appropriés. En cas de contact avec la peau, les muqueuses ou les yeux, laver
immédiatement avec une grande quantité d’eau.
CONSERVATION
Le coffret doit être conservé à 2-8°C. Dans ces conditions, les réactifs sont valables jusqu’à la date d’expiration
indiquée sur le coffret.
PROCÉDURES DE CONTRÔLE
Pour chaque nouveau lot de réactif et ensuite une fois par semaine, les procédures de contrôle suivantes doivent
être établies:
1. Contrôle positif: utiliser une souche SARM connue, telle que ATCC ® 43300 (Culti-Loops ® OXOID CL9022).
Suivre la méthode mentionnée dans la section «Mode d’emploi». S’assurer que l’agglutination apparaît en 3
minutes.
2. Contrôle négatif: utiliser une souche de Staphylococcus aureus sensible à la méticilline (SASM), telle que
ATCC ® 25923 ou ATCC ® 29213 (Culti-Loops ® OXOID CL7010 ou CL7011). Suivre la méthode mentionnée dans
la section «Mode d’emploi». S’assurer qu’aucune agglutination n’apparaît en 3 minutes.
3. Ne pas utiliser le test si les réactions de contrôle sont incorrectes.
4. Ne pas utiliser les coffrets après la date de péremption.
NOTE IMPORTANTE
Ne pas contaminer le réactif en touchant l’échantillon sur la carte de réaction avec l’embout du compte-gouttes.
S’assurer que les bouchons sont bien vissés après utilisation pour prévenir toute contamination ou dessèchement
des réactifs. Après utilisation, replacer le coffret au réfrigérateur en position verticale.
Recueil et préparation des échantillons
Le test doit être réalisé à partir de colonies isolées sur l’un des milieux gélosés suivants :
Gélose Columbia +5% de sang de mouton, Mueller-Hinton, Tryptone soja +5% de sang de mouton.
Il est recommandé d’utiliser des cultures fraîches (18-24 heures). Néanmoins des cultures de 24h à 48h peuvent
être testées si nécessaire.
Les performances indiquées dans cette notice (faisant partie de la validation FDA) ont été générées à partir de
ces milieux.
D’autres données montrent que le test est également valide avec des colonies de S. aureus cultivés sur Tryptone
soja et Columbia +5% de sang de cheval, gélose Iso-Sensitest et DSTA. Ces milieux sont couramment utilisés en
Europe mais pas en Amérique du Nord où ont été générées les études relatives aux performances.
Le test PLP2 / doit être utilisé uniquement sur les staphylocoques (cocci gram+). Une coagulase ou un test
équivalent doit être fait pour déterminer s’il s’agit d’un S. aureus ou d’une autre espèce de staphylocoque.
Préparation de l’inoculum
Pour S. aureus, le test peut être fait à partir de colonies isolées sur la première boîte d’isolation si la pousse est
suffisante ou à partir d’une subculture. Les autres micro-organismes présents sur la boîte n’ont pas montré
d’interférences avec le test.
Pour les staphylocoques coagulase négative, une induction est nécessaire pour avoir une production suffisante de
PLP2 / .
1. Préparer un bouillon du germe à tester équivalent à 1 McFarland et ensemencer en nappe sur une gélose
Tryptone soja au sang, Columbia au sang ou Mueller-Hinton. Une autre possibilité est d’ensemencer la boîte
en 4 quadrants.
2. Placer un disque d’oxacilline (1µg/ml) sur la boîte (à l’endroit où il y a le plus de germes pour la méthode des
quadrants).
3. Incuber à 37°C pendant au moins 24h mais pas plus de 48h.
Attention: Pour éviter d’avoir de faux négatifs, ne pas faire le test si l’inoculum est trop faible.
MODE D’EMPLOI
Extraction des PLP2 /
1. Ajouter 4 gouttes de réactif d’extraction 1 dans un microtube.
2. Environ 1.5x10 9 (3-5µl) cellules doivent être testées. Il est possible d’utiliser une oese stérile de 5µl et d’en
remplir le diamètre intérieur avec les colonies. Il est aussi possible d’utiliser une oese de 1µl et de prélever
plusieurs colonies de façon à remplir l’oese et à recouvrir de 1mm le diamètre extérieur de l’oese. Mettre en
suspension ces colonies dans le microtube. Vortexer si des agrégats sont visibles. La suspension doit être très
trouble.
3. Placer le tube dans un bain-marie bouillant ou un bloc chauffant (à 100°C) pendant 3 minutes.
4. Sortir le tube et le laisser revenir à température ambiante.
5. Ajouter une goutte de réactif d’extraction 2 dans le tube et bien mélanger.
6. Centrifuger à 1500g pendant 5 minutes (c’est à dire 3000rpm avec un rayon de rotation de 15 cm ou 4500rpm
avec un rayon de rotation de 4.5cm). Utiliser le surnageant pour le test.
Procédure d’agglutination
1. Pour chaque surnageant à tester, identifier un cercle de la carte de réaction pour le latex test et un autre cercle
pour le latex de contrôle.
2. Bien mélanger les latex en retournant les flacons plusieurs fois et déposer une goutte de latex test ou de latex
contrôle dans chaque cercle.
3. Déposer 50µl de surnageant sur le cercle test et sur le cercle contrôle en évitant de toucher le culot. Bien
mélanger le latex et le surnageant dans chaque cercle avec un stick.
4. Imprimer un mouvement de rotation à la carte pendant 3 minutes et observer l’agglutination dans des
conditions de lumière normale.
5. Eliminer la carte de réaction dans un désinfectant.
LECTURE ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
Agglutination avec le latex test, mais pas PLP2 / (+) (SARM)
avec le latex de contrôle en 3 minutes
Pas d’agglutination avec le latex test et contrôle en 3 minutes PLP2 / (-) (SASM)
Agglutination avec le latex de contrôle en 3 minutes Non interprétable
Intensité de l’agglutination
Négative (-) = Suspension homogène sans agrégat visible
Positif faible (+) = Petits agrégats visibles sur un fond trouble
Positif fort (++) = Petits et gros agrégats sur un fond trouble ou gros agrégats sur un fond clair.
NB : Occasionnellement des réactions négatives peuvent avoir une apparence granuleuse très fine ou certaines
réactions peuvent être filamenteuses. Dans ce cas, le résultat doit être interprété en fonction du degré
d’éclaircissement du fond. Un fond opaque indique que la réaction est négative, tandis qu’un éclaircissement du
fond indique que la réaction est positive.
LIMITES
1. En cas de résultat ininterprétable, la souche doit être re-testée sur un nouvel extrait frais. Si le résultat est
toujours ininterprétable, déterminer la résistance à la méticilline par une autre technique.
2. Des faux négatifs peuvent être observés si une quantité insuffisante de culture est testée. Dans ce cas, le test
doit être répété avec suffisamment de germes.
3. Les résultats vrais positifs produisent généralement des réactions fortes.
Les réactions faussement positives sont rares, et sont généralement de faible intensité. Ces résultats peuvent
être vérifiés avec des cultures fraîches.
4. Les S. aureus de type MODSA et BORSA ne possèdent pas de PLP2 / et ne doivent donc pas réagir avec ce
test.
5. Certaines souches peuvent avoir un bas niveau de résistance à la méticilline, ou dans de rares cas produire
des quantités de PLP2 / en faible quantité et donner des résultats faussement négatifs.
6. A cause des limitations de sensibilité et spécificité des tests d’antibiogramme CLSI pour les staphylocoques
coagulase négative 9 , spécialement pour les souches autres que S. epidermidis, les résultats du test PLP2 /
peuvent ne pas être en accord avec les résultats de l’antibiogramme standard. Les souches avec des CMI
≥0.5µl/ml doivent être considérées comme résistantes à la méticillline quels que soient les résultats du test
PLP2 / .
PERFORMANCES
1. Le test d’agglutination au latex PLP2 / d’OXOID a été évalué dans 4 laboratoires situés dans des zones
géographiques différentes avec des souches cliniques fraîches de S. aureus. 201 échantillons ont été testés
avec les techniques d’antibiogramme NCCLS et avec le test OXOID PLP2 / à partir de 3 types de milieux. Une
réaction faible faussement positive avec le test latex OXOID PLP2 / (retesté négatif) a été trouvé sur Tryptone
soja au sang. Toutes les réactions positives ont été fortes excepté 3 faibles réactions (mais positives) sur milieu
Mueller-Hinton.
La sensibilité du test latex OXOID PLP2 / pour détecter les SARM sur chaque milieu est de 100%. La spécificité
est de 99% sur Tryptone soja au sang et 100% sur les autres milieux.
Résultats des 201 souches cliniques fraîches de S. aureus des 4 laboratoires
SARM BORSA A SASM
Nombre testé 68 3 130
Pousse sur milieu salé à l’oxacilline (NCCLS) 68 0 0
CMI ≥ 4µg/ml (NCCLS) 68 0 0
Latex positif sur milieu Tryptone soja au sang 68 0 1 (1) B
Latex positif sur Columbia au sang 68 0 0
Latex positif sur Mueller-Hinton 68 (3) B 0 0
A Les CMI sont à 2µg/ml et le gène MecA est négatif
B Nombre de réactions faibles entre parenthèses
2. Tests sur des souches de S. aureus de 3 zones géographiques distinctes
3 laboratoires ont examinés chacun un panel de souches de S. aureus collectées et caractérisées
précédemment, et comparés les résultats du PLP2 / avec la méthode du NCCLS pour la détermination de la
résistance à la méticilline.
Un total de 724 souches ont été testées à partir de Tryptone soja au sang. La sensibilité du test OXOID PLP2 /
est de 98.5% et la spécificité de 100%. Les sensibilités des 2 méthodes de référence NCCLS sont de 98.7% et
99.2% et les spécificités de 90% et 88.7%.
2 souches de MODSA ont été testées séparément: Les 2 souches ont donné des résultats négatifs avec le
latex OXOID PLP2 / .
3. Test sur les staphylocoques coagulase négative
2 laboratoires ont testé les staphylocoques coagulase négative avec le test OXOID PLP2 / après induction avec
un disque d’oxacilline. Un laboratoire a testé 115 souches résistant à la méticilline et 45 souches sensibles à la
méticilline, en incluant 58 souches issues de patients.
La sensibilité est de 96.5% avec le milieu Tryptone soja au sang et 95.6% avec le milieu Mueller-Hinton. La
spécificité est de 100% à partir du Tryptone soja au sang et 98% avec le Mueller-Hinton. Obtenir un bon
inoculum est plus difficile avec une gélose Mueller-Hinton. Le second laboratoire a testé 212 souches résistant
à la méticilline et 203 souches sensibles à la méticilline avec une sensibilité de 99.5% et une spécificité de
99.5% en utilisant une gélose Columbia pour la culture.
4. Reproductibilité
10 souches différentes de S. aureus bien caractérisées (3 SARM, 3 SASM, 3 BORSA, et 1 MODSA) ont été
envoyées à 3 laboratoires situés dans 3 zones géographiques différentes. Chaque souche codée a été testée
en aveugle 5 fois. L’ensemble des 150 résultats obtenus correspondaient à ceux attendus avec une
reproductibilité de 100%. Les 3 souches MecA positive ont donné un résultat positif à chaque fois (45/45 tests).
Les 3 souches SASM et les 3 souches BORSA ont donné un résultat négatif à chaque fois (90/90 tests). La
souche MODSA qui avait une CMI de 16µg/ml à l’oxacilline, a donné un résultat négatif avec le latex OXOID
PLP2 / comme attendu (15/15 tests).
IT
PENICILLIN-BINDING PROTEIN (PBP2 / ) LATEX AGGLUTINATION TEST
DR0900
APPLICAZIONI
Il kit consente di evidenziare la presenza della proteina penicillin binding protein PBP2 / (nota anche come
PBP2a) 7 , in Staphylococcus spp., fornendo un criterio per l'identificazione sia di Staphylococcus aureus resistente
alla meticillina (MRSA, Methicillin Resistant Staphylococcus aureus), sia degli stafilococchi coagulasi negativi
resistenti alla meticillina.
PRINCIPIO DEL TEST
Gli stafilococchi sono tra le principali cause di infezioni ospedaliere e di comunità in tutto il mondo 2 . In molti istituti
una percentuale variabile tra il 25% ed il 50% dei ceppi di S. aureus e una percentuale di circa il 75% dei ceppi di
stafilococchi coagulasi negativi risulta resistente alla meticillina 12 . Un fattore particolarmente preoccupante è la
facilità con cui alcuni ceppi MRSA si diffondono e colonizzano i pazienti debilitati. Per il trattamento dei ceppi
sensibili alla meticillina è preferibile usare le penicilline resistenti alla penicillinasi (PRP), perché sono assorbite
più facilmente nei fluidi e tessuti corporei, causano minori complicanze terapeutiche ed evitano di selezionare
ceppi resistenti alla vancomicina. E’ quindi evidente l'importanza della corretta identificazione dei ceppi resistenti
alla meticillina.
I ceppi di S. aureus con ridotta sensibilità alle PRP sono suddivisi come segue:
ii(i) S. aureus meticillino resistente (MRSA), che produce PBP2 / a bassa affinità, codificata dal gene mecA 3,6 ;
i(ii) borderline methicillin-resistant S. aureus (BORSA), la cui resistenza è generalmente attribuita alla
iperproduzione di beta-lattamasi di tipo A 10 ; e
(iii) ceppi con PBP modificata in seguito ad alterate capacità di legare la penicillina o alla iperproduzione di PBP
(MODSA) 1,2 .
I ceppi MODSA sono stati isolati solo raramente e la loro risposta clinica al trattamento con beta-lattamici non
è stata ancora ben studiata. Da ciò si evince che, per le applicazioni cliniche, a parte alcune eccezioni, la
presenza di PBP2 / è responsabile della resistenza alla meticillina, nel trattamento delle infezioni sostenute da
S. aureus e da stafilococchi coagulasi negativi 2,6 .
I metodi tradizionali di identificazione dei ceppi MRSA, che sono basati sui test standard di sensibilità agli
antibiotici, spesso si rivelano inaffidabili a causa della variabilità dell'espressione fenotipica della resistenza in
vitro.
L'accuratezza della valutazione della resistenza alla meticillina può infatti subire delle variazioni a seconda delle
dimensioni dell'inoculo, dei tempi e della temperatura di incubazione, del pH e della concentrazione di sali nel
terreno, e da altri fattori 8,9 . Inoltre, questi metodi colturali richiedono 24 ore di incubazione per ottenere risultati
accurati. Gli stafilococchi coagulasi negativi spesso producono quantità di PBP2 / inferiori e richiedono di essere
indotti, con esposizione ad una delle PRP, al fine di produrre una quantità sufficiente di proteina che ne consenta
la rilevazione 2,3,12 .
La metodica di rilevazione del gene mecA, grazie alla sua accuratezza, è considerata il gold standard per la
determinazione della resistenza alla meticillina, risulta tuttavia laboriosa e dal costo elevato 1,6 . Il test di
agglutinazione al lattice PBP2 / Oxoid ha il vantaggio di rilevare direttamente la proteina PBP2 / in tempi rapidi e
con minimo sforzo. Il test può risultare, potenzialmente, anche più accurato della rilevazione del gene mecA,
perché evita il rischio di risultati falsi positivi forniti da ceppi, che possiedono il gene, ma non sono in grado di
sintetizzare la proteina.
Il test PBP2 / Oxoid è stato precedentemente valutato in tutto il mondo, dimostrando le sue elevate caratteristiche
di sensibilità e specificità 4,5,11 .
Le particelle di lattice sensibilizzate con un anticorpo monoclonale specifico per la PBP2 / reagiscono in maniera
specifica con ceppi di stafilococco resistenti alla meticillina, determinando un'agglutinazione visibile ad occhio
nudo.
MATERIALI COMPRESI NEL KIT
DR0901 Test Latex - Reagente al lattice sensibilizzato con anticorpo monoclonale specifico per la PBP2 /
DR0902 Control Latex - Reagente al lattice di controllo, sensibilizzato con un anticorpo monoclonale della
stessa sottoclasse (IgG), specifico per una proteina umana, non reattivo nei confronti di S. aureus
DR0903 Extraction Reagent 1 - Reagente per la prima estrazione
DR0904 Extraction Reagent 2 - Reagente per la seconda estrazione
Cartoncini di reazione
Bastoncini per mescolare i reagenti sul cartoncino di reazione
Materiali occorrenti non compresi nel kit
● Micropipetta e puntali (50µl)
● Ansa batteriologica (5µl/1µl)
● Bagno con acqua bollente o blocco riscaldante
● Centrifuga (1500 x g)
● Provette da microcentrifuga (con chiusura di sicurezza)
● Idoneo disinfettante
PRECAUZIONI
Il prodotto è da utilizzarsi esclusivamente per uso diagnostico in vitro.
Durante la fase di riscaldamento del campione si raccomanda di rispettare il tempo di tre minuti. Se il
riscaldamento viene prolungato oltre 5 minuti si può verificare una diminuzione della sensibilità del test. Se i tempi
di riscaldamento vengono ridotti ad 1 minuto o meno, si possono verificare agglutinazioni non specifiche. Quando,
dopo la centrifugazione, si recupera il sovranatante da utilizzare per il test, evitare di prelevare il materiale solido
presente sul fondo della provetta.
La presenza di questo materiale potrebbe causare agglutinazioni aspecifiche.
Prima dell'uso, agitare accuratamente i reagenti al lattice fino a quando le sospensioni non risultano perfettamente
omogenee.
I reagenti contengono sodio azide 0.095% come conservante. La sodio azide è tossica e può reagire con il
piombo o con il rame eventualmente presenti nelle tubature, producendo azidi metalliche esplosive. Per prevenire
l'accumulo di sodio azide nelle tubature, si raccomanda di lasciar scorrere a lungo l'acqua nel lavandino quando si
eliminano i residui.
I campioni devono essere manipolati con le opportune precauzioni riservate ai materiali potenzialmente patogeni.
Poiché la procedura di estrazione non uccide i batteri, anche l'estratto deve essere maneggiato con le stesse
precauzioni.
I due reagenti per l'estrazione contengono una sostanza lievemente irritante e un acido debole. Si raccomanda di
evitare il contatto diretto, indossando opportune protezioni (guanti, camice, ecc.). In caso di contatto diretto con la
cute, con le mucose o con gli occhi, lavare immediatamente e a lungo con acqua.
CONSERVAZIONE
Il kit deve essere conservato a 2-8°C. In queste condizioni, i reagenti mantengono inalterata la loro attività fino
alla data di scadenza indicata sulla confezione.
CONTROLLI
Le procedure di controllo descritte di seguito devono essere eseguite tutte le volte che si usa il kit.
1. Controllo positivo: utilizzare un ceppo MRSA noto, ad esempio ATCC ® 43300 (Culti-Loop Oxoid, Cod.
CL9022). Seguire le istruzioni ed accertarsi che l'agglutinazione intervenga entro 3 minuti.
2. Controllo negativo: utilizzare un ceppo di Staphylococcus aureus sensibile alla meticillina, ad esempio ATCC ®
25923 oppure ATCC ® 29213 (Culti-Loop Oxoid, Cod. CL7010 oppure CL7011). Seguire le istruzioni ed
accertarsi che non intervenga agglutinazione entro i primi 3 minuti. Non utilizzare il kit se le reazioni con i ceppi
di controllo sono diverse da quelle attese.
3. Non usare il kit dopo la data di scadenza.
IMPORTANTI NOTE PROCEDURALI
Per prevenire la contaminazione dei reagenti, evitare accuratamente di toccare i campioni sui cartoncini di
reazione con la punta del contagocce dei flaconi e chiudere accuratamente i flaconi stessi. Dopo l'uso, riporre il kit
in frigorifero, accertandosi che i flaconi siano in posizione verticale.
PREPARAZIONE DELLA COLTURA
Per la coltura si può utilizzare uno qualsiasi dei seguenti terreni:
Tryptone Soya Agar (Cod. CM0131B) addizionato con sangue 5% (SR0051), Columbia Blood Agar Base (Cod.
CM0331B + SR0051), Mueller-Hinton Agar (Cod. CM0337B). Si raccomanda di utilizzare colonie provenienti da
colture recenti (18-24 ore). E’ tuttavia possibile saggiare colture di 24-48 ore, qualora fosse necessario ottenere
crescita sufficiente.
I dati relativi alle caratteristiche del kit riportati in questo foglio istruzioni e sottoposti al North America Food and
Drug Administration sono stati ottenuti usando i terreni elencati in precedenza.
Dati di archivio Oxoid mostrano che comunque il test funziona anche saggiando colonie isolate su Tryptone Soya
Agar e Columbia Agar addizionati con sangue di cavallo, Iso Sensitest Agar e DSTA. Questi terreni sono
comunemente usati in Europa ma non in Nord America e quindi non sono stati utilizzati nelle prove che hanno
generato i dati presentati nel capitolo Caratteristiche.
Richieste speciali:
Il test PBP2 / deve essere eseguito esclusivamente su specie di Staphylococcus (Cocchi Gram positivi). Si
raccomanda di eseguire il test della coagulasi o equivalente al fine di determinare se il ceppo isolato è S. aureus
o appartenente ad un’altra specie di stafilococco.
Preparazione dell’inoculo:
Per S. aureus, se la crescita è sufficiente, il test può essere eseguito a partire da colonie ben isolate sulla piastra
di primo isolamento, o a partire da sottocolture dell’isolato. Non è stato evidenziato che eventuali altri
microrganismi presenti sulla piastra possano interferire con il saggio. Per gli stafilococchi coagulasi negativi è
necessario eseguire l’induzione per ottenere quantità sufficienti di PBP2 / .
1. Preparare una sospensione del microrganismo in brodo con torbidità pari a
1 Standard McFarland e seminarla per striscio sulla superficie di TSA più sangue, oppure di Columbia Blood
Agar, o di Mueller-Hinton Agar al fine di ottenere una crescita confluente. In alternativa, inoculare le piastre di
terreno agarizzato con un inoculo pesante del microrganismo ed eseguire lo striscio lungo i quattro quadranti
della piastra.
2. Deporre un disco di oxacillina (1µg/ml) sulla superficie della semina confluente o sul quadrante che contiene
l’inoculo più pesante.
3. Incubare a 37°C per almeno 24 ore ma non più di 48 ore. Attenzione: Per evitare risultati falsi negativi, non
eseguire il test se l’inoculo è insufficiente.
4. Al fine di saggiare solo le cellule batteriche sicuramente indotte, si raccomanda di prelevare una sufficiente
quantità di microrganismo nell’immediata vicinanza del disco di oxacillina.
TECNICA
Estrazione della PBP2 /
1. Introdurre 4 gocce di Extraction Reagent 1 in una provetta da microcentrifuga.
2. Il test richiede di saggiare approssimativamente 1.5x10 9 cellule (3µl-5µl). La quantità adeguata di cellule
batteriche può essere ottenuta con un’ansa sterile calibrata da 5µl, prelevando una quantità sufficiente di
microrganismo per colmare il diametro interno dell’ansa. In alternativa è possibile usare un’ansa sterile
calibrata da 1µl e prelevare 3 porzioni di crescita batterica (colmando ogni volta il diametro dell’ansa).
Risospendere quindi le cellule batteriche nella provetta da microcentrifuga.
3. Porre la provetta per 3 minuti in acqua bollente o in un apposito blocco riscaldante (la temperatura deve essere
superiore a 95°C).
4. Rimuovere la provetta da microcentrifuga e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente.
5. Aggiungere nella provetta 1 goccia di Extraction Reagent 2 ed agitare accuratamente.
6. Centrifugare per 5 minuti a 1500xg (3000 rpm con raggio di rotazione di 15 cm oppure 4500rpm con raggio di
rotazione di 4.5cm). Eseguire il test sul sovranatante.
Test di agglutinazione
1. Contrassegnare sul cartoncino di reazione un cerchio di reazione per il Test Latex e un cerchio di reazione per
il Control Latex.
2. Deporre 50µl di sovranatante sull'area destinata al test e aggiungere 1 goccia di Test Latex. Mescolare
accuratamente con uno degli appositi bastoncini forniti con il kit.
3. Deporre 50µl di sovranatante sull'area destinata al controllo e aggiungere 1 goccia di Control Latex. Mescolare
accuratamente con uno degli appositi bastoncini forniti con il kit.
4. Ruotare il cartoncino per 3 minuti e osservare in condizioni di luce normali se interviene agglutinazione.
5. Eliminare il cartoncino di reazione immergendolo in una opportuna soluzione disinfettante.
LETTURA ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Agglutinazione del Test Reagent Il ceppo saggiato è positivo
e non del Control Reagent per la PBP2 / (MRSA)
Assenza di agglutinazione Il ceppo saggiato negativo
con entrambi i reagenti per la PBP2 / (MSSA)
Agglutinazione solo con il Control Reagent Risultato non interpretabile
Forza della reazione di agglutinazione
Reazione negativa: sospensione omogenea delle particelle di lattice, senza formazione di
agglutinazione visibile.
Reazione debolmente positiva: piccole, ma definite agglutinazioni su sfondo torbido.
Reazione fortemente positiva: grandi e piccole agglutinazioni su sfondo torbido o agglutinazioni di grandi
dimensioni su sfondo molto chiaro.
Nota: Occasionalmente, le reazioni negative possono presentare aspetto finemente granulare o reazione fibrose.
In questi casi, il grado di chiarificazione dello sfondo può essere usato per l’interpretazione del risultato. Un fondo
opaco indica un risultato negativo, un fondo chiaro può indicare un risultato positivo.
LIMITAZIONI
Per i campioni che hanno fornito risultati indeterminati si raccomanda di ripetere il test saggiando un estratto
fresco. Se anche dopo questa ripetizione si ottenesse ancora un risultato indeterminato, si suggerisce di utilizzare
un metodo alternativo.
Si possono verificare risultati falsi negativi se si saggia una quantità insufficiente di coltura. In questi casi, il test
deve essere ripetuto con una quantità sufficiente di coltura.
I risultati veri positivi presentano solitamente reazioni di agglutinazione fortemente positive.
E’ stato evidenziato che reazioni false positive si verificano raramente, ma sono generalmente limitate a reazioni
di debole agglutinazione. Questi risultati possono essere verificati ripetendo il test su coltura fresca.
I ceppi Modified S. aureus (MODSA), e i ceppi BORSA non possiedono PBP2 / e quindi si attende che non
reagiscano al test.
Alcuni microrganismi possono avere un basso livello di resistenza alla meticillina, o in rari casi, producono PBP2 /
in basse quantità, e forniscono risultati falsi negativi.
A causa delle limitazioni di sensibilità e specificità nella metodica del test di sensibilità CLSI per gli stafilococchi
coagulasi negativi 9 , in particolare per i ceppi diversi da Staphylococcus epidermidis, i risultati ottenuti con PBP2 /
possono non essere in accordo con quelli forniti dal test di sensibilità standard. Ceppi con valori di MIC ≥ 0.5µg/ml
devono essere considerati meticillino resistenti, a prescindere dai risultati con PBP2 / test.
CARATTERISTICHE
1. Saggio di ceppi MRSA
Il test di agglutinazione PBP2 / Oxoid è stato valutato in quattro laboratori dislocati in diverse aree geografiche,
che hanno saggiato ceppi clinici di S. aureus di fresco isolamento.
Sono stati esaminati 201 ceppi sia con il metodo standard NCCLS sia con PBP2 / Oxoid, preparando gli inoculi
a partire da TSA + Sangue, Columbia Agar + Sangue e Mueller-Hinton.
Il test al lattice ha evidenziato un falso positivo su TSA con sangue (il test ripetuto è risultato negativo). Tutte le
reazione positive hanno evidenziato forte agglutinazione, ad eccezione di tre reazioni deboli (ma comunque
positive) evidenziate su Mueller-Hinton Agar.
La sensibilità del test al lattice per la rilevazione degli MRSA su ciascun terreno è risultata pari al 100%, la
specificità pari al 99% per il TSA con sangue e del 100% sugli altri terreni.
Risultati ottenuti da 4 diversi laboratori su 201 ceppi di S. aureus, isolati di fresco da campioni clinici:
MRSA BORSA A MSSA
Numero di test 68 3 130
Crescita su Oxacillin Salt Agar (NCCLS) 68 0 0
MIC ≥ 4µg/ml (NCCLS) 68 0 0
Lattice positivo su TSA+Sangue 68 0 1 (1) B
Lattice positivo su Columbia+Sangue 68 0 0
Lattice positivo su Mueller-Hinton 68 (3) B 0 0
A Le MIC erano di 2 µg/ml ed i ceppi mecA negativi
B Il numero di reazioni debolmente positive è evidenziato in parentesi
2. Saggio di ceppi problematici di S. aureus provenienti da tre diverse aree geografiche
Tre laboratori hanno esaminato un gruppo di ceppi problematici di S. aureus, collezionati precedentemente e
hanno confrontato i risultati ottenuti con il test PBP2 / con quelli forniti dai metodi standard NCCLS per la
determinazione degli MRSA. Sono stati saggiati in totale 724 ceppi a partire da TSA con sangue. La sensibilità
di PBP2 / Test Oxoid è stata del 98.5% e la specificità pari al 100%. La sensibilità del test con agar screen e la
determinazione della MIC è risultata rispettivamente del 98.7% e del 99.2%, la specificità rispettivamente del
90.0% e dell’88.7%. Sono stati esaminati separatamente anche due ceppi MODSA; entrambi hanno fornito
risultato negativo al test di agglutinazione al lattice.
3. Saggio di stafilococchi coagulasi negativi
Due laboratori hanno saggiato ceppi di stafilococchi coagulasi negativi, dopo induzione con il disco di
oxacillina. Un laboratorio ha esaminato 115 ceppi meticillino resistenti e 45 meticillino sensibili, inclusi 58
isolamenti clinici freschi. La sensibilità è risultata pari al 96.5% per i ceppi isolati su TSA + Sangue e del 95.6%
per quelli cresciuti su Mueller-Hinton. La specificità è stata del 100% per i ceppi isolati su TSA + sangue e del
98% per quelli cresciuti su Mueller-Hinton. L’ottenimento di un inoculo pesante è risultato più difficoltoso su
Mueller-Hinton Agar. Il secondo laboratorio ha esaminato 212 ceppi meticillino resistenti e 203 ceppi meticillino
sensibili, ottenendo una sensibilità del 99.5% e una specificità del 99.5%, impiegando Columbia Agar per
l’inoculo.
4. Riproducibilità
Dieci ceppi di S. aureus ben caratterizzati (3 MRSA, 3 MSSA, 3 BORSA ed 1 MODSA) sono stati inviati a tre
laboratori appartenenti a tre differenti aree geografiche. Ciascun ceppo è stato inviato 5 volte, usando una
codifica in cieco. Tutti i 150 test hanno concordato con i risultati attesi fornendo una riproducibilità del 100%.
Tre ceppi positivi per il gene mecA sono risultati positivi tutte le volte che sono stati saggiati (45/45 test). I tre
ceppi di MSSA e i tre ceppi di BORSA hanno fornito risultati negativi, tutte le volte che sono stati saggiati
(90/90 test). I ceppi di MODSA che presentavano una MIC di 16 µg/ml per l’oxacillina hanno fornito, come
atteso, risultato negativo al test al lattice.
X6555B February 2011
The ATCC Licensed Derivative Emblem, the ATCC Licensed Derivative word mark®,
and the ATCC catalogue marks are trademarks of ATCC. Oxoid Limited. is licensed to
use these trademarks and to sell products derived from ATCC® cultures.
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