SEIX 17-20 octobre 2005 - Atelier Calcium

2005
Ca 2+ et signalisation : généralités (Catherine Leclerc, Toulouse)
Techniques électrophysiologiques (Philippe Lory, Montpellier)
Techniques d‟imagerie - nouvelles sondes (Marc Moreau, Céline Gohory, Bruno Combette)
Calcium et signalisation NOD (Jean Jacques Bono, Toulouse)
Calcium et signalisation des sphingolipides (Sylvie Coursol, Gif/Yvette)
Analyse du signal calcique nucléaire et modélisation (Christian Brière, Toulouse)
Caméras EMCCD (Bruno Combettes, Hamamatsu)
Le TIRF (Emmanuelle Beccari, Nikon)
Modélisation (Jacques Haiech, Strasbourg)
Imagerie calcique du système olfactif de l‟abeille domestique : du cerveau à la cellule
(Valérie Raymond-Delpech, Toulouse)
Variations calciques dans le système nerveux central de Drosophile (Philippe Rosay,
Bordeaux)
Calcium signalling in Drosophila primary cultures and cell lines: combining physiology, RNA
interference and microarray studies (David Sattelle, Oxford, G.B.)
Coopération mortelle entre calcium intracellulaire et activité pacemaker de neurones
d´insecte (Bruno Lapied, Angers)
TIRF et patch optique (Marc Moreau, Toulouse)
Atelier pratique TIRF (Catherine Leclerc, Toulouse)
Les canaux calciques voltage-dependants comme nouvelles cibles pour le traitement de la
douleur (E. Bourinet, Montpellier)
Douleur neuropathique et activité électrique ectopique: Rôle des canaux chlorures Activés par
le calcium (Frédérique Scamps, Montpellier)
Le calcium comme marqueur d'activation des neurones DRGs en reponse aux agonistes PAR
(Nathalie Vergnolle Calgary)

LA SIGNALISATION CALCIQUE
Catherine Leclerc et Marc Moreau
Centre de Biologie du Développement, UMR CNRS 5547, et GDR 2688 Université Paul
Sabatier, 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse cedex.
Le calcium est un signal ubiquitaire contrôlant de nombreux processus cellulaires. C‟est en
1883 que Sidney Ringer a montré le rôle prépondérant joué par le calcium lors de la
contraction cardiaque chez la grenouille, mais ce n‟est que depuis les vingt dernières années
que le rôle du calcium dans la signalisation cellulaire commence à être compris.
Le calcium intervient aussi bien chez les animaux que les végétaux pour transmettre des
informations perçues au niveau de la membrane de la cellule vers des cibles intracellulaires.
Il intervient dans toutes les étapes de la vie : lors de la reprise de la méiose, à la fécondation et
au cours de différents processus du développement embryonnaire et contrôle dans les cellules
différenciées, de nombreuses fonctions physiologiques telles que la contraction musculaire, la
sécrétion, la mémoire, l‟apprentissage....
Comment un seul ion peut contrôler tous ces phénomènes. La signalisation cellulaire par le
calcium est toujours liée à une augmentation de la concentration en Ca 2+ interne. Le signal
calcique est caractérisé par son amplitude, sa durée et aussi par sa fréquence et son origine. Le
signal peut durer de quelques microsecondes à plusieurs heures, peut être transitoire ou peut
présenter des variations de concentration oscillatoires.
1. LES SOURCES DE CALCIUM
Figure 1 : les différentes voies de signalisation dépendantes du calcium. VOC : voltage operated channel, RyR :
récepetur à Ryanodine, IP3R, récepteur IP3 TyrKR : récepteur à tyrosine kinase, SOC :store operated channel.
Le schéma (figure 1) présente les différentes voies permettant d‟obtenir une augmentation de
calcium dans la cellule. D‟une manière générale, l‟augmentation de calcium est due :
soit à une entrée (un influx) de calcium venant du milieu extérieur par l‟intermédiaire de
canaux calcique
soit à une libération à partir des réserves internes au niveau du réticulum endo ou
sarcoplasmique. Cette libération fait intervenir l‟activation de récepteurs-canaux situés sur
le réticulum. Ces récepteurs peuvent être stimulés soit par l‟IP3 lors de l‟activation du
cycle des phosphoinositides soit par le calcium lui-même.
2

Une augmentation prolongée du niveau de calcium est toxique pour la cellule (il précipite le
phosphate, source d‟énergie pour la cellule). La cellule maintient un faible niveau de calcium
intracellulaire (effet tampon) grâce à l‟existence de protéines capable de fixer le calcium
(Calcium-binding proteins)
Le gradient de concentration pour les ions Ca 2+ est très élevé. La concentration intracellulaire
est de l‟ordre de 100 nM contre 1-2 mM à l‟extérieur. Le gradient électrochimique (V-Eca)
est en faveur d‟une entrée de calcium dans la cellule. Le maintien de l‟homéostasie calcique
se fait grâce au fonctionnement d‟ATPases. La sortie de calcium est un processus qui
nécessite de l‟énergie. De la même façon, la concentration en calcium à l‟intérieur du
réticulum est très élevée, de l‟ordre de 100 µM. Ce qui veut dire que lors de la stimulation des
récepteurs-canaux situés sur le réticulum le calcium va sortir selon le gradient de
concentration. (sens réserve vers cytoplasme). La reconstitution des réserves nécessite
l‟activation de calcium-ATPases.
1.1. Les canaux calciques activés par le potentiel
Dans de nombreux cas les canaux Ca 2+ sont activables par des variations de potentiel
membranaire. Ce sont des canaux dit voltage dépendants. Ces canaux sont présent aussi bien
sur des cellules excitables que non excitables. Lorsque la membrane est à son potentiel de
repos (-70 mV), les canaux calciques sont fermés, sous l‟effet d‟une dépolarisation, ces
canaux s‟ouvrent et le calcium entre dans la cellule suivant le gradient électrochimique. C‟est
une diffusion passive. On distingue deux catégories de canaux calciques. La première s‟active
pour de faibles dépolarisations (seuil à –50 mV) et s‟inactive rapidement. Ce sont des canaux
dit bas seuil. La seconde catégories est activée pour des dépolarisations plus élevées (seuil à –
30 ou –20 mV) et engendre des courants qui s‟inactivent peu ou pas. Ce sont des canaux dit
haut seuil. Il existe différents types de canaux calciques : classés T, L N, P, Q, R. A l‟origine
la classification est fondée sur des critères électrophysiologiques (seuil d‟activation et
cinétique) et pharmacologiques, depuis la classification a été affinée sur des bases
moléculaires. Ces canaux présentent des différences de sensibilité aux toxines. Ainsi le canal
de type L est caractérisé par sa sensibilité aux dihydropyridines contenant à la fois des
agonistes comme le BayK et des antagonistes comme la nifédipine. Le type N est lui bloqué
spécifiquement par une toxine peptidique isolée d‟un escargot marin (Conus geographicus, la
conotoxine) ; le type P par une toxine provenant du venin d‟une araignée (Agelenopsis aperta,
aga IVA).
Pour en savoir plus consultez les archives de l’atelier site :
http://www-cbd.ups-tlse.fr/calcium/ les fascicules 2000, 2001 et 2004 avec les
contributions de Philippe Lory.
1.2. Les canaux du réticulum.
1.2.1. les récepteurs à l‟IP3
Localisation
Ce type de récepteur est situé majoritairement au niveau du réticulum endoplasmique, mais
une activité IICR (IP3-Induced Calcium Release) a été mise en évidence au niveau de
l‟enveloppe nucléaire, du Golgi, de vésicules de sécrétion (controversé) et pour certains types
cellulaires au niveau de la membrane plasmique (lymphocyte T humain). Trois gènes distincts
3

(I-III) sont identifiés. Il existerait 2 isoformes supplémentaires (IV-V) mais les séquences
sont partielles.
Figure 3 : le récepteur IP3
Structure
Il existe 3 type de récepteurs IP3 : R1,
R2, R3. D‟une manière générale, on
distingue 3 domaines. Le récepteur
de type 1 est celui qui est le mieux
caractérisé du point de vue structurefonction.
La structure primaire est présentée
figure 3.
Domaine N-terminal correspond
au domaine de fixation à l‟IP3.
Ce domaine comprend environ
650 à 800 acides aminés.
Domaine C-terminal : porte la fonction canal.
Ce domaine contient 6 domaines transmembranaires putatifs. La partie C-terminale est
cytoplasmique. Il a été mis en évidence une séquence entre les segments transmenbranaires 5
et 6 capable de former un pore (23 acides aminés en forme d‟épingle à cheveux). Cette
séquence est aussi capable de fixer le Ca 2+ . Cette séquence est similaire aux domaines SS1-
SS2 des canaux ioniques voltages dépendants (types Na, Ca ou K).
Domaine central : ce domaine d‟environ 2000 acides aminés sépare le domaine de fixation
IP3 à la partie canal en C-terminal. Il Sert à moduler l‟activité du récepteur et est
nécessaire pour réaliser la transduction entre la fixation d‟IP3 et l‟ouverture du canal.
Le récepteur est un tétramère (homo ou hétéromèrique) chacune des sous-unités portant 1 site
de fixation IP3 au niveau cytoplasmique. Le mécanisme de IICR est contrôlé par un
mécanisme de feedback, par le calcium lui-même. Cette régulation peut-être positive ou
négative suivant la concentration en calcium cytosolique. Des concentrations en calcium de
l‟ordre de la micromole inhibe la fixation d‟IP3 par contre, des concentrations plus faibles
potentialisent l‟effet de l‟IP3.
Une augmentation de calcium liée à l‟activation du récepteur IP3 a été mise en évidence lors
de l‟activation ovocytaire, La fécondation, division cellulaire au cours du développement,
développement des structures ventrales chez l‟embryon de Xénope, activation des
lymphocytes T…
http://www-cbd.ups-
Pour en savoir plus voir Christophe Pignier fascicule 2002
tlse.fr/calcium/
4

Pharmacologie du récepteur IP3
Un inhibiteur du récepteur IP3 est l‟héparine mais son utilisation pose problème car c‟est un
composé imperméant, il faut donc l‟injecter.
1.2.2. Récepteur ryanodine
Il forme une famille de récepteurs présentant de fortes homologies avec le récepteur IP3.
Comme pour le récepteur IP3, le récepteur ryanodine est un tétramère formé de 4 sous-unités
identiques de 560 kDa environ. Les 3 isoformes connues sont codées par 3 gènes différents.
Ces 3 isoformes présentent une
homologie importante (66% d‟identité).
Initialement ces récepteurs ont été mis en
évidence au niveau du réticulum
sarcoplasmique des muscles
squelettiques (RyR1) et cardiaques
(RyR2). Depuis les récepteurs ryanodine
ont été identifiés dans beaucoup d‟autres
types cellulaires. Ainsi les 3 isoformes
s‟expriment dans le cerveau avec des
distributions spécifiques.
Figure 4 : le récepteur à Ryanodine
Structure
Le récepteur est un tétramère formant une structure en trèfle (figure 4). Le domaine C-
terminal constitue le pore ionique. Le domaine cytoplasmique interagit avec le récepteur aux
dihydropyridines (DHP-sensible Ca channels ou L-type calcium channel). Il y a 3 sites de
fixation Ca 2+ potentiels dans la régulation N-terminale, proche du canal.
Pour en savoir plus voir fascicule 2001 Michel Ronjat : http://www-cbd.ups-tlse.fr/calcium/
Fonction
Couplage excitation-contraction dans le muscle
Dans le muscle squelettique c‟est la brusque augmentation de calcium intracellulaire
survenant lors de la dépolarisation de la cellule qui active la contraction. Cette augmentation
de calcium provient de la libération de calcium contenu dans le réticulum sarcoplasmique
selon un mécanisme de Depolarisation Induced Calcium Release (DICR). Il existe un
couplage mécanique entre le canal L et le récepteur ryanodine.
Amplification de la fonction neuronale
Dans le mécanisme de Calcium-Induce Calcium Release (CICR) c‟est la liaison du calcium,
entré dans la cellule par l‟ouverture des canaux calciques, sur les récepteurs de type 2 ou 3,
qui provoque l‟ouverture du canal ryanodine et la libération du calcium dans le cytoplasme.
Ce type de mécanisme est utilisé dans les neurones pour contrôler l‟excitabilité; la
transmission synaptique, la plasticité.
5

Pharmacologie du récepteur Ryanodine
La ryanodine est un alcaloïde extrait de Ryana speciso qui est un inhibiteur à forte
concentration et activateur à faible concentration. La caféine est activatrice mais pour des
concentrations de l‟ordre du mM. L‟activateur endogène du récepteur ryanodine serait le c-
ADP-ribose. Toutefois, les études actuelles n‟ont pas permis de déterminer s‟il pouvait être
considéré comme un messager secondaire au même titre que l‟IP3 ou l‟AMP-c. En particulier
aucune étude n‟a montré que le niveau intracellulaire de c-ADP-ribose augmentait après
stimulation de la cellule.
1.3. Contrôle de l’homéostasie calcique
Il existe plusieurs systèmes pour contrôler l‟homéostasie calcique. Les principaux sont : les
échangeurs Na+/Ca 2+ et les calcium-ATPases. Nous nous intéresserons aux calcium-ATPases.
1.3.1.Les calcium-ATPases
Les calcium-ATPases sont localisées aussi bien sur la membrane plasmique que sur la
membrane du réticulum. Elles appartiennent à la famille des ATPases de type P, assurant le
transport d‟ions. Le transport est actif, le calcium se déplace contre son gradient
électrochimique. Ces transports sont de plus beaucoup plus lents que les transports passifs :
par exemple, un canal ionique délivre environ 10 7 ions par seconde alors que l‟ATPase-Ca 2+
permet le transport de 10 à 100 ions par seconde.
Calcium-ATPase de la membrane plasmique.
Elles sont codées par une famille de 4 gènes : PMCA1-4. La distribution des isoformes est
ubiquitaire ou localisée selon le type.
Structure
La taille de la molécule est de 125-140 kDa. La séquence comporte environ 1200 acides
aminés et 10 segments transmembranaires ont été identifiés. Les segments M4, M6 et M8
portent des sites de fixation pour le calcium (figure 5). 80% de la protéine est du côté
cytosolique. Il y a 2 boucles
intracellulaires importantes. La partie
C-terminale est très longue et comporte
les sites de régulation les plus
importants avec en particulier un site
de fixation pour la calmoduline. C‟est
un domaine d‟autoinhibition. Dans des
conditions où la concentration en
calcium intracellulaire est faible, la
calmoduline n‟est pas fixée et
l‟ATPase est inactive.
Figure 5 : La calcium ATPase de la membrane plasmique
Fonction
Les dernières études montrent que la fonction des calcium-ATPases de la membrane
plasmique ne se résume pas seulement à maintenir l‟homéostasie calcique. Ces protéines ont
un rôle plus dynamique dans la signalisation calcique, elles contribuent à la forme du signal.
6

Calcium-ATPase du réticulum sarcoplasmique (SERCA).
Il existe au moins 10 isoformes codées par 3 gènes différents : SERCA1-3.
Structure
C‟est aussi une ATPase de type P, d‟environ 110 kda. Cette ATPase est plus petite que la
précédente, elle comprend entre 994 et 1043 aa. Elle a une structure asymétrique et comprend
3 domaines :
Le domaine cytoplasmique qui représente environ 70% de la molécule
Domaine transmembranaire avec 10 hélices
Domaine se situant au niveau de la lumière du réticulum (3% de la molécule)
Le domaine cytoplasmique a une structure complexe et est impliqué dans la transduction.
Au niveau du domaine transmembranaire les hélices 4, 5, 6 et 8 sont impliquées dans la
fixation du calcium (2 sites) et forment un canal permettant la translocation du calcium du
cytoplasme vers la lumière du réticulum.
Régulation
En plus de régulations par phosphorylation, deux protéines de faible poids moléculaires
participent à la régulation de l‟activité de cette ATPase. Il s‟agit de la Phospholamban et de la
sarcolipin.
La phospholamban : protéine de 52aa, possède 2 domaines. Se présente sous forme de
monomère ou de
Figure 6 : La SERCA
contrôlée par le niveau de calcium intracellulaire.
pentamère, c‟est
cette dernière forme
qui est active.
La sarcolipin :
protéine de 31 aa qui
s‟exprime
principalement dans
les muscles rapides.
L‟activité de la
sarcolipin est
Mécanisme de transport du calcium par les Calcium-ATPases
Les PMCA et SERCA réalisent l‟hydrolyse d‟une molécule d‟ATP par cycle. Dans le cas de
la PMCA 1 ion calcium est transporté , par contre la SERCA transporte 2 ions calcium par
cycle.
Dans le cas de la SERCA le transport de calcium s‟effectue selon mécanisme en 4 étapes.
1. Fixation de 2 ions calcium sur les sites de transport côté cytoplasmique.
2. L‟ATPase hydrolyse une molécule d‟ATP et fixation d‟un phosphate. Ceci conduit à
l‟occlusion des sites de transport.
3. Les ions calcium se dissocient lentement en direction de l‟intérieur du réticulum.
4. La dernière étape est la déphosphorylation de l‟ATPase.
Ce mécanisme est réversible.
7

Pharmacologie des ATPases calcium dépendantes.
Pour les ATPases du réticulum la thapsigargin (sesquiterpene extrait d‟une ombellifère) est un
inhibiteur très sélectif, le blocage de l‟ATPase par la thapsigargin provoque une augmentation
de calcium intracytoplasmique.
Pour en savoir plus voir fascicule 2004, Régis Bobé, http://www-cbd.ups-tlse.fr/calcium/
1.4. Le courant capacitif : Une autre voie d’entrée du calcium
Il s‟agit d‟un courant calcique activité par le calcium interne. Ce mécanisme particulier
d‟entrée du calcium est appelé entrée de calcium capacitif, le courant calcique qui en
résulte est nommé ICRAC (Calcium Release-Activated Calcium current). Le mécanisme
d‟activation de ICRAC est peu connu, l‟idée prépondérante est en faveur d‟un message
diffusible qui permet de faire le lien entre la libération de calcium à partir des réserves
internes et l‟activation des canaux calciques au niveau de la membrane plasmique. Les études
en électrophysiologie indiquent qu‟il y a en fait une grande diversité dans les phénotypes des
canaux qui pourraient être responsable du courant capacitif.
Le candidat le plus plausible est un canal appartenant à la famille TRP (Transient Receptor
Potential channel). TRP est un photorécepteur isolé chez la Drosophile. Ce canal est un
homotétramère qui présente de forte homologie avec les canaux calciques de mammifères
activés par le potentiel.
Sur les TRPs, voir la revue exhaustive de François Rassendren dans le fascicule de 2003
http://www-cbd.ups-tlse.fr/calcium/
1.5. Le NAADP et cADP ribose
Initialement découvert dans les microsomes d‟œufs d‟oursins (Lee et Aarhus, 1995), le
NAADP mobilise le Ca 2+ dans de nombreux types cellulaires d‟organismes supérieurs. Chez
les mammifères, il élève le Ca 2+ cytosolique dans les cellules de pancréas exocrine et
endocrine, dans les lymphocytes T, ou encore dans les cellules neuronales (Cancela et coll.,
1999 ; 2003 ; Mitchell et coll., 2003 ; Berg et coll., 2000 ; Chameau et coll., 2001 ). Cette
molécule est le second messager libérant du Ca 2+ le plus actif (Cancela 2001 ; Cancela et
coll., 2003 ; Lee 2003). Le récepteur au NAADP n‟est pas encore caractérisé. L‟origine des
réserves calciques mobilisées par le NAADP reste débattue. Elle pourrait être lysosomiale ou
venant de l‟enveloppe nucléaire. (Mitchell et coll., 2003 ; Gerasimenko et coll., 2003).
Sur le NAADP voir José Cancela dans le fascicule de 2003
http://www-cbd.ups-tlse.fr/calcium/
Le cADPR est plus un modulateur qu‟un messager. Le cADPR injecté dans la cellule a peu
d‟effet immédiat. L‟effet est souvent à très long terme. Il semble qu‟il puisse agir en
augmentant la sensibilité des récepteurs à ryanodine (RYRs) pour le calcium. Le mécanisme
de modulation de la sensibilité des RYRs est inconnu. Le cADPR ne s‟associe pas
directement au RYRs, il pourrait agir par l‟intermédiaire d‟une protéine, la FK506 binding
protein 12.6, associée au RYR. Le cADPR pourrait aussi agir via la pompe SERCA. (Berridge
et al. 2004)
8

1.6. Les sphingolipides
Des signaux calciques peuvent être induits indépendamment de la mobilisation des récepteurs
IP3 ou des RYRs. Dans les mastocytes, le S1P (messager sphingolipidique) active aussi le
récepteur IP3 pour libérer les médiateurs liés à l‟inflammation. Dans ces cellules, le S1P
provoque un pic de Ca 2+ suivi par un plateau IP3 dépendant. On ne connaît pas le mécanisme
de libération du Ca 2+ à partir des stocks internes. Un candidat intéressant serait la protéine
CSaMPER (sphingolipid Ca 2+ release-mediating protein of endoplasmic reticulum). On ne lui
connaît aucune homologie avec des canaux Ca 2+ connus, c‟est une protéine de 20 KD à un
seul domaine transmembranaire.
Pour plus de détails voir Sylvie Coursol, atelier 2005 http://www-cbd.ups-tlse.fr/calcium/
1.7. Les Ca 2+ binding proteins
Il existe environ 200 protéines capable de lier le Ca 2+ dans une cellule humaine. Ces protéines
agissent soit en effecteurs soit en tampon.
Les tampons peuvent être chargés par le calcium lors des réaction on et se décharger pendant
les réactions off. Ces protéines peuvent donc moduler finement le signal Ca 2+ en altérant
l‟amplitude et le temps de retour à la normal du transitoire Ca 2+ . Par exemple la calbindin D-
28 ou la calretinin sont des tampons très rapides alors que la parovabulmin est un tampon très
lent avec une grande affinité pour le Ca 2+ . Le patron d‟expression de ces tampons est variable.
Les motoneurones ont une faible capacité tampon pour le calcium ce qui permet la génération
de signaux Ca 2+ rapides, mais qui les rendent plus sensibles à un effet toxique du Ca 2+ .
1.8. Le calcium nucléaire.
Le noyau est séparé du cytoplasme par une enveloppe nucléaire, cette enveloppe joue un rôle
important dans le transport de molécules intervenant dans le contrôle de la transcription.
L‟enveloppe nucléaire est constituée d‟une membrane externe en contact avec la membrane
du réticulum (mais pas identique à la membrane du réticulum) et d‟une membrane interne.
Ces membranes aussi bien internes qu‟externes possèdent des récepteurs IP3 ainsi que des
récepteurs ryanodine. De plus côté externe il existe des ATPase calciques. L‟espace entre ces
2 membranes appellé cisterne constitue donc un réservoir à calcium.
Il a été montré que le calcium contenu dans la citerne nucléaire jouait un rôle dans le contrôle
du transport de molécules dont la taille est comprise entre 500 Da et 60 kDa.
Pour plus de détails voir les contributions de A. Malviya fascicule de 1999 et Chritian
Mazars 2001 http://www-cbd.ups-tlse.fr/calcium/
Références
Berridge MJ, Bootman MD, Roderick HL. (2003) Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling
Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-29.
Furuichi, T., Kohda, K., Miyawaki, A., and Mikoshiba, K. (1994). Intracellular channels.
Current Opinion in Neurobiology 4, 294-303.
Garcia, M. L., and Strehler, E. E. (1999). Plasma membrane calcium ATPases as critical regulators of calcium
homeostasis during neuronal cell function. Front Biosci 4, D869-82.
Nargeot, J., and Charnet, P. (1994). Diversité moléculaire des canaux calciques: du gène à la fonction.
médecine/sciences 10, 1293-1308.
9

Perez-Terzic, C., Jaconi, M., and Clapham, D. (1997). Nuclear calcium and the regulation of the nuclear pore
complex. Bioessays 19, 787-792.
Putney, J. W., and McKay, R. R. (1999). Capacitive calcium entry channels. Bioessays 21, 38-46.
10

L’ELECTROPHYSIOLOGIE EN 2005
Philippe Lory
Institut de Génomique fonctionnelle, Département de Physiologie
141 rue de la Cardonille, 34094 Montpellier cedex 05
BIOELECTRICITE.
Les cellules dites excitables répondent à une stimulation en générant un courant électrique.
Cette activité électrique constitue un des principaux moyens de couplage entre les signaux
stimulants qui arrivent sur une cellule (variation de champ électrique, hormones et
neurotransmetteurs…) et l‟activation de la réponse cellulaire. D‟un point de vue biophysique,
la membrane plasmique joue un rôle essentiel dans les activités bioélectriques. La bicouche
lipidique de la membrane plasmique se comporte comme un condensateur électrique capable
d‟accumuler des charges et de définir une différence de potentiel électrique entre l‟intérieur et
l‟extérieur de la cellule. D‟autres éléments de la membrane se comportent comme des
résistances permettant le passage d‟un courant électrique. Ce sont des protéines appelées
canaux ioniques qui permettent à des charges électriques, les ions, de traverser cette
membrane. Le fonctionnement de ces canaux ioniques répond à des principes biophysiques
désormais bien identifiés. La mesure des activités bioélectriques, c‟est à dire
l‟électrophysiologie cellulaire, a connu de nombreux développements technologiques au cours
de ces 50 dernières années. Citons ici les travaux de Hodgkin & Huxley en 1952 (le voltage
imposé) et de Neher, Sakmann & collègues en 1978 – 1981 (le patch-clamp) récompensés par
le prix Nobel.
QUELQUES CHIFFRES ET DEFINITIONS ….
La membrane plasmique formée par les domaines hydrophobes des phospholipides est un
isolant électrique caractérisé par une résistance élevée : ~ 10 3 Ohm.cm 2 et peut supporter des
gradients de potentiel élevés : 133 000V/cm
La capacitance de la membrane plasmique (Cm) est de l‟ordre de 0.4 – 1.0 µF/cm 2 .
Par convention, le potentiel (V en volt V) extracellulaire est définit comme étant 0 mV. La
différence de potentiel mesurée aux bornes de la membrane plasmique, c‟est à dire entre
l‟intérieur et l‟extérieur de la cellule est négatif. Typiquement le potentiel transmembranaire
d‟une cellule animale se situe entre –30 et –90 mV et entre –150 et –200 mV pour une cellule
végétale.
11

Une membrane plasmique permet le passage de charges électriques. Ce mouvement de
charges est appelé courant électrique (I en Ampère A). Ce courant électrique emprunte la
« résistance » membranaire : c‟est à dire les canaux ioniques (en fait, des conducteurs).
L‟amplitude de ces courants électriques cellulaires se situe dans une large gamme : un seul
canal produit un courant de l‟ordre du
picoampère (10 -12 A), certains courants
ioniques mesurés à l‟échelle d‟une cellule
peut atteindre le microampère (10 -6 A). La
membrane plasmique doit donc être
représentée par un schéma électrique
simple : une capacitance et une résistance
en circuit parallèle (voir ci-contre).
Membrane biologique : Circuit électrique équivalent :
Conductance (G en Siemens S) versus Résistance (R en Ohm Ω). Ces deux notions se
complètent : résistance met en avant la notion de contrôle du flux ionique alors que
conductance privilégie la notion de flux ionique. La conductance est l‟inverse de la résistance :
R = 1/G. En électrophysiologie, c‟est la notion de conductance qui prime. La valeur de la
conductance unitaire caractérise un canal ionique.
Loi d’Ohm : La différence de potentiel (désignée V ou U) entre deux points d‟un circuit
électrique par lequel transite un courant électrique est fonction de la résistance/conductance
du circuit : U = R I ou U = I/G
Cette loi d‟ohm s‟applique à de nombreuses situations expérimentales en électrophysiologie :
ex. mesure de la résistance d‟une pipette de patch lorsque celle ci est plongée dans le milieu
extracellulaire, juste avant la réalisation du « giga-seal » (voir plus loin)
Loi de Nernst : Un canal ionique est un conducteur dont le fonctionnement répond à
plusieurs principes. En particulier, 1) Il existe des « portes » biophysiques qui contrôlent son
ouverture et sa fermeture ; 2) tout canal ionique présente une certaine sélectivité pour une
espèce ionique donnée et répond à un gradient électrochimique donné et c‟est l‟asymétrie de
concentration des ions entre les milieux intracellulaire et extracellulaire qui permet leur
passage au travers de la membrane et engendre le courant ionique. En général, l‟intérieur de la
cellule est riche K + alors que le milieu extracellulaire est riche en Na + . Les ions Cl - et Ca 2+
sont également plus concentrés à l‟extérieur de la cellule. Lors de l‟ouverture d‟un canal, le
passage des ions s‟effectue selon le gradient électrochimique de l‟espèce ionique considérée.
Prenons l‟exemple des canaux K + et Na + : pour un potentiel précis, le potentiel d’inversion
12

ou potentiel d’équilibre, il n‟y a pas de diffusion ionique au travers de la membrane. En deça
de ce potentiel, ces ions diffusent vers l‟intérieur de la cellule : on parle de courant entrant.
Au delà de ce potentiel, les ions diffusent vers l‟extérieur de la cellule : on parle de courant
sortant. La valeur du potentiel d‟équilibre (E) d‟un ion donné peut être calculée par
l‟équation de Nernst : E ion = ( RT/ zF ) . Ln ([ion ext ]/[ ion int ])
E ion : Potentiel d‟équilibre R : Constante des gaz parfaits (8.314 joules/mol.degré)
T : Température absolue (273° + °C)
z : Valence de l‟ion
F : Nombre de Faraday (96500 coulombs par valence) Ln : Log népérien (2.303 log 10 )
[ion ext ] et [ ion int ] : concentration extracellulaires et intracellulaires de l‟ion considéré
On peut ainsi calculer le potentiel d‟équilibre pour chaque ion : E K = -80 mV, E Na = +60 mV,
E Ca = + 100 mV (valeurs indicatives).
PROPRIETES GENERALES DES COURANTS IONIQUES.
Le potentiel de repos V M d‟une cellule excitable (par ex. –70 mV) est proche du potentiel
d‟équilibre pour les ions K + , ce qui signifie qu‟au repos la membrane est quasi exclusivement
perméable au K + . Cette caractéristique est dûe à certains canaux K + qui sont ouverts en
permanence et produisent un « courant de fond » : si l‟on amène le potentiel
transmembranaire à une valeur plus positive, l‟intensité du courant K + est plus grande,
favorisant un retour au potentiel de repos. On dit que la membrane se comporte comme une
pile au K + et que le courant K + est un courant repolarisant. A chaque instant, la valeur du
potentiel membranaire dépend de l‟équilibre entre courants dépolarisants et repolarisants.
L‟évolution du potentiel de membrane vers des valeurs plus positives correspond à
l‟activation de courants dépolarisants, c‟est à dire une entrée de charges positives. Par
convention, on dit qu‟un courant est « entrant » lorsque les charges positives transitent de
l‟extérieur vers l‟intérieur de la cellule (et inversement pour un courant sortant). Les ions
Na + et Ca 2+ ont des potentiels d‟équilibre très positifs si bien que dans la gamme de potentiel
physiologique (de –100 mV à +80 mV), l‟ouverture des canaux Na + et Ca 2+ produit un influx
de ces ions dans la cellule qui génère des courants entrants et dépolarisants. Inversement, dans
cette gamme de potentiel (plus positive que le potentiel d‟équilibre aux ions K + ) il se produit
un efflux d‟ions K + lors de l‟ouverture des canaux K + qui génère un courant sortant et
repolarisant. Le mouvement des ions Cl - est également électrogène et régit par la loi de Nernst,
mais attention (il s‟agit d‟une charge négative) : l‟entrée d‟ion Cl - créée un courant sortant, et
inversement.
L‟expression quantitative d‟un courant : son intensité (I en ampère) à un potentiel de
membrane donné (Em), dérive de la voie d‟Ohm : I = G (Em – Eq)
13

ou G est la conductance et Eq le potentiel d‟équilibre
L‟électrophysiologiste aime représenter son canal
favori avec sa courbe courant-potentiel (courbe I-
V). Cette relation I-V dérive de la loi d‟Ohm en
intégrant d‟une part, la composante électromotrice
du courant (I = G (Em – Eq)) et d‟autre part la
voltage-dépendance de l‟activation du canal. Ainsi,
la courbe I-V d‟un courant calcique a une forme
en « V » (voir ci contre) caractéristique indiquant
Activation
-100 -50
Vm (mV)
Cell attached
(canal unique) :
Inside-out
Courbe courant potentiel :
0.5
1
I (nA)
le seuil d‟activation et le potentiel d‟inversion Eq du courant. Il est important de noter,
toutefois, que la valeur du potentiel d‟inversion (~ +50 mV) reste éloigné du potentiel
d‟équilibre théorique pour l‟ion Ca 2+ (~ +130 mV). A ce jour, la raison du décalage entre
potentiel d‟inversion et d‟équilibre pour les canaux calciques n‟est pas identifié, ces canaux
étant hautement sélectifs pour les ions Ca 2+ .
L’ENREGISTREMENT DE COURANTS IONIQUES.
L‟activité électrique d‟une cellule excitable au cours du temps dépend des courants ioniques
qui modulent, et sont modulés en retour, par le potentiel membranaire. Mesurer ces courants
ioniques nécessite un contrôle du potentiel membranaire. On enregistre les courants ioniques
en utilisant la technique de voltage imposé (voltage-clamp). Cette approche consiste à utiliser
un amplificateur opérationnel pour contrôler en permanence le potentiel de membrane afin
d‟enregistrer le courant ionique à l‟état stationnaire. Différentes approches techniques
permettent des mesures en voltage imposé : simple microélectrode, double microélectrodes et
bien sur le patch-clamp… Certaines techniques permettent d‟enregistrer l‟activité électrique
sur des préparations multicellulaires. Je présenterai ici uniquement la technique de patchclamp
qui permet la mesure de courants ioniques à l‟échelon de la cellule unique.
Le patch-clamp (voir ci contre) est la
technique la plus performante pour enregistrer
les courants ioniques cellulaires. Elle consiste
à coller une pipette de verre (borosilicate,
quartz..) sur une cellule. Un gigaseal est
obtenu lorsque l‟on atteint l‟étanchéité ionique
dans cette configuration : la résistance est de
l‟ordre de 10 12 Ω. Cette résistance élevée
permet d‟établir un circuit électrique
connectant le milieu intracellulaire avec le
Whole Cell
(cellule entière)
Outside-out
milieu intra-pipette. La mesure d‟un courant ionique via l‟électrode de la pipette est alors
Eq
+50
14

possible. Lors de la réalisation du gigaseal, seule la microsurface membranaire délimitée par
la pointe de la pipette est électriquement controlée. Cette configuration du patch-clamp est
appelée « cell-attached ». Si un canal est présent sur ce « patch » de membrane, le passage
d‟ions peut-être détecté : on parle alors de courant unitaire (canal unique ou single channel).
Si l‟on casse cette membrane, on permet une continuité électrique entre le milieu intra-pipette
et le compartiment intracellulaire (configuration cellule entière ou whole cell) et l‟activité de
l‟ensemble des canaux de cette cellule peut être mesurée : on parle de courant macroscopique
( ou whole cell recording). D‟autres configurations peuvent être obtenues par le jeu de suction
et de retrait de la pipette : inside-out et outside-out. Ces variantes de la configuration « canal
unique » permettent d‟étudier les propriétés biophysique d‟un canal d‟une façon
complémentaire : en inside-out, la face intracellulaire du canal est dans la chambre
d‟enregistrement ce qui permet d‟étudier les régulations intracellulaires du canal.
Ces différentes configurations peuvent donc être utilisées pour enregistrer des courants
calciques. Il convient toutefois de respecter certaines règles pour ces enregistrements. En
particulier, la composition des milieux intracellulaire et extracellulaire doit être adaptée. Afin
de mesurer un courant calcique, il faut
s‟affranchir des autres conductances, Na + ,
et K + en particulier. En configuration
cellule entière, la substitution du Na +
extracellulaire par du TEA
(tetraethylammonium) et la substitution
du K + intracellulaire par du Cs + est une
possibilité. Des bloqueurs
pharmacologiques et toxines peuvent être
Activation
Mesure du courant calcique :
-30 mV
50 pA
Inactivation
20 ms
-110 mV
Déactivation
également utilisés. Ceci permet d‟enregistrer un courant entrant (vers le bas) qui est porté par
les ions Ca 2+ (voir ci dessus). Les ions Ca 2+ peuvent être substitués par des ions Ba 2+ (Baryum)
ou Sr 2+ (Strontium) qui sont aussi perméants pour les canaux calciques. Une analyse
biophysique des courants calciques peut alors être effectuée. Aux différentes composantes de
ce courant : activation, inactivation, déactivation.. correspondent des changements
conformationnels des canaux (Fermé – Ouvert – Inactivés). L‟ensemble des paramètres
d‟enregistrement et d‟analyse des canaux sera présenté et discuté lors de la présentation.
15

NOUVELLES SONDES POUR DETECTER LE CALCIUM
Marc Moreau, Catherine Leclerc et Patrice Thuleau*
Centre de Biologie du Développement, UMR 5547, et GDR 2688, Université Paul Sabatier,
118 route de Narbonne, 31062 TOULOUSE Cedex 4
* UMR CNRS-UPS 5546, et GDR 2688 Pôle de Biotechnologie Végétale, 24, Chemin de
Borde Rouge, BP 42617 Auzeville, 31326 CASTANET-TOLOSAN
Dès 1925 Mc Callum recherchait un indicateur coloré pour visualiser les concentrations
calciques dans les phénomènes physiologiques et la première communication montant les
mouvements de calcium lors du déplacement de l‟amibe fut publiée en 1928 par Pollack. En
1957 Hodgkin mesure à l‟aide de 45 Ca 2+ les mouvements de calcium dans l‟axone géant de
calmar. L‟évolution de nos connaissances sur la signalisation calcique est intimement liée à la
découverte et la purification d‟une protéine luminescente, sensible au calcium, ou
photoprotéine, l‟aequorine, (Shimomura et al. 1962). L‟aequorine a été utilisée par Ridgway
& Ashley quelques années plus tard (Ridgway and Ashley 1967), en tant qu‟indicateur
calcique, pour faire la première mesure de Ca 2+ libre dans la fibre musculaire géante de
balanne.
L‟imagerie restait difficile. Dans les années 80, Roger Tsien a mis au point des sondes
fluorescentes pour quantifier le calcium intracellulaire. Ce fut d‟abord le Quin2 puis le
populaire Fura2. Ces sondes ont permis de décrire les mouvements de calcium avec une très
bonne définition spatio-temporelle et avec une relative facilitée de calibration.
Les sondes permettant de détecter le calcium sont toutes composées d‟un calcium-sensor
couplé à un système de fluorochromes dont les propriétés spectrales varient en fonction de la
liaison avec le calcium. Les sondes bioluminescentes du type aequorine nécessitent l‟adition
d‟un co-facteur. Les sondes chimiques fluorescentes n‟ont pas besoin de cet ajout.
Le fonctionnement et les propriétés de ces différentes sondes peuvent être consultés sur le
site de l’atelier : http://www-calcium.ups-tlse.fr/atelier/archives.php dans les cours 1999,
2000, 2001 et 2004.
Cependant les sondes fluorescentes ne peuvent pas être adressées à des compartiments
déterminés de la cellules (noyau, mitochondrie, membrane…) ou des cellules précises d‟un
organe. De plus des phénomènes de compartimentation et de fuite se surajoutent ce qui rend
leur utilisation très limitée dans le temps. Par exemple, dans les cellules HeLa la
compartimentation du Fluo3 intervient en 10 à 15 minutes seulement.
Depuis quelques années des sondes codées génétiquement sont apparues. Elles s‟expriment
dans les cellules après transfection, peuvent être adressées à différents compartiments et ne
présentent pas de phénomènes de fuite. Elles permettent des mesures à long terme ce qui est
très utile en biologie du développement. Cependant elles ont souvent une moins bonne
dynamique que les sondes classiques. Les nouvelles sondes peuvent détecter les variations de
Ca 2+ , de pH, voire de potentiel de repos des cellules.
Ces sondes sont divisées en 2 catégories les sondes doubles composées de deux sondes
fluorescentes séparées par un linker qui est une calcium binding protéine telle la calmoduline
(sondes caméléons). les sondes simples sont composées d‟une molécule fluorescente souvent
dérivée de la GFP combinée avec une séquence calcium dépendante.
16

LES SONDES CAMELEONS
Les sondes « caméléon » ont été développées dans le groupe de Roger Tsien à San Diego
(Miyawaki et al. 1997). Elles allient les avantages de l‟aequorine, de par leur nature protéique,
avec ceux de la fluorescence. Ce sont des protéines de fusion entre des variantes de la GFP.
Une GFP mutée émettant soit dans le bleu (BFP) soit dans le cyan (CFP) est fusionnée à la
calmoduline (CaM), elle-même reliée au peptide M13 (peptide reconnu par le complexe Ca 2+ -
CaM) ; M13 est enfin fusionné soit à la GFP émettant dans le vert soit à la YFP émettant dans
le jaune. En absence de calcium, la BFP ou la CFP excitée respectivement à 370 ou 440 nm
va émettre une fluorescence à 440 ou 480 nm. En présence de calcium, le complexe Ca 2+ -
CaM va venir s‟associer au peptide M13, ce qui va provoquer un changement
conformationnel de la sonde et un rapprochement des GFP fusionnées. Par un mécanisme de
FRET, l‟émission de fluorescence émise par la BFP ou la CFP permettra d‟exciter
respectivement la GFP ou l‟YFP qui émettra alors à 510 nm ou 535 nm. Le changement de
fluorescence ou plus exactement le rapport de fluorescence mesuré (510/440nm ou
535/480nm) est proportionnel à la quantité de calcium, permettant ainsi un dosage fin de la
concentration de l‟ion.
Le phénomène de FRET a été traité dans le cours 2001, 2002, 2003, http://wwwcalcium.ups-tlse.fr/atelier/archives.php
La première génération de protéines caméléon synthétisées (Miyawaki et al. 1997) est
apparue néanmoins peu fiable. En effet, elles se sont rapidement avérées sensibles au pH et au
chlore. Une nouvelle série de sondes a été par la suite élaborée par une fusion entre la CFP et
une YFP modifiée, ayant subi deux mutations (V68L et Q69K). Cette nouvelle sonde, appelée
« yellow cameleon » 2.1 (YC 2.1), s‟avère insensible aux variations de pH cytosolique
(Miyawaki et al. 1999). Il existe aussi des protéines caméléon (YC3 et YC4) possédant une
plus faible affinité pour le calcium, capables de mesurer des variations de calcium au niveau
du réticulum endoplasmique (Miyawaki et al. 1999). Une nouvelle protéine caméléon, YC6.1
a été mise au point (Truong et al. 2001) en utilisant les propriétés du complexe CaM associé
au peptide CKKp (CaM-dependent kinase kinase, (Osawa et al. 1999)). Ainsi, la structure de
YC6.1 permet d‟améliorer l‟efficacité du FRET d‟un facteur 2 contre 1.6 pour YC2.1. La
sonde YC6.1 permet de suivre les variations de calcium induites par l‟histamine dans des
cellules HeLa et dans des neurones d‟hippocampe par le glutamate (Truong et al. 2001).
Céline Gohory vous présentera les applications avec cette sonde.
De par leur nature protéique, les sondes caméléon peuvent être introduites dans des
organismes vivants par génie génétique et être adressées à un organite ou un compartiment
donné. Par ailleurs, elles présentent des avantages supplémentaires. En effet, au delà du fait
qu‟elles permettent des mesures ratiométriques comme certaines sondes fluorescentes,
l‟intérêt de ces protéines caméléon par rapport à l‟aequorine est d‟une part qu‟elles ne
nécessitent pas de reconstitution, d‟autre part qu‟elles génèrent une quantité de lumière
(fluorescence) suffisante pour envisager des mesures et de l‟imagerie à l‟échelle d‟une cellule
unique (l‟aequorine n‟émet qu‟un photon, lors de la liaison avec le calcium).
Dans le domaine animal, l‟utilisation de ces sondes (YC2, YC4), adressées au réticulum
endoplasmique et aux mitochondries a permis de confirmer et d‟approfondir le rôle des
mitochondries dans le contrôle du remplissage en calcium du réticulum, la création de
domaines à forte concentration en calcium du réticulum et la génération des oscillations
calciques cytosoliques (Arnaudeau et al. 2001; Arnaudeau et al. 2002).
17

La sonde caméléon YC2.1 a été introduite chez le ver Caenorhabditis elegans sous le
contrôle de promoteurs spécifiques permettant l‟expression de cette sonde soit dans les
muscles du pharynx soit dans les neurones (Kerr et al. 2000). Il existe aussi plusieurs lignées
de drosophile exprimant YC2.1 au niveau des neurones de projection (Diegelmann et al.
2002; Fiala et al. 2002) et au niveau des neurones thermosensibles chez la larve (Liu et al.
2003). Ces organismes transgéniques pour YC2.1 ouvrent la possibilité de réaliser in vivo des
études de comportement (i.e ; apprentissage des odeurs chez la drosophile) tout en bénéficiant
des nombreux mutants identifiés chez ces deux organismes.
Chez les végétaux, Gethyn Allen dans le groupe de Julian Schroeder a récemment exprimé
la sonde caméléon YC 2.1 chez A. thaliana (via A. tumefaciens). Il a ainsi pu mesurer et
visualiser chez cette plante les variations de calcium dans les cellules de garde des stomates,
induites en réponse à différents stimuli, en particulier l‟acide abscissique (ABA). (Allen et al.
1999; Allen et al. 2000; Pei et al. 2000; Allen et al. 2001; Schroeder et al. 2001; Allen et al.
2002).
Grâce à ce système expérimental, Allen et ses collègues ont pu montrer que l‟ABA, le
calcium extracellulaire ainsi que le peroxyde d‟hydrogène (H 2 O 2 ), trois stimuli induisant la
fermeture des stomates, provoquent des oscillations calciques dans les cellules de garde. Par
contre le mutant det 3, chez lequel ces trois signaux ne provoquent pas la fermeture des
stomates, ne présente aucune oscillation calcique. En revanche chez ce dernier, si on génère
artificiellement des oscillations, on peut restaurer la fermeture des stomates (Allen et al.
2000). Par la suite, Allen a pu montrer que la fréquence, le nombre, la durée et l‟amplitude de
ces oscillations calciques étaient importants pour la réponse biologique (Allen et al. 2001).
Enfin, chez un mutant hypersensible à l‟ABA (era1-2) qui présente à de faibles concentrations
en hormone une fermeture accrue des stomates, l‟intensité des oscillations calciques en
réponse à l‟ABA est plus importante en comparaison de celle mesurée chez une plante
sauvage (Allen et al. 2002).
Ces données suggèrent que les cellules de garde sont capables de décoder l‟information
portée par les oscillations calciques pour répondre de manière appropriée au stimulus initial.
Il est à attendre que d‟autres travaux utilisant ces sondes caméléon devraient dans le futur
apporter encore de nouveaux éclairages sur l‟importance de la signalisation calcique chez les
végétaux.
LES PERICAMS
Les sondes caméléon présentent toutefois un inconvénient : leur faible dynamique. En
effet, en présence de calcium l‟intensité de fluorescence augmente seulement d‟un facteur 1.6
à 2, respectivement pour YC2.1 et YC6.1. Dans le but d‟améliorer leur dynamique, plusieurs
groupes ont mis au point un autre type de sonde calcique utilisant une seule GFP. Ces sondes
appelées Camgaroo (Baird et al. 1999), Pericam (Nagai et al. 2001) ou G-CaMP (Nakai et al.
2001) sont conçues sur le principe d‟une GFP circularisée (cpGFP) par permutation de la
partie N et C terminale de la GFP (Baird et al. 1999).
On distingue les flash pericams qui présentent une augmentation de fluorescence lorsque
la [Ca 2+ ] i croit et les inverse pericams qui fournissent une diminution de fluorescence lorsque
la [Ca 2+ ] i augmente. Les ratiometric pericams permettent une excitation à deux longueurs
d‟onde et une calibration précise.
Toutes ces nouvelles sondes présentent une dynamique allant de 7 à 10, ce qui est
nettement supérieur aux sondes caméléon mais qui reste encore très inférieur aux sondes
fluorescentes classiques comme le fluo3 dont la dynamique est de 40. Deux inconvénients
18

dans l‟utilisation de ces sondes sont à signaler, leur sensibilité vis-à-vis du pH et le repliement
de la cpGFP qui nécessite une température inférieure à 37°C. Très récemment, la protéine
fluorescente sensible au calcium, G-CaMP a toutefois permis de réaliser une cartographie du
cerveau de la mouche Drosophila melanogaster en réponse aux odeurs (Wang et al. 2003).
LES NOUVEAUX CALCIUM SENSORS
Les caméléons à base de CaM posent problème car souvent la CaM interagit avec la
machinerie cellulaire en particulier avec les CaM endogènes rendant la sonde inefficace. Les
troponeons constituent un système plus neutre. La troponine C, (calcium sensor des muscles
squelettiques et cardiaques) remplace la partie CaM. La troponine C se lie avec peu de
proteines endogènes (Heim and Griesbeck 2004).
Les fragments de troponine de muscle squelettique de poulet ou de troponine cardiaque
humaine sont insérés entre la CFP et la citrine ce qui donne des des S-troponeons ou des C-
troponeons. Il n‟y a pas besoin de rajouter le segment M13. La réponse est une réaction FRET
avec une affinité comprise entre 0.5 et 1.2 µM. Il existe un mutant basse affinité de 30 µM.
les troponéons ont une dynamique conservée lorsqu‟ils sont adressés à la membrane à l‟aide
d‟une fusion avec la synaptobrevin alors que les caméléons ont une dynamique diminuée dans
les mêmes conditions. Les troponeons se comportent mieux que les caméléons lorsqu‟ils sont
adressés à des domaines subcellulaires.
D‟autre part, R. Tsien vient de faire une nouvelle sonde en fabricant une calcium binding
molecule n‟interférant pas avec les protéines endogènes. Il replace dans le module CaM, 4
résidus basiques par 4 résidus acides. Ce mutant MLCK permet de réduire 10 000 fois
l‟affinité pour la CaM native. La nouvelle sonde CaM/MLCK a été insérée dans une caméléon
YC3.3, la sonde résultante, appelée D1, répond par FRET de la même manière que la
caméléon. Le FRET n‟est pas affecté par l‟addition de CaM. La dissociation avec le calcium
est accrue. Ces sondes YC peuvent être utilisées en microscopie bi –photonique.
ORGANISMES TRANSGENIQUES
Les premiers succès animaux ont été obtenus chez les invertébrés : la drosophile et
Coenorabditis elegans. Chez les mammifères les résultats sont plus mitigés sans doute en
raison d‟interactions des caméléons avec des protéines endogènes. Par contre on peut faire des
transfections transitoires par électroporation : par exemple, dans le muscle, les caméleons
peuvent rester fonctionnelles pendant 3 semaines.
Des souris transgéniques pour les pericams inverses et les camgaroo ont été réalisées sous
contrôle d‟un promoteur tétracycline. La sonde était exprimée dans le système nerveux. Des
mesures ont pu être faites sur des animaux âgés de 8 à 12 semaines. Les changements in vivo
sont cependant plus faibles que ceux observés sur les cultures de cellules (Hasan et al. 2004).
Chez les plantes, la caméléons sont assez utilisés.
Pensez à consulter Catherine Leclerc et Patrice Thuleau, fascicule 2002, http://wwwcalcium.ups-tlse.fr/atelier/archives.php
Bibliographie
Allen GJ, Murata Y, Chu SP, Nafisi M, Schroeder JI (2002) Hypersensitivity of abscisic acid-induced cytosolic
calcium increases in the Arabidopsis farnesyltransferase mutant era1-2. Plant Cell 14(7): 1649-1662.
Allen GJ, Kwak JM, Chu SP, Llopis J, Tsien RY et al. (1999) Cameleon calcium indicator reports cytoplasmic
calcium dynamics in Arabidopsis guard cells. Plant J 19(6): 735-747.
19

Allen GJ, Chu SP, Harrington CL, Schumacher K, Hoffmann T et al. (2001) A defined range of guard cell
calcium oscillation parameters encodes stomatal movements. Nature 411(6841): 1053-1057.
Allen GJ, Chu SP, Schumacher K, Shimazaki CT, Vafeados D et al. (2000) Alteration of stimulus-specific guard
cell calcium oscillations and stomatal closing in Arabidopsis det3 mutant. Science 289(5488): 2338-
2342.
Arnaudeau S, Kelley WL, Walsh JV, Jr., Demaurex N (2001) Mitochondria recycle Ca(2+) to the endoplasmic
reticulum and prevent the depletion of neighboring endoplasmic reticulum regions. J Biol Chem
276(31): 29430-29439.
Arnaudeau S, Frieden M, Nakamura K, Castelbou C, Michalak M et al. (2002) Calreticulin differentially
modulates calcium uptake and release in the endoplasmic reticulum and mitochondria. J Biol Chem
277(48): 46696-46705.
Baird GS, Zacharias DA, Tsien RY (1999) Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent
proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 96(20): 11241-11246.
Diegelmann S, Fiala A, Leibold C, Spall T, Buchner E (2002) Transgenic flies expressing the fluorescence
calcium sensor Cameleon 2.1 under UAS control. Genesis 34(1-2): 95-98.
Fiala A, Spall T, Diegelmann S, Eisermann B, Sachse S et al. (2002) Genetically expressed cameleon in
Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons. Curr Biol
12(21): 1877-1884.
Hasan MT, Friedrich RW, Euler T, Larkum ME, Giese G et al. (2004) Functional fluorescent Ca2+ indicator
proteins in transgenic mice under TET control. PLoS Biol 2(6): e163.
Heim N, Griesbeck O (2004) Genetically encoded indicators of cellular calcium dynamics based on troponin C
and green fluorescent protein. J Biol Chem 279(14): 14280-14286.
Kerr R, Lev-Ram V, Baird G, Vincent P, Tsien RY et al. (2000) Optical imaging of calcium transients in
neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron 26(3): 583-594.
Liu L, Yermolaieva O, Johnson WA, Abboud FM, Welsh MJ (2003) Identification and function of
thermosensory neurons in Drosophila larvae. Nat Neurosci 6(3): 267-273.
Miyawaki A, Griesbeck O, Heim R, Tsien RY (1999) Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using
improved cameleons. Proc Natl Acad Sci U S A 96(5): 2135-2140.
Miyawaki A, Llopis J, Heim R, McCaffery JM, Adams JA et al. (1997) Fluorescent indicators for Ca2+ based on
green fluorescent proteins and calmodulin. Nature 388(6645): 882-887.
Nagai T, Sawano A, Park ES, Miyawaki A (2001) Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to
sense Ca2+. Proc Natl Acad Sci U S A 98(6): 3197-3202.
Nakai J, Ohkura M, Imoto K (2001) A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent
protein. Nat Biotechnol 19(2): 137-141.
Osawa M, Tokumitsu H, Swindells MB, Kurihara H, Orita M et al. (1999) A novel target recognition revealed
by calmodulin in complex with Ca2+-calmodulin-dependent kinase kinase. Nat Struct Biol 6(9): 819-
824.
Pei ZM, Murata Y, Benning G, Thomine S, Klusener B et al. (2000) Calcium channels activated by hydrogen
peroxide mediate abscisic acid signalling in guard cells. Nature 406(6797): 731-734.
Ridgway EB, Ashley CC (1967) Calcium transients in single muscle fibers. Biochem Biophys Res Commun
29(2): 229-234.
Schroeder JI, Kwak JM, Allen GJ (2001) Guard cell abscisic acid signalling and engineering drought hardiness
in plants. Nature 410(6826): 327-330.
Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y (1962) Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent
protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol 59: 223-239.
Truong K, Sawano A, Mizuno H, Hama H, Tong KI et al. (2001) FRET-based in vivo Ca2+ imaging by a new
calmodulin-GFP fusion molecule. Nat Struct Biol 8(12): 1069-1073.
Wang JW, Wong AM, Flores J, Vosshall LB, Axel R (2003) Two-photon calcium imaging reveals an odorevoked
map of activity in the fly brain. Cell 112(2): 271-282.
20

APPLICATION : ETUDE D’UNE VOIE DE SIGNALISATION CALCIQUE DANS LE
FOLLICULE PILEUX HUMAIN AVEC LA SONDE CAMELEON YC6.1
Céline GOHORY
Centre de Biologie du Développement, UMR 5547, Université Paul Sabatier, 118 route de
Narbonne, 31062 Toulouse Cedex 4
Nous avons testé les performances de la sonde caméléon YC6.1 (Truong et al, 2001).
Cette sonde est constituée de deux GFP modifiées (CFP et YFP), et de deux fragments de
calmoduline reliés par le peptide CKKp (CaM – dependent kinase kinase, Osawa et al, 1999).
Cette sonde permet, lorsqu‟elle fixe le calcium un phénomène de FRET (Fluorescence
Resonance Energy Transfer) entre CFP et YFP. Le rapport de fluorescence YFP / CFP permet
de mesurer la concentration intracellulaire en calcium.
La sonde est introduite par transfection. Le protocole de transfection ainsi que la
fonctionnalité de la sonde ont tout d‟abord été testés sur des cellules Hela (lignée cellulaire de
kératinocytes issue d‟un cancer des ovaires humain). La lipofectine (Invitrogen) est utilisée
comme agent transfectant.
Les cellules sont cultivées dans un milieu D - MEM (Milieu de Eagle modifié par
Dulbecco) à forte teneur en glucose (Gibco) supplémenté de facteurs de croissance et
d‟antibiotiques.
Dès que les cellules atteignent un pourcentage de confluence suffisant (de l‟ordre de
70%), elles sont transfectées (4µg d‟ADN) à l‟aide de la lipofectine selon le protocole
Invitrogen. Les mesures peuvent être réalisées 24 heures après la transfection.
Les cellules sont alors transférées dans un milieu non autofluorescent préparé au
laboratoire : le KRH (Krebs Ringer Hepes Buffer) dont la composition est la suivante : KCl
5mM, MgSO 4 1.25 mM, NaCl 125 mM, Hepes 25 mM, Glucose 8 mM, KH 2 PO 4 1.25 mM, et
CaCl 2 1.5 mM. L‟imagerie est réalisée sur un microscope inversé à épifluorescence (Nikon
Eclipse TE2000 – E, objectif à immersion x63 N.A. : 1.4). L‟enregistrement des mouvements
de calcium est effectué grâce à une caméra triCCD et le logiciel Aquacosmos 2.5 (système
Ashura commercialisé par la société Hamamatsu). Une addition de 10 µM d‟histamine dans
le milieu extérieur entraîne une libération de calcium à partir des stocks internes. Dans de
nombreux cas nous observons des oscillations de la concentration en calcium intracellulaire
pouvant durer plus de 10 minutes.
Cette validation nous a permis d‟étudier le rôle prépondérant joué par une voie de
signalisation calcique dans le développement du follicule pileux humain.
A l‟heure actuelle, aucun traitement pour palier la chute de cheveux ne donne entière
satisfaction, il est donc important de comprendre quels sont tous les mécanismes moléculaires
mis en jeu lors du cycle pilaire. Il a été démontré que la protéine noggin, antagoniste des
BMPs joue un rôle dans ce cycle en participant à l‟initiation de la phase de croissance du poil
(Botchkarev et al, 2001). Or, il a été démontré dans notre équipe que noggin était capable
d‟induire une augmentation de calcium intracellulaire dans les cellules de l‟ectoderme lors de
la détermination neurale chez le xénope (Leclerc et al, 1997). Nous avons donc voulu
analyser l‟effet de noggin dans des cellules du follicule pileux humain lors de la phase de
croissance du cheveu (phase anagène).
A partir de biopsies de cuirs chevelus, nous avons effectué des microdissections de
follicules pileux en phase de croissance afin de prélever les principaux tissus qui le composent
pour réaliser des primo – cultures de cellules de plusieurs types :
21

des cellules de la papille dermique du follicule pileux humain (fibroblastes). La
papille dermique se situe à l‟extrémité de la racine du poil et lui apporte tous
les éléments nutritifs nécessaires à sa croissance
des kératinocytes de la gaine épithéliale externe du follicule pileux humain.
Cette gaine est une continuité de l‟épiderme et contient au niveau du site
d‟insertion du muscle arrecteur des cellules souches du cheveu.
La transfection est réalisée avec la lipofectine pour les kératinocytes. Le JETPEI TM
(Qbiogen) comme agent transfectant donne de meilleurs résultats avec les fibroblastes. Ce
produit est moins toxique et permet une meilleure survie cellulaire.
Les cellules du follicule pileux sont stimulées avec la protéine noggin (1 µg/ml)
produite au laboratoire grâce à une lignée de cellules d‟ovaires de hamster, les CHO – B3.
Nous avons pu mettre en évidence une augmentation intracellulaire de calcium dans le
cytoplasme des cellules du follicule pileux quelques minutes après addition de noggin dans le
milieu. Il reste à déterminer le rôle crucial que pourrait jouer le calcium dans le cycle pilaire à
la suite de l‟intervention de noggin.
Bibliographie
Kevin Truong, Asako Sawano, Hideaki Mizuno, Hiroshi Hama, Kit I. Tong, Tapas Kumar Mal, Atsushi
Miyawaki and Mitsuhiko Ikura : FRET – based in vivo Ca2+ imaging by a new calmodulin – GFP fusion
molecule. Nat. Struct. Biol. 2001 dec ; 8(12) : 1069 – 1073
Masanori Osawa, Hiroshi Tokumitsu, Mark B. Swindells, Hiroyuki Kurihara, Masaya Orita, Tadao Shibanuma,
Toshio Furuya and Mitsuhiko Ikura : A novel target recognition revealed by calmodulin in complex with Ca2+calmodulin
dependent kinase kinase. Nat. Struct. Biol. 1999 Sep ; 6 (9) : 819 -24.
V. A. Botchkarev, N. V. Botchkareva, M. Nakamura, O. Huber, K. Funa, R. Lauster, R. Paus and B. A.
Gilchrest : Noggin is required for induction of the hair follicle growth phase in postnatal skin : FASEB J. 2001
Oct ; 15(12) : 2205 - 14.
Leclerc C. , Daguzan C. , Nicolas MT. , Chabret C. , Duprat AM. , Moreau M. , : L – Type calcium channel
activation controls the in vivo transduction of the neuralizing signal in the amphibian embryos. Mech. Dev. 1997
Jun ; 64 (1-2) : 105 - 10
22

ASHURA : LE FRET PAR HAMAMATSU UTILISATION D’UNE CAMERA TRI-
CCD ORIGINALE POUR L’ANALYSE DU FRET EN TEMPS REEL
Bruno Combettes
Hamamatsu Photonics France rue du saule trapu, parc du moulin de Massy, BP 229 91882
MASSY Cedex
Caméra tri-CCD
CYR
prism
Nouveau prisme : Cyan, Yellow, Red
23

Emission
Pas de signal accepteur sur le capteur ‘donneur’
Monitoring en temps réel du bleaching de l‟accepteur (cube YFP) sur le capteur magenta:
quand accepteur ~ 0 , triggering de la mesure du donneur (sans accepteur)
Efficacité du FRET : E = 1 – d‟/d
d’ : donneur avec accepteur (avant bleaching)
d : donneur sans accepteur (après bleaching)
24

CALCIUM ET SIGNALISATION NOD
Jean-Jacques Bono
Surfaces Cellulaires et Signalisation chez les Végétaux, UMR 5546 CNRS-UPS, Pôle de
Biotechnologie Végétale, 24 chemin de Borde Rouge BP 42617 Auzeville, 31326 Castanet-
Tolosan
INTRODUCTION :
Les plantes de la famille des Légumineuses sont capables d‟établir une relation
symbiotique avec les bactéries du sol du genre Rhizobium. La symbiose se caractérise par la
présence d‟organes particuliers, situés au niveau de la racine, appelés nodule ou nodosités au
sein desquels la bactérie réduit l‟azote atmosphérique en ammoniac, assimilable par la plante.
En contre partie, la plante fournit à son symbiote une niche écologique et les substrats
carbonés issus de la photosynthèse, nécessaires à son métabolisme. Une des propriétés
fondamentales de la symbiose Rhizobium/Légumineuses est sa spéficité d‟interaction. En effet
une bactérie donnée ne peut noduler qu‟un nombre limité de légumineuses (parfois un seul
genre) et réciproquement. L‟établissement de cette reconnaissance spécifique résulte d‟un
dialogue moléculaire entre les deux partenaires schématisé sur la Figure 1.
Plante-hôte
( Medicago truncatula )
Flavonoides
Rhizobium
( Sinorhizobium meliloti )
Nod
D
* *
nodD
gènes nod structuraux
Formation du Nodule
Facteurs Nod
Figure 1 : La symbiose Rhizobium/Légumineuses : un dialogue moléculaire entre la plante et
la bactérie
Dans un premier temps, la plante produits des exsudats racinaires contenant des
flavonoïdes, qui, perçus par la bactérie, vont activer la transcription de gènes particuliers : les
génes nod. Ces gènes, sont responsables de la biosynthèse d‟un composé appelé facteur de
nodulation ou facteur Nod, qui, en retour, va déclencher chez la plante le programme
d‟organogenèse conduisant à la formation du nodule. Les facteurs Nod, isolés de différentes
espèces de Rhizobiacées, possèdent tous la même structure de base : ce sont des lipochitooligosaccharides
constitués d‟un squelette d‟oligochitine de 3 à 5 résidus de N-acétylglucosamine,
acylé à l‟extrémité non réductrice par un acide gras. La nature de la chaîne
grasse (longueur et degré d‟insaturation) et la présence de substituants chimiques sur le
squelette d‟oligochitine sont caractéristiques d‟une espèce bactérienne donnée et déterminent
25

la spécificité d‟interaction entre la bactérie et sa plante hôte (Dénarié et al., 1996). La
structure générale et la diversité des substitutions des facteurs Nod sont illustrées Figure 2.
Cb O
Cb O
O Ac , Cb
CH 2 O
O
O
N- Me
HO
CH 2
OH
O
NH
CO
CH n=1 à 3
3
O
Ara O
Fuc (Me, Ac , S)
Ara
Ac
O S
CH 2
O
NH
CO
CH
3
OH
C16:0, C16:1, C16:2
C18:1, C18:4
Figure 2 : Structure générale des Facteurs Nod et diversité des substitutions ; Ac, acétyl ; Ara,
arabinosyl ; Cb, carbamoyl ; Fuc, fucosyl ; Me, méthyl ; S, sulfuryl.
Les facteurs Nod sont des molécules extrêmement actives susceptibles d'induire, à de très
faibles concentrations (nano- à picomolaires) des réponses variées dans différents tissus de
l‟hôte, comparables à celles provoquées par la bactérie lors des phases de l‟interaction
symbiotique : réorganisation du cytosquelette des poils absorbants, induction de gènes
symbiotiques végétaux appelés nodulines, mitoses et formation de primordium nodulaires
dans le cortex (Cullimore et al., 2001). Le problème du mode de perception des facteurs Nod
et des voies de signalisation associées, est donc posé. Ces dix dernières années, les recherches
entreprises dans ce domaine, sur le couple Sinorhizobium meliloti-Medicago truncatula ont
permis (i) de mettre en évidence une voie de signalisation Nod et d‟identifier les gènes la
contrôlant, (ii) de montrer l‟intervention de l‟ion calcium à différents niveaux de cette voie.
LA VOIE DE SIGNALISATION NOD :
Les fluctuations calciques :
L‟application de facteurs Nod à des racines provoque deux types de variations
ioniques au niveau des poils absorbants : un influx rapide de Ca 2+ , dans la minute suivant
l‟application, suivi de variations calciques oscillatoires, localisées au niveau péri-nucléaire,
intervenant une dizaine de minutes après traitement et se poursuivant pendant 30 à 45
minutes.
L‟influx rapide de calcium :
A l‟aide de micro-électrodes sélectives, Felle et al (1998, 1999) ont mesuré un influx
rapide de calcium, suivi d‟une sortie de Cl - , de K + et d‟une alcalinisation du cytoplasme. Ces
mouvements ioniques sont à l‟origine de la dépolarisation membranaire qui avait été décrite
initialement comme le premier événement associé à la perception des facteurs Nod (Ehrhardt
et al., 1992). Cet influx rapide de Ca 2+ a également été mesuré à l‟aide de sondes calciques
fluorescentes (oregon green, calcium green) qui ont permis d‟apporter des informations
spatiales (Shaw and Long, 2003). Ainsi, au sein des poils absorbants en croissance, le calcium
26

se répartit selon un gradient orienté de l‟apex à la base. L‟addition de facteurs Nod à des
concentrations relativement élevées (10 nM), accentue ce gradient et provoque une vague
calcique en direction du noyau, situé en position basale. Les données obtenues sembleraient
indiquer qu‟au cours de cette phase, les variations calciques feraient intervenir du calcium
d‟origine extracellulaire mais provenant également de pools internes comme le suggère, au
niveau des poils absorbants, la présence de zones ou la concentration en Ca 2+ est très élevée.
Figure 3 : Distribution spatiale des
variations calciques au niveau d‟un poil
absorbant, visualisées à l‟aide de
calcium green, après un traitement par
les facteurs Nod (10 nM).
(A) : influx rapide de Ca2+
(B) : oscillations calciques
Cinétique des variations détectées au
niveau de l‟apex, d‟une zone
intermédiaire et du noyau (C et D).
Code couleur : bleu, vert, jaune
correspondant à des concentrations
croissantes.
D‟après Shaw et Long, (2003).
Les oscillations calciques:
Les oscillations calciques (Ca 2+ spiking), sont observées en réponse à un traitement par les
facteurs Nod pour des concentrations dix fois plus faibles (1 nM) que celles provoquant
27

l‟influx rapide. Elles sont localisées dans la région périnucléaire et se propagent en direction
de l‟apex (Fig. 3B). Le signal se décompose en une phase d‟élévation très rapide de la
concentration en Ca 2+ , suivie d‟un retour progressif à l‟état initial (Fig. 3D). Ce schéma biphasique
pourrait correspondre à l‟ouverture d‟un canal calcique sollicitant un pool interne,
puis à sa fermeture et à un re-pompage actif du calcium vers ce même compartiment ou un
autre. Cette hypothèse est confortée par des données pharmacologiques mettant en évidence
une inhibition des oscillations calciques en présence d‟inhibiteurs de canaux calciques et
d‟une pompe à Ca 2+ de type IIA (Pingret et al., 1998; Engstrom et al., 2002). Les évènements
intervenant durant la période de latence (10 minutes en moyenne) qui sépare l‟influx initial et
les oscillations calciques ne sont pas encore caractérisés. Il est probable que ce temps de
latence corresponde à une modification de l‟homéostasie calcique nécessaire à la mise en
place des variations oscillatoires. Toutefois, l‟influx rapide de calcium et les oscillations
constituent deux évènements indépendants pouvant être découplés. Ainsi, des oligomères de
chitine ou des facteurs Nod modifiés au niveau de la chaîne grasse provoquent des oscillations
mais pas d‟influx rapide de Ca 2+ (Walker et al., 2000). Inversement, chez M. truncatula,
certains mutants de nodulation répondent au traitement facteurs Nod par un flux rapide de
Ca 2+ qui n‟est pas suivi d‟oscillations calciques (Shaw et Long, 2003). L‟ensemble de ces
données suggèrent donc que les deux types de variations calciques sont associés à des voies
de signalisation cellulaires différentes mais faisant probablement intervenir des éléments
communs. Les oscillations calciques sont impliquées dans différents processus
physiologiques. Dans plusieurs cas, la réponse biologique peut être modulée en fonction de
l‟amplitude et/ou la fréquence des oscillations. Par analogie, les oscillations calciques
pourraient transduire, vers les étapes en aval, l‟information initiale codée lors de la perception
du facteur Nod,.
Les protéines de la voie de signalisation Nod :
La symbiose constitue un modèle d‟étude remarquable en terme de signalisation
cellulaire végétale car elle représente l'unique exemple d'organogenèse (formation du nodule),
où le composé morphogène (facteur Nod) a été identifié. Son caractère facultatif pour la
plante a permis de générer des mutants et de sélectionner, à l'aide d'un crible simple (absence
de nodules), ceux affectés dans le processus de nodulation. Ainsi, l‟approche génétique a
permis d‟identifier chez M. truncatula quatre gènes (DMI1, DMI2, DMI3 et NFP), impliqués
dans les étapes précoces de signalisation par les facteurs Nod et nécessaires aux réponses
symbiotiques telles que: la déformation des poils absorbants racinaires, l‟expression de gènes
de nodulines et la division des cellules corticales (Catoira et al., 2000). Il a été ainsi possible
d‟ordonner ces gènes par rapport à ces réponses morphologiques et cellulaires, en incluant les
variations calciques, et de proposer un modèle de voie de signalisation schématisée Fig.4. De
façon inattendue, les plantes affectées dans les gènes DMI1, DMI2 et DMI3 sont également
incapables d‟établir une interaction symbiotique avec les champignons mycorrhiziens,
suggérant l‟existence de voies de signalisation communes intervenant dans la mise en place
des deux symbioses. Récemment les gènes DMI1, DMI2, DMI3 et NFP ou leurs orthologues
chez d‟autres légumineuses ont été clonés. Ils codent respectivement une protéine
membranaire présentant une homologie faible avec un canal cationique (Ané et al., 2004), un
récepteur kinase à domaine extracellulaire LRR (Leucine Rich Repeat) (Endre et al., 2002),
une protéine Kinase Calcium et Calmoduline dépendante (Levy et al., 2004), un récepteur
kinase à domaine extracellulaire présentant des motifs LysM (Lysin Motif) connus pour
interagir avec les glycanes (Radutoiu et al., 2003).
28

Signal Myc?
Récepteur Myc?
DMI1
DMI2
DMI3
Facteur Nod
Récepteur Nod?
NFP
Influx calcique
Has
Oscillations calciques
Hab
Myc
NSP
ENOD11
Ccd
ENOD40
HCL
Nod
Figure 4 : Modèle hypothétique de la voie de signalisation Nod. NFP : Nod Factor
Perception ; DMI : Does not Make Infection ; NSP : Nodulation Specific Pathway ; HCL :
Hair Curling ; ENOD : Early Nodulin ; Has : Hair Swelling ; Hab : Hair branching ;
Myc : mycorrhization.
Le phénotype du mutant nfp (absence totale de réponse aux facteurs Nod) et la
présence dans le domaine extracellulaire de la protéine de motifs compatible avec la fonction
biochimique de reconnaissance du squelette oligosaccharidique des facteurs Nod, font de NFP
le récepteur présomptif des facteurs Nod. Un autre gène, LYK3, contrôlant l'infection de la
plante-hôte, récemment identifié, est également prédit pour coder un récepteur kinase à
domaine LysM (LysM-RLK) suggérant des mécanismes de perception complexes à
différentes étapes de l‟interaction symbiotique (Limpens et al., 2003).
La fonction de DMI1 et DMI2 n‟est pas encore connue. L‟étude approfondie de
l‟influx rapide de calcium a révélé des différences entre la plante sauvage et les mutants dmi1
et dmi2 (Shaw and Long, 2003). Chez la plante sauvage, l‟influx est bi-phasique avec un pic
transitoire suivi d‟un plateau pendant environ 5 minutes (Fig.5). Chez dmi1 et dmi2, le
plateau est absent, suggérant que le pic transitoire de calcium joue un rôle dans le phénotype
observé chez ces mutants (Has : gonflement du poil absorbant).
+ Facteur Nod
10 nM
M.t dmi1
Temps (min.)
M.t sauvage
M.t sauvage
Figure 5: Caractérisation de l‟influx rapide de Ca 2+ chez M. truncatula sauvage et dmi1
Le fait que les mutants dmi1 et dmi2 soient affectés au niveau des oscillations
calciques indique que DMI1 et DMI2 interviennent dans leur génération. Chez les
29

mammifères, les oscillations calciques sont induites par une signalisation lipidique initiée par
la phospholipase C. Des études pharmacologiques et biochimiques ont permis de mettre en
évidence l‟intervention de la phospholipase C et de la phospholipase D lors de la signalisation
Nod (Pingret et al., 1998; den Hartog et al., 2001). Ainsi des inhibiteurs de phospholipase C
inhibent les oscillations calciques et l‟induction de gènes de nodulines précoces (Engstrom et
al., 2002). Toutefois l‟intervention de DMI1ou DMI2 dans la signalisation lipidique reste à
établir.
Le décodage des oscillations calciques:
Le positionnement de DMI3 en aval des oscillations calciques et le fait que le mutant
correspondant soit affecté dans les étapes ultérieures de signalisation suggère fortement que
cette protéine assure le décodage des oscillations. DMI3 est une protéine kinase Calcium et
Calmoduline dépendante (CCaMK) dont la structure modulaire est shématisée Figure 6. Elle
possède un domaine kinase, un domaine de liaison à la calmoduline, présentant de fortes
homologies avec le domaine de liaison à la calmoduline de la CaMKII des animaux, un
domaine comportant 3 EF-hands présentant une homologie avec la visinine (une calciprotéine
neuronale). Par analogie avec la CaMKII, la CCaMK de M.truncatula serait capable de
percevoir la fréquence des oscillations calciques. Cependant son mécanisme d”action reste à
élucider et notamment les rôles respectifs des domaines visinine et de liaison à la calmoduline
dans la perception des variations calciques et l‟activation de l‟enzyme. En outre, sa
localisation nucléaire laisse entrevoir un rôle de cet organite dans la génération des
oscillations calciques.
Nuclear Localisation
Sequences
calmodulin binding site
N
C
ATP
binding site
serine/threonine
kinase domain
autoinhibitor
domain
EF hands
visinin-like domain
Figure 6: représentation schématique de la CCaMK
En raison de sa présence en un seul exemplaire dans le génome de M.truncatula et de
son intervention dans l‟établissement de la symbiose mycorrhizienne, la CCaMK pourrait
assurer un rôle d‟aiguillage dans le routage des signaux associés aux deux types de symbiose.
Cette hypothèse, séduisante, suppose que l‟interaction avec les champignons mycorrhiziens se
traduirait par la génération d‟une signature calcique différente (en terme de fréquence et/ou
d‟amplitude des oscillations) de celle associée à la voie Nod, qui serait également décodée par
la CCaMK. L‟identification d‟un facteur Myc, molécule signal équivalent au facteur Nod, ou
la détection d‟oscillations calciques associées à la mycorrhization constitueraient des
avancées importantes et permettrait de mettre à l‟épreuve cette hypothèse.
30

CONCLUSION:
L‟approche génétique a permis d‟identifier des gènes clés intervenant dans la voie de
signalisation Nod. Il devient maintenant possible d‟étudier cette voie d‟un point de vue
fonctionnel notamment en relation avec la signalisation calcique. Ainsi les champs de
recherche à explorer concernent notamment les rôles de DMI1 et DMI2 dans la génération des
oscillations calciques et le rôle de DMI3 dans le décodage de ce signal. Par ailleurs,
l‟existence de deux réponses calciques distinctes, nécessitant pour leur induction des
concentrations différentes en facteurs Nod suggère l‟existence de plusieurs récepteurs ou d‟un
système de perception multi-composantes présentant des affinités ou des mécanismes
d‟activation différents.
Bibliographie:
Ané JM, Kiss GB, Riely BK, Penmetsa RV, Oldroyd GE, Ayax C, Levy J, Debellé F, Baek JM, Kalo P,
Rosenberg C, Roe BA, Long SR, Dénarié J, Cook DR (2004) Medicago truncatula DMI1 required
for bacterial and fungal symbioses in legumes. Science, Vol 303, pp 1364-1367
Catoira R, Galera C, de Billy F, Penmetsa RV, Journet EP, Maillet F, Rosenberg C, Cook D, Gough C,
Dénarié J (2000) Four genes of Medicago truncatula controlling components of a Nod factor
transduction pathway. Plant Cell 12: 1647-1666
Cullimore JV, Ranjeva R, Bono JJ (2001) Perception of lipo-chitooligosaccharidic Nod factors in legumes.
Trends Plant Sci 6: 24-30
den Hartog M, Musgrave A, Munnik T (2001) Nod factor-induced phosphatidic acid and diacylglycerol
pyrophosphate formation: a role for phospholipase C and D in root hair deformation. Plant J 25: 55-65
Dénarié J, Debellé F, Prome JC (1996) Rhizobium lipo-chitooligosaccharide nodulation factors: signaling
molecules mediating recognition and morphogenesis. Annu Rev Biochem 65: 503-535
Ehrhardt DW, Atkinson EM, Long SR (1992) Depolarization of alfalfa root hair membrane potential by
Rhizobium meliloti Nod factors. Science 256: 998-1000
Endre G, Kereszt A, Kevei Z, Mihacea S, Kalo P, Kiss GB (2002) A receptor kinase gene regulating
symbiotic nodule development. Nature 417: 962-966
Engstrom EM, Ehrhardt DW, Mitra RM, Long SR (2002) Pharmacological analysis of Nod factor-induced
calcium spiking in Medicago truncatula. Evidence for the requirement of type IIA calcium pumps and
phosphoinositide signaling. Plant Physiol 128: 1390-1401
Felle HH, Kondorosi E, Kondorosi A, Schultze M (1998) The role of ion fluxes in Nod factor signalling in
Medicago sativa. Plant J 13: 455-463
Felle HH, Kondorosi E, Kondorosi A, Schultze M (1999) Elevation of the cytosolic free [Ca2+] is
indispensable for the transduction of the Nod factor signal in alfalfa. Plant Physiol 121: 273-280
Levy J, Bres C, Geurts R, Chalhoub B, Kulikova O, Duc G, Journet EP, Ane JM, Lauber E, Bisseling T,
Dénarié J, Rosenberg C, Debellé F (2004) A putative Ca2+ and calmodulin-dependent protein kinase
required for bacterial and fungal symbioses. Science 303: 1361-1364
Limpens E, Franken C, Smit P, Willemse J, Bisseling T, Geurts R (2003) LysM domain receptor kinases
regulating rhizobial Nod factor-induced infection. Science 302: 630-633
Pingret JL, Journet EP, Barker DG (1998) Rhizobium Nod factor signaling. Evidence for a G proteinmediated
transduction mechanism. Plant Cell 10: 659-672
Radutoiu S, Madsen LH, Madsen EB, Felle HH, Umehara Y, Gronlund M, Sato S, Nakamura Y, Tabata S,
Sandal N, Stougaard J (2003) Plant recognition of symbiotic bacteria requires two LysM receptor-like
kinases. Nature 425: 585-592
Shaw SL, Long SR (2003) Nod factor elicits two separable calcium responses in Medicago truncatula root hair
cells. Plant Physiol 131: 976-984
Walker SA, Viprey V, Downie JA (2000) Dissection of nodulation signaling using pea mutants defective for
calcium spiking induced by Nod factors and chitin oligomers. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 13413-
13418
31

SPHINGOLIPIDES ET SIGNALISATION CALCIQUE CHEZ LES PLANTES : ETAT
DES LIEUX ET PERSPECTIVES
Sylvie Coursol
UMR de Génétique Végétale du Moulon, INRA/CNRS/Université Paris XI/INA-PG, Ferme du
Moulon, 91190 Gif-sur-Yvette, France
Introduction
Si le rôle des glycérophospholipides et de leur dérivés, tels que l‟inositol-1,4,5-
trisphosphate (InsP 3 ), dans la transduction du signal calcique est clairement établi chez les
plantes au même titre que chez les mammifères, l‟importance des messagers dérivés d‟une
autre classe de lipides membranaires, celle des sphingolipides, est reconnue depuis quelques
années seulement.
Le constituant de base des sphingolipides est un amino alcool à longue chaîne, le
sphingoid long-chain base (LCB), dont l‟amidification sur le groupement NH 2 par un acide
gras caractérisé par une chaîne carbonée de longueur et de degré d‟insaturation et
d‟hydroxylation variables, conduit au céramide, le composé de base de tous les sphingolipides
(Fig. 1). Ces derniers sont ensuite obtenus par l‟addition d‟un substituant sur la fonction
alcool primaire du céramide, tel que la phosphorylcholine, le phosphorylinositol ou une
structure saccharidique, ce qui donne naissance respectivement aux sphingomyélines
(spécifiques des mammifères), aux inositolphosphorylcéramides (spécifiques des levures et
des plantes) ou aux glycosphingolipides (pour revues voir Holthuis et al., 2001 ; Futerman et
Hannun, 2004 ; Lynch et Dunn, 2004).
Figure 1. Structure de certains sphingolipides (d’après Futerman et Hannun, 2004). Pour simplifier, les
auteurs n’ont représenté qu’un seul type de LCB (la sphingosine, en bleu) et d’acide gras (l’acide palmitique, en
rouge).
Chez les mammifères, le LCB majoritaire est la sphingosine (Sph, d18:1 4 ) à 18
carbones qui est caractérisée par la présence d‟une double liaison entre les carbones 4 et 5.
Chez les levures, les LCB majoritaires sont la phytosphingosine (phyto-Sph, t18:0) qui
32

S1P lyase
S1P lyase
correspond à une Sph saturée et hydroxylée en position 4, et la dihydrosphingosine (DHS,
d18:0) qui correspond à une Sph saturée. Chez les plantes, les LCB majoritaires présentent la
particularité d‟avoir une double liaison en position 8 : ce sont le 4-hydroxy-8-sphingenine
(t18:1 8 ) et les stéréoisomères E ou Z de la 8-sphingenine (d18:1 8 ) et du 4,8-sphingadienine
(d18:2 4,8 ). Bien que présents en petite quantité dans les sphingolipides, la phyto-Sph et le
DHS sont les LCBs les plus abondants à l‟état libre dans les tissus végétaux. En revanche, la
Sph n‟y est présente qu‟à l‟état de trace (Lynch et Dunn, 2004 ; Coursol et al., 2005).
MAMMIFERES
COMMUN
LEVURE (PLANTES)
Sérine + Palmitoyl-CoA
SPT
Hexadécenal + Ethanolamine-1-P
S1P lyase
3-KétoDHS
KSR
Hexadécenal + Ethanolamine-1-P
S1P lyase
DH-S1P
SphK
DHS
SphK
DH-S1P
SPP
SPP
DH-Cer
CDase
synthase
S1P
Dihydrocéramide
DHS C4 hydroxylase
SphK
SPP
Phytosphingosine
DH-Cer
CDase
Sphingosine
CDase
désaturase
Cer
SPP
SphK
Cer synthase
synthase
Céramide
Phytocéramide
Phyto-S1P
LPP
SMase
SM synthase
IPC synthase
CerK
C1P
Sphingomyéline
Inositolphosphorylcéramide
Glu-Cer
synthase
Glucosylcéramide
Sphingolipides complexes
Sphingolipides complexes
Figure 2. Métabolisme des sphingolipides (adapté de Le Stunff et al., 2002). Chez tous les eukaryotes, la
synthèse des sphingolipides débute au niveau du RE par deux réactions simultanées catalysées par la sérine
palmitoyltransférase (SPT) et la 3-kéto-dihydrosphingosine reductase (KSR), ce qui conduit à la formation d’un
premier LCB, la dihydrosphingosine (DHS). Une fois formée, la DHS a trois routes possibles : elle peut être
phosphorylée pour former de la dihydrosphingosine-1-phosphate (DH-S1P), N-acylée et simultanément
désaturée pour former le céramide (désaturation en position 4 chez les mammifères, en position 4 et/ou 8 chez
les plantes), ou hydroxylée pour former de la phytosphingosine. C1P : céramide-1-phosphate ; CDase :
céramidase ; Cer : céramide ; CerK : céramide kinase ; IPC : inositolphosphorylcéramide ; LPP : lipid
phosphohydrolase ; Phyto-S1P : phytosphingosine-1-phosphate ; S1P : sphingosine-1-phosphate ; SM :
sphingomyéline ; SphK : sphingosine kinase ; SPP : S1P phosphatase.
Chez les mammifères, l‟activité biologiques des sphingolipides réside non seulement
dans les structures les plus complexes comme les glycosphingolipides, mais aussi dans les
produits de leur métabolisme que sont le céramide, la Sph, le céramide-1-phosphate (C1P),
produit de la phosphorylation du céramide par une céramide kinase (CerK), et la sphingosine-
1-phosphate (S1P), produit de la phosphorylation de la Sph par une Sph kinase (SphK) (Fig.
1-2). Au cours des années 1990, ces métabolites ont émergé comme les représentants d‟une
nouvelle classe de messagers lipidiques régulant de nombreux processus biologiques, tels que
la différentiation, la prolifération, l‟apoptose, la survie cellulaire et la concentration en
calcium libre intracellulaire ([Ca 2+ ] i ), selon le type cellulaire et la nature du stimulus
33

considérés (pour revues voir Hannun et Obeid, 2002 ; Spiegel et Milstien, 2003 ; Gómez-
Muňoz, 2004 ; Futerman et Hannun, 2004). La S1P présente la particularité de pouvoir agir, à
la fois hors de la cellule comme un ligand spécifique de cinq récepteurs de surface couplés à
des protéines G hétérotrimériques (S1P 1-5 ) et au sein de la cellule comme second messager. Il
a ainsi été montré que l‟interaction de la S1P avec S1P 2 , S1P 3 ou S1P 4 pouvait conduire à une
augmentation de la [Ca 2+ ] i via la voie bien connue de la phospholipase C (PLC), mais aussi
via des voies indépendantes de la PLC, telles que celle de la SphK/S1P. Néanmoins, la S1P
agit aussi de façon intracellulaire pour augmenter la [Ca 2+ ] i , en stimulant soit un influx de
calcium capacitif I CRAC , soit une libération de calcium du réticulum endoplasmique (RE), effet
médié par un récepteur non encore identifié, distinct des récepteurs InsP 3 et ryanodine (pour
revue voir Meyer zu Heringdorf, 2004).
Chez les plantes, des données récentes sont en faveur de l‟implication des
sphingolipidiques et de leurs dérivés dans la transduction du signal calcique. Dans ce contexte,
l‟objet de cette courte revue est de faire le point sur les connaissances actuelles dans ce
domaine chez les plantes.
1- Variation de la [Ca 2+ ] i dans les cellules d’Arabidopsis thaliana en réponse au C 2 -
céramide : rôle dans la mort cellulaire programmée
Tout au long de la vie des plantes, différents types cellulaires ou organes sont éliminés
au moment approprié, au profit de l‟organisme et de la population, et constituent des modèles
de mort cellulaire programmée (PCD, programmed cell death ; pour revue voir Lam, 2004).
La PCD est un phénomène essentiel retrouvé chez pratiquement toutes les formes de vie et
impliquant tout processus de mort cellulaire actif. Ainsi, la germination, la différentiation, la
croissance, la reproduction et le développement des graines impliquent la PCD. Par ailleurs,
les plantes ont aussi recours à la PCD pour s‟adapter et résister aux conditions adverses de
leur environnement, comme le manque de nutriments, les températures extrêmes, l‟hypoxie et
la réponse hypersensible (HR, hypersensitive response) qui survient chez les plantes
résistantes à un pathogène viral, bactérien ou fongique.
Chez les mammifères, l‟apoptose est une forme particulière de PCD qui passe par des
modifications morphologiques et biochimiques précises. Des différences majeures entre
l‟apoptose et la PCD végétale peuvent être dégagées, comme le rôle majeur de la vacuole et
l‟absence de la fragmentation du noyau, de la formation de corps apoptotiques engloutis par
les cellules avoisinantes, de séquences homologues aux caspases et aux membres de la famille
de BCL-2, et, dans plusieurs cas, de la dégradation internucléosomale de l‟ADN produisant
les fameuses échelles sur gel d‟agarose. Néanmoins, plusieurs similarités, comme la
condensation du cytoplasme, l‟activation de protéases et de nucléases, la dégradation de
l‟ADN nucléaire en gros fragments et l‟implication de la mitochondrie, des formes activées de
l‟oxygène (ROS, reactive oxygen species) et du calcium, suggèrent que certaines voies de
régulation sont évolutivement conservées entre ces deux règnes.
Dans ce contexte, le céramide fait figure de médiateur dans l‟arrêt de la croissance
cellulaire et l‟apoptose chez les mammifères. A l‟opposé du céramide, la S1P apparaît être un
régulateur positif universel pour la prolifération et la survie de nombreuses lignées cellulaires
de mammifères. Cuvillier et al. (1996) ont introduit le concept suivant : la balance entre les
taux intracellulaires du céramide et de la S1P (le « biostat sphingolipidique » ou « réhostat
céramide/S1P ») représente un facteur déterminant pour le destin de la cellule de mammifères.
Récemment, Liang et al. (2003) ont montré que le rôle du céramide était conservé au cours de
l‟évolution puisqu‟il influence également la PCD chez Arabidopsis thaliana. Ces auteurs ont
identifié un gène chez A. thaliana, ACD5 (accelerated cell death 5) qui code pour une CerK
fortement affine pour les C 6 - et C 8 -céramides (acide gras comprenant respectivement 6 et 8
34

carbones), régulant donc leur concentration intracellulaire ainsi que celle du C1P. La mutation
d‟un G par un A dans le gène ACD5 qui entraîne la substitution d‟une glycine par une
arginine en position 412 dans la séquence protéique prédite, aboutit à la diminution de la
concentration de C1P, à l‟accumulation des céramides endogènes, à des modifications
morphologiques caractéristiques d‟une PCD (dégradation internucléosomale de l‟ADN
produisant les fameuses échelles sur gel d‟agarose, condensation de la chromatine et
dégradation de l‟ADN nucléaire en gros fragments) et à un accroissement manifeste de la
PCD après exposition au pathogène bactérien virulent Pseudomonas syringae. L‟implication
du céramide dans l‟induction de la PCD a été confirmée par l‟addition dans le milieu
d‟incubation de protoplastes de plantes sauvages de C 2 -céramide exogène. De plus, l‟addition
de C 2 -céramide dans le milieu d‟incubation de protoplastes de plantes mutées acd5 induit une
plus forte PCD que celle observée chez les plantes sauvages. Pris dans leur ensemble, ces
résultats suggèrent que le céramide est suffisant pour induire une PCD chez A. thaliana. Par
ailleurs, l‟importance des LCB phosphorylés dans la survie chez A. thaliana est aussi
suggérée puisque l‟addition de 10 µM de C 2 -C1P exogène bloque partiellement la PCD
induite par 30 µM de C 2 -céramide.
La question qui se pose alors est de savoir comment les sphingolipides gouvernent le
devenir de la cellule ? Des développements récents dans la régulation de l‟apoptose par la
modulation des flux de calcium suggèrent un rôle central pour ce messager et le RE dans la
régulation de la mort par le céramide (Darios et al., 2003). Récemment, Townley et al. (2005)
ont montré que ce mécanisme de régulation était conservé chez A. thaliana. Le lanthanum
(La 3+ ), un bloqueur de canal calcique de la membrane plasmique, inhibe significativement
l‟action du C 2 -céramide exogène sur la PCD, suggérant qu‟une variation de la [Ca 2+ ] i soit
impliquée dans le mécanisme d‟action du C 2 -céramide. A l‟aide de suspensions cellulaires
d‟A. thaliana transformées avec des constructions du gène de l'aequorine permettant un
adressage de la protéine dans le cytoplasme, Townley et al., (2005) ont montré que l‟addition
de 50 µM C 2 -ceramide exogène induisait une augmentation transitoirement de la [Ca 2+ ] i qui
atteignait un maximum de l'ordre de 0,4 µM après 13 secondes de traitement avant de revenir
au niveau de base (environ 0.22 µM) après 10 secondes. L‟addition simultanée de La 3+ et de
C 2 -céramide abolit le pic transitoire observé, la [Ca 2+ ] i demeurant au niveau de base proche de
0.2 µM.
Chez les mammifères, les ROS semblent jouer un rôle majeur dans la signalisation
induite par le céramide (Garcia-Ruiz et al., 1997 ; Darios et al., 2003). Par ailleurs, il est établi
qu‟ils induisent l'entrée de calcium et une augmentation de la [Ca 2+ ] i dans les cellules de tabac
(Price et al., 1994) et active l'entrée de calcium dans les cellules de garde en réponse à l'acide
abscissique (Pei et al., 2000). Ainsi, le peroxyde d‟hydrogène (H 2 O 2 ) produit suite à
l'activation de la NADPH-oxydase en réponse aux pathogènes pourrait être impliqué dans les
augmentations de [Ca 2+ ] i induites par le C 2 -céramide. Pour vérifier cette hypothèse Townley
et al., (2005) ont étudié l'effet du C 2 -céramide exogène sur les teneurs en H 2 O 2 . L‟addition de
C 2 -céramide dans le milieu d‟incubation des cellules induit une production de ROS, avec un
maximum atteint en réponse à 1 µM de C 2 -céramide. Néanmoins, à cette concentration, le C 2 -
céramide n‟induit pas la PCD et le La 3+ n‟a pas d‟effet sur la production de H 2 O 2 induite en
réponse à 1 µM de C 2 -ceramide. Enfin, la consommation du H 2 O 2 produit en réponse à 1 µM
de C 2 -céramide, par addition de catalase, est sans effet sur la [Ca 2+ ] i . Par conséquent, ces
résultats suggèrent que la participation de la signalisation calcique dans la régulation de la
PCD par le C 2 -céramide, est indépendante de la production de ROS induite en réponse à ce
métabolite chez A. thaliana.
Récemment, Colina et al. (2004) ont montré que le céramide est capable d‟induire une
augmentation de la [Ca 2+ ] i dans les cellules humaines Jurkat T via la mobilisation de calcium
35

au niveau du RE puis l‟activation d‟un courant calcique capacitif I CRAC , en présence comme
en absence de calcium extracellulaire. Dans ce contexte, il s‟agit désormais de préciser
l‟origine du calcium intracellulaire libre induite en réponse au C 2 -céramide chez les plantes.
2- Variation de la [Ca 2+ ] i dans les cellules de garde en réponse à la S1P : rôle dans la
régulation par l’acide abscissique de la fermeture des pores stomatiques
Deux cellules de garde jointives délimitent un pore stomatique microscopique. Situés
sur l‟épiderme des parties aériennes de la plupart des plantes supérieures, les pores
stomatiques régulent la diffusion du CO 2 atmosphérique et les pertes hydriques, déterminant
deux processus majeurs, la photosynthèse et la transpiration. La modulation des échanges
gazeux entre la plante et l‟atmosphère résulte d‟une modification de la turgescence des
cellules de garde (pour revue voir Hetherington et Woodward, 2003). L‟augmentation de la
turgescence qui provoque l‟ouverture des pores stomatiques, est due à une entrée d‟eau dans
la vacuole, consécutive à une hausse de la pression osmotique dans ce compartiment. Cette
hausse est due, pour l‟essentielle, à une augmentation dans les cellules de garde, de la teneur
en ions K + . Les cellules de garde s‟avèrent être un système cellulaire exceptionnel pour
étudier la réponse des plantes au déficit hydrique.
La coordination de la réponse au déficit hydrique est essentiellement sous la
dépendance d‟une phytohormone de type terpénoide, l‟acide abscissique (ABA). L‟ABA
induit la fermeture des pores stomatiques en inhibant la H + -ATPase du plasmalemme et en
activant un canal perméable au calcium non sélectif, ainsi qu‟un canal anionique (Cl - ) de type
S. Ces évènements dépolarisent le potentiel membranaire des cellules de garde, ce qui génère
un efflux de K + de la vacuole vers le cytosol, puis du cytosol vers l‟extérieur des cellules de
garde. Cet efflux entraînant une baisse de la pression osmotique, provoque une sortie d‟eau
associée à une diminution de la turgescence. Par ailleurs, l‟ABA est capable à la fois d‟inhiber
les canaux K + entrant, ce qui renforce la fermeture des pores stomatiques, et d‟activer les
canaux K + sortant, ce qui inhibe l‟ouverture des pores stomatiques.
L‟étude des voies de signalisation induites par l‟ABA et conduisant à la régulation de
ces canaux ioniques a fait l‟objet de recherches intensives ces dernières années (pour revues
voir Schroeder et al., 2001 ; Fan et al., 2004). Bien que l‟identité et la localisation précises des
récepteurs de l‟ABA soient encore mal connues, un certain nombre d‟intermédiaires situés en
aval de l‟ABA ont déjà été identifiés, tels que la protéine kinase AAPK (ABA-activated
protein kinase), la phosphatase de type 2C ABI1 (ABA insensitive 1), l‟augmentation du pH
cytosolique et la phospholipase D . L‟ABA est également connu pour induire une
augmentation de la [Ca 2+ ] i via un canal perméable au calcium situé sur la membrane
plasmique (I ca ), une PLC, l‟inositol hexakisphosphate (InsP 6 ) et des canaux calciques (SVtype)
sensibles à la ryanodine et activés par l‟ADP-Ribose cyclique (ADPRc).
L‟augmentation de la [Ca 2+ ] i contrôle l‟activité d‟un grand nombre de canaux qui vont à leur
tour réguler la turgescence des cellules de garde.
Chez les mammifères, la S1P apparaît être un régulateur positif universel de la [Ca 2+ ] i .
Dans ce contexte, Ng et al. (2001) ont étudié si ce mécanisme de régulation était conservé
chez les plantes. Ces auteurs ont tout d‟abord montré, par spectrométrie de masse, que la S1P
était présente dans les feuilles de Commelina communis. Ce résultat a constitué une première
car la communauté scientifique débattait de la présence de ce métabolite dans les tissus
végétaux. A l‟aide d‟expériences de micro-injection de la sonde fluorescente Fura-2 dans le
cytosol des cellules de garde, Ng et al. (2001) ont par la suite montré que l‟addition de S1P
exogène (6-50 µM) dans le milieu d‟incubation entraînait des oscillations calciques dont
l‟amplitude et la période sont dépendantes de la concentration de S1P appliquée.
Corrélativement, une fermeture partielle des stomates a pu être associée à ces oscillations. A
36

l‟opposée des oscillations, elle est loin d‟être immédiate : un temps de latence variant entre
120 min à 4 min est observé en réponse respectivement à 6 et 50 µM de S1P. L‟ensemble de
ces résultats suggère que la S1P joue un rôle important dans la régulation de la turgescence
des cellules de garde via la mobilisation du calcium.
Pour répondre aux critères définis pour servir de messager, la concentration de S1P
doit être finement régulée. Chez les mammifères, la S1P est produite suite à la
phosphorylation de la Sph par la SphK (Fig. 2). Elle est ensuite, soit déphosphorylée sous
l‟action d‟une phosphatase spécifique localisée au niveau de la membrane plasmique, la SPP,
ce qui régénère de la Sph, soit dégradée sous l‟action d‟une lyase spécifique localisée au
niveau du RE et qui clive la S1P en hexadécenal et en éthalonamine-1-phosphate (Fig. 2 ;
pour revue voir Le Stunff et al., 2004). A ce jour deux gènes codant pour des SphK ont été
clonés chez les mammifères (SphK1 et SphK2) et chez la levure (LCB4 et LCB5). Néanmoins,
l‟activité SphK n‟avait pas encore été démontrée chez les plantes. Une approche
pharmacologique associée à une étude biochimique de l‟enzyme nous a permis d‟établir la
présence d‟une activité SphK dans la fraction membranaire des protoplastes de cellules de
garde d‟A. thaliana (Coursol et al., 2003, 2005). Cette localisation diffère de celle observée
pour les deux SphK de mammifères qui sont soit cytosolique (SphK1) soit nucléaire (SphK2).
L‟activité SphK d‟A. thaliana est stimulée in vivo par l‟ABA et inhibée in vitro et in
vivo par le N,N-diméthylsphingosine (DMS) (Coursol et al., 2003). Les études réalisées in
vivo sur épidermes isolés montrent que le DMS inhibe de manière partielle, mais significative,
l‟effet de l‟ABA sur la turgescence des cellules de garde. Par ailleurs, les études de patchclamp
en configuration « cellule entière » indiquent que le DMS inhibe l‟effet de l‟ABA sur
les canaux K + entrant et les canaux anioniques de type S des cellules de garde. L‟ensemble de
ces résultats montre qu‟une SphK est partie intégrante de la chaîne de transduction du signal
ABA contrôlant d‟une part, l‟activité des canaux K + entrant impliqués dans l‟ouverture
stomatique et d‟autre part, l‟activité des canaux anioniques de type S impliqués dans la
fermeture stomatique.
Chez les mammifères, les effets de la S1P sont médiés en partie via des récepteurs
couplés à des protéines G hétérotrimériques (GPCR, G protein-coupled receptor). Sachant que
la sous-unité de la protéine G hétérotrimérique d‟A. thaliana, GPA1, est impliquée dans le
contrôle de la turgescence des cellules de garde par l‟ABA (Wang et al., 2002), il nous a
semblé intéressant d‟étudier le rôle éventuel de cette protéine dans le mécanisme d‟action de
la S1P. Les études in vivo conduites sur épidermes isolés montrent que chez les plantes
sauvages la S1P inhibe l‟ouverture des stomates et induit leur fermeture, ce dernier résultat
étant similaire à celui obtenu par Ng. et al. (2001) chez C. communis (Coursol et al., 2003).
En revanche, les mutants T-DNA gpa1-1 et gpa1-2, qui n‟expriment pas le gène GPA1, sont
insensibles à l‟action de la S1P. Par ailleurs, les expériences de patch-clamp en configuration
« cellule entière » montrent que la S1P inhibe les canaux K + entrant et active les canaux
anioniques de type S des plantes sauvages, mais n‟a pas d‟effet sur ces canaux chez les
mutants gpa1. Ces résultats mettent en relief le rôle clé joué par la sous-unité GPA1 dans la
régulation par la S1P de la turgescence des cellules de garde d‟A. thaliana. Par ailleurs, ils
suggèrent que la S1P puisse activer un GPCR chez les plantes au même titre que chez les
mammifères.
Ces résultats ont conduit Pandey et Assmann (2004) à étudier le rôle éventuel de la
protéine GCR1 (G protein-coupled receptor 1), un GPCR putatif, dans le mécanisme d‟action
de la S1P chez A. thaliana. Les études conduites in vivo sur épidermes isolés montrent que les
mutants gcr1, contrairement aux mutants gpa1, sont hypersensibles à l‟action de l‟ABA et de
la S1P à la fois pour l‟inhibition de l‟ouverture et l‟induction de la fermeture des stomates. Il a
donc été proposé que GCR1 soit un régulateur négatif des voies dépendantes de GAP1 et
37

induites par l‟ABA et la S1P. Cette hypothèse est renforcée par le fait qu‟un certain nombre
de gènes connus pour être régulés par l‟ABA sont plus fortement exprimés dans les mutants
gcr1.
L‟ensemble de ces résultats montre que le mécanisme d‟action de la S1P dans les
cellules de garde est complexe et encore loin d‟être totalement élucidé. En effet,
l‟augmentation de la [Ca 2+ ] i observée pourrait résulter d‟une action extracellulaire de la S1P
via son association avec une protéine non encore identifiée couplée à GPA1. Cependant, elle
pourrait aussi résulter d‟une action intracellulaire de la S1P sur un récepteur/canal non encore
identifié. Dans ce contexte, il semble particulièrement intéressant d‟étudier le rôle de la S1P
dans l‟augmentation de la [Ca 2+ ] i chez les mutants gpa1.
Perspectives
Les sphingolipides et les produits de leur métabolisme s‟avèrent donc jouer un rôle clé
dans la signalisation calcique chez les plantes. Néanmoins, des études sont encore nécessaires
pour mieux appréhender leur rôle dans ce processus. Il apparaît ainsi essentiel aujourd‟hui (i)
d‟identifier et de caractériser les différentes enzymes impliquées dans le métabolisme de ces
composés, telles que la SphK, la SPP et la S1P lyase (ii) de développer des outils
pharmacologiques spécifiques permettant d‟étudier le mécanisme d‟action de ces enzymes, et
(iii) d‟identifier les cibles de leurs produits. Enfin, d‟autres sphingolipides ayant une activité
biologique chez les plantes, tels que la phytosphingosine-1-phosphate qui régule l‟état
d‟ouverture des stomates chez A. thaliana au même titre que la S1P (Coursol et al., 2005),
pourraient à l‟avenir être également impliqués dans la transduction du signal calcique.
Références bibliographiques
Colina C, Flores A, Rojas H, Acosta A, Castillo C, Garrido Mdel R, Israel A, DiPolo R, Benaim G. (2004)
Ceramide increase cytoplasmic Ca 2+ concentration in Jurkat T cells by liberation of calcium from
intracellular stores and activation of a store-operated calcium channel. Arch. Biochem. Biophys. 436: 333-
345.
Coursol S, Fan LM, Le Stunff H, Spiegel S, Gilroy S, Assmann SM (2003) Sphingolipid signalling in
Arabidopsis guard cells involves heterotrimeric G proteins. Nature 423: 651-654.
Coursol S, Le Stunff H, Lynch DV, Gilroy S, Assmann SM, Spiegel S (2005) Arabidopsis sphingosine kinase
and the effects of phytosphingosine-1-phosphate on stomatal aperture. Plant Physiol. 137: 724-737.
Cuvillier O, Pirianov G, Kleuser B, Vanek PG, Coso OA, Gutkind JS, Spiegel S (1996) Suppression of
ceramide-mediated programmed cell death by sphingosine-1-phosphate. Nature, 381: 800-803.
Darios F, Lambeng N, Troadec JD, Michel PP, Ruberg M (2003) Ceramide increases mitochondrial free calcium
levels via caspase 8 and Bid: role in initiation of cell death. J. Neurochem. 84: 643-654.
Fan LM, Zhao Z, Assmann SM (2004) Guard cells: a dynamic signaling model. Curr. Opin. Plant Biol. 7: 537-
546.
Futerman AH, Hannun YA (2004) The complex life of simple sphingolipids. EMBO Rep. 5: 777-782.
Garcia-Ruiz C, Colell A, Mari M, Morales A, Fernandez-Checa JC (1997) Direct effect of ceramide on the
mitochondrial electron transport chain leads to generation of reactive oxygen species. Role of
mitochondrial glutathione. J. Biol. Chem. 272: 11369-11377.
Gómez-Muňoz A (2004) Ceramide-1-phosphate: a novel regulator of cell activation. FEBS Lett. 562: 5-10.
Hetherington AM, Woodward FI (2003) The role of stomata in sensing and driving environmental change.
Nature 424: 901-908.
Hannun YA, Obeid LM. 2002. The ceramide-centric universe of lipid-mediated cell regulation: Stress
encounters of the lipid kind. J. Biol. Chem. 277: 25847–25850.
thuis JC, Pomorski T, Raggers RJ, Sprong H, Van Meer G (2001) The organizing potential of sphingolipids in
intracellular membrane transport. Physiol Rev. 81: 1689-1723.
Lam E (2004) Controlled cell death, plant survival and development. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5: 305-315.
Liang H, Yao N, Song JT, Luo S, Lu H, Greenberg JT (2003) Ceramides modulate programmed cell death in
plants. Genes Dev. 17: 2636-2641.
38

Le Stunff H, Peterson C, Liu H, Milstien S, Spiegel S (2002) Sphingosine-1-phosphate and lipid
phosphohydrolases. Biochim. Biophys. Acta. 1582: 8-17.
Le Stunff H, Milstien S, Spiegel S (2004) Generation and metabolism of bioactive sphingosine-1-phosphate. J.
Cell Biochem. 92: 882-899.
Lynch DV, Dunn TM (2004) An introduction to plant sphingolipids and a review of recent advances in
understanding their metabolism and function. New Phytol. 161: 677-702.
Meyer zu Heringdorf D (2004) Lysophospholipid receptor-dependent and -independent calcium signaling. J.
Cell Biochem. 92: 937-948.
Ng CYK, Carr K, McAinsh MR, Powell B, Hetherington AM (2001) Drought-induced guard cell signal
transduction involves sphingosine-1-phosphate. Nature 410: 596-599.
Pandey S, Assmann SM (2004) The Arabidopsis putative G protein-coupled receptor GCR1 interacts with the G
protein α subunit GPA1 and regulates abscisic acid signaling. Plant Cell 16: 1616-1632.
Pei ZM, Murata Y, Benning G, Thomine S, Klusener B, Allen GJ, Grill E, Schroeder JI (2000) Calcium channels
activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signaling in guard cells. Nature 406: 731-734.
Price AH, Taylor A, Ripley SJ, Griffiths A, Trewavas AJ, Knight MR (1994) Oxidative signals in tobacco
increase cytosolic calcium. Plant Cell 6: 1301-1310.
Schroeder JI, Kwak JM, Allen GJ (2001) Guard cell abscisic acid signalling and engineering drought hardiness
in plants. Nature 410: 327-330.
Spiegel S, Milstien S (2003) Sphingosine-1-phosphate: an enigmatic signalling lipid. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4:
397-407.
Townley HE, McDonald K, Jenkins GI, Knight MR, Leaver CJ (2005) Ceramides induce programmed cell death
in Arabidopsis cells in a calcium-dependent manner. Biol Chem. 386: 161-166.
Wang XQ, Ullah H, Jones AM, Assmann SM (2001) G protein regulation of ion channels and abscisic acid
signaling in Arabidopsis guard cells. Science 292: 2070-2072.
39

ANALYSE DU SIGNAL CALCIQUE NUCLEAIRE : ESSAI DE MODELISATION
Christian Brière
UMR 5546 CNRS/Université P. Sabatier « Surfaces cellulaires et signalisation chez les
végétaux », IFR 40, Pôle de Biotechnologie végétale, 24 chemin de Borde rouge BP17
Auzeville 31326 Castanet-tolosan, France
Chez les plantes comme chez l‟animal, de nombreux stimuli, biotiques ou abiotiques,
induisent des variations de calcium libre dans divers compartiments cellulaires – cytosol,
chloroplastes, mitochondries, noyau - dont les caractéristiques dépendent de la nature et de la
force du stimulus. Se pose alors évidemment le problème de la génération de ces variations et
de leur régulation. Le cas du noyau est particulièrement intéressant à considérer au vu de sa
fonction et de sa structure. Le nucléoplasme est en effet entouré d‟une double membrane,
constituant l‟enveloppe nucléaire (NE), percée de pores (NPC) au travers desquels diffusent
activement ou passivement molécules et ions. La régulation calcique intra-nucléaire dépend
donc en fait des échanges de calcium entre 4 compartiments : le nucléoplasme, l‟enveloppe
nucléaire, le cytosol et les stocks de calcium nucléaire lié (calcium-buffers). L'homéostasie
calcique du noyau résulte d'un contrôle précis de ces échanges, notamment dans des
conditions induisant de fortes variations calciques dans le cytosol. Afin de comprendre
comment s‟effectue cette régulation, il importe donc de considérer les différents éléments
potentiellement impliqués dans ce contrôle (cf schéma ci-dessous).
IP4R
Ca ATPase
Ca 2+ Ca 2+ TRPC
RyR
VDC
NPC
IP3 R
Ca buffer
Na/Ca
antiport
NE
Ca transport ?
RE
Fig.1. Eléments de régulation du calcium nucléaire
L’enveloppe nucléaire
Grâce à ses capacités de stockage et d‟échange de calcium avec le cytosol d‟une part et le
nucléoplasme d‟autre part, l‟enveloppe nucléaire joue un rôle clé dans cette régulation (Rose
et al., 2004). Il est important de noter que, dans la cellule, il existe une continuité entre
l‟enveloppe nucléaire et le reticulum endoplasmique (Echevarria et al., 2003), avec lequel elle
présente de nombreuses similarités. On peut donc raisonnablement s‟attendre à trouver dans
l‟enveloppe nucléaire des systèmes de transports de calcium semblables à ceux du réticulum.
Sur la membrane externe de l‟enveloppe l‟existence de pompes Ca2+-ATPases est bien
40

démontrée (Gerasimenko et al., 1996; Humbert et al., 1996; Downie et al., 1998; Abrenica
and Gilchrist, 2000; Bunney et al., 2000). Des récepteurs InsP4 ont aussi été mis en évidence
(Humbert et al., 1996). Sur la membrane interne de nombreuses observations démontrent ou
suggèrent la présence de canaux calciques sensibles à l‟InsP3 ainsi que des récepteurs à la
Ryanodine et au cADP ribose (Gerasimenko et al., 1995, 1996, 2003; Humbert et al., 1996;
Grygorczyk and Grygorczyk, 1998) de même que l‟existence de canaux calciques de type
TRP (Xiong et al., 2004). En ce qui concerne la possibilité de transport de calcium du
nucléoplasme vers l‟enveloppe, les données disponibles semblent montrer l‟absence de
pompes de type Ca-ATPase (Humbert et al., 1996). Par contre, chez l‟animal, des travaux
récents suggèrent fortement la présence d‟échangeurs sodium/calcium (Xie et al., 2002; Xie et
al., 2004).
Les pores nucléaires
La capacité de régulation des flux ioniques au travers des pores nucléaires est encore sujette à
controverse (Mazzanti et al., 2001). Si l‟existence d‟un contrôle des entrées/sorties de petites
protéines (moins de 50kDa) au travers des pores nucléaires ne fait guère de doute (Greber and
Gerace, 1995; Stehno-Bittel et al., 1995; Perez-Terzic et al., 1996; Lee et al., 1998;
Bustamante et al., 2000; Ribbeck and Gorlich, 2001), la situation est beaucoup moins claire
pour les ions, notamment le calcium (Bootman et al., 2000) dont la diffusion au travers des
pores semble selon les cas soit libre (Lin et al., 1994; Meyer et al., 1995; Stehno-Bittel et al.,
1995), soit strictement contrôlée (Santella and Carafoli, 1997). Les expériences sur noyaux
isolés militent dans le sens d‟une capacité de contrôle de la diffusion via les pores nucléaires,
sans laquelle une régulation fine du calcium nucléoplasmique n‟est guère envisageable.
Les « calcium buffers »
Dans le cytosol l‟existence d‟une capacité tampon calcium importante (Mogami et al., 1999)
constitue un élément essentiel pour l‟homéostasie calcique. Par contre, peu de données
existent sur la capacité tampon-calcium du noyau, bien que la présence de protéines affines
pour le calcium, comme la calmoduline et la calréticuline dans le nucléoplasme ou la
calreticuline dans l‟enveloppe nucléaire, ait cependant été montrée (Gilchrist et al., 1994;
Santella and Kyozuka, 1997; Holaska et al., 2002). La concentration totale de calcium dans le
noyau de cellules epithéliales a été estimée à 0.6 mM (Chandra and Lorey, 2001). Dans les
myocytes ventriculaires de souris, cette concentration est de l‟ordre de 200 µM dans le
nucléoplasme et de environ 1mM dans l‟enveloppe nucléaire (Kondratev and Gallitelli, 2003).
On peut donc penser qu‟il existe une capacité tampon calcium dans le nucléoplasme et dans
l‟enveloppe, peut-être moindre que dans le cytosol mais susceptible de jouer un rôle non
négligeable.
Le noyau possède donc semble-t-il tous les éléments nécessaires à la régulation du calcium
dans ses divers sous-compartiments, notamment le nucléoplasme, que ce soit in situ ou isolé
du contexte cellulaire. Une question majeure est de savoir quels sont les éléments essentiels à
cette régulation et comment ces éléments interagissent pour assurer l‟homeostasie calcique
dans un contexte donné.
Deux types de mécanismes ont été proposés pour expliquer les variations de calcium nucléaire
observées suite à divers stimuli : soit la simple diffusion du calcium cytosolique via les pores
nucléaires, soit la stimulation de stocks intranucléaires, les deux mécanismes pouvant
coexister. Dans la première hypothèse les variations du calcium nucléoplasmique résulteraient
des variations du calcium cytosolique par simple diffusion du calcium libre via les pores
nucléaires : tel est par exemple le cas dans le myocyte cardiaque de rat (Genka et al., 1999).
41

Dans la seconde hypothèse, le calcium libre stocké dans l‟enveloppe nucléaire participerait
directement à la génération du signal nucléoplasmique (Echevarria et al., 2003; Gerasimenko
et al., 2003). Il semble donc que, selon la cellule ou le stimulus, l‟un et/ou l‟autre des deux
mécanismes puisse être responsable des variations de calcium observées dans le noyau. Par
ailleurs, la possibilité d‟une génération directe de signaux calciques dans le noyau,
indépendamment du cytosol, a été montrée récemment chez le tabac (Pauly et al., 2000) et
dans des cellules de foie HepG2 (Leite et al., 2003). Enfin, l'observation de variations
calciques dans des noyaux isolés soumis à un stimulus mécanique ou à un choc osmotique
démontre clairement la capacité de réponse et d'autorégulation du noyau en terme de signal
calcium (Xiong et al., 2004). Dans un tel système, la question ne se pose donc pas de savoir
comment un signal cytosolique peut induire un signal nucléoplasmique, mais comment le
noyau peut-il lui-même générer un tel signal et comment régule-t-il sa concentration calcique.
Pour cela le développement de modèles peut apporter une aide efficace, en ce qu‟il permet de
tester in silico différentes hypothèses afin d‟en vérifier la pertinence. Pour illustrer cette
démarche, nous considérerons l‟exemple de noyaux isolés de cellules végétales,
mécaniquement stimulés. Nous présenterons un modèle simplifié de la dynamique du calcium
dans des noyaux isolés, prenant en compte les éléments essentiels connus ou supposés de cette
dynamique et s‟appuyant sur un certain nombre de données expérimentales.
Le modèle biologique
Le modèle biologique que l‟on considérera ici est le noyau isolé de cellules BY2 de tabac.
Sous certaines conditions de pH et de température, des noyaux isolés de cellules BY2 de tabac
répondent à un stimulus mécanique par une élévation transitoire de la concentration en
calcium libre nucléoplasmique [Ca 2+ ] nuc (Xiong et al., 2004). Cette réponse présente les
caractéristiques suivantes :
1. A pH acide le stimulus provoque un accroissement très rapide ( 1min) et
un retour au niveau de base initial. La réponse est d‟autant plus intense que le pH du
milieu externe est faible.
2. A pH neutre ou basique un stimulus mécanique n‟a aucun effet sur le niveau de
calcium nucléoplasmique qui reste constant. Par contre le niveau de base, en l‟absence
de stimulus, est plus élevé qu‟à pH acide et est sensible à la température : un choc
froid (de 20°C à 4°C) diminue rapidement (en quelques secondes) le niveau de
calcium, qui re-augmente ensuite progressivement avec la température.
3. La concentration en calcium du milieu extérieur n‟a aucun effet sur la réponse au choc
mécanique.
Les données connues permettent d‟expliquer assez facilement l‟entrée de calcium dans le
nucléoplasme par un influx de calcium en provenance de l‟enveloppe nucléaire (NE) ou du
reticulum nucléoplasmique (NR). On peut en effet supposer que certains des canaux situés sur
la membrane interne de l‟enveloppe seraient sensibles au stimulus appliqué. Par contre le
problème est plus difficile pour ce qui concerne la sortie de calcium, après la réponse au
stimulus. Deux possibilités peuvent être envisagées : soit une sortie vers le milieu externe via
les pores nucléaires, soit un re-captage vers l‟enveloppe ou des stocks nucléaires, par le biais
de transporteurs actifs (pompes ou échangeurs d‟ions).
42

Dans le cas de noyaux isolés dans un tampon ne contenant pas ou quasiment pas de calcium,
la diffusion libre des ions au travers des pores devrait entraîner un vidage du nucléoplasme.
L‟observation d‟une concentration non nulle de calcium dans celui-ci implique l‟existence
d‟un contrôle minimal de cette diffusion, par des conditions sur l‟ouverture des pores par
exemple, soit au niveau de la concentration dans le nucléoplasme, soit au niveau de la
concentration dans l‟enveloppe. L‟absence d‟influence de la concentration en calcium du
milieu extérieur sur la réponse au stimulus pose un autre problème. En effet, le courant
traversant les pores nucléaires, s‟il existe, est passif et ne peut donc pas aller contre le gradient
électrochimique ; par conséquent en présence d‟une concentration [Ca 2+ ] externe élevée (1mM) il
ne peut y avoir de fuite de calcium vers le milieu externe (au contraire, on devrait observer un
courant entrant). Les cinétiques observées ne peuvent s‟expliquer que par une résorption du
calcium nucléoplasmique vers des stocks nucléaires : enveloppe et/ou calcium-buffers.
La présence de transporteurs sur la membrane interne de l‟enveloppe, bien que non démontrée
chez les plantes expérimentalement, semble néanmoins plausible et constitue une hypothèse
de travail intéressante. Afin d‟en tester la cohérence avec les données expérimentales, nous
avons donc incorporé l‟hypothèse d‟un pompage actif de calcium du nucléoplasme vers
l‟enveloppe nucléaire dans un modèle « minimal » de la dynamique calcique nucléaire.
Description du modèle mathématique
On considère ici le noyau isolé comme un système fermé, dans lequel aucun échange de
calcium avec le milieu extérieur n‟a lieu. Au sein du noyau le calcium libre s‟échange entre
deux compartiments physiquement distincts : le nucléoplasme et l‟enveloppe nucléaire (pour
simplifier, on supposera que l‟enveloppe nucléaire et d‟autres stocks nucléaires éventuels , tel
le réticulum nucléoplasmique, constituent un même compartiment). Dans chaque
compartiment le calcium est présent sous forme libre ou liée. Le calcium libre diffuse de
l‟enveloppe vers le nucléoplasme via des canaux calciques activés par le stimulus mécanique.
Il est re-capté vers l‟enveloppe par transport actif.
L‟ensemble de ces hypothèses peut se résumer selon le schéma ci-dessous :
Ca lié
enveloppe
Ca buffering
Ca 2+ libre
Enveloppe
Ca channel
Ca transport
Ca 2+ libre
Nucléoplasme
Ca buffering
Ca lié
nucléoplasme
On supposera qu‟en l‟absence de stimulus il existe un flux de base, de l‟enveloppe vers le
nucléoplasme, similaire à celui observé entre le réticulum et le cytosol (Camello et al., 2002).
Pour simplifier on considérera ce flux proportionnel à la différence de concentration en
calcium entre ces deux compartiments. Le re-captage vers l‟enveloppe est assuré par un
transporteur dont le flux dépend de la concentration en calcium du nucléoplasme selon une
équation de Hill. Ces formules s‟inspirent de celles utilisées par divers auteurs (Kargacin,
2003; Sneyd et al., 2003; Sneyd et al., 2004) pour les échanges entre cytosol et reticulum
endoplasmique. D‟où les formules suivantes pour les flux :
43

C, #pH53a
Stimulus
J
J
enveloppe
nucleoplasme
nucleoplasme
enveloppe
2
2
( F(
t)
Vs)
Ca Ca
(1a)
p
2
Ca
Vp
p
Kp Ca
enveloppe
nucleoplasme
2 p
nucleoplasme
nucleoplasme
(1b)
où la fonction F(t ; ts) représente l‟effet au temps t d‟un stimulus appliqué au temps t s selon la
formule suivante :
t ts
t ts
t1
t 2
( t;
ts
) Fmax 1 e e
F (2)
Simulations
1) Réponse à un stimulus
L‟effet d‟un stimulus mécanique est simulé par un influx rapide et transitoire de calcium dans
le nucléoplasme à partir de l‟enveloppe, représenté par la courbe en bleu dans la figure 1 cidessous.
La réponse du système (1), représentée par courbe rouge dans la Fig. 2A, correspond bien aux
cinétiques observées. Les valeurs des paramètres ont été estimées par ajustement à une
cinétique observée (courbe noire).
La simulation de stimuli répétés est présentée Fig.2B. Comme observé expérimentalement,
des stimuli successifs induisent une réponse de même période, dont l‟intensité atteint
rapidement un plateau, sans qu‟il y ait d‟effet d‟accumulation ou d‟épuisement.
A
0.5
600
B
0.45
0.4
500
0.35
400
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
STARTTIME = 18
STOPTIME = 200
DT = 0.01
DTOUT = 0
X0 = 0.1
Q = 1000
Gamma = 0.2
Beta = 5e-4
Vs = 0.01244
Vp = 7.927
Kp = 0.228294
p = 1
Fmax = 12.9521
ts = 19
t1 = 1
t2 = 2
tf = 0
Period = 0
300
200
100
0.05
0
20
40
60
80
100
t
120
140
160
180
200
0
Figure 2. Modèle avec re-captage du calcium vers l‟enveloppe nucléaire. A. Réponse à un stimulus. Ajustement
à une cinétique observée à pH 5.3 (courbe noire). B. Réponse à des stimuli répétés. Courbe bleue : stimulus,
courbe rouge : réponse théorique.
44

C, #pH4, #pH6, #pH7, #pH9
C
2) Effet du pH et de la température
Un exemple de simulations de la réponse du système pour différentes valeurs du pH est
présenté Fig. 3. Les valeurs des coefficients ont été fixées de manière à ajuster les cinétiques
observées. Entre les différentes valeurs de pH, seuls les coefficients Vs (vitesse d‟influx de
base) et (capacité tampon) ont été modifiés.
Il est ainsi possible de simuler l‟effet d‟un accroissement du pH du milieu externe par une
augmentation du flux d‟entrée et par une variation simultanée de la capacité tampon du
nucléoplasme.
Dans les simulations de l‟effet de la température (Fig.4) on suppose que à t

aussi évidemment un modèle simplifié, de manière cependant à conserver l‟essentiel de la
structure et du fonctionnement nucléaire. Si l‟on ne peut donc pas en attendre des prédictions
fines des réponses calciques, par contre sa validité doit être jugée sur sa capacité à expliquer
les caractéristiques principales de ces réponses.
En ce sens ce modèle répond assez bien à cet objectif puisqu‟il permet de simuler avec un bon
accord qualitatif la plupart des comportements observés expérimentalement. On peut résumer
les conclusions résultant des simulations de la manière suivante :
1. Le niveau d‟équilibre (=au repos) de calcium dans le nucléoplasme est contrôlé par
l‟activité de canaux calciques et de transporteurs (Ca-ATPases ou Na/Ca échangeur
par ex.) situés sur la membrane interne de l‟enveloppe.
2. L‟ouverture de ces canaux, et donc le débit de calcium, sont régulés par le pH et la
température. A pH acide ou à faible température (0°C) l‟activité de ces canaux est
minimale. A pH neutre ou alkalin et à température ambiante (20°C) cette activité est
maximale. Cela entraîne une augmentation du niveau de calcium nucléoplasmique et
une forte baisse du niveau dans les stocks nucléaires.
3. La capacité tampon calcium du nucléoplasme varie elle aussi avec le pH et la
température. Elle est maximale à pH neutre et à température ambiante, et minimale à
pH acide ou à faible température. Ces modifications de la capacité tampon influent sur
la dynamique de la réponse aux stimuli.
4. L‟application d‟un stimulus mécanique entraîne un flux de calcium des stocks
nucléaires vers le nucléoplasme via des canaux mécano-sensibles d‟un type différent
de celui des canaux responsables du flux de base. Le calcium est ensuite re-pompé
vers les stocks par un transporteur. La modulation de l‟activité de cette pompe joue sur
la dynamique de la réponse et sur la vitesse de retour à l‟équilibre.
Ces considérations permettent donc de proposer un schéma de fonctionnement de
l‟homéostasie calcique dans le noyau isolé de cellules végétales. Selon ce schéma les
échanges entre nucléoplasme et enveloppe nucléaire joueraient un rôle essentiel dans cette
régulation. Cela n‟exclue pas bien entendu que in situ les échanges directs de calcium entre
cytosol et nucléoplasme aient aussi un rôle fondamental dans la dynamique calcique nucléaire.
Au contraire, la prise en considération de ces divers mécanismes de régulation ouvre des
perspectives nouvelles pour expliquer cette dynamique.
Références
Abrenica B. and Gilchrist J.S. (2000) Nucleoplasmic Ca(2+)loading is regulated by mobilization of perinuclear
Ca(2+). Cell Calcium 28: 127-136
Bootman M.D., Thomas D., Tovey S.C., Berridge M.J. and Lipp P. (2000) Nuclear calcium signalling. Cell Mol
Life Sci 57: 371-378
Bunney T.D., Shaw P.J., Watkins P.A., Taylor J.P., Beven A.F., Wells B., Calder G.M. and Drobak B.K. (2000)
ATP-dependent regulation of nuclear Ca(2+) levels in plant cells. FEBS Lett 476: 145-149
Bustamante J.O., Michelette E.R., Geibel J.P., Dean D.A., Hanover J.A. and McDonnell T.J. (2000) Calcium,
ATP and nuclear pore channel gating. Pflugers Arch 439: 433-444
Camello C., Lomax R., Petersen O.H. and Tepikin A.V. (2002) Calcium leak from intracellular stores--the
enigma of calcium signalling. Cell Calcium 32: 355-361
46

Chandra S. and Lorey D.R., 2nd (2001) SIMS ion microscopy in cancer research: single cell isotopic imaging for
chemical composition, cytotoxicity and cell cycle recognition. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 47: 503-518
Downie L., Priddle J., Hawes C. and Evans D.E. (1998) A calcium pump at the higher plant nuclear envelope?
FEBS Lett 429: 44-48
Echevarria W., Leite M.F., Guerra M.T., Zipfel W.R. and Nathanson M.H. (2003) Regulation of calcium signals
in the nucleus by a nucleoplasmic reticulum. Nat Cell Biol 5: 440-446
Genka C., Ishida H., Ichimori K., Hirota Y., Tanaami T. and Nakazawa H. (1999) Visualization of biphasic
Ca2+ diffusion from cytosol to nucleus in contracting adult rat cardiac myocytes with an ultra-fast confocal
imaging system. Cell Calcium 25: 199-208
Gerasimenko J., Maruyama Y., Tepikin A., Petersen O.H. and Gerasimenko O. (2003) Calcium signalling in and
around the nuclear envelope. Biochem Soc Trans 31: 76-78
Gerasimenko O.V., Gerasimenko J.V., Tepikin A.V. and Petersen O.H. (1995) ATP-dependent accumulation
and inositol trisphosphate- or cyclic ADP-ribose-mediated release of Ca2+ from the nuclear envelope. Cell
80: 439-444
Gerasimenko O.V., Gerasimenko J.V., Tepikin A.V. and Petersen O.H. (1996) Calcium transport pathways in
the nucleus. Pflugers Arch 432: 1-6
Gilchrist J.S.C., Czubryt M.P. and Pierce G.N. (1994) Calcium and calcium-binding proteins in the nucleus. Mol
Cell Biochem 135: 79-88
Greber U.F. and Gerace L. (1995) Depletion of calcium from the lumen of endoplasmic reticulum reversibly
inhibits passive diffusion and signal-mediated transport into the nucleus. J Cell Biol 128: 5-14
Grygorczyk C. and Grygorczyk R. (1998) A Ca2+- and voltage-dependent cation channel in the nuclear
envelope of red beet. Biochim Biophys Acta 1375: 117-130
Holaska J.M., Black B.E., Rastinejad F. and Paschal B.M. (2002) Ca2+-dependent nuclear export mediated by
calreticulin. Mol Cell Biol 22: 6286-6297
Humbert J.P., Matter N., Artault J.C., Koppler P. and Malviya A.N. (1996) Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor
is located to the inner nuclear membrane vindicating regulation of nuclear calcium signaling by inositol
1,4,5-trisphosphate. Discrete distribution of inositol phosphate receptors to inner and outer nuclear
membranes. J Biol Chem 271: 478-485
Kargacin G.J. (2003) Responses of Ca2+-binding proteins to localized, transient changes in intracellular [Ca2+].
J Theor Biol 221: 245-258
Kondratev D. and Gallitelli M.F. (2003) Increments in the concentrations of sodium and calcium in cell
compartments of stretched mouse ventricular myocytes. Cell Calcium 34: 193-203
Lee M.A., Dunn R.C., Clapham D.E. and Stehno-Bittel L. (1998) Calcium regulation of nuclear pore
permeability. Cell Calcium 23: 91-101
Leite M.F., Thrower E.C., Echevarria W., Koulen P., Hirata K., Bennett A.M., Ehrlich B.E. and Nathanson M.H.
(2003) Nuclear and cytosolic calcium are regulated independently. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 2975-
2980
Lin C., Hajnoczky G. and Thomas A.P. (1994) Propagation of cytosolic calcium waves into the nuclei of
hepatocytes. Cell Calcium 16: 247-258
Mazzanti M., Bustamante J.O. and Oberleithner H. (2001) Electrical dimension of the nuclear envelope. Physiol
Rev 81: 1-19
Meyer T., Allbritton N.L. and Oancea E. (1995) Regulation of nuclear calcium concentration. Ciba Found Symp
188: 252-262; discussion 262-256
Mogami H., Gardner J., Gerasimenko O.V., Camello P., Petersen O.H. and Tepikin A.V. (1999) Calcium
binding capacity of the cytosol and endoplasmic reticulum of mouse pancreatic acinar cells. J Physiol 518
( Pt 2): 463-467
Pauly N., Knight M.R., Thuleau P., Van der Luit A.H., Moreau M., Trewavas A.J., Ranjeva R. and Mazars C.
(2000) Control of free calcium in plant cell nuclei. Nature 405: 754-755
47

Perez-Terzic C., Pyle J., Jaconi M., Stehno-Bittel L. and Clapham D.E. (1996) Conformational states of the
nuclear pore complex induced by depletion of nuclear Ca2+ stores. Science 273: 1875-1877
Ribbeck K. and Gorlich D. (2001) Kinetic analysis of translocation through nuclear pore complexes. Embo J 20:
1320-1330
Rose A., Patel S. and Meier I. (2004) The plant nuclear envelope. Planta 218: 327-336
Santella L. and Carafoli E. (1997) Calcium signaling in the cell nucleus. Faseb J 11: 1091-1109
Santella L. and Kyozuka K. (1997) Association of calmodulin with nuclear structures in starfish oocytes and its
role in the resumption of meiosis. Eur J Biochem 246: 602-610
Sneyd J., Tsaneva-Atanasova K., Bruce J.I., Straub S.V., Giovannucci D.R. and Yule D.I. (2003) A model of
calcium waves in pancreatic and parotid acinar cells. Biophys J 85: 1392-1405
Sneyd J., Tsaneva-Atanasova K., Yule D.I., Thompson J.L. and Shuttleworth T.J. (2004) Control of calcium
oscillations by membrane fluxes. Proc Natl Acad Sci U S A
Stehno-Bittel L., Perez-Terzic C. and Clapham D.E. (1995) Diffusion across the nuclear envelope inhibited by
depletion of the nuclear Ca2+ store. Science 270: 1835-1838
Xie X., Wu G., Lu Z.H. and Ledeen R.W. (2002) Potentiation of a sodium-calcium exchanger in the nuclear
envelope by nuclear GM1 ganglioside. J Neurochem 81: 1185-1195
Xie X., Wu G., Lu Z.H., Rohowsky-Kochan C. and Ledeen R.W. (2004) Presence of sodium-calcium
exchanger/GM1 complex in the nuclear envelope of non-neural cells: nature of exchanger-GM1 interaction.
Neurochem Res 29: 2135-2146
Xiong T.C., Jauneau A., Ranjeva R. and Mazars C. (2004) Isolated plant nuclei as mechanical and thermal
sensors involved in calcium signalling. Plant J 40: 12-21
Adresses utiles d’outils de modélisation et simulation :
BerkeleyMadonna :
Biospice :
Gepasi :
E-Cell :
Jarnac :
JDesigner :
M-Cell :
Virtual Cell :
http://www.berkeleymadonna.com/
https://biospice.org/index.php
http://www.gepasi.org/
http://ecell.sourceforge.net/ecellbook-takahashi-noecell/node1.html
http://www.sys-bio.org/
http://www.cds.caltech.edu/~hsauro/JDesigner.htm
http://www.mcell.cnl.salk.edu/
http://www.nrcam.uchc.edu/vcellR3/login/login.jsp
48

UNE NOUVELLE CAMÉRA PAR HAMAMATSU : ELECTRON MULTIPLYING
CCD C9100 HIGH SPEED WITH LOW LIGHT LEVELS
Bruno Combettes
Hamamatsu Photonics France rue du saule trapu, parc du moulin de Massy, BP 229 91882
MASSY Cedex
• Sensor is designed based on the frame transfer back thinned CCD technology.
• Multiplication register is added on the serial register.
• In the multiplication register, up to 50 volts is applied to the one of charge transfer
gate (GS) in order to get the multiplication gain.
• Electrical field under the transfer gate (GS) accelerates the signal electron and
energetic collision occurs in the silicon matrix.
• Such collision will result in an occasional extra electron in the transferred charge.
• This is called IMPACT IONIZATION
• Every stage in the multiplication register has a statistical chance of 1.0% to 1.6% of
creating an impact ionization event.
• When multiplied by 500 steps ,for example, this generates several thousand times
“gain”.
• Mathematically gain is given by G=(1+g)N
– where N is the stage number in the multiplication register and g is the
probability of generating a secondary electron.
– For example, N is 500 and g is 1.5%(0.015), then G is 1710.
• The normal read noise of a camera becomes “relatively” very small compared to this.
• High speed readout at low intensity with low “relative read noise” is the main
advantage of this technology.
• Advantage
– Readout noise is constant and fixed.
– Gain is controllable.
– When signal is gained up bigger than Readout noise, then it relatively readout
noise becomes less than 1 electron.
Cooling is the most important technology for EM-CCD.
• Why?
– Dark current is the part of signal.
– At high gain, dark current becomes a main source of back ground noise.
– EM Gain is the function of temperature. Need -50 degree C cooling to get
2000 times gain.
– Sensor gain is strongly affected by the sensor temperature and it must be very
stable against ambient temperature movement.
– Only very stable sensor temperature realizes the quantitative measurement.
49

• For the quantitative measurement, sensor temperature must be very stable and must
be well regulated against the drift of ambient temperature.
• In order to get higher gain, CCD sensor must be cooled down.
Hamamatsu Cooling technology
What kind of cooling technology Hamamatsu is using?
• Hamamatsu uses
Hermetic sealed cooling
system without O-rings.
Vacuum level is 10 -7
Torr. Because of no
convection in the head,
cooling is done
effectively.
• No re-evacuation.
• Maintenance free for
vacuum.
July,2004
HAMAMATSU 16
Sensor temperature and Image quality
- 20 C/
SD 63
Frequency -20 deg.C
40
35
30
25
20
15
10
5
0
400 500 600 700
Intensity
- 30 C /
SD 40
Frequency -30 deg.C
40
35
30
25
20
15
10
5
0
400 500 600 700
Intensity
- 50 C/
SD 35
Frequency -50 deg.C
40
35
30
25
20
15
10
5
0
400 500 600 700
Intensity
July,2004
HAMAMATSU 9
50

N
Image area
Multiplication Reg.
Stage number M
Principle of EM-CCD
Store area
Gate 1
e
p
Variable
voltage
Gate
e
Impact
Ionization
e
Electrons are
collected in potential
well and holes escape
either to the substrate
or to the channel stop
Electrons begin to
transfer from Gate 1
to high field region
under the Gate 2.
Under this
condition, multiple
impact ionization
effect starts and
generates multiple
electron and hole
pairs. This process
is repeated with the
multiplication
register pixel
number.
51

MICROSCOPE TIRF SYSTEME D’IMAGERIE
A ONDES EVANESCENTES
Emmanuelle Beccari
Nikon France, 191, rue du marché Rollay, 94504 Champigny-sur-Marne CEDEX
Principe des ondes évanescentes ou TIRF
Que sont les ondes évanescentes ou Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)?
Le TIRF est un phénomène optique qui se produit lorsque la lumière frappe une interface
entre deux milieux d’indices de réfraction différents. L‟incidence d‟un angle supérieur à
l‟angle critique entraîne une réflexion totale.
Lorsque cette lumière est totalement réfléchie, elle ne se propage pas à travers l‟échantillon,
mais engendre un champ électromagnétique (appelé onde évanescente) qui s‟étend en z.
L‟énergie de ce champ décroît de façon exponentielle et l‟onde évanescente ne peut se
propager au-delà d‟une centaine de nanomètres dans le second milieu. C‟est pourquoi,
uniquement cette portion de l‟échantillon, traversée par l‟onde évanescente, peut être excitée
pour émettre de la fluorescence et donc être observée. C’est l’essence de la microscopie
TIRF.
L‟avantage clé du TIRF est la faible profondeur de pénétration de cette onde évanescente.
Seulement les fluorophores adsorbés, adhérés ou liés à la membrane de l‟échantillon sont
excités pour émettre, créant ainsi une très fine section optique. Inversement, les molécules
dispersées en solution ne seront pas excitées. Il en résulte une fluorescence minimale en
dehors de cette section optique, ce qui autorise un rapport signal/bruit important.
Le système TIRF permet la mesure en temps réel des cinétiques de liaison des molécules à
la surface des membranes. C‟est une technique rapide, non dé-structurante, sensible, qui
convient parfaitement au contrôle des interactions moléculaires. Elle offre la possibilité de
suivre les changements de conformation, d’orientation mais aussi la mobilité latérale des
molécules.
Pourquoi le TIRF est-il utile en fluorescence ?
L‟onde évanescente excitera uniquement les fluorophores situés dans une couche de ~100 nm
adjacente à la lamelle. L‟excitation de cette petite section optique aboutit à une très forte
augmentation du rapport signal/bruit. En résultat de cette augmentation, de très petits signaux,
telles que des molécules uniques fluorescentes peuvent être résolues au-delà du bruit de fond.
SYSTEME D’IMAGERIE D’ONDES EVANESCENTES NIKON
TIRF Double Layer
Grâce à sa technologie optique unique CFI60, Nikon a développé des rehausses permettant
d‟intégrer de nouveaux systèmes d‟excitation. Les objectifs TIRF Nikon de grande ouverture
numérique rendent possible l‟introduction d‟une illumination laser à des angles incidents plus
53

grands que l‟angle critique. Cela résulte en une réflexion totale interne qui crée des ondes
évanescentes directement adjacentes à l‟interface lamelle/spécimen.
La structure unique en strate
extensible du microscope inversé
TE2000 de Nikon permet le montage
simultané des systèmes TIRF et
d‟illumination en épi-fluorescence,
sans aucune restriction de leurs
capacités individuelles. Cela autorise
également l‟utilisation indépendante
de leurs propres filtres. De plus,
switcher de l‟un à l‟autre système est élémentaire.
Nouveau TIRF Single Layer
Nikon a profité de ses particularités techniques pour mettre au point un système d‟ondes
évanescentes utilisable en routine sans contraintes. Le nouveau modèle d‟illuminateur TIRF
permet sur un seul « étage » de coupler le TIRF et l‟épi fluorescence classique dans le but de
mettre à profit le second étage laissé disponible pour d‟autres techniques telles la PA-GFP,
les pinces optiques etc. Ainsi, différentes techniques d‟illumination, non redondantes sont à
présent, disponibles sur microscope unique, ce qui facilite l‟étude par différentes approches
sur un même échantillon.
Perfect Focus System NIKON : La révolution.
Une des particularités du TIRF est l‟épaisseur de la section optique excitée par les ondes
évanescentes, mais cela devient aussi une contrainte. En effet, si l‟on admet que l‟onde ne
peut se propager au-delà des 200nm au contact de la lamelle, en utilisant un objectif 60x
ouvrant à 1.45, la profondeur de propagation est inférieure ou égale à la résolution en z de
l‟objectif. De ce fait la plus petite dérive en z résulte en une perte le plan de mise au point et
dans le cadre du TIRF, une disparition d‟image. Cette dérive sera accrue par la durée de
l‟expérience.
Nikon répond à cette problématique grâce à sa dernière innovation, le PFS (Perfect Focus
System). Ce système est fourni pour « pister » le plan de mise au point automatiquement en
détectant la limite de surface entre la lamelle et le milieu aqueux grâce à une lumière proche
infrarouge qui n‟interfère pas avec l‟observation générale. Ne contrôlant la mise au point que
par « tracking » des fluctuations verticales d‟interface, ce système est indépendant des
changements d‟états de l‟échantillon.
54

C
B
A
Culture medium:
~1.35
Glass: 1.5
Water: 1.333
or Oil: 1.514
or Air: 1.0
Ce système disponible sur le statif inversé motorisé TE2000E, particulièrement adapté pour le
TIRF, est aussi très performant dans toutes les applications sensibles aux vibrations, telles
Time Lapse/vidéo-microscopie, Optigrid, microscopie confocale.
55

ATELIER MODELISATION DE LA SIGNALISATION CALCIQUE
Jacques Haiech
Institut Gilbert Laustriat, IFR85 «Biomolécules et Innovations Thérapeutiques» UMR 7175
CNRS, Faculté de Pharmacie et Ecole Supérieure de Biotechnologie de Strasbourg, 74, route
du Rhin, 67401 ILLKIRCH
Comprendre la signalisation calcique passe par une modélisation du signal calcium.
L‟objectif de cet atelier est d‟aborder les concepts et méthodes de cette modélisation, non pas
pour les dominer mais pour avoir l‟envie de les utiliser et de les comprendre.
Au delà de la description du signal calcium et des éléments qui le composent, le but est de
construire à minima un modèle prédictif et dans le meilleur cas un modèle explicatif.
On va d‟abord définir ce que l‟on entend par :
signal calcique et on en déduira différentes approches de modélisations,
modèle macroscopique versus modèle microscopique et on en déduira les limites
des modèles utilisés ou développés dans la littérature,
utilisation des modèles soit pour prédire (pharmacologie virtuelle par exemple) soit
pour comprendre (aide à la création et à l‟interprétation d‟expériences).
Les modélisations du signal calcique
Le signal calcique doit être vu comme :
un signal physique, à savoir la modification dans l‟espace, dans le temps et dans un
volume donné du nombre d‟atome de calcium. Cela nécessite un système capable
de réguler cette valeur physique et d‟un point de vue expérimental, des systèmes
d‟observations, qui interférent peu ou de manière quantifiable avec le système
précédent.
Un signal logique, à savoir le déchiffrage du signal physique et sa transformation
en un effet et/ou phénomène biologique (prolifération, motilité, métabolisme,
différentiation, …).
La modélisation du signal physique implique :
une définition des compartiments impliqués dans le signal,
56

une description des propriétés des éléments impliquées dans la génération du
signal calcique (canaux, pompes, tampons)
la dérivation d‟un modèle mathématique à partir des éléments précédents,
la résolution numérique du modèle précédent à partir d‟un ensemble de données
initiales.
57

« The national ressource for cell analysis and modeling » a développé un ensemble d‟outils
donc « virtual cell » pour aborder ce problème (http://www.nrcam.uchc.edu/) et ci-dessus.
La maitrise de cet outil ne peut se faire lors de cet atelier mais nous aborderons la logique de
l‟utilisation de cet outil en le considérant comme le prototype et le stereotype d‟une nouvelle
génération d‟outils de modélisation qui vont être aussi nécessaire que les logiciels de
bioinformatique permettant d‟annoter les séquences génomiques.
La modélisation du signal logique nécessite :
décrire l‟ensemble des éléments impliquées dans la transduction du signal calcique
en un effet biologique, i.e les protéines de liaisons du calcium qui vont détecter le
signal puis interagir avec des enzymes ou des protéines de structures pour
déclencher une cascade d‟événement conduisant à l‟événement cellulaire,
modéliser l‟interaction calcium-protéine et protéine-protéine afin de modéliser
l‟ensemble du phénomène.
Nous avons développé une technique permettant de construire les équations permettant de
simuler de tels systèmes sans faire appel aux techniques mathématiques. Nous aborderons ce
type de modélisation du signal calcique logique.
Ci-dessous est présenté un exemple de dérivation d‟équations décrivant la liaison entre une
protéine avec deux sites et un ligand sans passer par la résolution d‟un système d‟équations.
De simples tableurs du type excel permettent d‟utiliser ces modèles pour tester l‟effet des
valeurs initiales ou des paramètres sur la transduction du signal. L‟outil « virtual cell » permet
aussi de réaliser ce type de modélisation et de le combiner avec la modélisation du signal
physique afin d‟obtenir une modélisation aussi complète que possible.
Les limites de ces modélisations
Dans une dernière partie, nous aborderons les limites de ces modélisations et les problèmes
liés à l‟amélioration des techniques d‟imagerie conduisant à observer un nombre de plus en
plus petit de molécules et d‟atomes et les perturbations qu‟entrainent les technologies
d‟imagerie ou de spectrométrie.
58

Nous essaierons de faire émerger un guide de bonne conduite de la modélisation à partir des
expériences dans ce domaine des participants à l‟atelier.
Annexe sur les équilibres multiples
Equilibres Multiples
Une vision simplifiée permettant d’aider à la compréhension de l’atelier.
L‟apparition de la vie a probablement coïncidé avec la mise en place d‟un système d‟analyse
de l‟information extérieure et de gestion de l‟information par la cellule. Dans un monde
hostile à la vie (quelques trois milliards d‟années avant nous), la cellule a mis en place des
mécanismes d‟adaptation. Plus tard, l‟égoïsme cellulaire a laissé la place à un altruisme
cellulaire. La cellule a alors transmis de l‟information à sa tribu et par la suite des sociétés
cellulaires se sont constituées. L‟organisme multicellulaire n‟est qu‟une société cellulaire
stable qui a développé un système politique allant du despotisme le plus absolu à la
démocratie en jonglant parfois avec l‟anarchie auto-régulée.
L‟évolution a sélectionné les mécanismes moléculaires permettant d‟envoyer et de recevoir de
l‟information. Pour ce faire, la nature devait utiliser les propriétés physico-chimiques des
macromolécules constituant les éléments cellulaires.
Essayons de nous mettre à la place de la cellule primordiale ( le progénote) plus de trois
milliards et demi d‟années. Cette cellule est probablement composé d‟une membrane qui isole
un cytoplasme le plus stable possible d‟un milieu extérieur qui peut changer. La membrane de
la cellule est principalement composée de lipides avec quelques protéines qui traversent la
membrane avec une partie à l‟extérieur et une partie à l‟intérieur.
Les produits qui se trouvent à l‟extérieur de la membrane vont d‟abord être captés par les
protéines extérieures. Si ces produits sont nocifs pour la cellule, la cellule devra bouger pour
changer d‟environnement ou bien construire un chemin métabolique afin de détruire ou
d‟utiliser le produit détecté.
Nous prendrons comme première loi du vivant que :
la détection de la présence d‟un produit chimique par la cellule passe par la formation d‟un
complexe macromolécule-produit. En général, la macromolécule est une protéine.
Nous savons que cette formation d‟un complexe doit obéir aux lois de la thermodynamique et
donc suivre la loi d‟action de masse.
Nous utiliserons les définitions suivantes :
P est la protéine que nous appellerons parfois E pour enzyme, L est le ligand que nous
appellerons parfois S pour substrat.
La rencontre de P et de L donnera un complexe PL et l‟on écrira :
P + L
PL
59

Un tel système se caractérise par sa composition. dans un tube à essai, on aura des molécules
de protéines P présentant un site pour des molécules de ligand L entouré par des molécules de
solvant, en général de l‟eau.
Une visualisation d‟un tel système sera alors :
P + L
PL
Un tel système sera caractérisé par un comportement cinétique. La vitesse à laquelle le
complexe PL se forme sera proportionnel entre autres au nombre de collision entre P et L et
donc à la vitesse auxquelles diffusent P et L. Cette vitesse de formation de PL sera caractérisé
par une constante cinétique k on . De même, le complexe PL peut se dissocier avec une vitesse
qui sera proportionnelle au nombre de collision de ce complexe avec les molécules du solvant.
Cette vitesse de dissociation sera caractérisé par une constante cinétique koff.
En tenant compte de la formation et de la dissociation du complexe, on aura :
d(
PL)
dt
kon*(
P)*(
L)
koff
*( PL)
60

Le premier terme de l‟équation décrit la vitesse de formation du complexe PL. Le deuxième
terme décrit le mécanisme de formation et de dissociation de complexe.
A l‟équilibre, le système est stable. Les flux de formation et de dissociation de complexe
s‟équilibrent. On a donc :
d(
PL)
dt
d‟où :
0
kon* ( P)*(
L)
koff *( PL)
0
et donc :
( PL)
kon 1
Ka
( P) * ( L)
koff Kd
Ka est une constante qui a pour nom la constante d‟association et Kd la constante de
dissociation.
Dans un tube à essai, le nombre de molécule dans un volume donné est très grand. Il devient
impossible de suivre la vitesse et la position de chaque molécule constituant le système que
l‟on étudie. On considère alors que le système est constitué d‟états et ce que l‟on désire, c‟est
pouvoir caractériser les différents états de notre système. Caractériser l‟état du système, c‟est
pouvoir calculer des fonctions caractéristiques des états du système (l‟enthalpie H et
l‟entropie S du système) en fonction de variable dépendant du système observé (température,
volume, pression, concentration molaire des éléments du système).
61

Dans notre cas, on passe d‟un état A ou la protéine et le ligand sont à l‟état libre à un état B où
on a formation d‟un complexe entre la protéine et le ligand. A l‟état A est associé une valeur
d‟enthalpie H A et une valeur d‟entropie S A (respectivement H B et S B pour l‟état B). En général,
on peut difficilement mesurer des valeurs de fonction d‟état associé à un état donné mais des
variations d‟enthalpie ou d‟entropie due à un changement d‟état. Dans notre cas, on a accès à
la variation d‟enthalpie quand on passe de l‟état A à l‟état B (respectivement, la variation
d‟entropie).
On a :
S= S B -S A et H=H B -H A
Pour une température T (en degré Kelvin), on définit la variation d‟énergie libre (ou enthalpie
libre) ou énergie de Gibbs :
G= H-T* S
On a la très classique relation :
G= G°+ R*T*Ln[(PL)/(L)*(P)] où G° est l‟énergie libre standard de la réaction
P+L
PL.
A l‟équilibre, on a G = 0 et on retrouve la loi d‟action de masse ( G° = -R*T*Ln(Ka)).
62

Toutefois, ce dernier paragraphe ne nous a absolument pas permis d‟expliciter ce que sont ces
mystérieuses fonctions d‟états (H, S, G sans parler de U).
Protéine avec un ligand
Considérons le système
P + L PL
Par définition, P sera le récepteur (en général, une protéine) et L le ligand (un composé
chimique de faible poids moléculaire). Expérimentalement, on fera varier la concentration du
ligand. On mesure un signal physique associé à P (S 0 ) et à PL (S 1 ). Le signal que nous
observons sera donc la somme du signal provenant de la fraction de P dans le tube et de la
fraction de PL. Dans notre tube, au départ de l‟expérience, on a une concentration totale de
protéine (Pt). Au cours de l‟expérience, on fait varier la concentration libre du ligand (L).
En permanence, on a :
Pt= (P) + (PL) et la concentration totale du ligand est Lt= (L) + (PL).
Le signal que nous observons est donc :
S= S 0 *(P)/Pt + S 1 * (PL)/Pt
Ainsi, en absence de ligand, on a :
(P)=Pt et S= S 0
En présence d‟une quantité saturante de ligand, on a :
(PL)=Pt et S=S 1
63

On a donc une variation du signal entre S0 et S1 quand on ajoute progressivement du ligand L.
Pour réaliser ce type d‟expérience, il nous faut :
1) une mesure de la concentration de ligand libre (L) dans le système,
2) un signal physique associé à la protéine qui soit différent quand le site est libre ou occupé
par un ligand.
64

Méthodes expérimentales
Quatre types de signaux sont utilisés :
a) la mesure du ligand liée à la protéine,
b) une mesure physique associée à une modification conformationelle de la protéine,
c) une mesure d‟une fonction d‟état associée au système,
d) une mesure d‟une fonction biologique associée à la protéine.
Modélisation et méthodes de représentation
La modélisation du système consiste à exprimer le signal S en fonction de la concentration en
ligand libre (L).
(1) S= S 0 *(P)/Pt + S 1 * (PL)/Pt
La loi de conservation des masses nous donne :
(2) Pt = (P) + (PL)
La loi d‟action de masse peut s‟exprimer de la manière suivante :
(3) K= (PL)/(P)(L)
Les équations (1), (2) et (3) permettent d‟écrire :
65

S
S
0
1
S1
* K *( L)
K *( L)
Mesure du ligand lié
Si l‟on mesure par dialyse la quantité de ligand liée par complexe, alors on a :
S 0 = 0 et S 1 =1
En général, on a pour convention d‟appeler ce signal
K *( L)
1 K *( L)
K est dans ce cas la constante d‟association macroscopique (ou constante stœchiométrique
d‟association) et la constante individuelle du site (ou constante microscopique d‟association).
On a :
Titration enthalpique par microcalorimétrie isotherme
S= H ; S 0 =0 ; S 1 = H1
Puisque G°=-R*T*Ln(K), on a S° = ( H°- G°)/T. On a donc une mesure complète des
caractéristiques thermodynamiques du système que l‟on étudie.
66

Titration conformationelle du système
S
S
0
1
S1
* K *( L)
S0
S0
* K *( L)
( S1
S0
K *( L)
1 K *( L)
)* K
*( L)
et donc,
S
( S1
S0)*
K *( L)
1 K *( L)
On accède à une mesure du changement conformationnel au travers de toutes les mesures
physico-chimiques possibles (Fluorescence, spectroscopie UV-visible, RMN, ....).
Mesure enzymatique
Considérons un enzyme E qui peut lier un substrat S. Cet enzyme transforme le substrat S en
produit P. On a le modèle suivant :
E + S ES ----->E + P
H
H
1
0
1
* K *( L)
K *( L)
67

V
V
1
m
* K *( S)
K *( S)
Si l‟étape de fixation du substrat n‟est pas ou peu modifié par l‟étape de transformation du
substrat en produit et si l‟on associe au complexe ES la vitesse maximale de transformation du
substrat (Vm), on a :
Si l‟on pose Km=1/K, alors
V
V
K
m
m
*( S)
( S)
Ceci représente l‟équation de Michaelis-Mentens.
Protéine avec deux ligands identiques
Dans le cas d‟une protéine avec deux sites pour le même ligand, on ne peut plus
confondre constantes stœchiométriques et constantes individuelles.
On a deux représentations :
L
k1
k3
P
k2
k4
68

P + L PL PL 2
K1
K2
Représentation macroscopique et représentation microscopique
On a une représentation au niveau moléculaire où on suppose que l‟on peut différencier entre
les deux sites. On a donc une constante individuelle pour chaque site (k1 et k2). Quand le site
1 est occupé, on peut avoir une modification de l‟affinité pour le site 2. La constante
individuelle du site 2 quand le site 1 est occupé devient k3. On considère donc un facteur de
couplage entre le site 1 et le site 2, c. on a :
c= k3/k2. Si k3 est égal à k2, alors les deux sites sont indépendants et le facteur de couplage
est 1. Si l‟occupation du site 1 augmente (diminue) l‟affinité pour le site 2, alors c >1 ( c

On peut écrire :
S
s
0
( s
1
s ) * k1*
x
0
1
( s
1
k1*
x
s ) * k2*
x
0
k2*
x
( s
1
1
0
c * k1*
k2*
x
s ) * c * k1*
k2*
x
2
2
Les méthodes expérimentales que nous utilisons ne permettent pas en général de distinguer
sans ambiguïté les deux sites. On a une vision macroscopique du système où l‟on considère
les complexes stœchiométriques. Associons à chaque complexe stœchiométrique un signal, à
savoir S 0 , S 1 et S 2 et exprimons S (le signal observé) en fonction de la concentration en ligand
libre (L). On obtient :
S
S
S
S
0
0
S
1
1
( S
* K
1
K
1
1
* x
* x
S
K
1
2
1
* K
* K
2
1
* K
* x
S
0
) * K1
* x ( S
2
1 K * x K
2
2
1
* x
0
* K
2
2
S ) * K
* x
1
2
* K
2
* x
2
Comme le signal observé est le même quelque soit la manière de dériver l‟équation, on peut
ainsi déduire des relations permettant de relier les constantes stœchiométriques et les
constantes individuelles.
Ainsi, on a :
K
K
1
2
k
1
c*
k
k
1
k
1
2
* k
k
2
2
et pour les signaux :
70

S
S
S
0
1
2
s
s
0
s1
* k1
k
1
1
1
1
s * k
k
2
2
Ces équations sont obtenues en identifiant les dénominateurs et les numérateurs. On obtient
deux systèmes d‟équations. Le premier système d‟équations comprend eux équations et trois
inconnus et le deuxième système, une équation à deux inconnus. En général, ces systèmes
sont indéterminés. Afin de pouvoir totalement caractériser un système présentant une
interaction non-covalente, il faudrait pouvoir caractériser les constantes individuelles et les
facteurs de couplages. Expérimentalement, nous atteignons en général les constantes
macroscopiques. Il faut donc faire des hypothèses pour résoudre les systèmes d‟équations
précédentes.
Il existe deux grands types d‟hypothèses :
les sites sont équivalents : cela signifie que k 1 =k 2 =k,
les sites sont indépendants : cela signifie que c=1.
Dans le cas de l‟hypothèse des sites équivalents, on a :
K
K
1
2
k
1
c*
k
k
1
k
1
2
* k
k
2
2
2* k
c*
k * k
2* k
c
*
2
k
d‟où on obtient :
71

k
c
K
1
2
4 * K
K
1
2
Dans le cas de l‟hypothèse de sites indépendants, on a :
K
K
1
2
k
1
k
k
1
1
k
2
* k
k
2
2
Cela implique que k1 et k2 sont les racines positives du polynôme de liaison :
P(x)=1+K 1 *x+K 1 *K 2 *x 2
Cela n‟est possible que si K 1 *K 1 -4*K 1 *K 2 >=0, soit K 1 >=4*K 2
En conclusion, une hypothèse de symétrie sur la protéine permet toujours de résoudre les
équations reliant constantes macroscopiques, constantes individuelles et facteur de couplage.
A l‟inverse, l‟hypothèse de sites indépendants ne permet pas de résoudre les équations dans
tous les cas.
Méthodes d’études
On aimerait ne pas faire d‟hypothèses et être capables de résoudre les équations précédentes.
Supposons que l‟on ait un signal spectrométrique qui permette de suivre l‟occupation d‟un
seul site, on obtient pour le site 1 :
S
s
0
( s
1
s ) * k1*
x
0
( s
1 k1*
x k2*
x
1
s ) * c * k1*
k2*
x
0
c * k1*
k2*
x
2
2
( s
1
s0
) *
1
2
k1*
x c * k1*
k2*
x
k1*
x k2*
x c * k1*
k2*
x
2
et pour le site 2 , l‟équation suivante :
( s'
1
s'
0
) * k2*
x ( s'
1
s'
0
) * c * k1*
k2*
x
S'
s'
0
2
1 k1*
x k2*
x c * k1*
k2*
x
2
( s'
1
s'
0
) *
1
2
k2*
x c * k1*
k2*
x
k1*
x k2*
x c * k1*
k2*
x
2
Ces deux équations permettent d‟obtenir les valeurs de k1 et k2 et donc de c.
Pour réaliser ce type d‟expérience, il faut deux signaux indépendants et qui permettent de
suivre l‟occupation d‟un seul site ou bien de réaliser des mutants isofonctionnels qui
présentent un signal physique spécifique d‟un seul site.
72

Protéines avec n ligands (vision macroscopique)
On peut représenter la suite des complexes stœchiométriques sur une protéines qui possèdent
n sites.
P PL PL 2 ........... PLi-1 PLi .............. PL n-1
PL n
K 1 K 2 Ki K n-1 K n
K
i
PL
PL
i 1
i
* L
et K 0 =1
On a donc :
S
i
i
n
S *(
i
0 j 0
i n
(
j i
i 0 j 0
j
i
i
K ) * x
i
K ) * x
j
j
Protéines avec deux ligands différents
Représentation du système et modélisation du système
73

On a ks, ki, et ci,s le facteur de couplage
On a l‟équation suivante :
S
S
0
S * k
i
1
i
*( I)
k *( I)
i
S
s
* k
k
s
s
*( S)
*( S)
c
i,
s
S
i,
s
* k
* c
i
i,
s
* k
s
* k
i
* k
s
*( S)*(
I)
*( S)*(
I)
Si les deux sites sont indépendants, alors ci,s=1. Si on a compétition stricte entre I et S, alors
ci,s=0. Si ci,s >1, on a une coopérativité positive entre les deux sites. Si ci,s

Inhibition noncompetitive : S0=Si=Si,s=0, ci,s=1 et Ss=Vm
Inhibition incompetitive : S0=Si=Si,s=0, ki=0 , ki*ci,s=Ki et Ss=Vm
Protéines avec n ligands différents
On considère une protéine avec n ligands différents et chaque ligands sur un site. Soit xi la
concentration du ligand Li
On a l‟équation suivante :
S
j
j
i
i
1
0
S
j ,..., j
j
j
i
i
1
1
0
c
n
* c
j ,..., j
1
j ,..., j
n
1
n
* k
j
1
* k
1
j
1
1
*...* k
*...* k
j
n
n
j
n
n
* x
j
1
* x
1
j
1
1
*.....* x
*.....* x
j
n
n
j
n
n
Ou en rassemblant les monômes de même degré total
S
k
k
n
0 j1
...
k n
S
j1
,..., jn
jn
k
k 0 j1
...
c
* c
j1
,..., jn
jn
k
j1
,..., jn
* k
j1
1
* k
j1
1
*...* k
*...* k
jn
n
jn
n
* x
j1
1
* x
j1
1
*.....* x
*.....* x
jn
n
jn
n
Si l‟on considère que les ligands sont tous les mêmes, alors
x1=x2=....=xn et on a :
S
k
k
n
(
0 j1
...
k
k
n
(
s
j1
,..., jn
jn
k
0 j1
...
c
* c
j1
,..., jn
jn
k
j1
,..., jn
* k
j1
1
* k
j1
1
*...* k
*...* k
jn
n
jn
n
) * x
) * x
k
k
On a donc les relations entre constantes stœchiométriques, constantes individuelles et facteurs
de couplages
j
j
k
K
j
0 j1
...
j1
c
j ,..., j
* k
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On a une relation similaire reliant les signaux associés avec chaque complexe.
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IMAGERIE CALCIQUE DU SYSTEME OLFACTIF DE L’ABEILLE DOMESTIQUE :
DU CERVEAU A LA CELLULE
Valérie Raymond-Delpech, Nina Deisig, Tristan Jaillard & Jean-Christophe Sandoz
Centre de Recherches sur la Cognition Animale, CNRS UMR 5169, Université Paul Sabatier
118 Route de Narbonne, 31062 TOULOUSE Cedex 4, France
Depuis de nombreuses années, l‟abeille domestique est un sujet d‟étude de
neuroanatomie, neurophysiologie et de comportement important, en particulier en ce qui
concerne ses capacités de communication, de perception, de mémoire et d‟apprentissage (von
Frisch 1967, Menzel 1999). Le sens olfactif joue chez l‟abeille un rôle primordial, étant
impliqué aussi bien dans les relations sociales entre individus de la colonie (communication
phéromonale) que dans le contexte du butinage. Dans la ruche, des phéromones émises par la
reine inhibent par exemple le développement ovarien des ouvrières, induit un comportement
de cours de la part des ouvrières, et assure la cohésion de la colonie (Free 1987). Les
ouvrières émettent elles aussi des phéromones, induisant ainsi une agrégation des
individus, ou un comportement de défense (Free 1987). Lors de la récolte de nourriture, les
odeurs des fleurs constituent des signaux importants, que les ouvrières sont capables
d‟apprendre et de mémoriser sur de longues périodes de temps, ce qui augmente
considérablement leur succès de butinage (von Frisch 1967, Menzel et al. 1993). Elles
forment alors des associations entre les odeurs rencontrées et la qualité du nectar obtenu et
utilisent des processus cognitifs qui peuvent être dans certains cas très complexes (Giurfa
2003). La question qui se pose alors est comment le système nerveux plutôt simple de cet
insecte lui permet de détecter, différencier, reconnaître et apprendre ces signaux olfactifs ?
Dans cet article, nous aimerions montrer l‟intérêt d‟une approche intégrée allant de l‟étude de
signaux évoqués par les odeurs sur le cerveau entier in vivo à celle des flux calciques dans des
neurones du système olfactifs en culture. Les études que nous présentons utilisent toutes
l‟imagerie calcique, avec différents types de marquages qui donnent chacun des informations
complémentaires. Nous expliquons comment sont réalisées ces expériences et comment elles
sont utilisées pour répondre à nos questions.
Grâce à de nombreux travaux de neuroanatomie, les structures nerveuses impliquées dans le
traitement des signaux olfactifs sont bien connues (Mobbs 1982 ; Flanagan et Mercer 1989).
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Les stimuli olfactifs sont détectés par les récepteurs olfactifs portés par approximativement
60.000 neurones sensoriels des antennes. Les axones des neurones sensoriels olfactifs se
projettent dans le lobe antennaires (Figure 1), le premier relais de la voie olfactive, qui
correspond au bulbe olfactif des vertébrés. Chaque lobe antennaire est constitué
d‟approximativement 160 structures sphériques de 30-50 m, les glomérules (Flanagan et
Mercer 1989). C‟est au sein de ces glomérules que les neurones sensoriels se connectent avec
les neurones de projection (800 environ) qui transmettent ensuite l´information vers les centre
nerveux supérieurs, comme les corps pédonculés ou le protocerebrum latéral. Dans les
glomérules, on distingue aussi les synapses de 4000 neurones inhibiteurs locaux. C‟est au
niveau de ces réseaux neuronaux du lobe antennaire que ce ferait le premier traitement
nerveux de l‟information olfactive. De par sa structure modulaire, le lobe antennaire se prête
extrêmement bien à une étude de la représentation nerveuse des odeurs : les glomérules sontils
des structures fonctionnelles individuelles qui nous permettraient de lire comment est
codée l‟information olfactive dans le cerveau ?
Figure 1: Le cerveau de l‟abeille et la voie olfactive. a) Tête d‟ouvrière montrant la position du
cerveau. Le premier relais de traitement de la voie olfactive, le lobe antennaire est encadré en blanc;
b) Vue schématique des principales structures du cerveau d‟abeille dans la même position qu‟en a). A
gauche la voie olfactive et les connexions les plus importantes. LA : lobe antennaire (encadré en noir),
CP : corps pédonculés, LPL : lobe protocérébral latéral, CL : calice latéral, CM : calice médian, Pe :
pédoncule, α : lobe α, : lobe , NSO : neurones sensoriels olfactifs, NP : neurones de projection ;
c) Schéma de la connectivité du lobe antennaire (exemple dans un glomérule). Les neurones sensoriels
(NSO) se projettent dans les glomérules, unités fonctionnelles du LA. Des réseaux d‟interneurones locaux
(INL) induisent d´importantes inhibition latérales entre glomérules. Les neurones de projection (NP)
transmettent l‟information traitée vers les centres nerveux supérieurs (b et c, figures d‟après B.
Grünewald et G. Galizia, Berlin, Allemagne).
La technique d´imagerie optique permet de mesurer l´activité de populations de neurones en
même temps. Chez l´abeille, c‟est grâce à l‟imagerie calcique que l‟on a pu pour la première
fois révéler l‟activité cérébrale induite par une odeur (Joerges et al. 1997). Cette technique est
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aujourd‟hui utilisée en routine pour comprendre comment l‟information olfactive est codée
dans le cerveau.
Protocole 1 : Préparation du cerveau in vivo et imagerie calcique du lobe antennaire
Les abeilles sont anesthésiées par le froid sur de la glace pillée jusqu‟à immobilité, afin de permettre une
manipulation plus aisée. Elles sont ensuite fixées sur un support en plexiglas permettant d‟isoler physiquement la
région céphalique du reste du corps pour les enregistrements d‟imagerie. La tête est maintenue immobile à l‟aide
de cire dentaire fondant à basse température (Deiberit 502, Böhme & Schöps, Allemagne). Grâce à la cire et à de
la colle Epoxy à deux composants (type Araldite), on crée une zone étanche autour du cerveau, laissant les
antennes, organes olfactifs, à l‟air libre, afin de pouvoir leur appliquer des stimulation olfactives. Les pièces
buccales sont fixées à la cire pour éviter tout mouvement de la préparation. Une fenêtre est alors découpée dans
la cuticule de la capsule céphalique, des antennes à l‟avant jusqu‟aux ocelles à l‟arrière, en suivant le contour
délimité par les yeux sur les côtés. Une fois la cuticule retirée, les glandes mandibulaires, les trachées et les
membranes qui recouvrent le cerveau sont retirées délicatement à l‟aide de pinces extra-fines. La zone étanche
réalisée permettra de baigner le cerveau dans du liquide physiologique (Ringer : 130 mM NaCl, 6 mM KCL, 4
mM MgCl 2 , 5 mM CaCl 2 , 160 mM sacchacrose, 25 mM glucose, 10 mM HEPES, pH 6,7). La sonde calcique
utilisée est le Calcium Green 2-AM (Molecular Probes, Oregon, USA). Le groupement acétoxyméthylester (AM)
rend la sonde liposoluble, ce qui permet au colorant de passer à travers les membranes plasmiques et de marquer
ainsi toutes les cellules. Dans le cytoplasme, la sonde devient fonctionnelle après le clivage du groupement AM
par les estérases endogènes. Une dose de 50μg est diluée dans 20 μl de Pluronic F-127 (solution à 20% dans du
DMSO) puis dans 800 μl de Ringer, pour une concentration finale de 33 M. Le marquage se fait en bain, en
déposant 20 μl de cette solution sur le cerveau. L‟incubation est effectuée sur de la glace pendant 1h, après quoi
le cerveau est abondamment rincé à l‟aide de Ringer.
Les expériences d‟imagerie calcique sont réalisées à l‟aide d‟un système d‟imagerie T.I.L.L. photonics
(Gräfelfing, Allemagne) adapté sur un microscope à épifluorescence Olympus BX51WI. Le système d‟imagerie
est composé d‟un monochromateur permettant d‟exciter la préparation avec une longueur d‟onde donnée (bande
d‟environ 15 nm), d‟une caméra refroidie (IMAGO, 12bits), d‟un ordinateur contenant un logiciel d‟acquisition
et d‟exploitation des images (Tillvision). Les enregistrements sont réalisés à l‟aide d‟objectifs 10x et 20x à
immersion à eau (Olympus). La préparation est excitée à 475nm (optimum du colorant in vivo). Un système
contenant un filtre dichroique (à 505nm) et un filtre d‟émission (laissant passer la lumière au-dessus de 515 nm)
permet de récupérer principalement la lumière pertinente, i.e. correspondant à la concentration intracellulaire de
calcium. L‟intensité du signal fluorescent étant relativement faible, il est nécessaire de regrouper plusieurs pixels
entre eux (« binning » horizontal et vertical). Les images sont donc réalisées avec un « binning » de 4 (16 pixels
regroupés), avec 45 à 60 ms d‟exposition et sont capturées à une fréquence de 5 Hz avec une résolution de 12
bits (4095 niveaux de gris). Un enregistrement typique dure 20 sec (100 images), une odeur étant présentée à
l‟abeillependant 1 sec, entre les images 15 et 20.
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Figure 2 : Signaux calciques dans le lobe antennaire d‟abeille in vivo. a) Cartes d‟activation présentant en
fausses couleurs (ici niveaux de gris) l‟amplitude du signal obtenu avec une odeur donnée en différents points de
la zone imagée. Les numéros correspondent aux glomérules identifiés à ces emplacements. Alors que le 2-
octanol active les glomérules 17, 28, 33 et 52, le 1-hexanol active les glomérules 28, 36, 38 et 52. b) Cinétique
des signaux calciques enregistré après marquage en bain. On observe un signal biphasique, dont le maximum est
obtenu 1 sec après le début de la stimulation olfactive.
Sur une bonne préparation, on obtient un signal calcique au niveau de zones circulaires
d‟environ 30-50 m de diamètre (Figure 2a). Grâce à un marquage servant à révéler les zones
neuropilaires du lobe (par exemple grâce à la sonde de potentiel RH795 associée à une
protéase pour favoriser le marquage), on peut révéler que les signaux prennent leur origine au
sein des glomérules (Joerges et al. 1997, Sachse et al. 1999). En conditions classiques on peut
imager en même temps environ 30 glomérules à la surface du lobe antennaire. Le signal
calcique est biphasique, montrant d‟abord une augmentation de fluorescence avec un
maximum 1 sec après le début de la stimulation olfactive, puis une décroissance avec un
minimum environ 10 sec après, et enfin un retour à la ligne de base dans les 20 sec (Figure 2b)
Cette technique d‟imagerie calcique du lobe antennaire in vivo a permis de montrer que les
odeurs induisent des motifs d´activité glomérulaire différents, i.e. pour différentes odeurs, une
combinaison différente de glomérule sera activée (Figure 2a). Ces motifs d‟activité sont
reproductibles chez un même individu, mais aussi entre individus (Galizia et al. 1999, Sachse
et al. 1999). De plus, ils sont bilatéralement symétriques (Sandoz et al. 2003). Récemment,
nous avons pu montrer que ces signaux calciques nous renseignent effectivement sur la
manière dont les abeilles perçoivent le monde olfactif (Guerrieri et al. 2005) : en effet, en
comparant les résultats obtenus en imagerie calcique avec ceux obtenu en comportement, on a
observé que les relations de similarité entre odeurs sont les mêmes avec les deux types de
mesures. Ainsi, des odeurs similaires sur le plan des signaux induits dans le cerveau sont
traitées comme similaires par les abeilles dans leur comportement ! Cette technique
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d´imagerie calcique a aussi été utilisée pour étudier les effets d‟un apprentissage olfactif, dans
lequel l‟abeille apprend à associer une odeur à une récompense sucrée (conditionnement de
l‟extension du proboscis). Ainsi, il a été montré qu‟un apprentissage olfactif induit des
modifications des signaux calciques à court (Faber et al. 1999) mais aussi à plus long terme
(Sandoz et al. 2003).
De quels neurones proviennent ces signaux ?
Afin d‟interpréter les expériences citées plus haut sur la perception et l‟apprentissage olfactifs
utilisant ces marquages en bain avec la sonde calcique, il est important de connaître leur
origine. Ainsi, comme nous l‟avons vu plus haut, différents types cellulaires peuvent être
potentiellement marqués par la sonde calcique AM : neurones sensoriels, interneurones
locaux, neurones de projection. Pour différentes raisons, nous pensons que les signaux
enregistrés correspondent de manière prépondérante à la participation des neurones sensoriels
olfactifs. Premièrement, ils sont les plus nombreux (60000 par lobe). Ensuite, les signaux
observés sont très stéréotypés, et ne montrent jamais d‟activité spontanée ou d‟inhibition à la
présentation de l‟odeur, ce qui est une caractéristique des interneurones locaux et des
neurones de projection. Une méthode développée récemment (Sachse et Galizia 2002)
marquant spécifiquement les neurones de projection permet de nous en rendre compte (Figure
3) :
Protocole 2 : Imagerie calcique des neurones de projection in vivo
La préparation de l‟abeille est similaire à celle utilisée pour les marquages en bain. Les neurones de projection
quittent le lobe antennaire pour se projeter dans d‟autres centres nerveux (Figure 1). Nous profitons de cette
caractéristique en lésant spécifiquement un tractus de neurones de projection (l-ACT) grâce à une électrode fine
de verre. Des cristaux de Fura-2 dextran (10kDa ; Molecular Probes, USA) sont dilués dans une goutte de
quelques microlitres de BSA (bovine serum albumine) à 2%, et après épaississement, la pâte formée est enduite
au bout de l‟électrode. Le colorant est déposé à l‟aide de l‟électrode au niveau de la lésion. Lors de l‟incubation,
qui dure entre 3 et 6h, il sera pris en charge par les neurones lésés et pourra migrer grâce au groupement dextran
jusque dans les terminaisons post-synaptiques présentes au niveau des glomérules du lobe antennaire. C‟est à ce
niveau que nous pouvons observer les réponses calciques des neurones de projection (ce sont alors les seuls
marqués) à des odeurs. On utilise pour cela le même système d‟imagerie que précédemment, mais en excitant la
préparation alternativement à 340nm et à 380 nm (100 images à 5 Hz pour chaque longueur d‟onde). Le temps
d‟excitation est en général de 15-60 ms à 340 nm et de 5-15 ms à 380 nm Un filtre dichroïque à 410 nm et un
filtre d‟émission à 440 nm, permettent de récupérer la lumière émise par le fluorochrome lors des deux
excitations. Le calcul du ratio entre les signaux obtenus à 340 nm et 38 nm nous permet de connaître les
80

variations de concentration de calcium intracellulaire dans les neurones de projection. En réponse à l‟odeur, des
types de réponses plus complexes sont observés que lors d‟un marquage en bain (Figure 3): la plupart des
réponses sont de types excitateur (environ 80%), avec une augmentation du ratio de fluorescence qui atteint un
maximum environ 600ms après le début de la stimulation odorante, et une décroissance au niveau de base la
plupart du temps très rapide, mais dans certains cas plus lente (voir les deux types de cinétiques en Figure 3b).
Dans certains glomérules, on observe des réponses de type inhibiteur, le ratio décroissant rapidement à l‟odeur,
avant de revenir à la ligne de base en fin de présentation d‟odeur.
Figure 3 : Exemple d‟enregistrements spécifiques in vivo des neurones de projection, grâce au Fura-2 dextran. a)
Carte d‟activité du lobe antennaire en réponse au 2-octanol. On remarque une correspondance entre les glomérules
activés dans ce cas, et lors du marquage enbain (comparer avec Fig 2). b) Les deux types de réponses observés : à
gauche (glomérule 17) on observe une augmentation du ratio en réponse aux deux odeurs présentées. A droite
(glomérule 49), c‟est une claire diminution qui est observée. Ces variations de concentration calcique proviennent des
dendrites des neurones de projection.
Les signaux observés grâce à ces marquages spécifiques et à des enregistrements
électrophysiologiques ont permis de montrer que les signaux calciques suivent très bien les
phases d‟excitation (augmentation du nombre de potentiel d‟action) ou d‟inhibition (baisse du
nombre de potentiels d‟action en dessous du niveau d‟activité spontanée) de ces neurones
(Galizia et Kimmerle 2004). Ces signaux sont donc de bons indicateurs de l‟activité neuronale
induite par les odeurs, et permettent de comprendre comment le réseau du lobe antennaire
traite l‟information olfactive. Par exemple, on peut montrer que les odeurs activent moins de
glomérules que lors d‟un marquage en bain. On note de plus que la différence entre les motifs
d‟activation des odeurs est plus marquée, en particulier à de faibles concentrations d‟odeurs
(Sachse et Galizia 2002, 2003), ce qui laisse penser que le lobe antennaire augmente le
contraste entre stimuli, envoyant ainsi une représentation neuronale des odeurs plus distinctes
vers les centres supérieurs. Les réponses inhibitrices observées sont, elles, le fruit d‟inhibition
latérales entre glomérules et sont dues aux interneurones locaux.
81

Origine du calcium impliqué dans la perception olfactive
Comme nous l‟avons vu, les signaux calciques observés in vivo reflètent bien l‟activité
électrique des neurones, induite par la présentation d‟odeurs. Jusqu‟ici, on s‟est très peu
intéressé au calcium per se, et à ce jour, aucune étude n‟a permis de déterminer au niveau
cellulaire comment les signaux calciques observés in vivo sont initiés. Comme chez les autres
insectes, le système cholinergique est très développé dans le cerveau de l‟abeille (Bicker
1989). De nombreux éléments indiquent que les neurones olfactifs (neurones sensoriels et
neurones de projection) sont cholinergiques (Kreissl et Bicker 1989). C‟est pourquoi
l‟acétylcholine (ACh) est présentée comme le neurotransmetteur de la voie nerveuse olfactive.
L‟ACh peut agir sur deux types de récepteurs : les récepteurs ionotropes nicotiniques
(AChRn), qui sont perméables aux cations, et les récepteurs métabotropes muscariniques
(AChRm) qui entraînent l‟activation de cascades intracellulaires. Des expériences de
marquages immunohistochimiques ont révélé la présence d‟AChE dans le système olfactif,
avec un marquage de forte intensité au niveau des glomérules. De plus, dans le lobe
antennaire, il existe des sites de liaison à un antagoniste des récepteurs nicotiniques, l‟ -
bungarotoxine ( -BGT) (Kreissl et Bicker 1989, Bicker 1999). Récemment, des expériences
d‟hybridation in situ menées au laboratoire ont permis de préciser que les cellules des LA
possèdent des ARN messagers codant pour des sous-unités entrant dans la composition de
différents récepteurs nicotiniques (Thany et al. 2003, 2005). Chez la drosophile, des
récepteurs muscariniques (DM1) ont été localisés par immunohistochimie principalement
au niveau des glomérules (Blake et al. 1993). Des travaux en imagerie calcique sur la lignée
cellulaire S2 de drosophile exprimant le récepteur DM1 ont permis de mettre en évidence que
l‟activation de ces récepteurs entraîne des variations de Ca 2+ d‟origine intracellulaire, à partir
des stocks calciques internes (Raymond Delpech et al. 2004). Sur le plan comportemental,
l‟acétylcholine participe aux fonctions d‟apprentissage et de mémoire, impliquant des rôles
très importants mais différents pour les récepteurs nicotiniques et muscariniques (Cano
Lozano et Gauthier 1998, Cano Lozano et al. 2001). En raison de leur localisation dans les
lobes antennaires, ces récepteurs pourraient être impliqués dans les variations de Ca 2+
observées dans les cellules du lobe antennaire. Nous utilisons une méthode d‟imagerie
cellulaire sur ces cellules afin de tester leurs réponses à l‟ACh et à des agonistes des deux
types de récepteurs.
82

Amplitude moyenne (%)
Protocole 3 : Imagerie calcique de neurones du lobe antennaire in vitro
1) Préparation cellulaire : Les abeilles sont anesthésiées par le froid sur de la glace pillée jusqu‟à
immobilité. La cuticule de la capsule céphalique est ouverte et le cerveau découvert comme dans les protocoles
précédents. La cavité céphalique est alors remplie de milieu Leibovitz L15 additionné de saccharose (122,7 mM),
de glucose (22,2 mM), de fructose (13,9 mM), de proline (28,7 mM) et d‟antibiotiques (Pénicilline [200 UI/ml],
Streptomycine [200 g/ml]), le pH étant ajusté à 7,4 avec du NaOH. Etant donné que les somas des cellules du
lobe antennaire se situent à sa base (voir leur position en haut à droite de la Figure 1c), l‟ensemble du lobe est
prélevé sous loupe binoculaire à l‟aide de pinces extrafines. L‟isolement des cellules est ensuite réalisé en
conditions stériles grâce à une digestion enzymatique suivie d‟une dissociation mécanique. Pour cela, les tissus
prélevés sont incubés pendant 30 minutes dans du liquide physiologique contenant un mélange de collagénase
(0,25 mg/ml)/protéase (1 mg/ml) et dépourvu de calcium et de magnésium. La dissociation mécanique est
ensuite réalisée dans du milieu de culture contenant du sérum de veau fœtal (13%) par passages successifs des
tissus digérés à travers des pipettes de diamètres décroissants. Vingt microlitres de suspension cellulaire sont
ensuite délicatement déposés sur une lamelle de verre recouverte d‟un mélange concanavaline A/ laminine.
Après avoir laissé les cellules adhérer, du milieu de culture est ajouté. Les cellules sont alors maintenues dans
une étuve à 26°C en atmosphère humide jusqu‟à leur utilisation lors des expériences d‟imagerie.
2) Imagerie cellulaire : Les expériences sont réalisées avec la sonde calcique Fura2-AM, qui est déposée à
une concentration entre 2 et 5 M (avec pluronic et DMSO – Cf Protocole 1) dans les boîtes de Pétri contenant
les cellules. Grâce au groupement AM, la sonde pénètre dans les cellules pendant l‟incubation, qui dure entre 30
et 75 min. Les expériences sont réalisées avec le même système d‟imagerie que précédemment, avec un objectif
20x à immersion à eau. Les images sont réalisées avec un « binning » de 4 à une fréquence comprise entre 0,5 et
4 Hz. Le temps d‟exposition aux longueurs d‟onde d‟excitation du fura2-AM (340 nm et 380 nm, voir plus haut)
est compris entre 5 et 50 ms. Contrairement aux expériences présentées précédemment, du liquide physiologique
est perfusé en continu (débit réglé à 5 ml/min par une pompe péristaltique) lors de l‟expérience. Le liquide
perfusé est extrait en permanence par une pompe à vide de telle manière que la quantité de liquide dans la
chambre reste constante. Un système de perfusion par gravité permet d‟effectuer les stimulations
pharmacologiques de manière contrôlée, pendant une durée fixe (ici 15 sec).
Grâce à ce protocole d‟imagerie cellulaire, nous avons pu étudier les réponses des cellules du
lobe antennaire à l‟ACh. Ainsi, l‟application d‟ACh à la dose de 10 -5
M entraîne une
augmentation de calcium dans la plupart des cellules en culture [67 % (10/15)] (Figure 4).
a
ACh 10 -4 M
b
115
105
Δ ratio 0,1
1 min
95
90
0
LP ACh 10 -5 M LP ACh 10 -4 M
Figure 4 : Récepteurs cholinergiques des cellules du lobe antennaire. a) Exemples de tracés de l‟évolution du ratio de
fluorescence (Δ ratio) en fonction du temps (min). L‟application d‟ACh (10 -4 M) entraîne une augmentation du calcium
cytoplasmique dans les cellules isolées en culture. b) Représentation en pourcentage de l‟amplitude moyenne des réponses
(± SEM). Suite aux applications d‟ACh 10 -5 et 10 -4 M sur les cellules isolées, les amplitudes des réponses sont
significativement supérieures à celles du liquide physiologique (LP).
83

Amplitude moyenne +/- SEM (%)
L‟amplitude moyenne des réponses calciques est de 106,5 ± 3,7 % (n = 6). L‟application
d‟ACh à la dose de 10 -4 M entraîne une augmentation plus importante du niveau de calcium
dans les cellules. L‟amplitude moyenne des réponses est de 109,2 ± 4,9 % (n = 27).
Ces résultats montrent que la plupart des cellules du lobe antennaire portent des récepteurs
membranaires sensibles à l‟ACh. L‟activation de ces récepteurs cholinergiques induit une
augmentation du calcium cytoplasmique, qui semble de plus croissante en fonction de la dose
d‟ACh, confirmant que ces réponses sont bien liées à l‟application d‟ACh. Comme nous
l‟avons indiqué précédemment, l‟ACh peut agir sur des récepteurs nicotiniques et/ou des
récepteurs muscariniques. Ces 2 types de récepteurs peuvent induire des événements
moléculaires différents pouvant mener à une entrée du calcium extracellulaire (récepteurs
nicotiniques) ou à une sortie du calcium contenu dans les stocks internes (récepteurs
muscariniques). Afin d‟identifier plus précisément le type de récepteurs mis en jeu,
l‟application d‟agoniste pour chacun de ces récepteurs a été réalisée. Ainsi, l‟application de
nicotine (10 -4 M) entraîne une augmentation du taux de calcium dans 71 % (5/7) des cellules.
L‟amplitude moyenne des réponses est de 103 ± 0,5 % (n = 4). De manière similaire,
l‟application de muscarine (10 -5 M) entraîne une augmentation de Ca 2+ dans 68 % (17/25) des
cellules en culture (Figure 5). Leur amplitude moyenne est de 103,9 ± 0,2 % (n = 9). Ceci
suggère que des récepteurs cholinergiques sensibles à la nicotine et des récepteurs sensibles à
la muscarine sont exprimés par les cellules du lobe antennaire et que leur activation entraîne
une augmentation du calcium cytoplasmique.
110
105
100
95
0
LP
10 -5 M
Figure 5 : Récepteurs sensibles à la muscarine exprimés sur les cellules du lobe antennaire
Représentation en pourcentage de l‟amplitude moyenne des réponses (± SE M). Suite aux applications de
muscarine 10 -5 sur les cellules isolées, les amplitudes des réponses sont significativement supérieures à celles
du liquide physiologique (LP).
84

Ce type d‟approche nous permet d‟approcher de plus près les phénomènes cellulaires qui ont
lieu lors de la perception d‟une odeur, c'est-à-dire, lorsque de l‟acétylcholine est libéré par les
neurones sensoriels dans les glomérules du lobe antennaire. A l‟avenir, il sera nécessaire de
préciser le profil pharmacologique des récepteurs cholinergiques en utilisant différents
antagonistes spécifiques des récepteurs nicotiniques et muscariniques. Enfin, l‟effet des
neurotransmetteurs responsables de l‟inhibition latérale au sein du lobe antennaire (en
particulier le GABA) sur ces réponses devra être étudié.
Conclusion : Nous avons décrit trois types de protocoles expérimentaux qui nous permettent
d‟étudier des réponses calciques globales aux odeurs au niveau du cerveau entier in vivo
(Protocole 1), de suivre les réponses calciques de populations de neurones identifiés in vivo
(Protocole 2) et enfin d‟étudier précisément les réponses calciques de cellules en culture en
réponse à des agonistes du système cholinergique (Protocole 3). Cet ensemble d‟expériences
d‟imagerie calcique, utilisé comme révélateur d‟activité ou comme indicateur calcique per se,
montre l‟intérêt d‟une approche intégrée allant de l‟animal entier à la cellule, et la valeur d‟un
modèle insecte comme celui de l‟abeille pour ce type d‟approche.
Bibliographie
Bicker G. (1999) Histochemistry of classical neurotransmitters in antennal lobes and mushroom bodies of the
honeybee. Microsc Res and Tech, 45: 174-183.
Blake A. D., Anthony N. M., Chen H. H., Harrison J. B., Nathanson N. M., Sattelle D.B. (1993) Drosophila
nervous system muscarinic acetylcholine receptor transient functional expression and localization by
immunocytochemistry. Mol Pharm, 44: 716-724.
Cano Lozano V., Gauthier M. (1998) Effects of the muscarinic antagonists atropine and pirenzepine on olfactory
conditioning in the honeybee; Pharm Bioch and Behav., 59: 903-907.
Cano Lazano V., Armengaud C., Gauthier M. (2001) Memory impairment induced by cholinergic antagonists
injected into the mushroom bodies of the honeybee. J Comp Physiol, 187: 249-254.
Faber T., Joerges J., Menzel R. (1999) Associative learning modifies neural representations of odors in the insect
brain. Nature neuroscience, 2, (1): 74-78.
Flanagan D., Mercer A.R. (1989) An atlas and 3-D reconstruction of the antennal lobes in the worker honey bee,
Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae). Int.J.Insect Morphol.& Embryol. 18:145-159.
Free J. B. (1987) Pheromones of social bees, London:Chapman & Hall.
Galizia CG, Sachse S, Rappert A, Menzel R. 1999a. The Glomerular code for odor representation is species
specific in the honeybee Apis mellifera. Nature neuroscience 2: 473-478
Galizia C.G., Kimmerle B. (2004) Physiological and morphological characterization of honeybee olfactory
neurons combining electrophysiology, calcium imaging and confocal microscopy. J Comp Physiol,
190 :21-38.
Guerrieri F., Schubert M., Sandoz J.C., Giurfa M. (2005) Perceptual and neural olfactory similarity in honeybees.
PLOS Biol, 3 : 1-14.
Joerges J., Kuttner A., Galizia C.G., Menzel R. (1997) Representations of odours and odour mixtures visualized
in the honeybee brain. Nature, 387: 285-288.
Kreissl S., Bicker G. (1989) Histochemistry of acetylcholinesterase and immunocytochemistry of an
acetycholine receptor-like antigen in the brain of the honeybee. J Comp Neurol, 286: 71-84.
85

Menzel R., Greggers U., Hammer M. (1993) Functional organization of appetitive learning and memory in a
generalist pollinator, the Honey Bee. In: Insect learning: Ecological and evolutionary perspectives,
edited by D. Papaj and A. C. Lewis, New York:Chapman & Hall, p. 79-125.
Menzel R. (1999) Memory dynamics in the honeybee. J Comp Physiol A 185, 323-340.
Mobbs P.G. (1982) The brain of the honeybee Apis mellifera. The connections and spatial organization of the
mushroom bodies. Phil Trans R. Soc Lond, 298, 309-354.
Raymond Delpech V., Towers P., Sattelle D. (2004) Gene silencing of selected calcium-signaling molecules in a
drosophila cell line double-stranded RNA interference. Cell Calcium, 35: 131:139.
Sachse S., Rappert A., Galizia C.G. (1999) The spatial representation of chemical structures in the antennal lobe
of honeybees: Stepps towards the olfactory code. Eur J Neurosci, 11: 3970-3982.
Sachse S., Galizia C.G. (2002) Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output
neurons: a calcium imaging study. J Neurophysiol., 87: 1106-1117.
Sachse S., Galizia C. G. (2003). The coding of odour-intensity in the honeybee antennal lobe: local computation
optimizes odour representation. Eur J Neurosci 18 (8):2119-2132.
Sandoz J.C., Galizia C.G., Menzel R. (2003) Side-specific olfactory conditioning leads to more specific odor
representation between sides but not within sides in the honeybee antennal lobes. Neurosci, 120 : 1137-
1148.
Thany S.H., Lenaers G., Crozatier M., Armengaud C., Gauthier M. (2003) Identification and localization of the
nicotinic acetylcholine receptor alpha3 mRNA in the brain of the honeybee, Apis mellifera. Insect Mol
Biol, 12: 255-262.
Thany S.H., Crozatier M., Raymond-Delpech V., Gauthier M., Lenaers G. (2005) Apis 2, Apis 7-1 and
Apis 7-2: three new neuronal nicotinic acetylcholine receptor -subunits in the honeybee brain. Gene,
344: 125-132.
von Frisch, K. (1967) The dance language and orientation of bees, Cambridge:Harvard Univ.Press.
86

VARIATIONS CALCIQUES DANS LE SYSTEME NERVEUX CENTRAL DE
DROSOPHILE
Philippe Rosay
Université de Bordeaux 1, Laboratoire de Neurosciences Cognitives, Avenue des Facultés
33405 Talence Cedex, France
Préambule
Le calcium, et ses variations de concentration, sont maintenant connus pour réguler une
gamme tellement vaste de processus cellulaires, qu‟il convient de préciser le champ de ce
document. En effet, même en se limitant aux neurones (en développement ou matures),
cerner toutes les fonctions du calcium est extrêmement difficile. Le calcium intervient
dans la libération rapide de neurotransmetteurs, comme dans les changements de plus
longue durée, avec modifications de l‟expression des gènes. Notre propos se concentrera
sur la description de telles variations de niveau de calcium intracellulaire, dans des
neurones matures de la drosophile et leur possible contribution dans la consolidation de
la mémoire chez cet insecte.
La mémoire
Deux questions intéressantes sur le fonctionnement du système nerveux de Drosophile se
résument ainsi : « Que nous apprend la Drosophile ? » et d‟abord « Que peut on
apprendre à une mouche ? » (Waddel S, 2001). Dans un conditionnement de type
pavlovien, les mouches peuvent être entraînées à fuir une odeur si elles en ont fait
préalablement l‟expérience avec un choc électrique (Tully T, 1985). C‟est un
apprentissage simple qui demande à l‟animal d‟intégrer deux indices, l‟odeur (un
stimulus conditionnant) et un choc électrique (stimulus inconditionnel). Il est bien sur
possible d‟apprendre aux mouches à se diriger vers une odeur, dans ce cas en l‟associant
à une récompense, généralement de la nourriture. Ces capacités d‟apprentissage sont
particulièrement accessibles à l‟analyse génétique dans cet organisme. Les trente
dernières années été riches en découvertes, avec surtout des moyens diversifiés de muter
les mouches pour tester leur descendance pour des défauts d‟apprentissage ou de
mémoire (Dudai, 1976). Les mutants retenus sont ceux qui gardent la sensibilité aux
chocs électriques, leur capacité gustative ou à détecter les odeurs ;
Les premières (et la majorité) des mutagenèses ont été menées avec le paradigme
d‟apprentissage olfactif. Depuis la découverte des gènes dunce, rutabaga, amnesiac et radish,
le comportement des mutants a été analysé très en détail, et donne maintenant une image
d‟ensemble de la mémoire qui comporte des phases distinguables à la fois génétiquement et
aussi dans leur succession temporelle (figure 1). L‟apprentissage est perturbé dans les mutants
latheo, volado, linotte ou turnip, alors que la mémoire à court terme (une heure après
l‟apprentissage, pour donner un ordre de grandeur) est dépendante du bon fonctionnement des
produits des gènes dunce, shaker ou rutabaga. Le gène amnesiac est particulier à la mémoire à
moyen terme, sa mutation n‟empêche pas d „apprendre convenablement, mais l‟oubli vient
très vite, ce qui donne un accès moléculaire pour comprendre la phase de consolidation de la
mémoire.
87

Figure 1 : les différentes phases de la mémoire. Du point de
vue expérimental, la décroissance de la rétention est régulière avec le
temps (“observation”). Il est possible de distinguer une mémoire à
court, moyen et long terme, et une mémoire résistant à l‟anesthésie
(d‟après Margulies, 2005).
De ces expériences émergent trois propriétés universelles. D‟abord, immédiatement
après l'apprentissage, les informations sont mémorisées sous une forme dite fragile et
éphémère. Puis suit une consolidation de cette mémoire (en quelques heures) qui devient alors
plus stable et durable. Ensuite (et c‟est vrai pour les humains !) un apprentissage par étapes
successives (la répétition d'une même expérience) permet d'obtenir rapidement une mémoire
consolidée. Enfin, certains traitements comme un choc électrique, l'administration
d'anesthésiants, l'injection de composés inhibant la synthèse protéique, peuvent ralentir ou
bloquer la consolidation de la mémoire.
Chez la Drosophile, la mémoire consolidée d'un apprentissage associatif est divisée en deux
entités additives, génétiquement distinctes et fonctionnellement indépendantes: la mémoire
résistant aux anesthésiques (ARM) et la mémoire à long terme (LTM). Si la première
s'estompe en quatre jours et est résistante par exemple aux chocs hypothermiques, la
deuxième perdure après 7 jours et implique l'existence d'une synthèse protéique. CREB
(AMPc-responsive element binding protein transcription factor) est un exemple célèbre
d‟intervenant dans la formation de la LTM identifié chez l‟insecte.
Localisation(s) de la mémoire, substrats neuro-anatomiques
Parmi les indices pointant vers les sites probables de la mémoire et de l'apprentissage des
odeurs ainsi que du comportement lors de la parade amoureuse chez les insectes, l‟expression
préférentielle de
ENCART 1. L‟AEQUORINE
gènes comme
L'aequorine est une protéine luminescente, sensible au calcium,
isolée de la méduse Aequorea. Elle a été utilisée relativement
extensivement pour détecter les flux de calcium dans différents
contextes chez les vertébrés et les invertébrés principalement par
micro-injection ou par transgenèse. Chez la Drosophile, son
expression est dirigée de façon indépendante dans des types
cellulaires définis grâce au système binaire GAL4/UASG.
dunce et
rutabaga dans
une même
région : les corps
pédonculés.
Cette région
caractéristique
du système
nerveux de
88

l‟insecte (comme l‟hippocampe chez les vertébrés) est constituée de cellules de Kenyon, avec
une distribution parallèle et compacte des fibres nerveuses. Les cellules de Kenyon reçoivent
l‟information au niveau de leurs dendrites situés dans les calices de corps pédonculés ; Cette
information (olfactive) arrive des antennes et des palpes via les lobes antennaires. Dans
chacun des deux corps, c‟est environ 2500 cellules de Kenyon qui projettent leur axone dans
un pédoncule vers les lobes.
Les corps pédonculés peuvent être amputés de l‟insecte adulte, simplement en nourrissant les
larves à un moment restreint et précis de leur développement avec de l‟hydroxyurée. Les
drosophiles ne sont alors pas du tout gênées dans la perception des odeurs, ou au niveau visuel
dans la perception de formes simples, ni dans leur sensibilité tactile ; par contre, cette
expérience révèle que les corps pédonculés sont indispensables à l‟apprentissage et à la
mémoire olfactive. Les données récentes suggèrent qu‟ils ne seraient pas obligatoires pour
l‟acquisition ou le stockage des informations olfactives, mais bien pour le traitement de ces
informations et le rappel de la mémoire olfactive.
De ces données, on peut tirer non seulement un modèle de fonctionnement au niveau
cellulaire peu ou prou articulé autour de la cascade de l‟AMPc (Davis, 2001) et un schéma des
circuits neuro-anatomiques impliquant les corps pédonculés (Margulies, 2005). Il est alors
d‟autant plus important de comprendre les patterns d‟activité neuronale du cerveau, tant dans
leur déroulement dans le temps que dans leur organisation dans l‟espace. En contrôlant
l‟expression d‟un transgène pour l‟expression de la protéine aequorine dans les corps
pédonculés, un des points d‟accès de l‟activité des cellules de Kenyon a été de suivre
l‟évolution des niveaux de calcium intracellulaires, dans des insectes intacts. Intrinsèquement,
les corps pédonculés possèdent une activité oscillatoire du calcium avec une période moyenne
de cinq minutes
dans les mouches
ENCART 2. GENETIQUE MOLECULAIRE : le système
normales.
GAL4/UAS
Lorsque les
Le système de piège à enhancer GAL4/UAS s'est révélé
extrêmement utile, non seulement pour visualiser, mais aussi
pour manipuler les corps pédonculés au sein d'un organisme
intact. Le rapporteur au calcium aequorine est placé sous
contrôle du facteur de transcription GAL4. De cette façon,
nous avons établi un système dans lequel nous avons en
quelque sorte accès à l‟activité de tissus intacts de Drosophile.
Une large collection de pièges à enhancer a été établi dans le
laboratoire de Kim Kaiser à Glasgow. Leur expression est
centrée sur certaines sous-structures du cerveau, dont les corps
pédonculés.
mesures sont
effectuées dans un
cerveau intact (et
non dans une
mouche complète)
les oscillations
sont toujours
présentes, ce qui
indique qu‟elles se
manifestent
spontanément et
indépendamment
des afférences
sensorielles. Elles sont donc le résultat de changements synchronisés d‟une majorité de la
population des cellules de Kenyon des corps pédonculés. À l‟heure actuelle, cette
synchronisation peut avoir son origine dans une horloge interne, ou découler d‟un réseau
établi entre les cellules de Kenyon ou enfin découler d‟afférentes externes aux corps
pédonculés. Ces oscillations peuvent être modulées pharmacologiquement en bloquant une
variété de canaux dépendant du voltage et de récepteurs aux neurotransmetteurs. Ces
oscillations sont pourtant spontanées, car observées sans manipulation (stimulation électrique
ou chimique). L‟amplitude de ces oscillations est augmentée de façon spectaculaire dans le
89

contexte d‟un mutant amnesiac. Ces oscillations à fréquence assez basse pourraient donc
contribuer à la phase de consolidation de la mémoire décrite plus haut.
L’analyse dynamique du calcium : autres méthodes
Les détecteurs du calcium comme les sondes cameleons et camgaroos ont aussi été exprimés
avec des moyens transgéniques dans la mouche, et amenées plus de résolution spatiale aux
mouvements dynamiques du calcium. Avec ces techniques, il est possible d‟analyser les
réponses évoquées par les odeurs en distinguant entre compartiments post et pré synaptiques,
de mesurer différentiellement la réponse à l‟acétylcholine dans les différents lobes des corps
pédonculés (Yu, 2003). Pourtant, la mesure au niveau d‟une cellule de Kenyon dans un
cerveau intact de niveaux de calcium intracellulaire reste encore à réaliser avec ces techniques.
Néanmoins l‟étude des cellules de Kenyon avec de l‟imagerie fura-2 en culture au stade pupal
tardif montre des élévations transitoires de calcium qui possèdent des fréquences similaires,
10-20 par heure, à celles observées plus tardivement au stade adulte (Jiang, 2005). A ce stade
de développement, les effets de neurotransmetteurs (Acétylcholine, GABA..) s‟exercent en
modulant les élévations de calcium, alors que l‟effet in vivo dans un cerveau intact est
beaucoup plus prononcé, et en accord avec ce qui est connu des corps pédonculés. Enfin, les
sites de stockage intracellulaire de calcium ne sont pas une source nécessaire à ces élévations
transitoires de calcium, alors qu‟un influx de calcium par des canaux dépendant du voltage est
indispensable.
Quelques références utiles
Dudai Y, Jan YN, Byers D, Quinn WG, Benzer S. dunce, a mutant of Drosophila
deficient in learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976 May;73(5):1684-8.
Jiang SA, Campusano JM, Su H, O'Dowd DK. Drosophila mushroom body Kenyon cells
generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J
Neurophysiol. 2005
Margulies C, Tully T, Dubnau J. Deconstructing memory in Drosophila. Curr Biol. 2005
Sep 6;15(17):R700-13.
Ronald L. Davis Mushroom Bodies, Ca2 Oscillations, and the Memory Gene amnesiac
(Minireview) Neuron, 2001 Jun ;30, 653–656
Rosay P, Armstrong JD, Wang Z, Kaiser K. Synchronized neural activity in the
Drosophila memory centers and its modulation by amnesiac. Neuron. 2001
Jun;30(3):759-70.
Tully T, Quinn WG. Classical conditioning and retention in normal and mutant
Drosophila melanogaster. J Comp Physiol [A]. 1985 Sep;157(2):263-77.
Waddell S, Quinn WG. What can we teach Drosophila? What can they teach us? Trends
Genet. 2001 Dec;17(12):719-26.
Yu D, Baird GS, Tsien RY, Davis RL. Detection of calcium transients in Drosophila
mushroom body neurons with camgaroo reporters. J Neurosci. 2003 Jan 1;23(1):64-72.
90

CALCIUM SIGNALLING IN DROSOPHILA CELL LINES AND PRIMARY
CULTURES: COMBINING PHYSIOLOGY, RNA INTERFERENCE AND
MICROARRAY STUDIES
David B Sattelle, Steven D Buckingham and Valérie Raymond-Delpech
MRC Functional Genetics Unit, Department of Human Anatomy and Genetics, University of
Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3QX, UK
SUMMARY
With the completion of the Drosophila genome project (www.flybase.org), the ready
application of forward and reverse genetics, as well as calcium imaging and electrophysiology,
this model organism offers exciting opportunities for the investigation of calcium signalling
pathways. In particular the utility of an ease to culture Drosophila cell line (Schneider S2 cells)
will be demonstrated. The cells can be conveniently deployed to study endogenous calcium
signalling pathways and lend themselves to transfection with additional receptor /channel
molecules. The application of RNA interference (RNAi) to Drosophila S2 cells and also to
Drosophila neuronal primary cultures has facilitated the identification of novel calcium
signalling components.
INTRODUCTION
Access to the genome of the fruitfly Drosophila melanogaster provides exciting opportunities
for rapid advances in the functional analysis of gene products [1]. Such developments are
further facilitated by the ease of expression of novel proteins in Drosophila cell lines, such as
the S2 cells [2]. Also, the recent advances in gene silencing by double-stranded RNA
interference (RNAi) permit rapid and direct investigation of protein function in cell lines [3].
For example, a Drosophila S2 line expressing a musarinic acetylcholine receptor [4] has
proved a particularly useful vehicle for studying components in the IP3 signalling pathway to
which the receptor is coupled [5]. Primary cultures of Drosophila neurons also offer a
suitable substrate for combined calcium imaging and RNAi experiments. Here we illustrate,
using our own studies, how this approach can be used to identify the nicotinic acetylcholine
receptor (nAChR) subunits that play a key role in the responses to nicotine of primary
cultured larval Drosophila cholinergic neurons.
FURA-2 BASED CALCIUM MEASUREMENTS IN DROSOPHILA S2 CELLS
S2 cells are readily loaded with 2-4 M Fura-2/AM and 0.002% pluronic acid F-127
dispersing agent in saline for 45 min at room temperature. The coverslip on which the cells
are dispersed forms the base of the experimental chamber which is mounted on the stage of an
inverted microscope equipped with a 40x, 1.3N.A. oil immersion objective. Using a filter
wheel, cells are illuminated at 340 and 380nm. Emitted light is passed through a dichroic
mirror set to 510nm and passed first to an image intensifier, then to a CCD camera [Fig 1]. In
our laboratory the image acquisition and subsequent processing is performed using a Concord
imaging system from Perkin-Elmer (UK). Imaging experiments are performed at room
temperature; a pump and suction pipette maintain a constant volume of saline in the
experimental chamber.
91

Figure 1 : Set-up used for ratiometric imaging of intracellular Ca 2+ using
fluorescent dye Fura-2.
SILENCING ENDOGENOUS CALCIUM SIGNALLING COMPONENTS USING
RNA INTERFERENCE
We have generated a number of S2 cell lines expressing metabotropic and ionotropic
receptors (for review see [2]).
Figure 2: Calcium imaging in Drosophila S2 cells A: S2-DM1 cells (an S2 cell
line stably expressing a Drosophila muscarinic acetylcholine receptor (DM1)) in
normal saline stained with fura-2 AM. B: The same cells following a 20 s
application of 100 M carbamylcholine, a muscarinic receptor agonist.
The Drosophila S2 cell line stably expressing a cloned muscarinic acetylcholine receptor
(mAChR, DM1) [Fig 2] has been used to explore the utility of gene silencing by double-
92

stranded RNA interference (RNAi) in the study of mAChR activated calcium signalling [4].
Knockdown by RNAi of either the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor and SERCA resulted
in a reduction, in all cells tested, of carbamylcholine-evoked calcium transients to 10% or less
of control values. This knockdown was achieved with soaking in dsRNA without the need for
transfection agents, and only
10 microgrammes of dsRNA per million cells was needed. Although RNAi knockdown of
the DM1 receptor was much less effective in reducing carbamylcholine responses, we
attribute this to the high levels of DM1 expression. [Fig. 3]
Figure 3: Application of carbamylcholine (CCh, 100 M) induces an increase of
intracellular Ca 2+ concentration [Ca 2+ ] i (A). Intracellular Ca 2+ response from cells
loaded with Fura-2/AM are presented in the panels. Timing of drug application is
indicated by a horizontal bar. Application of CCh elicits an increase of [Ca 2+ ]i in
S2-DM1 cells (A) but also in S2-DM1 cells treated with DM1 dsRNA
(B). However, no response to CCh is observed when the cells are treated with either
Ins(1,4,5)P3R (C) or SERCA (D) dsRNA.
COMBINING REVERSE GENETICS WITH CALCIUM MEASUREMENTS TO
IDENTIFY NOVEL CALCIUM SIGNALLING COMPONENTS in DROSOPHILA S2
CELLS
The Drosophila genome contains approximately 14,000 genes and, of these, many remain to
have a function assigned to them. Thus, it is likely that there will be many hitherto unknown
genes that contribute to functions such as calcium signalling. Genome-wide RNAi screens
have been fruitful in finding novel genes involved in the growth and viability of Drosophila
cells [Boutros et al 2004][6]. Our own studies (Raymond et al 2004) [5] and those of Roos et
al (2005) [7] have demonstrated the potential of using RNAi in conjunction with calcium
93

signalling to address the functions of calcium signalling components in Drosophila S2 cells.
This approach has proved successful in identifying STIM-1, a novel protein coupling store
depletion to capacitative calcium entry [7, 8].
CALCIUM MEASUREMENTS IN DROSOPHILA CHOLINERGIC NEURONS
We have used fura-2-based calcium imaging to examine nAChR-induced increases in [Ca 2+ ] i
in 3 rd instar larval primary cultured neurons derived from a transgenic Drosophila line in
which GFP is expressed in cholinergic (Cha-1) neurons of the central nervous system.
Cholinergic (Cha-1) neurons were isolated from flies homozygous for a 7.4 kb Cha-Gal4
driver and a UAS-GFP(S65T) responder transgene. Primary cultures from 3 rd instar larvae
were generated. Larvae were surface-sterilized in 70% ethanol, rinsed 3x in distilled water
and brains isolated in dissection medium (27% Leibovitz medium, 73% dissociation saline).
The composition of dissociation saline is as follows (in mM): CaCl 2 , 5.4; KCl, 21.4; MgCl 2 ,
12.3; NaCl, 36.0; NaHCO 3 , 4.8; KH 2 PO 4 , 1.5; glucose, 11.1; Tris, 24.8; penicillin G (50
units/ml), streptomycin sulphate (50 g/ml), pH 7.2, adjusted with NaOH and HCl. Brains
were incubated in 0.5 mg/ml collagenase in Ca 2+ - and Mg 2+ -free saline solution (in mM: NaCl
137; KCl, 2.7; NaH 2 PO 4·H 2 O, 0.36; NaHCO 3 , 12.0; glucose, 0.56) for 45 min in order to
disrupt the extracellular matrix. Optic and antennal lobes were removed prior to dissociation.
Larval brains were triturated using a sterile siliconized glass pipette. Cells were plated onto 22
mm diameter round glass coverslips and incubated in dissociation medium (dissection
medium plus 10% v/v heat-inactivated foetal bovine serum). Two day old neurons on
coverslips were rinsed three times in physiological saline (of composition in mM: NaCl, 140;
CaCl 2 , 2.0; MgCl 2 , 4.0; KCl, 3.0; HEPES 5; pH 7.2), and loaded with dye by immersion in
physiological saline containing the Ca 2+ -sensitive dye fura-2AM (1 M) and 0.002% pluronic
acid F-127 dispersing agent in saline for 1 h at room temperature.
GENE EXPRESSION PROFILING IN DROSOPHILA CHOLINERGIC NEURONS
USING MICROARRAYS
The only way to monitor and compare the full complement of genes being expressed in cells
under different conditions is by the use of microarrays. In a collaboration with The Salvaterra
lab we have used microarray-based gene expression to study the genes expressed in GFPtagged
cholinergic neurons of Drosophila. Based on studies with Affymetrix microarrays, we
have shown the presence of a number of ion channels and receptor subunits in these cells
including nAChRs. The expression of the D 2, D 6, D 7, D 1 and D 2 subunits has been
detected in embryonic and larval Cha-1 RNA by microarray analysis. The D 2 and D 2
subunits are the most abundantly expressed subunits at both developmental stages. The
mAChR receptor, DM1 is detected as well as voltage-gated sodium and calcium channels. IP3
receptors and ryanodine receptors are both present in these cells, in contrast to S2 cells where
only IP3 receptors are present.
SILENCING ENDOGENOUS RECEPTOR SUBUNITS AND MONITORING
FUNCTION USING FURA-2 BASED CALCIUM IMAGING
Using calcium imaging and patch-clamp electrophysiology, we have shown that Cha-1
(cholinergic) neurons respond to ACh, nicotine and choline. Responses to these agonists are
blocked by 10 M mecamylamine and 1 M -bungarotoxin ( -BTX). PCR amplification of
nAChR subunits from embryonic and larval Cha-1 cDNA shows that embryonic and larval
Cha-1 neurons express multiple nAChR subunits. We have detected developmental regulation
94

of both the transcription and alternative splicing of nAChR subunits in Cha-1 neurons. The
expression of the D 2, D 6, D 7, D 1 and D 2 subunits is also detected in embryonic and
larval Cha-1 RNA by microarray analysis. The D 2 and D 2 subunits are the most
abundantly expressed subunits at both developmental stages. By combining calcium imaging
and knock-down of individual nAChR subunits by RNA interference (RNAi), we have shown
that a reverse genetic approach can be used to demonstrate roles for the D 2 and D 6 nAChR
subunits in cultured Cha-1 neurons.
THE INTERACTOME AND GENOME-WIDE RNA INTERFERENCE: PROSPECTS
FOR IDENTIFYING NOVEL CALCIUM SIGNALLING/MODULATING
COMPONENTS
The ease with which RNAi can be applied to S2 cells makes them particularly suitable for
genome-wide RNAi screens. Genes affecting calcium signalling can be detected in a number
of ways. The most obvious is to look for genes whose knockdown results in an abolition of
store-operated entry. This has been done in one study [7] by applying dsRNA for each gene
to S2 cells and subsequently using FLIPR to measure the calcium transients in response to
thapsigargin-evoked store depletion. The detection of only one gene product (STIM1) using
this approach implies either that only one gene is necessary for store-operated calcium entry
or, more likely, that the screen is not sufficiently sensitive to detect other essential genes, or
that there is a high degree of redundancy in the calcium signalling pathway. The latter can be
addressed using combinatorial RNAi screens, whose scale should perhaps be limited by
restricting the screen to a set selected on the basis of the presence of calcium-binding motifs
or other sequence elements, such as PZD domains, that suggest they might interact with
calcium-binding proteins. Future screens might use a different end-point for the assay, such
as thapsigargin-evoked apoptosis. Thus, the knockdown of genes that regulate calcium
signalling might result in changes in the probability of apoptosis resulting from challenges to
the calcium homeostasis machinery.
In addition to genome-wide screens, more direct approaches combining RNAi and
bioinformatics are possible. Alternatives to genome-wide screens include direct tests of
proteins that are recorded in the Drosophila interactome database as being interactors with
calcium-regulating genes. We have identified a number of genes on the basis of text-mining
approaches, the roles of each of which in calcium signalling can be tested using RNAi.
CONCLUSIONS
1) Drosophila cell lines and cell cultures lend themselves well to RNAi and calcium imaging
studies designed to uncover new calcium signalling components.
2) Genome – wide RNAi screens are feasible and when combined with use of known mutants
will afford functional screens for functionally linked molecules in signalling pathways.
3) Such studies will in future serve as a substrate for systems biology.
REFERENCES
1. Adams M.D. et al (2000) Science 287, 2185-2189.
2. Towers and Sattelle (2002) Bioessays 24, 1066-1073.
3. Clemens et al. (2000) PNAS 97, 6499-6503).
4. Millar et al (1995) 1843-1850.
5. Raymond et al (2004) Cell Calcium 35, 131-139.
95

6. Boutros et al (2004) Science 303, 832-835.
7. Roos et al (2005) J Cell Biol. 169, 435-45.
8. Liou et al (2005) Curr Biol. 15, 1235-41.
96

COOPERATION MORTELLE ENTRE CALCIUM INTRACELLULAIRE ET
ACTIVITE PACEMAKER DE NEURONES D’INSECTES
Bruno Lapied et Françoise Grolleau
Laboratoire Récepteurs et Canaux Ioniques Membranaires (RCIM) UPRES EA 2647,
Université d‟Angers, 2 boulevard Lavoisier, 49045 Angers cedex
1. INTRODUCTION
L‟intégrité d‟un organisme vivant est conditionnée par la bonne coordination des
activités des cellules qui le constituent. Au cours de l‟évolution, ses cellules vont se
différencier, se spécialiser et leur activité va non seulement dépendre du fonctionnement de
chacune d‟elles mais aussi de leur propre activité intrinsèque auto-entretenue. Cette
coordination entre cellules et au sein d‟une même cellule est nécessaire tout au long de la
période de développement de l‟organisme. Parmi les cellules douées d‟une activité intrinsèque
cyclique, il existe des neurones qui possèdent une richesse de stratégies biologiques mise en
œuvre pour assurer de multiples fonctions physiologiques fondamentales (e.g., réception,
intégration, transmission d‟une information). Dans ce cas, ces stratégies reposent, en
particulier, sur la mise en place de cycles moléculaires harmonieux mettant en scène une
succession de canaux ioniques transmembranaires dépendants ou non du potentiel qui
obéissent à des schémas de base complexes issus d‟un héritage dont l‟origine reste encore
aujourd‟hui bien mal connue.
Néanmoins l‟activation et/ou l‟inactivation de ces différents canaux ioniques suivent
une partition bien réglée dont l‟un des chefs d‟orchestres ubiquitaires ne pouvait être que le
calcium essentiel pour coordonner au niveau moléculaire les nombreuses interactions existant
entre chacun de ces canaux ioniques. Il arrive parfois que la nécessité d‟ajuster ces
mécanismes ioniques membranaires résonne comme une fausse note. Le neurone dans ces
conditions se retrouvent en sursis et la mécanique mise en place par le calcium fait naître un
nouveau type de coopération, mortel celui-ci, puisqu‟il aboutira à l‟extinction neuronale.
C‟est ce mécanisme inhabituel, différent de l‟apoptose neuronale, qui déclenchera une
réaction en chaîne devenue incontrôlable.
2. ACTIVITE PACEMAKER NEURONALE
L‟activité pacemaker ou spontanée d‟un neurone est une propriété intrinsèque du soma.
C‟est une activité auto-rythmique générée par un neurone et ceci en absence de toutes
afférences provenant d‟autres cellules nerveuses. Cette propriété intrinsèque résulte de la
combinaison séquentielle de différents canaux ioniques transmembranaires qui s‟activent et
s‟inactivent de façon cyclique, imposant une instabilité permanente du potentiel de membrane.
Cette activité spontanée est essentiellement due à l‟existence d‟une phase dite phase de
prédépolarisation lente qui permet d‟une part d‟atteindre le seuil de déclenchement du
potentiel d‟action et d‟autre part de conditionner la fréquence et le mode de décharge du
neurone (i.e., fréquence de décharge régulière ou bouffée de potentiels d‟action) (Levitan et
Kacmarek, 1997).
Parmi les préparations pacemaker neuronales étudiées, les neurones d‟invertébrés ont
certainement contribué à obtenir une meilleure compréhension des différents mécanismes
ioniques, souvent complexes, impliqués dans la genèse de cette auto-rythmicité (Levitan et
97

Kacmarek, 1997 ; Staras et coll., 2002). Ceci étant dû en partie à leur participation dans des
réseaux neuronaux simples, leur facilité d‟accès et leur adaptabilité reconnue pour les
techniques électrophysiologiques classiques. A ce titre les neurones d‟insectes n‟ont rien à
envier à leurs homologues vertébrés. En effet, au sein du système nerveux central des insectes,
il existe une population de cellules neurosécrétrices nommée les « Dorsal Unpaired Median »
(DUM) neurones qui constituent la seule population identifiée à ce jour de neurones doués
d‟activité pacemaker (Grolleau et Lapied, 2000 ; Wicher et coll. 2001). Il a été possible
d‟identifier au moins une douzaine de courants ioniques engendrés par des canaux spécifiques
présents dans la membrane et ayant une fonction parfaitement bien identifiée dans les
différentes phases qui caractérisent l‟activité pacemaker neuronale (Fig. 1).
Figure 1 : Courants ioniques impliqués dans l’activité électrique pacemaker des DUM
neurones présents à la surface du dernier ganglion abdominal de la chaîne nerveuse ventrale
du système nerveux central d’un insecte la blatte Periplaneta americana.
98

Tous ces courants ioniques se regroupent selon des caractéristiques biophysiques spécifiques :
transitoires ou permanents activés par le calcium ou le sodium intracellulaire, dépolarisants ou
hyperpolarisants, dépendants ou indépendants du potentiel membranaire (Grolleau et Lapied
2000 ; Wicher et coll. 2001). La mise en place de cette auto-rythmicité obéit à une sorte de
« marche militaire »‟ très ordonnée. La dépolarisation conditionne la repolarisation qui est
essentielle pour développer la post-hyperpolarisation. Celle-ci enfin est fondamentale pour
déclencher la pré-dépolarisation si importante dans l‟origine de l‟activité pacemaker. En
résumé, il apparaît très clairement que les canaux ioniques sont les architectes de cette
propriété intrinsèque du soma, le maître d‟œuvre étant le calcium. En effet ce dernier joue un
rôle clé dans la régulation de la fréquence et du mode de décharge neuronal. Il s‟oppose à tout
excès (e.g., hyperexcitabilité) et permet de maintenir un minimum vital en dessous duquel le
neurone deviendrait silencieux. La cible spécifique du calcium est la phase de prédépolarisation
qui met en jeu deux types de canaux calcium à bas seuil d‟activation :
transitoire (ICat) et maintenu (ICam) (Fig. 1 ; Grolleau et Lapied, 1996) également décrits
chez le vertébré (Avery et Johnston, 1996 ; Kostyuk 1999).
La particularité du courant calcium maintenu à bas seuil d‟activation est sa très grande
sensibilité vis à vis du calcium intracellulaire. Ce courant qui intervient dans la dernière partie
de la phase de pré-dépolarisation (Fig. 1) est à l‟origine de l‟ultime étape pour atteindre le
seuil de déclenchement du potentiel d‟action et ainsi maintenir une activité pacemaker
régulière. Il opère dans une gamme de concentration en calcium très étroite (Grolleau et
Lapied 1996).
Figure 2 : Régulation en cloche du courant calcium maintenu à bas seuil d’activation par le
calcium intracellulaire.
Toutes augmentation ou diminution expérimentale et/ou physiologique de la concentration en
calcium intracellulaire (Fig. 2) entraînera une inactivation de ce courant provoquant par
conséquent une forte réduction de la fréquence de décharge du neurone. Ce courant maintenu
subit donc une régulation en cloche par le calcium intracellulaire (Fig. 2). Seulement dans
99

certaines circonstances, l‟entrée de calcium dans la cellule déclenche toute une série de
réactions en chaîne incontrôlées qui aboutit à une désynchronisation de l‟activité des canaux
ioniques conduisant à la disparition complète de l‟activité pacemaker.
3. ACTEURS MIS EN JEU DANS CETTE COOPERATION MORTELLE
Lors d‟une dépolarisation, une succession d‟évènements moléculaires va contribuer à
la disparition de l‟activité pacemaker dès l‟instant ou la concentration intracellulaire en
calcium atteint un certain seuil. La première étape, dépendante de cette dépolarisation,
correspond à l‟activation des canaux calciques à haut seuil d‟activation de type N (Wicher,
2001). L‟augmentation de la concentration cytosolique de calcium est à l‟origine de
l‟activation d‟un acteur inattendu : le NCCE pour « Non-Capacitive Calcium Entry » qui va
déterminer l‟étape finale conduisant à la disparition de l‟activité électrique pacemaker. Les
NCCEs se distinguent nettement des canaux calciques dépendants des stocks ou « capacitifs »,
les CCE pour « Capacitive Calcium Entry ». Ces CCEs s‟ouvrent lorsque les stocks sont
insuffisants. Ces canaux sont donc appelés « capacitifs » car ils redonnent à la cellule sa
capacité à produire un signal calcique efficace. Il joue donc un rôle fondamental dans l‟entrée
de calcium extracellulaire et en second plan, à la sortie de calcium des stocks. Les NCCEs,
dont le rôle est encore mal connu est activé en présence d‟acide arachidonique provenant du
diacyl glycérol (Fig. 3).
Figure 3. Schéma comparatif des mécanismes intracellulaires qui régulent le CCE et le
NCCE. Le LOE-908 est l’un des seuls composés permettant de bloquer spécifiquement le
NCCE (modifié d’après Moneer et Taylor, 2002).
Il a été possible de déterminer, au niveau des DUM neurones, la succession
d‟évènements intracellulaires impliqués entre la production d‟acide arachidonique (AA) et
l‟activation du NCCE. L‟AA active une guanylate cyclase sensible au NO (GC-NO). La
production de GMP cyclique à partir de GTP consécutive à l‟activation de cet enzyme stimule
100

une phosphodiestérase de type 2 (PDE2) impliquée dans la dégradation d‟AMP cyclique en
5‟AMP. C‟est la diminution de la concentration en AMP cyclique qui est responsable de
l‟activation du NCCE et donc de l‟entrée de calcium (Wicher et coll. 2004).
Dans notre contexte, l‟entrée de calcium via l‟activation des canaux calciques de type
N stimulerait une nouvelle voie annexe à cette régulation. En effet, l‟augmentation de calcium
importante activerait la PDE2, sans utiliser la voie de la GC-NO/GMP cyclique, entraînant
une diminution rapide du taux d‟AMP cyclique intracellulaire. Cette diminution stimule le
NCCE qui permet une entrée de calcium supplémentaire dans le neurone. Finalement, c‟est
cette augmentation qui aurait pour conséquence une inactivation du courant calcique maintenu
à bas seuil d‟activation, inactivation qui produit une réduction voire une disparition de
l‟activité pacemaker neuronale (Figs. 2 et 4).
Figure 4. Schéma récapitulatif de l’inactivation du courant calcique maintenu à bas
seuil d’activation (LVACam) consécutive à l’entrée de calcium via les canaux calciques de
type N à haut seuil d’activation (HVACa) sensibles à la dépolarisation membranaire. VDNa,
canaux sodium dépendants du potentiel ; PDE2 phosphodiestérase de type 2 sensible au GMP
cyclique ; NCCE Non-Capacitive Calcium Entry.
4. CONCLUSION
L‟analyse des mécanismes moléculaires qui sous-tendent cette coopération
« mortelle » pour un neurone montre la fragilité d‟un mécanisme cellulaire dépendant du
calcium impliqué dans le maintien de la fonction neuronale. Le neurone dans ces conditions
est en sursis permanent. La caractérisation de la participation inattendue du NCCE dans cette
mort « non programmée » montre à quel point cette régulation synchronisée de l‟activité des
101

différents canaux ioniques, pour entretenir une activité pacemaker, peut se transformer en une
véritable « cacophonie » synonyme de disfonctionnements importants. Tous les évènements
décrits dans le cas des DUM neurones ont été identifiés également sur diverses préparations
de vertébrés. Une seule marche reste à franchir pour extrapoler ces résultats aux neurones
pacemaker de vertébrés. Cette étude nous montre encore une fois qu‟une perturbation
quelconque du fonctionnement d‟un seul canal ionique apparaisse et c‟est toute une fonction
qui est perdue entraînant un trouble majeur.
5. POUR EN SAVOIR PLUS
Avery RB & Johnston D (1996) Multiple channel types contribute to the low-voltageactivated
calcium current in hippocampal CA3 pyramidal neurons. J. Neurosci, 16, 5567-7782.
Grolleau F. & Lapied B. (2000) Dorsal Unpaired Median neurones in the insect central
nervous system : Towards a better understanding of the ionic mechanisms underlying
spontaneous electrical activity – A review. J. Exp. Biol., 203, 1633-1648.
Grolleau F. & Lapied B. (1996) Two distinct low-voltage-activated calcium currents
contribute to the pacemaker mechanism in cockroach dorsal unpaired median neurons. J.
Neurophysiol., 76, 963-976.
Kostyuk PG (1999) Low-voltage-activated calcium channels ; achievements and problems.
Neuroscience, 92, 1157-1163.
Levitan IB & Kaczmarek LK (1997) The neuron, 2nd edition, Oxford University Press,
Oxford.
Moneer Z & Taylor CW (2002) Reciprocal regulation of capacitive and non-capacitive
calcium entry in A7r5 vascular smooth muscle cells : only the latter operates during receptor
activation. Biochem. J., 362, 13-21.
Staras K, Gyori J & Kemenes G (2002) Voltage-gated ionic currents in an identified
modulatory cell type controlling molluscan feeding. Eur. J. Neurosci., 15, 109-119.
Wicher D. (2001) Peptidergic modulation of insect voltage-gated calcium currents ; role of
resting calcium current and protein kinases A and C. J. Neurophysiol., 86, 2353-2362.
Wicher D., Messutat S., Lavialle C. & Lapied B. (2004) A new regulation of Non-Capacitive
Calcium Entry in insect pacemaker neurons. J. Biol. Chem., 279, 50410-50419.
Wicher D, Walther C & Wicher C (2001) Non-synaptic ion channels in insects : basic
properties of currents and their modulation in neurons and squeletal muscles. Prog.
Neurobiol., 64, 431-425.
102

TRAITER LA DOULEUR EN INHIBANT LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE-T !
Emmanuel Bourinet
Département de Physiologie, Institut de Génomique Humaine
CNRS UMR5203 INSERM U661 Université Montpellier I & II
La prise en compte et le traitement de la douleur est un aspect essentiel de la qualité de
vie, cependant la réponse thérapeutique proposée par le corps médical se limite à quelques
drogues connues depuis de nombreuses années, voir des siècles pour la morphine, et qui ont
soit de nombreux effets indésirables, soit une efficacité limitée. De plus, aucun concept
pharmacologique innovant n‟a aboutit à la découverte de nouveaux analgésiques lors des
dernières décennies. Dans ce contexte, la découverte de nouvelles médications est un réel
besoin. Les explorations du système nerveux ont mis en évidence que des terminaisons
nerveuses spécialisées localisées dans la peau et dans tous les organes sont capables de
détecter les atteintes tissulaires et les signaux douloureux. Lorsque ces neurones spécialisés
(appelés aussi nocicepteurs) sont stimulés, ils transmettent des signaux électriques aux centres
cérébraux d‟intégration des sensations de la douleur. En conséquence, la compréhension du
fonctionnement moléculaire de ces nocicepteurs est d‟un intérêt capital pour améliorer les
stratégies thérapeutiques anti-douleur 1 .
Des protéines, connues sous le nom de canaux ioniques, forment les particules
élémentaires de l‟excitabilité cellulaire en initiant puis véhiculant les signaux électriques dans
les neurones et toutes les cellules excitables. Les nocicepteurs ne dérogent pas à la règle, et de
manière intéressante, ils expriment un répertoire unique de ces canaux ioniques pour une
détection et une transmission optimale des signaux douloureux. De plus, des recherches
récentes ont mis en évidence que lors des états de douleur chronique comme les pathologies
inflammatoires ou les neuropathies d‟étiologies diverses (diabète, cancer, sida,
chimiothérapies, zonas,…), des changements des niveaux d‟expression des canaux ioniques
s‟opèrent dans les nocicepteurs donnant lieux à des modifications de perception des signaux
sensoriels et conduisant souvent les patients à percevoir comme douleurs sévères des signaux
perçus autrement comme des sensations indolores. Comme de nombreux médicaments ont
pour cibles directes ou indirectes des canaux ioniques dans le traitement de pathologies
diverses (hypertension, épilepsie,…), l‟identification des canaux ioniques les plus influents
pour l‟excitabilité des nocicepteurs sera certainement cruciale pour la découverte de nouvelles
thérapies spécifiques permettant de traiter et/ou de prévenir les états de douleur chronique.
Parmi les principaux canaux sélectifs pour des ions donnés, les canaux calciques sont
uniques en étant à la fois acteurs importants de l‟excitabilité cellulaire, mais aussi en étant une
voie principale d‟entrée de calcium dans la cellule ; cet ion jouant alors un rôle de véritable
second messager contrôlant de nombreuses fonctions physiologiques comme par exemple la
transmission synaptique ou l‟expression génique dans les neurones. Récemment, une nouvelle
famille de trois gènes homologues (Ca V 3.1, Ca V 3.2, et Ca V 3.3) a été identifiée 2 . Ces gènes
engendrent des canaux calciques activés par des faibles dépolarisations de la membrane
cellulaire, communément appelés canaux calciques « bas seuils » ou « type-T ». Les
connaissances sur les rôles physiologiques des ces canaux de type-T étaient très limitées
jusqu'à très récemment ; cependant ces canaux, bien avant l‟identification de leurs gènes
constitutifs, ont été décrits fonctionnellement dans les nocicepteurs suggérant un rôle possible
103

dans la perception de la douleur. Les quelques données de pharmacologie comportementale
chez les rongeurs, utilisant des inhibiteurs non-sélectifs de ces canaux, confortent ce rôle
important dans la physiopathologie des nocicepteurs et de la sensation de douleur 3,4 .
L‟identification des gènes Ca V 3 a rendu possible l‟utilisation d‟approches génétiques pour
valider l‟utilité potentielle de bloquer les canaux calciques de type-T pour réduire la
perception de la douleur. Pour cibler les neurones nocicepteurs chez le rat, nous avons réalisé
des injections dans l‟espace intrathecal (autour de la moelle épinière) de petites séquences
synthétiques d‟ADN « antisens » qui s‟hybrident spécifiquement sur chacun des trois ARN
messagers générant des canaux de type-T. Comme l‟ARN messager est le précurseur de la
protéine dans la cellule, l‟hybridation de l‟ADN antisens sur l‟ARN bloque sélectivement la
synthèse de la protéine. Cette approche d‟inhibition (communément appelée knock-down) via
l‟injection intrathecale d‟antisens a été validée dans plusieurs études, et a montré toute son
efficacité pour identifier des gènes qui participent à la détection de la douleur. En utilisant
cette approche expérimentale, nous avons mis en évidence que l‟un des trois gènes codant
pour les canaux de type-T (Ca V 3.2) a un rôle primordial dans l‟excitabilité des nocicepteurs et
donc dans la perception de la douleur 5 . L‟inhibition de l‟expression de Ca V 3.2 dans les
neurones nocicepteurs a ainsi pour conséquence une inhibition remarquable des réactions
comportementales à des stimuli douloureux chez des animaux sains (effet analgésique), mais
surtout chez des animaux « neuropathiques » mimant les pathologies humaines de la douleur
chronique (effet anti-hyperalgésique, figure1). De surcroît, ces animaux neuropathiques, tout
comme bon nombre de patients douloureux chroniques, perçoivent ou interprètent des stimuli
indolores comme sensations nociceptives (état d‟allodynie). Comme pour traiter
l‟hyperalgésie, peu de médicaments ont une action anti-allodynique efficace. A l‟inverse,
l‟antisens dirigé contre Ca V 3.2 s‟est révélé comme possédant une action anti-allodynique
spectaculaire en permettant de normaliser la perception de la douleur aux niveaux
physiologiques chez des animaux neuropathiques.
En conclusion, l‟étude menée à l‟Institut de Génomique Fonctionnelle de Montpellier
a mis en évidence que l‟application intrathécale d‟un antisens dirigé contre le gène Ca V 3.2
engendre une inhibition de l‟expression et de l‟activité des canaux de type-T dans les
nocicepteurs. Cette inhibition « génétique » démontre la fonction importante du canal de
type-T généré par Ca V 3.2 dans la perception de la douleur physiologique et pathologique.
Compte tenu, d‟une part de l‟absence d‟effets indésirables liés à la déplétion des nocicepteurs
en canaux Ca V 3.2, et d‟autre part de l‟abondance de Ca V 3.2 dans ces nocicepteurs ; des
molécules capables de bloquer ces canaux seraient vraisemblablement douées de propriétés
anti-douleur tout en étant dénués d‟effets secondaires. Dans cette perspective la découverte
de molécules antagonistes sélectives des canaux de type-T devrait être d‟un grand intérêt pour
la prise en charge symptomatique et/ou préventive de la douleur chez l‟homme.
Références
(1) Julius, D.; Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature 2001, 413, 203-210.
(2) Lory, P.; Monteil, A.; Chemin, J.; Bourinet, E.; Nargeot, J. Du clonage des canaux calciques de type T à
l'étude de leurs rôles physiologiques. Médecine / Sciences 2001, 17, 979-988.
(3) Matthews, E. A.; Dickenson, A. H. Effects of ethosuximide, a T-type Ca(2+) channel blocker, on dorsal
horn neuronal responses in rats. Eur J Pharmacol 2001, 415, 141-149.
(4) Dogrul, A.; Gardell, L. R.; Ossipov, M. H.; Tulunay, F. C.; Lai, J. et al. Reversal of experimental
neuropathic pain by T-type calcium channel blockers. Pain 2003, 105, 159-168.
104

Courants de type-T (pA/pF)
Seuil de douleur (g)
Injections antisens
(5) Bourinet, E.; Alloui, A.; Monteil, A.; Barrere, C.; Couette, B. et al. Silencing of the Ca V 3.2 T-type
calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception. Embo J 2005, 24,
315-324.
800
700
600
500
400
300
200
100
Avant
ligature
Après
ligature
contrôle
20 ms
Douleur mécanique
(test de pression de la patte)
Courants de type-T à J+4
AS Ca V 3.2
200pA
*
*
*
-7 0 4 5 6 7 8 9 10 11 12
(jours)
*
10
8
6
4
2
0
*
(n=43)
(n=53)
contrôle
AS Ca V 3.2
contrôle AS Ca V 3.2
D’après Bourinet et coll (2005) EMBO J
*
Figure1:
Effet cinétique de
l‟injection
intrathécale
d‟antisens dirigés
contre Ca V 3.2 chez
les
rats
neuropathiques. La
neuropathie a été
induite selon le
modèle de Bennett
& Xie consistant en
des ligatures lâches
du nerf sciatique.
Deux groupes
d‟animaux, rendus
neuropathiques par
la constriction du
nerf sciatique, on été
injectés deux fois
par jours pendant 4
jours avec 10µl
contenant 12.5 µg
d‟antisens (triangles)
ou d‟une séquence
d‟ADN contrôle (cercles). Les seuils de réponses douloureuses à un stimulus mécanique (pression de la patte)
ont été enregistrés dans le strict respect des règles d‟étique. Les seuils représentés sur le graphique ont été
mesurés avant (J-7) et après (J0) l‟induction de la neuropathie, puis tous les jours après la fin du protocole
d‟injection des antisens. Il faut noter que l‟antisens anti-Ca V 3.2 induit un effet antidouleur massif (supérieur à
celui obtenu à des doses maximales de morphine sur ce test par ex) qui perdure pendant 5 jours après l‟arrêt
du traitement. Des expériences contrôles d‟électrophysiologie montrent qu‟à la fin du traitement à J4 (flèche
rouge), les neurones nocicepteurs d‟animaux injectés par les antisens montrent une forte réduction de
l‟expression des canaux calciques de type-T contrairement au neurones prélevés sur des animaux traités avec
la séquence contrôle (partie encadré).
105

DOULEUR NEUROPATHIQUE ET ACTIVITE ELECTRIQUE ECTOPIQUE: ROLE
DES CANAUX CHLORURES ACTIVES PAR LE CALCIUM
Frédérique Scamps
Institut des Neurosciences Montpellier, INSERM U-583, 80 rue Augustin Fliche, 34095
Montpellier Cedex 5
Douleur neuropathique
Le système nerveux périphérique somatique est composé des ganglions rachidiens dorsaux,
GRD, situés de part et d'autre de la moelle épinière. Les terminaisons nerveuses périphériques
des neurones constituant les GRD sont situées dans la peau, les muscles, les viscères et sont
responsables de la douleur, du toucher et de la proprioception. L'existence de récepteurs
périphériques spécifiques permet d'intégrer toute la diversité des sensations. En ce qui
concerne la douleur, il existe plusieurs familles de récepteurs: les nocicepteurs responsables
de la douleur inflammatoire, du chaud et du froid et les mécanorécepteurs dits à haut seuil
d'activation, responsables de la douleur aigue (Petruska et al., 2000).
Alors que ces divers types de douleur sont des systèmes d'alerte nécessaires à la survie et au
maintien de l'intégrité de l'organisme, il peut se développer à la suite d'une pathologie
traumatique, virale, toxique…une douleur pathologique, la douleur neuropathique. Le
problème de la douleur neuropathique est qu'elle se manifeste de façon soutenue, voir
chronique avec divers degrés douloureux allant du simple picotement à la douleur fulgurante
et conduit à des symptômes secondaires comme l'anxiété et la dépression.
L'hyperalgie et l'allodynie sont les symptômes primaires d'une douleur neuropathique.
L'hyperalgie se définie comme une sensibilité exacerbée à la douleur inflammatoire et
mécanique (hyperalgie thermique et mécanique) et implique les récepteurs à la douleur.
L'allodynie est une douleur induite par un stimulus mécanique qui ne provoque normalement
pas la douleur, et donc implique des neurones non nociceptifs. De même, on considère que la
douleur neuropathique peut être évoquée ou spontanée. (Woolf & Mannion, 1999; Jensen &
Baron, 2003).
Quelque soit l'étiologie des douleurs neuropathiques, le mécanisme cellulaire de base est une
hyperexcitabilité des neurones sensitifs (Amir et al., 1999; Abdulla & Smith, 2001).
Activité électrique et calcium
L'activité électrique est le moyen de coder la prise d'information sensorielle. Cette activité se
manifeste par l'ouverture de divers types de canaux ioniques permettant la genèse et la
propagation d'un potentiel d'action. Cette dépolarisation membranaire permet l'ouverture de
canaux calciques voltage-dépendants. Ces canaux conduisent à une augmentation du calcium
intracellulaire, ce qui, in fine, va induire la libération de neurotransmetteur au niveau de la
synapse centrale. Cependant, les entrées de calcium induites par l'activité électrique contrôlent
aussi l'activité. Ce rétrocontrôle se fait par activation de canaux ioniques dits calciumdépendants.
A ce jour, trois grandes familles de canaux activés par le calcium intracellulaire
sont répertoriées: les canaux potassiques; les canaux cationiques non spécifiques et les canaux
chlorures. Le rôle majeur de ces canaux est de contrôler l'excitabilité cellulaire soit en
l'augmentant, soit en la diminuant.
106

Lésion périphérique et canaux chlorures activés par le calcium
Lors d'un traumatisme nerveux, les neurones sensitifs présentent une augmentation de leur
excitabilité intrinsèque qui conduit dans un certain nombre de cas aux symptômes de douleur
neuropathique. L'hyperexcitabilité neuronale se manifeste de deux façons, soit par une
diminution du seuil d'excitation à un stimulus donné, soit par une augmentation de la
fréquence de décharge des potentiels d'action, PA. L'effet d'une augmentation de la fréquence
de décharge des PA est une augmentation progressive et importante du calcium intracellulaire,
ce qui suggère que l'homéostasie calcique joue un rôle prépondérant dans la douleur
neuropathique.
Les canaux chlorures activés par le calcium sont des protéines ubiquitaires dont la nature
moléculaire est toujours inconnue (Scott et al., 1995). Ces canaux par définition sont activés
par le calcium, mais ne présentent pas de spécificité vis à vis des voies de mobilisation du
calcium, intra ou extracellulaire ou d'un type particulier de canal calcique. Dans les neurones
sensitifs adultes, ce courant est exprimé dans environ 30 % des cellules impliquées dans la
mécanotransduction. Par contre après une lésion nerveuse périphérique, comme la section du
nerf sciatique, 80 % de ces neurones l'exprime, alors que les nocicepteurs inflammatoires ne
l'exprime pas. Les canaux chlorures sont donc des molécules candidates dans les mécanismes
d'hyperalgie mécanique ou d'allodynie
Pour comprendre le rôle de ces canaux surexprimés après un traumatisme nerveux, leur
sensibilité au calcium a été évaluée en couplant des mesures de variation du calcium
intracellulaire avec l'activation du courant chlorure, ICl(Ca), à différentes charges calciques.
Les charges calciques sont obtenues en contrôlant la durée de l'influx calcique induit par les
canaux calciques.
- 80 mV
0
(0 mV, 15 ms)
(0 mV, 100 ms)
Courant (nA)
ICl(Ca)
2 nA
ICl(Ca)
1 sec
50 %
F/F0 (%)
Figure 1: Couplage en ligne des mesures électrophysiologiques (courants) avec la
photométrie (Fluo-3 en F/F0). (Andre et al., 2003)
Il apparaît qu'une charge calcique relativement importante est nécessaire à l'activation de
ICl(Ca), ce qui a conduit à une analyse des variations de calcium lors de l'activité électrique.
Canaux chlorures activés par le calcium et activité électrique des neurones axotomisés
L'activité électrique induit des augmentations du calcium intracellulaire en permettant
l'ouverture des canaux calciques voltage-dépendants. Selon leur amplitude, les transitoires
calciques vont activer ICl(Ca). Comme tout canal ionique, l'activation de ICl(Ca) génère des
107

PA (mV)
charges électriques qui doivent influencer la forme et/ou la fréquence de l'activité électrique.
Notamment, en théorie, ce courant devrait induire une dépolarisation membranaire suivant un
PA. L'enregistrement de l'activité électrique de la population des neurones sensitifs
axotomisés exprimant ICl(Ca) montre qu'un potentiel d'action n'est pas suivi d'une
dépolarisation membrane, suggérant que ICl(Ca) n'est pas activé. Les études de couplage
calcium intracellulaire et activité électrique démontrent effectivement une mobilisation
calcique trop faible au cours d'un PA pour activer ICl(Ca). Par contre lorsque la fréquence de
stimulation est augmentée, on observe une mobilisation calcique compatible avec l'activation
de ICl(Ca). Cependant, aucun signe d'activation de ce canal n'est observé.
F/F0 (%) Potential (mV)
20 mV
20 mV
-50mV
-50mV
200 ms
20 %
200 ms
20 %
Figure 2: Couplage en ligne de l'activité électrique et des variations calciques induites par
l'activité à différentes fréquences de stimulation.(Hilaire et al., 2005b)
Les canaux potassiques contrôlent l'expression fonctionnelle de ICl(Ca)
L'activité électrique est la résultante de la mise en jeu de divers canaux ioniques, dépendants
du voltage et du calcium. La charge nette dépolarisante ou repolarisante est portée par l'entité
dominante. La seule hypothèse possible pour rendre compte de l'apparente non-activation de
ICl(Ca) est que des courants repolarisants masquent l'effet dépolarisant de ICl(Ca). Des
expériences pharmacologiques où l'on obtient une inhibition non spécifique et progressive des
canaux potassiques repolarisants par perfusion de CsCl (a), démontre la présence de ICl(Ca)
par l'apparition d'une dépolarisation (b) parfois suivie de décharges spontanées (c).
(a)
60
40
20
0
-20
-40
-60
I = 1 nA
200 ms
(b)
200 ms
(c)
Figure 3: le césium intracellulaire induit un allongement progressif de la durée du PA et
l'apparition d'une dépolarisation.
108

Les décharges électriques spontanées des neurones axotomisés sont sous contrôle du
calcium
Dans ce modèle de pathologie, l'enregistrement d'une activité électrique maintenue est
observable lorsque les canaux potassiques sont partiellement inhibés. Il est clair que la
dépolarisation progressive du potentiel membranaire est due à l'activation de ICl(Ca) et
conduit à l'arrêt des activités spontanées par inactivation des canaux sodiques. Cependant, la
participation des canaux chlorures dans l'initiation de cette activité spontanée n'est pas
démontrée. De plus, il est bien connu que l'inhibition des canaux potassiques activés par le
calcium induit des activités répétitives. Pour vérifier l'implication de tels canaux dans les
activités spontanées, des expériences d'enregistrement d'activité électriques sont faites en
présence d'un tampon calcique intracellulaire, l'EGTA. En présence d'EGTA, nous
enregistrons des activités répétitives non suivies par une dépolarisation membranaire. (Hilaire
et al., 2005)
-62 mV
I = 1.1 nA
I = 0.6 nA
-55 mV
I = 1 nA
I = 0.5 nA
Axotomie (-) EGTA
Axotomie (+) EGTA
Conclusions
L'homéostasie calcique semble jouer un rôle complexe dans la douleur neuropathique en
contrôlant des conductances antagonistes. Il apparaît que les canaux chlorures activés par le
calcium pourraient inhiber les activités électriques maintenues et ainsi avoir un effet antidouleur.
L'identification moléculaire de cette protéine nous permettrait d'analyser le rôle de ce
canal ionique in vivo.
Ce programme est réalisé avec le soutien de l'Association Française contre les
Myopathies, et l'INSERM
Abdulla, F.A. & Smith, P.A. (2001) Axotomy- and autotomy-induced changes in the
excitability of rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol, 85, 630-643.
Amir, R., Michaelis, M. & Devor, M. (1999) Membrane potential oscillations in dorsal root
ganglion neurons: Role in normal electrogenesis and neuropathic pain. J Neurosci, 19,
8589-8596.
109

Andre, S., Boukhaddaoui, H., Campo, B., Al-Jumaily, M., Mayeux, V., Greuet, D., Valmier, J.
& Scamps, F. (2003) Axotomy-induced expression of calcium-activated chloride
current in subpopulations of mouse dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol, 90,
3764-3773.
Hilaire, C., Inquimbert, P., Al-Jumaily, M., Greuet, D., Valmier, J. & Scamps, F. (2005)
Calcium dependence of axotomized sensory neurons excitability. Neurosci Lett, 380,
330-334.
Hilaire, C., Campo, B., André, S., Valmier, J. and Scamps, F. (2005 b) K+ current regulates
calcium-activated chloride current-induced afterdepolarization in axotomized sensory
neurons. Eur. J. Neurosci. In Press.
Jensen, T.S. & Baron, R. (2003) Translation of symptoms and signs into mechanisms in
neuropathic pain. Pain, 102, 1-8.
Petruska, J.C., Napaporn, J., Johnson, R.D., Gu, J.G. & Cooper, B.Y. (2000) Subclassified
acutely dissociated cells of rat DRG: histochemistry and patterns of capsaicin-, proton-,
and ATP-activated currents. J Neurophysiol, 84, 2365-2379.
Scott, R.H., Sutton, K.G., Griffin, A., Stapleton, S.R. & Currie, K.P. (1995) Aspects of
calcium-activated chloride currents: a neuronal perspective. Pharmacol Ther, 66, 535-
565.
Woolf, C.J. & Mannion, R.J. (1999) Neuropathic pain: aetiology, symptoms, mechanisms,
and management. Lancet, 353, 1959-1964.
110

SIGNAL DE PROTÉASES AUX AFFÉRENCES SENSITIVES
Nathalie Vergnolle
Dept of pharmacology and therapeutics, 3330 Hospital DR.NW CALGARY, AB, T2N4N1
Canada
Une des fonctions majeures des fibres afférentes sensitives est de conduire les messages
douloureux générés a la périphérie dans les tissus, jusqu‟aux centres supérieurs du système
nerveux central. Ces neurones, dont les corps cellulaires sont localisés au niveau des nœuds
ganglionnaires de la racine dorsale, peuvent être isolés et mis en culture afin d‟étudier les
récepteurs qu‟ils expriment, mais également les mécanismes de signalisation cellulaires qui
régissent la physiologie de ces récepteurs et des afférences sensitives en général. La
connaissance des phénomènes de signalisation aux fibres afférentes sensitives ouvre un accès
direct à l‟étude de signaux périphériques pro-algésiques ou anti-algésiques (analgésiques).
Un exemple de tels signaux peut être illustré par l‟étude des effets de protéases sur la réponse
d‟afférences sensitives.
Les protéases sont des enzymes qui clivent d‟autres protéines à des sites spécifiques. Les
protéases ont été considérées longtemps principalement comme des enzymes digestives. Ce
n‟est que depuis peu de temps que l‟on considère les protéases non plus comme des molécules
dégradatives, mais réellement comme des molécules de signalisation qui sont capables
d‟envoyer des signaux spécifiques aux cellules. Une des façons pour les protéases de
communiquer de
façon spécifique
avec les cellules
est à travers
l‟activation de
récepteurs appelés
PARs, pour
Protease-Activated
Receptors.
Les récepteurs
PARs sont des
récepteurs à 7
domaines
transmembranaires
liés à des protéines
G. Ils sont activés
par le clivage de
leur extrémité
Terminale exposée
à la surface
cellulaire. Ce
clivage a pour effet
de libérer une
nouvelle extrémité
Terminale qui agit
alors comme un
Figure 1: Mécanisme d‟activation des PARs.
a/ Les protéases clivent l‟extrémité Terminale du récepteur libérant une nouvelle extrémité
Terminale qui agit alors tel un ligand endogène se fixant de façon intramoléculaire à la 2ème boucle
extracellulaire du récepteur. b/ Un petit peptide de synthèse (5 a 6 acides aminés) correspondant au
domaine du récepteur qui est libéré par l‟action de protéases (le ligand endogène) est capable de
mimer l‟action du ligand endogène et constitue ainsi un important outil pharmacologique permettant
l‟ étude de la physiologie de ce type de récepteur.
a
b
Protéase
NH 2
NH 2
Peptide synthétique
Signal
intracellulaire
Signal
intracellulaire
111

ligand endogène se fixant à la deuxième boucle extracellulaire du récepteur, pour induire un
signal intracellulaire (voir figure 1).
Il existe 4 membres clonés dans cette
famille des récepteurs PARs. Les PAR 1 , PAR 3 et PAR 4 sont considérés comme des
récepteurs à la thrombine car ils sont tous les 3 responsables des effets d‟agrégation des
plaquettes en réponse à la thrombine. Toutefois, ces récepteurs sont également présents sur
d‟autres types cellulaires que les plaquettes et peuvent être activés par d‟autres protéases que
la thrombine, comme par exemple les facteurs Xa et VIIa de la cascade de coagulation, la
cathepsine G libérée par des cellules inflammatoires telles que les neutrophiles, la trypsine, ou
encore des protéases de pathogènes. Un autre membre de la famille des récepteurs PAR est le
PAR 2 , qui n‟est pas activé par la thrombine, mais qui peut être activé par la trypsine ou la
tryptase libérée par les mastocytes.
De petits peptides de synthèse correspondant à la séquence de ligand endogène peuvent
mimer l‟effet du ligand endogène et ainsi activer de façon spécifique ces récepteurs. Ces
petits peptides de synthèse constituent d‟importants outils pharmacologiques qui permettent
de comprendre les fonctions qu‟exercent ces récepteurs.
Les récepteurs PAR 1 , PAR 2 et plus récemment PAR 4 ont été décrits comme étant exprimés
sur des neurones d‟afférences sensitives isolés à partir de noyaux ganglionnaires de la racine
dorsale de rats ou de souris (Steinhoff et al. Nat. Med. 2000, De garavilla et al. Br. J.
Pharmacol. 2001, Asfaha et al. Submitted to Pain).
Des études mesurant la mobilisation de calcium dans ces cellules en culture en réponse à des
agonistes peptidiques sélectifs pour chacun de ces récepteurs ont montrés une mobilisation
calcique en réponse aux agonistes des récepteurs PAR 1 et PAR 2 . Ces observations montrent
que PAR 1 et PAR 2 ne sont pas seulement exprimés sur les afférences sensitives, mais
également fonctionnels. Les afférences sensitives exposées au peptide agoniste du récepteur
PAR 4 ne mobilisaient pas de calcium. En revanche, ces neurones répondaient par un signal
calcique lorsqu‟ils étaient exposés à de fortes concentrations de chlorure de potassium (KCl),
et ce signal était réduit lorsque les neurones étaient pré exposés aux agonistes sélectifs de
PAR 4 . Ces dernières observations suggèrent que bien que l‟activation de PAR 4 ne mobilise
pas une réponse calcique des cellules, cette activation est capable d‟inhiber la réponse
calcique au KCl.
Étant donné que des signaux pro-nociceptifs sont en général associés à une mobilisation
calcique dans des neurones sensitifs, ces résultats suggèrent que l‟activation de PAR 1 et PAR 2
sur ces neurones provoquerait un signal pro-nociceptif, alors que l‟activation de PAR 4 serait
plutôt inhibitrice d‟un signal pro-nociceptif. Toutefois, la démonstration d‟un message proou
anti-nociceptif (analgésique) passe toujours par des tests de douleur in vivo, tels que ceux
que nous avons effectués pour les récepteurs PAR 1 , PAR 2 et PAR 4 .
L‟injection dans la patte de rat ou de souris d‟agonistes sélectifs pour chacun des PARs a
montré que les agonistes PAR 2 provoquaient l‟activation de nocicepteurs au niveau spinal,
mais également allodynie et hyperalgésie (2 composantes majeures de la réponse douloureuse
inflammatoire). L‟injection intra plantaire d‟agonistes PAR 1 et PAR 4 diminuaient le seuil de
douleur chez des animaux naïfs, et diminuait l‟allodynie et l‟hyperalgésie inflammatoires
observées chez des animaux après l‟injection intra plantaire de carragénine (Asfaha et al.
2001, Asfaha et al. Submitted to Pain). Ces résultats confirment donc un rôle pro-nociceptif
112

pour le PAR 2 et un rôle anti-nociceptif pour le PAR 4 . En revanche, ils réfutent un rôle pronociceptif
pour le PAR 1 , démontrant au contraire un rôle anti-nociceptif. Ces derniers
résultats peuvent s‟expliquer par le fait que l‟effet anti-nociceptif de PAR 1 n‟est pas dû à une
activation directe des afférences sensitives, mais à la libération par des cellules adjacentes, en
réponse aux agonistes PAR 1 , de médiateurs anti-nociceptifs. Certains résultats préliminaires
suggèrent en effet que l‟activation d‟immunocytes par les agonistes PAR 1 provoque la
libération par ces cellules, d‟opioïdes endogènes.
En résumé, ces études nous montrent que le suivi du signal calcique dans les cultures
d‟afférences sensitives donne une bonne indication sur la fonctionnalité des récepteurs
étudiés, mais que des recherches supplémentaires, utilisant des modèles in vivo, sont
nécessaires afin de déterminer le rôle pro- ou anti-nociceptif de médiateurs.
Une autre utilisation possible du suivi de mobilisation calcique dans les afférences sensitives,
est la possibilité de déterminer si une molécule d‟intérêt peut interférer avec le signal de
médiateurs connus pour leurs effets pro-nociceptifs.
Ici encore, l‟activation des récepteurs PARs illustre ce propos.
L‟activation du récepteur à la capsaïcine TRPV1 est connue pour provoquer un signal proalgésique
à la fois in vivo et in vitro dans des neurones en culture, l‟activation de TRPV1
provoquant une mobilisation calcique. L‟activation de TRPV1 est connue comme étant
responsable de la majorité des effets d‟hyperalgésie inflammatoire en réponse à une
stimulation thermique. Nous avons récemment démontré que l‟activation du TRPV1 était
potentialisée par une exposition préalable des fibres nerveuses ou des tissus à l‟agoniste PAR 2 .
Ce phénomène de potentialisation est sous la dépendance de l‟activation d‟une protéinase
Kinase C que nous tentons à l‟heure actuelle d‟identifier. Cette démonstration s‟est faite
selon 3 approches différentes :
- la première était de démontrer que le signal calcique en réponse aux agonistes
TRPV1 dans des neurones sensoriels en culture, était potentialisé par une
exposition préalable de ces neurones aux agonistes PAR 2 . Cet effet de
potentialisation était inhibé en présence d‟inhibiteurs de PKC.
- La deuxième était de démontrer que le signal électrique dans ces neurones, en
réponse aux agonistes TRPV1, était potentialisé également par une pré exposition
aux agonistes PAR 2 , et que cet effet était inhibé par des inhibiteurs de PKC. Cette
approche s‟est effectuée en utilisant des techniques d‟électrophysiologie.
- La troisième était de démontrer que l‟hyperalgésie en réponse aux agonistes
TRPV1 était elle aussi potentialisée lorsque les animaux avaient reçus une
injection intra plantaire de faibles doses d‟agonistes PAR 2 , cette réponse étant
inhibée par un prétraitement avec un inhibiteur de PKC.
Ces 3 différentes approches démontrent toutes la même chose : que le signal du TRPV1 peut
être amplifié par l‟activation de PAR 2 , démontrant par la même, un phénomène de « cross-
113

talk » entre ces 2 récepteurs, et expliquant en partie le mécanisme pro-algésique de
l‟activation de PAR 2 .
Le TRPV1 étant aujourd‟hui une cible thérapeutique pour le développement de médicaments
contre la douleur, les techniques capables de suivre la modulation/activation de la voie du
TRPV1 constituent donc une approche importante pour le test d‟effets analgésiques.
Notre étude montre une corrélation parfaite entre le suivi du signal calcique, l‟activité
électrique des afférences sensitives, et la réponse douloureuse in vivo en ce qui concerne les
voies d‟activation du TRPV1. De ces 3 approches, le suivi du signal calcique est
certainement la plus rapide et la moins coûteuse. Ceci met donc en lumière l’intérêt de
l’utilisation du suivi de signal calcique pour le « screening » de molécules interagissant
potentiellement avec les voies d’activation du TRPV1.
Un dernier exemple d‟utilisation du suivi de mobilisation calcique dans des neurones sensitifs
est celui de l‟effet du peptide dérivé de la protéine S100A9 qui a été démontré comme ayant
des propriétés analgésiques in vivo dans différents modèles inflammatoires. Récemment,
nous avons voulu déterminer si ces propriétés analgésiques étaient dues à un effet direct sur
les afférences sensitives, ou à un effet indirect sur des cellules adjacentes. Le suivi de signal
calcique dans des neurones sensoriels en culture exposés au peptide S100A9 a démontré que
ce peptide était capable d‟inhiber le signal calcique d‟afférences sensitives en réponse à
différentes molécules pro-algésiques (TRPV1, PAR 2 , trypsine ou même KCl), suggérant un
effet direct de ce peptide sur les neurones sensoriels.
En conclusion, le suivi du signal calcique dans des afférences sensitives en culture se
révèle être un outil efficace pour l‘étude des processus douloureux. Bien que cette
approche doive être parfois complétée par une approche électrophysiologique et une
approche in vivo, elle constitue néanmoins un outil intéressant de screening de molécules
potentiellement analgésiques.
114