Mise en évidence d'un effet insulino-stimulant de ... - Biologie & Santé

Mise en évidence d'un effet insulino-stimulant
de fractions de graines de coloquinte
(Citrullus colocynthis L. Schrader).
R. NMILA 1-2 , H. RCHID 1-2 , R. GROSS 4 , M. MANTEGHETTI 4 , G. RIBES 4 , P. PETIT 5 ,
M. TIJANE 3 , Y SAUVAIRE 2 .
1- Département des Sciences de la Vie, Faculté des Sciences, Université Chouaib Doukkali, El Jadida, Maroc
2- Laboratoire de Recherche sur les Substances Naturelles Végétales (UPRES EA 1677), Université Montpellier II, France
3- Laboratoire de Biochimie-Immunologie, Faculté des Sciences Rabat-Agdal, Maroc.
4- UMR 5094 du Centre National de la Recherche Scientifique, Université Montpellier I, France
5- Laboratoire de Pharmacologie, Faculté de Médecine (UPRES EA 1677), Université Montpellier I, France.
Résumé :
La coloquinte, Citrullus colocynthis L. Schrad. est largement utilisée en médecine traditionnelle
dans les régions du moyen orient et dans les pays du pourtour méditerranéen.
Sous forme d'infusion, le fruit est utilisé au Maroc pour lutter contre le diabète sucré.
Lors de travaux antérieurs, nous avons montré que plusieurs fractions de la graine, riches
en acides aminés, possédaient une activité insulino-stimulante pouvant, tout au moins en
partie, être impliquée dans l'effet antidiabétique du fruit de la coloquinte. L'objectif du
présent travail a été de rechercher le (ou les) composé(s) des fractions responsable(s) de
l'activité insulinotrope. L'effet insulino-stimulant a été évalué sur le pancréas isolé et
perfusé de rat en présence de 8,3 mM de glucose. Plusieurs sous-fractions obtenues à
partir de l'extrait clairement insulino-sécréteur, RN X ont été testées, à savoir, RN XIV,
RN XXII, RN XVIII, RN XXIII. La concentration utilisée a été de 0,1 mg/ml.
A partir des résultats obtenus nous pouvons conclure que l'activité insulino-stimulante
de la fraction basique (RN X) de la graine est également observée dans les sous-fractions
qui en sont issues (RN XXII et RN XIV). Notre étude montre que le ß-(Pyrazol-1-yl-)-
L-alanine, acide aminé libre spécifique aux cucurbitacées et majoritaire dans la graine
de coloquinte, n'est pas impliqué dans l'effet insulino-stimulant. L'implication de la
phénylalanine, autre acide aminé présent dans la graine, dans l'effet insulino-sécréteur
est discutée.
L'absence d'effet sur la sécrétion d'insuline avec RN XVIII ou RN XXIII administrés
seuls ne nous permet cependant pas d'exclure la possibilité de l'existence d'une synergie
d'action de ces deux fractions.
Mots-clés : Citrullus colocynthis, cucurbitacée, fractionnement, acides aminés,
sécrétion d’insuline, diabète.
Article reçu le 19 Juillet 2002.
Adresse de correspondance et de tirés à part : Pr. Rachid NMILA
Université Chouaib Doukkali, Faculté des Sciences, Département des Sciences
de la Vie, B.P. 20, 24000 El Jadida, Maroc. Tél : 212 23 34 23 25/30 03.
Fax : 212 23 34 21 87. Email : rnmila@hotmail.com
88
Biologie & Santé vol. 2, n° 2, 2002

Activité insulino-stimulante de la coloquinte
Le diabète sucré est une maladie métabolique
chronique caractérisée par un taux de glucose
élevé dans le sang ou hyperglycémie. Il existe
essentiellement deux types de diabète, le
diabète de type 1 ou diabète insulinodépendant
et le diabète de type 2 ou diabète non
insulinodépendant. Le diabète de type 1 résulte
d'une déficience absolue ou presque du taux
d'insuline circulante. Ce type de diabète est
principalement dû à une destruction autoimmune
des cellules B pancréatiques, cellules
qui sécrètent l'insuline. Le traitement du
diabète de type 1 nécessite l'apport d'insuline
exogène. Le diabète de type 2 est classiquement
caractérisé par une altération de la
réponse insulinique au glucose associée à une
déficience des effets de l'insuline sur les tissus
périphériques et sur le foie (insulinorésistance)
(1, 2, 3, 4). Le diabète de type 2 est
de loin le plus fréquent et représente environ
90% de l'ensemble des diabètes (plus de cent
cinquante millions d'individus dans le monde).
Pour diverses raisons, notamment liées à la
nutrition, à l'obésité, à la sédentarité ou encore
à l'espérance de vie accrue, on estime que le
nombre de diabétiques pourrait doubler en l'an
2010 (5), cette estimation pourrait être plus
importante si l'on tient compte des nouveaux
critères diagnostiques du diabète qui ont été,
ces dernières années, abaissés. Ainsi, toute
personne ayant une glycémie supérieure à
126mg/dl peut être considérée comme
diabétique selon l'OMS (6).
Au Maroc, une étude récente conformément
aux nouveaux critères de l’OMS, menée en
1997 sur 1200 personnes de plus de 20 ans
dans 10 provinces, a révélé une prévalence de
10%. Cette prévalence est significativement
plus importante en milieu urbain (12,7%)
qu’en milieu rural (7,3%) (7).
Pour gérer cette situation qui est devenue un
problème mondial de santé publique, l'arsenal
thérapeutique actuel, au delà des mesures
d'hygiène de vie, est relativement limité. Les
médicaments existant du diabète de type 2
(antidiabétiques oraux) se répartissent en trois
familles pharmacologiques :
- les agents insulino-stimulants, capables de
restaurer la réponse insulinique pancréatique :
ce sont les sulfonylurées ou substances
apparentées (glinides), qui stimulent la
sécrétion d'insuline en agissant sur le canal
potassique-ATP dépendant présent sur la
membrane de la cellule B pancréatique.
- les agents agissant sur l'action de l'insuline
sur les tissus cibles extrapancréatiques; ce sont
des insulino-sensibilisateurs. Le chef de file est
un biguanide, la metformine. Plus récemment
ont été développées les glitazones.
- les inhibiteurs des α glucosidases qui
réduisent l'absorption intestinale de glucose
(acarbose et substances apparentées ).
Enfin, l'insuline exogène, traitement substitutif,
permet ponctuellement de mettre au
repos la sécrétion d'insuline par le pancréas
endocrine afin de relancer ensuite sa
fonctionnalité ; dans d'autres cas, il s'agira d'un
traitement définitif visant à assurer un contrôle
glycémique plus strict.
Ainsi, étant donné le nombre croissant de
diabétiques de type 2, la recherche de
nouveaux agents pharmacologiques ou
l'identification de nouvelles cibles pharmacologiques
s'est intensifiée ces dernières années.
Les plantes peuvent fournir la source pour de
nouveaux médicaments antidiabétiques, et des
centaines de plantes ont été citées dans le
traitement traditionnel du diabète (8, 9).
Parmi ces plantes, certaines ont révélé dans
différentes conditions expérimentales, une
activité antidiabétique comme la momordique
(Momordica charantia L., cucurbitacée) (10,
11) ou encore le fenugrec (Trigonella foenumgraecum
L., légumineuse) (12, 13).
Biologie & Santé vol. 2, n° 2, 2002 89

R. Nmila et al.
Au Maroc, la médecine traditionnelle est
largement répandue et tient une place majeure
dans le traitement du diabète (14). Une étude
récente dans la région de Marrakech a montré
que 90% des patients utilisent les plantes pour
soigner leur diabète (15).
Une cucurbitacée, la coloquinte ou Citrullus
colocynthis L. Schrader, plante herbacée des
régions saharo-arabiennes et du bassin
méditerranéen, est utilisée en médecine traditionnelle
depuis des temps très anciens (16)
et notamment pour lutter contre le diabète (17).
Dans des travaux précédents, nous avons
montré que des fractions de la graine de
coloquinte possédaient une activité insulinostimulante.
(18).
Le but du présent travail a été d'évaluer
l'activité insulino-stimulante de différentes
sous-fractions issues des extractions précédentes.
Nos travaux pharmacologiques ont été
réalisés sur le pancréas isolé et perfusé de rat.
Matériels et méthodes
Matériel végétal :
Les fruits de coloquinte (Citrullus colocynthis
L. Schrad.) sont achetés sur le marché populaire
auprès des herboristes ou ramassés sur le
terrain dans la région d'El Jadida (Maroc). Les
fruits sont triés, coupés en deux et séchés à l'air
libre pendant une semaine (méthode
traditionnelle). Les graines sont ensuite
séparées de la pulpe, nettoyées et pesées.
Un spécimen (RN002) a été déposé à l'institut
de Botanique de Montpellier (Université de
Montpellier I, France).
Les graines matures sont broyées soit
manuellement dans un mortier (méthode traditionnelle)
soit mécaniquement à l'aide d'un
broyeur à couteaux (IKA-Labortechnik Type
A10).
Figure 1: Schéma récapitulatif du protocole d’extraction et de
purification des différentes fractions obtenues à partir de la
graine de Citrullus colocynthis L. Schrader.
* βPA : β-(Pyrazol-1-yl-)-L-alanine (=RN XVIII) obtenu par
synthèse chimique.
Extraction et fractionnement de la graine :
(Figure 1)
* Extractions :Les différentes extractions et les
premières étapes de fractionnement sont
réalisées selon le protocole décrit en partie
dans nos travaux antérieurs (18).
Des extractions à partir des graines ont été
réalisées avec différents solvants :
- Infusion ( méthodes traditionnelles)
- Extraction hydroalcoolique à température
ambiante.
90
Biologie & Santé vol. 2, n° 2, 2002

Activité insulino-stimulante de la coloquinte
Les extraits bruts obtenus sont réduits en
poudre après concentration sous vide,
congélation à l'azote liquide et lyophilisation
pour donner respectivement RN I et RN II.
* Fractionnement de la graine : La poudre de
graines est soumise à deux extractions
successives à l'extracteur Soxhlet (60-80°C).
D'abord une délipidation à l'hexane (3x12h)
pour isoler les lipides neutres (18,6%), la
poudre délipidée restante (Tourteau I) est
séchée puis extraite (3x12h) avec le mélange
solvant isopropanol/eau (70/30, v/v). L'extrait
obtenu est débarrassé du solvant et concentré
sous vide à l'évaporateur rotatif puis lyophilisé,
on obtient la fraction délipidée codée RN VI
(figure 1).
L'extrait délipidé RN VI est fractionné, après
solubilisation, sur une résine échangeuse d'ions
(Amberlite IR 120, forme H + , Fluka). Les
composés basiques fixés sur la résine sont
élués avec une solution de NH 4 OH (1M), après
concentration et lyophylisation on obtient la
fraction basique RN X.
RN X est subdivisé en plusieurs sous-fractions
selon un protocole de fractionnement biodirigé
(Fig.1) basé sur des séparations chromatographiques:
- chromatographie sur colonne (CC): réalisée
avec du gel de silice 60 (0,063 – 0,2 mm,
Merck). La chromatographie est réalisée avec
les mélanges solvants successifs suivants :
a) CHCl 3 /MeOH/H 2 O (65/50/15,v/v/v), b)
mélange (a)/EtOH 90 % (50/50,v/v), c) EtOH
70 %. Cette étape permet d’obtenir la sousfraction
RN XIV.
- chromatograchie en couche mince (CCM)
préparative : les supports sont des plaques
recouvertes de gel de silice Sil G-25, UV254,
20x20 cm (Macherey-Nagel). Le développement
est effectué en présence du mélange
CHCl 3 /MeOH/H 2 O (65/50/15, v/v/v). La
révélation de bandes latérales de la plaque
permet un repérage des composés sous formes
de bandes qui sont isolées après prélèvement et
élution de la silice avec de l'éthanol à
différentes proportions. L’extrait RNX soumis
à une CC suivie d’une CCM permet
l’obtention de la sous-fraction RN XXII.
- chromatographie liquide à haute performance
(HPLC) préparative: cette technique a été
utilisé pour purifier la fraction RN XVII
(obtenu à partir du RN XIV par CC et CCM),
à l'aide d'un appareil Varian 5000 Liquid
chromatograph. La séparation se fait sur une
colonne C18 (Merck-Hibar column RP-
18,100A 10 µm, 250x25 mm). L'élution est
réalisée en isocratique avec le solvant binaire
MeOH/H 2 O (90/10, v/v) à un débit de 16
ml/min, la détection est faite à 220 nm à l'aide
d'un détecteur UV (Gilson 112UV). Après la
purification du RN XVII et son identification
physicochimique (RMN H1-C13 et FAB +et-),
une synthèse chimique a été réalisée pour
l'obtention du produit pur : RN XVIII. Enfin la
sous-fraction RN XXIII est issue du RN XIV
suite à une CC suivie d’une CCM préparative.
Analyse des acides aminés :
L'analyse des acides aminés est réalisée par
HPLC à l'aide d'un appareil Varian 5000
Liquid chromatograph couplé à un fluorimètre
Shimadzu FR-530 (Japon). L'acquisition des
données se fait grâce au logiciel Millenium 32
Chromatography Manager.
Le dosage est réalisé selon une méthode mise
au point au laboratoire et inspirée des travaux
de Dorresteijn et coll. (19). Elle est basée sur
la dérivation des acides aminés présents dans
l’échantillon végétal par l’orthophtaldialdéhyde
(OPA). La séparation des acides
aminés est réalisée sur une colonne Alltima C8
(250x4,6 mm,5µm) (Alltech,USA).
L’élution se fait avec un gradient binaire :
CH 3 COONa 80 mM à pH =5,7 et MeOH +
Tetrahydrofurane (93/7, v/v). L’identification
des acides aminés se fait par comparaison des
Biologie & Santé vol. 2, n° 2, 2002 91

R. Nmila et al.
temps de rétention des différents pics présents
dans l’échantillon par rapport à ceux d’un
étalon de 18 acides aminés (Standard Sigma
A9781) auquel on ajoute de la citrulline, la
glutamine, l’asparagine et le GABA (acide
gamma-amino butyrique). Cette méthode
présente une sensibilité de l’ordre de 10
picomoles.
Etude pharmacologique:
Protocole :
Cette étude in vitro est réalisée sur le pancréas
isolé et perfusé de rats Wistar mâles ayant libre
accès à la nourriture et à l'eau jusqu'au moment
de l'expérience ; les rats pesant environ 350 g
sont anesthésiés par injection intrapéritonéale
de pentobarbital sodique (60mg/kg) et les
pancréas sont isolés et perfusés selon la
technique mise au point par Loubatières et coll.
(20). Le pancréas est totalement isolé des tissus
voisins et immédiatement perfusé (par son
système artériel) avec une solution physiologique
de Krebs-Ringer bicarbonaté
contenant 2g/l d'albumine de boeuf.
Le milieu est thermostaté à 37°C et bullé en
permanence (O 2 /CO 2 , 95/5%) pour maintenir
un pH à 7,4. Pour assurer une légère
stimulation de la sécrétion d'insuline, on ajoute
au milieu, du glucose à la concentration de 8,3
mM. La circulation du liquide de perfusion est
assurée par une pompe péristaltique à pression
constante et calibrée pour avoir un débit
pancréatique basal d'environ 2,5ml/min en
début d'expérience. Des prélèvements
effectués juste à la sortie du pancréas sont
réalisés, le 1er à 30min (période de
stabilisation), ensuite deux autres
prélèvements sont effectués à 40 et 45min. Ce
dernier prélèvement (45min de stabilité)
représentera la valeur de base témoin. Après la
45ème minute, à la solution de Krebs-Ringer
est rapidement ajouté l'un des extraits ou
fractions solubilisés (issues de la graine de
coloquinte) à la concentration de 0,1 mg/ml, et
le pancréas est ainsi perfusé pendant une durée
de 20min avec des prélèvements à des temps
déterminés. Des pancréas isolés et perfusés
uniquement avec la même solution de Krebs-
Ringer contenant 8,3 mM de glucose
constituent le groupe témoin.
Les prélèvements d'effluents pancréatiques
durent 1min et permettent de connaître le débit
de l'organe ; ils sont rapidement congelés à -
20°C pour les dosages d'insuline réalisés
ultérieurement.
Le dosage de la concentration d'insuline
contenue dans le liquide de perfusion est
réalisé selon une méthode radio immunologique
adaptée de Herbert et coll. (21). Le
principe de la méthode repose sur la
compétition entre l'hormone de l'échantillon à
doser et l'hormone marquée : Insuline-I 125
(CIS international, Gif sur Yvette, France), vis
à vis d'un anticorps anti-insuline (Laboratoires
Miles, Paris, France).
La gamme étalon est préparée à partir
d'insuline pure de rat (Novo, Copenhague,
Danemark) ayant une activité biologique de
22,3µUI/ng.
La méthode présente une sensibilité de
0,1ng/ml. Le débit pancréatique est donné
directement par mesure du volume émis par le
pancréas isolé par minute, et le débit de
l'insuline est déterminé en multipliant la
concentration (ng/ml) par ce débit.
Expression des résultats et analyse
statistique :
Les résultats sur la sécrétion d'insuline sont
calculés en ng/min (débit ml/min x
concentration d'insuline ng/ml) et représentés
en pourcentage par rapport à la valeur obtenue
à la 45ème minute (graphiques). Toutes les
cinétiques exprimées en moyennes ± SEM ont
été soumises à l'analyse de variance. Enfin
92
Biologie & Santé vol. 2, n° 2, 2002

Activité insulino-stimulante de la coloquinte
l'analyse des résultats a été complétée par le
calcul des aires sous la courbe (5 premières
minutes ou les 20 minutes de perfusion des
fractions).
Résultats
Etude de l'extrait RN X
Composition en acides aminés (Tableau I)
L'analyse de l'extrait RN X révèle la présence
de différents acides aminés libres qui sont
présents à des proportions plus ou moins
importantes. On note la présence de deux
acides aminés majoritaires, le premier
correspond à la citrulline et le deuxième
correspond à un acide aminé non convention-
nel. Une purification suivie d'études physicochimiques
a permis sa caractérisation et son
identification; il s'agit d'un acide aminé hétérocyclique
non protéinique, spécifique de la
famille des cucurbitacées : le ß-(Pyrazol-1-yl)-
L-alanine (ß PA). Ces deux acides aminés
libres majoritaires représentent à eux seuls
près de 40% de l'ensemble des acides aminés
dosés. On note également la présence
d'alanine (5,9%) et d'acide glutamique (5,3%),
accompagnés d'asparagine et de sérine (près de
3% chacun) et de GABA (2,3%). D'autres
acides aminés sont présents à des proportions
moins importantes ou à l'état de traces.
L'extrait RN X contient d'autres composés qui
sont détectés sur le chromatogramme à des
temps différents de ceux des acides aminés du
standard, l'ensemble de ces composés non
Tableau I : Composition en acides aminés libres des différentes fractions testées sur le pancréas isolé et
perfusé de rat wistar. Les valeurs sont exprimées en pourcentages du total des acides aminés dosés dans chaque fraction
Biologie & Santé vol. 2, n° 2, 2002 93

R. Nmila et al.
minute (+ 60%). L'aire sous la courbe (5
minutes) est de 689,2 ± 46,7 ng versus 498,9 ±
16,5 ng pour les pancréas témoins (p

Activité insulino-stimulante de la coloquinte
l'ensemble des acides aminés dosés.
Effets pharmacologiques ( Figure 4)
La perfusion de RN XIV induit une augmentation
de la sécrétion d'insuline qui, comme
pour RN X et RN XXII, est immédiate et
significative (p

R. Nmila et al.
dès la 2ème minute (+ 63 %). L'aire sous la
courbe pour les 5 premières minutes est de
620,4 ± 42 ng. Cependant pour cette fraction,
la phase de sécrétion se poursuit jusqu'à la
10ème minute. Comme les deux fractions
précédentes, RN XIV augmente le débit
pancréatique. Cet effet dure toute la perfusion.
L'aire sous la courbe correspondante est de
51,8 ± 0,5 ml (p 99,5 %). En
effet le RN XVIII a été synthétisé après
purification et identification du produit naturel
dans la fraction RN XVII issue de la graine de
coloquinte.
Dans la fraction RN XXIII nous constatons la
prédominance de cinq acides aminés : leucine
(21,6%), isoleucine (15,3%), tryptophane
(11,2%), phénylalanine (9,4%) et ßPA (7,7%).
La valine, la serine et la citrulline sont
également présents à des proportions non
négligeables (4,9%, 4,8% et 3,1% respectivement).
L'alanine est représenté à moins de 2%.
Les composés non identifiés représentent
14,8% de l'ensemble des acides aminés dosés
dans la fraction RN XXIII.
Effets pharmacologiques
RN XVIII et RN XXIII n'ont aucun effet
significatif sur la sécrétion d'insuline. Les aires
sous la courbe (5 minutes) pour la sécrétion
d'insuline sont respectivement de 504,5 ± 72,7
ng et de 552 ± 69 ng versus 498,9 ± 16,5 ng
pour les pancréas témoins. En ce qui concerne
les débits pancréatiques, RN XXIII n'a aucun
effet (aire sous la courbe des 20 minutes de
perfusion = 49,3 ± 3 ml, n=3). RN XVIII
produit une augmentation du débit comparable
à celle observée par perfusion de RN XIV (aire
sous la courbe des 20 minutes = 52 ± 0,9 ml).
Discussion
Notre travail montre que différentes fractions
de la graine de coloquinte (Citrullus
colocynthis L. Schrad.) ont la propriété de
stimuler la sécrétion d'insuline et d'augmenter
le débit vasculaire pancréatique dans le
pancréas isolé de rat.
Ces résultats confirment l'effet insulino-stimulant
et vasodilatateur déjà décrits avec d'autres
fractions de la graine de coloquinte (18).
Le principal objectif de ce travail a été de
poursuivre le fractionnement et l’isolement de
sous-fractions de la graine afin de rechercher le
ou les composant(s) des fractions impliqué(s)
dans les effets pharmacologiques observés. Les
acides aminés présents dans chaque fraction de
la graine ont particulièrement retenu notre
attention. Il est connu depuis de nombreuses
années que les acides aminés stimulent la
sécrétion d'insuline. Ainsi Floyd et coll. (22)
ont montré qu'un mélange d'acides aminés
essentiels stimulait la sécrétion d'insuline chez
l'homme par un effet direct sur la cellule B
pancréatique, indépendamment des facteurs
gastro-intestinaux sécrétés lors de l'ingestion
de ces nutriments. On sait, de plus, que certains
acides aminés administrés seuls sont capables
de stimuler la sécrétion d'insuline (23).
Les acides aminés responsables de l’effet
insulino-stimulant peuvent être soit présents
chez les mammifères ou spécifiques des
plantes. Ainsi, notre équipe a antérieurement
démontré que la 4-hydroxyisoleucine, acide
aminé extrait d'une légumineuse, le fenugrec,
absent chez les mammifères, avait des
propriétés insulino-stimulantes (24) et
antidiabétiques (25).
En ce qui concerne les fractions de graines de
96
Biologie & Santé vol. 2, n° 2, 2002

Activité insulino-stimulante de la coloquinte
coloquinte testées sur le pancréas isolé de rat,
RN X, RN XIV et RN XXII stimulent la
sécrétion d'insuline. L'analyse de leur
composition en acides aminés libres révèle que
RN X et RN XXII ont une proportion non
négligeable de phénylalanine. Or la
phénylalanine est connue pour avoir une
propriété insulino-sécrétrice (26, 27) et
pourrait donc être responsable des effets
observés avec les fractions RN X et RN XXII.
Il faut à cette occasion rappeler qu'un dérivé de
la D-phénylalanine (A4166) est un agent
hypoglycémiant insulino-stimulant (28, 29)
déjà utilisé dans la thérapeutique du diabète de
type 2.
L'effet de RN XIV sur la sécrétion d'insuline
ne semble pas pouvoir être dû à la
phénylalanine seule contenue dans cette
fraction puisque cet acide aminé n'y est présent
qu'en très faible quantité.
La richesse en ß-(Pyrazol-1-yl-)-L-alanine,
notamment dans la fraction RN XIV, nous a
incité à rechercher la responsabilité de ce
composé dans l'effet insulino-stimulant. Nos
expériences réalisées avec la fraction RN
XVIII (ßPA > 99,5%) montrent que cet acide
aminé libre, non conventionnel et spécifique
des cucurbitacées ne peut pas être impliqué.
Comme pour RN XVIII, les expériences
réalisées avec RN XXIII ne révèlent aucun
effet notable sur la sécrétion d'insuline. Or ces
deux sous fractions testées individuellement
proviennent de l'extrait insulino-stimulant RN
XIV et il n'est pas exclu que l'effet insulinostimulant
observé nécessite une synergie
d'action entre les composés présents dans les
deux sous-fractions.
Les effets de RN X, RN XIV et RN XXII sur
le débit vasculaire pancréatique pourraient
refléter un effet vasodilatateur de ces fractions.
Si cela devait être confirmé, l'intérêt
thérapeutique antidiabétique de ces extraits
serait alors renforcé puisqu'il est bien connu
que les complications cardiovasculaires sont
les principales causes de morbidité ou de
mortalité (30) de la maladie diabétique.
De futures expérimentations devraient nous
permettre d'identifier clairement les molécules
impliquées dans l'effet insulino-sécréteur de la
graine de coloquinte et d'avancer vers une
meilleure connaissance du (des) mécanisme(s)
intervenant dans les effets pharmacologiques
observés.
Remerciements
Les auteurs remercient le Dr. Roumestant M.L.
(laboratoire des Amino-acides, Peptides et
Protéines Université Montpellier II) pour la
synthèse du ß PA et Mr. Samuel Dietz (UMR
5094) pour sa participation technique.
Summary
Citrullus colocynthis is widely used in
traditional medecine, in Middle Eastern areas
and Mediterranean countries. In Morocco,
infusion of the fruit are used as an antidiabetic
medication. In a previous work, we could show
that different fractions of the seed rich in
amino acids, are able to stimulate insulin
secretion, an effect that could, at least partly,
account for the antidiabetic action of citrullus
colocynthis fruit. The aim of the present work
was to determine the component(s) of different
fractions, involved in the insulin secretory
effect. Insulin secretion was studied in the
isolated perfused rat pancreas in the presence
of 8.3 mM glucose. We tested various
subfractions obtained from RN X, the extract
that was clearly insulinotropic, i.e RN XIV, RN
XXII, RN XVIII and RN XXIII ; the
Biologie & Santé vol. 2, n° 2, 2002 97

R. Nmila et al.
concentration selected was 0.1 mg/ml.
From our data, we can conclude that the insulin
secretory effect of the basic RN X fraction is
also found for RN XXII and RN XIV, two
subfractions obtained from RN X. Our stydy
also shows that ß-(Pyrazol-1-yl-)-L-alanine,
the major amino acid present in citrullus
colocynthis seeds and specific of cucurbitaceae
is not involved in the stimulation of insulin
secretion. The implication of phenylalanine,
another amin oacid present in the seed is
discussed.
The inefficiency of RN XVIII or RN XXIII
alone suggest that a synergistic action of
different components present in the two
fractions is necessary for the insulinotropic
effect of RN XIV.
Key-words: Citrullus colocynthis, cucurbi-taceae,
fractionation, amino acids, insulin secretion, diabetes.
Références
1. Cerasi E., Efendic S. Decreased sensitivity
of the pancreatic beta cells to glucose in
prediabetic and diabetic subjects. Diabetes,
1972, 21 : 224-34.
2. Kahn SE., Porte D. Islet dysfunction in noninsulin-dependent
diabetes mellitus. Am. J.
Med., 1988, 85 : 4-5.
3. De Fronzo RA., Bonadonna FC., Ferrannini
E. Pathogenesis of NIDDM. Diabetes Care,
1992, 12 : 318-68.
4. Girard J. Insulinorésistance : quel rôle dans
le diabète de type 2. Role of insulin
resistance in Type 2 diabetes. Diabète
Métabol., 1994, 20 : 330-6.
5. Gerber P. Diabète. Méd. et Hyg., 1998, 56 :
21-28.
6. Alberti K.G., Zimmet P.Z. For the Who
consultation, definition, diagnosis and
classification of diabetes mellitus and its
complications. Part I : Diagnosis and
classification of diabetes mellitus
provisional report of a Who consultation.
Diabetic Med., 1998, 15 : 539-553.
7. Saad A., Mouzoun F.Z., Mahjour J.
Programme National de Prévention et de
Contrôle du Diabète. 7ème Congrès du
Groupe Pan Africain pour l’étude du
Diabète : « Le diabète en milieu marocain
en 2001 », 24-26 Mai 2001,Casablanca,
Maroc.
8. Bailey CJ., Day C. Traditional plant
medicines as treatments for diabetes.
Diabetes Care, 1989, 12 : 553-64.
9. Ivorra MD., Paya M., Villar A. Review of
natural products and plants as potential
antidiabetic drugs. J. Ethnopharmacol.,
1989, 27 : 243-75.
10. Day C., Cartwright T., Provost J., Bailey
CJ. Hypoglycaemic effect of Momordica
charantia extracts. Planta Med., 1990, 56 :
426-9.
11. Sarkar S., Pranava M., Marita R.
Demonstration of hypoglycaemic action of
Momordica charantia in a validated animal
model of diabetes. Pharmacol. Res. 1996,
33 : 1-4.
12. Shani J., Goldschmied A., Ahronson Z.,
Sulman F.G. Hypoglycaemic effect of
Trigonella foenum graecum and Lupinus
termis (Leguminosae) seeds and their
major alkaloïds in alloxan diabetic and
normal rats. Arch. Inter. Pharmacodyn.
Ther., 1974, 210 : 27-36.
13. Ribes G., Sauvaire Y., Da Costa C., Baccou
J.C., Loubatières-Mariani M.M.
Antidiabetic effects of subfractions from
fenugreek seeds in diabetic dogs. Proc.
Soc. Biol. Med. 1986, 182 : 159-166.
14. Sekkat C. Le diabète et son traitement par
les plantes. Enquête auprès de 100 DID et
100 DNID. Thèse médecine, 1987, Rabat
Maroc, 140 p.
15. Jaouhari J.T., Lazrek H.B., Jana M. Etude
de la toxicité aigüe de dix plantes
marocaines réputées hypoglycémiantes.
98
Biologie & Santé vol. 2, n° 2, 2002

Activité insulino-stimulante de la coloquinte
Thérapie, 1999, 54 : 701-6.
16. Sevri S., Kenan S., Eris A., Gülbin O. A
study on the medicinal formulas used in the
treatement of dental diseases, recorded in
Avicenna’s aqrabadhin with respect to
today’s pharmacy. Hamdard medicus,
1994, 37(2) : 5-16.
17. Bellakhdar J. La pharmacopée marocaine
traditionnelle. Médecine arabe ancienne et
savoirs populaires. IBIS press, France,
1997 : 262-263.
18. Nmila R., Gross R., Rchid H., Roye M.,
Manteghetti M., Petit P., Tijane M., Ribes
G., Sauvaire Y. Insulinotropic effect of
Citrullus colocynthis fruit extracts. Planta
Med. 2000, 66 : 418-423.
19. Dorresteijn R.C., Berwald L.G., De
Gooijer C.D., Wieten G., Beuvery E.C.
Determination of amino acids using o-
phtalaldehyde-1-mercaptoethanol
derivatisation, effect of reaction conditions.
Journal of chromatography A, 1996, 727:
159-167.
20. Loubatières AL., Mariani MM., De
Malbosc H., Ribes G., Chapal J. Etude
expérimentale d’un nouveau sulfamide
hypoglycémiant particulièrement actif le
HB419 ou glibenclamide. I. Action
bêtacytotrope et insulinosécrétrice.
Diabetologia, 1969, 5 : 1-10.
21. Herbert V., Laws KS., Gottlieb CW.,
Bleicher SJ. Coated charcoal immunoassay
of insulin. J. Clin. Endocrinol., 1965, 25 :
1375-84.
22. Floyd J.C., Fajans S.S., Pek S., Thiffault
C.A., Knopf R.F., Conn J.W. Synergestic
effect of essential amino acids and glucose
upon insulin secretion in man. Diabetes,
1970, 19 : 109-115.
23. Charles S., Henquin J.C. Distinct effects of
various aminoacids on 45 Ca 2+ fluxes in rat
pancreatic islets. Biochem. J., 1983, 214 :
899-907.
24. Sauvaire Y., Petit P., Broca C., Manteghetti
M., Baissac Y., Fernandez-Alvarez J.,
Gross R., Leconte A., Gomis R., Ribes G.
4-Hydroxyisoleucine, a novel amino acid
potentiator of insulin secretion. Diabetes,
1998, 74 : 206-210.
25. Broca C., Gross R., Petit P., Sauvaire Y.,
Manteghetti M., Tournier M., Masiello P.,
Gomis R., Ribes G. 4-Hydroxyisoleucine :
experimental evidence of its insulinotropic
and antidiabetic properties. Am. J. Physiol.,
1999, 277 : E617-E623.
26. Sener A., Malaisse W.J. The stimulussecretion
coupling of amino acid-induced
insulin release: insulinotropic action of
branched-chain amino acids at physiological
concentrations of glucose and glutamine. Eur.
J. Clin. Invest., 1981, 11 : 455-460.
27. Loubatières-Mariani M.M. Données
actuelles sur l'insulinosécrétion et sa
régulation. J. Pharmacol., 1986, 17 ( suppl
II ) : 83 –103.
28. Shinkai H., Nishikawa M., Sato Y., Toi K.,
Kumashiro I., Seto Y., Fukuma M., Dan K.,
Toyoshima Sh. N-(cyclohexylcarbonyl)-
D-phenylalanines and related compounds.
A new class of oral hypoglycemic agents. J.
Med. Chem.,1989, 32 : 1436-1441.
29. Sato Y., Nishikawa M., Shinkai H.,
Sukegawa E. Possibility of ideal blood
glucose control by a new oral hypoglycemic,
N-[(trans-4-isopropylcyclohexyl)-
carbonyl]-D-phenylalanine (A-4166), and its
stimulatory effects on insulin secretion in
animals. Diabetes Research and Clinical
Practice, 1991, 12 : 53-60.
30. Panzram G. Mortality and survival in type
II (non-insulin-dependent) diabetes
mellitus. Diabetologia, 1987, 30 : 123-31.
Biologie & Santé vol. 2, n° 2, 2002 99