Les symbiotes mycorhiziens du peuplier noir (populus nigra L.) : la ...

Les Actes du BRG, 4 (2003) 453-466© BRG, 2003Article originalLes symbiotes mycorhiziensdu peuplier noir (Populus nigra L.) :la spécificité des assemblages fongiquesen milieu riverainMonique GARDES * , Emmanuelle BIALET, Estelle BINET,Cécile BROUSSEAU, Frédéric CARRÉ, Jean-Yves CHARCOSSET,Nolwenn FRADET, Patricia GRIFFITH, Hervé GRYTA,Marc LAQUERBE, Carole MARTINEZ, Sophie MILLOTCentre d’écologie des systèmes aquatiques continentaux, UMR CNRS - UniversitéPaul Sabatier, 29 rue Jeanne Marvig, 31055 Toulouse Cedex 4, FranceAbstract - Mycorrhizal fungi associated with black poplar (Populus nigra L.):specificity of the symbiotic assemblages on a riparian site. Genetic resourcesof indigenous black poplar (Populus nigra L.) are threatened because of the risk ofintrogression from cultivated hybrids and anthropic disturbances of the riparianhabitat. We looked for the diversity of mycorrhizal fungi associated with this pioneerplant species on a riparian ecosystem. Our results showed a complex dynamicsof mycorrhizal types in relation to stand age and poplar development and/or to thedegree of hydrological disturbance. Arbuscular mycorrhizae (AM) were detected onroots from young poplars located on disturbed to highly disturbed habitats, andectomycorrhizae (EM) on roots from older trees on less disturbed habitats. Undercertain ecological conditions, both mycorrhizal types simultaneously colonizedpoplar roots. However, strong seasonal variations in colonization patterns were alsoobserved. Molecular analysis of the ectomycorrhizal community using ITS typing(ITS-RFLP) revealed a predominance of pioneer fungal species with a broad hostrange. Among the dominant taxa, we found many ascomycetes including severalspecies of truffles (Tuber sp.). Finally, two populations of two Tricholoma speciesfrom two contrasting habitats were analyzed using RAPD and IGS-RFLP in orderto infer the influence of disturbance on the mode of reproduction. We found numerousand small génets on the riparian site, suggesting that spores are the primarymeans by which these species colonized this disturbed habitat. However, sporemigration from other habitats may be limited as new genotypes appeared to be allclosely related to pre-existing local genotypes.mycorrhizal symbiosis / black poplar / fungi / riparian habitat / biodiversity* Correspondance et tirés à part : gardes@cict.fr453

M. Gardes et al.Résumé - Les populations naturelles de peuplier noir (Populus nigra L.) sont menacéespar une pollution génétique liée aux nombreux cultivars et par les perturbations anthropiquesde l’habitat riverain. Nous avons examiné la diversité des champignonsmycorhiziens associés à cette essence pionnière des ripisylves. Nous avons mis enévidence l'existence d'une dynamique complexe des types mycorhiziens liée au stadede développement du peuplement et/ou au niveau de perturbation du milieu. Il y aune prédominance des endomycorhizes à vésicules et arbuscules dans les jeunes peuplementssur des sols fortement à moyennement perturbés, et des ectomycorhizesdans les peuplements plus âgés sur les sols les moins perturbés. Les peupliers sontdoublement mycorhizés sous certaines conditions mais il existe des variations saisonnièresmarquées. L'analyse des communautés ectomycorhiziennes par typage moléculaire(ITS-RFLP) fait apparaître une prédominance de la mycoflore ectomycorhiziennepionnière à mutualisme généraliste. Parmi les espèces dominantes, on trouve de nombreuxascomycètes, des truffes (Tuber sp.) en particulier. Finalement, sur la base dedifférents marqueurs génétiques (RAPD, IGS-RFLP), nous avons révélé chez deuxespèces de tricholomes associées au peuplier, la présence de nombreux génets depetite taille suggérant une colonisation de l’habitat riverain par l’intermédiaire desspores méiotiques. Mais le renouvellement des populations est probablement limité enmilieu riverain puisqu'il semble s'effectuer à partir des génotypes locaux, sans ou avecpeu d’apport extérieur au site.symbiose mycorhizienne / peuplier noir / champignons / ripisylve / biodiversité1. INTRODUCTIONL'association mycorhizienne résulte de l'interaction entre la racine d'uneplante-hôte avec le mycélium d'un champignon. Probablement apparue au siluro-dévonien(il y a 350 à 460 millions d'années), cette symbiose se serait développéeà plusieurs reprises dans l'histoire des plantes et des champignons. Elleconcerne la plupart de nos espèces végétales et plus de 6 000 espèces de champignons,et rassemble en fait une très grande diversité d'associations possiblesentre des plantes et des champignons. Ce processus, à bénéfices réciproquespour les deux partenaires, est un des mécanismes majeurs de l'évolution et del'écologie des organismes [15], [17], [19]. La symbiose accélère l'innovation évolutiveet favorise l'expansion et la diversification des espèces. Elle joue égalementun rôle moteur dans la richesse, la stabilité et la complexité des écosystèmespar ses effets régulateurs sur les populations et les communautés d'organismesqui lui sont directement ou indirectement associées. Dans le cadre denotre projet, nous avons cherché à comprendre comment les communautés etpopulations de champignons mycorhiziens associés au peuplier noir (Populus gr.nigra) se mettent en place à des échelles locales et régionales, et quels sont lesfacteurs écologiques et génétiques qui orientent leur dynamique. Notre objectifdans ces approches comparatives était de révéler l'étendue de la plasticité de lasymbiose mycorhizienne vis-à-vis des contraintes environnementales chez le454

Les champignons mycorhiziens du peuplier noirpeuplier noir. En effet, les associations plantes-champignons optimisent potentiellementleur ajustement au milieu en jouant : i) sur les différents types de mycorhizeset leur proportion, mais également, ii) sur la richesse et la distributiondes espèces et des individus et la diversité de leurs capacités nutritionnelles et iii)sur le degré de généralisation ou de spécialisation des partenaires. Soulignonségalement que le système racinaire d'une plante peut héberger plusieurs espècesde champignons, voire plusieurs individus de chaque espèce. Parmi ces assemblages,on trouve des espèces fongiques avec des gammes d'hôtes larges : ellessont qualifiées de généralistes ; d'autres, au contraire, manifestent une préférencevoire une spécificité étroite vis-à-vis de certains taxa : ce sont les espèces qualifiéesde spécialistes [12]. Dans notre projet, nous avons entrepris une étude dupolymorphisme génétique dans des populations naturelles de deux espèces detricholomes avec des spectres d'hôtes très contrastés. L'une, Tricholoma populinum,est inféodée aux peupliers tandis que l'autre, Tricholoma scalpturatum, s'associe àune panoplie d'angiospermes et de gymnospermes ligneux (par exemple peuplier,saule, chêne, pin).Le peuplier noir est une essence ligneuse à vocation pionnière, souventdominante dans les stades précoces d'évolution des ripisylves. Il sert de basegénétique pour l'obtention de nombreux hybrides euraméricains (par exemple,P. deltoides x P. nigra) cultivés dans les plantations françaises. Malheureusement,la populiculture et d'autres activités humaines, par exemple, certains aménagementsfluviaux, ont appauvri le potentiel génétique du peuplier noir et réduitson habitat [1], [9]. Au-delà de ces considérations économiques, le peupliernoir est un modèle végétal intéressant pour la compréhension de la symbiosemycorhizienne puisqu'il est une des rares espèces végétales à pouvoirhéberger simultanément deux types de mycorhizes : des endomycorhizes àvésicules et arbuscules et des ectomycorhizes. Les premières concernent desespèces de champignons microscopiques appartenant à la division des zygomycètes.Dans cette symbiose, le champignon pénètre à l'intérieur des cellulesdu parenchyme cortical sans engendrer de déformation de la racine. Les secondesconcernent près de 6 000 espèces décrites de champignons macroscopiquesappartenant aux divisions ascomycètes et basidiomycètes. Le champignonforme un manchon d'hyphes autour des racines courtes et un réseau demycélium entre les cellules corticales. Quel que soit le type mycorhizien, lesmycorhizes (endo- et ecto-) sont des sites privilégiés d'échanges entre la racineet le sol. Les associés fongiques améliorent la nutrition minérale des plantes,contribuent à une meilleure alimentation hydrique, interfèrent avec le métabolismehormonal de l'hôte végétal et assurent un rôle de protection phytosanitaire[17]. Selon certains auteurs, la double colonisation permettrait d'accroîtrel'amplitude écologique de l'hôte végétal en améliorant son alimentation minérale: les symbiontes endomycorhiziens faciliteraient la nutrition phosphatéede la plante, les ectomycorhiziens la nutrition azotée [17]. Des rôles autres quenutritionnels sont également à envisager.455

M. Gardes et al.Dans cet article, nous présentons les résultats issus des travaux sur lescommunautés et les populations de champignons, réalisés pour l'essentieldans le cadre du projet et une synthèse des travaux antérieurs effectués dansnotre laboratoire sur la mycorhization du peuplier noir. Quels sont les déterminantsde la distribution de la diversité fongique ? Quelles peuvent êtreles conséquences des modifications de l'habitat riverain et de la disparitiondes peuplements naturels du peuplier noir sur cette diversité ? Des conditionsenvironnementales imprévisibles favorisent-elles un mutualisme généralisteou un mutualisme étroit ? Comment la diversité génétique est-ellemaintenue dans des environnements soumis à de fortes contraintes abiotiques? Afin d'apporter des éléments de réponse à ces questions sur la dynamiquede la mycorhization, nous avons réalisé une prospection de la diversitédes symbiontes fongiques à différentes échelles spatio-temporelles etniveaux d'organisation (types mycorhiziens, communautés, populations).2. MATÉRIEL ET MÉTHODES2.1. Les sites d'échantillonnage pour le suivi des types mycorhizienset des communautés fongiquesNous avons effectué nos prélèvements dans deux peuplements naturelsde peupliers noirs en bordure de Garonne. Le site principal se trouve dans ledépartement du Tarn-et-Garonne, sur la commune de Monbéqui, à unecinquantaine de kilomètres en aval de Toulouse. À l'intérieur d'un périmètred'environ 3,5 hectares, les peupliers se répartissent principalement sur unbanc de galets qui s'étend sur environ 900 mètres de la berge Sud vers laberge Nord et, à un degré moindre, sur une zone périphérique, qualifiée deberge, située entre le banc de galets et des peupleraies cultivées. Nous avonsanalysé la mycorhization du peuplier le long d'une chronoséquence, du stadeplantule le long de la rivière jusqu'au stade sénescent sur la berge. Nousavons réalisé notre échantillonnage dans 4 zones (A, B, C et D) représentativesdes différents stades de succession en nous basant sur l'âge des différentescohortes, celles-ci étant distribuées selon un gradient de perturbationshydrologiques (tableau I). Le deuxième site se trouve sur la commune dePortet-sur-Garonne à une dizaine de kilomètres en amont de Toulouse. Nosprélèvements ont été réalisés sur des peupliers juvéniles (2 à 10 ans selonnos estimations) localisés sur un banc de galets près de la rivière, et sur desarbres sénescents situés sur la berge.456

Les champignons mycorhiziens du peuplier noirTableau I : Principales caractéristiques des zones d'échantillonnage sur le site deMonbéqui à proximité de la Garonne.ZonesType de milieuFréquence des crues aucours d'un cycle annuelÂge approximatif despeupliers (en 1997)A banc de galets très élevée < 1 anB banc de galets élevée 2 à 4 ansC banc de galets moyennement élevée 10 à 15 ansD berge rare 25 ans à 50 ans ?2.2. Les sites d'échantillonnage pour le suivi des populationsNous avons récolté et cartographié 74 carpophores de T. scalpturatum (61en 1998, 13 en 1999) et 24 de T. populinum en 1998 sur la zone C de Monbéqui,c'est-à-dire sous une cohorte de peupliers d'une dizaine d'années ; l'aireéchantillonnée est d'environ 200 m 2 . À titre de comparaison, en 2000, nousavons également récolté et cartographié 296 carpophores de T. scalpturatum et95 de T. populinum sur un deuxième site de la proche banlieue toulousaine, àMontaudran. L'aire d'échantillonnage définie sur ce site est de 250 m 2 ; il s’agitd’une pelouse herbeuse bordée sur deux côtés par une haie artificielle de peupliersnoirs d'une trentaine d'années. Cet habitat n'est donc pas soumis auxfortes fluctuations hydrologiques caractéristiques du site de Monbéqui.2.3. Détermination du statut mycorhizien et quantification de lacolonisationNous avons recensé la présence (+) ou l’absence (-) d’endo- et d’ectomycorhizessur des échantillons de racines prélevées au hasard dans les 4zones de Monbéqui, au cours de 3 années successives. Pour quantifier lacolonisation des endomycorhizes à arbuscules (AM), nous avons utilisé laméthode classique de Kormanick et MacGraw [8] après coloration des racinesau bleu trypan [14]. Nous avons également dénombré toutes les structuresfongiques (hyphes, vésicules, arbuscules et spores intraracinaires) présentesdans 50 cm de racines d’un diamètre inférieur à 1 mm. Pour les ectomycorhizes,la quantification a été effectuée selon la méthode de Giovannetti etMosse [5] sur des échantillons de racines de diamètre inférieur à 1,5 mm,pour une longueur racinaire totale de 2,5 à 3,5 m. Sous la loupe binoculaire,nous avons noté la présence ou l'absence d'ectomycorhizes à chaque intersectiond'une racine avec le quadrillage d'une boîte de Pétri.2.4. Échantillonnage des ectomycorhizes et identificationtaxonomique des espèces fongiques par typage de l'ITSNous avons prélevé au hasard des racines provenant de 3 à 10 arbres, aucours de 3 années successives à Monbéqui et lors du printemps 1999 à Portet457

M. Gardes et al.(tableau II). Une centaine de mycorhizes étaient récoltées pour chaque arbre ;un sous-échantillon de 20 à 100 soumises à l'amplification PCR. Les donnéesgénétiques recueillies pour l'ensemble des arbres et années sont de 937 mycorhizesà Monbéqui et de 114 à Portet-sur-Garonne. Pour l'identification destaxa, nous avons amplifié par PCR la région intergénique transcrite de l'unitéribosomale nucléaire du symbionte fongique à l'aide d'amorces « spécifiques »des champignons [4]. L'analyse du produit amplifié a été réalisée en deux étapes.La première consistait à examiner le polymorphisme dans la longueur desfragments de restriction pour 2 à 4 enzymes et à regrouper les symbiontesmycorhiziens présentant des profils similaires. Cette analyse, ITS-RFLP, permetune séparation rapide et relativement fiable des espèces de champignonsectomycorhiziens [3],[4]. En effet, de nombreux travaux ont mis en évidenceune conservation des séquences à l'intérieur des espèces taxonomiques définiesselon des critères classiques et, parallèlement, une forte divergence entreles espèces [7]. Dans une deuxième étape, nous avons séquençé l'ITS desprincipaux groupes RFLP afin de préciser l'appartenance taxonomique dusymbionte par comparaison avec des bases de données existantes (« Blastsearch »).Tableau II : Diversité des communautés ectomycorhiziennes du peuplier en fonctiondu site, de l'habitat et des années. Chaque taxa correspond à un groupe électrophorétiquedéfini par les profils de restriction de la région ribosomale nucléaire(ITS-RFLP) pour 2 à 4 enzymes. Sur le site de Monbéqui, les mycorhizes analyséesproviennent de : i) 13 arbres pour la zone B et la zone C et ii) 9 arbres pour la zoneB, toutes années confondues. Sur le site de Portet-sur-Garonne, la diversité dessymbiontes a été analysée sur 6 arbres, dont 3 localisés sur un banc de galets près dela rivière et 3 sur la berge.Nb. total de taxa Nb. moyen de taxa par arbre1998 1999 2000 1998 1999 2000MonbéquiGalet zone B - - 20 - - 2,2Galet zone C 37 19 42 3,7 6,3 7Berge zone D 41 15 17 4,1 5,0 4,3Portet-sur-GaronneGalets - 14 - - 4,7 -Berge - 13 - - 4,3 -2.5. Caractérisation génétique des individus de tricholomes etanalyse des donnéesUne caractérisation génétique des isolats a été réalisée à l'aide de marqueursRAPD. Vingt-deux amorces ont initialement été testées sur un souséchantillonde carpophores (tableau III). Celles qui ont fourni des fragments458

Les champignons mycorhiziens du peuplier noirbien définis et polymorphes ont été retenues pour la suite de l'analyse : 6pour T. populinum et 7 pour T. scalpturatum. Les profils RAPD ont été établisen terme de présence-absence des fragments amplifiés. Seuls les fragmentsreproductibles (plusieurs amplifications PCR d’un même extrait d’ADN surplusieurs gels) ont été retenus. Une matrice de comparaison deux à deux desisolats de chaque espèce a été établie en calculant pour chaque paire d'isolatsl'indice de similarité classiquement utilisé de Nei et Li [13] : SI = 2Nxy/(Nx+ Ny) (1) où Nxy correspond au nombre de fragments communs à x et y et,Nx et Ny le nombre de fragments présents respectivement chez x et chez y.Les carpophores présentant les mêmes profils RAPD ont été traités commeappartenant à un même génet. Une estimation de la diversité génique a étéeffectuée pour chaque population par le calcul de l'indice de Shannon [16]sur les fréquences alléliques estimées à chaque locus de chaque génet. Uneanalyse PCR/RFLP de la portion IGS2 de l'espaceur intergénique de l'ADNribosomique nucléaire a également été réalisée sur la population de T. scalpturatumde Monbéqui.Tableau III : Principales caractéristiques des populations de T. populinum etT. scalpturatum : i) sur le site fortement perturbé par les crues de Monbéqui et ii) surle site peu perturbé de Montaudran.MonbéquiMontaudranTricholomaTricholoma TricholomaTricholoma scalpturatumpopulinumpopulinum scalpturatum1998 1998 1999 2000 2000Nb. de carpophoresrécoltés24 61 13 95 296Nb. de carpophoresanalysés24 58 12 44 62Nb. de génets 7 56 10 2 12Nb. de carpophores pargénet1 - 18 1 - 3 1 - 2 13 - 31 1 - 27Nb. moyen de carpophorespar génet3,4 1,1 1,1 22 5,2D. max a 1,8 m 0,35 m 0,06 m 13 m 9,2 ma : Distance maximale entre 2 carpophores appartenant au même génet.3. RÉSULTATS3.1. Dynamique spatio-temporelle des types mycorhiziens sur lesite de MonbéquiAu cours des 2 premières années, les peupliers étaient : i) non mycorhizésdans la zone A (à l'exception de 2 plantules (sur dix) récoltées la deuxième annéeet qui avaient quelques hyphes et vésicules), ii) endomycorhizés dans la zone Bet iii) doublement mycorhizés (endo- et ectomycorhizes sur un même système459

M. Gardes et al.racinaire) dans les zones C et D (figure 1). D'importants changements dans lamycorhization ont donc été mis en évidence le long de la chronoséquence, de larivière vers la berge. D'autre part, les taux de colonisation endomycorhizienneétaient significativement plus faibles dans la zone B (fortes perturbations) encomparaison de la zone D (faibles perturbations), quelle que soit la saison oul'année de prélèvement (figure 1 A). Parallèlement à cette diminution, on a observéune augmentation de la colonisation ectomycorhizienne de la zone C versla zone D (figure 1 B).Figure 1 : Comparaison des taux moyens de colonisation endomycorhizienne (A) etectomycorhizienne (B) du peuplier noir sur le site de Monbéqui. Les arbres échantillonnésétaient distribués dans des zones représentatives des différents niveaux deperturbations hydrologiques. Dix arbres par zone ont été échantillonnés en 97 et 98.Finalement, les taux d’endomycorhization étaient les plus forts en automne.Ces résultats s’expliquaient en partie par une forte abondance desvésicules de réserve chez les champignons. De nouvelles modifications dans lamycorhization sont apparues au cours de la troisième année. Ainsi, des hypheset quelques arbuscules et vésicules ont été observées sur 73 % des plantulesrécoltées dans la zone A, sur un terrain en voie de stabilisation à la suite d'unemodification du chenal de la rivière. Nous avons également observé des ec-460

Les champignons mycorhiziens du peuplier noirtomycorhizes sur quelques peupliers de la zone B ; un sous-échantillon a étésoumis à l'analyse moléculaire. Tous ces résultats mettent en évidence unedynamique rapide de la mycorhization du peuplier noir en milieu riverain etun fort impact des conditions environnementales sur ce processus.3.2. Dynamique spatio-temporelle des communautés dechampignons ectomycorhiziensIl existe une dynamique complexe des types mycorhiziens. Qu’en est-il desespèces ? Les résultats de l'analyse moléculaire sur les symbiontes ectomycorhizienssont présentés dans le tableau II et la figure 2.Figure 2 : Distribution et abondance des taxa de champigons ectomycorhiziensdans un peuplement de peuplier noir sur le site de Monbéqui en fonction de lalocalisation des arbres (zone B, C ou D) et de l'âge des cohortes. La séparation destaxa repose sur une analyse des profils de restriction dans la région intergéniquetranscrite (ITS-RFLP), et leur identification taxonomique sur la similarité de séquencesITS avec les bases de données existantes («Blast search»). Les mycorhizesproviennent de 13 arbres différents pour la zone C et la zone D et de 9 arbres pourla zone B. Au total, 974 ectomycorhizes ont été analysées.Ils font apparaître : i) une richesse en taxa du même ordre de grandeur surles 2 habitats, banc de galets et berge quel que soit le site ; ii) la dominance dequelques espèces et la présence de nombreuses espèces rares dans les 2 communautés; iii) la forte représentation d'une flore fongique présentant des caractèrespionniers : c'est le cas par exemple des genres Tomentella, Thelephora etHebeloma. Ces basidiomycètes se retrouvent sur 2 sites au moins (Monbéqui et461

M. Gardes et al.Portet) et sont présents aussi bien sur le banc de galets que sur la berge ; iv) laprésence de nombreux ascomycètes à fructification hypogée, par exemple legenre Tuber (truffe). Ces taxa sont particulièrement abondants sur le site deMonbéqui, souvent dans les zones les plus perturbées3.3. Structuration et dynamique spatio-temporelle des populationsde deux espèces de tricholomesLes tableaux III et IV résument les principaux résultats de l'analyse génétiquedes fructifications de tricholomes récoltées sur 2 sites éloignés géographiquement.L'espèce généraliste, T. scalpturatum, montre une diversité plusgrande que l'espèce spécialisée ; cette tendance se confirme sur les 2 sites, l’unperturbé et l’autre non perturbé par les crues. Les génets de T. scalpturatumsont généralement de petite taille. Au contraire, chez T. populinum on note laprésence de plusieurs génets pérennes, parfois de grande taille (par exempleun génet représenté par 31 carpophores dispersés sur 40 m 2 à Montaudran).Tableau IV : Paramètres génétiques des populations de T. populinum et T. scalpturatumsur les sites de Monbéqui et de Montaudran.Similarité entre lesgénets aT. populinum T. scalpturatumMonbéqui Montaudran Monbéqui Montaudran1998 2000 1998 1999 200077 - 97 % 85 % 51 - 99 % 62 - 99 % 20 - 86 %(1998/1999 : 52 - 99 %)Diversité génique b 0,27 (± 0,29) 0,13 (± 0,25) 0,20 (± 0,25) 0,19 (± 0,26) 0,38 (± 0,24)a : Indice de similarité de Nei et Li (1979).b : Indice de Shannon (Shannon & Weaver, 1949).Ces résultats soulignent l'importance de la reproduction végétative parcroissance mycélienne dans la structuration des populations de cette espèce.Le suivi temporel réalisé sur la population de T. scalpturatum à Monbéqui a misen évidence la présence de nouveaux génets par le biais de la reproductionsexuée, avec peu ou pas de recrutement extérieur au site (tableau IV). Finalement,les populations des 2 espèces sont structurées par les conditions environnementales.En effet, pour les deux espèces, l'absence de perturbationsfortes se traduit par une diminution de la colonisation par spores méiotiquesau profit de la croissance végétative. Les génets des 2 espèces occupent généralementdes surfaces très restreintes sur le site sous fortes contraintes abiotiques(i.e. Monbéqui). Mais de façon générale, ils sont de grande taille sur le sitede Montaudran (i.e. non perturbé par les crues).462

4. DISCUSSIONLes champignons mycorhiziens du peuplier noirNos résultats ont montré l'existence d'une dynamique complexe des typesmycorhiziens (endomycorhizes à vésicules et arbuscules et ectomycorhizes)du peuplier noir à une échelle locale dans un milieu soumis à de fortescontraintes abiotiques. Des variations similaires dans la proportion des typesmycorhiziens ont également été décrites chez d'autres espèces d'arbres ouarbustes [10], [11], [18]. De façon générale, chez le peuplier noir, les endomycorhizesprédominent dans les jeunes peuplements sur des sols fortementà moyennement perturbés mais leur abondance sur le système racinaire d'unmême arbre diminue rapidement au profit des ectomycorhizes. Ces variationssont à mettre en relation avec le niveau de perturbation du milieuet/ou le stade de développement de leur hôte et du peuplement. Des interactionspositives ou négatives entre les types trophiques (endo- ou ecto)sont également à envisager pour expliquer cette dynamique. Une connaissanceplus approfondie de l'évolution spatio-temporelle de ces types mycorhizienspar des approches expérimentales et descriptives à des échelles plusfines semble cependant nécessaire afin de comprendre comment ces différentsfacteurs interagissent pour définir ces équilibres. Il conviendrait parailleurs de préciser le rôle respectif de chaque type dans la nutrition du peuplierafin de quantifier le niveau d'adaptation locale de ces différentes relationsmutualistes et d'autre part, d'évaluer l'importance de cette diversitédans le fonctionnement et la stabilité des ripisylves.L'analyse des communautés a révélé une stabilité de la richesse globale, dubanc de galets vers la berge. Elle est comparable à celle observée dans d’autresécosystèmes forestiers [2], [7]. D'autre part, de nombreux taxa ectomycorhiziensdominants ou intermédiaires sont présents dans les deux peuplementsde peuplier sur le banc de galets (zone C) et sur la berge (zone D) ; les taxaspécifiques à chaque peuplement sont dans la plupart des cas des taxa rares àl’échelle du site. L’identification taxonomique par séquençage de plusieursespèces dominantes sur le site de Monbéqui a montré qu’elles appartiennenttoutes à des genres à vocation pionnière. Selon les données de la littérature, leschampignons « pionniers » auraient plutôt des stratégies écologiques de type ret seraient généralement peu spécifiques envers les espèces de plantes [6], [17].Il est probable que l'écosystème riverain dans son ensemble soit trop instablepour qu’une mycoflore à vocation tardive puisse s’y établir durablement. Finalement,nous avons mis en évidence une forte représentation de champignonshypogés du genre Tuber sur le site de Monbéqui. Ainsi une espèce dominait lacommunauté (en terme de fréquence des mycorhizes) sur les 2 habitats, bancde galets et berge. Elle a envahi rapidement et efficacement les peuplementsjeunes sur des zones soumises à de fortes fluctuations hydrologiques (zones Bet C). L'abondance des champignons hypogés sur ce site et leur propagationrapide suggèrent l'existence de mécanismes adaptatifs particuliers (peut-être463

M. Gardes et al.liés à des possibilités de conservation et de dissémination des organes de fructification)permettant d'accroître les capacités de résistance ou de tolérance deces espèces vis-à-vis des perturbations.Par leur manque de mobilité et leur fixation au sol, les champignons mycorhizienssont étroitement soumis aux conditions environnementales localesdans lesquelles se déroule leur croissance. Sur la base de marqueurs RAPDs,du polymorphisme dans la longueur des fragments de restriction dans l'espaceurintergénique ribosomal (IGS) et d'une approche comparative sur 2 espècesde tricholomes, nous avons révélé une évolution vers la propagation clonaleliée au niveau de spécialisation des espèces et à la stabilisation du milieu.La taille des génets est plus faible pour les deux espèces sur le site fortementperturbé par les crues. Toutefois, bien que le nombre de génets soit plus élevésur ce site, la diversité génétique apparaît beaucoup plus faible. Les nouveauxgénotypes qui apparaissent par le biais de la reproduction sexuée semblenttous issus d'une recombinaison des génotypes locaux, sans apport extérieur.Le renouvellement de la diversité dans le milieu riverain apparaît donc limitépour ces 2 espèces de champignons. Finalement, les génotypes produisant desphénotypes intéressants pour une raison ou une autre sont fixés par propagationclonale chez l'espèce à mutualisme étroit ; cette tendance est particulièrementaccentuée sur le site non perturbé. En conclusion, le milieu changeant(i.e. la ripisylve) dans lequel vivent et évoluent les populations de ces 2 espècesde champignons a un fort impact sur la structuration génétique des populations.Cette approche populationnelle demande cependant à être développée àdes échelles plus larges et sur d'autres espèces afin de prédire et de gérer lesconséquences écologiques et génétiques, de forts changements écologiquesdes ripisylves et d'érosion de la diversité biologique.5. CONCLUSIONLe peuplier noir est un vecteur de diversité pour les ripisylves : les assemblagesfongiques qui lui sont directement associés sont extrêment diversifiésà différents niveaux d'organisation. Il constitue un réservoir d'inoculumfongique pour toutes les espèces végétales mycotrophes susceptibles dese développer dans ce milieu, des herbacées endomycorhiziennes aux ligneuxplutôt ectomycorhiziens (par exemple le saule, l'aulne, le frêne). Nousavons montré que cette espèce est susceptible de s'ajuster aux variations dumilieu par l'intermédiaire de ses partenaires fongiques en jouant sur i) ladiversité des types mycorhiziens et ii) les caractéristiques biologiques desnombreuses espèces fongiques qu'il contribue à entretenir. La réponse decette mycoflore mycorhizienne face aux modifications de l'environnementse situe sur des échelles de temps très courtes, traduisant ainsi une plasticitéélevée du système symbiotique peuplier-champignons dans un habitat sou-464

Les champignons mycorhiziens du peuplier noirmis à de fortes contraintes abiotiques. En résumé, nous pensons que l'introductionde cette essence dans des programmes de conservation et de restaurationdes ripisylves devrait significativement contribuer au maintien de ladiversité végétale et microbienne dans cet écosystème.REMERCIEMENTSNous remercions Dimitri Barthet, Maxime Galan et Catherine Lafittepour leur aide technique, les lecteurs pour leurs remarques. Le travail présentédans ce manuscrit a été soutenu financièrement par le Bureau desRessources Génétiques et le Centre National de la Recherche Scientifique.RÉFÉRENCES[1] Cagelli L., Lefèvre F., Conservation of Populus nigra and gene flow with cultivatedpoplars in Europe, For. Genet. 2 (1995) 135-144.[2] Gardes M., Bruns T.D., Community structure of ectomycorrhizal fungi in aPinus muricata forest: above- and below-ground views, Can. J. Bot. 74 (1996)1572-1583.[3] Gardes M. & Bruns T.D., ITS-RFLP matching for the identification of fungi. in:Clapp JP.(éd.), Methods in Molecular Biology: Species Diagnostics Protocols:PCR and Other Nucleic Acid Methods. Totawa: Humana Press Inc., 1996, pp.177-192.[4] Gardes M., Bruns T.D., ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes-applicationto the identification of mycorrhizae and rusts, Mol. Ecol. 2(1993) 113-118.[5] Giovanetti M., Mosse B., An evaluating of techniques for measuring vesiculararbuscularmycorrhizal infection in roots, New Phytol. 84 (1980) 489-500.[6] Guinberteau J, Courtecuisse R., Diversité des champignons (surtout mycorhiziens)dans les écosystèmes forestiers actuels, in: Le Tacon F. (éd), Champignonset mycorhizes en forêt, Revue Forestière Française, 1997, pp. 25-39.[7] Horton T.R., Bruns T.D., The molecular revolution in ectomycorrhizal ecology:peeking into the black-box, Mol. Ecol. 10 (2001) 1855-1871.[8] Kormanik P.P. & McGraw A.C., Quantification of vesicular-arbuscular mycorrhizaein plant roots. in Schenck N.C. (éd.), Methods and principles of mycorrhizalresearch, The American Phytopathological Society, St Paul Minnesota,1984, pp. 37-45.[9] Lefèvre F, Legionnet A., Valadon A., Villar M., Programme national de conservationde Populus nigra, Commission Technique Nationale de Conservation desRessources Génétiques Forestières, 2 Mai 1996, 10 p.[10] Lodge D.J., Negative associations among VA-mycorrhizal fungi and some ectomycorrhizalfungi inhabiting the same root system, Oikos 57 (1990) 347-356.[11] Lopez Aguillon R., Garbaye J., Some aspects of a double symbiosis with ectomycorrhizaland VAM fungi, Agricul. Ecosyst. 29 (1990) 263-266.465

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