écologie des virus influenza aviaires en Camargue - IRD

UNIVERSITÉ MONTPELLIER IISCIENCES ET TECHNIQUES DU LANGUEDOCTHESEpour obtenir le grade deDocteur de l'Université Montpellier IIDiscipline: Biologie de l'Évolution et Écologie.École doctorale: Systèmes Intégrés en Biologie, Agronomie,Géosciences, Hydrosciences, Environnement.MALADIES INFECTIEUSES ET ÉCOSYSTÈMES:ÉCOLOGIE DES VIRUS INFLUENZA AVIAIRES EN CAMARGUEparCamille LebarbenchonSoutenue publiquement le 30 octobre 2008 devant le jury composé de:Björn Olsen, Professeur, Université d'Uppsala, UppsalaHervé Fritz, Chargé de Recherche, CNRS, LyonFrank D'Amico, Maître de conférence, Université de Pau et des Pays de l'Adour, PauFrédéric Thomas, Directeur de Recherche, CNRS, MontpellierMichel Gauthier­Clerc, Chargé de Recherche, Tour du Valat, ArlesSerge Morand, Directeur de Recherche, CNRS, MontpellierRapporteurRapporteurExaminateurDirecteurDirecteurPrésident

UNIVERSITÉ MONTPELLIER IISCIENCES ET TECHNIQUES DU LANGUEDOCTHESEpour obtenir le grade deDocteur de l'Université Montpellier IIDiscipline: Biologie de l'Évolution et Écologie.École doctorale: Systèmes Intégrés en Biologie, Agronomie,Géosciences, Hydrosciences, Environnement.MALADIES INFECTIEUSES ET ÉCOSYSTÈMES:ÉCOLOGIE DES VIRUS INFLUENZA AVIAIRES EN CAMARGUEparCamille LebarbenchonSoutenue publiquement le 30 octobre 2008 devant le jury composé de:Björn Olsen, Professeur, Université d'Uppsala, UppsalaHervé Fritz, Chargé de Recherche, CNRS, LyonFrank D'Amico, Maître de conférence, Université de Pau et des Pays de l'Adour, PauFrédéric Thomas, Directeur de Recherche, CNRS, MontpellierMichel Gauthier­Clerc, Chargé de Recherche, Tour du Valat, ArlesSerge Morand, Directeur de Recherche, CNRS, MontpellierRapporteurRapporteurExaminateurDirecteurDirecteurPrésident

RemerciementsCette thèse est le fruit de trois années de travail réalisées entre Montpellier, la Camargue et Paris. Des captures decanards aux longues journées de laboratoire, des réunions scientifiques à la vulgarisation « grand public », j'ai eul'opportunité de rencontrer une riche diversité d'acteurs, tous intéressés par la « grippe aviaire ». Je souhaite iciprésenter mes remerciements à toutes les personnes avec qui j'ai pu échanger et apprendre, bien entendu sur denombreux aspects scientifiques mais également humains.Fred, je tiens à t'exprimer mes plus sincères remerciements pour m'avoir donné l'opportunité de travailler àtes cotés. Il y a quatre ans tu m'as tendu la main à une période de mes études extrêmement incertaine, je t'en seraiéternellement reconnaissant. Merci également pour t'être tant investi dans mon projet de thèse et dans la recherched'un financement. Tu as une manière de transmettre ta passion et ton énergie absolument sans égal. Ton dynamisme etta capacité de travail continuent de m'impressionner et ont sans aucun doute été source de motivation tout au long deces années.Michel, merci d'avoir accepté de m'encadrer. Tu m'as accordé ta confiance dès le début de ma thèse, que cesoit en mettant en avant mon travail ou en me demandant de te représenter lors de réunions, j'en suis très honoré.Merci de m'avoir ouvert les portes de l'univers « véto – zoonoses – conservation » que je connaissais très peujusqu'alors. Nos discussions sur le monde de la recherche et les différentes manières de voir et appréhender le travailde chercheur ont été extrêmement enrichissantes.C'était une très grande chance d'être encadré par deux chercheurs d'une telle qualité scientifique et humaine.J'ai évolué dans un environnement de travail extrêmement favorable à mon épanouissement scientifique. Fred,Michel, je souhaite vous exprimer ici ma plus profonde reconnaissance.Je remercie les membres du jury pour m'avoir fait l'honneur de critiquer mon travail. Merci à Hervé Fritz etBjörn Olsen pour avoir accepté d'être rapporteur de ma thèse. « Jag vill rikta ett särskilt tack till Björn Olsen som förett år sedan accepterade att medverka vid min disputation, och som har rest ända från Sverige för att komma hit ! »(I hope the sentence is good). Merci également à Serge Morand et Frank D'Amico pour avoir accepté de faire partiede mon jury. Frank, c'est sans aucun doute grâce à tes cours, il y a 6 ans, que j'ai décidé de m'orienter vers l'écologieévolutive et de quitter la côte Basque pour l'université de Montpellier. Je ne regrette pas ce choix aujourd'hui, tu as étéde très bon conseil !Je remercie également les membres de mon comité de thèse: Thierry Boulinier, Christine Chevillon etFrançois Mesléard, pour leurs précieuses remarques et nombreux conseils.J'exprime une profonde reconnaissance à François Renaud pour avoir suivi, valorisé, et s'être investi dansmon travail de thèse depuis son commencement. Un grand merci pour ta confiance et ton écoute, pour m'avoirproposé de participer au workshop à Hanoï, et pour tous tes bons conseils. Les échanges que nous avons eu ont tousété très enrichissants et j'espère avoir la chance de les entretenir dans le futur.Il y a quatre ans, Robert Barbault, Jacques Blondel, Jean­Dominique Lebreton, Francois Renaud etMichel Tibayrenc, ont apporté leur soutien à mon projet de thèse. Je leur exprime ici toute ma gratitude.Je remercie très sincèrement Sam Brown, Chris Feare, Jean­François Guégan et Robert Poulin pour avoiraccepté de contribuer à la rédaction et la publication d'articles présents dans cette thèse.Pour m'avoir chaleureusement ouvert les portes de leurs marais de chasse et de leurs foyers, je souhaiteégalement témoigner mes remerciements à Messieurs R. Coeur, J­N. Cordesse, R. De Fabritis, A. Gil, B. Gori,J­F. Herbinger et M. Rayssac.Ces trois années de thèse ont été financées conjointement par la Région Languedoc­Roussillon et le Centre

Remerciementsde Recherche de la Tour du Valat. Je remercie ces deux structures pour m'avoir accordé le soutien financier nécessaireà la réalisation de ce travail.Un très grand merci à l'ensemble du personnel de l'unité de Génétique et Évolution des Maladies Infectieuses àMontpellier. Merci à tous pour votre accueil chaleureux et pour la bonne ambiance que vous savez maintenir au seindu labo. Je remercie en particulier les membres passés et actuels de l'équipe Organismes Parasitiquement Modifiés.Merci à David Biron, Fleur Ponton, David Duneau (alias Félix), Marta Sanchez et Dorothée Missé.Merci à Audrey et Nadine pour leur patience et gentillesse exemplaires face à mes déboires avec lesmultiples formalités administratives nécessaires au bon déroulement des missions et à mon incompétence face àl'utilisation d'un fax !Benjamin, ce fut un plaisir de travailler avec toi. Tu as finalement quasiment réussi à me donner envie defaire de la modélisation ! J'espère que l'on pourra continuer à travailler ensemble dans les années à venir. Noséchanges ont vraiment été très enrichissants (même au squash). Un grand merci à Eric Elguéro pour m'avoir initié àl'art des GLM sous R ! Marco, je te remercie d'avoir pris le temps de me faire visiter et me faire une excellentepublicité de la vie à Athens. Je vais partir serein grâce à toi !Merci aux potes de bureau, la bande des Biomans: Cyril, Julien, Céline et Thierry. Céline, ce fut un plaisirde partager cet espace avec toi. Bien entendu, un grand merci pour les bons cafés (accompagnés de pains au chocolattout chauds) et pour avoir supporté pendant de longs mois nos remarques et discussions de mâles avec « force bleue ».Mais, bien au delà, je te remercie très sincèrement pour ton extrême gentillesse et pour l'amitié que tu me témoignetous les jours (et t'inquiète pas, on va le retrouver ton chat !).Un remerciement particulier à Nil pour m'avoir sorti de mes déboires de dernière minute avec mes fichierspdf, ainsi qu'à Phil et Andrew pour avoir accepté de relire et corriger mon anglais.J'ai une pensée très amicale aux organisateurs des « troisièmes rencontres écologie et comportement ».Organiser ce congrès avec vous aura été une expérience vraiment enrichissante (et finalement réussie !). Un grandmerci à Adèle, Alex (moustique), Alex (criquet), Alexandra, Bertrand, Florent, Julie, Philippe et Thierry.La performance des « viens prendre ta volley gamin » au dernier tournoi de volley d'Agropolis est sansaucun doute à relier à la sportivité exemplaire et aux entraînements assidus de mes coéquipiers: Lise, Mallo, Sylvie,Anne, Franck, Cédric et Thierry (quoi qu'un peu moins assidu). Merci à tous pour ces bons moments passésensemble.Enfin je terminerai avec mon bon « Jacques » (cf. le grand détournement). Depuis notre voyage de noces àRennes il y a presque 4 ans, j'ai toujours apprécié ton positivisme à toute épreuve, l'énergie que tu transmets, tonregard critique sur la science mais également ta franchise, la confiance que l'on a pu avoir l'un envers l'autre ainsi quetes qualités de joueur de foot sur console (que je n'égale pas). Thierry, c'était une chance formidable de réaliser mathèse en même temps que toi. Nos discussions furent toutes enrichissantes qu'il s'agisse de biologie de l'évolution oud'aspects plus personnels. Cette thèse m'aura donné l'opportunité de côtoyer le brillant étudiant et futur chercheur quetu es mais également de rencontrer un très précieux ami.

RemerciementsJe remercie Jean­Paul Taris et Jean Jalbert ainsi que Patrick Grillas et Jean­Jacques Bravais pour m'avoir donné lapossibilité de travailler à la Tour du Valat. Un grand merci à tous le personnel de la station pour votre accueil et pourles divers échanges que j'ai pu avoir avec vous tous. Un remerciement tout particulier à Marie­Antoinette, Mireille etFlorence pour leur gentillesse et leur disponibilité, ainsi qu'à Sarah pour ses nombreuses relectures des manuscrits etprésentations en anglais.Il y a trois ans, mes connaissances en ornithologie étaient extrêmement limitées. Je dois à Yves Kayser toutce que j'ai acquis dans ce domaine. Merci de m'avoir rapidement fait confiance sur le terrain et enseigné l'art dubaguage ! C'est avec toute mon amitié que je te présente ces remerciements. J'espère très sincèrement que l'on resteraen contact et, qui sait, que tu passeras par les USA me montrer quelques piafs biens cachés !?Pour leur aide sur le terrain je remercie également Antoine Arnaud, Manuel Ballesteros, Pierre­ChristianBeaubrun, Thomas Blanchon, Anne­Laure Brochet, Jonathan Fuster, Patrick Mayet, Philippe Peret, Christophe Pin etNicolas Sadoul.Merci à Muriel Dietrich et Frédéric Albespy. Mes deux premières expériences de (co­) encadrementd'étudiants auront été particulièrement agréables et facile à réaliser grâce à votre sérieux et votre excellent travail !Après les journées de travail, il y a les soirées et la vie trépidante des stagiaires de la Tour du Valat. Une listede noms serait trop longue étant donné le nombre d'étudiants que j'ai pu côtoyer tout au long de ces trois années alorsje vous remercie TOUS pour avoir su animer chaleureusement repas et soirées, vous êtes sans aucun doute le cœur dela vie de cette station ! Je souhaite témoigner mon amitié et une reconnaissance toute particulière à Alexandros(malaka), Manuel et Emilien (stars du TdV FC), Leire, Sylvie, Kévin (le muge), Lucie, Renan, Marie (Muguette),Marta, Ali (direct !), Marco, Camille (et les lancés de verres), Mathieu, Thomas et Audrey.Je remercie très chaleureusement Sylvie van der Werf pour m'avoir accueillie dans l'unité de Génétique Moléculairedes Virus Respiratoires à l'Institut Pasteur de Paris, et toute l'équipe du CNR pour son investissement dans l'analysedes échantillons. Je souhaite ici apporter toute ma reconnaissance à Vincent Enouf, Saliha Azebi, FrédériqueCuvelier, Vanessa Roca et Sébastien Le Gal. Un remerciement particulier à Patricia Jeannin pour sa patience et lasympathie qu'elle a su me dévouer lors de ma première venue dans l'unité, puis tout au long des missions qui ontsuivies. Enfin, je porte une mention spéciale à Christophe Batéjat (de la CIBU) pour m'avoir sorti, avec toujoursautant de disponibilité et de bonne humeur, de mes multiples déboires avec l'extracteur automatique !Concernant les analyses en laboratoire, je dois l'avancée et la qualité de ce travail à Chung­Ming Chang etViviane Grandhomme. Chung­Ming, avoir travaillé à tes cotés m'a beaucoup appris en biologie moléculaire bienentendu, mais aussi sur le plan humain. Toujours positif et enthousiaste, c'était un réel plaisir de travailler avec toi.J'espère que nos carrières nous permettrons de mettre en place de nombreuses collaborations dans le futur !Viviane, je reste impressionné par ton organisation, ton efficacité, et la bonne humeur que tu transmets quoiqu'il arrive dans ton travail. Même si mes venues à Pasteur se sont faites plus rares depuis ton arrivée, j'appréciesincèrement ton professionnalisme et je suis extrêmement reconnaissant de la clarté que tu t'es attachée à mettre danschacun de nos échanges.Mes nombreuses venues dans la capitale se sont également organisées autour des disponibilités denombreuses personnes qui me sont toutes très chères et m'ont proposé de me loger dans des conditions très variablesmais toujours chaleureuses. Je porte ici une très grande reconnaissance à Philippe, Tim (et ses colloc'), Florian, Tiina,

RemerciementsJean­Paul et Anne. Merci à vous tous, vous avez grandement facilité et égayé ma vie Parisienne !Enfin, je souhaite remercier les chercheurs et étudiants qui m'ont permis d'arriver à ce niveau d'étude de par leursaides, conseils, sympathies ou simplement à travers le partage d'une passion.Je remercie Gérard Metge, Directeur de l'ex­DEUST Gestion des Espaces Naturels (UniversitéAix­Marseille III), pour la sympathie et la confiance qu'il accorde à ses étudiants. Cette année d'étude aura sansaucun doute été l'une des plus riches sur le plan scientifique mais également humain. Merci à Michel Magot(IBEAS – Université de Pau et des Pays de l'Adour) pour m'avoir donné l'opportunité de réaliser mon premier stagedans un laboratoire de biologie moléculaire, à une période où mes connaissances dans le domaine étaient trèslimitées. Je remercie Claudine Montgelard (EPHE – Montpellier) pour m'avoir accordé sa confiance et permis decontinuer tant bien que mal à faire de la recherche pendant ma difficile année de transition entre la maîtrise et leDEA. Enfin un grand merci à Marie­Ka Tilak (ISEM – Montpellier) pour le dynamisme et les encouragements qu'ellem'a transmis à cette même période, et la sympathie qu'elle m'a toujours témoignée.Un très grand merci à tous ceux avec qui j'ai partagé travail et vie personnelle au cours de ces 9 dernièresannées: Benjamin (le meilleur DJ de Puyvert – 84), Vicky, Nico (pour les sessions snowboard), Mari(ms)e (et dédéle crabe), Séb (quand on change le code, on prévient !), Davy, Odile (et la mémorable dilution du marqueur de taille)et Delphine (pour nos longues discussions sur l'évolution du sexe, chez les parasitoïdes bien entendu...).Je me dois de remercier ouvertement certaines personnes qui ont contribué indirectement, mais pour beaucoup, aubon déroulement de ce travail.Marion, toi qui a été à mes cotés pendant toutes ces années, je te remercie de tout cœur pour m'avoirencouragé, valorisé et apporté l'amour nécessaire à une vie épanouie tout au long de mes études. Tu as toujoursécouté et approuvé mes choix professionnels, parfois au dépend d'autres plus personnels. C'est avec mes sentimentsles plus sincères que je te porte aujourd'hui toute ma reconnaissance.Je souhaite remercier toute ma famille. Votre soutien et vos félicitations m'ont toujours profondémenttouché. Merci à mes parents pour leur confiance. Malgré quelques passages difficiles, vous avez toujours supporté etencouragé mes choix scolaires et universitaires sans jamais les remettre en question. C'est sans aucun doute vous quim'avez inculqué la force de toujours regarder devant, de me relever et de relativiser en cas d'échec. Merci infiniment !Un petit clin d'œil à mon frère: « toi tu fais rien mais tu es intelligent, alors ça compense ! ». Merci pour lesnombreux moments de détentes partagés, pour les sessions de surf et snowboard mémorables, pour ton accueiltoujours chaleureux et tout simplement pour être MON petit frère, le (futur) plus grand réalisateur de cinéma de tousles temps !!!Enfin, c'est sans aucune retenue que j'exprime mes remerciements à Muriel. Bien entendu je te remerciepour tes relectures, tes critiques et bons conseils sur ce manuscrit ainsi que sur bien d'autres aspects de mon travail etchoix professionnels. Pour ton calme, ta confiance et ta patience à toutes épreuves qui sont parvenus à apaiser mesangoisses dans les périodes de doutes. Mais c'est surtout pour mille aspects beaucoup plus personnels que je teremercie du fond de mon cœur, j'ai beaucoup de chance de t'avoir à mes cotés...

SommaireIntroduction. 11. Zoonoses émergentes. 22. Maladies infectieuses et écosystèmes. 43. Virus influenza aviaires en Camargue. 54. Objectifs et questions abordées. 7Chapitre I: Activités humaines, parasitisme et écosystèmes. 91. Activités humaines et évolution des pathogènes. 102. Surpeuplement des espaces protégés et transmission de pathogènes. 10Chapitre II: Influenza aviaires en Camargue. 311. Écologie et évolution des virus influenza aviaires. 311.1. Généralités. 311.2. Hôtes naturels et cycle viral. 311.3. Évolution virale. 331.4. Virus hautement pathogènes. 332. Prévalences d'infections chez les oiseaux sauvages en Camargue. 342.1. Échantillonnage. 352.2. Biologie moléculaire et virologie. 362.3. Analyse statistique. 372.4. Résultats et discussion. 373. Identification des virus circulant. 423.1. Méthodologie. 423.2. Premiers résultats. 434. Les écosystèmes aquatiques: réservoir naturel de virus influenza aviaires ? 44Chapitre III: Émergence du virus H5N1 hautement pathogène. 911. Le virus H5N1 HP chez les oiseaux sauvages. 922. Introduction et circulation du virus H5N1 HP en Camargue. 933. Persistance des virus hautement pathogènes dans les écosystèmes naturels. 94Discussion générale et perspectives. 1451. Écologie des virus influenza aviaires. 1451.1. Dynamique temporelle d'infection. 1451.2. Détection de virus chez les laro­limicoles. 1461.3. Rôle réservoir des écosystèmes aquatiques. 1472. Maladies infectieuses émergentes et écosystèmes. 1482.1. Émergence de virus influenza aviaires et modification des écosystèmes. 1482.2. Activités humaines, maladies infectieuses et écosystèmes. 150Références bibliographiques. 153

Liste des publicationsChapitre I: Activités humaines, parasitisme et écosystèmes.Article 1 (p. 11):Lebarbenchon C., Brown S.P., Poulin R., Gauthier­Clerc M. & Thomas F. 2008. Evolution ofpathogens in a man­made world. Molecular Ecology 17(1): 475­484.Article 2 (p. 23):Lebarbenchon C., Poulin R., Gauthier­Clerc M. & Thomas F. 2006. Parasitologicalconsequences of overcrowding in protected areas. Ecohealth 3(4): 303­307.Chapitre II: Influenza aviaires en Camargue.Article 3 (p. 45):Lebarbenchon C., Chang C­M., van der Werf S., Aubin J­T., Kayser Y., Ballesteros M.,Renaud F., Thomas F. & Gauthier­Clerc M. 2007. Influenza A virus in birds during springmigration in the Camargue, France. Journal of Wildlife Diseases 43(4): 789­793.Article 4 (p. 53):Lebarbenchon C.*, Chang C­M.*, Gauthier­Clerc M., Thomas F., Renaud F. & van der WerfS. 2008. H9N2 avian influenza virus in a Mediterranean gull. Journal of Molecular andGenetic Medicine, Sous­presse.Article 5 (p. 59):Roche B.*, Lebarbenchon C.*, Gauthier­Clerc M., Chang C­M., Thomas F., Renaud F., vander Werf S. & Guégan J­F. Avian influenza dynamics in wild birds are driven by water­bornetransmission. Soumis à Infection, Genetics and Evolution.Chapitre III: Émergence du virus H5N1 hautement pathogène.Article 6 (p. 95):Gauthier­Clerc M., Lebarbenchon C. & Thomas F. 2007. Recent expansion of highlypathogenic avian influenza H5N1: a critical review. Ibis 149(2): 202­214.Article 7 (p. 111):Lebarbenchon C., van der Werf S., Thomas F., Aubin J­T., Azebi S., Cuvelier F., Jeannin P.,Roca V., Chang C­M., Kayser Y., Roche B., Guégan J­F., Renaud F. & Gauthier­Clerc M.2007. Absence of detection of highly pathogenic H5N1 in migratory waterfowl in southernFrance in 2005–2006. Infection, Genetics and Evolution 7(5): 604­608.Article 8 (p. 119):Lebarbenchon C., Feare CJ., Renaud F., Thomas F. & Gauthier­Clerc M. Why highlypathogenic avian influenza viruses do not persist in natural ecosystems. Soumis à BMCInfectious Diseases.* Contribution égale.

Liste des annexesAnnexe 1 (p. 161):Lebarbenchon C., Poulin R. & Thomas F. 2007. Parasitisme, Biodiversité et Biologie de laConservation. In: Ecologie et Evolution des Systèmes Parasités, Thomas F., Renaud F. &Guégan J­F. (editors). De Boeck Université, Bruxelles: Belgium.Annexe 2 (p. 191):Lefèvre T., Lebarbenchon C., Gauthier­Clerc M., Missé D., Poulin R. & Thomas F. Theecological significance of manipulative parasites. Accepté dans Trends in Ecology andEvolution.Annexe 3 (p. 217):Album photos: captures d'oiseaux sauvages et prélèvements biologiques.Annexe 4 (p. 223):Espèces échantillonnées, effectifs et nombre d'individus infectés.

INTRODUCTION

IntroductionIntroduction.En 2008, plus de 6,7 milliards 1 d'êtres humains peuplent la planète, alors qu'il y a seulement300 ans la taille de la population mondiale était presque 10 fois moins importante 2 . Cetteexplosion démographique sans précédent n'est pas sans conséquences et l'homme doit, etdevra, faire face à une contrainte environnementale majeure: la répartition inégale et limitéedes ressources vivantes et fossiles à la surface de la Terre. L'accès et la gestion équitable deressources vitales (alimentaires, énergétiques, etc.) sont des problèmes délicats quiconfrontent, mais se doivent d'intégrer conjointement, des logiques sociales, économiques etenvironnementales.L'homme, à travers ses multiples activités, modifie le fonctionnement naturel desécosystèmes. La destruction d'habitats (e.g. déforestation, incendies, désertification), laperturbation des cycles biologiques et biogéochimiques (e.g. espèces invasives, pollutionschimiques) ou encore la création d'écosystèmes artificiels et contrôlés (e.g. élevage intensif)sont autant d'exemples qui illustrent les répercussions des activités de l'homme sur sonenvironnement. Une liste exhaustive des perturbations des écosystèmes naturels liés auxactivités humaines est complexe à réaliser tant les origines sont diverses et le nombregrandissant.Les conséquences de ces activités sur l'environnement dans lequel nous vivons etévoluons sont donc multiples et de différentes ampleurs. De telles perturbations ne sont pasnouvelles à l'échelle de l'humanité puisque, depuis le développement de l'agriculture il y aenviron 10 000 ans, nous transformons une large diversité d'habitats et domestiquons denombreuses espèces animales et végétales, afin d'augmenter la quantité et la qualité desressources alimentaires. Ce qui est en revanche totalement inédit est l'ampleur de cesperturbations et, devant l'explosion démographique des populations humaines, il estaujourd'hui extrêmement difficile, voire impossible, de prévoir et contrôler ces changementsrapides et globaux.1 2008 World population data sheet, Population Reference Bureau.2 Historical estimates of world population, US Census Bureau.1

Introduction1. Zoonoses émergentes.Dans ce monde changeant, les maladies émergentes (i.e. apparues dans une population pourla première fois, ou ayant existé dans le passé, dont l'incidence augmente rapidement et/ougéographiquement 3 ) sont aujourd'hui particulièrement étudiées et surveillées du fait del'augmentation sans précédent de leur nombre, mais également de leur vitesse et leur échellede dispersion. Qu'ont en commun la fièvre Ébola, la dengue, le SIDA 4 et la grippe aviaireH5N1 ? En plus d'être considérées comme des maladies dont l'incidence sur les populationshumaines est, ou risque d'être, particulièrement aiguë, elles ont toutes une origine animale,sauvage ou domestique (Webster et al. 1998; Wolfe et al. 2007). Il est estimé aujourd'hui que75% des maladies infectieuses émergentes chez l'homme ont une origine zoonotique (Tayloret al. 2001), c'est à dire causées par des agents infectieux pouvant se transmettrenaturellement entre l'homme et d'autres espèces d'animaux vertébrés. Parmi ces agentsinfectieux, 71% s'avèrent provenir d'animaux sauvages (Jones et al. 2008) et, autre pointcommun des maladies précédemment citées, la plupart des pathogènes émergents s'avèrentêtre des virus (Cleaveland et al. 2001; Taylor et al. 2001; Woolhouse et al. 2005; Figure 1).Figure 1. Nombre d'agents infectieux considérés comme émergents (d'aprèsTaylor et al. 2001).3 Organisation Mondiale de la Santé (O.M.S.; http://www.who.int/topics/emerging_diseases/en/).4 Syndrome de l'Immuno­Déficience Acquise.2

IntroductionDe nombreux facteurs favorisent, ou ont favorisé, l'émergence des maladiesinfectieuses au sein des populations humaines. Historiquement, la domestication animale està l'origine de l'augmentation de la diversité et de la gravité de maladies telles que la rougeole,les oreillons, la grippe ou encore la variole (Polgar 1964; Armelagos et al. 1991). Le contactrapproché et prolongé entre populations humaines et animales n'est cependant pas la seulesource d'émergence de maladies zoonotiques. Des facteurs aussi variés que la destructiond'habitats, le transport et commerce d'animaux de compagnie, ou les changementsclimatiques, ont un véritable effet catalyseur sur l'incidence et la répartition de nombreusesmaladies (e.g. Patz et al. 2000; Rogers & Randolph 2000; Chomel et al. 2007; Greger 2007).De manière générale, l'origine de nombreuses zoonoses émergentes est donc à relierdirectement avec les perturbations générées par l'homme sur son environnement naturel(Jones et al. 2008), à plus ou moins grande échelle.La faune sauvage et domestique est également concernée par l'émergence denombreux pathogènes (Daszak et al. 2000; Dobson & Foufopoulos 2001) et, là encore, lephénomène est à rapprocher des activités humaines et leurs impacts sur le fonctionnementnaturel des écosystèmes. Concernant la faune sauvage, l'émergence des maladies peuts'avérer particulièrement problématique en terme de conservation d'espèces protégées et demaintien de la biodiversité (e.g. May 1988; Scott 1988; Harvell et al. 2002). Chez les espècesdomestiques, l'apparition de nouveaux pathogènes peut provenir, directement ouindirectement, d'échanges avec la faune sauvage (e.g. Gortázar et al. 2007), et avoir desconséquences désastreuses en terme de santé vétérinaire et humaine, mais également de fortsimpacts économiques. L'apparition récente 5 de la forme hautement pathogène du virus H5N1montre comment une maladie émergente peut à la fois causer des épizooties rapides et degrande ampleur au sein des populations d'oiseaux domestiques, être transmise aux oiseauxsauvages et présenter un risque majeur de pandémie pour l'espèce humaine.Ainsi, malgré la répartition inégale des pathogènes responsables de ces maladies à lasurface de la planète (Guernier et al. 2004), le phénomène d'émergence est un problèmed'ordre global, qui concerne à la fois les populations d'animaux sauvages, domestiques ethumaines. Si la gestion des pathogènes semble primordiale en terme de santé publique(Morens et al. 2004) par la mise en place de réponses médicales rapides (e.g. vaccination,5 Détecté pour la première fois en 1996, en Chine.3

Introductionmédication), la compréhension et l'intégration des mécanismes écologiques et évolutifs quifavorisent cette émergence a également toute son importance (Stearns & Koella 2008). Eneffet, ces connaissances fondamentales devraient permettre d'anticiper et de répondre, avecdes moyens de contrôles adaptés et à long terme, à ce problème d'émergence auquel nossociétés sont et seront de plus en plus confrontées dans le futur (e.g. Williams & Nesse 1991;Stearns & Ebert 2001).2. Maladies infectieuses et écosystèmes.Au cours des dernières décennies, une attention toute particulière a été apportée à l'étude dela dynamique des maladies infectieuses dans les écosystèmes et leurs effets sur lespopulations et communautés d'hôtes (Hudson et al. 2002; Collinge & Ray 2006).Parallèlement, de nombreux travaux ont mis en valeur l'importance écologique des parasites 6dans le fonctionnement des écosystèmes (Poulin 1999; Thomas et al. 2005; Hudson et al.2006). Les connections entre maladies infectieuses, fonctionnement des écosystèmes et santéhumaine semblent donc de plus en plus évidentes (Ostfeld et al. 2008).L'étude des interactions entre maladies infectieuses émergentes et écosystèmesnécessite d'adopter une approche intégrant un large panel de disciplines (e.g. écologie,épidémiologie, virologie) et leurs méthodes de travail respectives. De très nombreux aspects,qu'ils soient fondamentaux ou appliqués, peuvent alors être traités (e.g. Ostfeld et al. 2008).Par exemple, il est souvent important, dans un premier temps, de se focaliser sur des aspectsécologiques et évolutifs (Schrag & Wiener 1995), afin d'identifier les interactions naturellesentre les pathogènes, leurs hôtes et leur environnement. Il est également nécessaire d'aborderdes aspects épidémiologique dans le but de caractériser les cycles d'infections dans l'espaceet dans le temps. Pour certains parasites, le rôle clé dans le fonctionnement des écosystèmeset le maintien de la biodiversité se doit également d'être appréhendé. Dans un second temps,la mise en valeur des facteurs (i.e. biotiques et abiotiques) qui peuvent expliquer comment et6 De nombreuses définitions peuvent être données aux termes « parasite » et « pathogène ». Dans un contexted'écologie évolutive, je considérerai ici que les pathogènes sont des parasites, c'est à dire qu'ils sedéveloppent et se reproduisent au dépend de leur(s) hôtes(s), au cours d'une interaction durable(e.g. Combes 2001). J'utiliserai le terme pathogène, ou parasite pathogène, pour définir un micro­organisme(e.g. virus) qui induit des troubles cliniques chez son hôte.4

Introductionpourquoi le parasite est en phase d'émergence s'avère cruciale. Cet aspect nécessite d'étudierle type et le niveau de perturbation générées par les activités humaines sur les écosystèmesnaturels, et ainsi intégrer des disciplines aussi différentes que l'écologie, l'économie et lessciences sociales.3. Virus influenza aviaires en Camargue.Les écosystèmes aquatiques contribuent au maintien d’une biodiversité importante, aussibien en espèces libres (Blondel & Aronson 1999) que parasites (Thomas et al. 1997). Parmielles, le bassin méditerranéen est identifié comme une zone exceptionnellement riche enterme de diversité biologique (Myers et al. 2000). Profondément façonnées par l'hommedepuis l'époque romaine, les zones humides méditerranéennes telle que la Camargue(Bouches du Rhône, Figure 2a) sont le lieu de conflits d'usages à l’origine de profondesmodifications de l'environnement (Blondel & Aronson 1999). En Camargue par exemple,l'utilisation du milieu est soumise à un arbitrage socio­économique dans lequel les activitésagricoles (riziculture, élevage, saliculture) sont mises en balance avec les activitésécologiques (zones de conservation), cynégétiques, touristiques et récréatifs (Picon 1988;Mathevet 2004). Les écosystèmes Camarguais subissent l'impact de diverses activitéshumaines, entraînant des modifications des communautés animales et végétales et, à pluslarge échelle, de la biodiversité locale.ArlesPetit RhôneGrand Rhônea.Mer MéditerranéeFigure 2. a. Le delta du Rhône et la Camargue: situationgéographique. b. Principales voies de migration des oiseauxsauvages qui traversent la Méditerranée (d'après Papayannis2002). L'étoile représente la situation géographique de laCamargue.b.5

IntroductionSituée au carrefour de plusieurs routes de migration (Figure 2b), la Camargue estreconnue comme étant un site d'importance majeure pour les arrêts migratoires, lanidification et l'hivernage d'une diversité considérable d'espèces d'oiseaux (Berthold 2001;Blondel & Isenmann 1981). Ces derniers représentent les hôtes naturels de nombreuxpathogènes (Hubalek 2004) dont certains peuvent représenter un risque pour la santéhumaine (Reed et al. 2003; Tsiodras et al. 2008). La Camargue fait ainsi office de « pointchaud » en terme de risque d'introduction et de transmission de pathogènes aviaires(Jourdain et al. 2007a).Prenons un exemple concret. En novembre 2000, le virus du Nil Occidental (ou« West Nile ») est réapparu en Camargue après 35 ans d'absence (Murgue et al. 2001). Lesoiseaux sauvages et domestiques font office de réservoir pour ces virus et, en Camargue, il aété récemment montré que certaines espèces sédentaires peuvent jouer un rôle majeur dansl'épidémiologie de ces virus (Jourdain et al. 2007b, 2008). Le risque de l'émergence du virusWest Nile en Camargue est également à relier avec la présence de son hôte vecteur(moustiques du genre Culex, Balenghien et al. 2007), mais aussi avec les changementsgénérés par les activités humaines sur les écosystèmes aquatiques de la région (i.e.développement de la riziculture), entraînant la création de gîtes larvaires propices audéveloppement du vecteur (Ponçon et al. 2007).Intéressons­nous maintenant aux virus de grippes aviaires. Ces virus circulentnaturellement chez les oiseaux sauvages, et en particulier les oiseaux d'eau tels que lescanards, les cygnes et les oies mais également les mouettes, les goélands, les sternes et denombreux limicoles (Webster et al. 1992). Chaque hiver, la Camargue abrite des centaines demilliers de canards dans des écosystèmes aquatiques allant des marais d'eau douce (utiliséspour la chasses et les espaces protégés) aux marais salants (Tamisier & Dehorter 1999). Auprintemps, la Camargue fait office de zone de nidification, sous la forme de colonies denses,pour les goélands, les mouettes, les sternes, mais également des oiseaux d'eauemblématiques tels que les flamants roses (Isenmann 2004). Quelles sont les modalitésd'apport, de transmission et de maintien de virus influenza aviaires dans les écosystèmesCamarguais ? Un tel questionnement s'avère particulièrement intéressant dans le contexteactuel d'émergence de virus potentiellement dangereux pour la santé publique, qu'ils soientfaiblement (e.g. H9N2) ou hautement (e.g. H5N1) pathogènes (Alexander 2007).6

Introduction4. Objectifs et questions abordées.Mon travail s'inscrit dans le contexte de l'émergence des zoonoses, et des relations que lespathogènes responsables de ces maladies entretiennent avec les écosystèmes. Plusieursobjectifs ont été définis et m'ont donné l'opportunité de travailler avec différentes approcheset méthodes de travail. Le premier objectif était d'aborder l'étude des interactions entre« activités humaines, parasitisme et écosystèmes » par l'intermédiaire de travaux de synthèseet de réflexion. Le second objectif visait à étudier plus en détail l'écologie des virusinfluenza aviaires en Camargue afin de répondre à des questions de base, mais d'importancemajeure, telles que: quelles sont les prévalences d'infection des oiseaux par ces virus ?Quelles sont les espèces concernées ? Quelle est la dynamique temporelle d'infection ?Quelles sont les caractéristiques génétiques des virus circulant ? Les écosystèmes aquatiquesont­ils un rôle de réservoir pour ces virus ? Afin d'apporter des connaissances et deséléments de discussion sur l'émergence et la propagation de formes hautement pathogènes(HP) des virus influenza aviaires, le troisième objectif était d'étudier plus spécifiquement levirus H5N1 HP, à l'échelle de la Camargue mais aussi à une échelle plus large, afinnotamment de mettre en valeur la nécessité d'intégrer les connaissances relatives à l'écologiede l'hôte et au fonctionnement des écosystèmes dans l'étude de cette maladie émergente.Cette thèse est donc composée de trois chapitres. Le premier traite des interactionsentre les activités humaines, le parasitisme et les écosystèmes. Cette thématique a étéabordée à travers deux articles, l'un portant sur l'impact des activités humaines sur l'évolutiondes pathogènes (Article 1) et l'autre sur les conséquences du surpeuplement dans les espacesprotégés sur la transmission parasitaire (Article 2).Le second chapitre traite de la circulation des virus influenza aviaires en Camargue.Ce chapitre synthétise dans une première partie les connaissances actuelles sur l'écologie etl'évolution de ces virus. Je présente ensuite les résultats de trois années de suivi deprévalences d'infections réalisés sur une large diversité d'espèces d'oiseaux en Camargue.Certains de ces résultats sont publiés (Article 3 et 4). Enfin, ce chapitre se termine par untravail mettant en valeur l'importance des écosystèmes aquatiques dans la dynamiquetemporelle d'infection, au sein des communautés d'oiseaux présents en Camargue (Article 5).7

IntroductionLe troisième chapitre traite plus particulièrement de la forme hautement pathogène duvirus H5N1. Le rôle des oiseaux migrateurs dans la propagation de ce virus pendant l'hiver2005­2006 est tout d'abord discuté dans un article de synthèse (Article 6). Des résultats plusspécifiques à la circulation de ce virus en Camargue sont ensuite présentés (Article 7).Enfin, une discussion portant sur l'émergence et la persistance de formes hautementpathogènes dans les écosystèmes naturels est proposé dans l'Article 8.Une discussion générale traitant à la fois d'aspects spécifiques à l'étude des virusinfluenza en Camargue et d'aspects plus généraux concernant la nécessité d'étudier lespathogènes responsables des zoonoses émergentes à l'échelle des écosystèmes, clôture cettethèse.8

CHAPITRE I:ACTIVITÉS HUMAINES, PARASITISMEET ÉCOSYSTÈMES

Activités humaines, parasitisme et écosystèmesChapitre I: Activités humaines, parasitisme et écosystèmes.Au cours des dernières décennies, une attention toute particulière a été apportée àl’importance écologique des parasites dans le fonctionnement des écosystèmes (Poulin 1999;Thomas et al. 2005; Collinge & Ray 2006; Hudson et al. 2006; Ostfeld et al. 2008). Il a étémontré que des bouleversements d’équilibres entre populations d’hôtes et de parasitespeuvent, par exemple, être à l’origine de perturbations des chaînes trophiques (Lafferty et al.2006; Kuris et al. 2008), des relations de compétitions entre espèces, ou encore du potentielinvasif de certaines d’entre elles et ainsi favoriser, ou au contraire défavoriser, le maintien dela biodiversité (Lafferty & Kuris 2005). Le rôle des parasites dans le fonctionnement desécosystèmes et, plus particulièrement, le maintien de la biodiversité est synthétisé dans lechapitre de livre présenté en Annexe 1. J'ai également eu l'opportunité de contribuer à larédaction d'un article présentant plus spécifiquement l'importance écologique des parasitesmanipulateurs 7 dans le fonctionnement des écosystèmes (Annexe 2).L’homme, à travers ses multiples activités (e.g. agricoles, industrielles, touristiques),peut être à l’origine de perturbations dans les interactions entre parasitisme etfonctionnement des écosystèmes. La destruction d'habitats naturels, la perte de biodiversité,les pollutions, les changements climatiques ou encore l’introduction d’espèces sont autant decauses susceptibles de perturber la dynamique des communautés de pathogènes. J'ai abordé,au cours de ma thèse, la thématique « activités humaines, parasitisme et écosystèmes »principalement à travers des travaux de réflexion et de synthèse. Les modifications apportéesà l'échelle de l'écosystème peuvent avoir des conséquences directes par exemple (i) surl'évolution des communautés de pathogènes ou encore (ii) sur la dynamique de transmissiondes parasites au sein de la faune sauvage. Ces deux aspects ont été traités au travers desArticles 1 et 2.7 Un parasite manipulateur est un parasite qui modifie le phénotype de son hôte dans un sens qui favorise satransmission d'un hôte vers un autre, ou permet à ses propagules d'être libérés dans un environnementfavorable (pour plus de détails: Moore 2002; Thomas et al. 2005; Poulin 2007).9

Chapitre I1. Activités humaines et évolution des pathogènes.Les activités humaines peuvent entraîner des modifications de l'environnement à très largeéchelle. Tout comme les organismes libres, les pathogènes doivent faire face à ceschangements et évoluer en conséquence. A partir d'exemples issus de travaux théoriques etexpérimentaux, l'Article 1 décrit la manière dont l'homme peut, directement ouindirectement, influer l'évolution de nombreux traits d'histoire de vie des pathogènes (e.g. laspécificité en hôte, la virulence, le polymorphisme). Les rôles directs et indirects des facteurstels que la fragmentation de l'habitat, la pollution, la perte de biodiversité, l'utilisation devaccins et d'antibiotiques ou encore le vieillissement de la population, sont discutés dans cetarticle de synthèse.Ce travail a été publié suite à une invitation de Frédéric Thomas par la revue« Molecular Ecology ». Cet article est paru dans le cadre d'un numéro spécial portant sur leschangements évolutifs dans les environnements altérés par les activités humaines(« Evolutionary change in human­altered environments »), suite au congrès s'étant déroulé àl'Université de Californie (Los Angeles), du 8 au 10 février 2007.2. Surpeuplement des espaces protégés et transmission de pathogènes.Quelles sont les conséquences de la gestion de la biodiversité sur les communautés deparasites, par exemple à travers la création d'espaces protégés ? Si les études portant sur lesinteractions entre parasitisme et écosystèmes sont de plus en plus nombreuses, l'intégrationde ces connaissances dans les programmes de gestion de la biodiversité reste très limitée. Ilest aujourd'hui largement reconnu que de nombreuses pratiques de conservation (e.g.translocation d'animaux sauvages, supplémentation en nourriture) peuvent conduire à desproblèmes parasitaires chez des espèces au statut de conservation défavorable. A partird'exemples choisis dans la littérature nous discutons, dans l'Article 2, des interactions entrela surpopulation en espèces hôtes et la dynamique des populations de parasites, l'évolution dela virulence ou encore les effets indirects sur la structure des communautés d'hôtesintermédiaires.10

Activités humaines, parasitisme et écosystèmesArticle 1:Lebarbenchon C., Brown S.P., Poulin R., Gauthier­Clerc M. & Thomas F. 2008.Evolution of pathogens in a man­made world. Molecular Ecology17(1): 475­484.11

Chapitre I12

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Activités humaines, parasitisme et écosystèmesArticle 2:Lebarbenchon C., Poulin R., Gauthier­Clerc M. & Thomas F. 2006.Parasitological consequences of overcrowding in protected areas.Ecohealth 3(4): 303­307.23

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Chapitre I30

CHAPITRE II:INFLUENZA AVIAIRES EN CAMARGUE

Influenza aviaires en CamargueChapitre II: Influenza aviaires en Camargue.1. Écologie et évolution des virus influenza aviaires.1.1. Généralités.Les virus influenza aviaires (ou influenza de type A) sont des virus enveloppés, sphériques,mesurant de 80 à 120 nanomètres de diamètre, appartenant à la famille desOrthomyxoviridae. Ils se distinguent des virus influenza de type B et C principalement sur labase de différences antigéniques de deux protéines internes: la nucléoprotéine et la protéinede la matrice (Webster et al. 1992). Le génome des virus influenza de type A est constitué dehuit segments d’ARN monocaténaires de polarité négative, codant pour onze protéines(Obenauer et al. 2006; Figure 3). Deux de ces protéines, l'hémagglutinine et laneuraminidase, ont un rôle clé dans l’infection et la réplication du virus et, de ce fait,représentent les principales cibles du système immunitaire de l’hôte (Suarez & Schultz­Cherry 2000; Subbarao & Joseph 2007). En effet, situées à la surface du virus,l’hémagglutinine (HA) assure la fixation et la pénétration du virus à l’intérieur de la celluleet la neuraminidase (NA) permet la libération des nouveaux virions après la phase demultiplication virale. Les virus influenza de type A se distinguent par la forte diversitégénétique de ces deux protéines, avec seize types d'hémagglutinine (H1 à H16) et neuf deneuraminidase (N1 à N9) décrits à ce jour (Webster et al. 1992; Fouchier et al. 2005).Différents sous­types (notés HxNy) sont identifiés selon la combinaison de ces deuxprotéines et, pour chaque sous­type, plusieurs souches génétiquement différentes peuventêtre distinguées.1.2. Hôtes naturels et cycle viral.Bien qu'ils soient principalement inféodés aux oiseaux, les virus influenza aviaires affectentégalement plusieurs espèces de mammifères telles que l’homme, le porc, le cheval, le chat, lechien, le phoque, certains cétacés et mustélidés (Wallensten 2007). Les oiseaux d'eaux, et en31

Chapitre IIparticulier ceux appartenant à l'ordre de Ansériformes (canards, oies et cygnes) et desCharadriiformes (mouettes, goélands, sternes et limicoles), représentent le réservoir naturelde ces virus (Stallknecht & Shane 1988; Webster et al. 1992; Alexander 2000).Généralement, ces virus se multiplient en grande quantité dans les cellules épithéliales del'intestin. Il en résulte une élimination massive dans les matières fécales qui peuvent alorscontaminer les milieux aquatiques, et ainsi contribuer à entretenir le cycle de l’infection(Hinshaw et al. 1979; Markwell & Shortridge 1982; Ito et al. 1995). La persistance de cesvirus dans l'eau dépend des caractéristiques génétiques du virus (sous­type, souche) maiségalement des caractéristiques abiotiques du milieu telles que la température, le pH ou lasalinité de l'eau (Stallknecht et al. 1990a, b; Brown et al. 2007).Figure 3. Représentation schématique de la structure des virus influenzaaviaires (d'après Kaiser 2006).32

Influenza aviaires en Camargue1.3. Évolution virale.Afin d'échapper au système immunitaire de l'hôte, les virus influenza aviaires sontconstamment soumis à sélection de nouveaux variants antigéniques (e.g. Earn et al. 2002).Les deux principaux mécanismes génétiques permettant à ces virus de modifier lacomposition de leurs génomes sont la dérive génétique et les réassortiments viraux. Ladérive génétique est caractérisée par des changements de séquence du génome viral quipeuvent se traduire par des changements de la structure des antigènes de surface(l'hémagglutinine et la neuraminidase) liés à des mutations ponctuelles affectant lessegments viraux codant pour ces protéines. Ces mutations apparaissent fréquemment du faitde l'absence de mécanismes de réparation des segments d'ARN lors de la réplication virale.En effet, Chen & Holmes (2006) ont récemment mis en évidence des taux de substitutiontrès élevés, pour les huit segments composant le génome viral, caractéristique partagée cheztous les virus à ARN (e.g. Chao 1992 pour synthèse).Le caractère segmenté des virus influenza aviaires permet également à ces virusd'échapper aux défenses immunitaires de l'hôte par l'intermédiaire de réassortiments viraux.Ces derniers correspondent à des échanges de segments d'ARN entre deux virus différentslors de l'infection d'une même cellule hôte et représentent un moyen efficace de productionde nouvelles formes virales (sous­types ou souches). Les mécanismes permettant lacoinfection d'un oiseau hôte et favorisant l'émergence de nouveaux variants viraux ont ététrès peu étudiés (e.g. Sharp et al. 1997; Hatchette et al. 2004; Spackman et al. 2005), bienqu'un fort taux de réassortiments génétiques au sein des populations de canards sauvages aitrécemment été décrit (Dugan et al. 2008).1.4. Virus hautement pathogènes.Les virus influenza aviaires se divisent en formes faiblement et hautement pathogènes. Lesformes faiblement pathogènes provoquent une infection localisée des voies respiratoires etdigestives, causant des symptômes légers voire inexistants (Webster et al. 1992, van Gils etal. 2007). Au contraire, les formes hautement pathogènes sont la plupart du tempsresponsables d’infections généralisées, mais ont rarement été isolées chez les oiseaux33

Chapitre IIsauvages vivants (Olsen et al. 2006). A ce jour, seuls les sous­types H5 et H7 comportent desformes hautement pathogènes (Swayne & Suarez 2000). Les déterminants moléculaires decette différence de virulence sont multiples (e.g. Obenauer et al. 2006). L'insertionpeptidique dans la séquence codant pour le site de clivage de l'hémagglutinine sembletoutefois en être la principale cause (Garten & Klenk 1999, Figure 4).a. b.Figure 4. L'hémagglutinine (HA): déterminant majeur du caractère pathogènedes virus influenza aviaires. L'HA joue un rôle clé dans l'entrée du virus dansla cellule hôte. Après fixation aux récepteurs cellulaires, le virus estinternalisé par endocytose. L'HA (HA0), qui est clivée en deux chaînespolypeptidiques (HA1 et HA2), subit alors un changement conformationnelqui permet l’exposition du peptide de fusion à l’extrémité N­terminale de laHA2. Ceci permet la fusion entre l'enveloppe du virus et la membrane del'endosome, permettant ainsi la libération de la capside nucléique dans lecytoplasme. a. L'hémagglutinine des virus faiblement pathogènes est clivéepar des protéases localisées dans les organes respiratoires et digestifs. b. Lesite de clivage des virus hautement pathogènes possède une insertion d'acidesaminés basiques permettant à l'HA d'être clivée par des protéasesextracellulaires ubiquitaires présentes dans un grand nombre d'organes,entraînant une infection généralisée (modifié d'après Horimoto & Kawaoka2005).2. Prévalences d'infections chez les oiseaux sauvages en Camargue.La première étape de mon travail sur les virus influenza aviaires a été d'étudier le portageviral d'une large diversité d'espèces d'oiseaux circulant en Camargue tout au long de l'année.Cette étude a eu pour but de dégager le patron global de circulation de ces virus au sein descommunautés aviaires. La mise en place de captures d'oiseaux et de prélèvements34

Influenza aviaires en Camarguebiologiques en Camargue a débuté à l'automne 2005. Les analyses moléculaires etvirologiques on été réalisées à l'Institut Pasteur de Paris, au sein de l'unité de « GénétiqueMoléculaire des Virus Respiratoires » dirigé par Sylvie van der Werf. Ces analyses ont étéréalisées par (i) Saliha Azebi, Frédérique Cuvelier, Patricia Jeannin et Vanessa Roca(Techniciennes, Institut Pasteur), pendant la première année; (ii) Chung­Ming Chang(Ingénieur, CNRS) pendant la seconde année; (iii) Viviane Grandhomme (Ingénieur, CNRS)pendant la troisième année. J'ai également pris part à l'analyse de ces échantillons à traversdes séjours réguliers de travail à l'Institut Pasteur (14 semaines au total).2.1. Échantillonnage.L'échantillonnage des oiseaux a été réalisé à l'aide de plusieurs méthodes de capture, enfonction de l'accessibilité aux individus (Annexe 3). Chaque oiseau capturé est marqué avecune bague alphanumérique du Muséum National d’Histoire Naturelle (Paris). Il est ensuiteidentifié (espèce et éventuellement sous­espèce), sexé et âgé (âge non déterminé, juvéniled’un an ou adulte) selon des critères de mue des plumes spécifiques. Des mesuresmorphométriques sont également réalisées: indice d’adiposité, mesure de l’aile et pesée.Pour chaque oiseau, un prélèvement cloacal est réalisé à l'aide d'un écouvillon (Annexe 3).Pendant la période d'hivernage des canards (septembre à décembre) nous avonségalement eu l'opportunité de réaliser des prélèvements sur des oiseaux tués à la chasse(Annexe 3). Plusieurs propriétaires et gestionnaires de « chasses camarguaises » nous ontpermit en effet de réaliser régulièrement des prélèvements sur un grand nombre d'individusfraîchement tués. Enfin, pour les mouettes, goélands et sternes, des fientes fraîches ont étédirectement récoltées au sol sur des îlots de reproduction dans des colonies mono­spécifiques(Annexe 3).Les prélèvements ont été placés dans des tubes individuels contenant un milieu deconservation (Viralpack, Biolys). Il ont ensuite été transportés dans une glacière réfrigéréepuis conservés à ­80°C jusqu'à leur analyse.35

Chapitre II2.2. Biologie moléculaire et virologie.La première étape de l'analyse correspond à la détection des virus influenza dans leprélèvement. L’extraction de l’ARN viral a été réalisé à l’aide du kit QIAamp VirusBioRobot MDX (Qiagen TM ) et du BioRobot MDX (Qiagen TM ) selon les indications duconstructeur. Devant l'amélioration des techniques disponibles pour la détection des virus,plusieurs méthodes ont été employées au cours des trois saisons d'échantillonnage (i.e.années de thèse):Lors de la première saison (de septembre 2005 à juillet 2006), la présence de virusinfluenza a été détectée par transcription inverse (RT pour « reverse transcription »)et réaction de polymérisation en chaine (PCR pour « polymerase chain reaction »).L'amplification est réalisée sur environ 201 paires de bases (pb) du segment M, avecles amorces M52C: 5'­CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG­3' et M253R: 5'­AGGGCA TTT TGG ACA AAK CGT CTA­3' (Fouchier et al. 2000). Les produitsd'amplifications sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose (1%) et colorationau bromure d'éthydium (BET). Cette méthode ayant récemment montré desproblèmes de spécificité (Busquets Marti et al. 2006), les techniques employées ontété revues afin de s'affranchir d'un tel problème, mais aussi de gagner en sensibilitédans la détection virale. L'analyse des échantillons de la seconde saison d'échantillonnage (de septembre 2006à juillet 2007) a été réalisée en couplant deux méthodes de PCR en temps réelle. Eneffet, après une phase de RT, tous les échantillons ont été analysés avec une techniquede PCR en temps réel utilisant un agent fluorescent (le SYBR Green). Karlson et al.(2007) ont récemment montré que la combinaison de cette méthode utilisant le SYBRgreen, avec une autre méthode de détection utilisant une sonde d'hybridation Taqmanpermet d'obtenir des résultats plus fiables que les méthodes d'analyses classiques(e.g. Fouchier et al. 2000). Les échantillons détectés comme positifs par la PCR entemps réel, utilisant le SYBR green, ont donc dans un second temps été confirmésavec une autre PCR en temps réel, utilisant une sonde d'hybridation: MqPCR­Probe2:5'­(fam) CCT CAA AGC CGA GAT CGC GCA (Tamra)­3'. La combinaison de cesméthodes a permis de gagner en sensibilité (SYBR Green) et spécificité (sonde36

Influenza aviaires en Camargued'hybridation) dans la détection des échantillons.Du fait de l'acquisition de nouveau matériel (e.g. Light Cycle 480, Roche TM ) et de lamise au point par Chung­Ming Chang de la méthode de « one­step » RT­PCR tempsréel avec la sonde d’hybridation décrite précédemment, la détection des échantillonspositifs a été considérablement améliorée. Ainsi, la méthode utilisée pour analyser leséchantillons issus de la troisième saison d'échantillonnage (de septembre 2007 àjuillet 2008), mais également la confirmation des positifs détectés lors de la secondesaison, est la plus spécifique et la plus sensible (100 copies par µL) des techniquesutilisées jusqu’alors. Cette méthode est dorénavant utilisée en routine pour ladétection des virus influenza aviaires.2.3. Analyse statistique.Les variations de prévalences d'infections ont été analysées par régression logistique (GLM,binomial, R version 2.6.2). Le statut d'infection pour chaque échantillon (i.e. individu) estconsidéré comme une variable binaire: un oiseau est infecté et excréteur ou non. Cetteméthode a été utilisée principalement pour tester un effet de la période d'échantillonnage etde l'espèce hôte.2.4. Résultats et discussion.Entre le 1 er septembre 2005 et le 31 juillet 2008, 6793 échantillons ont été réalisés sur 121espèces d'oiseaux différentes (Figure 5 et Annexe 4). L'effort d'échantillonnage estdirectement dépendant des possibilités techniques de capture et de la présence des oiseaux, etest donc variable suivant les différentes périodes de l'année (Figure 5). Par exemple, lescanards sont principalement échantillonnés pendant les mois de septembre à février, alorsqu'au printemps, entre mars et mai, les passereaux sont les principaux oiseaux capturés.La prévalence globale d'infection (i.e. mesurée sur l'ensemble de la communauté, toutau long de l'année) par les virus influenza est de 2,2% (150 virus détectés au total). Laprévalence mensuelle est présentée dans la Figure 6. Nous observons une cyclicité dansl'infection avec le même patron d'une année à l'autre, caractérisée par des plus forts taux37

Chapitre IIFigure 5. Nombre d'échantillons réalisés et analysés (en terme de présence absence d'un virus influenzaaviaire) entre septembre 2005 et juillet 2008.Figure 6. Prévalence globale d'infection des oiseaux sauvages en Camargue, par les virus influenza aviaires,entre septembre 2005 et juillet 2008.38

Influenza aviaires en Camargued'infections pendant l'automne et l'hiver (septembre à février, GLM; OR = 14,7; CI = [5,4 –39,6]; P < 0,001). Une telle cyclicité a été également mise en évidence en Europe du Nord eten Amérique du Nord mais habituellement avec des prévalences d'infections plus élevées(e.g. Munster et al. 2007; Wallensten et al. 2007).Cette cyclicité s'explique par l'abondance d'oiseaux appartenant à l'ordre desAnsériformes, réservoirs naturels de virus influenza aviaires, pendant la période d'hivernage.Cet ordre d'oiseaux est en effet significativement plus infecté que les autres en Camargue(GLM; OR = 31,2; CI = [11,5 – 84,2]; P < 0,001). Si l'on regarde plus en détail la dynamiquetemporelle d'infection pendant la période d'hivernage (Figure 7), on observe une variationsaisonnière de la prévalence d'infection (prévalences plus fortes pendant la saison2007­2008, GLM; OR = 3,1; CI = [1,9 – 4,9]; P < 0,001) mais surtout un pic d'infectionchaque saison au début de l'automne, en septembre (GLM; OR = 3,1; CI = [1,9 – 5,0]; P

Chapitre IIrésistance face aux sous­types circulant. De telles explications restent hypothétiques etnécessitent des investigations plus appropriées, notamment sur le statut immunitaire descanards pendant la période d'hivernage et sur la diversité des sous­types circulants.Parmi les espèces de canards échantillonnées pendant la période d'hivernage (Tableau1, la Sarcelle d'été est la plus infecté (GLM; OR = 11,4; CI = [1,1 – 114,4]; P < 0,5). Cerésultat est cependant à interpréter avec précaution devant la faible taille de l'échantillon,mais également de part le fait que cette espèce a été échantillonnée uniquement en début desaison (septembre­octobre). Les individus prélevés correspondent à des oiseaux en migration(pour la plupart pendant le mois de septembre), utilisant les milieux aquatiques camarguaiscomme lieux de repos et d'alimentation (Tamisier & Dehorter 1999). Il apparaît importantd'étudier plus en détail cet aspect afin de déterminer si cette espèce est réellement plusinfectée que les autres. Si tel est le cas, la Sarcelle d'été pourrait avoir un rôle clé dans lescycles épidémiologiques de la maladie, en initiant la dispersion des virus chaque année audébut de la migration d'automne.Tableau 1. Liste des espèces déterminés positives à une infections par un virus influenzaaviaire, an Camargue, entre septembre 2005 et juillet 2008.Espèce Prévalence Taille d'échantillonAnseriformesCanard pilet Anas acuta 1% 100Canard souchet Anas clypeata 3,2% 282Sarcelle d'hiver Anas crecca 5,3% 1798Canard colvert Anas platyrhynchos 4,4% 767Sarcelle d'été Anas querquedula 10,3% 29Canard chipeau Anas strepera 1,3% 237Fuligule milouin Aythya ferina 0,3% 201CharadriiformesMouette mélanocéphale Larus melanocephalus 2,8% 71Goéland leucophée Larus michahellis 0,5% 369Si cette espèce n'est pas prise en compte dans l'analyse, il faut noter que l'on n'observealors pas de différence significative de prévalence d'infection entre les autres espèces decanards. Si l'on regroupe les espèces par genre, une différence entre les canards plongeurs dugenre Aythya et les canards de surface du genre Anas est détectée (Chi2 = 10,685; df = 1;40

Influenza aviaires en CamargueP < 0,001). Ce résultat est intéressant puisque à ce jour très peu de canards plongeurs ont étééchantillonnés et testés pour la présence de virus influenza aviaires. L'origine d'une tellevariation n'est pas expliquée à ce jour. Les virus subsistant principalement dans la couchesuperficielle de la colonne d'eau, les différences liées aux stratégies d'alimentation entre cesdeux genres pourraient éventuellement expliquer ce résultat.Concernant les autres espèces échantillonnées, seules deux espèces de Laridés, lamouette mélanocéphale et le goéland leucophée (respectivement Larus melanocephalus et L.michahellis) ont montré des infections aux virus influenza aviaires. Les faibles prévalencesobservées pour ces espèces (Tableau 1) sont du même ordre que celles enregistrées enEurope du Nord (Fouchier et al. 2003). Olsen et al. (2006) ont en effet estimé une prévalencemoyenne d'infection pour ces oiseaux (mouettes et goélands, i.e. Larus sp) de 1,4%. Chez cesoiseaux cependant, les virus influenza aviaires sont divisés en lignées Européenne etAméricaine, et certains sous­types (H13 et H16) semblent être restreints au genre Larus(Fouchier et al. 2005, Olsen et al. 2006).Comme les laridés, les hérons et flamants roses sont des oiseaux d'eau coloniaux. Latransmission de virus influenza aviaires est donc théoriquement possible dans cespopulations. Malgré un effort d'échantillonnage relativement important (N = 177 pour héronset aigrettes, N = 113 flamants roses) aucun oiseau ne s'est avéré positif (Article 3), suggérantun rôle limité de ces oiseaux dans l'épidémiologie de la maladie. Ce rôle limité concerneégalement les passereaux (Olsen et al. 2006), en effet, en Camargue, aucun virus n'a étédétecté sur les 1599 échantillons analysés, pendant les migrations de printemps (Article 3) etd'automne.Le détail des effectifs et espèces analysées est présenté en Annexe 4. Les résultatscorrespondant à la première saison d'échantillonnage, hivernage 2005­2006 et migration deprintemps 2006, ont été publiés respectivement dans l'Article 7 (présenté dans leChapitre III) et l'Article 3.41

Chapitre II3. Identification des virus circulant.La seconde étape de l'analyse des échantillons a consisté à déterminer les caractéristiquesgénétiques des virus détectés. Cette étape est particulièrement longue à réaliser et uneimportante phase de mise au point des méthodes a du être effectuée. Les résultats présentésdans ma thèse sont donc partiels et ne peuvent pas conduire à une interprétation globale descaractéristiques génétiques des virus circulant en Camargue.3.1. Méthodologie.Tous les échantillons positifs ont été analysés en priorité pour la forme hautement pathogènedu virus H5N1 (méthode détaillée dans l'Article 7). La technique de détection est une qRT­PCR temps réel (avec des sondes d’hybridations Taqman respectivement spécifiques desgènes H5 et N1 aviaire). Pour chaque virus identifié H5 et H7 le site de clivage est séquencéafin de vérifier qu'il ne comporte pas l'insertion peptidique caractéristique des virushautement pathogènes (Figure 4).Les autres sous­types sont ensuite testés pour les échantillons positifs. Afin demaximiser les chances de détermination du sous­type, nous nous sommes basés sur lesconnaissances génétiques des virus circulants dans la faune sauvage en Europe. Les soustypesH4, H6, N2 et N6 ont donc été testés en priorité du fait de leur forte prévalence chezles canards en Europe du Nord (Munster et al. 2007). Les méthodes de caractérisation dusous­type par RT­qPCR sont encore à l'étape de validation ou de mise au point à l'InstitutPasteur. Les résultats présentés concernant le typage viral sont donc encore à l'étatd'acquisition. A ce jour les sous­types H5, N1 mais également H7 et H9 (méthode modifiéed'après Tsukamoto et al. in press) ont été identifiés avec certitude. Les sous­types H1, H4,H6, N2 et N6 ont été identifiés mais les méthodes utilisées sont en cours de validation.L'étape suivante consiste à isoler les virus d'intérêt afin d'obtenir une grande quantitéde matériel génétique et de procéder au séquençage de leur génome. Ces étapes étant encoreen cours de réalisation, les résultats issus de ces manipulations ne seront pas présentés ici(excepté ceux de l'Article 4).42

Influenza aviaires en Camargue3.2. Premiers résultats.Aucun des 150 virus influenza aviaires détectés ne correspond à une forme hautementpathogène (une partie des résultats est publié dans l'Article 7). Ce résultat estparticulièrement important dans le contexte actuel de la propagation de ces virus à l'échellemondiale, et du rôle potentiel des oiseaux migrateurs. Au moment de la rédaction de cettethèse, les virus détectés sont pour la plupart des virus H5 faiblement pathogènes (40%;Figure 8). Ce résultat est très intéressant puisque les sous­types majoritaires décrit en Europesont habituellement H4, H6 et H7 (Munster et al. 2007). La forte fréquence de virus H9 estégalement à noter puisque la circulation de ce sous­type semblait jusqu'alors anecdotiquedans la faune sauvage, du moins en Europe. Afin de mettre en valeur le type d'informationsque peuvent révéler les caractéristiques génétiques de ces virus, une première étudephylogénétique a été réalisée sur un virus H9N2, détecté sur une mouette mélanocéphale auprintemps 2006. Les résultats sont détaillés dans l'Article 4.Figure 8. Fréquence des sous­types identifiés.43

Chapitre II4. Les écosystèmes aquatiques: réservoir naturel de virus influenza aviaires ?Les mécanismes permettant aux virus influenza aviaires de se transmettre et de persister, ausein des communautés d'oiseaux sauvages, restent à l'heure actuelle peu étudiés. Comprendrela dynamique de transmission de ces virus nécessite en effet de prendre en compte à la foisl'écologie de l'hôte (e.g. densité des populations, périodes de migrations), les caractéristiquesabiotiques de l'environnement (e.g. température et salinité de l'eau) et bien entendu lescaractéristiques génétiques des virus.Un modèle mathématique a été développé en collaboration avec Benjamin Roche(étudiant en thèse dans l'unité de Génétique et Évolution des Maladies Infectieuses) afind'apporter des éléments d'informations sur les mécanismes qui influencent la dynamiqued'infection observée au sein des communautés d'oiseaux sauvages. Ce modèle tient compte àla fois de données quantitatives concernant la présence des espèces d'oiseaux recensées enCamargue tout au long de l'année (Jourdain et al. 2007) et des prévalences d'infectionsenregistrées durant la première année de ma thèse (Article 3 et 7).Les résultats (Article 5) indiquent que la transmission des virus influenza aviaires enCamargue dépend à la fois des densités d'espèces hôtes présentes, et de la capacité depersistance de ces virus dans l'eau. Ce travail souligne l'importance de la prise en compte desécosystèmes aquatiques dans l'étude des mécanismes favorisant la persistance et latransmission de ces virus au sein de populations d'oiseaux sauvages.44

Influenza aviaires en CamargueArticle 3:Lebarbenchon C., Chang C­M., van der Werf S., Aubin J­T., Kayser Y.,Ballesteros M., Renaud F., Thomas F. & Gauthier­Clerc M. 2007.Influenza A virus in birds during spring migration in the Camargue, France.Journal of Wildlife Diseases 43(4): 789­793.45

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Influenza aviaires en CamargueArticle 4:Lebarbenchon C.*, Chang C­M.*, Gauthier­Clerc M., Thomas F., Renaud F.& van der Werf S. 2008. H9N2 avian influenza virus in a Mediterranean gull.Journal of Molecular and Genetic Medicine, Sous presse.* Contribution égale.53

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Influenza aviaires en CamargueArticle 5:Roche B.*, Lebarbenchon C.*, Gauthier­Clerc M., Chang C­M., Thomas F.,Renaud F., van der Werf S. & Guégan J­F. Avian influenza dynamicsin wild birds are driven by water­borne transmission.Soumis à Infection, Genetics and Evolution.* Contribution égale.59

Chapitre II60

Influenza aviaires en CamargueAvian influenza dynamics in wild birds are driven by water­borne transmissionRunning title: Water­borne transmission of avian influenzaBenjamin Roche 1¥* (roche@mpl.ird.fr), Camille Lebarbenchon 1,2¥(Camille.Lebarbenchon@mpl.ird.fr), Michel Gauthier­Clerc 2 (Gauthier­Clerc@tourduvalat.org), Chung­Ming Chang 1,3 (cmchang@mail.cgu.edu.tw), FrédéricThomas 1 (fthomas@mpl.ird.fr), François Renaud 1 (frenaud@mpl.ird.fr), Sylvie van derWerf 3 (svdwerf@pasteur.fr) and Jean­François Guégan 1,4 (guegan@mpl.ird.fr)1. Génétique et Evolution des Maladies Infectieuses (GEMI), UMR CNRS/IRD 2724, 911,avenue Agropolis, BP 64504, 34394 Montpellier Cedex 5, France.2. Centre de Recherche de la Tour du Valat, Le Sambuc, 13200 Arles, France.3. Génétique Moléculaire des Virus Respiratoires, URA3015 CNRS, EA302 UniversitéParis­Diderot, Institut Pasteur, 25­28 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.4. French School of Public Health, 35000 Rennes, France.¥ These authors contributed equally to this work* Corresponding author: Tel.: +33.4.67.41.62.32, Fax.: +33.4.67.41.62.99, email:roche@mpl.ird.fr61

Chapitre IIAbstractTransmission and persistence of avian influenza viruses (AIV) among wildlife remains anunresolved issue because it depends both on the ecology of the host (e.g. population density,migration) and on the environment (e.g. AIV persistence in water). We have developed amathematical model that accounts for both AIV epidemics and bird community dynamics.The model is parameterized using bird counts and AIV prevalence data. Results suggest thatthe transmission patterns driving the dynamics of infection at our study site (Camargue,South of France) involved both a density­dependent and a water­borne transmissionprocesses. Water­borne transmission is, however, the main determinant of the diseasedynamics and observed prevalence level. This pattern of transmission highlights theimportance of the persistence of viral particles into water in AIV dynamics in wild birds.Keywords : Influenza A, water­borne transmission, mathematical modeling.62

Influenza aviaires en CamargueIntroductionEcological issues and human health concerns have been shown to be increasinglyconnected (Collinge and Ray 2006; Thomas et al. 2005), therefore, understanding thedynamics of infectious diseases in wildlife has become a central focus in public healthscience. Disease origin, persistence and transmission among wildlife remain difficult toassess because they depend on a huge variety of factors, including strict host­pathogeninteractions (e.g. virulence, immunity) and ecological aspects, such as the characteristics ofnatural environments (Collinge and Ray 2006; Thomas et al. 2005; Daszak et al. 2000).Thus, the threat of emerging zoonotic diseases cannot be addressed without considering themyriad of environmental factors that influences transmission patterns in field conditions.Influenza viruses are widespread in the animal kingdom; birds, humans, horses, pigsare often infected, as sometimes are cetaceans, dogs and mustelids. Wild aquatic birds of theorders Anseriformes (e.g. ducks, geese, swans) and Charadriiformes (e.g. gulls, terns,waders) are traditionally considered natural hosts of most avian influenza viruses (AIV).These pathogens are assumed to be mainly transmitted via the fecal­oral route. In wild birds,infection is caused by low pathogenic (LP) AIV (Olsen et al. 2006; Webster et al. 1992) andis usually asymptomatic. However, recent reports have shown that behavioural modificationsbrought about by infection are probably more common than previously recognized (e.g. vanGils et al. 2007). Conversely, domestic birds, particularly poultry, have experienced recurrentoutbreaks of highly pathogenic (HP) AIV of the subtypes H5 and H7 (Alexander 2000),resulting in high mortality and significant economic loss.Three transmission routes may be implicated in AIV dynamics. The first one is the“density­dependent” process (McCallum et al. 2001), which is the classical assumption for63

Chapitre IIinter­individual transmission of wildlife diseases. According to this transmission pattern,contact rate between individuals increases when the host community size increases(assuming that host community size is correlated to the host density). For clarity, weconsider here that “host community size” and “host community dynamics” refer,respectively, to the population size and the population dynamics for all bird species withinour study area.The second pattern is “frequency­dependent” inter­individual disease transmission. Inthis case, the contact rate between bird individuals remains constant even though the hostcommunity size increases. Although density­dependent transmission is often involvedheuristically, frequency­dependent process sometimes provide a better model fit to a range ofwildlife disease data sets (McCallum et al. 2001; Dobson et al. 1996).Finally, waterfowl may also acquire AIV by drinking or filtering water while feeding(Delogu et al. 2003). AIV persistence in water has been suggested as a natural mechanism tomaintain influenza viruses in avian species (Hinshaw et al. 1979; Stallknecht et al. 1990a, b;Ito et al. 1995; Brown et al. 2007a). Water­borne transmission is likely to spread the infectionwithout the need of direct contact between birds. This transmission pattern has explained themaintenance of LP AIV in domestic ducks under particular farming conditions (Markwell etal. 1982). However, the general importance of water­borne transmission in naturalecosystems is, as yet, poorly understood.Materials and MethodsIn this study, we tried to elucidate the most plausible transmission route by computinga mathematical model that reproduces AIV dynamics and takes into account host community64

Influenza aviaires en Camarguedynamics. We computed data from AIV prevalence (Lebarbenchon et al. 2007a,b, see onlineappendix) and bird community demography (Jourdain et al. 2007, see online appendix)recorded in the Camargue area (Rhône delta, South of France). This area is of particularinterest because it is at the cross­road of many migratory routes of Palaearctic birds(Berthold 2001), and is identified as a potential hot­spot for the introduction andtransmission of bird­borne pathogens (Jourdain et al. 2007). Based on the annual cycle ofthis pathogen observed in other locations (Wallensten et al. 2007), we assumed that the samedynamics of infection occur every year in wild birds present in the Camargue.We simulated a classical SIRS model (Anderson and May 1991; Grenfell and Dobson1995). This model assumes that hosts are divided into three classes according to theirimmunological status: Susceptible (S), which includes the immunologically naiveindividuals, Infectious (I), made up of birds which can infect other individuals, andRecovered (R) which consists of birds resistant to the disease. Since immune responseagainst AIV in wild birds is poorly understood, the rate of loss of immunity (ε) has beenincluded in the model, and three scenarios were tested: (i) permanent immunity ( ε =0) (ii) aloss of immunity in one year ( ε=1.individual.year ­1 ) and (iii) a loss of immunity in four years( ε = 4 individual.year ­1 ).In this study, we added an additional compartment (B), which represents the aquaticenvironment or, more precisely, the quantity of viral particles in the aquatic environment.Our model is based on previous mathematical models for human cholera, which is anenvironmentally persistent water­borne disease (Codeço 2001; Constantin de Magny et al.2005). The following differential equations were used to describe the disease dynamics:65

Chapitre IIParameters b m and d m are respectively birth and death rates for month m, N is the number ofbirds and is the rate of infection for each transmission process. We introduced time­forceddemographic parameters that allowed us to reproduce the avian community dynamics asobserved in our study site. For inter­individual transmission with a density­dependentprocess we thus have: =I; for inter­individual transmission with a frequency­dependentprocess: =I/N; and finally, for water­borne transmission: = /( +). This kind oftransmission is assumed to be a saturating function since experimental studies have testedindependently different initial viruses load which all lead to an high infection rate (Lu andCastro 2004;Webster et al. 1978; Webster et al. 1992). In fact, these results suggest athreshold for viral load needed to bring susceptible individuals to an infectious state (θforthe viral load in water). On the other side, since this model incorporates time­forceddemographic parameters (b m and d m ) and consequently dynamic population size (N t ),abundance of viral particles fluctuates in time. If these model does not incorporate thisfeature, abundance of viral particles could reach a persistent value at equilibrium and thesethree transmission routes can be viewed as a continuum. In this case, water­bornetransmission is an intermediate form between density­dependent and frequency­dependenttransmission. Accordingly, we investigated outputs with such an intermediate model,between frequency­dependent and density­dependent. The corresponding transmission66

Influenza aviaires en Camarguemechanism is defined by = I/(N ) where is the contact rate between individuals and is the degree of frequency­dependence of transmission ( = 0 for full density­dependenttransmission and = 1 for full frequency­dependent transmission). Estimation of , , , and was performed using the values of σ(recovery rate per individual), θ(minimal viralload to initiate infection), γ(viral shedding per day per infected individual) andπ(viralparticle inactivation rate in water) presented in Table 1 (evaluation procedure is detailed inthe online appendix.). We also investigated transmission patterns which involved twotransmission routes: density dependent + water­borne transmission, and frequency dependent+ water­borne transmission.For each of the disease transmission mechanisms, we optimized the transmissionparameters in our mathematical model to obtain the minimal error against the disease data.More specifically, we maximized the likelihood of all models and applied afterwards alikelihood ratio test in order to select the most parsimonious model which shows the bestdata adequacy. The evaluation procedure is detailed in the online appendix.This mathematical framework starts from the following hypotheses. (i) Each birdspecies has the same duration of virus excretion: a one to two week duration has beenreported for the most common avian species (Webster et al. 1978; Lu and Castro 2004). (ii)Each bird species excretes the same number of viral particles: we assumed that viral particleproduction is equal across different host species. From a mathematical point of view thisassumption is not really important when a threshold of viral particle concentration in theenvironment is reached. We also assumed that viral particles produced by different avianspecies remain infectious for the same duration irrespective of the AIV subtypes. (iii) Watercontacts are equal across avian species: we assumed that there are no differences in terms of67

Chapitre IIwater contact rate for disease transmission between avian species. This rough approximationallow us to analyze the impact of the mean aquatic behavior of avian species.We then analyzed how these different transmission patterns may modify the diseasedynamics by using optimized transmission parameters for each of the transmissionmechanisms we investigated. The most intuitive way to evaluate the effect of transmissionwas to analyze the synchrony between disease dynamics and host community dynamics. Wetherefore used the classical cross­correlation method (Tobin and Björnstad 2003) betweenAIV and bird community dynamics. With this method, each transmission pattern will resultin different "dynamic signatures" (i.e. different synchronies between disease dynamics andhost community dynamics).ResultsWe tested the 194 possible parameters set using different values of the parameters includedin our model. For each of the six transmission mechanisms we investigated, we choose theone with the best parameter estimation and then compared different model outputs (Figure1). Results from the LRT (Table 2) allow us to statistically identify the model with the bestfit with the infection dynamic data recorded in our study site.This analysis indicates that the transmission process which drives the dynamics ofinfection recorded in our study site (Camargue, South of France), involved both a densitydependentand a water­borne transmission component (Figure 1). This model gives themaximal likelihood and is significantly better than others transmission processes (Table 2).The associated parameter estimates for this transmission process are: θ= 10 1.8 , γ= 1 EID 50ind.day ­1 , π= 1/28 ind.day. ­1 , ε= 1 ind.year. ­1 , 0% of infectious and recovered newcomers68

Influenza aviaires en Camargueand c = 0 (for more details on c, see online appendix).To identify the role of each transmission route in the observed dynamics, and henceto see if one single transmission route may reproduce the dynamical signature observed inour data, we computed a cross­correlation factor between AIV dynamics and bird populationdynamics. Results highlight that, for our recorded AIV dynamics, a significant crosscorrelationfactor was present and corresponded to a lag of zero (Figure 2A). This means thatAIV dynamics are synchronous with host community dynamics (without any delay). Bothtypes of inter­individual transmission considered in isolation (Figure 2B and 2C) leads to theloss of synchrony between AIV dynamics and host community dynamics, suggesting thatthese transmission routes, in isolation, cannot lead to the dynamical signature recorded in ourstudy site. Figure 2D shows the dynamical signature for a water­borne transmission model. Itis different from those obtained for the inter­individual transmission patterns as maximalcross­correlation is centered on lag of zero. This means that the host community dynamicsdrive the disease transmission (by viral particle production in water and by a high number ofsusceptible individuals) and the environment constitutes a persistent source of infectionthrough time. Thus, each new susceptible bird (either a juvenile or a migrant) may rapidlybecome infectious. This process results in a maximal cross­correlation with no delay betweenhost bird community and disease dynamics.According to these results, the dynamical signature of our disease data seems to becompatible only with a water­borne transmission pattern. This underlines the important roleof water­borne transmission in the processes which drive the dynamics of infection,involving both density­dependent and water­borne transmission components.We then investigated the implications of each transmission route in the model which69

Chapitre IIincludes water­borne and density­dependent transmission on the disease dynamics, with theparameters fitted to the combined waterborne and density dependent model. We removed,step by step, (i) density­dependent transmission and (ii) water­borne transmission, andlooked at the consequences on the dynamics of infections (Figure 3). Removal of densitydependenttransmission leads to high prevalence and the correct dynamic behavior isconserved. In contrast, removal of water­borne transmission leads to an increase ofprevalence from October to May, but at a lower level than predicted with a water­bornetransmission model.DiscussionDensity­dependent transmission is classically assumed for directly­transmitted diseasesdespite some studies showing that frequency­dependent transmission can also explain diseasedata. In this paper, we investigated if these two transmission functions could be involved inAIV. Because these viruses infect mainly waterbirds, and viral particles can persist in waterfor a long period, we also considered water­borne transmission in order to determine the roleof aquatic ecosystems in AIV epidemiology in wild birds.This study highlights that the transmission processes which drive the AIV dynamicsof infection in our study site (Camargue, South of France), involved both a density­dependentand a water­borne transmission component (Figure 1, Table 2). Persistence in water has beensuggested as a possible way of maintaining AIV in wild birds (Wallensten 2007). We indeedsee the importance of aquatic ecosystems in the persistence and transmission of AIV andfurther, our research provides evidence that water­borne transmission drives the dynamics ofinfection in bird communities (Figure 2 and 3).70

Influenza aviaires en CamargueThese results depend both on the bird community dynamics and AIV prevalencerecorded in our study site. AIV prevalence is known to vary not only by region, but also byspecies, in which case differences are likely to be a result of feeding behavior (Garamszegiand Moller 2007). Our mathematical model follows the assumptions that all species have thesame duration of virus excretion, immunity, number of viral particles produced and watercontact rate. More ecological data concerning these aspects are required in order to refinesuch mathematical model. Along the same idea, identifying habitat heterogeneity (e.g.salinity, pH, temperature) is particularly important in order to identify potential hot­spots ofaquatic transmission risks. We are also aware that our model simplify the impacts of birdmigrations in term of introduction and dispersion of influenza viruses. It seems plausible thatmigrations may explain alone the observed disease dynamics. However, investigations ofsuch aspects would require precise dataset concerning birds movements, according to thespecies and periods of the year. Our results highlight that disease dynamics may however notbe driven only by immigration and emigration rates of infected birds.The recent spread of the HP H5N1 AIV is a matter of concern for public healthauthorities. Despite the fact that the relative contribution of wild water birds in the spread ofthe disease remains controversial (Gauthier­Clerc et al. 2007), the dynamics and pathways ofvirus dispersion has started to become clearer (Kilpatrick et al. 2006). Recent studiesreporting the effects of wild bird infections with HP H5N1 AIV highlighted that the virusreplicates (and for a longer time) in the host bird trachea rather than in the digestive tract(Sturm­Ramirez et al. 2005; Brown et al. 2006; Keawcharoen et al. 2008) suggesting thatairborne transmission may be more significant for HP than for LP AIV. In artificialconditions (i.e. intensive farming), HP AIV are likely to be transmitted by density­ or71

Chapitre IIfrequency­ dependent mechanisms, because of the confined environment and high contactrate among bird. Nevertheless, in natural conditions, the mechanistic acquisition of AIV inwater is probably similar both for LP and HP AIV. Brown et al. (2007a) recently providedevidence that HP H5N1 does not persist as long as LP AIV in water, at least underexperimental conditions. Because the persistence of viral particles into water seems to be thekey parameter of AIV dynamics in wild birds, these results are of primarily importance inunderstanding HP persistence in aquatic ecosystems.Water­borne transmission could be a major determinant in the epidemiology of AIV.Increased persistence of multiple strains concurrently in the environment is likely to translateinto an increased risk of infection for animals and humans, but could also enhance theprobability of host co­infection and viral re­assortment (Spackman et al. 2005). Thisunderlines the potential role of the environment for AIV emergence and dispersion, and theurgent need of a thorough consideration of ecological factors to properly assess the risk ofemerging infectious diseases.AcknowledgementsWe sincerely acknowledge our two anonymous referees for their very constructive remarkson the previous version of the manuscript. Thanks to Marco Andrello, Roman Biek, HélèneBroutin, Marc Choisy, Guillaume Constantin de Magny, Scott Duke­Sylvester, Elsa Jourdain,Thierry Lefèvre, Andrew Park, Franck Prugnolle, Leslie A. Real and Lance Waller for theirvaluable comments during the preparation of this paper. BR and JFG are supported by theEDEN project (EU grant GOCE­2003­010284 EDEN). CL is supported by a “Tour du Valat /Région Languedoc­Roussillon” PhD fellowship. CMC is supported by a “Centre National de72

Influenza aviaires en Camarguela Recherche Scientifique (CNRS)” post­doctoral fellowship. This publication is cataloguedby the EDEN Steering Committee as EDEN0048 (http://www.eden­fp6project.net/). Thecontents of this publication are the sole responsibility of the authors and don't necessarilyreflect the views of the European Commission. This work was funded by the French “AgenceNationale de la Recherche” (ANR) “Santé­Environnement/Santé au travail”.ReferencesAlexander, D.J., 2000. A review of avian influenza in different bird species. Vet. Microbiol.74, 3­13.Anderson, R.M., May, R.M., 1991. Infectious diseases of humans: Dynamics and control.Oxford: Oxford Science Publications.Berthold, P., 2001. Bird Migration: A General Survey. Oxford: Oxford University Press.Brown, J.D., Stallknecht, D.E., Swayne, D.E., 2008. Experimental infection of swans andgeese with highly pathogenic avian influenza virus (H5N1) of asian lineage. Emerg. Infect.Dis. 14(1), 136­142.Brown, J.D., Stallknecht, D.E., Beck, J.R., Suarez, D.L., Swayne, D.E., 2006. Susceptibilityof North American ducks and gulls to H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses. J.Wild. Dis. 12(11), 1663­1670.Brown, J.D., Stallknecht, D.E., Valeika, S., Swayne, D.E., 2007b. Susceptibility of woodducks to H5N1 highly pathogenic avian influenza virus. J. Wild. Dis. 43(4), 660­667.Brown, J.D., Swayne, D.E., Cooper, R.J., Burns, R.E., Stallknecht, D.E., 2007a. Persistenceof H5 and H7 influenza viruses in water. Avian Dis. 51, 285­289.Codeço, C.T., 2001. Endemic and epidemic dynamics of cholera: the rôle of aquatic73

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Influenza aviaires en CamargueEcology in Health and Disease 19, 122­139.Wallensten, A., Munster, V.J., Latorre­Margalef, N., Brytting, M., Elmberg, J., Fouchier,R.A.M., Fransson, T., Haemig, P.D., Karlsson, M., Lundkvist, A., Osterhauss, ADME,Stervander, M., Waldenström, J., Olsen, B., 2007. Surveillance of influenza A virus inmigratory waterfowl in northern Europe. Emerg. Infect. Dis. 13(3), 404­411.Webster, R.G., Bean, W.J., Gorman, O.T., Chambers, T.M., Kawaoka, Y., 1992. Evolutionand Ecology of Influenza A viruses. Microbiol. Rev. 56, 152­179.Webster, R.G., Yakhno, M., Hinshaw, V.S., Bean, W.J., Murti, K.G., 1978. Intestinalinfluenza: Replication and characterization of influenza viruses in ducks. Virology 84,268­278.77

Chapitre II78

Influenza aviaires en CamargueTable 1 (page précédente) : Parameter values used for estimations.DD FD WDD+W 47.72 (p

Chapitre IIFigure 1: Model outputs for the best estimation of the model on the basis of theepidemiological data. The model which involves water­borne and density­dependenttransmission (black dashed line) shows the better agreements with the data (see also Table2). Dashed red lines are confidence intervals for the observed data. The following parameterswere used (i) density­dependent transmission: = 0.01, (ii) frequency­dependenttransmission: = 100, (iii) water­borne transmission: = 6.73, (iv) continuumtransmission: = 0.9982 and = 273.6289, (v) density­dependent and water­bornetransmission: = 2.85.10­4, = 2.34 and (vi) frequency­dependent and water­bornetransmission: = 100, = 1.27. All these models assume 0% of infectious and recoverednewcomers and c = 0 (see online appendix for more details).80

Influenza aviaires en CamargueFigure 2: Cross­correlation factors (CCF) between disease dynamics and host communitydynamics for the three different transmission processes. A: Field data; B: density­dependenttransmission; C: frequency­dependent transmission; and D: water­borne diseasetransmission. Water­borne transmission shows a maximal cross­correlation centered on a lagof zero and it is the most similar to that obtained from the field data. Inserted plots representbird community dynamics (solid lines) and AIV dynamics predicted (dotted lines).81

Chapitre IIFigure 3: Impact of transmission route removal in the model which involves densitydependentand water­borne transmission. Removal of water­borne transmission ( ω =0) leadsto a lower disease prevalence with a peak in May. Removal of density­dependenttransmission ( β =0) leads to a higher disease persistence than with density­dependenttransmission only. Water­borne transmission in isolation leads to similar dynamic, but lessamplified, as those observed for the model involving both transmission routes (water­borne +density dependent transmission).82

Influenza aviaires en CamargueOnline appendixDisease dataWe collected and tested 2 389 fecal samples from 89 free­living avian species belonging to12 orders. Birds were trapped from September 2005 to July 2006. The presence of avianinfluenza viruses (AIV) was detected by reverse transcription polymerase chain reactionamplification (RT­PCR) targeting the conserved matrix gene segment (Lebarbenchon et al.,2007a,b). Twenty­six samples were positive for AIV (i.e. detection of virus in feces), butnone were found positive for a highly pathogenic (HP) AIV virus. Details concerningsamples collection and molecular analysis were previously published by Lebarbenchon et al.(2007a,b). Figure S1 represents the AIV prevalence in wild birds used in this study.Population dynamics of the whole avian communityOrnithological data (Jourdain et al. 2007, Figure S2) provide the minimal population size foreach species for each month. These population sizes were added up to quantify thepopulation dynamics of the whole community. Within our framework, we assumed that therecorded abundance was reached at the end of the month.We assumed that population fluctuations were only due to birth or death. In fact, thedynamic system is not change either if bird leave the community by migration or by death.However, this assumption may introduce some confusion concerning the entry process. If abird is introduced in the community by migration, as Infectious or Recovered, rather than bybirth, i.e. as Susceptible, this could influence the dynamics of the whole community.83

Chapitre IIDifferent studies within the Mediterranean wild bird populations revealed low prevalences (1to 4%) of AIV infection (De Marco et al. 2004, Lebarbenchon et al. 2007a) but a recentpaper highlighted a higher prevalence (up to 12%) in Northern Europe (Wallensten et al.2007). Hence, the prevalence observed in our study area cannot be due only to a migratoryprocess. The introduction of infectious individuals within our study area should not exceedone percent at most and if we consider one percent of births as Infectious we obtain similarresults for our analysis.The duration of AIV immunity in wild birds is not well known, but we can reasonablyassume that immunity will be mainly subtype­specific and that given the high mutation rateof AIV (Chen and Holmes 2006) immunity escape might occur every year. Thus, immuneprevalence should not be higher than maximal infectious prevalence observed elsewhereduring one season. This leads to include a factor of vaccination rate at “birth”. The analysisof a community with an introduction of thirty percent of immune individuals (suggested byDe Marco et al. 2004) at birth does not change results.Assuming that a population increase leads to no deaths is a very strong hypothesis.However, we tried to add constant birth and death rates to this forced demographic parameter(i.e. b m =b m +c and d m =d m +c). We included into our different scenarios the maximal birdlifespan recorded in the Camargue (c = 20 years­1). Table S1 presents the values of b m andd m .Parameter estimationsFor simulations, we started our model at the disease­free equilibrium (S = N, I = R = B = 0)with one infectious bird. Assuming that transient dynamics go on during ten years we ran our84

Influenza aviaires en Camarguemodel for eleven years and removed the first ten years from our analysis. Results are similarfor a transient length of one hundred and fifty years.We wanted to fit our model against disease data collected for all the transmissionpatterns tested in this study. First, we performed an exploratory fitting to define the mostplausible values. We found = 0.001 for inter­individual density­dependent transmission, = 250 for frequency­dependent transmission, = 5 for water­borne transmission and= and for continuum model. This exploratory fitting allowed us to select thecorrect range of values to be tested.We minimized the negative log­likelihood function between the prevalence ofinfectious individuals for each month from model outputs and prevalence of infectiousindividuals observed in our study area. Thus, we assumed that errors would be normallydistributed (e.g. Turchin and Hanski, 2001; Choisy et al. 2007) with a variance and weminimized:where f m is prevalence observed on the field, o m are prevalence from the model and xrepresents set of parameters. Indeed, we assumed that the field work had been performedduring the maximal disease activity each month. However, if we use the mean or the minimaldisease activity for each month from model outputs, we obtain also similar parameterestimations. We have selected random seed values: 0.0005

Chapitre IIdisease activity. To quantify the weight of each transmission pathway on the others, we alsoestimated transmission parameters for combined transmissions, except for the combinationbetween density and frequency­dependent transmission. To avoid problems of localminimum optimization, we repeated this procedure 100 times. Table 2 in the main textsummarizes these results.BibliographyChen, R., Holmes, E.C., 2006. Avian Influenza virus exhibits rapid evolutionary dynamics.Mol. Biol. Evol. 23, 2336­2341.Choisy, M., Rohani, P., Guégan, J.F., 2007. Mathematical modelling in infectious diseasesdynamics. In: Tibayrenc M, editors. Encyclopedia of Infectious diseases: Modernapproaches. Chichester (USA): Wiley, Sons Ltd.De Marco, M.A., Campitelli, L., Foni, E, Raffini E, Barigazzi G., Delogu, M., Guberti, V.,Di Trani, L., Tollis, M., Donatelli, I., 2004. Influenza surveillance in birds in italian wetlands(1992­1998): is there a host restricted viruses in sympatric ducks and coots. Vet Microbiol.98, 197­208.Turchin, P., Hanski, I., 2001. Contrasting alternative hypotheses about rodent cycles bytranslating them into parameterized models. Ecol. Lett. 4, 267­276.Jourdain, E., Gauthier­Clerc, M., Bicout, D.J., Sabatier, P., 2007. Bird migration routes andrisk for pathogen dispersion into Western mediterranean wetlands. Emerg. Infect. Dis. 13,365­372.Lebarbenchon, C., Chang, C.M., van der Werf, S., Aubin, J.T., Kayser, Y., Ballesteros, M.,Renaud, F., Thomas, F., Gauthier­Clerc, M., 2007b. Influenza A virus in birds during spring86

Influenza aviaires en Camarguemigration in the Camargue, France. J. Wild. Dis. 43, 789­793.Lebarbenchon, C., van der Werf, S., Thomas, F., Aubin, J.T., Azebi, S., Cuvelier, F., Jeannin,P., Roca V., Chang, C.M., Kayser, Y., Roche B., Guégan, J.F., Renaud, F. and Gauthier­Clerc,M., 2007a. Absence of detection of highly pathogenic H5N1 in migratory waterfowl inSouthern France in 2005­2007. Infect. Genet. Evol. 7, 604­608.Wallensten, A., Munster, V.J., Latorre­Margalef, N., Brytting, M., Elmberg, J., Fouchier,R.A.M., Franson, T., Haemig, P.D., Karlsson, M., Lundkvist, A., Osterhaus, A.D.M.E.,Stervander, M., Waldenström, J., Olsen, B., 2007. Surveillance of Influenza A virus inmigratory waterfowl in Northern Europe. Emerg Infect Dis. 13, 404­411.87

Chapitre IITable S1: Demographic parameters used in the model.88

Influenza aviaires en CamargueFigure S1: Influenza A virus prevalence in wild birds in the Camargue (South of France)between September 2005 and July 2006.89

Chapitre IIFigure S2: Population dynamics of bird community yearly present in the Camargue.90

CHAPITRE III:ÉMERGENCE DU VIRUS H5N1HAUTEMENT PATHOGÈNE

Émergence du virus H5N1 hautement pathogèneChapitre III: Émergence du virus H5N1 hautement pathogène.Les oiseaux domestiques sont victimes d'épizooties récurrentes dues à des virus influenzaaviaires hautement pathogènes (HP), généralement limitées à des zones très localisées maisresponsables de forts taux de mortalités et de pertes économiques importantes (Swayne &Suarez 2000). La forme HP du virus H5N1 circulant actuellement en Asie du sud­est a étédétectée pour la première fois en 1996 dans la province du Guangdong, en Chine, sur une oiedomestique (Xu et al. 1999). En 1997, plusieurs cas de transmission directe entre oiseau ethomme sont apparus à Hong­Kong, causant la mort de 6 personnes. Le virus responsable decet événement était issu de réassortiments entre le virus H5N1 HP détecté en 1996 et lesvirus H9N2 et H6N1 qui circulaient dans les élevages de cailles dans cette même région(Guan et al. 1999; Hoffmann et al. 2000). A partir de 2000, d'autres échanges génétiques onteu lieu entre virus circulants au sein des élevages d'oiseaux domestiques et ont conduit àl'apparition de plusieurs lignées génétiques (i.e. génotypes) de H5N1 HP (Peiris et al. 2007pour synthèse).Depuis 1996, 387 cas d'infections humaines (Tableau 2) ont été recensés,principalement en Asie du sud­est (Indonésie et Vietnam) mais également au Moyen Orient(Egypte et Turquie) et en Afrique (Nigéria). La circulation endémique de ce virus, coupléeau nombre de cas croissant de transmission entre oiseau et homme, entraînent un risqued'émergence d'un nouveau virus influenza qui pourrait être responsable d'une pandémiegrippale chez l'homme à l'échelle mondiale (W.H.O. 2005; Chen et al. 2006a). A ce jour, lescas de transmissions inter­humaines de virus H5N1 restent limités et très discutés (e.g.Ungchusak et al. 2005; Yang et al. 2007). Un réassortiment entre un virus aviaire H5N1 et unvirus influenza humain (H1N1 ou H3N2) semble donc nécessaire à l'apparition d'unenouvelle forme virale qui pourrait se transmettre efficacement et rapidement au sein despopulations humaines, tout comme l'ont été les virus à l'origine des pandémies de 1957, 1968et probablement 1918 (Horimoto & Kawaoka 2005; Taubenberger et al. 2005; Kilbourne2006).Beaucoup d'études portent aujourd'hui sur les bases génétiques de la virulence duvirus H5N1 HP, sur les effets physio­pathologiques sur l'hôte ainsi que sur l'évolution du91

Chapitre IIIgénome de ces virus à l'échelle mondiale. Les études portant sur les conditionsenvironnementales nécessaires à l'émergence de tels virus sont beaucoup moins nombreuses.Dans ce chapitre je traiterai du rôle des oiseaux sauvages dans la propagation du virus H5N1HP depuis l'Asie du sud­est vers l'Europe et l'Afrique, et plus généralement, des conditionsécologiques favorisant l'émergence et la persistance de tels virus.Tableau 2. Nombre de cas d'infection et de mortalité liées au H5N1 hautement pathogène 8 .1. Le virus H5N1 HP chez les oiseaux sauvages.Contrairement aux oiseaux domestiques, les oiseaux sauvages sont rarement concernés pardes infections liées aux virus hautement pathogènes. En effet, avant 1996, seule uneépidémie liée à ces virus a été documentée au sein de la faune sauvage, entraînant la mortd'environ 1 300 sternes pierregarin (Sterna hirundo) en Afrique du Sud (Becker 1961).Depuis cette date, l'apparition et la propagation des lignées asiatique du virus H5N1 HP a été8 O.M.S: http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/en/index.html (10 septembre 2008).92

Émergence du virus H5N1 hautement pathogèneresponsable de la mort de plusieurs dizaines de milliers d'oiseaux sauvages, parfois lorsd'épisodes de mortalités massives (e.g. oies à têtes barrées – Anser indicus – sur le lacQuinghai, en Chine; Liu et al. 2005; Butler 2006; Chen et al. 2006b). La détection de virusHP chez les oiseaux sauvages vivant reste cependant un événement rare, qu'il s'agisse duvirus H5N1 (Chen et al. 2006a) ou d'autres sous­types HP (Gaidet et al. 2008). En effet, lesrécentes études qui se sont intéressées à la circulation de virus influenza aviaires dans lespopulations sauvages, (Gaidet et al. 2007; Wallensten et al. 2007; Article 3 et 7) confirmentle fait que les oiseaux sauvages ne font pas office de réservoirs naturels de ces virus, mêmedans les zones où le H5N1 HP est endémique chez les oiseaux domestiques (Chen et al.2006a).Quel est le rôle des oiseaux migrateurs dans la propagation du virus H5N1 HP ? Dansl'Article 6 nous présentons une revue critique sur le phénomène de dispersion de ce virus en2005­2006. Ce travail met notamment en avant le rôle partagé des activités humaines dans lapropagation du virus depuis l'Asie du sud­est vers l'Europe et l'Afrique.2. Introduction et circulation du virus H5N1 HP en Camargue.Durant l'automne 2005, la forme HP du virus H5N1 s'est donc propagée rapidement depuisl'Asie vers l'Europe de l'ouest. Du fait de nombreux cas de mortalité d'oiseaux sauvagespendant cette période, les oiseaux migrateurs ont été considérés comme les principaux agentsde dispersion du virus à une échelle intercontinentale. La Camargue fait office de zoned'hivernage pour de nombreuses espèces de canards de la zone Paléarctique et, de ce fait, estreconnue comme un véritable point­chaud d'introduction et de transmission de pathogènesaviaires (Jourdain et al. 2007a). Dans l'Article 7, par le biais d'analyses moléculaires et derecensements des tailles de populations d'oiseaux, nous avons analysé la possibleintroduction et circulation du H5N1 HP en Camargue. Sur les 1345 oiseaux analysés, aucunne s'est avéré positif à ce virus. Par ailleurs, le recensement des principales espèces decanards hivernants n'a pas révélé de diminution anormale de tailles de populations, et aucontraire, souligne l'augmentation de certaines comme le Canard colvert et la Sarcelled'hiver. Nous discutons, à la lumière de ces résultats, de l'implication des canards sauvages93

Chapitre IIImigrateurs dans l'arrivée du virus H5N1 HP en Europe.3. Persistance des virus hautement pathogènes dans les écosystèmes naturels.Quelques études ont récemment porté sur les facteurs environnementaux ayant contribué à lapropagation du virus H5N1 HP à partir, et au sein, de l'Asie du sud­est (Kilkpatrick et al.2006; Gilbert et al. 2006, 2008; Fang et al. 2008). Les connaissances générales sur lesmécanismes d'émergence et de persistance de formes HP dans les populations sauvagesrestent cependant très limitées. Du fait de différences écologiques entre les conditionsnaturelles (oiseaux sauvages) et artificielles (e.g. élevage intensif de volailles) dans lesquellesles virus influenza évoluent, des processus de spécialisation peuvent apparaître et sontsusceptibles de conduire à des niveaux de virulence différents. Dans l'Article 8 nousdiscutons de ces aspects et mettons en valeur l'importance de l'étude des pathogènes àl'échelle des écosystèmes.94

Émergence du virus H5N1 hautement pathogèneArticle 6:Gauthier­Clerc M., Lebarbenchon C. & Thomas F. 2007. Recent expansion ofhighly pathogenic avian influenza H5N1: a critical review. Ibis 149(2): 202­214.95

Chapitre III96

Émergence du virus H5N1 hautement pathogène97

Chapitre III98

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Chapitre III108

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Chapitre III110

Émergence du virus H5N1 hautement pathogèneArticle 7:Lebarbenchon C., van der Werf S., Thomas F., Aubin J­T., Azebi S.,Cuvelier F., Jeannin P., Roca V., Chang C­M., Kayser Y., Roche B.,Guégan J­F., Renaud F. & Gauthier­Clerc M. 2007. Absence of detection ofhighly pathogenic H5N1 in migratory waterfowl in southern Francein 2005–2006. Infection, Genetics and Evolution 7(5): 604­608.111

Chapitre III112

Émergence du virus H5N1 hautement pathogène113

Chapitre III114

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Chapitre III116

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Chapitre III118

Émergence du virus H5N1 hautement pathogèneArticle 8:Lebarbenchon C., Feare CJ., Renaud F., Thomas F. & Gauthier­Clerc M.Why highly pathogenic avian influenza viruses do not persist in naturalecosystems. Soumis à BMC Infectious Diseases.119

Chapitre III120

Émergence du virus H5N1 hautement pathogèneDebateWhy highly pathogenic avian influenza viruses do not persist in natural ecosystemsCamille Lebarbenchon* 1,2 , Chris J Feare 3 , François Renaud 2 , Frédéric Thomas 2,4 and MichelGauthier­Clerc 1Addresses: 1 Centre de recherche de la Tour du Valat, Le Sambuc, 13200 Arles, France; 2GEMI, UMR CNRS/IRD 2724, IRD, 911 avenue Agropolis BP 64501, 34394 Montpelliercedex 5, France; 3 WildWings Bird Management, 2 North View Cottages, GrayswoodCommon, Haslemere, Surrey GU27 2DN, United Kingdom; 4 Institut de recherche enbiologie végétale, Département de sciences biologiques, Université de Montréal, 4101, rueSherbrooke est Montréal (Québec), Canada H1X 2B2.Email: Camille.Lebarbenchon@mpl.ird.fr, feare_wildwings@msn.com,Francois.Renaud@mpl.ird.fr, Frederic.Thomas@mpl.ird.fr, gauthier­clerc@tourduvalat.org* Corresponding author121

Chapitre IIIAbstractBackground: Since its detection in 1996, the highly pathogenic (HP) H5N1 avian influenzavirus (AIV) has led to a proliferation of studies, mostly focused on pathogenicity, the geneticbasis of virulence and the evolution of the subtype's genome. Our understanding ofecological factors which favor the emergence and maintenance of such HP viruses is howeverstill limited. Recent surveillance of wild populations in fact reported a virtual absence of HPH5N1, or insignificant levels of circulation, even in south­eastern Asia where the virus isnow endemic in domestic birds.Discussion: While low pathogenic (LP) AIV persist and evolve in wild populations, HP AIVevolve in domestic birds, where they can cause economically serious epizootics that onlyoccasionally spill back into wild populations, generally causing high mortality in infectedbirds. Here, we argue that evolutionary ecology considerations can explain this apparentparadox. Host structure (e.g. density, inter­ and intra­species genetic diversity) andtransmission possibilities differ considerably between wild and domestic birds and are likelyto be the main determinants of virulence selection. Because viral fitness is highly dependentof host survival and dispersion in nature, it is unlikely that virulent forms will persist in wildpopulations if they kill hosts quickly and/or affect host predation risk or migratoryperformance. Finally, virus shedding (excretion via oropharyngeal versus fecal routes) andviral persistence in water suggest differential transmission strategies between low and highlypathogenic AIV.Summary: Human activities artificially shape AIV evolutionary ecology and select for traits(high virulence, host specialisation, etc.) that confer optimal fitness under artificialconditions. Prediction and control of AIV emergence urgently need to consider host ecology122

Émergence du virus H5N1 hautement pathogèneand ecosystem characteristics (natural or linked with human activities) in which these virusesevolve.BackgroundWild birds, and especially waterbirds in the Anseriformes (ducks, geese and swans) andCharadriiformes (gulls, terns, waders) orders, are natural hosts for influenza A (or avianinfluenza) viruses [1, 2]. Avian influenza viruses (AIV) are classified on the basis of genetic,antigenic and structural characteristics of the hemagglutinin and the neuraminidase proteins,respectively involved in the binding of the virus to host cells and the release of new virionsfrom them. Currently, 16 HA (H1­H16) and 9 NA (N1­N9) have been described. For AIV ofsubtypes H5 and H7, two forms of virulence exist: low pathogenic (LP) AIV, generallyconsidered to produce benign respiratory and/or intestinal tract infections, and highlypathogenic (HP) AIV generally responsible of multi­organ systemic infections.Low pathogenic AIV naturally infect wild aquatic birds according to host species,age, immune status, feeding behaviour, pre­migration aggregation and aquatic survival of thevirus [3, 4, 5]. Long term studies performed in Europe and Northern America also revealedsignificant seasonal variation in LP AIV infection rates and circulating subtypes [6, 7].The switch from a LP to a HP AIV phenotype is mainly achieved by the introductionof basic amino acid residues into the HA cleavage site, which facilitates systemic virusreplication. This switch normally occurs within poultry after the introduction of LP AIV H5and H7 viruses, presumably from wild birds or contact with their derivatives [8, 9], and wasdemonstrated experimentally by Ito et al. [10].Since 1955 (and presumably before the virus was characterised), domestic birds have123

Chapitre IIIbeen victims of recurrent outbreaks due to HP AIV [11], generally limited to localised areasbut responsible for high mortality and substantial economic losses. By contrast, wild birdshave rarely been involved in HP AIV infections. Before 1996, only one HP AIV outbreak wasdocumented in the wild, leading to the death of c. 1 300 common terns (Sterna hirundo) insouth Africa [12]. Since that date, the emergence and the spread of the Asiatic lineage HPH5N1, first discovered in domestic geese in southern China in 1996, has been responsible forthe death of more than ten thousand wild birds, sometimes through mass mortality events(e.g. lake Quinghai, China, in May­June 2005; [13 ­ 15]). Detection of HP H5N1 in freelivingwild birds remains however a rare event. Extensive surveillance of wild populationshas failed to detect this subtype [7, 16 ­ 18], even in areas where the virus is endemic indomestic birds [19, 20]. The few reports of asymptomatic infection by HP H5N1 in healthy,free­living wild birds lack important substantiating information [21] and such cases ofinfection have yet to be convincinly demonstrated.Although some recent studies have focused on environmental factors that contributedto the spread of HP H5N1 from (and within) south­eastern Asia to Europe and Africa [e.g.22 ­ 24], our general knowledge concerning mechanisms of emergence and persistence of HPforms is still limited. Here, we argue that because the ecological landscape in which AIVevolve is totally different between natural (i.e. wild birds) and artificial conditions (e.g.intensive poultry farming or free grazing ducks), specialization processes occur. Thesephenomena, whose directions are predictable from an evolutionary ecology perspective, arelikely to explain both virulence heterogeneity among AIV and why HP forms do notnaturally emerge or persist in natural ecosystems.124

Émergence du virus H5N1 hautement pathogèneDiscussionTechnological and cultural changes in human populations open new ecological niches forpathogens and inevitably influence their evolution [e.g. 25, 26]. In many host­pathogeninteractions, evolution toward an optimal virulence is likely to occur more or less rapidlyafter successful introduction into a new host species [27]. LP forms of AIV naturallycirculating in wild aquatic birds may indeed become highly pathogenic (at least for H5 andH7 subtypes), after introduction into domestic birds [e.g. 28]. Virulence evolution does notsolely result from this host species switch but is probably driven by a larger set of ecologicalconstraints encountered in artificial ecosystems, such as poultry farming, especially whenintensive, or free grazing duck production (Figure 1). It is thus likely that LP and HP AIV areadapted respectively to natural and artificial ecosystems in which they face differentecological constraints such as host population structure or host species genetic diversity.Natural selectionThe avian influenza virus genome is composed of eight segments of negative singlestranded RNA, coding for 11 proteins [29]. Replication by these viruses is termed "lowfidelity" since RNA mutations lead to a wide diversity of genetic variations in progenyresulting in imprecision in the replication processes [1, 30, 31]. Genetic reassortmentbetween segments of different viruses frequently occurs when host cell is co­infected, and islikely to be an efficient way for rapid evolution and emergence of new AIV in the wild [32,33].The imprecision inherent in AIV replication, combined with the high level of genomereassortment, generates a lot of genetic variants (in terms of gene composition and segment125

Chapitre IIIcombinations). Many variants will not be viable but on those that do survive to enter newhosts, selection will act during many stages of the infection process, within both environmentand host, offering a wide range of selection pressures in natural ecosystems. Under theconditions in which domestic birds are maintained, on the other hand, the range of hostspecies available for infection is considerably reduced but galliform birds, in addition towaterfowl, are readily available. Poultry host density is often considerably higher than thevirus would encounter in the wild, age structure is generally more uniform andenvironmental conditions are frequently kept more constant. In addition, wider opportunitiesfor viral transmission exist in the form of multiple physical transport mechanisms for bothliving poultry and their products. The latter include feces, feathers and meat, and physicaltransport can include cages, packaging, farm workers and their clothes, and vehicles used onfarm and over long distances. Under these circumstances, selection pressures differ greatlyfrom those encountered by the virus in their natural, primarily aquatic, ecosystems. AIVstrains that have evolved to survive under these domestic conditions are highly likely to bemal­adapted to natural ecosystems and hosts. In particular, HP AIV, which often demonstratehigh and rapid lethality in their hosts, evolve reliance on a high and sustained host contactrate that is rare under natural conditions.HP AIV H5N1 infections in wild birds appear to retain their high virulence, leadingto infections in such birds being discovered almost entirely in sick or dead birds.Significantly, there have been no reported instances of LP AIV H5N1 viruses showinggenetic affinities to the Asiatic lineage H5N1 following outbreaks of the latter in wild birds.Although there have been examples of mutual host­pathogen co­evolution when new highlyvirulent viruses enter new wild hosts, e.g. the amelioration of myxomatosis virulence in wild126

Émergence du virus H5N1 hautement pathogènerabbit (Oryctolagus cuniculus) populations [34, 35], there is no indication that this happenswhen HP H5N1 gains access to wild bird populations.Host diversityThe influence of host population structure in selection for virulence is often critical [e.g. 36].Levels of virulence are determined by and proportional to the frequency with which interhost transmission opportunities arise. Low virulence is typically selected for when host­hostcontacts are infrequent, while high virulence can be selected only when the host contact rateis high [37]. In wild bird populations, contact rates between individuals differ markedlybetween seasons (e.g. reproductive period, migration, wintering), species (e.g. colonialbirds), age, etc. For instance, high bird densities are reached by some species in moulting andwintering areas. These yearly aggregations do not, however, lead to the selection andemergence of HP AIV [e.g. 3, 17]. Compared to wild conditions, host densities in farmingconditions are not only high (even extreme under intensive poultry production), butconsistently so, which may be a major determinant for the selection of high virulence.Networks of poultry production are also likely to favor the persistence of virulent strains,with continuous circulation of AIV between connected markets. Such networks probablyfavor the endemicity of HP H5N1 today in south­eastern Asia [24].In the wild, in addition to variable host contact, and thus transmission, rates, AIVencounter high host species diversity, as in multi­species waterfowl aggregations. The mostefficient transmission strategy in this context is to be a generalist pathogen in order to be ableto infect a large spectrum of host species [e.g. 38, 39], thereby maximizing replication anddispersal opportunities. LP AIV have been isolated from at least 105 bird species of 26127

Chapitre IIIdifferent families [2], suggesting that they are indeed able to infect a large diversity of hostspecies. Under farming conditions, the low (sometimes null) host species diversity is likely toselect for species­specific and/or ecosystem­specific pathogens. Recently, some studiesinvestigated species­related variation in susceptibility (from ducks to passerine birds) andclinical signs generated by an infection with HP H5N1 [40 ­ 42]. Among the bird speciesartificially challenged with the virus, some laboratory­maintained Mallard (Anasplatyrhynchos) presented viral excretion for long periods without clinical or pathologicevidence of debilitating disease [41 ­ 44]. Such results highlighted that, for some HP H5N1AIV strains, high host­pathogen specificity is probably already acquired or at least selectedfor. This rapid evolution of host specificity is believed to have contributed to the spread andendemicity of HP H5N1 in Asia, through domestic ducks [43 ­ 45].Similarly, LP AIV must evolve in the face of intra­specific variability betweenindividuals of a host population. In the wild, immune response is variable among birds of thesame species, depending on their genetic backgrounds, age, activities such as breeding,moult and migration, health status and previous infections with pathogens and other parasites[e.g. 46, 47]. Low pathogenic AIV must be adapted to this diversity in wild birds. Undermany modern farming conditions, on the other hand, potential hosts have low geneticdiversity, highly structured age distribution and are regularly protected from pathogensthrough vaccination and antibiotics. Here again, such artificial conditions, with poor interindividualdiversity, are likely to select for specialist pathogens. Current knowledge on theeffects of intra­specific diversity on AIV evolution is limited to extrapolations fromexperimental studies. These experimental conditions however do not reflect intra­speciesdiversity encountered in the wild and avoid detection of potential individual variation in128

Émergence du virus H5N1 hautement pathogèneresponse to AIV infection, according to host life history traits.Should I kill my host?AIV infection in wild birds may also indirectly lead to host death via predation. In manyhost­pathogen associations, the pathology related to the infection leads to an overallweakening of infected individuals. Given that predators sometimes prey preferentially on sickindividuals, differential susceptibility between several host species (or individuals) can leadto greater predation on the more susceptible ones [48]. Recent studies reported clear effectsof LP AIV infection on food uptake and migratory competence [49], suggesting that hostbehavior may be affected by LP AIV viruses in subtle ways not previously envisaged. Suchphysiological or behavioral effects may decrease host anti­predator performance, favorpredation on infected birds and thus decrease AIV transmission among target hosts of thepathogen (but can lead to infections among predators and scavengers, as seen with Asiaticlineage HP AIV H5N1). Under this scenario, viruses that induce strong physiological effects,even if they do not directly lead to death, are unlikely to be selected in wild populations.Investigations on differential predation rates on AIV­infected wild bird species, consideringthe effects of the infection itself, but also differences in behaviour induced by infection, arecritically lacking.Pathogen distributions and abundances in the environment can alter the decisionshosts make with regard to whether to stay and resist or to disperse from one place to another[50]. Pathogen transmission and dispersal are intricately linked, and it is widelyacknowledged that pathogens may benefit from investing in dispersal strategies. AIVdispersal is poorly documented in natural conditions. Van Gils et al. [49] however recently129

Chapitre IIIreported, in Bewick's swans (Cygnus columbianus bewickii) infected with LP AIV, analteration of foraging and migration efficiencies. For HP AIV, the current knowledge ofpotential virus dispersion through migration is limited to extrapolations from experiments oncaptive­reared ducks performed under laboratory conditions [42]. These birds are thus notsubjected to sustained high energy expenditure and unlikely to experienceimmunosuppression, for which there is increasing evidence in birds undertaking migration[51]. While infected birds might be able to transmit virus over short distances (e.g. duringcold weather periods) [22, 52], more realistic experiments, using birds subjected tophysiological stresses associated with migration, are needed to determine their capacity tospread virus over long distances during seasonal migration.Life outside the hostThe transmission of LP AIV among wild waterbirds is considered to be mainly via the fecaloralroute, with virus particles excreted from infected birds directly into water in feces fromthe digestive system, and contracted by potential hosts by ingestion of the virions in the water[53 ­ 55]. Recent studies have highlighted that HP AIV H5N1 replicates more (and for longerperiods) in the host bird trachea rather than in the digestive tract [41, 42, 44]. Wild swans thathad died following HP AIV H5N1 infection revealed no virus in fecal samples, suggestinglimited cloacal shedding [56], but severe lung congestion and alveolar and bronchiolaredema, together with virus isolation from tracheal swabs, suggested oropharyngeal excretionhad occurred [57]. Preponderance of oropharyngeal excretion is associated with the systemicinfections caused by HP AIV, in contrast to the propensity for cloacal virus excretionassociated with digestive tract infections of LP AIV. Oropharyngeal and fecal excretion thusrepresent two different strategies that may be selected according to ecosystem characteristics.130

Émergence du virus H5N1 hautement pathogèneProduction of viral particles in aerosols is probably the most efficient transmission strategyin confined environments with high densities of birds, such as under intensive farmingconditions [58], leading to selection for systemic infection in these circumstances.While AIV persistence in water appears to be the natural mechanism to maintain andtransmit influenza viruses in wild bird populations, Brown et al. [55] recently found that HPH5N1 does not persist as long as LP AIV in water, at least under experimental conditions.HP AIV are thus potentially less adapted to survive in aquatic ecosystems, suggesting thatalternative forms of transmission, such as aerosol dispersal and inhalation, may have beenselected for these subtypes.AIV in a man­made worldConnectivity in modern human populations, through transportation, has undoubtedlyincreased during the last century. On theoretical grounds, Boots and Sasaki [59] providedevidence that these increasing connections may boost emergence risks of virulent diseases.The past two decades have seen a huge increase in poultry production and associated nationaland international trade in south­east Asia [60]. After adapting to intensive farming processes,AIV hitch­hike human transportation (both deliberate and accidental) to spreadintercontinentally among poultry populations. This appears to be the most likely scenario forthe spread of HP H5N1 from Asia to Europe and Africa, in which the poultry trade (legal,unregulated and illegal) seems to have been the predominant mechanism [61].Human activities thus artificially shape AIV evolutionary ecology and select for traits(e.g. virulence, oropharyngeal excretion, host specialisation, etc.) that confer optimal fitness131

Chapitre IIIunder the artificial conditions of intensive poultry production and dispersal. Evolution of thishost­pathogen system, created by humans, may represent one of the main threats for humanhealth. Thanks to a growing number of studies focused on genetic characteristics of AIV, weare aware of the mechanistic basis of high pathogenesis. Our desire to predict and control ofAIV emergence through this complex host­pathogen system must, however, consider hostecology and ecosystem characteristics (natural or linked with human activities) in whichtheses viruses evolve.If the application of evolutionary theory to medical sciences allows a predictiveframework for long­term host­pathogen interactions, it also provides interesting possibilitiesfor the design of medical and public health protection measures [e.g. 62 ­ 63]. Integration ofecological and evolutionary theory in epidemiology and human diseases is of growinginterest [e.g. 64 ­ 65]. While they can provide useful information for long­term diseasemanagement, for AIV such approaches and their possible applications are unfortunatelycritically lacking. Do we have to favor developments of poorly diversified farming conditionswith high densities of genetically impoverished birds? What are the long­term effects ofmass vaccination? Can we avoid virus exchanges between wild and domestic birds? It is clearthat answering such key questions first requires sound understanding of natural mechanismsof virulence selection and, from that knowledge, takes account of ecological features thatmay select for HP AIV in artificial ecosystems.SummaryDetection of HP AIV in wild living birds is a rare event, suggesting that emergenceand persistence of such virulent forms in nature remain infrequent.132

Émergence du virus H5N1 hautement pathogèneHost structure (e.g. density, inter­ and intra­species genetic diversity) differconsiderably between wild and domestic birds and is likely to be the maindeterminant of virulence selection.Virus fitness is highly dependent on host survival and dispersion in nature, and it isthus unlikely that virulent forms will persist in wild populations if they kill quickly,increase predation risk or compromise migratory performance.Prediction and control of AIV emergence urgently need to consider host ecology andecosystem characteristics (natural or linked with human activities) in which theseviruses evolve.Competing interestsThe authors declare that they have no competing interests.Authors' contributionsCL reviewed the literature and drafted the manuscript. CJF, FR, FT and MGC revised andimproved the discussion. All authors have read and approved the final manuscript.AcknowledgmentsWe sincerely acknowledge Muriel Dietrich, Thierry Lefèvre and Benjamin Roche for theirvaluable comments during the preparation of this manuscript. Camille Lebarbenchon issupported by a “Centre de Recherches de la Tour du Valat / Région Languedoc­Roussillon”PhD fellowship. This work was funded by the French “Agence Nationale de la Recherche”(ANR) “Santé­Environnement/Santé au travail”, the “European Union's Framework Program133

Chapitre IIIfor Research and Technological Development (FP6)” and the “Région Provence­Alpes­Côted'Azur”. We also thanks the “Institut de Recherches pour le Développement (IRD)” and the“Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)” for their financial support.References1. Webster RG, Bean WJ, Gorman OT, Chambers TM, Kawaoka Y: Evolution and Ecologyof influenza A viruses. Microbiol Rev 1992, 56:152­179.2. Olsen B, Munster VJ, Wallensten A, Waldenström J, Osterhaus ADME, FouchierRAM: Global patterns of influenza A virus in wild birds. Science 2006,312:384­388.3. De Marco MA, Campitelli L, Foni E, Raffini E, Barigazzi G, Delogu M, Guberti V, DiTrani L, Tollis M, Donatelli I: Influenza surveillance in birds in Italian wetlands(1992­1998): is there a host restricted circulation of influenza viruses in sympatricducks and coots? Vet Microbiol 2004, 98:197­208.4. Munster VJ, Baas C, Lexmond P, Waldenström J, Wallensten A, Fransson T,Rimmelzwaan GF, Beyer WEP, Schutten M, Olsen B, Osterhaus ADME, Fouchier RAM:Spatial, temporal and species variation in prevalence of influenza A viruses in wildmigratory birds. PLoS Path 2007, 3:e61.5. Garamszegi LZ, Møller AP: Prevalence of avian influenza and host ecology. Proc RSoc Lond B. 2007, 274:2003­12.6. Krauss S, Walker D, Pryor SP, Niles L, Chenghong L, Hinshaw VS, Webster R: InfluenzaA viruses of migrating wild aquatic birds in North America. Vect B Zoon Dis 2004,4:177­189.134

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Émergence du virus H5N1 hautement pathogèneFigure 1: Natural versus artificial ecosystems: different ecological constraints for avianinfluenza viruses evolution?143

Chapitre III144

DISCUSSION GÉNÉRALEET PERSPECTIVES

Discussion générale et perspectivesDiscussion générale et perspectives.1. Écologie des virus influenza aviaires.Étudier l'écologie des virus influenza aviaires en Camargue est un projet extrêmement délicatà mettre en place de part la lourdeur de l'échantillonnage (i.e. capture d'oiseaux sauvages) etdes analyses moléculaires et virologiques nécessaires pour avoir des informations de base surces virus (i.e. faibles prévalences et sous­type). Cette thèse a permis d'apporter les premièresinformations sur la circulation de ces virus au sein de l'avifaune sauvage en Camargue. Lesrésultats génèrent cependant de nouvelles questions et permettent d'envisager de nombreuxaxes de recherches dans le futur.1.1. Dynamique temporelle d'infection.L'étude des virus influenza en Camargue a permis d'accroître nos connaissances sur lacyclicité des prévalences d'infections d'une large diversité d'espèces d'oiseaux sauvages. Nosrésultats mettent clairement en évidence un effet de la saison et de l'espèce sur cetteprévalence. D'autres travaux réalisés en Europe ont montré des patrons similaires d'infection,dépendant également de l'espèce étudiée et de la période de l'année (e.g. De Marco et al.2004; Munster et al. 2007; Wallensten et al. 2007). En Camargue, il apparaît nettement queles canards du genre Anas font office de réservoir naturel de ces virus et que le début del'automne (septembre) est la période où ces oiseaux sont le plus infectés. Il semble égalementque les sarcelles d'été (Anas querquedula) jouent un rôle majeur dans l'épidémiologie de cesvirus de par leurs fortes prévalences d'infection. Ce résultat nécessite des investigations plusapprofondies étant donné le faible échantillonnage pour cette espèce d'oiseaux, et s'avèreparticulièrement intéressant compte tenu de leur passage migratoire post­nuptial enCamargue plus tôt que les autres espèces de canards (Blondel & Isenmann 1981).Afin de comprendre de manière plus globale les cycles épidémiologiques liés à cesvirus en Camargue, la recherche d'oiseaux infectés couplée avec une étude d'immunoécologie,permettrait de mesurer la dynamique temporelle de séro­conversion (i.e.145

Discussion générale et perspectivesdéveloppement d'anticorps spécifiques des sous­types circulants). Certaines études ontmontré des taux de séro­prévalences particulièrement élevés et différents selon les espècesétudiées (De Marco et al. 2004). En Camargue, il est probable que l'évolution du nombred'animaux possédant ces anticorps soit inversement proportionnelle à la prévalence d'oiseauxinfectés au cours de l'hiver. Il serait également intéressant de voir si des mécanismesd'immunité croisée permettent aux canards d'être résistants à plusieurs souches circulantdurant la même saison. De nombreuses axes de recherches sont envisageables sur ces aspectset apporteront sans aucun doute des informations importantes concernant la dynamiquetemporelle d'infection par les virus influenza aviaires, chez les canards hivernant enCamargue.Concernant des aspects plus méthodologiques, l'amélioration des méthodes dedétection des virus et la mise au point de protocoles standardisés pour le typage viral parqRT­PCR a permis d'accroître considérablement la qualité des analyses. Un certain nombred'incertitudes concernant les résultats de ce travail sont cependant à énoncer. Il est parexemple probable que de nombreux virus n'aient pas été détectés du fait de la mauvaisequalité du prélèvement (e.g. charge virale trop faible dans l'échantillon due à un prélèvementréalisé en début ou fin de période d'excrétion, présence d'inhibiteurs de PCR). Les méthodesayant évolué au cours des trois années d'études, la sensibilité n'a pas été la même entre lestrois saisons d'hivernage et rend difficile l'interprétation des différences de prévalencesmesurées. De nombreuses questions et approches expérimentales pourraient également êtreapprofondies dans ce domaine afin d'apporter, à plus large échelle, des informations sur lesméthodes permettant de détecter et caractériser les virus influenza aviaires dans lespopulations naturelles de manière optimale. La caractérisation, dans les fèces, d'inhibiteurspotentiels (e.g. bactéries) des réaction de PCR et la détermination d'une quantité minimale defientes nécessaire pour détecter la présence du virus chez un individu infecté sont parexemple des aspects qu'il serait intéressant d'étudier.1.2. Détection de virus chez les laro­limicoles.Certaines espèces d'oiseaux appartenant à l'ordre des Charadriiformes semblent être infectéespar des virus particuliers, appartenant aux sous­types H13 et H16 (Hinshaw et al. 1982;146

Discussion générale et perspectivesKawaoka et al. 1988; Fouchier et al. 2005). Les connaissances portant sur l'infection de cesoiseaux par les virus influenza aviaires sont cependant très inégales. Par exemple, enAmérique du Nord, certaines espèces de limicoles ont été identifiées comme ayant un rôleclé dans l'épidémiologie de ces virus (Hanson et al. 2008) et de fortes prévalences ont étéenregistrées (pouvant atteindre 10%). La Camargue étant une zone d'arrêt migratoire pour denombreuses espèces de limicoles (Blondel & Isenmann 1981), il serait intéressant d'envisagerdans le futur la mise en place de captures, prélèvements et analyses sur ces espèces. Cetravail pourrait également être couplé avec des perspectives méthodologiques. En effet, lesprélèvements étant réalisés par récolte de fientes fraîches au sol, dans des milieux aquatiquessalés, il est possible que la quantité et qualité de virus soit limitées et que la présence de selsinterfère avec les réactions de PCR. Cet aspect technique n'est pas à négliger dans nosrésultats de prévalences d'infections mesurées chez les mouettes et goélands et pourrait êtreun biais dans l'étude des virus influenza dans les milieux aquatiques salés.Enfin, ces oiseaux vivant dans des écosystèmes aquatiques différents de ceux utiliséspar les canards (i.e. milieux salés), et à des périodes de l'année différentes (i.e. printemps,été), il est probable que les caractéristiques génétiques des virus ainsi que leur modalité decirculation soient différentes de celles détectées chez les Anseriformes. Ces virus sont­ilsplus résistants à de fortes salinités et à des températures élevées ? Sont­ils spécifiques de cesespèces ? Des virus issus de réassortiments entre lignées génétiques et géographiquesdifférentes, comme le virus H9N2 étudié dans l'Article 4, sont­ils fréquents chez ces oiseaux? L'étude des virus influenza aviaires dans ces populations et écosystèmes est doncprometteuse tant les questions et approches peuvent être diverses et originales (e.g. écologiede l'hôte, caractéristiques génétiques des virus, conditions physico­chimiques du milieu).1.3. Rôle réservoir des écosystèmes aquatiques.Les résultats présentés dans l'Article 5 montrent pour la première fois que la dynamiquetemporelle d'infection par les virus influenza dans les communautés d'oiseaux sauvages estrégie principalement par la capacité de persistance de ces virus dans l'eau. Il est suggérédepuis longtemps que les écosystèmes aquatiques peuvent faire office de réservoir147

Discussion générale et perspectivesenvironnemental pour ces virus (Hinshaw et al. 1979; Stallknecht et al. 1990a,b).Paradoxalement, le nombre de travaux portant sur ces aspects est extrêmement limité. Parexemple, les caractéristiques génétiques sous­jacentes à la capacité de persistance de cesvirus dans l'environnement ne sont pas étudiées alors que des variations de survie des virusinfluenza ont été enregistrées entre sous­types (Stallknecht, communication personnelle),mais également entre souches et entre formes hautement et faiblement pathogènes (Brown etal. 2007).La Camargue est composée d'une grande diversité d'écosystèmes aquatiques,directement liée à l'utilisation du milieu. La répartition des oiseaux d'eau est doncdépendante de ces milieux et il est également probable que leurs caractéristiques abiotiquesinfluent localement sur la persistance et la circulation des virus influenza. Dans ce contexte,il serait donc possible d'étudier directement les interactions entre activités humaines,caractéristiques des écosystèmes et circulation de ces virus. De tels aspects sont trèsintéressants et s'avèrent particulièrement cruciaux dans le contexte actuel de l'émergence deformes hautement pathogènes et dans un but de gestion et de prévention des habitatspotentiellement à risque.2. Maladies infectieuses émergentes et écosystèmes.2.1. Émergence de virus influenza aviaires et modification des écosystèmes.Les mécanismes favorisant l'émergence de nouveaux virus influenza en Camargue n'ont pasdirectement été abordés dans le cadre de mon travail. Les résultats publiés dans l'Article 4montrent cependant comment il est possible de détecter des « nouveaux » virus, issus deréassortiments entre lignées génétiques d'origines géographiques différentes. Les premiersrésultats des analyses génétiques réalisées montrent également une forte proportion de virusde type H9, habituellement très rarement détectés en Europe (Munster et al. 2007). Cerésultat pourrait suggérer une circulation de ces virus spécifiques à la Camargue. Les virusinfluenza aviaires se divisent en effet en souches géographiquement différentes, entreAmérique et Eurasie (Olsen et al. 2006). La possibilité de différences de circulation à des148

Discussion générale et perspectiveséchelles géographiques plus fines a pendant longtemps été exclue (Webster et al. 1992).Cependant, Pereda et al. (2008) ont récemment montré une circulation de lignées génétiquesde virus H13N9 probablement endémiques d'Amérique du Sud. Ce nouveau résultat montreque de tels aspects ont sans doute été sous­estimés jusqu'alors. Il sera intéressant d'accumulerdans les années à venir plus de données sur les caractéristiques génétiques des viruscirculants, afin de voir notamment si une circulation endémique est possible en Camargue,en particulier pour les virus H9.Concernant les virus hautement pathogènes il est très peu probable de les détecter enCamargue du fait (i) de leur faible circulation chez les oiseaux sauvages (Chen et al. 2006a;Gaidet et al. 2008) et (ii) de l'absence d'élevages intensifs d'oiseaux domestiques en contactavec la faune sauvage, condition principale à l'émergence de tels virus (Banks et al. 2000; Itoet al. 2001). Ainsi, si la Camargue reste un point chaud en terme d'introduction et detransmission de virus influenza aviaires, de part sa situation géographique, elle ne participesans doute pas à l'émergence de formes hautement pathogènes au sein de la faune sauvage.Dans l'Article 8 nous mettons en avant les modifications nécessaires sur les écosystèmesdans lesquels les virus influenza évoluent, pour favoriser l'émergence de formes hautementpathogènes. Les travaux portant sur l'écologie et l'évolution de ces virus, dans lesécosystèmes naturels mais également modifiés par l'homme, apporteront probablement desinformations clés sur les pressions de sélections favorisant leur émergence et persistance.Ainsi, de nombreuses questions peuvent être abordées en conditions naturelles. Parmielles, l'étude des conditions écologiques favorisant l'infection d'un hôte par deux virus (coinfection)et les réassortiments viraux est particulièrement prometteuse. En effet, cemécanisme génétique a un rôle majeur dans l'évolution de ces virus puisqu'il leur permetd'échanger rapidement leur génome et ainsi de répondre efficacement à des changements depression de sélection (Dugan et al. 2008). Quelles sont les caractéristiques génétiques quipermettent aux virus d'optimiser la survie dans l'eau, ou bien de maximiser leur duréed'excrétion dans l'hôte tout en infligeant des coûts moindres sur sa physiologie et soncomportement ? Les réponses à ces questions permettront de mieux comprendre lesmécanismes favorisant la sélection et l'émergence de virus influenza en conditions naturelles.Des perspectives similaires peuvent être envisagées dans des écosystèmes artificiels(i.e. élevages plus ou moins intensifs). Favoriser la diversité en hôtes permet­elle de diminuer149

Discussion générale et perspectivesle risque d'émergence de formes hautement pathogènes ? Existe­t'il une densité seuild'individus dans les élevages contribuant à l'émergence et au maintien de tels virus ? Faut­iléviter les contacts entre populations sauvages et domestiques ou au contraire maintenir desflux de virus entre les deux systèmes ? Toutes ces questions sont de première importancedans le contexte actuel de la propagation et de la maintenance du virus H5N1 HP en Asie duSud­Est. Paradoxalement, les publications scientifiques qui portent sur la surveillance desvirus circulant dans les élevages, ainsi que les conditions écologiques favorisant l'émergencede ces virus, sont extrêmement rares, alors que ces écosystèmes artificiels sont les plus àrisque.2.2. Activités humaines, maladies infectieuses et écosystèmes.Pendant longtemps l'étude du parasitisme a fait l'objet d'une discipline à part entière: laparasitologie. Les travaux réalisés au cours des dernières décennies ont replacé lesinteractions hôte­parasite dans un contexte plus large faisant appel à d'autres disciplines de labiologie (e.g. écologie, évolution, comportement), de la médecine et de l'épidémiologie. Depart la petite taille de nombreux parasites, leur importance dans le fonctionnement desécosystèmes a souvent été négligée. Certaines estimations portent à plus de 50% laproportion d'espèces parasites au sein du monde vivant (de Meeûs & Renaud 2002). Un vifintérêt concernant l'importance écologique du parasitisme s'est donc développé ces dernièresannées et, des travaux très récents mettent en avant le rôle clé des parasites au sein de chaînestrophiques et dans la stabilité des écosystèmes (e.g. Lafferty et al. 2006, 2008).L'influence de l'homme dans l'introduction, la maintien ou le retrait d'organismesparasites dans les écosystèmes est de plus en plus étudiée. Huspeni & Lafferty (2004) ont parexemple montré comment des opérations de restauration de milieux aquatiques (maraissalants en Califormie, Etats­Unis) ont permis d'augmenter la biodiversité locale en parasitesmais également en hôtes invertébrés et vertébrés. Ce type de gestion d'un écosystème a doncété directement bénéfique au parasitisme et, par des effet en cascades, a favorisé la richessespécifique en hôtes et ainsi permis de stabiliser la biodiversité locale. A l'inverse, favoriser ledéclin d'un parasite peut avoir des conséquences dramatiques à l'échelle de l'écosystème.L’un des exemples les plus célèbres est l’épidémie de peste bovine en Afrique de l’Est150

Discussion générale et perspectives(Plowright 1982; Dobson 1995a, b). Bien qu’il ne touche pas directement l'être humain, levirus responsable de cette maladie a causé des famines diffuses et infligé de graves dégâtséconomiques et sociaux dans les régions qui dépendent du bétail pour la viande, les produitslaitiers et la traction animale. Des efforts importants ont donc été réalisés pour éradiquer cevirus, par l'intermédiaire de la vaccination du bétail. Dans le parc du Serengeti (Tanzanie),les populations d’ongulés (e.g. gnous, buffles) se sont multipliées, entraînant une fortecroissance des populations de carnivores, en particulier des lions et des hyènes. En parallèle,l’augmentation de la pression de prédation a été préjudiciable aux antilopes, les changementsdans les communautés d’herbivores se sont accompagnés de modifications de la végétationet certaines espèces comme les chiens sauvages ont totalement disparues, visiblement à lasuite de la compétition avec les hyènes. Face à la déstabilisation complète de l'écosystèmeque l’élimination du virus a entraînée, il ressort clairement que ce parasite était une espèceclé dans son fonctionnement. Même si en terme de biomasse le poids total du virus estinsignifiant, les effets qu’il entraîne sont majeurs.L'étude des virus et bactéries au sein de la faune sauvage et des interactions qu'ilsentretiennent avec les populations humaines restent souvent le domaine de prédilection dedisciplines telles que la médecine humaine ou vétérinaire, l'épidémiologie, la virologie et labactériologie. Souvent étudiés en marge des études portant sur l'écologie évolutive dessystèmes hôte­parasite, les pathogènes responsables de zoonoses sont à l'heure actuellerarement pris en compte dans le fonctionnement des écosystèmes. De nombreuses étudesmontrent aujourd'hui l'intérêt et l'importance de croiser différentes disciplines et approchesdans l'étude des agents infectieux responsables des maladies émergentes (e.g. Schrag &Wiener 1995; Lefèvre et al. 2006; Morand & Krasnov 2008; Stearns & Koela 2008; Ostfeldet al. 2008). En effet, en plus d'apporter des connaissances nouvelles sur le fonctionnementdes systèmes hôte­parasites, et sur leur place dans l'environnement, de nombreusesapplications médicales (humaines et vétérinaires) sont envisageables (e.g. Williams & Nesse1991; Stearns & Ebert 2001) mais également en terme de gestion et de conservation de labiodiversité (Ostfeld et al. 2008).151

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ANNEXES

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la ConservationAnnexe 1:Lebarbenchon C., Poulin R. & Thomas F. 2007. Parasitisme, Biodiversité etBiologie de la Conservation. In: Ecologie et Evolution des Systèmes Parasités,Thomas F., Renaud F. & Guégan J­F. (editors). De Boeck Université,Bruxelles: Belgium.161

Annexe 1162

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la Conservation163

Annexe 1164

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la Conservation165

Annexe 1166

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la Conservation167

Annexe 1168

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la Conservation169

Annexe 1170

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la Conservation171

Annexe 1172

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la Conservation173

Annexe 1174

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la Conservation175

Annexe 1176

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la Conservation177

Annexe 1178

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la Conservation179

Annexe 1180

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la Conservation181

Annexe 1182

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la Conservation183

Annexe 1184

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la Conservation185

Annexe 1186

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la Conservation187

Annexe 1188

Parasitisme, Biodiversité et Biologie de la Conservation189

Annexe 1190

« The ecological significance of manipulative parasites »Annexe 2:Lefèvre T., Lebarbenchon C., Gauthier­Clerc M., Missé D., Poulin R.& Thomas F. The ecological significance of manipulative parasites.Accepté dans Trends in Ecology and Evolution.191

Annexe 2192

« The ecological significance of manipulative parasites »The ecological significance of manipulative parasitesThierry Lefèvre 1 , Camille Lebarbenchon 1,2 , Michel Gauthier­Clerc 2 , Dorothée Missé 1 , RobertPoulin 3* 1, 4*and Frédéric Thomas*equal contributionfthomas@mpl.ird.fr1GEMI/UMR CNRS­IRD 2724. 911, Avenue Agropolis, BP 64501, 34394 MontpellierCedex 5, France.2Centre de Recherche de la Tour du Valat. Le Sambuc, 13200 Arles, France.3Department of Zoology, University of Otago, PO box 56, Dunedin, New Zealand.4Institut de recherche en biologie végétale, Université de Montréal, 4101, rue SherbrookeEst, Montréal (Québec), Canada H1X 2B2AbstractThe diversity of ways in which host manipulation by parasites interferes with ecological andevolutionary processes governing biotic interactions has been recently documented, and indicates thatmanipulative parasites are full participants in the functioning of ecosystems. Phenotypic alterations inparasitized hosts modify host population ecology, apparent competition processes, food web structure,energy and nutrient flow between habitats, as well as favouring habitat creation. As is usually the casein ecology, these phenomena can be greatly amplified by a series of secondary consequences (cascadeeffects). Here, we review the ecological relevance of manipulative parasites in ecosystems and proposedirections for further research.193

Annexe 2Ecology of ecosystems and parasites: a recent storyAlthough parasites were virtually ignored for decades by ecologists, considerableefforts have been made over the past 15 years to understand their functional importance inecosystems [1­5]. Although easy to overlook, parasites can sometimes account for asignificant portion of total biomass in natural ecosystems [6]. Most, if not all, ecologists andconservation biologists are now aware that the introduction or elimination of a parasite in anecosystem can strongly affect the interactions between a diverse range of species in thecommunity, and hence affect biodiversity [7]. Most studies concern apparent competitionphenomena – that is, how shared parasites impact on diversity by mediating competitionbetween different host species (Box 1) – and food webs [8,9].Very recently, interest in the relationship between ecosystem functioning andparasites has stimulated exploration in other directions, focusing in particular on the socalledcategory of ‘manipulative parasites’ (see Glossary). A wide range of protozoan andmetazoan parasites indeed manipulate the phenotype (e.g. behaviour, morphology and/orphysiology) of their hosts in a way that favours their own transmission (Figure 1). Thesealterations can vary greatly in their magnitude, from slight shifts in the percentage of timespent performing a given activity (e.g. biting rate in Leishmania­infected sandflies [10]) tothe production of complex and spectacular behaviours (e.g. Figure 1e) [11,12].While manipulative parasites have been traditionally approached from the viewpointof parasitology, they now constitute a common research area of interest to bothparasitologists and ecologists. Understanding their importance significantly contributes toexpanding our knowledge of the pivotal role of parasites in ecosystems. Manipulated hostscan be seen as complex organisms since they keep some of the properties and attributes ofuninfected individuals but they also display new characteristics, involving them in noveldirect and indirect interactions with other species and/or conspecifics. Because of thissingularity, manipulative parasites have unusual ecological effects compared with ‘regular’parasites (i.e. parasites that do not manipulate their host). Our primary purpose is to reviewevidence for these original consequences. We also outline future research needs to advanceour understanding of this emerging topic.194

« The ecological significance of manipulative parasites »Ecology of parasitically modified populationsWhen the shift in phenotype caused by parasites is large, and when prevalence in thehost population is less than 100%, the distribution of trait values is likely to become bimodal,with parasitized and unparasitized individuals forming distinct groups [11,13]. For instance,the ecology of Gammarus insensibilis (Figure 1.a) populations could not be fully understoodwithout acknowledging the fact that a fraction of the population harbours the manipulativeparasite Microphallus papillorobustus [14]. Not only does this parasite split its hostpopulation into two discrete subunits (one at the water surface and one near the bottom), butseveral differences also exist between the characteristics of individuals from the two subunits(differences in body size, inter­moult duration, fecundity, physiology, density of individuals,etc). The pattern of mating is also deeply influenced, with paired individuals being matchedfor the presence or absence of the parasite.Infection by the trematode Cercaria batillariae causes a large portion of the Asianmud snail (Batillaria cumingi) population to move lower in the intertidal zone [15]. Infectedsnails thereby increase their submergence time, which increases access of cercariae to theirsecondary host, a fish. This parasite also induces gigantism in the mollusc. These shifts inhabitat and size change resource utilization within the snail population. The movement ofinfected snails away from uninfected snails alleviates competition with the remainingreproductive snails. Interestingly in this case, we can no longer speak of intraspecificcompetition since infected snails are castrated and produce only larval trematodes, so that itbecomes more a case of interspecific competition between uninfected snails and trematodeswith a similar (snail) phenotype [15].Thus, just because of a manipulative parasite, a given host population in a givenecosystem consists of at least two groups with different ecological traits. Even thoughexamples described above [14,15] focussed on spatial segregation between infected anduninfected individuals, sources of phenotypic heterogeneity between infected and uninfectedsubunits are potentially numerous (e.g. body size, physiology, life history traits). Theseeffects not only influence host population biology, they also affect biotic interactions andthus result in profound ecological consequences.195

Annexe 2Apparent competitionWith few exceptions, parasitic manipulation dramatically reduces host fitness. Notsurprisingly, manipulative parasites have been shown to be involved in apparent competitionprocesses (see Box 1), like other kinds of parasites. For instance, while the bird trematodeMicrophallus papillorobustus equally infects the two gammarids Gammarus insensibilis andGammarus aequicauda as (second) intermediate hosts, it does not alter their behaviour withthe same ease [16]. Infected G. insensibilis are always manipulated, displaying a suicidalbehaviour which increases their probability of predation by aquatic birds. By contrast, in G.aequicauda , host manipulation is observed only when infection occurs in juvenilegammarids; in adults, M. papillorobustus has no significant effect on the crustacean’sbehaviour. In the field, populations of the two host species exhibit strongly contrastedpatterns of parasite­induced mortality, indicating that M. papillorobustus acts as animportant mechanism regulating the density of G. insensibilis populations only. Interestingly,the latter gammarid species is also known to possess a greater reproductive success than G.aequicauda. The manipulative parasite M. papillorobustus can thus favour the coexistence ofthe two gammarids when in sympatry [16].Along the same lines, a study analyzed the effects of bird acanthocephalans(Profilicollis antarcticus and Profilicollis novaezelandensis) on two intertidal shore crabs,Macrophthalmus hirtipes and Hemigrapsus crenulatus, both species serving as intermediatehosts [17]. The two crab species are common inhabitants of sheltered mudflats in NewZealand and are frequently found coexisting. It is typical for these two crab species to avoidpredation by burrowing into the sediments at low tide; however, many individuals of bothspecies are also found totally exposed even when the tide is at its lowest. Exposed individualsof M. hirtipes (i.e. those still active at low tide), but not H. crenulatus, have significantlyhigher infection levels than did hidden conspecifics. This result suggests that Profilicolliscystacanths, by altering hiding behaviour, can increase the vulnerability of their intermediatehost M. hirtipes to predation [17]. In this case, the preferential manipulation of oneintermediate host species over another can directly influence the population dynamics of M.hirtipes and also the relative abundances of other crab species occurring in the same habitat.The role of manipulative parasites in apparent competition phenomena has also been196

« The ecological significance of manipulative parasites »documented in the context of invading species. Bauer et al. [18] compared the behaviouralinfluence of a fish acanthocephalan parasite, Pomphorhynchus laevis, on two species ofamphipods: Gammarus pulex, a resident species, and Gammarus roeseli, a recent colonizerpresent in the same river. Infected G. pulex are strongly photophilic compared withuninfected conspecifics and to both infected and uninfected G. roeseli. Host manipulation isthus observed for the resident species but not for the invasive ones. A field­based study [19]has additionally demonstrated an increased predation mortality of P. laevis­infectedindividuals compared with uninfected amphipods in the indigenous gammarid host but not inthe invasive one. Knowing that the two gammarids are sympatric and share the same trophicniche, this inequality in the face of the same manipulative parasite probably contributes tolocal invertebrate community structure. Thus, although manipulative parasites alter adifferent repertoire of phenotypic traits in their hosts compared with ‘regular’ parasites, theyalso have the potential to mediate interspecific competition processes in communities.Although this influence is important, manipulative parasites also strongly influence bioticinteractions by altering trophic links between species.Food webs and energy flowThe basic structure of a food web consists of the web’s architecture, or topology, andof the relative amounts of matter and energy flowing along the different trophic chainsmaking up the topological network. Manipulative parasites can affect food webs in manyways [20, 21 and references therein]. First, manipulative parasites can modulate the flow ofenergy throughout the web by strengthening the trophic links involved in their transmission.Numerous trophically­transmitted parasites alter the behaviour of prey hosts in ways thatincrease their rates of consumption by predators (e.g. Figure 1 a­d). Field experiments usedto quantify these rates for both parasitized and unparasitized prey (see, for example Refs[22,23]) have shown that parasites inducing relatively small host modifications cannevertheless increase rates of energy flow from prey to predator disproportionately.Second, manipulative parasites can affect the strength of other trophic links, i.e.trophic links not directly involved in parasite transmission. For example, the isopodCaecidotea communis is a major consumer of detritus in New Jersey streams. When infectedby the manipulative parasite Acanthocephalus tahlequahensis, however, its consumption197

Annexe 2rates decrease significantly [24]. The impact of the parasite is greatest in autumn, when thebulk of leaf detritus enters the streams, thus affecting the input of an important basalresource to the ecosystem. Similarly, non­lethal effects of trematodes on the intertidal mudsnails B. cumingi (see earlier section) are likely to alter energy transfer in littoral food websby shifting host population size structure, as well as habitat and resource use [15].Third, manipulative parasites can create completely novel trophic interactions, andthe exclusion of parasites from a community would affect food web structure moreprofoundly by removing other links as well. For example, cockles stranded on the sedimentsurface of New Zealand intertidal mudflats because of heavy trematode infections in theirfoot (see Box 2) experience non­lethal predation from wrasses: the fish crop the foot ofsurfaced cockles that try in vain to burrow at high tide [25]. This particular trophicrelationship exists exclusively because of parasites: unparasitized cockles are unaffected andremain buried under the sediments out of the fish’s reach. Surface­stranded cockles are alsoexploited by other opportunistic predators such as whelks, adding to the total cockle biomassdiverted to other members of the food web solely because of manipulative parasites. Byincreasing the accessibility to prey that are normally difficult to capture, manipulativetrophically transmitted parasites are likely to enhance the trophic potential of ecosystems. InCooking Lake and Hastings Lake in Alberta, most birds (and probably mammals) feed oninvertebrates that are at the water surface (those infected by the acanthocephalanPolymorphus paradoxus), but relatively few predators are suitable hosts [26]. Similarly, inFrench rivers, infection with acanthocephalans increases the vulnerability of Gammaruspulex (Crustacea, Amphipoda) to non­host invertebrate predators [27]. Manipulativeparasites are likely to locally influence the levels of both intra and inter­specific competitionbetween predators, and hence their local community structure.Novel trophic relationships can even be initiated between different compartments ofthe ecosystem. Hairworms which make their arthropod hosts (crickets and grasshoppers)jump into water (reproductive habitat of the parasite, see Figure 1.e) cause an allochthonousresource input (nutrient transfer between habitats [28]) at the forest­river interface. Indeed,this parasitic manipulation brings terrestrial arthropods into the diet of salmonid fish [29].Theoretical approaches also support the idea that manipulative parasites can haveimportant impacts on the structure, and possibly the stability, of natural food webs [30­33].198

« The ecological significance of manipulative parasites »For instance, Fenton & Rands [33] recently showed that the degree of manipulation cangreatly alter the dynamic and stability of predator­prey communities. However, the preciseoutcome of the interaction depends on both the form of the manipulation and the nature ofthe predator’s functional response. The presence of manipulative parasites and the degree ofmanipulation do not directly affect the persistence of the predator and prey populations, butthey can greatly alter the quantitative dynamics of the community, potentially resulting inhigh amplitude oscillations in abundance. Another aspect to consider is that the life historiesof the predators and their prey are also of importance in determining the persistence of theparasite and the optimal level of host manipulation. Manipulative parasites can drive hostpopulation sizes down to levels where environmental stochasticity could render the host (andtherefore the parasite) extinct. Host­manipulative parasite interactions and predator­preyinteractions are intricately linked because host manipulation can affect predator­preyinteractions and vice versa.Habitat creationSome organisms create habitats for other species by modifying the environmentthrough a myriad of activities such as, for instance, nest or dam building. How specieschange their own niche (niche construction [34]) and physically change the environment inways that facilitate the production of niches for other species (i.e. ecosystem engineering[35,36]) have received growing attention in the past decade [37,38]. Manipulative parasites,by altering the phenotype of their host, can interfere with these processes and thus potentiallyhave important repercussions on the whole community [7,39] (Figure 2). We can distinguishtwo main types of interference resulting in habitat creation. First, manipulative parasites cancreate new habitats by altering a host trait involved in the modification of resourceavailability to other species (Figure 2.B). Second, manipulative parasites can act directly asecosystem engineers when, for instance, they give rise to an engineering function in the hostthat did not previously exist (Figure 2.C).The first situation is well illustrated by the association between the New Zealandcockle Austrovenus stuchburyi and two echinostome (Trematoda) species, Curtuteriaaustralis and Acanthoparyphium sp. (Box 2). Given the important ecological differences199

Annexe 2(e.g. light, humidity, temperature) between living under (uninfected) or above (infected) thesurface of the mud, manipulated cockles clearly constitute a new habitat for sessile species.As a result, echinostomes increase the diversity of the invertebrate community by providinghabitats for species like limpets and anemones that would normally be absent from the softsedimenthabitat [40­42] (Box 2).Probably the most important role of parasites as ecosystem engineers takes placeinside host species, since living organisms are themselves an ecosystem for numerousparasite species [43]. Depending on their life cycle and transmission routes, shared interestsor, conversely, conflicts of interests, may occur within parasite communities. For instance,behavioural alterations induced by M. papillorobustus (Figure 1a) are not neutral for theother parasites co­occurring inside G. insensibilis. In field gammarids, there is a positiveassociation between M. papillorobustus and another trematode, Maritrema subdolum, whichdoes not manipulate the behaviour of the amphipod but has the same definitive hosts as themanipulative M. papillorobustus [44]. Because the infective stages of M. subdolum swimcloser to the water's surface compared to those of M. papillorobustus, they more frequentlyencounter and infect manipulated gammarids than uninfected ones (i.e. the ‘hitch­hiking’strategy [44]). Leung and Poulin [45] recently investigated how the presence of manipulativeechinostomes in New Zealand cockles impacts the whole community of parasites andsymbionts co­occurring in these bivalves. They found a novel potential case of a hitch­hikerparasite: another trematode (a gymnophallid) that shares the same transmission route asechinostomes but is not capable of manipulation preferentially infects manipulated cockles(but see Ref [46]). These examples illustrate well how manipulative parasites, by modifyingtheir living habitats (i.e. the intermediate host), can change the selective pressures acting onother species and consequently influence the structure of communities.Just as shared interests exist between manipulative parasites and other parasitesexploiting the same host species, conflicts are also likely to occur. The nematodeGammarinema gammari (Figure 3) uses G. insensibilis as a habitat and source of nutrition,not as a ‘vehicle’ for transmission to birds. There is evidence that this nematode prefers nonmanipulatedgammarids and seems also able to reverse the manipulation induced by M.papillorobustus, changing gammarids from an altered behaviour back to a normal behaviour[47]. A similar situation has been reported within the gammarid G. roeseli between the bird200

« The ecological significance of manipulative parasites »acanthocephalan Polymorphus minutus and microsporidia that are vertically transmitted.Apparently, microsporidia are also capable of sabotage: the behavioural manipulationinduced by P. minutus to reach aquatic birds is weaker in hosts also infected by microsporidia[48]. Several other potentially conflicting situations exist in nature, for instance betweentrophically transmitted parasites sharing the same intermediate host but with differentdefinitive hosts [49­50]. Thus, by turning their host from a phenotype A (uninfected) to aphenotype B (infected), manipulative parasites directly and/or indirectly control the habitatcharacteristics for other parasites and symbionts.Future directionsThe ecological consequences presented here are generally not associated with‘regular’ parasites, suggesting that manipulative parasites deserve special attention fromecologists. Compared to the important effort invested in the study of host manipulations byparasites (reviewed in Ref [12]), relatively few studies have considered the ecological contextin which they occur. This is unfortunate as it compromises our understanding of manyaspects related both to the evolution of manipulation itself and to its ecological consequenceswithin ecosystems [51]. Thus, at the moment, more research linking host manipulation andecosystem ecology is clearly needed to correctly assess the functional importance ofmanipulative parasites in ecosystems. Future studies should also determine whether or notecological generalisations are possible. Do similar manipulative changes exerted by differentparasite species result in the same ecological consequences? For instance, New Zealandtrematodes are not alone with respect to their ability to impair the burrowing capacities oftheir bivalve hosts: the same phenomenon is induced by several other trematode species inEurope [23]. However, it is not known whether or not whole intertidal communities of freelivinginvertebrates and of symbionts are influenced in a similar way.Generalisations about the ecological importance of manipulative parasites would also requirethe study of a greater diversity of biological models and ecosystems (especially terrestrialones). Ultimately, such data will help to assess which variables, if any, on a large scaleexplain the magnitude of the ecological consequences due to the presence of manipulativeparasites (e.g. host and/or parasite taxonomy, type of ecosystems, levels of interactions201

Annexe 2between species, types of phenotypic traits that are altered, proportion of manipulativeparasites in the parasitic community, etc). Exploring the idea that ecosystem dynamics andfood web complexity contribute in return to the evolution of manipulation by parasites isanother exciting direction.A full understanding of the roles played by manipulative parasites in ecosystemswould additionally require detailed investigations of the complexity of manipulated hosts,focusing in particular on phenotypic traits other than those that are the most obviouslyaltered. Parasitically modified hosts are not simply normal hosts with one (more or lessstrong) trait alteration (e.g. behaviour); instead they are deeply modified organismsdisplaying a range of subtle modifications [14,51,52]. Certain of these trait alterations,although not spectacular, might be quite relevant in terms of ecosystem consequences. Forinstance, certain acanthocephalans have recently been shown to increase salinity tolerance incrustacean amphipods [53]. Although this physiological change may be less spectacular thanthe behavioural changes generally induced by these parasites (e.g. Figure 1.b), it can behighly relevant from an ecological viewpoint since salinity tolerance is a key determinant ofthe invasion potential of amphipod species [54]. Similarly, for reasons that still need to bedetermined, several studies suggest that aquatic crustaceans whose behaviour is manipulatedby helminths of aquatic birds concomitantly display significantly higher levels of lipids andglycogen than uninfected conspecifics (trematodes: Ref [14]; acanthocephalans: Ref [55];cestodes: Ref [56]). Manipulated hosts are therefore not only easier to capture, they may alsorepresent prey of higher nutritive value for foraging predators [57]. Whatever the exactproximate and ultimate reasons for higher lipid reserves in manipulated hosts, theimplications at the ecosystem level and for conservation are undoubtedly important,particularly when variation in parasite prevalence exists between habitats. We thus encourageother researchers to examine a broader range of phenotypic traits in manipulated hosts thanthe ones of immediate relevance to transmission.Furthermore, research into this area would benefit greatly from an emphasis onquantitative measurements of the impact of manipulators on ecological processes (e.g.predation rates, competition, and energy flow along food chains). The study of hostmanipulation has its roots in a natural history approach that did not encourage rigorousquantitative analyses beyond those directly linked to the manipulation itself. Indeed, for some202

« The ecological significance of manipulative parasites »of the textbook examples of manipulation (e.g., the spectacular impact of the trematodesDicrocoelium and Leucochloridium on ants and snails, respectively), we have no estimate atall of the effects on predation rates by definitive hosts. There is little doubt that manipulativeparasites change the strength of numerous links within the web of interactions making up anecosystem, even links that do not directly involve their hosts. A shift toward these broaderimpacts is the logical next step in the study of parasite manipulation within an ecosystemcontext. Such data will also be essential for building theoretical models exploring theevolution of life­history strategies within predator­prey­manipulative parasite communities.Unless we improve our understanding of the ecological significance of the wholebiodiversity, including that of manipulative parasites, we have an insufficient understandingof the functioning of ecosystems.Acknowledgements:This work was funded by “ANR blanc” grant to FT. CL is supported by a “Centre deRecherche de la Tour du Valat / Région Languedoc­Roussillon” PhD fellowship. We aregrateful to Kevin Lafferty and 4 referees for commenting on an earlier draft of this paper.REFERENCES1 Holmes, J.C. (1996) Parasites as threats to biodiversity in shrinking ecosystems. Biodiv.Cons. 5, 975­9832 Marcogliese, D.J. and Cone, D.K. (1997) Food webs: a plea for parasites. Trends Ecol.Evol. 12, 320­3253 Horwitz, P. and Wilcox, B.A. (2005) Parasites, ecosystems and sustainability: an ecologicaland complex systems perspective. Int. J. Parasitol. 35, 725­7324 Hudson, P.J. et al. (2006) Is a healthy ecosystem one that is rich in parasites? Trends Ecol.Evol. 21, 381­3855 Wood, C.L. et al. (2007) Parasites alter community structure. PNAS 104, 9335­93396 Kuris, A.M. et al. (2008) Ecosystem energetic implications of parasite and free­livingbiomass in three estuaries. Nature 454, 515­5187 Thomas, F. et al. (2005) Parasitism and Ecosystems. Oxford University Press203

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« The ecological significance of manipulative parasites »23 Thomas, F., and Poulin, R. (1998) Manipulation of a mollusc by a trophically transmittedparasite: convergent evolution or phylogenetic inheritance? Parasitology. 116, 431­43624 Hernandez, A.D. and Sukhdeo, M.V.K. (2008) Parasite effects on isopod feeding rates canalter the host’s functional role in a natural stream ecosystem. Int. J. Parasitol. 38,683­69025 Mouritsen, K.N. and Poulin, R. (2003) Parasite­induced trophic facilitation exploited by anon­host predator: a manipulator’s nightmare. Int. J. Parasitol. 33: 1043­105026 Helluy, S. and Holmes, J.C. (2005) Parasitic manipulation: further considerations. Behav.Process. 68, 205­21027 Kaldonski, N. et al. (2008) Infection with acanthocephalans increases the vulnerability ofGammarus pulex (Crustacea, Amphipoda) to non­host invertebrate predators.Parasitology 135, 627­63228 Jefferies, R.L. 2000. Allochtonous inputs: intergrating population changes and food­webdynamics. Trends Ecol. Evol. 15: 19­22.29 Sato, T. et al. (2008) Parasite­mediated allochthonous input: do hairworms enhancesubsidised predation of stream salmonids on crickets? Can. J. Zool. 86, 231­23530 Dobson, A.P. (1988) The population biology of parasite­induced changes in host behavior.Q. Rev. Biol. 63, 139­165.31 Hadeler, K.P. and Freedman, H.I. (1989) Predator­prey populations with parasiticinfection. J. Math. Biol. 27, 609­631.32 Lafferty, K.D. (1992) Foraging on prey that are modified by parasites. Am. Nat. 140,854­86733 Fenton, A. and Rands, S.A. (2006) The impact of parasite manipulation and predatorforaging behavior on predator­prey communities. Ecology 87, 2832­28434 Odling­Smee, F.J. et al. (2003) Niche Construction: the neglected process in evolution.Princeton University Press35 Jones, C.J. et al. (1994) Organisms as ecosytems engineers. Oikos 69, 373­386.36 Jones, C.J. et al. (1997) Positive and negative effects of organims as physical ecosystemengineers. Ecology 78, 1946­195737 Erwin, D.H. (2005) Seeds of diversity. Science 308, 1752­175338 Erwin, D.H. (2008) Macroevolution of ecosystem engineering, niche construction and205

Annexe 2diversity. Trends Ecol. Evol. 23: 304­310.39 Thomas, F. et al. (1999) Parasites and ecosystem engineering : what roles could theyplay ? Oikos 84, 167­17140 Thomas, F. et al. (1998) Manipulation of host behaviour by parasites : ecosystemengineering in the intertidal zone? Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 265, 1091­109641 Mouritsen, K.N. and Poulin, R. (2005) Parasites boost biodiversity and change animalcommunity structure by trait­mediated indirect effects. Oikos 108, 344­35042 Mouritsen, K.N. and Poulin, R. (2005) Parasitism can influence the intertidal zonation ofnon­host organisms. Mar. Biol. 148, 1­1143 Pedersen, A.B. and Fenton, A. (2006) Emphasizing the ecology in parasite community.Trends Ecol. Evol. 22, 133­13944 Thomas, F. et al. (1997) Hitch­hiker parasites or how to benefit from the strategy ofanother parasite. Evolution 51, 1316­131845 Leung, T.L.F. and Poulin, R. (2007) Interactions between parasites of the cockleAustrovenus stuchburyi: hitch­hikers, resident­cleaners, and habitat facilitators.Parasitology 134, 247­25546 Leung, T.L.F. and Poulin, R. (2007) Recruitment rate of gymnophallid metacercariae inthe New Zealand cockle Austrovenus stuchburyi: an experimental test of the hitch hiking.Parasitol. Res. 101, 281­28747 Thomas, F. et al. (2002) Conflict of interest between a nematode and a trematode in anamphipod host : test of the ‘sabotage’ hypothesis. Behav. Ecol. Sociobiol. 51, 296­30148 Haine, E.R. et al. (2005) Conflict between parasites with different transmission strategiesinfecting an amphipod host. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 272, 2505­251049 Cézilly, F. et al. (2000) Conflict between co­occurring manipulative parasites? Anexperimental study of the joint influence of two acanthocephalan parasites on thebehaviour of Gammarus pulex. Parasitology 120, 625­63050 Lafferty, K.D. (1999) The evolution of trophic transmission. Parasitol. Today 15, 111­11551 Thomas, F. et al. (2005) Parasitic manipulation : where are we and where should we go ?Behav. Process. 68, 185­19952 Cézilly, F. and Perrot­Minnot, M­J. (2005) Studying adaptive changes in the behaviour ofinfected hosts: A long and winding road. Behav. Process. 68, 223­228206

« The ecological significance of manipulative parasites »53 Piscart, C. et al. (2007) An acanthocephalan parasite increases the salinity tolerance ofthe fresh water amphipod Gammarus roeseli (Crustacea: Gammaridae)Naturwissenschaften 94, 741­74754 Devin, S. and Beisel, J­N. (2007) Biological and ecological characteristics of invasivespecies: a gammarid study. Biol. Invasion 9, 13­2455 Plaistow, S. et al. (2001) The effect of the acanthocephalan parasite Pomphorhynchuslaevis on the lipid and glycogen content of its intermediate host Gammarus pulex. Int. J.Parasitol. 31, 346­35156 Amat, F. et al. (1991) Some aspects of Artemia biology affected by cestode parasitism.Hydrobiol. 212, 29­44.57 Sanchez, M. et al. (2008) Neurological and physiological disorders in Artemia harbouringmanipulative cestodes. J Parasitol. In press58 Helluy, S. (1983) Un mode de favorisation de la transmission parasitaire : la manipulationdu comportement de l'hôte intermediaire. Rev. Ecol. 38, 211­22359 Aeby, G.S. (1991) Behavioral and ecological relationships of a parasite and its hostswithin a coral reef system. Pac. Sci. 45, 263–26960 Yanoviak, S.P. et al. (2008) Parasite­induced fruit mimicry in a tropical canopy ant. Am.Nat. 171, 536­54461 Thomas, F. et al. (2002) Do Hairworms (Nematomorpha) manipulate their terrestrial hostto seek water ? J. Evol. Biol. 15, 356­36162 Lefèvre, T. and Thomas, F. (2008) Behind the scene something else is pulling the strings:Emphasizing parasitic manipulation in vector­borne diseases. Inf. Genet. Evol. 8, 504­51963 Scott, M.E. (1987) Regulation of mouse colony abundance by Heliogomosomoidespolygyrus (Nematoda). Parasitology 89, 159­19464 Hudson, P.J. et al. (2002) Trophic interactions and population growth rates: describingpatterns and identifying mechanisms. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 357,1259­127165 Tompkins, D.M. et al. (2001) Differential impact of a shared nematode parasite on twogamebird hosts: implications for apparent competition. Parasitology 122, 187­19366 Moller, A.P. (2005) Parasitism and the regulation of host populations. In Parasitism andEcosystems (Thomas, F. et al. eds), pp. 43­53, Oxford University Press207

Annexe 267 Park, T. (1948) Experimental studies of interspecies competition. I. Competition betweenpopulations of the flour beetles, Tribolium confusum Duval and Tribolium castaneumHerbst. Ecol. Monogr. 18, 265­30868 Holt, R.D. (1977) Predation, apparent competition, and the structure of prey communities.Theor. Popul. Biol. 12, 197­22969 Holt, R.D. and Pickering, J. (1985) Infectious disease and species coexistence: a model ofLotka­Volterra form. Am. Nat. 126, 196­21170 Holt, R.D. and Lawton, J.H. (1993) Apparent competition and enemy­free space in insecthost­parasitoid communities. Am. Nat. 142, 623­64571 Holt, R.D. and Lawton, J.H. (1994) The ecological consequences of shared naturalenemies. Annu. Rev. Ecol. Syst. 25, 495­52072 Bonsall, M.B. and Hassel, M.P. (1997) Apparent competition structures ecologicalassemblages. Nature 388, 371­37373 Hudson, P.J. and Greenman, J.V. (1998) Competition mediated by parasites: biologicaland theoretical progress. Trends Ecol. Evol. 13, 387­390.74 Greenman, J.V. and Hudson, P.J. (1999) Host exclusion and coexistence in apparent anddirect competition: an application of bifurcation theory. Theor. Popul. Biol. 56, 48­6475 Hatcher, M.J. et al. (2006) How parasites affect interactions between competitors andpredators. Ecol. Lett. 9, 1253­127176 Mouritsen, K.N. (2002) The parasite­induced surfacing behaviour in the cockleAustrovenus stuchburyi: a test of an alternative hypothesis and identification of potentialmechanisms. Parasitology 124, 521­52877 Babirat, C. et al. (2004) Equal partnership: two trematode species, not one, manipulatethe burrowing behaviour of the New Zealand cockle, Austrovenus stutchburyi. J.Helminthol. 78, 195­19978 Bush, A.O. et al. (1997) Parasitology meets ecology on its own terms: Margolis et al.revisited. J. Parasitol. 83, 575­583208

« The ecological significance of manipulative parasites »GlossaryNiche: Term describing the ways in which tolerances and requirements interact to define theconditions and resources needed by an individual or a species in order to practise its wayof lifeManipulative parasite: parasite inducing phenotypic (morphology, behaviour, physiology,etc.) changes in their hosts, that increase the probability of their transmission from onehost to another, and /or ensure that propagules will be released in an appropriatelocation.Parasite prevalence: Number of hosts infected with one or more individuals of a particularparasite species divided by the number of hosts examined for that parasite species [78].Parasite abundance: Number of individuals of a particular parasite in or on a single hostregardless of whether or not the host is infectedFunctional response: The effect of prey abundance on the predator's consumption rate.There are three main types of functional response:Type 1: consumption rate rises linearly with prey densityType 2: consumption rate rises with prey density until a plateau at which itremains constant irrespective of prey density.Type 3: this response is sigmoidal: at high prey densities, consumption rate issimilar to type 2, and at low densities, the response has an accelerating phasewhere an increase in prey density leads to a more than linear (e.g. exponential)increase in consumption rate.Reproductive success: defined as the passing of genes onto the next generation. In practice,this is often the number of offspring produced by an individual (or species) per time unit.209

Annexe 2BOX1: Parasite­mediated apparent competitionLike most natural enemies, parasites are capable of having profound impacts on thedemography and the population dynamics of their hosts when they decrease host fecundityand/or survival in a density­dependent fashion (see for instance Refs [16,63­66]). Frequencyof infection and level of virulence of a parasite usually differ between two or more hostspecies. The species whose fitness is the most impaired by the infection is therefore at aselective disadvantage in competition with less­affected species (apparent competition,Figure I). Park, in 1948 [67], was the first to show experimentally that parasites couldmaintain biodiversity through the effects of shared enemies and apparent competition. Whenthe two flour beetles Tribolium castaneum and T. confusum were kept together in the samecontainers, T. castaneum usually drove T. confusum to extinction. However, when thesporozoan parasite Adelina tribolii was also present in the mixed cultures, the reverse patternwas observed. The parasite A. tribolii was simply more deleterious to T. castaneum than to T.confusum and its presence shifted the outcome of competitive interactions between the twobeetle species. Following the pioneering work of Park, there are now many theoretical andempirical studies on parasites and apparent competition ([68­74]; see Ref [75] for a review).It is now well admitted that parasite­mediated apparent competition may be as important asdirect competition or predation.(a)(b)PA B A BFigure 1 in Box 1: Apparent competition via shared parasite. When the parasite is absentfrom the ecosystem (a), host species A is more competitive than host species B. Species A ishowever more susceptible to infection than species B and thus, in presence of the parasite(b), the outcome of the competition between the two hosts is changed. The size of the210

« The ecological significance of manipulative parasites »triangles represents the abundance of each host in the ecosystem and the thickness of thearrow the intensity of the interactions between the two species.BOX 2. Manipulative parasites and habitat creation: the cockle­trematode associationFigure I panel (a) shows the cockle, Austrovenus stuchburyi, with the two most commoninvertebrate species living on its shell, the limpet Notoacmea helmsi and the anemoneAnthopleura aureodiata. When the foot of the cockle is heavily parasitized by metacercariae,the mollusc cannot burrow under the mud and lies at the sediment surface. This behaviouralalteration facilitates the parasites' transmission to the definitive host by making cockles moresusceptible to avian predators (e.g. oystercatchers) [23,76,77]. A study demonstrated that theechinostome parasites facilitate the local co­existence of limpets and anemones [40].Surfaced cockles indeed represent a new niche for the limpets that are normally outcompetedfor space on burrowed cockles by sea anemones (Figure I panel b). By manipulating theparasite load of buried cockles and the density of surfaced ones during a long­term fieldexperiment, Mouritsen and Poulin [41] showed that the echinostomes boost benthicbiodiversity. First, high parasite loads significantly reduced the cockle's mobility and henceits bioturbation potential. This resulted in an increase of the density of no less than 18macrofaunal species as well as an increase of total and average species richness. Second, theexperimental manipulation of the surfaced cockle density modified the near­seabedhydrodynamics and sedimentary conditions, resulting in a profound impact on the structureof the benthic community. On average, species belonging, for instance, to taxa such aspolychaetes, gastropods, and nemertines increased in diversity and abundance withincreasing density of cockles on the surface [41]. In addition to increasing species densityand diversity on small scales, it has been shown that the parasites influence the intertidalzonation of the cockle host as well as that of four other non­host organisms associated withcockles [42]. Figure I modified from Ref [7]. Manipulative parasites have thus the potentialto modify and create habitats for other species.211

Annexe 2(a)(b)Box 2, figure I:panel (a): The cockle, Austrovenus stuchburyi, with the two most common invertebratespecies living on its shell, the limpet Notoacmea helmsi and the anemone Anthopleuraaureodiatapanel (b) : Schematic representation of habitat creation by manipulative parasites212

« The ecological significance of manipulative parasites »(a)(b)(c)(d)(e)Figure 1. Examples of manipulative parasites.(a) The crustacean amphipod Gammarus insensibilis manipulated by the trematodeMicrophallus papillorobustus (Photo P. Goetgheluck); infected gammarids display a positivephototactism, a negative geotactism and an aberrant evasive behaviour. Indeed, instead ofhiding under stones, they swim towards the surface, and are preferentially eaten by aquaticbirds (definitive hosts) [58]. (b) Cystacanth of Polymorphus minutus (Acanthocephalan)encysted in the body cavity of Gammarus pulex [49] (Photo F. Cezilly). Unlike M.papillorobustus which is encysted in the brain of the gammarid (in (a)), the acanthocephalanis encysted in the body cavity in (b). Remarkably, this acanthocephalan also ends its lifecycle in an aquatic bird and induces similar behavioural changes in the gammarid. Becausetrematodes and acanthocephalans are phylogenetically distant, this illustrates a case ofevolutionary convergence in the manipulative process. (c) Coral polyps infected with atrematode (Podocotyloides stenometra). The parasite induces pink, swollen nodules on thecoral colony and impairs their retraction ability. Infected polyps are, therefore, bothconspicuous and vulnerable to predation by the coral­feeding butterflyfish, Chaetodonmulticinctus (the parasite’s definitive host) [59] (Photo G. Aeby). (d) An ant (Cephalotesatratus) parasitized by a nematode (Myrmeconema neotropicum). The parasite induces fruitmimicry and modifies the ants' behaviour, making them more likely to be ingested by fruiteatingbirds (final hosts) [60] (Photo S.P. Yanoviak). (e) The Gordian worm (Paragordiustricuspidatus) exiting the body of a cricket (Nemobius sylvestris) (Photo P. Goetgheluck).213

Annexe 2Mature worms manipulate cricket behaviour, causing them to jump into water. Once emergedthe parasite swims away to find a mate [61].(a)(b)(c)Phenotypic trait having no engineering functionPhenotypic trait having en engineering functionalTrait altered by parasitesFigure 2. Interactions between traits altered by parasites and traits involved inengineering function.(a) Non­interference: host traits altered by parasites are not those involved in an engineeringfunction of the host.(b) Traits altered by parasites are those involved in engineering function.(c) Emergence of an engineering function in the infected host that did not previously exist(modified from Ref [39])214

« The ecological significance of manipulative parasites »Figure 3. The nematode Gammarinema gammari (arrows) escaping from the head ofGammarus insensibilis (photo by P. Goetgheluck).215

Annexe 2216

Album photos: captures d'oiseaux sauvages et prélèvements biologiquesAnnexe 3:Album photos: captures d'oiseaux sauvages et prélèvements biologiques.217

Annexe 3218

Album photos: captures d'oiseaux sauvages et prélèvements biologiquesa. b.c. d.e. f.1. Anseriformes et Charadriiformes: a. et b. Nasses disposées dans les marais de la Tour du Valat pour lacapture des canards. c. Prélèvement cloacal réalisé sur un Canard colvert (Anas platyrhynchos). d. Prélèvementseffectués sur des canards tués à la chasse. e. Colonie de goélands leucophées (Larus michahellis) dans les salinsd'Aigues­Mortes. f. Prélèvement de fiente fraîche au sol.219

Annexe 3220

Album photos: captures d'oiseaux sauvages et prélèvements biologiquesa.b.c. d.e. f.2. Passeriformes: a. Filet japonais pour la capture d'oiseaux en vol. b. Gobemouche noir (Ficedula hypoleuca)capturé dans un filet. c. Identification selon les critères de mue des plumes. d. Pesée d'un passereau.e. Prélèvement cloacal. f. Passereau placé dans une boite pour recueillir une fiente fraîche.221

Espèces échantillonnées, effectifs et nombre d'individus infectésAnnexe 4:Espèces échantillonnées, effectifs et nombre d'individus infectés.223

Annexe 4224

Espèces échantillonnées, effectifs et nombre d'individus infectésOrdre Famille Espèce Analysés Positif (M)AccipitriformesAccipitridae Accipiter nisus 2 0Accipitridae Buteo buteo 4 0Accipitridae Buteo vulpinus 2 0AnseriformesAnatidae Anas acuta 100 1Anatidae Anas carolinensis 1 0Anatidae Anas clypeata 282 9Anatidae Anas crecca 1798 95Anatidae Anas penelope 116 0Anatidae Anas platyrhynchos 767 34Anatidae Anas querquedula 29 3CaprimulgiformesCharadriiformesCiconiiformesAnatidae Anas strepera 237 3Anatidae Anser anser 3 0Anatidae Aythya ferina 291 1Anatidae Aythya fuligula 13 0Anatidae Netta rufina 14 0Anatidae Tadorna tadorna 8 0Caprimulgidae Caprimulgus europaeus 2 0Charadriidae Vanellus vanellus 29 0Laridae Larus genei 114 0Laridae Larus melanocephalus 71 2Laridae Larus michahellis 369 2Laridae Larus ridibundus 133 0Recurvirostridae Recurvirostra avosetta 4 0Scolopacidae Actitis hypoleucos 1 0Scolopacidae Gallinago gallinago 109 0Scolopacidae Limosa limosa 1 0Scolopacidae Lymnocryptes minimus 16 0Scolopacidae Numenius arquata 4 0Scolopacidae Scolopax rusticola 1 0Scolopacidae Tringa erythropus 5 0Scolopacidae Philomachus pugnax 1 0Sternidae Sterna albifrons 1 0Sternidae Sterna hirundo 5 0Sternidae Sterna sandvicensis 82 0Ardeidae Ardea cinerea 2 0Ardeidae Ardea purpurea 1 0Ardeidae Ardeola ralloides 33 0Ardeidae Bubulcus ibis 46 0Ardeidae Egretta garzetta 31 0225

Annexe 4Ordre Famille Espèce Analysés Positif (M)Ciconiiformes (suite) Ardeidae Ixobrychus Minutus 3 0Ardeidae Nycticorax nycticorax 12 0Ciconiidae Ciconia ciconia 19 0Threskiornithidae Plegadis falcinellus 30 0ColumbiformesColumbidae Columba palumbus 8 0Columbidae Streptopelia orientalis 1 0Columbidae Streptopelia turtur 2 0CoraciiformesMeropidae Merops apiaster 6 0Upupidae Upupa epops 13 0GalliformesPhasianidae Coturnix coturnix 1 0Phasianidae Phasianus colchicus 32 0GruiformesRallidae Fulica atra 172 0Rallidae Gallinula chloropus 23 0Rallidae Rallus aquaticus 7 0Passeriformes226Aegithalidae Aegithalos caudatus 8 0Alcedinidae Alcedo atthis 6 0Corvidae Corvus monedula 8 0Emberizidae Emberiza cirlus 4 0Emberizidae Emberiza schoeniclus 244 0Fringillidae Carduelis cannabina 6 0Fringillidae Carduelis carduelis 2 0Fringillidae Carduelis spinus 2 0Fringillidae Coccothraustes coccothraustes 1 0Fringillidae Fringilla coelebs 11 0Fringillidae Serinus serinus 1 0Hirundinidae Delichon urbica 10 0Hirundinidae Hirundo rustica 49 0Hirundinidae Riparia riparia 2 0Laniidae Lanius senator 3 0Motacillidae Anthus campestris 2 0Motacillidae Anthus pratensis 1 0Motacillidae Motacilla flava iberiae 2 0Muscicapidae Ficedula albicollis 1 0Muscicapidae Ficedula hypoleuca 53 0Muscicapidae Muscicapa striata 9 0Oriolidae Oriolus oriolus 1 0Paridae Parus caeruleus 4 0Paridae Parus major 4 0Passeridae Passer domesticus 67 0Passeridae Passer montanus 6 0Prunellidae Prunella modularis 4 0Remizidae Remiz pendulinus 28 0Sturnidae Sturnus vulgaris 3 0

Espèces échantillonnées, effectifs et nombre d'individus infectésOrdre Famille Espèce Analysés Positif (M)Passeriformes (suite) Sylviidae Acrocephalus melanopogon 2 0Sylviidae Acrocephalus schoenobaenus 1 0Sylviidae Acrocephalus scirpaceus 60 0Sylviidae Cettia cetti 42 0Sylviidae Hippolais icterina 4 0Sylviidae Hippolais polyglotta 3 0Sylviidae Locustella naevia 1 0Sylviidae Phylloscopus bonelli 3 0Sylviidae Phylloscopus collybita 74 0Sylviidae Phylloscopus sibilatrix 2 0Sylviidae Phylloscopus trochilus 124 0Sylviidae Phylloscopus trochilus acredula 5 0Sylviidae Regulus regulus 7 0Sylviidae Sylvia atricapilla 192 0Sylviidae Sylvia borin 22 0Sylviidae Sylvia cantillans 56 0Sylviidae Sylvia communis 13 0Sylviidae Sylvia conspicillata 3 0Sylviidae Sylvia melanocephala 13 0Sylviidae Sylvia undata 1 0Troglodytidae Troglodytes troglodytes 5 0Turdidae Erithacus rubecula 214 0Turdidae Luscinia megarhynchos 44 0Turdidae Luscinia svecica 14 0Turdidae Oenanthe hispanica 2 0Turdidae Oenanthe oenanthe 1 0Turdidae Phoenicurus ochruros 10 0Turdidae Phoenicurus phoenicurus 94 0Turdidae Saxicola rubetra 1 0Turdidae Turdus merula 12 0Turdidae Turdus philomelos 32 0PhoenicopteriformesPhoenicopteridae Phoenicopterus ruber 113 0PiciformesPicidae Jynx torquilla 5 0PodicipédiformesPodicipedidae Podiceps cristatus 1 0Podicipedidae Podiceps nigricollis 11 0Podicipedidae Tachybaptus ruficollis 2 0StrigiformesStrigidae Asio otus 2 0Strigidae Otus scops 2 0Strigidae Strix aluco 1 0Au total, 6793 échantillons appartenant à 121 espèces (14 ordres) ont été analysés. Seulement150 se sont avérés positifs (en gras) à la présence d'un virus influenza aviaire.227

Résumé: Les maladies infectieuses émergentes sont aujourd'hui particulièrement étudiées etsurveillées du fait de l'augmentation sans précédent de leurs nombres, de leurs vitesses et échelles dedispersion, que ce soit au sein de la faune sauvage, domestique ou des populations humaines. Chezl'homme, il est estimé aujourd'hui que 75% de ces maladies émergentes ont une origine zoonotique,c'est à dire causées par des agents infectieux pouvant se transmettre naturellement entre l'homme etd'autres espèces d'animaux vertébrés. L'origine de l'émergence de ces zoonoses est à relierdirectement avec les perturbations générées par l'homme sur son environnement naturel à plus oumoins grande échelle. Mon travail s'inscrit dans ce contexte et se focalise plus particulièrement surles interactions entre les pathogènes responsables de ces maladies et les écosystèmes. Les objectifs dema thèse étaient donc (i) d'aborder l'étude des interactions entre activités humaines, parasitisme etécosystèmes, par l'intermédiaire de travaux de synthèse et de réflexion; (ii) d'étudier plus en détaill'écologie des virus influenza aviaires en Camargue et plus particulièrement les prévalencesd'infections des communautés d'oiseaux présents tout au long de l'année, le rôle des écosystèmesaquatiques dans la dynamique temporelle de la maladie et les caractéristiques génétiques des viruscirculant; (iii) d'étudier plus spécifiquement le virus hautement pathogène H5N1, à l'échelle de laCamargue mais aussi à une échelle plus large. Il est notamment mis en valeur la nécessité d'intégrerles connaissances relatives à l'écologie de l'hôte et au fonctionnement des écosystèmes dans l'étude decette maladie émergente. Les travaux effectués ont permis d'accroître nos connaissances concernantl'écologie des virus influenza en Camargue et, plus généralement, de souligner la nécessité d'étudierles pathogènes responsables des zoonoses émergentes à l'échelle des écosystèmes.Mots clés: écologie évolutive, maladies infectieuses émergentes, écosystèmes aquatiques,biodiversité, parasitisme, virus, influenza A, grippe aviaire, H5N1, H9N2, Anatidae, Laridae, Larusmelanocephalus, Camargue.Infectious diseases and ecosystems: ecology of avian influenza virusesin the Camargue (South of France)Abstract: Emerging infectious diseases are particularly studied and monitored today because of theirunprecedented increase in number, speed and wideness of dispersion within wildlife, domestic orhuman populations. In humans, it is now estimated that 75% of these emerging diseases have azoonotic origin, meaning they are caused by infectious agents that can be transmitted naturallybetween humans and other vertebrate animal species. The origin of the emergence of these zoonosesis directly linked to human interference with the natural environment, to a greater or lesser degree.Within this framework, my thesis specifically focuses on the interactions between pathogensresponsible for these diseases and ecosystems. The objectives were (i) to study interactions betweenhuman activities, parasites and ecosystems through synthesis and discussion papers; (ii) to study inmore detail the ecology of avian influenza viruses in the Camargue, especially the prevalence ofinfections in bird communities present throughout the year, the role of aquatic ecosystems in thetemporal dynamics of the disease, and genetic characteristics of the circulating virus; (iii) to studymore specifically highly pathogenic H5N1 viruses within the Camargue but also on a wider scale,particularly to highlight the need to integrate knowledge about the ecology of the host and thefunctioning of ecosystems in the study of this emerging disease. The work led to increased knowledgeof the ecology of influenza virus in the Camargue and, more generally, to stress the need to studypathogens responsible for emerging zoonotic diseases at the level of ecosystems.Keywords: evolutionary ecology, emerging infectious diseases, aquatic ecosystems, biodiversity,parasitism, virus, influenza A, bird flu, H5N1, H9N2, Anatidae, Laridae, Larus melanocephalus,Camargue.Discipline: Biologie de l'Évolution et Écologie.Laboratoires: (i) Génétique et Évolution des Maladies Infectieuses, UMR CNRS/IRD 2724, IRD –911 avenue Agropolis, BP 64501, 34394 Montpellier cedex 5; (ii) Centre de recherche de la Tour duValat, Le Sambuc, 13200 Arles.