Genetika morzsa

Polimeráz láncreakción alapuló molekuláris genetikai módszerek
Készitette: Poczai Péter
1. A PCR működési elve
A természetben előforduló élőlények közös jellemzője, hogy képesek szaporodni (replikáció,
DNS szintézis). Ennek a folyamatnak a tanulmányozása jelentős eredményeket hozott a
molekuláris genetikában. Ezek közül kiemelkedő az in vitro kémiai oligonukleotid szintézis
és az enzimatikus DNS bioszintézis, ami számos új technika kidolgozását tette lehetővé. Ezek
közül kiemelkedik a polimeráz láncreakció (Polymer Chain Reaction) amelyet Kary B. Mullis
és Michael Smith fedezett fel 1985-ben. Munkáságukért, a technika kidolgozásáért és az
oligonukleotidokra alapított, helyspecifikus mutagenezis lehetőségének felfedezésért 1993ban
kaptak kémiai Nobel-díjat. A DNS szintéziséért a polimeráz enzim különböző fajtái
felelősek. A módszerrel a kiválasztott kromoszómális vagy klónozott (cDNS) célszekvenciát
szaporítjuk fel (amplifikáljuk) enzimatikus úton hőmérsékletét pontosan változtató
készülékben. Noha a reakciót már az 1970es években leírták, gyakorlati alkalmazása váratott
magára, ami miatt egyértelműen az a tény okolható, hogy az első hőstabil polimeráz enzimet
csak jóval később izolálták hőforrásokban élő termofil Thermus aquaticus baktériumból. Az
Taq-polimeráz enzim tulajdonságai közül a legfontosabb, hogy 94˚C-on is megőrzi
működőképességét. A polimeráz enzimek működésének meghatározó eleme az új,
denaturációval létrejövő szál szekvenciáját meghatározó ssDNS (single-stranded DNS,
templát DNS), a szintézis terminuszát kijelölő primer oligonukleotid pár, valamint a prekurzor
dezoxiribonukleotid-trifoszfátok (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, együttes elnevezéssel dNTP). A
primerek gondos megválasztásával meghatározhatjuk a szintézis irányát és kezdetét. A
meghatározott DNS szakasz felszaporítása, a PCR reakció ciklusokból áll. Egy ciklus három
lépésre osztható denaturálás, a primer párok kötődése, és az új szálak szintézise. A folyamat
automatizálható, így rövid idő (1-2 óra) alatt egyetlen kétszálú DNS kópiáról 2 n-1 kópia
készíthető, ahol az „n” a ciklusok száma. Így pl. egy 20 ciklusból álló folyamat során egyetlen
kb hosszúságú DNS-molekulából 2 19 db, mintegy 0,2 mg DNS nyerhető (BISZTRAY, 2001).
A ciklusok eltérő hőmérsékletet igényelnek. A reakció rendkívül érzékeny az oligonukleotid
primerek hibridizációjakor meghatározott hőmérsékletre. A DNS elméleti olvadáspontja alatt
értjük a hőmérséklet növekedés és a fényelnyelés mértéke által alkotott görbe átmeneti
inflexiós pontját. Ez a jelenség csak analóg folyamat, de közel sem azonos az olvadással. Az
olvadáspont (Tm ) függ a G és C bázisok arányától, ugyanis ezeket a bázisokat hármas
hidrogénkötések kapcsolják össze, így a G és C százalékos növelésével egyenesen arányosan
növekszik a molekula olvadáspontja. A reakció optimalizálásánál mindenképpen figyelembe
kell venni arányukat. A kiválasztott DNS szakasz amplifikálása akkor lehetséges, ha az egyik
kiválasztott primer szekvenciája megegyezik az adott DNS 5’ végének szekvenciájával. A
másik primernek, értelemszerűen, a kívánt szekvencia 3’ irányával kell egyezőséget mutatnia,
mégpedig úgy, hogy a 3’ véggel 5’-3’ irányú homológ komplementaritást mutat. A primereket
úgy kell megterveznünk, hogy azok ne legyenek egymástól túl messze (100-2000bp).
Nagyságuk általában 10-30 bp között változik. Egyes bázispárok stop kódot is tartalmaznak.
Egy PCR elegy több komponensből áll: dezoxinukleotid-trifoszfátok, primerek, DNSpolimeráz,
templát-DNS, 10-szeres koncentrációjú reakciópuffer. Ezek közül előkísérletekben
a templát, a primer, a dNTP és a MgCl2 arányát kell előzetes kísérletekben megállapítani.
A magnézium koncentráció befolyásolja a
- primer kapcsolódását
- a primer dimerek keletkezését
1

-a DNS-Taq-polimeráz aktivitását és
-a másolás pontosságát.
A Taq-polimeráz működéséhez szabad magnéziumion jelenléte szükséges.(HAJÓSNÉ, 1999).
A PCR ciklusainak tehát három fázisa van, denaturáció, primer párok kötődése,
polimerizáció.
1. Denaturáció: ebben a fázisban magas hőmérsékletű kezelést alkalmazunk minden nem
kívánt enzimatikus reakció leállítására és a dsDNS szétválasztására. Az általánosan
alkalmazott hőmérséklet a 94˚C. Ha a hőmérséklet megválasztása nem megfelelő nem történik
meg a szétválás így a reakció sikertelen lesz. A 94˚C melegítést alkalmazzuk a Taq polimeráz
működésének leállítására is, mivel az enzim nem áll ellen a hosszabb hőhatásnak.
2. Primer párok szintézise: ebben a fázisban csökkentjük a hőmérsékletet, a primerek
beépülése érdekében. Ez egy véletlen folyamat , a reakció legérzékenyebb része, ami a
primerek koncentrációjától és a kötődési helyek jelenlététől függ. Amikor a hőmérséklet
csökken, a Brown-mozgással mozgó primerek a PCR reakcióban folyamatosan kötődnek a
komplementer templát DNS-hez, illetve le is szakadnak róla. A hőmérséklet csökkenésével
egyre hosszabb ideig kötődnek (PUTNOKY, 2000)
3. Polimerizáció: a reakcióban használt Taq polimeráz működési optimuma 72˚C körül van.
Az enzim alacsonyabb hőmérsékleten is aktív, ami fontos a sikeres reakció szempontjából. A
leggyakrabban használt primerek, néhány kivételtől eltekintve, olvadáspontja 72˚C alatt van.
A primerek nagy része az extenziós hőmérséklet elérésekor már levált a templátról. A reakció
úgy lehetséges mégis, hogy az annealing után a hőmérséklet emelkedik 72˚C-ra, ekkor már
folyik a polimerizáció. Az annealing alatt néhány extra bázis adódik a primerhez, ez pedig
növeli a primer templát DNS kötés erősségét. Így amikorra beáll a polimerizációs hőmérséklet
(kb. 30 másodperc) a primer már része egy szintetizálódó DNS szálnak (PUTNOKY, 2000).
Polimeráz láncreakcióval 50 bp- 3 kb méretű DNS-fragmenteket lehet felszaporítani, de lehet
RNS-t is amplifikálni. A PCR-technikákat széles körben alkalmazzák az evolúció-, a fejlődésés
a molekuláris biológiában, továbbá a diagnosztikában és a populációgenetikában is
(HAJÓSNÉ, 1999).
Egy PCR elegy több komponensből áll: dezoxinukleotid-trifoszfátok, primerek, DNSpolimeráz,
templát-DNS, 10-szeres koncentrációjú reakciópuffer.
2. Véletlen primerek használatán alapuló módszerek
A láncreakció felfedezése óta számos PCR-en alapuló technika vált ismereté. Azoknak a
technikáknak a segítségével, amelyek ismert szekvenciájú, de véletlen nukleotidokból álló
primert vagy primereket használnak, a genomok régióit tudjuk felszaporítani, ahová a
primerek elég közel kapcsolódnak az ellenkező fonalon, lehetővé téve a közbeeső, ismeretlen
szekvenciájú DNS-szakasz felszaporítását. Ezek a DNS-fragmentumok megfelelő primerek
alkalmazásakor tehát egyedenként vagy vonalanként eltérő mintázatot, polimorfizmust
mutatnak.
A véletlen primerekkel történő amplifikáció magyarázatára CAETANO-ANOLLIÉS AT AL.
(1992) modellt dolgoztak ki. A modell szerint az első néhány hőmérsékleti ciklusban a
„templát elemző” (screening) fázisban rokon amplikonok (felszaporítandó DNS-szakaszok)
egy csoportja szelektálódik az amplifikációhoz. Ezt a folyamatot a primer-templát-enzim
kölcsönhatások irányítják, amelyek téves primer-templát párosodást okoznak. Az első kör
amplifikációs termékei kezdetben egyszálúak, de palindróm végük van, és így belőlük primer-
2

templát és templát-templát dimerek, vagy hajtű hurkok jöhetnek létre. A primernek fel kell
ismernie és ki kell szorítani ezeket a szerkezeteket, mert csak így válik lehetővé az enzim
rögzítése és a primer meghosszabbodása. A következő ciklusokban kialakul az egyensúly. A
ritka primer-templát dimerek enzimatikus úton a felszaporodó amlifikációs termékké
alakulnak át.
Ide tartoznak a RAPD és a rokon módszerek AP-PCR (Arbitrary Primered PCR= PCR tetszés
szerinti primerrel), DAF (DNA Amplification Fingerprinting = DNS amplifikációs
ujjlenyomat). Közös jellemzőjük az, hogy a felszaporított kromoszómális DNSfragmentumokat
gélen elválasztjuk, láthatóvá tesszük, lefényképezzük, majd a kapott
mintázatot kiértékeljük. Különbség közöttük az alkalmazott primerek hosszában, az
amplifikáció körülményeiben, az elválasztás módjában és a felszaporított kromoszómális
DNS-fragmentumok láthatóvá tételében van (HAJÓSNÉ, 1999).
2.1. RAPD módszer jellemzése
A RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA = random amplifikált polimorf DNS)
technikát WILLIAMS ET AL. (1990), valamint WELSH ET AL. (1990) olyan eljárásként
írják le, amellyel az RFLP-nél használt klónozott DNS-próbák nélkül lehet polimorfizmust
találni. A RAPD módszerrel a genom ismeretlen DNS szekvenciáit lehet felszaporítani 1 vagy
2 tetszés szerint választott, 10-12 nukleotidból álló (10-12mer) primerrel. Az amplifikáció
kiindulását képező primerek a genomon véletlenszerűen hibridizálnak a komplementer
szekvenciákkal.
Ha az amplifikációhoz egy primert használunk, akkor a DNS mindkét szálának
felszaporításához a primerrel komplementer szekvenciáknak mindkettőn néhány kbp-nyi
távolságon belül kell lenniük. PCR-rel általában maximum 2 kb DNS fragmentumot lehet
felszaporítani. Az amplifikációs terméket a PCR-reakció után 1,5 %-os agaróz gélen futtatjuk,
és etídium-bromiddal tesszük láthatóvá. UV fényben azonnal lefényképezzük, és a képet
számítógépbe visszük. Megfelelő primer vagy primerek alkalmazásakor a gélen primerenként
változó számú (általában 10) és méretű (néhány 100 bp- 2000 bp) fragmentumokat látunk. A
fragmentumok méretét a mintákkal együtt futtatott DNS-markerek segítségével állapítjuk
meg.
Véletlen primerek használatakor az egyedek vagy vonalak közötti polimorfizmust egyrészt a
primer kötőhelyben levő DNS-szekvenciakülönbség, másrészt pedig az amplifikált régióban
vagy a primer kapcsolódási helyén kialakuló deléció, inszerció vagy inverzió okozhatja.
Primerpárok használatakor a termékeknek több mint 50%-a különbözik a bármely egyedüli
primer által létrehozottól. A primerpárok használata növeli a RAPD analitikai
feloldóképességét. Egyetlen primer használatakor a véletlen kiválasztás során arra kell
vigyázni, hogy a G+C tartalom 40-60% között legyen, és palindrom szekvenciák ne
forduljanak elő. Két primer együttes használatakor pedig arra kell ügyelni, hogy ne legyen
közöttük komplementaritás.
A RAPD-okkal kimutatott genetikai polimorfizmus lokuszonként 1 allélt fed fel, ami megfelel
a látható amplifikációs terméknek. A RAPD mintázatok domináns öröklődésűek, ezért a
heterozigóta genotípusok kimutatására nem alkalmasak (HAJÓSNÉ, 1999).
A RAPD mintázatok reprodukálhatósága körül sok vita van. A reprodukálhatóságot főleg a
templát DNS minősége és mennyisége határozza meg, ezért a DNS bomlását kizáró izolálási
módszert kell választani.
A RAPD mintázatokban levő variabilitást leginkább a DNS etanollal kicsapható
szennyeződései okozzák. A templát DNS minőségét hígítási sor készítésével lehet ellenőrizni.
Ha jó minőségű a templát DNS, akkor minden koncentrációnál azonos mintázatot kapunk.
3

A nagyon magas vagy nagyon alacsony templát DNS-koncentáció szintén megbízhatatlan
mintázathoz vezet. Ha egy adott templát DNS-re az optimális koncentrációt megállapíthatjuk,
akkor a további RAPD-analíziseknél is ezt kell használni.
Néhány primer-templát kombináció nem ad reprodukálható mintázatot standard amplifikációs
körülmények között. Ekkor a reakció paramétereit (pl. magnéziumkoncentráció) is
optimalizálni kell. A legjobb azonban nagyszámú primert vizsgálni, és ezek közül a további
vizsgálatokhoz azokat kiválasztani, amelyek a kérdéses templát DNS-sel ismételhető
mintázatot adnak.
Mivel az agaróz gélen a fragmentumokat csak hosszuk alapján lehet elválasztani, ezért az
alacsony feloldóképességű RAPD-technikával csak túlsúlyban lévő termékeket lehet
kimutatni.
A RAPD-markeres polimorfizmus alkalmazási területei:
-genetikai különbözőségek és/vagy rokonságok megállapítása
-tulajdonságok térképezése,
-DNS-ujjlenyomat készítése,
-beltenyésztett vonalak homozigótaságának megállapítása,
-fajták homogenitás vizsgálata,
-F1 hibrid vetőmagok uniformitásának megállapítása.
Különboző Solanum fajok RAPD mintázata.(POCZAI-TALLER-SZABÓ, 2005)
MORELL et al. (1995) hagyma-, repce-, brokkoli-, karfiol-, zeller-, zab-, és kakaófajták
azonosítására használták a RAPD technikát, és még olyan közeli rokon fajtákat is meg tudtak
különböztetni, amelyeknek genomja 94% hasonlóságot mutatott. A RAPD-analízissel feltárt
rokonságot az allozim és tartalékfehérje markerekkel kapott eredmények is igazolták.
Fajtaazonosítás esetében nagyon fontos, de nehezen megválaszolható kérdés az, hogy hány
RAPD primert kell használni, és hogy a fajtákat hány sáv alapján lehet megkülönböztetni.
Repcefajták megkülönböztetésénél pl. elég lehet egy jól kiválasztott primer és/vagy 5-25
véletlenül kiválasztott fragmentum (HAJÓSNÉ,1999).
4

2. 1. 1. A RAPD módszer előnyei
A módszer nem igényel előzetes szekvenciaismeretet vagy munkát (pl. cDNS-bank készítés) a
markerek előállításához, és ugyanazon primerek széles körben használhatók több fajtához is.
További előnyei abból erednek, hogy ez egy PCR-en alapuló módszer, azaz viszonylag
egyszerű műszerezettséget igényel (egy hőciklusszabályozó készülék), gyors és sok markert
eredményez izotóp használata nélkül. Nagyon kis mennyiségű templát-DNS-t (ng-nyi
mennyiség) igényel a reakció, így akár egy levéldarab vagy beszárított növényi rész is
használható kiindulásként (SUTKA, 2004).
2. 1. 2. A RAPD módszer hátrányai
A szükséges kiindulási DNS-mennyiség miatt érzékeny a templát szegénységre, valamint az
ismételhetőség miatt fontos a reakcióhoz szükséges alkotórészek koncentrációjának pontos
beállítása. A domináns kiértékelésű, ezért kevesebb információval rendelkező markerek a
genetikai munkák során gondot okozhatnak, mivel a markerek nagy része intron vagy repetitív
szekvenciákból amplifikálódik (ezek A+T gazdag szekvenciák), ezért az amplifikált
fragmentumok hibridizációs próbaként való használata nem mindig sikeres (KALÓ, 1999).
2. 2. AP-PCR
Arbitrary Primered PCR=PCR tetszés szerinti primerrel elve ugyan az, mint a RAPD
módszernél, csak a primerek hossza különbözik általában 20-34 nukleotidból állnak, tehát
kétszer vagy háromszor olyan hosszúak valamint a reakcióelegyben a primerek koncentrációja
magasabb. A PCR reakcióban a blokk hőmérsékletet meg kell változtatnunk és a
detektáláshoz nem ethidium-bromidos festést hanem radioaktív detektálást és poli-akril-amid
gélelektroforézist használunk.
2. 3. DAF
DNS amplifikációs újlenyomat melyet 1991-ben CETANO-ANOLLÉS et al. alkalmazott
először. A DAF reakcióban általában a primerek hossza 8-12 nukleotid körül mozog, de
kisebb primerekkel is kaphatunk egyedi mintázatot. A reakcióhoz egy primer szükséges de
primer párokat is alkalmazhatunk ebben az esetben az egyes primerekkel külön kapott
mintázatok összegződnek és egyes sávok eltűnnek és újak keletkeznek. Abban az esetben ha a
primereket külön-külön használjuk azok a genom diszkrét speciálisan a primerekkel
meghatározott részét fogják felszaporítani és jellegzetes fragmentumok keletkeznek.
A primerek szekvenciájának G+C tartalmának változtatásával szabályozni tudjuk a sávok
jellegzetességét és változatosságát. Magasabb G+C arányú primerekkel több fragmentumot
lehet kapni.
A sávok számát és polimorfizmusát növelhetjük ha a felszaporítást egy endonukleázos
emésztés előzi meg. Ebben az esetben tecMAAP-ről beszélünk (Template Endonuclease
Cleavage Multiple Arbitrary Amplification Profiling= Endonucleázos templát hasításos
töbszörös tetszés szerint amplifikációs profil)
5

A DAF technikát jól alkalmazhatjuk azonosság tesztelésére, populáció és pedigré analízisre,
közel izogén vonalak molekuláris jellemzésére és nagy felbontású genetikai térképek
készítésére.
2. 4. A miniszatellit polimorfizmus
A eukarióta genom nem kódoló régiójában, a heterokromatikus részekben előforduló DNS
szatelitek is felhazsnálhatóak a PCR technológiák során. A módszert VNTR (Variable
Number of Tandem Repeats=változó számú tandemismétlődések) nek nevezik.
A módszer röviden:
A genomban előforduló ismétlődő szatelit szekvenciák az ismétlődések számának
különbözősége miatt, mint molekuláris markerek használhatók. A változószámú tandem
ismétlődéseket vizsgáló eljárás az ismétlődések határszekvenciáira specifikus primereket
alkalmazva PCR reakció során szaporítja fel a különböző fragmentumokat, melyek
méretkülönbözőségei gélen történő elválasztással mutathatók ki. A módszer hátránya, hogy a
VNTR szekvenciák a genomban bizonyos régiókban (pl. centromer közeli régiók)
tömörödnek (BISZTRAY, 2001).
2. 5. A mikroszatellit markerek
A mikroszatellitek (1-5 nukleotidnyi) tandem ismétlődések, melyek a genomban szórtan
helyezkednek el. Kiváló genetikai markerek a legtöbb alacsony polimorfizmust mutató genom
esetében is. A határszekvenciákra specifikus primereket igényel a viszgálat. A fragmentumok
analízise automatizálható (BISZTRAY, 2001).
3. AFLP
A DNS makromolekulán bizonyos mintázatok szabályosan ismétlődnek. Ezeket a
szekvenciákat a különböző endonukleázok felismerik és az adott ponton a DNS molekulát
szét is hasítják. Az így kapott mintázatok (fragmentumok) száma, hossza az adott fajra,
egyedre jellemző, egyedi. Ha ezeket a nagyon kis koncenrtációban jelenlévő mintázatokat
rendszerezni tudjuk és lehetővé válik a megjelenítésük (detektálásuk) az egyes fajok vagy
egyedek között különbséget tudunk tenni. A köztük lévő genetikai távolságok pontosan
meghatározhatóak és egyéb értékelési módszerek kiindulási pontjait képezhetik (pl.
allélgyakoriság, cluster-analízis stb.).
1993-ban VOS at al. szabadalmaztatott, majd 1995-ben publikált egy olyan eljárást, amely
megoldja azt a problémát, mely a PCR-rel történő polimerizálás során lép fel, azaz ahhoz,
hogy egy adott DNS szakaszt felszaporítsunk legalább egy, kezdeti részének a bázissorrendjét
ismernünk kell. Ez a szekvenciaismeret azért nagyon fontos, mert a DNS-polimeráz enzim
csak akkor tudja elkezdeni a működését, ha rendelkezésére áll egy olan kevés bázisból álló,
egyszálú DNS szakasz, oligonukleotid, amely már előzőleg hozzákötődött a másolni kívánt
DNS-hez. Ezt az oligonukleotidot primernek nevezzük, mely a nevében is hordozza, hogy a
folyamat beindulására szolgál. Ezt természetesen egy másik enzim szintetizálja ra a szétnyílt
DNS láncra azon pontján, ahonnan az adott szakasz szintézise kezdődni fog. A PCR esetében
ezt az enzimet nem használjuk, hanem egy előre szintetizált primert adunk a reakcióelegyhez.
Ahhoz azonban, hogy tudjuk, milyen bázissorrendű primert vigyünk be a rendszerbe
ismernünk kell az adott DNS szakasz szekvenciáját. A RAPD módszer ezzel ellentétben
véletlenszerű primerekkel történő DNS „letapogatáson” alapul.
6

Erre kínál megoldást az AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) azaz felerősített
fragmentumhossz polimorfizmus. Polimorfizmusról akkor beszélünk, ha kettő vagy több
genetikai jelleg egy populációban nagyobb gyakorisággal jelenik meg, mint amelyre az
ismétlődő mutáció esetén számíthatunk.(HAJÓSNÉ, 1999)
Ennek lényege, hogy mivel ismerjük a DNS-t felszabdaló restrikciós endonukleázok hasítási
helyének szekvenciáját , azt is tudjuk, hogy a fragmentumok végein milyen bázisok vannak.
Ez csak néhány, 1-2 bázis ismeretét jelenti, de már elég ahhoz, hogy olyan adaptereket
ligáljunk a restrikciós fragmentumokhoz, amelyek a végekhez hozzá tudnak kötődni.(Lásd az
ábrán).
Mivel a fragmentek végén lévő néhány tíz bázis párból álló adapterek teljes bázissorrendjét
ismerjük, már csak olyan primereket kell hozzáadnunk amelyek ezekhez az adapterekhez
bekötődnek és amelyeket már a Taq polimeráz is felismer. Így szinte maradéktalanul fel
tudjuk szaporítani az összes fragmentumot anélkül, hogy akár csak a kezdeti szekvenciájukat
is ismernénk, a hasítási helyeket leszámítva (ZUBOR at al.).
Az AFLP három lépésből áll
1. templátkészítés
2. fragmentum felszaporítás
3. gélanalízis
A templátkészítéshez két restrikciós endunukleázt használunk, egy ritkán és egy gyakran
vágót. A ritkán vágó (EcoRI.- G↓AATTC)) nukleázok csökkentik az amplifikálódott
fragmentumok számát és szabályozzák a szükséges szelektív nukleotidok számát.
A gyakran vágó (MseI.- T↓TAA) kisebb fragmentumokat hoz létre és biztosítja a
fragmentumok diverztását.
A hasítást követi az adapterek szintézise a hasított fragmentumhoz. Az AFLP adapterek egy
központi szekvenciából és egy az enzim hasítási helyéhez kapcsolódó szekvenciából állnak.
Az adapterek úgy kapcsolódnak, hogy ligálás után a hasítási helyek nem alakulnak vissza. A
ligálási reakcióban a restrikciós enzimek működése miatt a fragmentumok egymással nem
kapcsolódnak. Az adapterek pedig azért nem tudnak egymással kapcsolódni, mert
7

foszforiláltak. A ligálás után olyan fragmentumokat kapunk, amelyek vagy MseI.-MseI. vagy
EcoRI-EcoRI. illetve EcoRI-MseI kapcsolódással rendelkeznek.
Második lépésben a primerek módosításával csökkentjük a felerősített szakaszok számát. A
primerek úgy épülnek fel, hogy van egy központi, komplementer részük, amellyel az adott
adapterhez kapcsolódni tudnak és egy olyan enzimspecifikus részük amelyet a Taq polimeráz
felismer. Ezen felül van még egy olyan három nukleotidból álló részük amit szabadon
választunk meg. Ennek a három szelektív bázisnak a módosításával eltérő primereket
hozhatunk létre.
Az tényleges amplifikációt egy preszelektív PCR előzi meg, maikor csak az első szelektív
bázist hatátozzuk meg. Ekkor csak azok a fragmentumok fognak felszaporodni, amelyeknél az
adott enzim hasítási helye után közvetlenül a primeren lévő szelektív bázis komplementere
megtalálható.
A továbbiakban olyan primereket alkalmazunk amelyeknél mind a három szelektív bázist
meghatározzuk. A módszerrel kiválóan szelektálhatunk a fragmentumok közül és biztosan
amplifikálunk olyat, ami csak az adott fajra jellemző.
A termékek felszaporítását követően poli-akril-amid gélelektroforézissel a fragmentumok
szétválaszthatóak. A fragmentumok megjelenítéshez radioaktív foszfor izotópos módszert
vagy ezüstfestést alkalmazhatunk. Így a következő gélképhez hasonló eredményeket
kaphatjuk:
8

Ezen a módon egy olyan adatrendszert kapunk, ahol az egyes mintáknál szerepel, hogy az
adott primer párral hány egyedi, illetve egy másik mintával hány közös fragmentje volt. Ez
alapján kiszámítható a minták relatív távolsága, amely aztán clusterenként ábrázolva jól
szemlélteti a vizsgált minták közti különbséget vagy azonosságot.
A módszer általánosan alkalmazott növény, állat, prokarióta stb. fajok közötti és fajon belüli
távolságok felmérésére, valamint géntéképezéshez, bulk szegregációs analítishez és
nemesítési anyagok genetikai különbözőségének a vizsgálatára. Hátránya, hogy az AFLP
markerek domináns öröklődést mutatnak, így a homo- és heterozigótákat nem lehet
megkülönböztetni a módszerrel.
4. A molekuláris genetikában alkalmazott elválasztás technikák
4. 1. Elválasztás elektromos töltés alapján
A biológiai makromolekulák nagy része töltést hordoz, amelynek nagysága környezeti
körülményektől függ. Az aminosavak amfoter tulajdonságúnak tekinthetők, amiknek a töltése
erősen függ az oldatban lévő hidrogén ionok negatív tízes alapú logaritmusától. Ezeket a
töltésbeli megoszlásokat jól ki lehet használni a molekulák elkülönítésénél. A molekulák
elválasztására szolgáló módszerek közül, két jelentős módszertani csoport van, ami a töltések
megoszlásán alapszik: az elektroforézis és az ioncserélő kromatográfia. Az ionkromatográfia
kis mennyiségű ionok gyors, hatékony elválasztása alkalmas nagyteljesítményű
folyadékkromatográfiás módszer, melyet a 70-es évek közepén fejlesztettek ki. Az oldott
kationok és anionok elválasztása valamint minőségi és mennyiségi meghatározásán HPLCoszlopba
(High Presure Liquid Cromatography) töltött kation- ill. anioncserélő gyantákon
történik, rendszerint konduktometriás detektálás mellett (KRISTÓF, 2000).
4. 1. 1. Az elektroforézis
Az elektroforézis volt az első olyan rendszer, amit sikerrel alkalmaztak fehérjék elvlasztására.
A klasszikus, Tiselius-féle elektroforézises rendszer az ún. szabad elektroforézises technikák
közé tartozik, a fehérjéket tartalmazó keveréket U alakú csőbe töltött puffer tetejére
rétegezték, majd egyenfeszültséggel elindították az elektroforézist. A fehérjemolekulák
vándorlását fotometriásan követték (BOROSS, 2003). A szabad elektroforézis napjainkban
ismét előtérbe került, az elektroforézist kapilláris csőben végzik, ami rendkívül nagy
felbontást tesz lehetővé, és módot ad mikroméretű preparatív elválasztásra is
(kapilláriselektroforézis). Az elektroforézis igazi sikere akkor következett be, amikor oldat
helyett megfelelő hordozót használtak közegként, amely biztosította, hogy az elektroforézis
befejezésével a zónák ne tudjanak szétdiffundálni. Hordozóként először speciális szűrőpapírt
alakalmaztak, amit pufferrel átnedvesítettek (papírelektroforézis). (SAJGÓ, 2003) A
szűrőpapírra vitt minta helyét és a retenciós időt a vizsgálat végén különböző színreakciókkal
lehet meghatározni.
Az elektroforézist gyakran együtt alkalmazzák autoradiográfiával (pl. Maxam-Gilbert féle
DNS szekvenálás, RFLP technikák). Ezt a módszert abban az esetben alkalmazzák, ha
szelektíven csak a vizsgálat során radioaktív izotóppal jelölt molekulák jelenlétére kíváncsiak.
Az izotópok megjelenítéséhez radiokatív filmet használunk.
9

4. 1. 2. A gélelektroforézis
Az elektroforetikus el-választástechnikában, nagy előrelépést jelentett a gél álló fázis
alkalmazása. Az imént említett, klasszikus, folyékony álló fázison történő szétválasztásnak és
a papírelektroforézisnek korlátozott az alkalmazása, hiszen a folyékony fázison szétválasztott
molekulák újra elegyednek és eluensek nem alkalmazhatók, papír hordozón pedig erősen
korlátozott a szétválasztható anyagok száma. Ilyen nehézségek ellenére, a lánchosszhoz
igazodó elektroforetikus elválasztás, nem csak lehetővé hanem elképzelhetetlenül
megbízhatóvá vált. Jól kezelhető és értékelhető formatartó eredményeket kapunk, ha a
molekulákat félkemény agaróz gélre visszük fel. Az agaróz egy növényi poliszaharid, ami a
D-galaktóz és a 3,6 anhidro L-galaktóz lineáris polimere és tengeri algából izolálják. Nagyobb
feloldóképessége miatt a poliakrilamid gélt is használják, amelynek porózus szerkezete
akrilamid (CH2=CH-CO-NH2) polimerizációjával jön létre a keresztkötést biztosító
N,N’-metilén-bisz–akrilamid (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2) jelenlétében. A
polimerizáció eredményeként színtelen, átlátszó rugalmas, szilárd, forralásnak és
fagyasztásnak ellenálló gél keletkezik. A gél sűrűségét, viszkozitását és pórusméretét az
akrilamid és a bisz-akrilamid koncentráció határozza meg. A polimerizációhoz szabad gyökök
képződése szükséges, amely termo- vagy fotokatalítikusan indítható meg (HAJÓSNÉ, 1999).
Az ilyen gélek pórusmérete erélyesen meghatározza, hogy milyen molekulák mozoghatnak
közte. A nukleinsavak, mivel tömegarányos töltésmennyiséggel rendelkeznek, a hosszúságuk
szerint fognak szétválni a gélen, a hosszabbak lassan, a rövidebbek gyorsabban fognak
keresztülvándorolni az álló fázis mátrix szerkezetén. Pontosabban, a megfelelő koncentrációjú
agaróz gélen egy lineáris duplex DNS molekulavándorlási sebessége ( és ezért az idő alatt a
megtett út) fordítottan arányos a molekula tömegének tízes alapú logaritmusával.
(PUTNOKY, 2000). Így még a nagyon hosszú láncú nukleinsavak ( 10 000-20 000 bázis) is
szétválaszthatók amik pár százalékos eltérést mutatnak és mindegyik lánc izolálható
(DARNELL, 1986)
Ily módon a fehérje láncok is szétválaszthatók hosszúságuk szerint, de az elektroforetikus
elválasztást egy SDS-es (sodium dodecyl sulfate vagy nátrium-lauril-szulfát, egy egyszerű
tisztító ágens ami a fogkrémben is megtalálható!) tisztító kezelésnek kell megelőznie.
(BALTIMORE, 1986)
A gél jóval nagyobb felbontást tesz lehetővé, mint a papírelektroforézis és rendelkezik azzal
az előnnyel, hogy a pórusméret a koncentrációval kalibrálható pl. 0,6% gél 1-20kb felbontás,
1,5% gél 0,2-0,3 kb felbontás. Megvalósítható az is, hogy a gél pórusméretét a két elektróda
közötti intervallumon belül folyamatosan változtatják, pórusgrádienst hoznak létre (grádienselektroforézis).
A módszer RNS szekvencia meghatározására is alkalmas. A méret
meghatározásban elért precizitás lehetővé tette, hogy kb. 50 cm hosszú poliakrilamid lemezen
végzett futtatás után meg tudják állapítani, hogy egy DNS-ből vagy RNS-ből származó
töredék 100 vagy 101 nukleotid hosszúságú-e (BOROSS, 2003). A DNS pH 7 körül negatív
töltéssel rendelkezik, így az elektromos erőtérben a (+) pólus felé fog vándorolni. Az
elválasztás annál jobb, minél lassabb a vándorlás. Az ismeretlen hosszúságú fragment
nagyságát úgy határozhatjuk meg, hogy mellette ismert hosszúságú fragmenteket tartalmazó
kontrolt (DNS létra) futtatunk és ennek segítségével - lemérve a vándorlási távolságokat -
kalibrációs görbét készítünk. A DNS fragmentek a gélben csak akkor láthatók, ha etídiumbromid
interaktáló festéket alkalmazunk és a gélt ultraibolya (UV) fénnyel megvilágítjuk. A
DNS 260 nm, a bázisok közé beékelődött fluoreszcens festék 300 nm illetve 360 nm
hullámhossznál rendelkezik elnyelési maximummal. A festék a gerjesztés hatására a látható
tartományban bocsát ki fényt (590 nm narancspíros). A festési eljárás több veszélyt hordoz
magában. Az etídium-bromid mutagén vegyület! (PUTNOKY, 2000)
11

4. 2. Centrifugálási technikák
A membrán illetve a sejtfal törmelékeit, a sejt egyéb alakos elemeit (mitochondriumokat,
liposzómákat stb.) centrifugálással különíthetjük el. Lényege az, hogy tengely körüli
forgómozgással a gravitációs érőteret megnöveljük. Egyszerű centrifugákban az elérhető
gravitációs gyorsulás 2000-5000 G, speciális ún. ultracentrifugákban a percenkénti 75000
fordulattal a nehézségi erő elérheti a földi gravitáció 500 000-szeresét is (összehasonlítás
kedvéért megjegyzem, hogy az űrhajósokat a fellövéskor maximálisan a földi nehézségi
gyorsulásnak hozzávetőlegesen 5-6 szorosa terheli, a mosógép centrifugája a földi nehézségi
gyorsulásnak hozzávetőlegesen 200 szorosát éri el.) A centrifugálás módszerének két
kiemelkedő technikája ismert: az úgynevezett sűrűségrádiens-centrifugálás és az
ultracentrifugálás. A sűrűséggrádiens-centrifugálás a preparatív biokémia gyakran alkalmazott
módszere. Lényege, hogy a centrifugacsőbe töltött oldószerben sűrűséggrádienst hozunk létre,
az oldószer sűrűsége a felszínen a legkisebb, a cső alján a legnagyobb. A vizsgálandó mintátamely
több, eltérő sűrűségű komponenst tartalmazhat- óvatosan az oldószer tetejére rétegzik,
majd a centrifugát elindítják. Az oldatban lévő komponensek a megnövekedett erőtér hatására
a centrifugálási erő irányába, a cső alja felé kezdenek vándorolni. Amikor azonban elérik azt
az oldószer réteget, amelynek sűrűsége megegyezik saját sűrűségükkel, tovább nem
vándorolnak, mert a felhajtó erő azonos lesz a nehézségi erővel. Az egyensúlyi helyzet beállta
után a centrifugát leállítják, a cső tartalmát térfogati frakciókra bontva óvatosan leszívják,
ezzel tiszta formában izolálhatók az eltérő sűrűségű komponensek.
Az ultracentrifuga mind analitikai, mind pedig, preparatív eszköz, segítségével nagy
pontossággal lehet meghatározni a makromolekulák molekulatömegét. A centrifugában
kialakuló igen nagy gravitációs tér a forgórész speciális kiépítését és meghajtását teszi
szükségessé.
A makromolekula az úgynevezett szedimentációs állandóval jellemezhető: s= v/ω 2 x,
amelyben s a szedimentációs állandó, ω a szögsebesség, x a forgásközponttól mért távolság. A
szedimentációs állandó dimenziója a sec. A fehérjék szedimentációs állandója 1-20·10 -13 sec
között változik, egységként a Svedberg-egységet (S) szokták alkalmazni, ami 10-13 sec
szedimentációs állandónak felel meg. (Svedberg svéd fizikokémikus az ultaracentrifuga
feltalálója).
Ez az egység elterjedten használatos, mind a fehérjék, mind a nukleinsavak, mind pedig sejtes
elemek különböző típusának jellemzésénél. A szedimentációs állandó sem csak a
molekulatömegtől függ, azonos szedimentációs állandójú molekulák vagy részecskék nem
feltétlenül azonos molekulatömegűek (SAJGÓ, 2003).
12

5. Bibliográfia
Bisztray Gy. (2001) in Velich István (2001): Növénygenetika, Mezőgazd. Kiad.
Boross László – Sajgó Mihály (2003): A biokémia alapjai, Mezőgazda Kiadó
Cetano-Anollés G.-Bassam B.J.-Gresshoff P.M (1992): Primer template interactions during
DNA amplification fingerprinting with single arbitrary oligonucleotides. Mol Gen Genet 235,
157-165.
Cetano-Anollés G.-Bassam B.J.-Gresshoff P.M.(1991): DNA amplification fingerprinting
using very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/Technology 9, 553-557.
Darnell-Lodish-Baltimore (1986): Molecular Cell Biology , Scientific American Books
Hajósné Novák M. (1999): Genetikai Variabilitás a növénynemesítésben, Mezőgazd. Kiad
Kaló P. (1999): RFLP és RAPD markerek. Növénytermelés 48, 549-558
Kristóf J.(2000): Kémiai analízis II. (Nagyműszeres analízis) Veszprémi Egyetemi Kiadó
Morell, M. K. – Peakall, R. – Appels, R. – Preston, L. R. – Lloyd, H. L. (1995). DNA
profiling technikes for plant variety identification. Austr J Exper Agric 35, 807-819
Mullis, M. K.- Faloona, F. A. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed
chain reaction. Methods Enzymol 155, 335-350
Poczai P., Taller J.,Szabó I. (2005): Különböző Solanum vonalak molekuláris genetikai
vizsgálata, XI. Ifjúsági Tudományos Fórum
Putnokí P. (2000): Molekuláris Biológiai Gyakorlatok, PTE TTK Genetikai és Molekuláris
Biológiai Tanszék
Sutka J. (2003): Növényi citogenetika, Mezőgazda Kiadó
Welsh, J.- McClelland, M. (1990). Fingerprinting genomes using PCR with arbitary primers.
Nucleic Acid Res 18, 7213-7218
Willams, K. at al. (1990). DNA polymorfism amplified by arbitary primers are useful as
genetic markers. Nuclesic Acids Res 18, 6531-6535
Zubor Á.-Surányi Gy.-Prokisch J.-Győri Z.-Borbély Gy.: AFLP módszerek alkalmazása
növényi minták azonosításához.
13

Tartalomjegyzék
POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓN ALAPULÓ MOLEKULÁRIS GENETIKAI
MÓDSZEREK ............................................................................................................. 1
KÉSZITETTE: POCZAI PÉTER.................................................................................. 1
1. A PCR MŰKÖDÉSI ELVE....................................................................................... 1
2. VÉLETLEN PRIMEREK HASZNÁLATÁN ALAPULÓ MÓDSZEREK.....................2
2.1. RAPD módszer jellemzése............................................................................................................................... 3
2. 1. 1. A RAPD módszer előnyei........................................................................................................................ 5
2. 1. 2. A RAPD módszer hátrányai..................................................................................................................... 5
2. 2. AP-PCR ...........................................................................................................................................................5
2. 3. DAF...................................................................................................................................................................5
2. 4. A miniszatellit polimorfizmus.........................................................................................................................6
2. 5. A mikroszatellit markerek..............................................................................................................................6
3. AFLP........................................................................................................................ 6
4. A MOLEKULÁRIS GENETIKÁBAN ALKALMAZOTT ELVÁLASZTÁS
TECHNIKÁK................................................................................................................ 9
4. 1. Elválasztás elektromos töltés alapján............................................................................................................9
4. 1. 1. Az elektroforézis...................................................................................................................................... 9
4. 1. 2. A gélelektroforézis................................................................................................................................. 11
4. 2. Centrifugálási technikák...............................................................................................................................12
5. BIBLIOGRÁFIA..................................................................................................... 13
14