Penetapan potensi antibiotika secara mikrobiologi - Biology East ...

Analisis HayatiPENETAPAN POTENSI ANTIBIOTIKASECARA MIKROBIOLOGIOleh : Dr. Harmita

Pendahuluan• Aktivitas (potensi) antibiotika dapat ditunjukkan padakondisi yang sesuai dengan efek daya hambatanterhadap mikroorganisme. Suatu penurunan aktivitasantimikroba juga akan dapat menunjukkan perubahankecil yang tidak dapat ditunjukkan oleh metode kimia,sehingga pengujian secara mikrobiologi atau biologibiasanya merupakan standar untuk mengatasi keraguantentang kemungkinan hilangnya aktivitas. Bab inimeringkaskan cara kerja penetapan antibiotika denganpengujian secara mikrobiologi.• Ada dua metode umum yang dapat digunakan, yaitupenetapan dengan lempeng-silinderatau “lempeng” danpenetapan dengan cara “tabung” atau turbidimetri

Peralatan• Semua peralatan harus dicuci bersihsebelum dan sesudah digunakan.Peralatan gelas untuk menyimpan danmemindahkan mikroorganisme uji,disterilkan dengan pemanasan kering ataudengan uap air.

Pengendalian Suhu• Pengendalian termostatik diperlukan dalam beberapatahap penetapan secara mikrobiologi, waktumembiakkan mikroorganisme dan penyiapan inokulanya,selama inkubasi dalam penetapan pada lempeng dantabung. Suhu pada penetapan dengan cara lempengdipertahankan pada lebih kurang 0,5°C C dari suhu yangdipilih. Pengendalian suhu yang lebih dekat (lebihkurang 0,1°C C dari suhu yang dipilih) sangat pentinguntuk inkubasi pada penetapan dengan cara tabung, halini dapat diperoleh dengan sirkulasi udara atau air,kapasitas panas dari air yang lebih besar lebihmenguntungkan daripada sirkulasi udara.

Spektrofotometer• Pengukuran transmitans dalam pita frekuensi yangsempit, membutuhkan spektrofotometer yang sesuai danmempunyai sumber cahaya panjang gelombang yangdapat diubah atau dibatasi menggunakan filter 530 nmuntuk pengukuran serapan pada pengujian dengan caratabung. Untuk tujuan tersebut, alat dapat diatur hinggadapat menerima tabung yang digunakan untuk inkubasidan menggunakan sel yang dimodifikasi yang dilengkapidengan pipa pembuangan untuk memudahkanpertukaran isi dengan cepat, atau lebih disukai sel yangmempunyai saluran untuk pengaliran secara sinambungselama pengukuran. Atur serapan dengan blangko untukserapan nol menggunakan media cair yang jernih tanpainokula yang disiapkan seperti dinyatakan untukmasing-masing antibiotika, termasuk sejumlah yangsesuai larutan uji dan formaldehida dalam setiap contoh.

Wadah Untuk PenetapanSecara Lempeng-Silinder• Untuk penetapan cara lempeng, gunakan cawanpetri kaca atau plastik (lebihkurang 20 mm x100 mm) yang mempunyai tutup dari bahanyang sesuai. Untuk silinder, gunakan silinderbesi tahan karat atau porselen dengan toleransiukuran masing-masinglebih kurang 0,1 mm;diameter luar 8 mm, diameter dalam 6 mm, dantinggi 10 mm. Cuci silinder dengan saksamauntukmembersihkansemuaresidu, kadang-kadangdiperlukansuatuasamsepertiasamnitrat 2 N atau asam kromat

Wadah Untuk PenetapanSecara Turbidimetri• Untuk penetapan dengan cara tabung reaksikaca atau plastik dengan ukuran misalnya 16mm x 125 mm x atau 18 mm x 150 mm yangpanjang, diameter dan ketebalannya relatifseragam serta permukaannya tidak cacat dantidak tergores. Tabung yang akan ditempatkanpada spektrofotometer harus yang sesuai, tanpagoresan dan tidak cacat. Bersihkan saksamatabung dari semua residu antibiotika dan sisalarutan pembersih, dan sterilkan sebelumdigunakan untuk penetapan berikutnya.

Media• Media yang diperlukan untuk penyiapan inokulamikroorganisme dibuat dari bahan-bahan yang tertera dibawah ini. Sedikit modifikasi dari masing-masing bahan,atau media kering yang direkonstitusi, dapat dilakukandengan syarat media yang dihasilkan mempunyai dayamenumbuhkan yang sama atau lebih baik danmemberikan respons kurva baku yang sama. Larutkanbahan-bahan dalam air hingga 1 L, dan atur pH larutanmenggunakan natrium hidroksida 1 N atau asam klorida1 N, hingga sesudah sterilisasi uap air didapatkan pHmedia sesuai.

Unit dan Baku Pembanding• Potensi antibiotika dinyatakan dalam“unit”atau “µg”aktivitasantibiotika. Baku Pembanding Farmakope Indonesia (BPFI) dikalibrasiasiterhadap baku primer antibiotika yang bersangkutan. Antibiotika BPFIdibuat dan diedarkan oleh instansi yang berwenang.• Pengertian “µg” aktivitas berasal dari sediaan antibiotika yang dipilihsebagai baku pembanding yang dianggap secara keseluruhan terdiri daribahan kimia tunggal, dan oleh karena itu dinyatakan potensi 1000 “µg”per mg. Dalam beberapa hal, sebagai hasil pengembangan metodepembuatan dan pemurnian antibiotika tertentu, aktivitas sediaan dapatlebih dari 1000 “µg”per mg. Karenanya dapat dimengerti bahwasediaan yang demikian mempunyai aktivitas yang setara dengan jumlahtertentu “µg”baku pembanding asli. Tetapi pada umumnya “µg”aktivitas adalah tepat setara secara numerik dengan µg g (bobot) sediaanmurni. Kesulitan timbul pada beberapa keadaan seperti jika antibiotikaterdiri dari bentuk basa bebas dan garamnya, dan “µg”aktivitasdinyatakan untuk salah satu dari bentuk tersebut, bahan antibiotikatikaterdiri dari sejumlah komponen yang memiliki sifat kimia yang sangatmirip tetapi mempunyai aktivitas antibiotika yang berbeda; atau potensidari satu kelompok antibiotika dinyatakan dengan baku pembandingyang merupakan salah satu antibiotika anggotanya, tetapi sediaan itusendiri dapat tidak serba sama (heterogen). Dalam hal ini “µg” aktivitasdinyatakan dalam “unit”. “µg”aktivitas harus tidak dianggap samadengan µg g (bobot) dari bahan antibiotika.•

Penyiapan Baku• Untuk menyiapkan larutan persediaan, larutkan sejumlahbaku pembanding antibiotika yang ditimbang saksamadan sebelumnya telah dikeringkan seperti yang terterapada Tabel 2.1, atau seluruh isi satu vial, jika diperlukan,dalam pelarut seperti yang tertera pada tabel 2.1.tersebut, kemudian encerkan hingga kadar yangdikehendaki. Simpan dalam lemari pendingin dangunakan dalam waktu yang ditentukan. Pada haripenetapan, buat pengenceran dari larutan persediaan 5atau lebih larutan untuk pengujian dengan kadarperbandingan 1:1,25 untuk penetapan dengan caralempeng silinderatau lebih kecil untuk penetapanturbidimetri. Gunakan pengencer akhir yang dinyatakandan urutan kadar dengan dosis tengah yang ditentukan.

Mikroorganisme dan InokulaMikroorganisme Uji• Mikroorganisme uji untuk setiap antibiotikatertera pada Tabel 2.2 beserta nomor identifikasiAmerican Type Culture Collection (ATCC) yangbersangkutan. Metode penetapan denganmikroorganisme uji tersebut tertera pada Tabel2.1. pelihara biakan pada media agar miringdengan kondisi inkubasi seperti tertera padaTabel 2.3 dan pindahkan setiap minggu padaagar miring yang baru. Untuk Klebsiellapneumoniae gunakan biakan tidak berkapsul.

Penyiapan Inokula• Untuk persiapan penetapan, inokulasikan biakan segarmikroorganisme dari agar miring atau biakan lain kepermukaan 250 ml media agar dalam sebuah botolRoux, kecuali untuk Streptococcus faccium dibiakkandalam media cair. Sebarkan suspensi secara merata keatas permukaan agar suspensi dengan bantuan butirankaca steril dan inkubasikan pada suhu yang ditetapkanselama waktu tertentu. Pada akhir periode inkubasi, buatsuspensi persediaan dengan mengumpulkan biakanpermukaan ke dalam 50 ml larutan natrium klorida 0,9% steril kecuali untuk Bleomisin (gunakan 50 ml Media34)

Cara Pengujian.• Rancangan Penetapan.Penetapan secara mikrobiologi memperoleh presisi yangmeyakinkan melalui pemisahan sumber-sumber penyebabkesalahan potensial serta bias yang relatif besar denganmenggunakan rancangan penetapan yang sesuai. Pada penetapandengan metode lempeng-silinder, perbandingan pokok dibatasihubungan pengukuran diameter hambatan antar lempeng, tidaktermasuk variasi di antara lempeng pada penyiapannya danpenanganan berikutnya. Untuk melaksanakan penetapanturbidimetri sehingga perbedaan kekeruhan yang diamati akanmenggambarkan perbedaan kadar antibiotika, diperlukankeseragaman suhu tabung melalui pengendali termostatik dalaminkubator dan penghindaran bias sistematik dengan penempatantabung secara acak dalam rak terpisah, setiap rak terdiri dari satu sset perlakuan yang lengkap. Perbandingan pokok kemudiandibatasi pada hubungan antara kekeruhan yang diamati padasetiap rak.

Metode Lempeng Silinder• Padapenyiapanlempengpenetapanmenggunakan cawan petri, tuang 21 mlMedia 2 dalammasing-masingdarisejumlahcawanyang diperlukandanbiarkan memadat sebagai lapisan dasaryang licindenganketebalanseragam,kecuali untuk Amfoterisin B, dan Nistatin,tidakdigunakanlapisandasaryangterpisah

Metode Turbidimetri• Pada hari penetapan, dipakai dosis yang diperlukan denganmengencerkan larutan persediaan baku dan setiap larutan uji.Tambahkan 1 ml setiap dosis pada masing-masing 3 tabung reaksiyang telah disiapkan dan tempatkan 3 replikat tabung dengan posisisecara acak pada rak tabung. Secara bersamaan letakkan padasetiap rak 1 tabung atau 2 tabung kontrol yang berisi 1 mlpengencer tetapi tanpa antibiotika. Setelah selesai semua pengisianlarutan (untuk Kandisidin dalam waktu 30 menit ketika airditambahkan pada larutan persediaan metil sulfoksida), tambahkan9,0 ml inokula ke dalam setiap tabung pada rak dan setelah lengkappengisian rak segera ditempatkan dalam inkubator atau tangas airdengan suhu yang dipertahankan pada 36°C C sampai 37,5°C C selama2 jam sampai 4 jam, kecuali untuk Kandisidin (inkubasi pada suhu27°C C sampai 29°C C selama 16 jam sampai 18 jam). Setelah inkubasi,tambahkan 0,5 ml larutan formaldehida encer ke dalam setiaptabung pada satu rak dalam waktu yang bersamaan, dan ukurtransmitans atau serapan pada 530 nm.

Pemasangan silinder / cakram filter padalapisan agar dalam cawan petri• Letakkan silinder besi tahan karat atau cakram kertasdengan jarak satu sama lain + 20-25 25 mm.Cara meneteskan larutan uji (U) dan larutan standar(S)• Urutan penetesan seperti pada gambar.• Teteskan setiap pengenceran 20 µl l pada silinder ataucakram kertas (diameter 6 mm)• Pada waktu meneteskan pada silinder besi tahan karatjangan kena dinding silinder.• Inkubasi selama 18-24 jam suhu 37°C.

• Cara 1:Untuk pengujian 3 dosis setiap sediaaanStandar (S)Uji (U)Jumlah zona kons. rendahJumlah zona kons. menengahJumlah zona kons. tinggiJumlah sediaanKontras linierS-- 1S 2S 3S 1+S 2+S 3=SS 3-S 1=L SU 1U 2U 3U 1+U 2+U 3=UU 3-U 1=L Ub=LS+ LU( d −1) InhY S=SndY U=UndYU−YSMU=b

• Rasio Potensi RU = antilog M U• Potensi = RU x 100%Keterangan :b = slope regresi zona log kons. semua sediaand = banyaknya ragam konsentrasi setiap sediaan = 3h = banyaknya sediaan termasuk standar = 2n = banyaknya penggandaan setiap perlakuan = 6I = interval log konsentrasi berdampingan(log S1-log S2 = log S2- log S3)

• Cara 2 :Untuk 2 dosis setiap sediaanU1 & S1 = diameter hambatandosis tinggiU2 & S2 = diameter hambatandosis rendahU ( U + U2) −(S1+ S2)log =S ( U + S)−(U + S )1×1122log4↓↓log PS1 = 1 µg 4x ==>log 4S2 = 4 µgS1 = 1 µg 2x ==>log 2S2 = 2 µgU1 & S1 = diameter hambatandosis tinggiU2 & S2 = diameter hambatandosis rendah

Cara 4Dengan 3 dosis atau 4 dosis setiap sediaanLarutan ujiDibuat larutan uji menggunakan pelarut yang sesuai untuk uji potensial sehinggadiperoleh larutan stok dengan konsentrasi 100 µg/ml (100 ppm)Encerkan larutan stok ini hingga diperoleh larutan dengan kadar seperti di bawah ini:U80,2 ppmU40,1 ppmU20,05 ppmU10,025 ppmLarutan sampelSiapkan larutan sampel yang konsentrasinya berada di antara konsentrasi larutan ujiS8± 0,2 ppmS4± 0,1 ppmS2± 0,05 ppmS1± 0,025 ppm

• Cara 3 :Untuk 2 dosis setiap sediaanPotensi = antilog (F/E x log KT/KR) x potensi standar (dalam µg/g atau %)E = 1/2 (ST – SR + BT – BR)F = 1/2 (ST + SR – BT – BR)ST = rata-rata zona hambatan larutan sampel tinggiSR = rata-rata zona hambatan larutan sampel rendahBT = rata-rata zona hambatan larutan baku tinggiBR = rata-rata zona hambatan larutan baku rendahKT = konsentrasi tinggiKR = konsentrasi rendahContoh uji potensi untuk 2 dosis setiap sediaanU1 = 25 mmS1 = 24,8 mmU2 = 20 mmS2 = 20 mmKT = 10 µg/mlKR = 5 µg/ml

Cara penetapan potensi.• Lakukan uji menggunakan cawan petri yang diisidengan 4 konsentrasi larutan uji (U1, U2, U4,U8) dan konsentrasi larutan sampel (S1, S2, S4,S8).• Jarak masing-masing cakram tidak kurang dari30 mm, karena diduga konsentrasi yangdijarakkan akan memberi diameter hambatansekitar 10-13 13 mm.• Lakukan inkubasi selama 24 jam.

Cara perhitungan1. Untuk 3 dosis setiap sediaan( U1+ U2+ U4) −(S1+ S2+ S4)logP=× log3( U + S ) −(U + S)8484( U2+ U4+ U8) −(S2+ S4+ S8)atau=× log3( U + S ) −(U + S )2. Untuk 4 dosis setiap sediaan(U1+ U2+ U4+ U)8−(S1+S2+ S4+ S)8logP =(U + U + S + S) −(U+ U + S + S )484821112212x log4

Con’d• Perhitungan potensi antibiotika secaraturbidimetriRumus :3a+2b+c-eL =53e+2d+c-aH=5L = Harga serapan (A) yang terendah yang dihasilkan kosentrasi terendah padakurva kalibrasiH = Harga serapan (A) tertinggi yang boleh dihasilkan oleh konsentrasi pada kurvakalibrasi a, b, c, d, e = Harga serapan yang dihasilkan dari konsentrasiterendah (a) sampai konsentrasi tertinggi (e)Dengan memasukkan harga serapan dari sampel ke kurva kalibrasi akan diperolehpotensi (µg/ml) dari sampel.