13.07.2015 Views

Uji Aktivitas Antijamur (+)-katekin dan gambir terhadap beberapa ...

Uji Aktivitas Antijamur (+)-katekin dan gambir terhadap beberapa ...

Uji Aktivitas Antijamur (+)-katekin dan gambir terhadap beberapa ...

SHOW MORE
SHOW LESS

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.

PENDAHULUAN


LATAR BELAKANGMenyirih merupakansalah satu kegiatan yangmemanfaatkan tanamantradisional.Gambir merupakansalah satu bahanmenyirih.Dibutuhkan penelitian ilmiah(SAINTIFIKASI) tentang kegunaan<strong>gambir</strong>Penelitian antijamur


Tujuan PenelitianMengetahui aktifitas anti jamur(+)- <strong>katekin</strong> <strong>gambir</strong> <strong>dan</strong> ekstrak air <strong>gambir</strong><strong>terhadap</strong> <strong>beberapa</strong> jamur.Mengetahui mekanismepenghambatan anti jamur (+)-<strong>katekin</strong><strong>gambir</strong> <strong>dan</strong> ekstrak air <strong>gambir</strong><strong>terhadap</strong> <strong>beberapa</strong> jamur.


Manfaat PenelitianPenelitian ini diharapkan memberikangambaran <strong>dan</strong> informasi tentang aktivitas antijamur dari (+)-<strong>katekin</strong> <strong>dan</strong> ekstrak air <strong>gambir</strong>,serta mekanisme panghambatannya <strong>terhadap</strong><strong>beberapa</strong> jamur untuk menunjang saintifikasi<strong>gambir</strong> sebagai pengobatan tradisional.


Bongkahan Gambir


Kandungan kimiaKandungan Kimia Daun Gambir <strong>dan</strong> Bongkahan GambirKandungan <strong>katekin</strong> total daun <strong>gambir</strong> 13,7 % (Anggraini etal, 2011), kandungan (+)-<strong>katekin</strong> daun <strong>gambir</strong> 9,4% (DasN.P, 1967).Kandungan utama bongkahan <strong>gambir</strong> adalah <strong>katekin</strong> (40-60%), zat penyamak (22-50%), serta sejumlah alkaloidseperti <strong>gambir</strong>tannin, turunan dihidro <strong>dan</strong> okso<strong>gambir</strong>tannin.(Wiart, 2006; Amos, 2010).Taniguchi et al (2008) menemukan 9 jenis <strong>katekin</strong> pada<strong>gambir</strong>, yakni, (+)-catechin, (-)-epicatechin Gambiriin A1,Gambiriin A2, Gambiriin B1, Gambiriin B2, Catechin-(4α-8)-ent-epicatechin, Gambirflavan D1 <strong>dan</strong> Gambirflavan D2.


Khasiat empirik• Kegunaan <strong>gambir</strong> secara tradisional adalah sebagai pelengkap makan sirih<strong>dan</strong> obat-obatan, <strong>gambir</strong> juga digunakan untuk obat luka bakar, disamping rebusan daun muda <strong>dan</strong> tunasnya digunakan sebagai obat diareserta obat kumur-kumur pada sakit kerongkongan.• Secara moderen <strong>gambir</strong> banyak digunakan sebagai bahan baku industrifarmasi <strong>dan</strong> makanan, di antaranya bahan baku obat penyakit hati denganpaten “catergen”, bahan baku permen yang melegakan kerongkongan bagiperokok di Jepang karena <strong>gambir</strong> mampu menetralisir nikotin.• Se<strong>dan</strong>gkan di Singapura <strong>gambir</strong> digunakan sebagai bahan baku obat sakitperut <strong>dan</strong> sakit gigi


(+)-Katekin• (+)-Katekin adalah golongan senyawa pilofenoltipe flavonoid, yang banyak dijumpai padateh, anggur, buah-buahan <strong>dan</strong> tumbuhtumbuhanpolon-polongan. Lima jenis <strong>katekin</strong>terbesar yaitu (+)- <strong>katekin</strong>, (-)- epi<strong>katekin</strong>, (-)-epigallo<strong>katekin</strong> (EGC), (-)- api<strong>katekin</strong> gallat,<strong>dan</strong> (-)- epi<strong>katekin</strong> gallat (I. C. W., Arts et al,1998).


Metode Pengujian AntimikrobaMetode DifusiMetode Dilusi


Bongkahan<strong>gambir</strong>DilarutkandalamaquadestFraksinasi etilasetatFreezedryingEkstrak etil asetat<strong>gambir</strong>Ekstrak air<strong>gambir</strong>Kromatografikolom(+)-<strong>katekin</strong><strong>Uji</strong> aktivitas antijamur


Pengujian aktivitas antijamurPenentuanzona hambatPengujian kebocoranmembran selPenentuan MICAnalisakebocoranprotein <strong>dan</strong> asamnukleat dgn UVAnalisa morfologi seldgn SEMAnalisa kebocoran ionlogam dgn AAS


Analisis kerusakan bakteri (Carson et al. 2002)Diambil 10ml suspensi bakteriSentrifuge dingin, kec 3500rpm, 20menitFiltrat dibuang, endapandicuci <strong>dan</strong> ditambahkanbuffer fosfatSuspensi disentrifuge, 15 mnt,kec 3500 rpmDiinkubasi shaker 24 jam,150rpmDitambahkan sampeldengan dosis 1 KHM & 2KHMDisaring dengan kertassaring sterilpelletAnalisis kerusakan seldengan SEMsupernatananalisis kebocoranprotein <strong>dan</strong> asam nukleatdengan spektro UV-VisAnalisis kebocoranion-ion logam K + <strong>dan</strong>Ca 2+ dengan AAS


HASIL PENELITIAN


Isolasi <strong>dan</strong> Identifikasi (+)-Katekin• Hasil dari KLT didapatkan <strong>beberapa</strong> fraksi yangdigabungkan, yaitu : 1-8, 9-10, 11-28, 29-40,41-75.• Persentase kadar (+)-<strong>katekin</strong> yang didapatsebesar 22,54%


Pengujian zona hambat<strong>Aktivitas</strong> Gambir <strong>dan</strong> Katekin <strong>terhadap</strong> 5 jamurpada konsentrasi 7000 µgNo. Jamur uji Diameter hambat1 Candida albicans -2 Saccharomyces cerevisiae -3 Fusarium oxysporum -4 Aspergillus niger -5 Aspergillus flavus -6 Kontrol pelarut -


Penentuan MICPenentuan nilai MIC2,5 mg/ml – 25 mg/mlNo. Jamur uji Nilai MIC (mg/ml)Gambir(+)-<strong>katekin</strong>12345Candida albicansSaccharomyces cerevisiaeFusarium oxysporumAspergillus nigerAspergillus flavus- -7,5 12,5- -- -- -6 Kontrol pelarut - -


Analisa kebocoran protein <strong>dan</strong> asamnukleat dgn spektrofotometri UV VISData Spektrofotometri UV VIS Gambir S.cerevisiaePanjanggelombangAbsorbansiKontrol 1 MIC 2 MIC260 nm280 nm0,693 0,747 0,8730,870 0,895 0,957


Analisa kebocoran protein <strong>dan</strong> asamnukleat dgn spektrofotometri UV VISData Spektrofotometri UV VIS (+)-Katekin S.cerevisiaePanjanggelombangAbsorbansikontrol 1 MIC 2 MIC260 nm280 nm0,693 1,575 1,8160,870 2,032 2,658


Analisa kebocoran ion-ion logamKonsentrasi Data ion Ca 2+ Data ion K +(+)-<strong>katekin</strong> Gambir (+)-<strong>katekin</strong> GambirKontrol Ca 2+ 1,57 1,57 1,57 1,57Kontrol K + 85,7 85,7 85,7 85,71 MIC 5,96 2,73 88,5 92,92 MIC 6,36 4,99 89,4 119,5


Perubahan Morfologi SelSaccharomyces cerevisiae(a) (b) (c)


Perubahan Morfologi SelSaccharomyces cerevisiae(d)(e)


Perubahan Morfologi SelSaccharomyces cerevisiae• Morfologi sel S. cerevisiae kontrol (a), sel S.cerevisiae setelah perlakuan dengan <strong>gambir</strong> 1MIC (b), sel S. cerevisiae setelah perlakuandengan <strong>gambir</strong> 2 MIC (c), sel S.cerevisiaesetelah perlakuan dengan <strong>katekin</strong> 1 MIC(d),<strong>dan</strong> sel S. cerevisiae setelah perlakuan dengan<strong>katekin</strong> 2 MIC (e) (Pembesaran 15.000 kali).Tanda panah adalah terjadinya kerusakan sel.


KESIMPULAN1. Persentase kadar (+)-<strong>katekin</strong> yang disiolasi dari<strong>gambir</strong> yang berasal dari Payakumbuh,Sumatera Barat sebesar 22,54%.2. Nilai MIC <strong>gambir</strong> pada S. cerevisiae (LIPIMC)adalah 7,5 mg/ml <strong>dan</strong> untuk (+)-<strong>katekin</strong> sebesar12,5 mg/ml. Se<strong>dan</strong>gkan <strong>gambir</strong> <strong>dan</strong> (+)-<strong>katekin</strong>tidak menunjukan aktivitas antijamur <strong>terhadap</strong>C. albicans (LIPIMC), A. niger (LIPIMC 759), A.flavus (LIPIMC 745), F.oxysporum (LIPIMC 762)hingga konsentrasi uji 25 mg/ml.


KESIMPULAN3. Mekanisme penghambatan <strong>gambir</strong> <strong>dan</strong> <strong>katekin</strong><strong>terhadap</strong> Saccharomyces cerevisiae adalah denganmengganggu permeabilitas membran sel.4. Karena <strong>gambir</strong> <strong>dan</strong> (+)-<strong>katekin</strong> <strong>terhadap</strong> C. albicans,A. niger, A. flavus , F.oxysporum , <strong>dan</strong> S. cerevisiaetidak menunjukan aktivitas hingga konsentrasi 25mg/ml, maka sampel uji diklasifikasikan sebagaiantimikroba resistant menurut data pengujianUniversity of Pennsylvania dalam University ofPennsylvania Medical Centre Guide Lines forAntimicrobial Therapy.


saran1. Perlu diperhatikan kualitas <strong>gambir</strong>, agardidapatkan hasil uji yang lebih baik.2. Perlu dilakukan penelitian <strong>terhadap</strong> (+)-<strong>katekin</strong> <strong>dan</strong> <strong>gambir</strong> untuk pemanfaatanlainnya.


Tinjauan Tentang JamurciricendawanpH optimum 3,8-5,6Suhu optimumGas22-30 0 C (saprofit);30-37 0 C (parasit)Aerobic obligat (kapang); FakultatifCahaya(khamir)Tidak adaKadar gula dalam medium laboratories 4-5%KarbonKomponen structural dinding selKerentanan <strong>terhadap</strong> antibioticOrganicKitin, selulose, atau glukanpeka <strong>terhadap</strong> griseofulvin


• Pembuatan Medium• Potato Dextrose Agar (PDA)• Serbuk PDA sebanyak 39 gram dilarutkandalam 1 L aquadest <strong>dan</strong> dipanaskan sampaimendidih sehingga larut. Larutan tersebutkemudian disterilkan dalam autoklaf padasuhu 121 °C selama 15 menit.


• Potato Dextrose Broth (PDB)• Serbuk PDB sebanyak 24 gram dilarutkandalam 1 L aquadest <strong>dan</strong> dipanaskan sampaimendidih sehingga larut. Kemudian disterilkandalam autoklaf pada suhu 121 °C selama 15menit.


• Pembuatan larutan <strong>Uji</strong>• Larutan uji dibuat dengan melarutkan <strong>gambir</strong>dengan DMSO 10% <strong>dan</strong> <strong>katekin</strong> dilarutkan dalamaseton (pengujian zona hambat) <strong>dan</strong> dalammethanol 20% (pengujian MIC). Untukpenentuan zona hambat antijamur, konsentrasilarutan uji yang dibuat sebesar 350 mg/ml untukpenentuan zona hambat jamur. Se<strong>dan</strong>gkan untukpenentuan nilai MIC konsentrasi larutan uji yangdigunakan adalah 2,5 mg/ml; 5 mg/ml; 7,5mg/ml; 10 mg/ml; 12,5 mg/ml; 15 mg/ml; 17,5mg/ml; 20 mg/ml; 22,5 mg/ml; <strong>dan</strong> 25 mg/ml.


• Pembuatan Stok Jamur• Jamur uji diinokulasi dalam media agar PDAyang dibuat membentuk agar miring dengancara menggoreskan masing-masing jamurmenggunakan jarum ose steril ke dalam 5 mlmedia agar miring PDA <strong>dan</strong> diinkubasi padasuhu ruang selama waktu tumbuh optimummasing-masing jamur.


• Penentuan Diameter Daerah Hambat• Penentuan aktivitas antijamur dari <strong>gambir</strong> <strong>dan</strong> (+)- <strong>katekin</strong><strong>terhadap</strong> Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillusniger, Aspergillus flavus ,<strong>dan</strong> Fusarium oxysporum dilakukan denganmetode difusi agar menggunakan kertas cakram. Media agar PDAyang sudah dicairkan sebanyak 20 ml dituang ke dalam cawan petristeril <strong>dan</strong> dibiarkan menjadi padat. Setelah memadat, suspensi darisetiap jamur sebanyak 0,1 ml disebar ke permukaan agar secaramerata pada cawan yang berbeda. Kertas cakram steril diletakkan diatas medium agar <strong>dan</strong> ditetesi larutan uji sebanyak 20 µl. Untukkontrol negatif digunakan pelarut DMSO 10% (pengujian <strong>gambir</strong>)<strong>dan</strong> aseton (pengujian <strong>katekin</strong>) sebanyak 20 µl pada setiap jamuruji. Masing-masing cawan petri diinkubasi pada suhu ruang selamawaktu tumbuh optimum masing-masing jamur. <strong>Aktivitas</strong> antijamurdiamati berdasarkan diameter daerah hambat yang terbentuk disekeliling kertas cakram. Pengujian dilakukan secara duplo.


• Analisis Kebocoran Protein <strong>dan</strong> Asam Nukleat (Carson et al., 2002)• Analisis kebocoran sel dilakukan dengan menggunakanspektrofotometer <strong>dan</strong> pengukuran absorbansi dilakukan padapanjang gelombang 260 nm (untuk kandungan nitrogen dari asamnukleat) <strong>dan</strong> panjang gelombang 280 nm (untuk kandungannitrogen dari protein). Suspensi jamur uji sebanyak 10 ml, yangtelah ditumbuhkan selama 24 jam dalam media PDB, disentrifusdingin dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit. Filtrat dibuanglalu endapan sel disuspensikan dengan 9,5 ml buffer fosfat pH 7,0.Selanjutnya ditambahkan sampel uji dengan dosis 1 MIC, 2 MIC <strong>dan</strong>kontrol, diinkubasi dalam shaker inkubator selama 48 jam. Setelahdiinkubasi, suspensi disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama15 menit, lalu disaring untuk memisahkan supernatan dari sel.Cairan supernatan diambil <strong>dan</strong> diukur absorbansinya pada panjanggelombang 260 nm <strong>dan</strong> 280 nm dengan menggunakanspektrofotometer UV. Pellet jamur dikoleksi untuk difoto denganSEM dengan perlakuan pada prosedur


Penentuan diameter zona hambat bakteriPDA steril yang telah memadatDiinokulasikan 0,1 ml suspensi selbakteriDiratakan dengan batang spreaderDiletakan kertas cakram sterilDiteteskan 10 µl (+)-Katekin/ ekstrak GambirDiinkubasi suhu 370 C, 24 jamDiukur zona bening disekitar cakram


Penentuan KHM Ekstrak Gambir & (+)-KatekinMicroplateLarutan uji <strong>dan</strong> pembanding (+50 µl)Larutan kontrolEkstrak Gambir+100 µl MHB, + 100 µlsuspensi bakteri(+)-Katekin150 µlMHB+100µl suspensibakteri100 µlMHB+100µlsuspensibakteri+50 µlpelarut200 µlMHB+50µl pelarut250µlmediumDiinkubasi 24 jam, 37 o CDi plating, diinkubasi selama 24 jam37 o CDiamati pertumbuhan bakteri


Analisis kerusakan Jamur (Carson et al. 2002)Diambil 10ml suspensi bakteriSentrifuge dingin, kec 3500rpm, 20menitFiltrat dibuang, endapandicuci <strong>dan</strong> ditambahkanbuffer fosfatSuspensi disentrifuge, 15 mnt,kec 3500 rpmDiinkubasi shaker 24 jam,150rpmDitambahkan sampeldengan dosis 1 KHM & 2KHMDisaring dengan kertassaring sterilpelletAnalisis kerusakan seldengan SEMsupernatananalisis kebocoranprotein <strong>dan</strong> asam nukleatdengan spektro UV-VisAnalisis kebocoranion-ion logam K + <strong>dan</strong>Ca 2+ dengan AAS


Penentuan diameter zona hambat bakteriMHA steril yang telah memadatDiinokulasikan 0,1 ml suspensi selbakteriDiratakan dengan batang spreaderDiletakan kertas cakram sterilDiteteskan 10 µl (+)-Katekin/ ekstrak GambirDiinkubasi suhu 370 C, 24 jamDiukur zona bening disekitar cakram

Hooray! Your file is uploaded and ready to be published.

Saved successfully!

Ooh no, something went wrong!