Uji Aktivitas Antijamur (+)-katekin dan gambir terhadap beberapa ...

PENDAHULUAN

LATAR BELAKANGMenyirih merupakansalah satu kegiatan yangmemanfaatkan tanamantradisional.Gambir merupakansalah satu bahanmenyirih.Dibutuhkan penelitian ilmiah(SAINTIFIKASI) tentang kegunaangambirPenelitian antijamur

Tujuan PenelitianMengetahui aktifitas anti jamur(+)- katekin gambir dan ekstrak air gambirterhadap beberapa jamur.Mengetahui mekanismepenghambatan anti jamur (+)-katekingambir dan ekstrak air gambirterhadap beberapa jamur.

Manfaat PenelitianPenelitian ini diharapkan memberikangambaran dan informasi tentang aktivitas antijamur dari (+)-katekin dan ekstrak air gambir,serta mekanisme panghambatannya terhadapbeberapa jamur untuk menunjang saintifikasigambir sebagai pengobatan tradisional.

Bongkahan Gambir

Kandungan kimiaKandungan Kimia Daun Gambir dan Bongkahan GambirKandungan katekin total daun gambir 13,7 % (Anggraini etal, 2011), kandungan (+)-katekin daun gambir 9,4% (DasN.P, 1967).Kandungan utama bongkahan gambir adalah katekin (40-60%), zat penyamak (22-50%), serta sejumlah alkaloidseperti gambirtannin, turunan dihidro dan oksogambirtannin.(Wiart, 2006; Amos, 2010).Taniguchi et al (2008) menemukan 9 jenis katekin padagambir, yakni, (+)-catechin, (-)-epicatechin Gambiriin A1,Gambiriin A2, Gambiriin B1, Gambiriin B2, Catechin-(4α-8)-ent-epicatechin, Gambirflavan D1 dan Gambirflavan D2.

Khasiat empirik• Kegunaan gambir secara tradisional adalah sebagai pelengkap makan sirihdan obat-obatan, gambir juga digunakan untuk obat luka bakar, disamping rebusan daun muda dan tunasnya digunakan sebagai obat diareserta obat kumur-kumur pada sakit kerongkongan.• Secara moderen gambir banyak digunakan sebagai bahan baku industrifarmasi dan makanan, di antaranya bahan baku obat penyakit hati denganpaten “catergen”, bahan baku permen yang melegakan kerongkongan bagiperokok di Jepang karena gambir mampu menetralisir nikotin.• Sedangkan di Singapura gambir digunakan sebagai bahan baku obat sakitperut dan sakit gigi

(+)-Katekin• (+)-Katekin adalah golongan senyawa pilofenoltipe flavonoid, yang banyak dijumpai padateh, anggur, buah-buahan dan tumbuhtumbuhanpolon-polongan. Lima jenis katekinterbesar yaitu (+)- katekin, (-)- epikatekin, (-)-epigallokatekin (EGC), (-)- apikatekin gallat,dan (-)- epikatekin gallat (I. C. W., Arts et al,1998).

Metode Pengujian AntimikrobaMetode DifusiMetode Dilusi

BongkahangambirDilarutkandalamaquadestFraksinasi etilasetatFreezedryingEkstrak etil asetatgambirEkstrak airgambirKromatografikolom(+)-katekinUji aktivitas antijamur

Pengujian aktivitas antijamurPenentuanzona hambatPengujian kebocoranmembran selPenentuan MICAnalisakebocoranprotein dan asamnukleat dgn UVAnalisa morfologi seldgn SEMAnalisa kebocoran ionlogam dgn AAS

Analisis kerusakan bakteri (Carson et al. 2002)Diambil 10ml suspensi bakteriSentrifuge dingin, kec 3500rpm, 20menitFiltrat dibuang, endapandicuci dan ditambahkanbuffer fosfatSuspensi disentrifuge, 15 mnt,kec 3500 rpmDiinkubasi shaker 24 jam,150rpmDitambahkan sampeldengan dosis 1 KHM & 2KHMDisaring dengan kertassaring sterilpelletAnalisis kerusakan seldengan SEMsupernatananalisis kebocoranprotein dan asam nukleatdengan spektro UV-VisAnalisis kebocoranion-ion logam K + danCa 2+ dengan AAS

HASIL PENELITIAN

Isolasi dan Identifikasi (+)-Katekin• Hasil dari KLT didapatkan beberapa fraksi yangdigabungkan, yaitu : 1-8, 9-10, 11-28, 29-40,41-75.• Persentase kadar (+)-katekin yang didapatsebesar 22,54%

Pengujian zona hambatAktivitas Gambir dan Katekin terhadap 5 jamurpada konsentrasi 7000 µgNo. Jamur uji Diameter hambat1 Candida albicans -2 Saccharomyces cerevisiae -3 Fusarium oxysporum -4 Aspergillus niger -5 Aspergillus flavus -6 Kontrol pelarut -

Penentuan MICPenentuan nilai MIC2,5 mg/ml – 25 mg/mlNo. Jamur uji Nilai MIC (mg/ml)Gambir(+)-katekin12345Candida albicansSaccharomyces cerevisiaeFusarium oxysporumAspergillus nigerAspergillus flavus- -7,5 12,5- -- -- -6 Kontrol pelarut - -

Analisa kebocoran protein dan asamnukleat dgn spektrofotometri UV VISData Spektrofotometri UV VIS Gambir S.cerevisiaePanjanggelombangAbsorbansiKontrol 1 MIC 2 MIC260 nm280 nm0,693 0,747 0,8730,870 0,895 0,957

Analisa kebocoran protein dan asamnukleat dgn spektrofotometri UV VISData Spektrofotometri UV VIS (+)-Katekin S.cerevisiaePanjanggelombangAbsorbansikontrol 1 MIC 2 MIC260 nm280 nm0,693 1,575 1,8160,870 2,032 2,658

Analisa kebocoran ion-ion logamKonsentrasi Data ion Ca 2+ Data ion K +(+)-katekin Gambir (+)-katekin GambirKontrol Ca 2+ 1,57 1,57 1,57 1,57Kontrol K + 85,7 85,7 85,7 85,71 MIC 5,96 2,73 88,5 92,92 MIC 6,36 4,99 89,4 119,5

Perubahan Morfologi SelSaccharomyces cerevisiae(a) (b) (c)

Perubahan Morfologi SelSaccharomyces cerevisiae(d)(e)

Perubahan Morfologi SelSaccharomyces cerevisiae• Morfologi sel S. cerevisiae kontrol (a), sel S.cerevisiae setelah perlakuan dengan gambir 1MIC (b), sel S. cerevisiae setelah perlakuandengan gambir 2 MIC (c), sel S.cerevisiaesetelah perlakuan dengan katekin 1 MIC(d),dan sel S. cerevisiae setelah perlakuan dengankatekin 2 MIC (e) (Pembesaran 15.000 kali).Tanda panah adalah terjadinya kerusakan sel.

KESIMPULAN1. Persentase kadar (+)-katekin yang disiolasi darigambir yang berasal dari Payakumbuh,Sumatera Barat sebesar 22,54%.2. Nilai MIC gambir pada S. cerevisiae (LIPIMC)adalah 7,5 mg/ml dan untuk (+)-katekin sebesar12,5 mg/ml. Sedangkan gambir dan (+)-katekintidak menunjukan aktivitas antijamur terhadapC. albicans (LIPIMC), A. niger (LIPIMC 759), A.flavus (LIPIMC 745), F.oxysporum (LIPIMC 762)hingga konsentrasi uji 25 mg/ml.

KESIMPULAN3. Mekanisme penghambatan gambir dan katekinterhadap Saccharomyces cerevisiae adalah denganmengganggu permeabilitas membran sel.4. Karena gambir dan (+)-katekin terhadap C. albicans,A. niger, A. flavus , F.oxysporum , dan S. cerevisiaetidak menunjukan aktivitas hingga konsentrasi 25mg/ml, maka sampel uji diklasifikasikan sebagaiantimikroba resistant menurut data pengujianUniversity of Pennsylvania dalam University ofPennsylvania Medical Centre Guide Lines forAntimicrobial Therapy.

saran1. Perlu diperhatikan kualitas gambir, agardidapatkan hasil uji yang lebih baik.2. Perlu dilakukan penelitian terhadap (+)-katekin dan gambir untuk pemanfaatanlainnya.

Tinjauan Tentang JamurciricendawanpH optimum 3,8-5,6Suhu optimumGas22-30 0 C (saprofit);30-37 0 C (parasit)Aerobic obligat (kapang); FakultatifCahaya(khamir)Tidak adaKadar gula dalam medium laboratories 4-5%KarbonKomponen structural dinding selKerentanan terhadap antibioticOrganicKitin, selulose, atau glukanpeka terhadap griseofulvin

• Pembuatan Medium• Potato Dextrose Agar (PDA)• Serbuk PDA sebanyak 39 gram dilarutkandalam 1 L aquadest dan dipanaskan sampaimendidih sehingga larut. Larutan tersebutkemudian disterilkan dalam autoklaf padasuhu 121 °C selama 15 menit.

• Potato Dextrose Broth (PDB)• Serbuk PDB sebanyak 24 gram dilarutkandalam 1 L aquadest dan dipanaskan sampaimendidih sehingga larut. Kemudian disterilkandalam autoklaf pada suhu 121 °C selama 15menit.

• Pembuatan larutan Uji• Larutan uji dibuat dengan melarutkan gambirdengan DMSO 10% dan katekin dilarutkan dalamaseton (pengujian zona hambat) dan dalammethanol 20% (pengujian MIC). Untukpenentuan zona hambat antijamur, konsentrasilarutan uji yang dibuat sebesar 350 mg/ml untukpenentuan zona hambat jamur. Sedangkan untukpenentuan nilai MIC konsentrasi larutan uji yangdigunakan adalah 2,5 mg/ml; 5 mg/ml; 7,5mg/ml; 10 mg/ml; 12,5 mg/ml; 15 mg/ml; 17,5mg/ml; 20 mg/ml; 22,5 mg/ml; dan 25 mg/ml.

• Pembuatan Stok Jamur• Jamur uji diinokulasi dalam media agar PDAyang dibuat membentuk agar miring dengancara menggoreskan masing-masing jamurmenggunakan jarum ose steril ke dalam 5 mlmedia agar miring PDA dan diinkubasi padasuhu ruang selama waktu tumbuh optimummasing-masing jamur.

• Penentuan Diameter Daerah Hambat• Penentuan aktivitas antijamur dari gambir dan (+)- katekinterhadap Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillusniger, Aspergillus flavus ,dan Fusarium oxysporum dilakukan denganmetode difusi agar menggunakan kertas cakram. Media agar PDAyang sudah dicairkan sebanyak 20 ml dituang ke dalam cawan petristeril dan dibiarkan menjadi padat. Setelah memadat, suspensi darisetiap jamur sebanyak 0,1 ml disebar ke permukaan agar secaramerata pada cawan yang berbeda. Kertas cakram steril diletakkan diatas medium agar dan ditetesi larutan uji sebanyak 20 µl. Untukkontrol negatif digunakan pelarut DMSO 10% (pengujian gambir)dan aseton (pengujian katekin) sebanyak 20 µl pada setiap jamuruji. Masing-masing cawan petri diinkubasi pada suhu ruang selamawaktu tumbuh optimum masing-masing jamur. Aktivitas antijamurdiamati berdasarkan diameter daerah hambat yang terbentuk disekeliling kertas cakram. Pengujian dilakukan secara duplo.

• Analisis Kebocoran Protein dan Asam Nukleat (Carson et al., 2002)• Analisis kebocoran sel dilakukan dengan menggunakanspektrofotometer dan pengukuran absorbansi dilakukan padapanjang gelombang 260 nm (untuk kandungan nitrogen dari asamnukleat) dan panjang gelombang 280 nm (untuk kandungannitrogen dari protein). Suspensi jamur uji sebanyak 10 ml, yangtelah ditumbuhkan selama 24 jam dalam media PDB, disentrifusdingin dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit. Filtrat dibuanglalu endapan sel disuspensikan dengan 9,5 ml buffer fosfat pH 7,0.Selanjutnya ditambahkan sampel uji dengan dosis 1 MIC, 2 MIC dankontrol, diinkubasi dalam shaker inkubator selama 48 jam. Setelahdiinkubasi, suspensi disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama15 menit, lalu disaring untuk memisahkan supernatan dari sel.Cairan supernatan diambil dan diukur absorbansinya pada panjanggelombang 260 nm dan 280 nm dengan menggunakanspektrofotometer UV. Pellet jamur dikoleksi untuk difoto denganSEM dengan perlakuan pada prosedur

Penentuan diameter zona hambat bakteriPDA steril yang telah memadatDiinokulasikan 0,1 ml suspensi selbakteriDiratakan dengan batang spreaderDiletakan kertas cakram sterilDiteteskan 10 µl (+)-Katekin/ ekstrak GambirDiinkubasi suhu 370 C, 24 jamDiukur zona bening disekitar cakram

Penentuan KHM Ekstrak Gambir & (+)-KatekinMicroplateLarutan uji dan pembanding (+50 µl)Larutan kontrolEkstrak Gambir+100 µl MHB, + 100 µlsuspensi bakteri(+)-Katekin150 µlMHB+100µl suspensibakteri100 µlMHB+100µlsuspensibakteri+50 µlpelarut200 µlMHB+50µl pelarut250µlmediumDiinkubasi 24 jam, 37 o CDi plating, diinkubasi selama 24 jam37 o CDiamati pertumbuhan bakteri

Analisis kerusakan Jamur (Carson et al. 2002)Diambil 10ml suspensi bakteriSentrifuge dingin, kec 3500rpm, 20menitFiltrat dibuang, endapandicuci dan ditambahkanbuffer fosfatSuspensi disentrifuge, 15 mnt,kec 3500 rpmDiinkubasi shaker 24 jam,150rpmDitambahkan sampeldengan dosis 1 KHM & 2KHMDisaring dengan kertassaring sterilpelletAnalisis kerusakan seldengan SEMsupernatananalisis kebocoranprotein dan asam nukleatdengan spektro UV-VisAnalisis kebocoranion-ion logam K + danCa 2+ dengan AAS

Penentuan diameter zona hambat bakteriMHA steril yang telah memadatDiinokulasikan 0,1 ml suspensi selbakteriDiratakan dengan batang spreaderDiletakan kertas cakram sterilDiteteskan 10 µl (+)-Katekin/ ekstrak GambirDiinkubasi suhu 370 C, 24 jamDiukur zona bening disekitar cakram