Ricerca Sanitaria Finalizzata - anno 2003 - Regione Piemonte

Direzione Sanità Pubblica
Progetti finanziati nell’anno 2003
Relazioni finali
(sintesi)
Torino, Marzo 2007

Questa pubblicazione riporta le relazioni finali sintetiche dei progetti finanziati con il bando
dell’anno 2003.
Tali relazioni sono state predisposte direttamente dai responsabili del progetto e solo in qualche
raro caso si sono resi necessari alcuni adattamenti formali irrilevanti rispetto alla sostanza del
lavori.
Gli interessati ad approfondire specifici temi trattati possono, oltre ad attivare contatti diretti con i
ricercatori, accedere alla consultazione del testo integrale dei progetti, previa autorizzazione da
parte della Direzione Sanità Pubblica - Settore Igiene e Sanità Pubblica - (e-mail
sanita.pubblica@regione.piemonte.it).
Redazione a cura:
Direzione Sanità Pubblica
Direttore regionale: Dr. Vittorio Demicheli
Settore Igiene e Sanità Pubblica:
Dirigente responsabile: Dr.ssa Michela Audenino
Coordinamento editoriale:
Dr.ssa Elisa Luparia
La responsabilità dei dati scientifici e tecnici è degli autori.
Riproduzione a cura del Centro Stampa della Regione Piemonte

Ogni anno la Regione Piemonte destina una significativa somma di circa 3.000.000,00=
Euro alla Ricerca Sanitaria Finalizzata, attività impegnativa, qualificante e promettente
nel garantire una buona sanità e, almeno indirettamente, nel promuovere salute.
La marcia verso questo traguardo di tutela e di promozione della salute è variegata e
multiforme, è caratterizzata da progetti e da stili operativi che comprendono ricerche
analitiche biomolecolari, esplorazione di meccanismi patogenetici, identificazione di
marcatori diagnostici e prognostici, valutazioni di efficacia di farmaci e validazione di
protocolli terapeutici, ricerche epidemiologiche tese alla valutazione di rischi attribuibili a
fattori eziologici psico-sociali, ambientali e alimentari.
La specifica attività di ricerca rappresenta dunque, insieme alla buona organizzazione
generale di sistema e alla formazione/informazione, un fattore ed una componente
cardine per perseguire una buona qualità ed una migliore efficacia degli interventi di
assistenza e di prevenzione.
Il sostegno alla ricerca continuerà ad essere un obiettivo strategico delle politiche
sanitarie e sociali della nostra Regione, nonostante le inderogabili riduzioni di
finanziamenti.
Questa quarta relazione sulle ricerche completate si propone di documentare e
socializzare il lavoro svolto, consentendo ad ogni lettore interessato libere ed
interlocutorie riflessioni sull’efficacia e sull’appropriatezza delle singole ricerche.
Tramite questa pubblicazione si intende anche favorire un informato e coerente dialogo
sociale che coinvolga gli attori professionali ed anche i cittadini che rappresentano gli
utenti finali del sistema sanitario pubblico.
Da parte dell’Assessorato Tutela della Salute e Sanità va un sentito grazie a tutti i
protagonisti di questa attività: a partire ovviamente dai ricercatori che hanno prodotto gli
studi e dai docenti dell’Università che si sono impegnati come referee, fino ai Tecnici ed
esperti della Commissione di valutazione e ai Dirigenti e Funzionari dell’Assessorato.
È, come sempre, una scommessa sulla intelligenza sociale e sulla produttività sociale.
L’Assessore alla Tutela della Salute e Sanità
Mario VALPREDA

Filoni tematici
I progetti di ricerca e di indagine ammessi al finanziamento regionale sono riconducibili ai
seguenti filoni tematici:
.
FILONE TEMATICO A
PREVENZIONE E FATTORI DI RISCHIO IN PATOLOGIA UMANA ED ANIMALE
1) La prevenzione delle malattie infettive dell’uomo e degli animali. (16)
2) Indagini sui fattori di rischio nelle malattie degenerative e tumorali. (45)
3) Prevenzione negli ambienti di vita e di lavoro. (12)
4) Prevenzione delle patologie collegate agli stili di vita. (18)
5) Prevenzione in ambito di salute mentale. (10)
6) Ricerca collegata con la tutela del benessere sugli animali da produzione,di affezione e per la
sperimentazione. (2)
FILONE TEMATICO B
SICUREZZA ALIMENTARE
1) Contributi alla sicurezza alimentare nell’ambito del controllo della produzione di alimenti. (12)
2) Metodologia per la ricerca dei residui volontari ed involontari negli alimenti. (3)
3) Prevenzione delle patologie collegate all’alimentazione. (13)
FILONE TEMATICO C
STUDIO, SPERIMENTAZIONE E VALUTAZIONE IN ORGANIZZAZIONE SANITARIA,
DIAGNOSTICA, TERAPIA E RIABILITAZIONE
1) Nuove tecnologie in tema di organizzazione sanitaria, diagnostica, follw up, terapia e riabilitazione
delle malattie. (74)
2) Appropriatezza, efficienza ed equità delle prestazioni sanitarie. (21)
FILONE TEMATICO D
STUDI EPIDEMIOLOGICI IN PATOLOGIA UMANA ED ANIMALE
1) Indagini epidemiologiche sulle malattie degenerative e tumorali. (13)
2) Indagini epidemiologiche sulle malattie infettive. (12)
3) Indagini epidemiologiche per la prevenzione delle malattie allergiche (3)
4) Applicazione della medicina basata sulle prove di efficacia (EBM) alla organizzazione sanitaria,
diagnostica, terapia e riabilitazione. (10)
I numeri riportati in parentesi indicano il numero di progetti finanziati per filone tematico.
IV

Maria Cesarina Abete
Sviluppo di un metodo basato sulla spettroscopia IR per rintracciare tessuti ossei di specie
animali diverse in mangimi ................................................................................................................ 1
Massimo Aglietta
Identificazione di possibili meccanismi di resistenza al trattamento con Herceptin in pazienti con
carcinoma mammario.......................................................................................................................... 3
Emanuele Albano
Caratterizzazione di nuovi marcatori immunologici della progressione della malattia
aterosclerotica ...................................................................................................................................... 5
Roberto Albera
Potenziali evocati uditivi automatici nello screening della sordità congenita nei centri di terapia
intensiva neonatale............................................................................................................................... 7
Oscar Argentero
Il fattore umano negli infortuni sul lavoro......................................................................................... 9
Pier Angelo Argentero
Sperimentazione di un osservatorio regionale per le infezioni acquisite nelle strutture sanitarie11
Roberto Arione
Stesura, diffusione ed implementazione di procedure per la prevenzione di eventi avversi
nell’ASO S. Giovanni Battista........................................................................................................... 13
Maria Carmen Azzolina
Stesura, divulgazione ed implementazione di Linee Guida per la prevenzione ed il trattamento
delle Lesioni da Decubito................................................................................................................... 16
Francesco Baccino
Suscettibilità all’epatocancerogenesi in relazione all’espressione di molecole coinvolte
nell’apoptosi........................................................................................................................................ 18
Piero Balbo
Le polmoniti acquisite in comunità nella ASL 13, dal territorio all'ospedale: proposta di gestione
integrata .............................................................................................................................................. 20
Emiliana Ballocchi
Indagine epidemiologica su Leptospira spp ed altre patologie presenti nelle nutrie nel
comprensorio del Basso Sesia ........................................................................................................... 22
Federico Balzola
Enterocolite autistica: studio clinico e laboratoristico di una nuova sindrome............................ 24
Franco Balzola
Fattori di rischio nell’incidenza di carcinoma del colon-retto in soggetti affetti da obesita’ di
grado medio-elevato........................................................................................................................... 26
Cristiana Barbera
Identificazione di casi di celiachia attraverso sintomi tipici e atipici e nelle patologie a rischio. 28
Alberto Bardelli
Il ruolo dei cancerogeni ambientali nell'insorgenza di instabilità genomica dei tumori ............. 30
Giuseppina Barrera
Carcinoma del colon: regolazione della crescita da parte di prodotti della perossidazione lipidica
e di ligandi dei PPAR ......................................................................................................................... 32
V

Ettore Bartoli
Fattori predittivi di resistenza insulinica e patologia degenerativa nel NIDDM: influenza di età e
climaterio............................................................................................................................................. 34
Simona Bastonero
Un nuovo marker per lo screening prenatale delle anomalie cromosomiche: l’osso nasale fetale36
Mario Bazzan
Razionalizzazione di diagnosi e cura delle sindromi mieloproliferative Ph- mediante creazione di
un sito web dedicato ........................................................................................................................... 38
Silvio Bellino
Il disturbo borderline di personalità: caratterizzazione della comorbilità ed esito del trattamento
a lungo termine ................................................................................................................................... 40
Giorgio Bellomo
Antiaterogenicità delle HDL ed abitudini alimentari: studio negli studenti dell’Università del
Piemonte Orientale............................................................................................................................. 42
Graziella Bellone
Espressione di SKI e SNON come indice di rischio di evoluzione neoplastica nell'esofago di
Barrett ................................................................................................................................................. 44
Chiara Benedetto
Prevenzione della preeclampsia con eparina a basso peso molecolare in gravide portatrici di
trombofilie........................................................................................................................................... 46
Bruno Bergamasco
Valutazione dell’efficacia della terapia chirurugica nella riabilitazione dei pazienti parkinsoniani
in fase avanzata................................................................................................................................... 48
Mauro Bergui
Sviluppo ed applicazioni cliniche della risonanza magnetica funzionale ...................................... 50
Maria Grazia Bernengo
La sifilide nel nuovo millennio........................................................................................................... 52
Laura Berta
Effetto delle onde d'urto sui fibroblasti umani nell'induzione dei processi riparativi: implicazioni
terapeutiche......................................................................................................................................... 54
Emma Bertuzzi
“Legami familiari” Ricerca-intervento per la prevenzione ed il trattamento dei disturbi
relazionali precoci............................................................................................................................... 56
Piero Bestagini
Screening del cervico-carcinoma nelle donne fra 25 e 64 anni delle ASL13-14: programmi
spontanei, organizzati o assenti ......................................................................................................... 58
Betta Pier-giacomo
Fattori di rischio biomolecolari nel cancro del polmone................................................................. 60
Alberto Biglino
Incidenza e fattori di rischio delle batteriemie nosocomiali catetere-correlate in Piemonte....... 62
Elisabetta Bignamini
Micobatteri non-tubercolari e Fibrosi Cistica: indagine di prevalenza e studio caso-controllo
retrospettivo ........................................................................................................................................ 65
Bartolomeo Biolatti
Effetti del trattamento con desametazone a dosi terapeutiche ed anabolizzanti sul sistema
immunitario del bovino...................................................................................................................... 67
VI

Giuseppe Boccuzzi
Individuazione precoce di markers ematici di danno ossidativo nel diabete mellito ................... 69
Filippo Bogetto
Sintomatologia depressiva e tipizzazione clinica della schizofrenia in fase acuta: implicazioni per
la prevenzione..................................................................................................................................... 71
Gianni Bona
Ruolo dell'analisi genetica e biochimica di ghrelina nella valutazione di obesi semplici e con
sindrome di Prader-Willi................................................................................................................... 73
Renato Bonardi
Le epatiti tossiche tra i lavoratori dell’industria plastica: indagine epidemiologica nell’area
torinese ................................................................................................................................................ 75
Luca Bonfanti
Il coniglio come modello di plasticità strutturale nel sistema nervoso dei mammiferi adulti ..... 78
Alberto Borraccino
Valutazione dei determinanti del ritardo alla diagnosi nei pazienti con deficit patologico di
ormone della crescita ......................................................................................................................... 80
Amalia Bosia
Le basi molecolari e gli indicatori della insulino-resistenza ........................................................... 82
Giovanni Botta
Impiego della telepatologia nella diagnostica fetoplacentare finalizzata alla costituzione di un
registro epidemiologico...................................................................................................................... 84
Salvatore Bozzaro
Meccanismo d’azione del gene Nramp1 nella resistenza alle infezioni e identificazione di
mutazioni geniche deleterie ............................................................................................................... 86
Enrico Bracco
Identificazione di molecole interattrici del recettore per il fattore di crescita delle cellule
staminali: c-kit/SCFR ........................................................................................................................ 88
Gianni Boris Bradac
Trombolisi intra-arteriosa nello stroke ischemico acuto: creazione di una rete regionale di
selezione pazienti ................................................................................................................................ 90
Paolo Branca
Metodica per la determinazione quantitativa del colorante liposolubile Sudan I nei prodotti
contenenti peperoncino...................................................................................................................... 91
Enrico Brignardello
Potenziamento della terapia radiometabolica del carcinoma tiroideo mediante pre-trattamento
differenziante...................................................................................................................................... 94
Guido Brizio
“Benessere animale": alternativa all'eccessiva medicalizzazione dell'allevamento cunicolo...... 96
Sandra Brunelleschi
Recettori PPAR-gamma in monocito/macrofagi umani: loro rilevanza nell'aterosclerosi, in
particolare nei fumatori..................................................................................................................... 98
Benedetto Bruno
Ricostituzione anticorpale dopo trapianto allogenico di cellule emopoietiche e prevenzione delle
infezioni ............................................................................................................................................. 100
VII

Graziella Bruno
Incidenza di retinopatia diabetica nella coorte di popolazione del registro diabete tipo 1 della
provincia di Torino........................................................................................................................... 102
Alfredo Brusco
Biologia dei metalli pesanti in linee e modelli cellulari di malattie neurodegenerative ereditarie104
Carlo Buffa
Analisi clinico-epidemiologica, biochimica e molecolare delle malattie da prioni dell'uomo in
Piemonte............................................................................................................................................ 106
Massimiliano Bugiani
Incidenza dell’infezione TB latente in lavoratori della sanità...................................................... 107
Giovanni Bussolati
Espressione di mRNA per CgA in neoplasie prostatiche CgA-negative all’immunoistochimica.
Correlazione con la sierologia ......................................................................................................... 109
Federico Bussolino
Diagnosi e terapia delle metastasi epatiche: un approccio proteomico ....................................... 111
Anna Maria Cacciatore
Studio di coorte storico sui lavoratori dello stabilimento Michelin di Cuneo: incidenza dei tumori
delle vie urinarie ............................................................................................................................... 113
Ennio Cadum
Predisposizione di un modello previsionale per l’identificazione delle ondate di calore e
valutazione epidemiologica .............................................................................................................. 115
Maria Costanza Calia
L'interfunzionalità comunicativa nella partnership tra Ospedale e Hospice ............................. 117
Ferdinando Canavese
Il criptorchidismo quale fattore di rischio di infertilità e di tumori testicolari .......................... 119
Pier Luigi Canonico
La farmacogenomica/genetica come strumento diagnostico/terapeutico nelle cefalee............... 120
Roberto Cantello
Potenziali evocati motori e diagnostica della malattia di Parkinson............................................ 122
Rosa Angela Canuto
Dieta e prevenzione del tumore del colon: ruolo degli acidi grassi linoleico coniugato e
docosaesaenoico ................................................................................................................................ 124
Maria Teresa Capucchio
Espressione del sistema Plasminogeno-Plasmina (PG-PL-PA) e PrP cellulare nella ghiandola
mammaria e nel latte bovino ........................................................................................................... 126
Maria Caramelli
Progetto pilota per un piano di monitoraggio per la ricerca di tessuto nervoso negli ambienti di
macellazione ...................................................................................................................................... 128
Pietro Caramello
Studio di suscettibilità e farmacodinamico dei ceppi di P.falciparum importati........................ 131
Nicola Carlone
Attivita’ antimicotica e immunomodulante di fitoterapici nei confronti di lieviti agenti di
candidosi............................................................................................................................................ 133
VIII

Laura Cavallarin
La filiera avicola piemontese: contaminazione da ocratossina A e individuazione di un marker
per l’allevamento biologico.............................................................................................................. 135
Federica Cavallo
Prevenzione dei carcinomi squamosi della cavità orale mediante vaccinazione a DNA:
sperimentazione preclinica.............................................................................................................. 137
Maria Rita Cavallo
Realizzare il governo clinico attraverso i percorsi diagnostico terapeutico assistenziali........... 139
Paolo Cavallo Perin
Sindrome metabolica: nuovi marcatori di danno endoteliale ...................................................... 141
Pietro Cazzola
Contenimento dell’ingresso di radionuclidi nella catena alimentare: applicazioni in campo... 143
Luisella Cesari
Modello di intervento per promuovere una sana alimentazione e l’attività fisica in bambini e
adolescenti in soprappeso ................................................................................................................ 145
Maria Pia Chianale
Informatizzazione e lettura dei dati provenienti dai bilanci di salute dei Pediatri di Libera Scelta
............................................................................................................................................................ 147
Livio Chiandussi
Studio sull’utilizzo di markers ormonali nella predizione e razionalizzazione della risposta ai
farmaci antipertensivi...................................................................................................................... 149
Roberto Chiarle
La nuova tecnologia dell’"Interferenza a piccoli RNA" per l'eliminazione di proteine oncogeniche
nei linfomi umani.............................................................................................................................. 151
Elena Chiarpotto
Effetto della restrizione calorica sul processo di fibrosi durante l’invecchiamento e in patologie ad
esso associate..................................................................................................................................... 153
Laura Chiavacci
La sorveglianza della Brucellosi bovina in Piemonte: elaborazione di uno strumento di analisi
decisionale ......................................................................................................................................... 155
Adriano Chiò
Gruppo multidisciplinare per la SLA: valutazione dell'efficacia dell'organizzazione di un modello
di cure palliative ............................................................................................................................... 157
Giovannino Ciccone
Determinanti individuali, sociali e ambientali di ospedalizzazione nella coorte dei bambini e dei
genitori SIDRIA ............................................................................................................................... 159
Tiziana Civera
Caratterizzazione mediante PFGE di ceppi di Listeria monocytogenes isolati da alimenti e
mappatura regionale........................................................................................................................ 161
Donato Colangelo
Telomerasi e virus e come marcatori prognostici e diagnostici delle neoplasie polmonari umane
............................................................................................................................................................ 163
Rosanna Coppo
Rete Regionale Piemontese di insufficienza d’organo in età pediatrica: diagnosi, cura, trapianto e
follow-up domiciliare ....................................................................................................................... 165
IX

Giorgio Cortesina
Basi precliniche per un vaccino a DNA contro recidive di carcinomi squamosi HER-2/neu positivi
............................................................................................................................................................ 167
Paolo Cotogni
L’apporto di lipidi nella prevenzione dell’evoluzione del danno polmonare acuto in pazienti in
alimentazione artificiale................................................................................................................... 169
Sandra D'Alfonso
Associazione genetica della Sclerosi Multipla con polimorfismi del gene MOG (myelin
oligodendrocyte glycoprotein) ......................................................................................................... 171
Paola Dalmasso
Le diseguaglianze di salute nell’infanzia e nell’adolescenza in Piemonte.................................... 173
Rosa D'ambrosio
Il Profilo di salute della città di Torino........................................................................................... 175
Oliviero Danni
Protezione da parte di estrogeni sull'induzione di beta-secretasi (BACE) indotta da stress
ossidativi............................................................................................................................................ 178
Antonella De Francesco
Qualita' di vita dei pazienti in nutrizione parenterale domiciliare (NPD) di lunga durata e dei loro
caregivers familiari........................................................................................................................... 180
Mario De Marchi
Studio pilota di geni implicati nella suscettibilità al carcinoma prostatico................................. 182
Lucia Decastelli
Modello di valutazione dell’assicurazione della qualita’ dei risultati dei laboratori di
autocontrollo ..................................................................................................................................... 184
Paola Defilippi
Studio dell'adattore p130Cas nelle preneoplasie e nei tumori della mammella: meccanismo
molecolare e studio in vivo............................................................................................................... 186
Maurizio Degiuli
Gastrectomia D2 VS D1 nel trattamento del carcinoma gastrico. studio prospettico multicentrico
randomizzato..................................................................................................................................... 188
Marcello Dei Poli
Espressione di Endoglina come fattore di rischio di recidiva nel carcinoma dell'esofago......... 189
Vittorio Demicheli
Revisione sistematica sull’efficacia e sicurezza della vaccinazione antinfluenzale degli anziani e
dei bambini........................................................................................................................................ 191
Paola Di Giulio
Studio prospettico sull'appropiatezza dei ricoveri in hospice ...................................................... 193
Marco Di Monaco
Vitamina D e recupero funzionale dopo frattura prossimale di femore...................................... 196
Giovanni Di Perri
Ruolo dei test rapidi per HIV e lue associati all'approccio sindromico in una popolazione a rischio
di MST............................................................................................................................................... 198
Maria Flavia Di Renzo
Fattori genetici di predisposizone al carcinoma renale: ricerca e studio funzionale di mutazioni
dei geni MET e fumarasi.................................................................................................................. 201
X

Irma Dianzani
Fattori genetici di rischio per lo sviluppo del mesotelioma maligno da esposizione all'amianto203
Umberto Dianzani
Ricerca di marcatori immunologici utili nella valutazione prognostica della sepsi ................... 205
Savina Ditommaso
In tema di infezioni ospedaliere: valutazioni teorico pratiche del lavaggio delle mani ............. 207
Marilena Durazzo
Effetti di un intervento alimentare nel decorso della steatosi epatica e steatoepatite non alcolica
............................................................................................................................................................ 209
Giorgio Emanuelli
Ruolo delle cicloossigenasi 1 e 2 nella trasformazione neoplastica dei polipi del colon ............. 211
Carola Eva
Ruolo del NPY e della sua interazione con il GABA nella farmacologia dell’etanolo ............... 214
Claudio Fabris
Toxoplasmosi: costruzione di una rete per la sorveglianza dell’infezione nella gravida e nel
neonato (Prosecuzione) .................................................................................................................... 216
Fabrizio Faggiano
Fattibilità di uno studio controllato e randomizzato sull'acido folico per la prevenzione delle
gravidanze Down.............................................................................................................................. 218
Secondo Fassino
Prevenzione della cronicizzazione nell’anoressia. Studio dei predittori precoci mediante f-rmi e
test neuropsicologici......................................................................................................................... 220
Elisabetta Fea
Valutazione della diffusione di alimenti contenenti sostanze ad azione estrogenica
commercializzati in Piemonte ......................................................................................................... 222
Riccardo Ferracini
Nuovo modello clinico per la quantificazione dell’attivazione degli osteoclasti da parte delle
cellule metastatiche. ......................................................................................................................... 224
Ezio Ferroglio
Indagine sul reale status dell'echinococcosi/idatidosi in Piemonte .............................................. 226
Giorgio Fezia
Indagine sierologica sulla presenza di infezione da BIV (Bov Immunodeficency Virus) in bovini
da latte in Piemonte.......................................................................................................................... 228
Dario Fontana
Ricerca di nuovi markers e antigeni di possibile utilità diagnostica mediante approccio
proteomico nei tumori urologici...................................................................................................... 230
Ettore Fontana
Prevalenza di Listeria monocytogenes nel gorgonzola della Regione Piemonte......................... 232
Marco Forni
Espressione dell’MGMT (enzima riparazione DNA) nei gliomi maligni e correlazione con la
risposta alla chemioterapia.............................................................................................................. 234
Paola Francia Di Celle
Utilizzo della Real Time PCR per la quantificazione della MMR in pazienti con LLC-B sottoposti
a terapia con Campath-1 ................................................................................................................. 236
XI

Gianluca Gaidano
Varianti polimorfiche dei geni di riparazione del dna nei linfomi non-Hodgkin B: implicazioni
patogenetiche e cliniche.................................................................................................................... 238
Alberto Gambino
Modello sperimentale di Acute Pain Service a basso costo dell'A.O. S. G. Battista di Torino.. 240
Armando Genazzani
Nuove strategie terapeutiche: la calcineurina come bersaglio nella terapia delle malattie
cardiache e neurodegenerative........................................................................................................ 242
Massimo Geuna
Trapianto allogenico non mieloablativo di cellule staminali nel carcinoma colorettale: studio
dell’assetto immunologico................................................................................................................ 244
Dario Ghigo
Ricerca di test per predire la tossicità di materiali fibrosi e di modalità di detossificazione delle
fibre di asbesto .................................................................................................................................. 246
Valeria Ghisetti
Diagnosi rapida di infezioni da patogeni emergenti ...................................................................... 248
Maria Michela Gianino
Indagine conoscitiva sulla diffusione dell'attività di Risk Management nelle Aziende Sanitarie
Piemontesi ......................................................................................................................................... 250
Marilena Gili
Sviluppo e validazione di metodi per la determinazione quantitativa di coccidiostatici e
avilamicina in mangimi.................................................................................................................... 252
Giorgio Gilli
Applicazione di campionatori passivi e test biologici nella valutazione dei rischi in ambiente
produttivo.......................................................................................................................................... 254
Maria Teresa Giordana
Validazione di un nuovo metodo di indagine nella diagnosi delle leucodistrofie dell'adulto: il
proteoma della mielina..................................................................................................................... 256
Maria Gabriella Giuffrida
Indagini epidemiologiche sull’insorgenza di allergie ad alimenti geneticamente modificati..... 258
Mariella Goria
Approfondimenti diagnostici ed epidemiologico-molecolari della tubercolosi da M.bovis
nell'uomo e negli animali ................................................................................................................. 260
Maria Ausilia Grassi
Profilo microbiologico di verdure di IV gamma destinate alla ristorazione collettiva............... 263
Carla Grattarola
Infezione da Brucella suis nel cinghiale in Piemonte: studio della diffusione in due Ambiti
Territoriali di Caccia........................................................................................................................ 265
Andrea Graziani
Studio dell’espressione di Diacilglicerolo cinasi in tumori epiteliali mediante real time RT-PCR.
............................................................................................................................................................ 267
Dario Gregori
Sviluppo e validazione di modelli previsivi di mortalità in pazienti con diabete di tipo II........ 269
Giorgio Gribaudo
Analisi dei meccanismi dello sviluppo del danno vascolare associato all'infezione con
Citomegalovirus................................................................................................................................ 271
XII

Bartolomeo Griglio
Indagine sulla sicurezza delle carni vendute al dettaglio, in relazione alle differenti tipologie di
vendita ............................................................................................................................................... 273
Gabriella Gruden
Inadeguato trattamento e tardivo riferimento al nefrologo dei pazienti con nefropatia diabetica:
cause e rimedi ................................................................................................................................... 276
Ornella Guardamagna
L’utilità della dieta nell’iperlipemia familiare combinata in età pediatrica............................... 278
Giovanni Carlo Isaia
Fattori di rischio dell'osteoporosi postmenopausale ed incidenza di osteoporosi secondarie nella
popolazione piemontese ................................................................................................................... 280
Ciro Isidoro
Espressione di Catepsina D e di FLIP nella progressione dei linfomi non-Hodgkin: utilità nella
diagnosi e nel follow up.................................................................................................................... 282
Thomas Oliver Jefferson
Revisione sistematica sulla efficacia e sicurezza della vaccinazione contro il Morbillo, la Parotite e
la Rosolia........................................................................................................................................... 284
Simonetta Kerim
Studio di marcatori biologici di progressione e prognosi nel carcinoma prostatico localmente
avanzato. ........................................................................................................................................... 286
Marco Ladetto
Riarrangiamenti non neoplastici di BCL-2: un possibile nuovo fattore di rischio per la genesi del
linfoma follicolare............................................................................................................................. 289
Santo Landolfo
Ruolo dei Papillomavirus (HPV) nella patogenesi dei tumori del distretto testa/collo (HNSCC)291
Maria Agnese Latino
Prevenzione delle infezioni da Chlamydia trachomatis nella popolazione giovanile. ................ 293
Giorgio Leigheb
Studio del meccanismo di azione di analoghi della vitamina D3 nella terapia della psoriasi.... 295
Maurizio Leone
Farmaci per la prevenzione ed il trattamento delle crisi epilettiche da sospensione alcolica: una
revisione Cochrane........................................................................................................................... 297
Antonio Liuzzi
Valutazione dell'arteriopatia periferica in pazienti con obesità grave con sindrome metabolica299
Grazia Lomolino
Revisione sistematica efficacia procedure di lavaggio delle mani per la prevenzione delle infezioni
nosocomiali........................................................................................................................................ 301
Mauro Maccario
Iperaldosteronismo primario nell’ipertensione resistente: prevalenza ed effetti sul danno
aterosclerotico precoce..................................................................................................................... 303
Corrado Magnani
Analisi statistica ed epidemiologica dei trends temporali di incidenza dei tumori infantili...... 305
Fabio Malavasi
Anticorpi monoclonali murini e ricombinanti per la diagnosi e la terapia in vivo di lesioni
neoplastiche....................................................................................................................................... 307
XIII

Paolo Manzini
Il donatore di sangue anti-HBc: rischio di trasmissione dell’epatite B con la donazione. ......... 309
Chiara Marinacci
Epidemiologia della disoccupazione nella provincia di Torino .................................................... 311
Luca Marozio
Definizione di protocolli specifici per l'assistenza alla gravidanza in donne extracomunitarie 313
Aldo Martelli
Rischio biologico negli alimenti: studio e applicazione di metodi analitici biotecnologici......... 315
Maria Giovanna Martinotti
Contaminazione ambientale da Aspergillus spp. e incidenza di aspergillosi invasiva in pazienti
ematologici......................................................................................................................................... 317
Massimo Massaia
Ruolo del sistema immunitario nella prevenzione e controllo dell'infezione da aspergillo nei
pazienti oncoematologici.................................................................................................................. 319
Marco Massobrio
Kallikreina Umana 6 (hK6): un nuovo biomarker sierico per screening e prognosi del cancro
ovario ................................................................................................................................................. 321
Lina Matera
Preparazione a scopo terapeutico di vaccino cellulare semiallogenico contro carcinoma prostatico
............................................................................................................................................................ 322
Giuseppe Matullo
Polimorfismi ed espressione dei geni della riparazione del dna in relazione alla prognosi e alla
chemiosensibilita’ ............................................................................................................................. 324
Margherita Meda
Naturale è sempre salutare? Curarsi da soli con le piante officinali è una soluzione o un problema
in più? ................................................................................................................................................ 326
Adalberto Merighi
Correlazione fra condizioni di stabulazione e sviluppo postnatale del sitema nervoso centrale in
animali da esperimento .................................................................................................................... 327
Giuseppe Migliaretti
Asma e inquinamento nella popolazione pediatrica: riduzione dei ricoveri legata ad una
diminuzione dell’esposizione ........................................................................................................... 329
Roberto Miniero
Obesità infantile in Piemonte: informatizzazione e percorsi diagnostico-terapeutici comuni nelle
strutture ospedaliere ........................................................................................................................ 331
Francesco Monaco
Strumento di valutazione informatizzato delle prestazioni riabilitative neuromotorie e
muscoloscheletriche.......................................................................................................................... 332
Guido Monga
Il ruolo dei polyomavirus umani e di SV40 nella insorgenza e nello sviluppo dei tumori del
sistema nervoso centrale .................................................................................................................. 334
Franco Mongini
Analisi dei fattori di rischio delle cefalee e del dolore facciale in una comunità di lavoro ........ 337
Giuseppe Montrucchio
Valutazione del ruolo della trombopoietina come fattore di rischio nell'epatocarcinoma e
nell'epatoblastoma............................................................................................................................ 339
XIV

Bruno Morra
Trattamento integrato della patologia allergica naso-sinusale .................................................... 341
Maria Adele Moschella
Rapporto tra atopia e malattia manifesta tra gli alunni delle Scuole Medie Inferiori del Verbano-
Cusio-Ossola ..................................................................................................................................... 343
Carmine Munizza
Reti sociali ed utilizzo dei servizi sanitari e psichiatrici................................................................ 345
Roberto Mutani
Strategie integrative ed alternative nella terapia della sindrome delle apnee ostruttive nel sonno.
............................................................................................................................................................ 347
Roberto Navone
Follow-up delle diagnosi citologiche di "ascus-agus" nello screening per il cervico-carcinoma349
Carlo Nebbia
L’approccio proteomico come metodo alternativo per evidenziare trattamenti con anabolizzanti
in bovini da carne............................................................................................................................. 351
Emanuela Noris
Produzione di vaccini edibili per la prevenzione delle infezioni da Papillomavirus umano ..... 353
Francesco Novelli
Un approccio innovativo nell'identificazione di antigeni tumorali: l'analisi serologica del
proteoma ........................................................................................................................................... 355
Fabio Orlandi
Valutazione del marker di malignità tiroidea galectina-3 in ELISA su eluato da citoaspirato
tiroideo e su siero.............................................................................................................................. 357
Maria Orlando
Ricerca sull’incidenza della guarigione dei minori sintomatici correlata al miglioramento della
funzione genitoriale.......................................................................................................................... 359
Giancarlo Orofino
Inserimento della prevenzione HIV nella cura di persone HIV positive: applicazione di linee
guida internazionali ......................................................................................................................... 361
Piero Paccotti
Approccio integrato allo studio della struttura e funzione muscolare: rilievi genetici, biochimici
ed elettromiografici .......................................................................................................................... 363
Gian Franco Pagano
La razionalizzazione della dieta da sola puo’ controllare la sindrome metabolica e il rischio
cardiovascolare connesso?............................................................................................................... 365
Augusta Palmo
Studio prospettico su supplementazione in antiossidanti nei soggetti in nutrizione parenterale
domiciliare long-term....................................................................................................................... 367
Pierino Panarisi
La famiglia in un sistema aziendale: il caregiver come risorsa nelle cura al paziente con problemi
cronici invalidanti............................................................................................................................. 369
Massimiliano Panella
Sperimentazione di un modello di gestione integrata del paziente schizofrenico....................... 371
Marzio Panichi
Studio epidemiologico delle morsicature canine e identificazione di nuove strategie di prevenzione
in Piemonte ....................................................................................................................................... 373
XV

Maurizio Parola
Terapia antifibrotica sperimentale cellulo-mirata nella prevenzione delle epatopatie croniche376
Adele Parziale
Ruolo dei polimorfismi del recettore 1 per la melanocortina e del recettore della vitamina D nel
rischio di melanoma ......................................................................................................................... 379
Barbara Pasini
Studio dei fattori genetici di rischio nell'adenocarcinoma gastrico famigliare: una malattia
ereditaria multifattoriale? ............................................................................................................... 381
Guido Pastore
Matrimoni e prole nelle persone, residenti in Piemonte, guarite da un tumore maligno insorto in
eta’ pediatrica ................................................................................................................................... 383
Alberto Paudice
Studio pilota per il follow-up degli esiti a lungo termine di un gruppo di pazienti psichiatrici.385
Angelo Penna
Costruzione e applicazione di un percorso integrato tra ospedale e territorio nella gestione dello
scompenso cardiaco.......................................................................................................................... 387
Alberto Piazza
Fattori di rischio genetici associati all'aterosclerosi coronarica e alla restenosi......................... 389
Pavilio Piccioni
Utilizzo di varie fonti informative nello studio della prevalenza di ASMA e BPCO nella città di
Torino ................................................................................................................................................ 391
Antonio Piga
Validazione di uno strumento EBM per l'utilizzo ottimale delle risorse Internet dedicate alla
prevenzione ....................................................................................................................................... 393
Lorenzo Pinessi
Cefalea a grappolo e stili di vita: indagine sui fattori di rischio ambientali e genetici............... 396
Enrico Pira
Modelli per lo studio del comportamento fisiopatologico della cute, a contatto con materiali tessili
utilizzati come DPI ........................................................................................................................... 399
Mario Pirisi
Ferro, determinanti genetici e progressione fibrotica nell’epatite cronica C ............................. 401
Valerio Podio
Miglioramento dell’attivita’ antalgica della terapia radiometabolica in pazienti con metastasi
ossee ................................................................................................................................................... 403
Giuseppe Poli
Colesterolo ossidato e marcatori di risposta infiammatoria nei pazienti a rischio vascolare.... 405
Antonio Ponzetto
Il carcinoma epatocellulare e infezione da virus dell'epatite C. Identificazione di fattori di rischio
associati.............................................................................................................................................. 407
Carola Ponzetto
I sarcomi a piccole cellule: nuove prospettive diagnostiche e terapeutiche................................. 408
Maria Prat
Anticorpi monoclonali contro il recettore Met nella prevenzione e terapia di infezioni da Listeria
monocytogenes .................................................................................................................................. 410
XVI

Michele Presutti
Costruzione e applicazione di un sistema di indicatori per la misurazione della qualita’
dell’assistenza domiciliare ............................................................................................................... 412
Giulio Preti
Studio dei fattori che regolano interfaccia tessuti-impianti per terapia di supporto in pazienti con
traumi o neoplasie ............................................................................................................................ 414
Vito Marco Ranieri
Ventilazione non invasiva (CPAP) per prevenire l’insufficienza respiratoria acuta nel paziente
chirurgico: studio randomizzato..................................................................................................... 415
Daniele Regge
Ruolo della colonscopia virtuale nell’identificare lesioni neoplastiche in soggetti con rischio
familiare o personale........................................................................................................................ 417
Corrado Rendo
Continuità assistenziale in gravidanza, parto e puerperio e individuazione di percorsi differenziati
e flessibili........................................................................................................................................... 419
Gabriella Restagno
Ottimizzazione della diagnosi molecolare di mutazioni causa di sordità congenita mediante
tecnologie miniaturizzate................................................................................................................. 421
Umberto Ricardi
Radioterapia stereotassica ipofrazionata del carcinoma broncogeno non a piccole cellule in stadio
I .......................................................................................................................................................... 423
Lorenzo Richiardi
Incidenza del tumore del testicolo in Piemonte e aree del Sud Europa: trend temporali e
differenze geografiche...................................................................................................................... 425
Franco Ripa
Lo sviluppo degli indicatori professionali per il miglioramento della performance clinica e della
qualità................................................................................................................................................ 427
Menico Rizzi
Studi strutturali e funzionali di NadN di Haemophilus influenzae: un potenziale candidato per lo
sviluppo di un vaccino...................................................................................................................... 429
Patrizia Robino
Identificazione di Helicobacter enterici in specie aviari e nell'uomo con metodi tradizionali e
biomolecolari .................................................................................................................................... 431
Rodolfo Rocca
Neurolisi plesso celiaco nella palliazione del dolore neoplastico: confronto della tecnica
radiologica e ecoendoscopica........................................................................................................... 433
Giovanni Rolla
Valore predittivo di asma della misura di NO nell’aria espirata nei pazienti rinitici con sintomi
simil-asmatici.................................................................................................................................... 435
Sergio Rosati
Sviluppo di nuovi test sierologici gE-ELISA per il controllo della Rinotracheite Infettiva del
Bovino (IBR)..................................................................................................................................... 437
Floriano Rosina
Ruolo dei polimorfismi dei geni immunoregolatori nella risposta alla terapia antivirale
nell’epatite cronica C ....................................................................................................................... 439
XVII

Daniela Rossi
Integrazione della “memoria artificiale” nella cartella clinica per studio, diagnosi e terapia delle
malattie rare...................................................................................................................................... 441
Ferdinando Rossi
Protezione e riparazione di circuiti nervosi mediante trapianti cellulari in modelli di patologie
neurodegenerative ............................................................................................................................ 442
Filiberto Rossi
I Giovani contro il doping................................................................................................................ 444
Stefano Rosso
Prevenzione dei tumori cutanei: sviluppo di un test biochimico per l'individuazione di gruppi ad
alto rischio ......................................................................................................................................... 446
Giuseppe Ru
Stima di denominatori della popolazione canina su un area pilota: aggiustamento dei dati di
anagrafe a fini sanitari ..................................................................................................................... 448
Roberto Russo
Criteri di appropriatezza di prestazioni ambulatoriali utili a definire contratti tra ASL e strutture
accreditate ......................................................................................................................................... 450
Giuseppe Saglio
Ricerca di marcatore molecolare per l’identificazione di pazienti affetti da Policitemia Vera e
Trombocitemia Essenziale. .............................................................................................................. 452
Mauro Salizzoni
Valutazione del reflusso gastroesofageo non acido mediante impedenziometria intraluminale
esofago-gastrica................................................................................................................................. 454
Bruna Santini
Gli acidi grassi strutturali nella dieta dei bambini in età scolare: valutazione qualitativa e
quantitativa dell’apporto ................................................................................................................. 455
Claudio Santoro
Identificazione e clonaggio di nuovi auto-antigeni associati al diabete mellito di tipo1 (T1DM)457
Alberto Sartoris
Infezione e stati carenziali quali fattori predisponenti l'insorgenza della malattia degenerativa e
neoplastica ORL ............................................................................................................................... 459
Luca Scaglione
Valutazione dell'uso della profilassi antitrombotica nei pazienti con fibrillazione atriale nonvalvolare
............................................................................................................................................ 461
Giorgio Vittorio Scagliotti
Farmacogenetica della risposta ai derivati del platino in pazienti affetti da carcinoma polmonare
............................................................................................................................................................ 463
Maria Pia Schieroni
Progetto per la mobilizzazione pazienti degenti per il miglioramento dell’outcome e il
contenimento della spesa sanitari.................................................................................................... 465
Giuseppe Scielzo
Determinazione delle dosi assunte da operatori, pazienti famigliari e popolazione nell'impiego
terapeutico di iodio 131.................................................................................................................... 468
Leandra Silvestro
Prevenzione dell’obesita’ in eta’ pediatrica: correlazione fra alimentazione e metabolismo
ormonale nel primo anno................................................................................................................. 470
XVIII

Fabiola Sinigaglia
Fattori di rischio trombotico: indagini sul meccanismo d’azione di estrogeni, progestinici e
colesterolo.......................................................................................................................................... 472
Piero Sismondi
DNA microarray dedicati per la diagnosi di diverse forme cliniche di carcinoma mammario 474
Vincenzo Soardo
Sicurezza alimentare e prodotti fitosanitari. Elaborazione di un percorso formativo per gli addetti
alla vendita........................................................................................................................................ 476
Bruno Sona
Bio-sicurezza negli allevamenti suinicoli: verifica dell’attuale situazione, valutazione e
proposizione di un piano di adeguamento...................................................................................... 478
Giovanni Succo
Nuovi percorsi diagnostici in rinologia pediatrica ........................................................................ 481
Nicola Surico
Ipotiroidismo subclinico da carenza iodica in gravidanza. Valutazione nella popolazione novarese
............................................................................................................................................................ 483
Luca Tamagnone
Semaforine e loro recettori come obiettivo diagnostico e terapeutico nel trattamento dei tumori
umani................................................................................................................................................. 485
Martina Tarantola
Studio di alcuni parametri correlati allo stress nel vitellone........................................................ 487
Corrado Tarella
Lunghezza del telomero come marker di istopatogenesi nelle patologie linfoproliferative mature
della serie........................................................................................................................................... 489
Pierpaolo Terragni
ARDS e ventilazione oscillatoria ad alta frequenza nella prevenzione della VILI: analisi delle
immagini TAC .................................................................................................................................. 491
Luciana Tessitore
p27 Kip1 , un nuovo marcatore delle lesioni preneoplastiche colorettali......................................... 493
Mauro Torchio
Le linee guida computerizzate come strumento di supporto alla decisione interattivo con la
cartella clinica................................................................................................................................... 495
Pier-angelo Tovo
Impiego di TaqMan PCR per la diagnosi precoce, il follow-up e la terapia di bambini con
infezione perinatale da HCV ........................................................................................................... 497
Anna Chiara Trompeo
Influenza dell'analgesia e della sedazione sullo svezzamento del paziente dal ventilatore in
Terapia Intensiva ............................................................................................................................. 499
Mariella Trovati
Modelli organizzativi per l'automonitoraggio glicemico nel diabete di tipo 2: valutazione del
rapporto costi-benefici. .................................................................................................................... 501
Giancarlo Ugazio
Monitoraggio delle particelle ultrafini nell’ambiente di vita e di lavoro, indoor e outdoor...... 503
Giovanni Vacca
Trattamento farmacologico dello shock cardiogeno ..................................................................... 504
XIX

Sergio Vai
Individuazione precoce dei difetti congeniti diagnosticabili in epoca neonatale ........................ 506
Adriano Vanni
Determinazione di prodotti tossici di trasformazione di fitofarmaci nei controlli sulla sicurezza di
prodotti alimentari ........................................................................................................................... 508
Franco Veglio
Dosaggio degli steroidi ibridi serici e urinari nella diagnosi differenziale dell’iperaldosteronismo
primitivo............................................................................................................................................ 511
Alessandro Vercelli
Neuroprotezione nella retina ischemica e glaucomatosa .............................................................. 513
Elisabetta Versino
Tubercolosi a Torino nel XXI secolo: ruolo dei determinanti socio ambientali ......................... 514
Alessandro Vigo
Utilità della Polisonnografia nel percorso diagnostico-assistenziale di patologie pediatriche
(OSAS, ALTE, Prematuranza)........................................................................................................ 516
Marco Vincenti
Sviluppo di metodi analitici per l'individuazione e la quantificazione di microinquinanti negli
alimenti.............................................................................................................................................. 519
Elsa Viora
Valutazione dell’appropriatezza dell’ecografia in gravidanza dopo adeguata preparazione degli
operatori............................................................................................................................................ 521
Pierantonio Visentin
Benchmarking sulla sicurezza delle attività sanitarie e di ricerca ............................................... 523
Enrico Zanalda
Patologia mentale e disabilita' sociale: "un modello di intervento per la prevenzione e la
riabilitazione in ambito lavorativo"................................................................................................ 526
Maria Maddalena Zanone
Espressione della nefrina nell’endotelio delle isole pancreatiche: ruolo nel diabete di tipo 1 e nel
trapianto di isole ............................................................................................................................... 529
Gian Paolo Zara
La Farmacogenetica per l’individualizzazione della terapia e la prevenzione delle reazioni avverse
da farmaci.......................................................................................................................................... 531
Alessandro Zennaro
Valutazione dell’intervento terapeutico residenziale: indicatori di esito clinico e verifica di qualità
dell’intervento................................................................................................................................... 533
Paolo Zola
Ossigenazione tumorale e COX2: fattori predittivi di risposta alla chemioterapia e di prognosi nel
cervicocarcinoma.............................................................................................................................. 535
Carla Maria Zotti
Le infezioni chirurgiche nel post-parto: studio di incidenza su parti cesarei e parti vaginali... 537
XX

Maria Cesarina Abete Filone tematico B3
Sviluppo di un metodo basato sulla spettroscopia IR per rintracciare
tessuti ossei di specie animali diverse in mangimi
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta
Centro di referenza nazionale per la sorveglianza e il controllo degli alimenti per gli animali
Il lavoro di ricerca ha riguardato studi basati sulla spettroscopia vibrazionale sia del vicino
(NIR) che del medio (MIR) infrarosso. Lo studio, condotto a livello molecolare, sulla struttura
di costituenti di origine animale quali farine di carne e ossa, ha consentito di sfruttare
specifiche proprietà di questi materiali per la messa a punto di un metodo innovativo d’analisi
per la loro individuazione in matrici complesse quali gli alimenti ad uso zootecnico.
Tale esigenza nasce dal fatto che la metodica ufficiale per la ricerca di costituenti animali nei
mangimi, prevalentemente frammenti ossei, risulta essere basata su valutazioni soggettive
condizionate dall’esperienza dell’operatore; l’identificazione del costituente animale avviene
infatti tramite riconoscimento visivo al microscopio ottico da parte di un operatore esperto
senza alcun supporto di un dato analitico oggettivo. Si deve inoltre sottolineare che la
normativa di riferimento, che vieta la somministrazione di farine animale di qualsiasi origine
zoologica ai ruminanti, consente l’utilizzo di farine di pesce per i non ruminanti (suini, pesci
pollame) e questo comporta la necessità di poter distinguere frammenti ossei di specie animali
differenti in modo accurato.
Studi precedenti hanno dimostrato che la spettroscopia NIR, in particolare una sua
applicazione innovativa definita microscopia FT-NIR, è in grado di discriminare in modo
accurato un frammento osseo da un frammento vegetale e minerale. Tale applicazione
prevede infatti un microscopio interfacciato allo spettrometro di configurazione classica,
coniugando le potenzialità della microscopia ottica (possibilità di analizzare singoli
frammenti), a quelle di un analisi strumentale. I campioni (mangimi), vengono trattati con
tetracloroetilene, secondo metodica ufficiale (D.M. 9/9/2004). Sul sedimento più pesante,
ottenuto per separazione gravimetrica dal trattamento con il solvente, viene condotta l’analisi
NIR. La prima parte dello studio ha riguardato la messa a punto della metodica in microscopia
NIR per la ricerca di frammenti ossei al fine di un’applicazione nella routine. La metodologia
è stata pensata e sviluppata come metodo di screening in grado di fornire una risposta in
termini di presenza - assenza di costituente animale nel mangime. Tale tecnica non si è
dimostrata capace tuttavia di identificare con la stessa accuratezza frammenti ossei di specie
animali differenti. Da qui la necessità di un metodo complementare, parimenti oggettivo, che
potesse dare indicazioni più precise sulla specie zoologica di appartenenza a partire dal
singolo frammento osseo.
E’ noto che il tessuto osseo è costituito da una parte organica costituita sostanzialmente dalle
fibrille di collagene, e da una matrice inorganica, principalmente idrossiapatite, nella quale le
fibrille sono immerse. Gli spettri NIR presentano solo bande originate da sovratoni dei legami
-CH, -OH, - NH, -SH e bande di combinazione di vibrazioni fondamentali di questi gruppi
funzionali e di quelle dei legami C=O e C=C, pertanto la spettroscopia NIR ha assorbimenti
riferibili soltanto alla materia organica mentre è “silente” per la parte inorganica. Dal
momento che la struttura della parte organica del tessuto osseo non varia significativamente al
variare della specie animale, ottenendo infatti spettri NIR di tessuti ossei di specie animali
1

diverse poco differenziati tra loro, si è ritenuto di studiare la matrice inorganica al fine di
evidenziare rilevanti caratteristiche strutturali utili per il riconoscimento della specie animale.
Tale studio è stato condotto mediante l’applicazione della spettroscopia del medio infrarosso
(MIR), essendo una tecnica semplice, e in grado di indagare la struttura inorganica del tessuto
osseo.
Per questo studio sono stati ottenuti frammenti ossei di specie animali da farine pure di carne
e ossa di specie bovina, aviaria (pollo), suina ed ittica (farina di pesce misto), per
sedimentazione con solvente ad alta densità (tetracloetilene), seguendo la stessa procedura per
l’analisi dei campioni ufficiali. Successivamente sono stati acquisiti gli spettri nella regione
spettrale del medio infrarosso (MIR) in riflettanza totale attenuata (ATR) sia sulle polveri,
ottenute dalla macinazione di una grande quantità di differenti frammenti, così da ottenere
spettri indicativi della composizione media dei tessuti ossei, sia su singoli frammenti con cella
micro-ATR, come applicazione ai campioni reali.
Studi sui frammenti ossei tal quali hanno evidenziato lievi ma significative differenze fra gli
andamenti degli spettri MIR di frammenti ossei di specie animali diverse. Tali differenze si
evidenziano particolarmente nella regione spettrale compresa tra 1250-850 cm-1, che si
riferisce agli assorbimenti dovuti ai gruppi fosfato e carbonato che costituiscono la matrice
minerale. Oltre ad uno studio spettrale nel range considerato, dall’insieme dei dati ottenuti e’
stato desunto un primo criterio di identificazione basato sul valore del rapporto delle intensità
delle componenti spettrali a 1030, 960 e 870 cm-1. Tale studio ha messo in evidenza che
frammenti ossei di origine ittica risultano facilmente distinguibili dai frammenti ossei delle
altre specie animali.
Difficoltà permangono nella distinzione fra le altre specie animali. Un primo trattamento dei
dati con tecniche di elaborazione chemiometrica quali l’analisi delle componenti principali
(PCA), la regressione delle componenti principali (PCR) e la cluster analisi (CA), ha portato
alle medesime conclusioni.
Al termine della ricerca un’ulteriore approfondimento bibliografico ha messo in evidenza che
semplici trattamenti fisici quali la calcinazione dei frammenti ossei, potrebbero mettere in
evidenza differenze e caratteristiche strutturali fra tessuti ossei di differente origine animale.
2

Massimo Aglietta Filone tematico C1
Identificazione di possibili meccanismi di resistenza al trattamento con
Herceptin in pazienti con carcinoma mammario
U.O.A. Oncologia Medica ed Ematologica - Candiolo
L’attività di ricerca nell’ambito dello studio della resistenza al trattamento con trastuzumab di
carcinomi mammari iperesprimenti HER2 si è articolata in due parti:
1) Continuazione di Herceptin in pazienti in progressione dopo un iniziale regime
contenente Herceptin in pazienti con carcinoma mammario HER2 positivo.
Osservazioni precliniche indicano che Herceptin potrebbe essere efficace anche in presenza di
progressione di malattia rallentando la crescita tumorale, hanno portato alla formulazione di
ipotesi cliniche di “prosecuzione” di tale trattamento. Mackey (2002), Fountzilas (2003),
Tripathy (2004) hanno evidenziato su limitate casistiche retrospettive, che la prosecuzione di
un trattamento con Herceptin da solo o in combinazione con altri farmaci citostatici dopo
progressione in corso di un regime iniziale contenente Herceptin è fattibile e sicuro in pazienti
con carcinoma mammario avanzato HER2 positivo. Come conseguenza, nonostante l’assenza
di studi prospettici randomizzati, numerosi oncologi considerano la prosecuzione di Herceptin
dopo una progressione come un approccio ragionevole nella pratica clinica corrente.
METODI
Da un database di 165 pazienti con carcinoma mammario HER2 positivo (HercepTest 2/3+ o
FISH +) abbiamo identificato 120 pazienti progrediti durante o dopo un iniziale trattamento
con un regime contenente Herceptin.
RISULTATI
Undici pazienti hanno sospeso il trattamento con Herceptin prematuramente a causa di
tossicità o di una decisione personale (durata media del trattamento 3 settimane, range 1-9
settimane). Dei restanti 109 pazienti, 19 hanno ricevuto solo terapia di supporto; 31 hanno
proseguito Herceptin; 59 hanno sospeso Herceptin e ricevuto chemioterapia (52) o
endocrinoterapia (7). Al tempo dell'ultima analisi, 76 pazienti sono deceduti (follow-up
mediano 17 mesi; range 1,2-60,8). I pazienti in progressione di malattia che avevano potuto
ricevere terapia aggiuntiva hanno avuto andamenti clinici simili, indipendentemente dall’aver
continuato o no Herceptin dopo la progressione. Dato l’alto costo del trattamento con
Herceptin, la strategia terapeutica in questa tipologia di pazienti necessita probabilmente di
una ulteriore valutazione in studi prospettici randomizzati.
2) Valore prognostico e predittivo dell’espressione e dell’attivazione di membri e ligandi
della famiglia di EGFR in carcinomi mammari umani iperesprimenti HER2.
Evidenze precliniche e cliniche provenienti dalla nostra istituzione e da altri gruppi,
suggeriscono che l’attivazione delle vie di trasduzione del segnale mediate da membri della
famiglia dell’EGFR potrebbero avere un ruolo nello sviluppo di resistenza “ab initio” o
acquisita nel trattamento con regimi contenenti Herceptin. Per indagare ulteriormente questo
problema, abbiamo selezionato tessuti neoplastici provenienti da una serie di pazienti
3

consecutivi con carcinoma mammario metastatico iperesprimente HER2 e trattate con
Herceptin da solo o in associazione a qualunque chemioterapia per valutare:
i) Il valore prognostico e predittivo di una positività immunoistochimica (analisi
semiquantitativa con score da 0+ a 3+) per TGFa, EGFR, EGFR fosforilato,
HER2, HER2 fosforilato, HER3, HER4, HER4 fosforilato, e l’impatto sulla
risposta tumorale, il tempo a progressione e la sopravvivenza globale.
ii) Dove il tessuto neoplastico fosse stato disponibile prima e dopo la progressione, se
TGFa, EGFR, EGFR fosforilato, HER2, HER2 fosforilato, HER3, HER4, HER4
fosforilato, potessero essere implicati nello sviluppo di resistenza acquisita.
METODI:
Analisi immunoistochimiche per TGFa, EGFR, EGFR fosforilato, HER2, HER2 fosforilato,
HER3, HER4, HER4 fosforilato su tumori primitivi sono state eseguite su 63 pazienti dei 120
pianificati e su cinque metastatasi (4 metastasi epatiche e un neoplasia controlaterale)
cresciute durante il trattamento con un regime terapeutico contenente Herceptin. Il valore
predittivo della risposta tumorale sarà studiato con un’analisi univariata con un test Chi
Quadrato; il valore prognostico dell’espressione sarà studiato con un’analisi univariata di
sopravvivenza libera da progressione e sopravvivenza globale utilizzando il metodo di Kaplan
Meyer.
RISULTATI PRELIMINARI: la prevalenza di TGFa, EGFR, EGFR fosforilato, HER2 e
HER2 fosforilato HER3, HER4, HER4 fosforilato nei tessuti neoplastici analizzati è risultata
sovrapponibile a quella della letteratura.
PUBBLICAZIONI
Valabrega G, Montemurro F, Sarotto I, Petrelli A, Rubini P, Tacchetti C, Aglietta M,
Comoglio PM, Giordano S. TGFalpha expression impairs Trastuzumab-induced HER2
downregulation. Oncogene. 2005; 24:3002-10
Montemurro F, Redana S, Valabrega G, Aglietta M. Controversies in breast cancer: adjuvant
and neoadjuvant therapy. Expert Opin Pharmacother. 2005; 6:1055-72
4

Emanuele Albano Filone tematico A2
Caratterizzazione di nuovi marcatori immunologici della progressione
della malattia aterosclerotica
Università “A. Avogadro” del Piemonte Orientale
Dipartimento di Scienze Mediche
CONTESTO E RAZIONALE
Alcuni recenti studi indicano che la presenza di anticorpi verso lipoproteine a bassa densità
(LDL) modificate per ossidazione costituiscono un fattore predittivo della evoluzione di
patologie aterosclerotiche. Tuttavia, le possibili applicazioni cliniche del dosaggio tali
anticorpi sono piuttosto limitate a causa della loro scarsa caratterizzazione dal punto di vista
della specificità antigenica.
OBIETTIVO DEL PROGETTO
Scopo del presente progetto è di ottenere una migliore caratterizzazione della risposta
anticorpale associata alla malattia aterosclerotica al fine di sviluppare test immunologici utili
per la valutazione della evolutività della malattia.
MATERIALI E METODI
Per questo studio sono stati reclutati presso la Divisione di Chirurgia Vascolare dell’Ospedale
Maggiore della Carità in Novara 30 pazienti con aterosclerosi conclamata e 30 soggetti di
controllo omogenei per sesso ed età ma senza evidenze di patologie aterosclerotiche il cui
siero è stato utilizzato per la valutazione tramite tests immunoenzimatici (enzyme-linked
immunosorbent assay, ELISA) della presenza di reattività anticorpale verso antigenici
generati dalla reazione di albumina umana con prodotti terminali della perossidazione lipidica
quali malondialdeide (MDA), 4-idrossinonenale, (HNE), nonché verso fosfolipidi
(cardiolipina, fosfatidilcolina) e LDL ossidate. Sebbene il gruppo di soggetti vasculopatici
dimostrasse titoli di anticorpi verso tutti gli antigeni testati significativamente maggiori dei
soggetti di controllo la percentuale di individui con valori superiori al 95° percentile dei
controlli risultava relativamente bassa (circa 20-25%) ad eccezione che nei test dove venivano
impiegate come antigeni LDL ossidate (percentuale di positivi pari al 44%). Ciò indica che la
specificità antigenica degli anticorpi verso le LDL ossidate non coinvolge ne gli addotti
aldeidici a proteine ne la presenza di anticorpi verso fosfolipidi ossidati. Tuttavia, alla luce di
alcune recenti osservazioni in modelli animali di aterosclerosi si è osservato che i pazienti con
aterosclerotici presentavano una specifica reattività anticorpale (53% di positivi) nei riguardi
di addotti formati dalla reazione fra fosfatidilcolina ossidata ed albumina umana (OxPC-
HSA). Una simile reattività (54% di positivi) era anche presente in un gruppo di 40 pazienti
con coronaropatia ischemica. Inoltre in entrambi i gruppi si evidenziava una buona
correlazione fra i titoli di anticorpi verso OxPC-HSA e quelli verso LDL ossidate (r=0.83;
p

utilizzando 1-arachidonil-2-steatoril-fosfatidilcolina ossidata. hanno evidenziato che
l’incubazione dei sieri umani con fosfoglicerocolina riduce di circa il 35% la capacita di
legame degli anticorpi. Al contrario, l’esposizione dei sieri ad addotti formati dalla reazione
fra HSA ed acido arachidonico ossidato riduceva del 62% la reattività nei riguardi di OxPC-
HSA. Inoltre si è osservato che mentre i sieri di pazienti con vasculopatia aterosclerotica
riconoscono in maniera analoga arachidonil-OxPC-HSA ed HSA complessata con acido
arachidonico ossidato, non presentano invece reattività verso linoleil-Ox-PC ed addotti fra
HSA ed acido linoleico ossidato. Da questi dati era possibile concludere che gli anticorpi
diretto verso OxPC-HSA riscontrati in alta frequenza nei soggetti con vasculopatia
aterosclerotica riconoscono principalmente composti generati dalla reazione di aminoacidi
con prodotti derivati dallo ossidazione dell’acido arachidonico presente in specifiche forme di
fosforilcolina. A tale proposito recenti ricerche del gruppo di Salamon hanno evidenziato che
la reazione tra i gruppi aminici di lisina ed i prodotti ossidazione di arachidonilfosfatidilcolina
o linoleil-fosfatidilcolina genera composti alchil-pirrolici caratterizzati da una
diversa struttura del sostituente alchilico a seconda dell’acido grasso da cui originano (Kaur et
al. Chem Res Toxicol 1997;10:1387-96). Su questa base è possibile ipotizzare che gli addotti
riconosciuti dagli anticorpi presenti nei sieri dei pazienti con aterosclerosi abbiano la struttura
di 2-(carbossipentil)-pirrolo.
Ulteriori informazioni sulla struttura chimica degli antigeni in studio è venuta da esperimenti
condotti utilizzando come donatore di gruppi aminici rispettivamente poli-lisina o poliarginina.
Si è osservato infatti che mentre il 50% dei sieri utilizzati ha dimostrato di avere
titoli di anticorpi verso poli-lisina complessata con acido arachidonico ossidato superiori al
95° percentile dei sieri di controllo, questa percentuale sale al 89% se si utilizza poli-arginina
complessata con acido arachidonico ossidato. Ciò suggerisce che la possibile presenza di due
gruppi di anticorpi di cui uno verosimilmente diretto verso strutture 2-(carbossipentil)pirroliche
legate a lisina ed un altro, con maggiore specificità per la vasculopatia
aterosclerotica, capace di riconoscere addotti per ora non ancora identificati, complessati con
arginina.
CONCLUSIONI
Queste osservazioni indicano che gli anticorpi diretti verso i prodotti generati dall’ossidazione
della fosfatidilcolina possano costituire un nuovo marcatore per valutare il coinvolgimento di
reazioni immunitarie verso le LDL ossidate nella progressione della malattia aterosclerotica
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Roberto Albera Filone tematico C1
Potenziali evocati uditivi automatici nello screening della sordità
congenita nei centri di terapia intensiva neonatale
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Fisiopatologia Clinica
CONTESTO E RAZIONALE
L’ipoacusia congenita bilaterale grave e gravissima ha una prevalenza di 1/1000. Questo
valore può aumentare anche di 10 volte se si considerano i neonati con fattori di rischio per la
sordità (vedi classificazione dalla Joint Committee of Infant Hearing). Inoltre studi in
letteratura riportano una frequenza di sordità dovuta a neuropatia uditiva significativamente
maggiore nei neonati ricoverati nelle unità di terapia intensiva. Rientrano nel quadro della
neuropatia uditiva quei casi in cui il danno è a livello delle cellule ciliate interne o della
giunzione cito-neurale. Questi quadri patologici non sono diagnosticabili con il solo utilizzo
delle emissioni otoacustiche poiché il pattern caratteristico di queste consiste nella presenza
delle emissioni otoacustiche in assenza dei potenziali evocati uditivi del tronco encefalico. La
registrazione dei potenziali evocati uditivi del tronco (ABR) in modo tradizionale prevede
l’utilizzo di uno strumento voluminoso ed ingombrante; l’intensità dello stimolo è regolabile a
piacere e parte da 90 dB nHL e il risultato deve essere refertato da un medico specialista. I
progressi in campo tecnologico degli ultimi 10 anni hanno permesso la realizzazione di
strumenti di piccole dimensioni, portatili, in grado di registrare i potenziali evocati uditivi del
tronco in modalità automatica (AABR) con uno stimolo di 35 dB HL di intensità.
OBIETTIVO del PROGETTO
Scopo del nostro studio è stato quello di valutare l’affidabilità di questi nuovi strumenti di
screening.
METODI
Al fine di eseguire lo studio abbiamo valutato 200 bambini, reclutati nelle unità di terapia
intensiva del S. Anna e del Regina Margherita, nel periodo da ottobre 2003 a ottobre 2004.
Questi 200 casi sono stati sottoposti alla registrazione delle emissioni otoacustiche e
dell’ABR, sia in modalità automatica con lo strumento Accu-Screen della MADSEN, sia in
modalità tradizionale con lo strumento MK 22 dell’AMPLIFON, al fine di valutare
l’affidabilità dello strumento automatico.Non si sono verificate discordanze tra le registrazioni
dell’ABR ottenute con lo strumento convenzionale dell’AMPLIFON e quelle ottenute con
Accu Screen della MADSEN. L’AABR si è dimostrato un test affidabile e di facile utilizzo; i
risultati sono di immediata comprensione e non necessitano dell’interpretazione da parte del
medico specialista. L’utilizzo di questo strumento risulta indispensabile per le neonatologie
che eseguono lo screening audiologico nei neonati a rischio ma può essere anche ampiamente
utilizzato per lo screening nei neonati fisiologici. In questo modo i casi risultati positivi allo
screening con le emissioni otoacustiche possono essere sottoposti all’AABR prima di essere
inviati ai centri audiologici per gli accertamenti di II livello, diminuendo notevolmente i costi
dello screening.
7

RISULTATI
Dai dati raccolti tra gennaio 2002 e gennaio 2005 dal nostro centro, che svolge attività
diagnostica di II livello, utilizzando l’AABR da circa 2 anni, 12 bambini sono risultati sordi; 4
erano neonati a rischio e 8 fisiologici. In 10 casi (83%) il sospetto era presente fin dalla prima
fase dello screening (emissioni otoacustiche assenti). In 2 casi (17%) una ipoacusia di grave
entità è stata diagnosticata a 14 e a 12 mesi dopo la nascita, durante il follow-up, impostato
per pregressa infezione intrauterina da citomegalovirus. Attualmente sono in corso di
valutazione 3 bambini in cui l’esame ABR, eseguito in modalità automatica utilizzando Accu
Screen della MADSEN, è risultato positivo.
8

Oscar Argentero Filone tematico A3
Il fattore umano negli infortuni sul lavoro
ASL 8 - Servizio Prevenzione e Sicurezza degli Ambienti di Lavoro
CONTESTO E RAZIONALE
L’indagine psicologica, finalizzata allo studio della relazione tra percezione del rischio ed
infortuni sul lavoro, ha evidenziato il peso di alcune variabili cognitive nella percezione del
rischio stesso. Si è rilevato, tra l’altro, come la percezione del rischio sia influenzata dalla
convinzione di poterlo controllare o evitare, dalle valutazioni circa il suo grado di pericolosità,
dalle opinioni riferite alla personale esposizione ai diversi fattori di rischio e dal livello di
conoscenze possedute; sussiste, tuttavia, un certo grado di disaccordo sia sulla natura delle
relazioni tra tali variabili sia sul peso che assumono nel determinare un evento infortunistico.
OBIETTIVI E METODI
La presente ricerca si pone l’obiettivo di esaminare la percezione del rischio infortunistico nel
settore tipografico, prendendo in considerazione sia alcune determinanti cognitive, sia
elementi riferiti alle personali esperienze professionali.
Il contesto organizzativo nel quale si è svolta l’indagine è un’industria tipografica del nord
Italia che produce per conto terzi cataloghi, libri e riproduzioni d’arte; il personale è composto
globalmente da 700 dipendenti. Lo studio si focalizza sulla popolazione operaia dello
stabilimento, ripartita in sei diversi reparti, caratterizzati da specifici processi produttivi:
reparto Lastre, Rotocalco, Roto-offset, Confezioni, Impianti e Manutenzione.
Agli operai dell’azienda è stato distribuito un questionario finalizzato alla rilevazione delle
percezioni riferite alle seguenti aree: pericolosità dei fattori di rischio presenti nel proprio
luogo di lavoro, frequenza degli infortuni, esposizione personale, possibilità di controllare i
fattori di rischio, formazione ricevuta; era inoltre presente una sezione dedicata alla raccolta
dei dati socio-anagrafici e degli eventi infortunistici subiti. I fattori di rischio inclusi nel
questionario sono stati ricavati da una precedente indagine pilota qualitativa, realizzata in
collaborazione con il Servizio di Prevenzione e Protezione aziendale e con i Rappresentanti
dei Lavoratori per la Sicurezza, che ha permesso di evidenziare i 6 principali fattori di rischio
comuni a tutti i reparti produttivi e 4 specifici per ciascuno di questi. Le modalità di risposta
al questionario prevedevano valutazioni espresse su scala Likert a 7 punti. I dati raccolti sono
stati sottoposti ad analisi descrittive, della varianza, correlazionali e fattoriali. I soggetti
coinvolti nella ricerca risultano 350 con caratteristiche socio-demografiche diverse con
prevalenza di soggetti di sesso maschile, di età compresa nella fascia 41-50 anni, con
anzianità lavorativa in azienda superiore a 10 anni.
RISULTATI Dalle analisi condotte sono emerse percezioni di rischio infortunistico
significativamente diverse tra i reparti presi in considerazione, riconducibili alle peculiarità
tecnologiche e produttive di ciascuna realtà. In sintesi, dai risultati emersi appare evidente
come la percezione dei rischi infortunistici si differenzi in base alle specifiche caratteristiche
delle lavorazioni presenti nei diversi reparti ed alle specifiche mansioni svolte dagli operai,
rispecchiando le differenti conoscenze e le esperienze professionali dei soggetti coinvolti
nell’indagine. I risultati ottenuti evidenziano alcune correlazioni significative riguardanti i
9

fattori pericolosità, frequenza ed esposizione che risultano essere fra di loro fortemente
associati (p

Pier Angelo Argentero Filone tematico A1
Sperimentazione di un osservatorio regionale per le infezioni acquisite
nelle strutture sanitarie
Asl 5 U. O. n A Interdipartimentale
Prevenzione delle Infezioni Ospedaliere
OBIETTIVO GENERALE
Costruire e sperimentare un modello per la sorveglianza delle Infezioni della Ferita
Chirurgica.
OBIETTIVI SPECIFICI:
1. Definire la frequenza delle infezioni della ferita chirurgica in interventi riguardanti le
Ernie, il Colon, protesi ortopediche di anca e di ginocchio.
2. Valutare la variabilità presente tra i diversi centri come base di attivazione di specifici
interventi preventivi.
3. Descrivere e analizzare le modalità assistenziali relative agli interventi oggetto di studio e
le procedure di controllo delle infezioni messe in atto (preparazione del paziente, uso di
antibiotici).
4. Disporre di una base dati per valutare l’efficacia di interventi di prevenzione e controllo.
MATERIALI E METODI
In seguito alla consultazione della bibliografia disponibile, delle linee guida del CDC sul
controllo delle SSI, di programmi e schede di sorveglianza adottati in altre Regioni Italiane
(Friuli Venezia Giulia, Emilia Romagna) e in altri Paesi (Francia, Gran Bretagna), sono stata
impostati il protocollo, la scheda raccolta dati, la guida alla compilazione della scheda. Il
protocollo e la scheda sono state oggetto di discussione e revisione da parte di operatori
regionali. Gli interventi da includere nello studio e la durata della sorveglianza sono stati
scelti in base a numerosità degli interventi condotti in Piemonte nel 2003, incidenza attesa di
infezione della ferita chirurgica, confronto con altre sorveglianze. Valutando il numero di
interventi attesi, la frequenza di infezione per classe di rischio e i relativi intervalli di
confidenza, è stata prevista una durata della sorveglianza pari a 6 mesi, con un follow-up a 30
giorni per gli interventi di chirurgia generale e a 30, 90 e 365 giorni per gli interventi
ortopedici. Il protocollo e la scheda sono state presentate alle ASL del Piemonte nel corso di
due riunioni effettuate nei mesi di giugno e luglio presso il Dipartimento di Sanità Pubblica e
Microbiologia dalla Regione Piemonte (Direzione Sanità Pubblica). Hanno aderito allo studio
19 ASL (compresa l’ASL di Aosta), per un totale di 30 Presidi ospedalieri, 6 Aziende
Sanitarie Ospedaliere, la Casa di Cura “Ospedale Cottolengo”.
La sorveglianza è stata avviata il 15 settembre 2004. A fine dicembre gli Ospedali partecipanti
hanno provveduto ad inviare all’ASL 5, presso l’Ospedale di Rivoli, la prima parte delle
schede raccolta dati riguardanti gli interventi effettuati entro il 30 novembre 2004. Tale invio
ha permesso sia di effettuare un controllo dell’accuratezza posta alla compilazione delle
schede, sia di iniziare il caricamento dei dati. Poiché il numero di interventi sorvegliati in due
mesi è risultato inferiore all’atteso, nel corso di una riunione svoltasi il 24 febbraio 2005, in
cui sono stati presentati alcuni dati preliminari, è stato proposto agli Ospedali partecipanti di
11

prolungare il periodo di sorveglianza a 8 mesi per poter raggiungere risultati statisticamente
significativi. Ha aderito a tale proposta il 92% degli Ospedali. La sorveglianza si è conclusa
nei mesi di maggio/giugno e l’invio delle schede raccolta dati è avvenuto nel periodo lugliosettembre
2005. L’invio delle schede si è protratto fino al mese di dicembre.
RISULTATI
E’ attualmente in corso presso il Dipartimento di Sanità Pubblica dell’Università di Torino la
registrazione dei dati su supporto informatico per mezzo di un programma di lettura ottica
delle schede; i dati saranno elaborati utilizzando il programma EpiInfo versione 3.3.2. Dati i
tempi di realizzazione del progetto da parte degli Ospedali le elaborazioni del materiale
pervenuto sono preliminari e l’analisi è descrittiva. Sono disponibili i dati relativi agli
interventi di chirurgia generale: sono pervenute 5311 schede, 4398 riguardanti interventi di
ernia, 913 riguardanti interventi sul colon. Interventi di ernia: il 90% dei pazienti è di sesso
maschile, l’età media è pari a 59 anni (mediana 62), il 73% degli interventi è stato condotto in
regime di Day Surgery. Nel 94% dei casi l’intervento è classificato come pulito, nell’84% con
indice NNIS pari a 0 e nel 16% pari a 1; nell’85% dei casi è stata posizionata una protesi.
E’ stata somministrata profilassi antibiotica nel 72% dei casi, nel 78% in camera operatoria
meno di 60 minuti prima dell’intervento (nel 15% in corsia meno di 120 minuti prima); la
profilassi non è proseguita nel periodo post-operatorio nell’83% dei casi. Il follow up è stato
completato a 30 giorni nell’86% dei casi (nel 97% con telefonata). Sono state diagnosticate 43
infezioni del sito chirurgico su 4236 interventi (1%, IC95% 0.7%-1.4%), 29 su 3162
interventi di classe NNIS=0 (0.9%, IC95% 0.6%-1.3%), 10 su 577 interventi con NNIS=1
(1.7%, IC95% 0.9%-3.3%). Il 95% delle infezioni si è manifestata dopo la dimissione, in
media dopo 13 giorni (mediana 8), nell’87% dei casi con localizzazione superficiale (13%
profonda). Interventi sul colon: il 57% dei pazienti è di sesso maschile, l’età media è pari a 69
anni (mediana 71). Nel 68% dei casi l’intervento è classificato come pulito/contaminato e nel
20% contaminato, nel 4% con indice NNIS M, nel 31% pari a 0 e nel 40% a 1.
E’ stata somministrata profilassi antibiotica orale nel 5% dei casi, nel 96% profilassi per via
endovenosa, nell’80% in camera operatoria meno di 60 minuti prima dell’intervento (nel 9%
in corsia meno di 120 minuti prima); la profilassi è proseguita nel periodo post-operatorio nel
64% dei casi, in media per 6 giorni. Il follow up è stato completato a 30 giorni nell’83% dei
casi (nel 90% con telefonata). Sono state diagnosticate 70 infezioni del sito chirurgico su 872
interventi (8%, IC95% 6.4%-10.1%), 3 su 35 interventi con NNIS=M (8.6%, IC95% 1.8%-
23.1%), 11 su 249 interventi di classe NNIS=0 (4.4%, IC95% 2.2%-7.8%), 16 su 315
interventi con NNIS=1 (5.1%, IC95% 3.0%-8.3%), 26 su 164 interventi con NNIS=2 (15.9%,
IC95% 10.6%-22.4%). Il 74% delle infezioni si è manifestata durante il ricovero, in media
dopo 12 giorni (mediana 10), nell’57% dei casi con localizzazione superficiale, 25%
profonda, 18 Organ/Space. Per quanto riguarda gli interventi ortopedici, sono pervenute
schede relative a circa 2000 interventi, di cui l’80% di protesi d’anca.
Le schede sono in fase di registrazione e è ancora in corso il follow-up a 12 mesi di almeno
due terzi degli interventi osservati; non è quindi attualmente possibile l'elaborazione dei dati,
né descrittiva né analitica. I dati elaborati saranno restituiti ai Centri sotto forma di Report,
presentati nel corso di una riunione e saranno oggetto di pubblicazione.
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Roberto Arione Filone tematico C2
Stesura, diffusione ed implementazione di procedure per la prevenzione
di eventi avversi nell’ASO S. Giovanni Battista
ASO S. Giovanni Battista – Struttura Complessa
Direzione Sanitaria Molinette e Servizi di Collegamento
OBIETTIVO
L’obiettivo principale del progetto era la riduzione di eventi avversi legati alla non
osservanza, assenza o incompletezza di procedure nell’ambito della gestione globale del
paziente ospedalizzato.
La metodologia utilizzata prevedeva per i principali eventi avversi occorsi presso la nostra
Azienda:
• stesura di precise procedure (basate sulle Linee Guida Nazionali ed Internazionali);
• condivisione con gruppi di esperti e successivamente con gli operatori;
• distribuzione delle procedure ad ogni Struttura Complessa.
METODI E RISULTATI
Dai dati raccolti, in riferimento al triennio 2000-2002 ed al 2003, tramite l’analisi delle
richieste di indennizzo della Struttura Complessa (SC) Patrimonio e degli indennizzi
effettivamente erogati sono state individuate le principali categorie di rischio presenti, per le
quali è stata eseguita apposita ricerca bibliografica e valutati gli interventi effettuati in altri
ospedali. Le aree di possibile intervento individuate sono state:
Danni legati ad intervento chirurgico in senso stretto
- Lesioni dentarie durante intubazione. Gruppo di lavoro in corso per stesura procedura
- Ustioni da elettrobisturi. Gruppo di lavoro in corso per stesura procedura
- Difetti estetici. Gruppo di lavoro in corso per stesura procedura
- Lesioni nervose. Procedura già elaborata, è stata presentata in data 17 febbraio 2005
- Corpi estranei. Gruppo di lavoro in corso per stesura procedura
Danni legati ad intervento chirurgico in senso lato e a mancanza di attenzione e
sorveglianza
Smarrimenti. Procedura già elaborata, è stata presentata in data 17 febbraio 2005
Danni legati a trasporto o a mancanza di sorveglianza
- Problemi di trasporto: per quanto concerne le cadute è già stata elaborata una procedura
che sarà presentata in data 22 marzo 2005
Legati a terapia emotrasfusiva (HCV,HBV, AIDS): è in fase di attivazione un gruppo di
lavoro con i colleghi Banca del Sangue per valutare mezzi di accertamento e diagnosi su
sangue e determinare la accuratezza e precisione dei test
Infezioni (Aspergillosi, Legionellosi, Pseudomonas):
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- è presente in Direzione Sanitaria apposito Ufficio dove le Infermiere addette al Controllo
delle Infezioni hanno il compito di sorvegliare l’occorrenza di infezioni ospedaliere
- è in atto una campagna di sensibilizzazione degli Operatori per un più frequente lavaggio
delle mani e per la scelta di tipologie di disinfezione (“Progetto Igiene delle Mani”)
- sono già stati attivati diversi corsi di formazione per i dipendenti (es. infezione da HIV)
- si sta progettando un’azione multinodale (tramite l’ausilio di poster, e-mail, conferenze e
corsi) finalizzate ad aumentare la compliance al lavaggio delle mani e degli strumenti
diagnostici (fonendoscopi)
All’interno del Dipartimento Direzione Sanitaria “Molinette” e Servizi di collegamento è stata
istituita una Struttura Complessa che si occupa dell’analisi e della prevenzione degli eventi
sfavorevoli, nell’ottica del miglioramento continuo della qualità.
Nell’ambito di tale SC è stato impostato un sistema di autoanalisi tra gli operatori (revisione
del percorso, valutazione random di cartelle cliniche e infermieristiche, audit clinico).
E’ stato inoltre strutturato un sistema di “voluntary reporting” tramite il quale un’apposita
Commissione Aziendale valuta gli eventi avversi generali, quelli prevedibili e quelle
situazione di rischio presunto o di “quasi errore” verificatisi all’interno dell’Azienda.
A tale scopo è stata elaborata una specifica scheda (“Scheda di Rilevazione Spontanea di
Eventi Sfavorevoli nella Pratica Clinica”) tramite la quale è possibile segnalare, in modo
anonimo il verificarsi di errori o di quasi errori da parte degli operatori sanitari.
Tale scheda è stata presentata dal Direttore della SC Qualità e Risk Management, in sessione
plenaria a tutti i Responsabili delle Unità Operative, in presenza del Direttore Generale e del
Direttore Sanitario ed al fine di ottenere una maggiore capillarità di diffusione, è stata
presentata alle singole riunioni di Dipartimento ed nel corso di una successiva seduta plenaria
è stato presentato il Data Base Informatico in cui i dati vengono inseriti e le modalità di
elaborazione.
Nel corso di un’ulteriore riunione in aula magna sono state presentate le procedure
attualmente elaborate (correzione di mal posizionamento, cadute etc.) che stanno per essere
distribuite all’interno dell’Azienda. Sono tuttora in corso riunioni di Reparto e di
Dipartimento nel corso delle quali sono discusse attività di Risk Management e le “Schede di
Rilevazione Spontanea di Eventi Sfavorevoli nella Pratica Clinica”.
È stata inoltre avviata un’accurata analisi del contenzioso con gli utenti sin dalla fase della
segnalazione in Direzione Generale, Direzione Sanitaria o all’Ufficio Relazioni con il
Pubblico: le segnalazioni che riferiscono ipotetici errori medici, deficit di assistenza, di
comunicazione, di organizzazione vengono attentamente esaminati dal Risk Manager (o nei
casi più complessi da una Commissione Tecnica appositamente deliberata) che:
1. richiede ulteriori chiarimenti agli operatori interessati ed ai responsabili di SC;
2. rivede la documentazione clinica;
3. studia attentamente il caso;
4. propone al Direttore Generale una risposta per l’utente.
In casi particolari vengono consultati il medico legale, la SC Patrimonio e/o la SC Legale.
EVENTI FORMATIVI ORGANIZZATI IN AZIENDA
- “Il Risk Management Aziendale” 05/05/04 e 21/09/04;
14

- “Dall’Accreditamento Istituzionale al Risk Management al Miglioramento della Qualità
nella pratica Clinico – assistenziale”, 14/12/04
- “Qualità e Risk Management nell’ASO S. Giovanni Battista: presentazione procedure”,
17/02/2005
BIBLIOGRAFIA PRODOTTA
- “L’attività di valutazione e gestione del rischio in un’Azienda Ospedaliera” M.
Rapellino, I.M. Raciti, M.C. Azzolina, A. Scarmozzino, R. Durando, E. Guglielmi, R.
Arione, P. Panarisi – presentato alla VII Conferenza Nazionale degli Ospedali per la
Promozione della Salute – Torino 21-22 novembre 2003
- “Analisi e Prevenzione del rischio nell’ASO San Giovanni Battista” M. Rapellino, I.M.
Raciti, M.C. Azzolina, A. Scarmozzino, R. Arione, P. Panarisi; pubblicato su Torino
medica anno XV – numero 1 gennaio 2004
- “Dall’analisi dei rischi in ospedale alla gestione dei gruppi di lavoro per la stesura di
procedure per le azioni correttive” L. Tessa, A. Todisco, M. Gulino, I.M. Raciti, M.C.
Azzolina, M. Rapellino - presentato al Congresso nazionale A.N.M.D.O. – Sorrento
(Napoli) 23-24-25 settembre 2004
- “Esperienza di “Incident Reporting dell’ASO S. Giovanni Battista di Torino” M.
Rapellino, M. Gulino, M.C. Azzolina, I.M. Raciti, M. Gessa, R. Broda, N. Demontis, R.
Arione, P. Panarisi presentato al Congresso nazionale A.N.M.D.O. – Sorrento (Napoli) 23-
24-25 settembre 2004
15

Maria Carmen Azzolina Filone tematico C1
Stesura, divulgazione ed implementazione di Linee Guida per la
prevenzione ed il trattamento delle Lesioni da Decubito
ASO S. Giovanni Battista – Struttura Complessa
Direzione Sanitaria Molinette e Servizi di Collegamento
OBIETTIVO DEL PROGETTO
Riduzione di incidenza e prevalenza delle Lesioni da Decubito (LDD) attraverso la
formazione del personale, al fine di rendere omogeneo il comportamento degli operatori nella
gestione dei pazienti a rischio di LDD, con conseguente riduzione dei rischi correlati
all’allettamento, aumento degli standard assistenziali e del comfort del paziente.
MATERIALI E METODI
Al fine di raggiungere l’obiettivo sono state svolte le seguenti attività:
• istituzione di una Commissione multidisciplinare coordinata da Direzione Sanitaria e
Ufficio Controllo Qualità Progetti composta da: un epidemiologo (componente del
gruppo EBM aziendale), un farmacista, un geriatra, un fisiatra, un dietologo, un chirurgo
vascolare, un chirurgo plastico, un diabetologo, un dermatologo, un fisioterapista, un
infermiere professionale. La Commissione si è occupata di effettuare una revisione della
letteratura nazionale ed internazionale e di elaborare una bozza del “Manuale prevenzione
e Trattamento LDD”.
• Formalizzazione e standardizzazione della modalità di richiesta per il noleggio superfici
antidecubito dinamiche e letti speciali al fine di predisporre in modo tempestivo e mirato
l’ausilio più appropriato per prevenire l’insorgenza delle LDD. La prescrizione degli
ausili è affidata al coordinatore infermieristico, il quale compila apposita scheda che oltre
a contenere i dati anagrafici include alcuni dati clinici (peso, altezza, diagnosi, condizioni
cliniche, presenza di lesioni).
• Attuazione del seguente piano formativo accreditato ECM: -
a) corso di I livello: seminari su “Prevenzione e trattamento LDD” rivolti a tutti gli
infermieri e gli OSS dell’Azienda a cui hanno partecipato circa 800 operatori;
b) corso di II livello “Valutazione, monitoraggio e trattamento LDD” rivolto ai referenti
dei reparti esposti a maggior rischio cui hanno partecipato 30 operatori.
• Affiancamento degli operatori, da parte dell’Ufficio Controllo Qualità Progetti in base alle
criticità dei pazienti.
• Supporto agli operatori nel definire il piano di cura personalizzato in base ai problemi
assistenziali (es. piano nutrizionale, piano di mobilizzazione, integrazione con ausili
speciali).
• Attivazione di un progetto pilota che prevede in via sperimentale l’utilizzo di letti
ergonomici con superfici antidecubito allo scopo di ridurre l’insorgenza di LDD e le spese
di noleggio per letti speciali. Il progetto è articolato in due fasi:
1. monitoraggio dei pazienti trattati con le nuove unità funzionali letto + materasso per
dimostrare:
16

- riduzione del fabbisogno delle giornate di noleggio;
- risoluzione problematiche relative al carico di lavoro del personale, correlato alla
movimentazione manuale dei pazienti ed ai rischi connessi.
2. Elaborazione dati e razionale per procedere all’investimento del denaro attualmente
speso dall’ASO per il noleggio.
• Stampa e distribuzione di:
- “Manuale per la prevenzione ed il trattamento delle Lesioni da Decubito” in formato
tascabile da distribuire a tutto il personale medico ed infermieristico dell’ASO.
- Brochure per pazienti e familiari: “prevenzione e cura delle lesioni da Decubito.
Assistenza a domicilio”.
Sono ancora in corso di elaborazione:
- Linee Guida integrali per ogni Unità Operativa;
- Flow-chart agli operatori di supporto, ai degenti ed ai loro familiari.
- schede - raccolta dati per misurare l'andamento del fenomeno e l'efficacia del trattamento
assistenziale;
- brochure contenenti le scale di valutazione per la prevenzione ed il trattamento delle
LDD;
- poster illustrati da affiggere presso le singole Unità Operative (UU.OO.) contenenti il
piano di prevenzione ed i protocolli di trattamento.
È inoltre in corso di elaborazione la strutturazione di due poster illustrati da distribuire a tutte
le UU.OO. di degenza e di Day Hospital con lo scopo di:
- orientare gli operatori a definire il piano di cure in base ad un algoritmo appositamente
elaborato ed alle raccomandazioni descritte;
- guidare gli operatori alla selezione del protocollo di trattamento idoneo in base alle
caratteristiche della lesione ed agli obiettivi assistenziali.
Sono state elaborate due schede per il monitoraggio del paziente portatore di LDD e per
l’approvvigionamento del materiale di medicazione da utilizzare.
• Indagini epidemiologiche al fine di stimare la prevalenza del fenomeno e l’andamento nel
corso degli anni.
RISULTATI
I pazienti sono classificati in base alla scala Braden, misura di rischio ampiamente accreditata
ed utilizzata a livello internazionale. Nel 2002 su 978 degenti valutati, la prevalenza è risultata
del 23,8%, il numero di lesioni 464, di cui il 46% dal II al IV stadio. Il 14 aprile 2005
l’indagine è stata nuovamente effettuata: su 948 degenti valutati, la prevalenza è risultata del
22,2%, il numero di lesioni 388, di cui il 53,7% dal II al IV stadio. ·attivazione di un progetto
di monitoraggio del trattamento delle LDD attraverso un sistema, gestito dalla Direzione
Sanitaria in collaborazione con la Farmacia, che si è occupato di formare un gruppo di
infermieri specializzati, dotati di strumenti tecnologici per la diagnosi ed il monitoraggio delle
LDD.
Sono stati inoltre elaborati specifici protocolli di trattamento che prevedono l’utilizzo di
medicazioni avanzate presenti nel Prontuario Terapeutico Ospedaliero ed acquisite
dall’Azienda tramite specifiche gare d’appalto.
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Francesco Baccino Filone tematico A2
Suscettibilità all’epatocancerogenesi in relazione all’espressione di
molecole coinvolte nell’apoptosi
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale
CONTESTO E RAZIONALE
Il carcinoma epatocellulare rappresenta la quinta causa di morte nei portatori di tumore e
rappresenta circa il 5% dei casi totali di cancro nel mondo; in alcune regioni dell’Africa e
dell’Asia, causa fino al 70% delle morti totali per cancro. La maggior parte dei casi di HCC al
momento della diagnosi si trova già in uno stadio avanzato, il che rende conto del tasso di
mortalità a 5 anni superiore al 95%. A differenza di altre neoplasie umane, l’eziologia
dell’HCC è in buona parte nota; infatti, il rischio aumenta nettamente in associazione ad
infezioni da virus dell’epatite e all’assunzione di aflatossine con la dieta. L’insorgenza
dell’HCC è un processo multifasico associato a modificazioni dell’espressione genica
dell’ospite. Numerose osservazioni condotte sia in modelli animali che nell’uomo
sottolineano l’importanza dell’assetto genico individuale nel determinare la suscettibilità al
cancro. La morte per apoptosi è un processo modulato sia positivamente che negativamente
dall’espressione di geni conservati nel corso della filogenesi e regolato dall’attività di fattori
pro- ed antiapoptotici. Alterazioni della regolazione del processo apoptotico sono alla base sia
della cancerogenesi che della resistenza del tumore ai chemioterapici. La comprensione dei
meccanismi attraverso i quali le cellule tumorali o trasformate sfuggono alla morte per
apoptosi potrebbe fornire una chiave per la comprensione dei rapporti che intercorrono tra la
genetica del cancro e la sensibilità ai trattamenti, e potrebbe costituire il punto di partenza per
un approccio razionale alla progettazione di nuovi farmaci e di nuovi protocolli terapeutici.
OBIETTIVI E METODI
Scopo della ricerca è stato l’analisi di vie di segnalazione coinvolte nel controllo della morte e
della sopravvivenza cellulare in relazione alla suscettibilità alla epatocancerogenesi chimica
nel ratto e in linee cellulari, umane e di ratto, di derivate da epatocarcinomi. In particolare,
l’attenzione focalizzata sulla misurazione dell’espressione e dell’attività di molecole coinvolte
nella trasduzione dei segnali a valle del recettore 1 del TNF.
Le analisi sono state effettuate su campioni di fegato di controllo e di lesioni neoplastiche
avanzate ottenute da ratti Fischer 344 (geneticamente suscettibili alla cancerogenesi chimica)
e BFF1 (geneticamente resistenti), e su cellule in coltura HTC (epatoma di ratto), e HepG2 e
Huh7 (epatomi umani) in condizioni basali e dopo trattamento con TNF in associazione a
cicloesimide. L'espressione delle molecole coinvolte nella trasduzione dei segnali di morte e
dei fattori pro- ed anti-apoptotici associati alla via mitocondriale di attivazione dell'apoptosi è
stata analizzata mediante western blotting, l’attivazione dei fattori di trascrizione NF-kB e
AP-1 è stata valutata mediante EMSA.
RISULTATI
Epatocarcinomi di ratto. In lesioni neoplastiche avanzate ottenute mediante il protocollo di
Solt e Farber in ratti F344 e BFF1, rispettivamente suscettibili e resistenti
all’epatocancerogenesi chimica, l’analisi dell’espressione di alcune proteine coinvolte nella
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trasduzione del segnale derivante da TNF-R1 non ha dimostrato differenze tra i due ceppi di
ratto. Al contario, tra tessuto neoplastico e fegato normale sono state riscontrate differenze
significative che nel loro complesso dimostrano un assetto anti-apoptosi nei tumori rispetto al
fegato di controllo. Questo dato è in accordo con il riscontro, negli epatocarcinomi,
dell’attivazione costitutiva del fattore pro-sopravvivenza NF-kB. Resta da chiarire in quale
fase del processo di epatocancerogenesi si attuino le variazioni di espressione osservate,
nonché, per quanto concerne l’attivazione di NF-kB, quali siano i suoi effettori e quali i geni
bersaglio.
Linee cellulari derivate da epatocarcinomi. Una scarsa predisposizione all’apoptosi è stata
anche dimostrata nella linea cellulare HTC, derivata da un epatoma di ratto. In queste cellule
infatti, il trattamento con TNF, associato a cicloesimide, non determina morte apoptotica
caspasi-dipendente; la citotossicità della citochina è piuttosto mediata dal comparto
vacuolare-acido e da stress ossidativo. La trasduzione del segnale apoptogeno da attivazione
di TNFR1 è stata anche valutata su due linee di epatocarcinoma umano, le HepG2,
assimilabili a epatociti di controllo, e le Huh7, esprimenti costitutivamente una forma mutata
di p53 e caratterizzate da maggiore malignità fenotipica. L’analisi comparativa dei
meccanismi coinvolti nell’attuazione dell’apoptosi nelle due linee cellulari ha dimostrato
complessivamente una minor suscettibilità delle cellule Huh7. Queste cellule inoltre,
diversamente dalle HepG2, ma analogamente agli epatocarcinomi di ratto, sono caratterizzate
dall’attivazione costitutiva di NFkB.
Epatociti isolati da ratti suscettibili e resistenti all’epatocancerogenesi. Esperimenti
preliminari hanno dimostrato l’importanza dell’attivazione di NF-kB nel condizionare la
suscettibilità all’apoptosi anche in epatociti isolati da fegato di ratto F344. Infatti, inibitori
dell’attivazione del fattore di trascrizione, quali la gliotossina, potenziano efficacemente
l’effetto del TNF.
CONCLUSIONI
Nel complesso i dati finora ottenuti hanno dimostrato, tra tessuto normale e lesioni
neoplastiche avanzate, cosi’ come tra le diverse linee di epatoma, alcune differenze nella
segnalazione a valle di TNFR1 il cui significato sarà approfondito in futuro.
PUBBLICAZIONI
P.Costelli, P.Aoki, B.Zingaro, N.Carbó, P.Reffo, F.J.Lopez-Soriano, G.Bonelli, J.M.Argilés,
F.M.Baccino (2003) Cell Death Differ 10:997-1004.
R.A.Canuto, G.Muzio, M.Maggiora, A.Trombetta, G.Martinasso, R.Autelli, P.Costelli, G.
Bonelli, F.M.Baccino (2003) J Lipid Res 44:56-64
M.Bossola, M.Muscaritoli, P.Costelli, G.Grieco, G.Bonelli, F.Pacelli, F.Rossi Fanelli, G.B.
Doglietto, F.M.Baccino (2003) Ann Surgery 237:384-389
M.Muscaritoli, P.Costelli, M.Bossola, G.Grieco, G.Bonelli, R.Bellantone, G.B.Doglietto,
F.Rossi Fanelli, F.M.Baccino (2003 Nutrition 19:936-939
P.Costelli, M.Muscaritoli, M.Bossola, R.Moore-Carrasco, S.Crepaldi, G.Grieco, R.Autelli,
G.Bonelli, F.Pacelli, F.J.Lopez-Soriano, J.M.Argilés, G.B.Doglietto, F.M.Baccino, F.Rossi
Fanelli (2005) Int J Oncol 26:1663-1668
P.Costelli, P.Reffo, F.Penna, R.Autelli, G. Bonelli, F.M. Baccino (2005). Int J Biochem Cell
Biol 37:2134-2146 7 R.Autelli, S.Crepaldi, D.De Stefanis, M.Parola, G.Bonelli, F.M.Baccino
(2005) Apoptosis 10:777-786
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Piero Balbo Filone tematico D2
Le polmoniti acquisite in comunità nella ASL 13, dal territorio
all'ospedale: proposta di gestione integrata
A.O. Maggiore della Carità– Novara
METODI E RISULTATI
Nel periodo dal 1/10/2004 al 30/09/2005 sono state ricoverate 672 CAP negli Ospedali
dell'ASL 13. Di queste sono state prese in considerazione solo le 348(51,8%) CAP
ospedalizzate nell'azienda Ospedaliera Maggiore della Carità di Novara. 259 pazienti (74%)
sono stati ricoverati nella U.O.A. di Pneumologia , 89 pazienti(25%) sono stati ricoverati in
altri reparti medici, 8 pazienti (2,3%)in UTI. L'età media dei pazienti era di 71,3 anni,
183(52,6%) avevano un'età >75 anni. 87(25%)erano fumatori, 6(17,5%) ex fumatori. Solo
111(31,9%) erano stati precedentemente vaccinati contro l'influenza, nessuno contro il
pneumococco. 31(8,9%) erano stati sottoposti a domicilio a terapia antibiotica(in assenza di
diagnosi radiologicamente confermata di polmonite).
Tale terapia veniva modificata o potenziata durante la degenza. 10%(30,2%) presentavano
all'ingresso in ospedalealterazioni dello stato mentale. 257(73,9%) avevano una FR>30/min,
87(32,5%) una FC>125/min, 225(64,7%) avevano una PaO2

mediante survey telefonico le condizioni cliniche e la sopravvivenza. Nè il controllo a 30
giorni nè il survey telefonico modidficvano la diagnisi di dimissione o aggiungevano morti da
imputare alla polmonite. Era pertanto possibile far coincidere la mortalità per polmonite con
la mortalità intraospedaliera. La mortalità intraospedaliera era di 54 pazienti (15,5%) e si
distribuiva come segue a seconda delle classi di gravità:Classe II-III:1 (1,7%), Classe IV:10
(18,5%), Classe V: 43 (79,6%). Solo 4 pazienti deceduti provenivano da una Casa Protetta.
Inoltre l'appartenenza ad una determinata classe di rischio condizionava in percentuale diversa
il rischio di morte:Classe II-III 1/72 (1,3%), Classe IV 10/106 (9,4%), Classe V 43/170
(25,3%). Si sottolinea che solo 1 paziente (12,5%) degli 8 ricoverati in UTI andava incontro a
morte per shock settico. Tra i fattori più importanti associati al rischio di morte oltre all'età
(età media dei pazienti deceduti con età >75 anni (75,9%) era 85,9 anni) ed alle comorbilità,
una particolare menzione nella nostra casistica merita il versamento pleurico presente in circa
il 50% dei pazienti.
CONCLUSIONI
Il presente studio dimostra come grazie ad un percorso preferenziasle i pazienti affetti da
sospettta polmonite, inviati dal medico di famiglia in ospedale, siano stati ricoverati in base
alla gravità della malattia. Infatti solo l'8% dei pazienti di classe II e stao ricoverato con
evidente riduzione dei ricoveri inutili. I pazienti , per la prima volta, sono stati stratificati
secondo le classi di rischio (PSI), trattati tempestivamente con protocolli omogenei ,
probabilmente a vantaggio di una maggiore efficacia terapeutica valutabile come riduzione
dela degenza media e come sostanziale assenza di ricadute/riospedalizzazioni per la stessa
malattia. Il tasso di guarigione, l'assenza di ricadute/riospedalizzazioni, ed il tasso di mortalità
a 30 giorni non si discostano da quelli pubblicati nelle piu autorevoli rassegne internazionali.
La mancanza di una Unità di Terapia Intermedia Respiaratoria (UTIR) con la possibilità di
sottoporre i pazienti a ventilazione incruenta (NIV), ha impedito di trattare in modo più
incisivo i " Grandi Vecchi" che , se affetti concomitanetmente da insufficienza respiratoria e
versamento pleurico, hanno uan elevata probabilità di morire nonostante l'ottimizzazione del
trattamento farmacologico.
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Emiliana Ballocchi Filone tematico D2
Indagine epidemiologica su Leptospira spp ed altre patologie presenti
nelle nutrie nel comprensorio del Basso Sesia
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta
Sezione di Vercelli
INTRODUZIONE
La nutria (Myocastor coypus) è un grosso roditore originario del sud America. Un adulto può
raggiungere il peso di 12 Kg e la lunghezza di 50 cm, 80 con la coda. E' un animale erbivoro,
prettamente acquicolo, dotato di zampe posteriori palmate, che predilige acque a bassa
velocità di scorrimento e che può ingerire vegetali sino al 25% del suo peso/giorno.
Introdotta in Italia nel 1928 a cura dell'Istituto di coniglicoltura di Alessandria e utilizzata
negli anni '70/'80 quale animale da pelliccia (il cosiddetto castorino) si è ben adattata al nostro
clima tanto che i soggetti sfuggiti alla cattività o liberati quando non più richiesti dal mercato
si sono notevolmente riprodotti facilitati dalla mancanza di antagonisti naturali; solo i cuccioli
possono essere predati da volpi o da uccelli rapaci. La nutria è considerata specie
indesiderabile sul territorio per l'origine esotica, per le interferenze negative alle biocenosi
autoctone (alterazione fitocenosi palustri e distruzione dei siti di nidificazione dell'avifauna
locale e migratoria) e per i problemi economici che la sua presenza comporta (danni ai canali
d'irrigazione delle coltivazioni di riso per l'abitudine a scavare tane profonde anche 2 m, con
ingressi di 50 cm circa e danni diretti a diverse colture delle quali si ciba e a piante ad alto
fusto la cui corteccia in inverno è viene utilizzata come alimento). Per contenere il numero
delle nutrie sul territorio le Amministrazioni Provinciali hanno la possibilità di attivare
abbattimenti (art.19 L.157/92 e art. 29 LR70/96).
MATERIALI E METODI
Alla sezione di Vercelli dell'IZS PLV da settembre 2004 a novembre 2005 sono pervenute 87
nutrie del comprensorio del Basso Sesia; una parte è stata catturata con gabbie metalliche,
contenenti carote e mele, poste in prossimità di argini di canali irrigui; una parte dei soggetti è
stata abbattuta dalle guardie provinciali in ottemperanza della delibera della giunta provinciale
di Vercelli del 11/12/2000; una piccola parte era costituita da soggetti rinvenuti morti ai lati di
strade dal personale del parco Lame del Sesia e dell'ASL di Vercelli.
I soggetti sono stati pesati e sessati; su tutti è stato eseguito un esame necroscopico e
parassitologico per ecto ed endo-parassiti (su materiale fecale prelevato da più punti del tubo
gastroenterico, sia a fresco che per arricchimento con solfato di zinco). I campioni di
diaframma e massetere di 55 soggetti di peso superiore a 3Kg sono stati sottoposti a ricerca di
larve di Trichinella dopo digestione artificiale con lo strumento Tricomatic 35. Su materiale
prelevato da intestino tenue e cieco di 35 soggetti sono state effettute ricerche di Salmonella
con prearricchimento in acqua peptonata,arricchimento selettivo in brodo selenite e
Rappaport,semina su terreno differenziale XLT4 e ricerca di Campylobacter con
arricchimento in Campylobacter broth, semina su CCDA,in microaerofilia. Sul siero di
sangue prelevato dal cuore o da cava addominale di 57 soggetti si è proceduto alla ricerca di
anticorpi anti-Leptospira (metodo della microagglutinazione,utilizzando 8 sierovarianti di
L.interrogans-ballum, bratislava, canicola, copenhageni, grippotyphosa, hardjo,
icterohaemorragiae, pomona e tarassovi e si è attribuito un valore di significatività a partire
22

dal titolo di 1:100) e alla ricerca anticorpi anti-Brucella abortus (metodo di
sieroagglutinazione rapida con antigene al rosa bengala e fissazione del complemento con
antigene Brucella abortus)
RISULTATI E CONSIDERAZIONI
Es.necroscopico. Tutti i soggetti erano in buono stato di nutrizione; due terzi erano maschi
(peso max 7Kg), un terzo femmine (max 6.5Kg); femmine con feti a termine(n°max feti 5)
sono state recapitate a marzo e ad agosto; feti nei primi stadi di gestazione erano al massimo
8, anche a stadi diversi di gestazione, a conferma di quanto citato da altri ricercatori circa la
possibilità di riassorbimento fetale e/o prolungamento della gestazione a seconda del clima e
della disponibilità di cibo. Il contenuto dello stomaco presentava esclusivamente vegetali.
Es.parassitologico. Non sono stati rinvenuti parassiti esterni, facili da osservare in
allevamenti a secco. Quattro soggetti presentavano lesioni epatiche imputabili in un caso a
Cisticerchi, in un altro a Fasciola, in 2 a Capillaria hepatica; nessuna lesione da coccidiosi
epatica. Sul materiale prelevato da lume intestinale sono stati osservati: Guardia (in 5
soggetti),oocisti di Coccidi (in 11), uova di cestodi (in 10) e nematodi gastro-intestinali (in
50), con infestazioni più lievi negli adulti che nei giovani, dove in qualche caso erano
associati ad enterite. In generale le infestazione non erano in nessun caso così gravi come si
osserva negli allevamenti da pelliccia.
Ricerca Trichinella. Ha sempre dato esito negativo. Secondo studi condotti in allevamenti di
nutria essa può essere infestata in percentuale maggiore rispetto ai suidi, alla stregua dei quali
è considerata (O.ACIS 27/4/1958 art.1); essendo la nutria selvatica erbivora è meno esposta al
rischio di infestazione.
Ricerca Salmonella e Campylobacter hanno sempre dato esito negativo. La nutria
d'allevamento è considerata animale sensibile a salmonella, mentre come selvatico sembra
esserlo meno, malgrado condivida un ambiente abitato da ratti. Si è pensato di aggiungere
anche la ricerca di campilobatteri in quanto ormai sono, insieme a salmonella, la principale
causa di enteriti nell'uomo per ingestione di alimenti di origine animale, di acque e vegetali
contaminati.
Ricerca Brucella Ha sempre dato esito negativo; il dato è confortante visto che l'ambiente
della nutria può essere condiviso da animali domestici e dall'uomo.
Ricerca Leptospira Ha dato esito positivo in 5 soggetti(8.7%); 4 sono risultati positivi per la
sierovariante bratislava, 2 per icterohaemorragiae e copenhageni. La mancata correlazione tra
positività sierologica e riscontro di lesioni renali potrebbe anche questa volta confermare il
ruolo della nutria quale portatore di Leptospira, inoltre la positività sierologica potrebbe
rappresentare un indice della presenza di questo microorganismo nell'ambiente.
CONCLUSIONI
Da diversi anni agli sforzi per la conservazione della specie a rischio di estinzione si sono
affiancati studi sul ruolo di animali selvatici alloctoni nell’epidemiologia di malattie
infettive/infestive. Sulla nutria sono stati effettuati studi di patologie coinvolgenti
prevalentemente soggetti di allevamenti da pelliccia, mentre pochi sono quelli su nutrie
selvatiche. E’importante continuare con la sorveglianza delle malattie parassitarie, batteriche
e virali che potenzialmente potrebbero essere responsabili di epizoozie in altri animali
selvatici,in animali domestici e nell’uomo che condividono lo stesso habitat.
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Federico Balzola Filone tematico A5
Enterocolite autistica: studio clinico e laboratoristico di una nuova
sindrome
ASO San Giovanni Battista di Torino
U.O.A.D.U. Gastro-Epatologia
INTRODUZIONE
L’autismo e più in generale i Disturbi Pervasivi di Sviluppo (DPS) costituiscono un problema
socio-sanitario di grande importanza con una prevalenza di 10-20 su 10000. L’eziologia di tali
disturbi è tuttora sconosciuta, viene riconosciuta una genesi multifattoriale con una rilevante
componente genetica. All’interno nei DPS è inoltre segnalata una elevata prevalenza di
disturbi gastroenterologici associati, con stime che variano tra il 9% ed il 45% dai pazienti
affetti da DPS. Questi venivano tuttavia per la maggior parte sottovaluti o non riconosciuti per
le difficoltà di comunicazione di questa categoria di pazienti. La descrizione della presenza di
una malattia infiammatoria cronica intestinale in un sottogruppo di pazienti affetti da autismo
è stata fatta per la prima volta nel 1998 dal Wakefield et al. Tale riscontro ha suscitato un
acceso dibattito scientifico sulle possibili relazioni tra il disturbo autistico e disturbi
gastrointestinali. Secondo alcuni autori la disfunzione a livello intestinale potrebbe essere uno
dei fattori causali del disturbo autistico, secondo altri i due disturbi potrebbero essere
espressione di uno stesso meccanismo eziopatogenetico che causerebbe un’alterazione
multisistemica.
SCOPO DELLO STUDIO
Lo scopo del nostro studio è stato quello di identificare una coorte di pazienti autistici con
caratteristiche cliniche suggestive per patologie intestinali per la successiva valutazione e
caratterizzazione di una patologia cronica intestinale.
MATERIALI E METODI
Sono giunti consecutivamente alla nostra osservazione 65 pazienti con disturbi
neuropsichiatrici e gastroenterologici dei quali 41 soddisfavano i criteri di inclusione dello
studio (diagnosi di autismo secondo il DSM-IV, sintomatologia gastroenterologica, non altre
condizioni patologiche associate). Di questi, 11 pazienti maschi (età media 16 anni, range 4-
30) hanno accettato il protocollo proposto e sono stati pertanto inseriti nello studio. Dopo gli
accertamenti di primo livello (esami ematochimici, fecali ed urinai ed ecografia addome
superiore ed intestinale) sono stati sottoposti ad esofago-gastro-duoedenoscopia e colonscopia
con biopsie multiple in narcosi ed enteroscopia con videocapsula nei soli pazienti adulti.
RISULTATI
Gli esami di primo livello hanno messo in evidenza la presenza di anemia in 2 pazienti e
sangue occulto fecale in 3 soggetti. Gli accertamenti endoscopici hanno rivelato all’esofagogastro-duodenoscopia
la presenza di gastrite in 4 pazienti, esofagite in uno e duodenite in uno.
L’esame istologico del materiale prelevato con le biopsie ha mostrato un’infiammazione
cronica dello stomaco e del duodeno in 7 pazienti (64%). Alla colonscopia sono state
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iscontrate alterazioni della mucosa intestinale in un paziente (ulcerazioni aftoidi e perdita del
pattern vascolare), mentre un’iperplasia nodulare linfoide era presente nell’ileo terminale di 5
pazienti (45%). L’esame istologico ed immunoistochimico dei tessuti biopsiati ha mostrato
una colite microscopica con infiltrazione di linfociti intarepiteliari ed eosinofili, atrofia della
mucosa e iperplasia dei noduli follicalari linfoidi in tutti i pazienti indagati (100% dei casi). A
livello dell’ileo terminale è stata evidenziata un’infiammazione cronica con iperemia e
accorciamento dei villi in 7 soggetti (64%). L’esplorazione dell’intero intestino tramite
videocapsula ha dimostrato in tutti e 5 i pazienti alterazioni infiammatorie specifiche di vario
grado di intensità (aree di sanguinamento ed iperemia con erosioni mucose e ulcere o aree
iperemiche o lesioni atipiche tipo vasculitico) sia nel digiuno che nell’ileo, localizzate in
maniera discontinua per l’intero tratto del piccolo intestino.
CONCLUSIONI
Lo studio condotto per la prima volta in Italia, sebbene su un gruppo limitato di pazienti, ha
riprodotto i dati pubblicati da altri autori all’estero, confermando la presenza di una malattia
infiammatoria cronica intestinale associata al disturbo autistico. Gli accertamenti effettuati
hanno dimostrato la presenza di lesioni macroscopiche sia nel tratto gastroenterico superiore
che in quello inferiore nel 54,5% dei pazienti ed alterazioni microscopiche evidenziate con
l’esame istologico nel 73% dei soggetti nel tratto gastroenterico superiore, nel 64% nell’ileo
terminale, nel 100% del colon. Tutti i pazienti osservati hanno mostrato un coinvolgimento
macroscopico e/o microscopico. I dati ottenuti con la video-capsula rappresentano inoltre le
prime immagini al mondo di un interessamento panintestinale di tale patologia. L’efficacia
delle terapia farmacologia sulla patologia intestinale ed i suoi riflessi sulla patologia
neuropsichiatria saranno oggetto di prossimi studi. I risultati ottenuti sono stati presentati nel
2005 a 2 congegni di gastroenterologia, uno nazionale ed uno internazionale, segnalati
preliminarmente su una rivista internazionale nello stesso anno e sono in fase di pubblicazione
più estesa nei prossimi mesi.
PUBLICAZIONI
F. Balzola, D.Clauser, A. repici, V. Barbon, A.Sapino, C.Barbera, PL.Calvo, M.Gandione,
R.Rigardetto, M.Rizzetto. Autistic enterocolitis: confirmation of a new inflammatory bowel
disease in an Italian cohort of patients.Digestive and Liver Disease PO2.87, S137.Vol 37.
Supplement N.1 March 2005
Balzola F, Barbon V, Repici A, Rizzetto M, Clauser D, Gandione M, Sapino A. Panenteric
IBD-like disease in a patient with regressive autism shown for the first time by the wireless
capsule enteroscopy: another piece in the jigsaw of this gut-brain syndrome Am J
Gastroenterol. 2005 Apr;100(4):979-81.
Balzola F, Daniela C, Repici A, Barbon V, Sapino A, Barbera C, Calvo PL, Gandione M,
Rigardetto R, Rizzetto M. Autistic enterocolitis: confirmation of a new inflammatory bowel
disease in an Italian cohort of patients. Gastroenterology
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Franco Balzola Filone tematico D1
Fattori di rischio nell’incidenza di carcinoma del colon-retto in soggetti
affetti da obesita’ di grado medio-elevato
Istituto Auxologico Italiano
OBIETTIVI
Obiettivo generale del progetto era verificare l’ipotesi di lavoro che la resistenza insulinica e
l’obesità rappresentino fattori di rischio per l’insorgenza di carcinoma colorettale e, in caso di
risposta affermativa, valutare il grado di interdipendenza di questi due fattori.
Obiettivi dettagliati erano rappresentati da:
1. assemblaggio di una coorte di pazienti residenti in Piemonte ed in Lombardia affetti da
obesità ricoverati (in regime di degenza ordinaria e di Day-Hospital) presso l’Ospedale
San Giuseppe (Piancavallo, VB) nel periodo 1995-2002. Sono stati arruolati nello studio i
pazienti ambosessi di età superiore ai 18 anni (30 anni nella versione originaria del
progetto) nella cui scheda di dimissione ospedaliera (SDO) dall’Ospedale San Giuseppe
fosse presente una diagnosi di “obesità”,
2. raccolta ed inserimento dati in database informatizzato adatto alle successive analisi
statistiche;
3. pulizia del database (eliminazione casi doppi, errori di codifica ecc.);
4. linkage con i database delle SDO delle Regioni Piemonte e Lombardia e rilevazione degli
eventi di ricovero negli anni successivi con diagnosi di “carcinoma del colon” e
“carcinoma del retto”;
5. analisi statistica dei dati.
MATERIALI E METODI
Assemblaggio della coorte (attività 1): si premette che i criteri di assemblaggio sono stati
modificati rispetto al progetto originario su indicazione dei Colleghi epidemiologi includendo
anche pazienti extra Regione Piemonte e Lombardia nonchè pazienti di età compresa tra i 18
ed i 30 anni, allo scopo di aumentare gli anni-uomo di osservazione e di potere allargare in
futuro gli obiettivi della ricerca ad altre patologie
La coorte arruolata ha le seguenti caratteristiche:
N. Pazienti
arruolati
Età Media M (%) F (%)
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Insulinemia disponibile
(%)
anno 1996 814 45.9 28 72 65
anno 1997 1577 46.5 21 79 73
anno 1998 1652 47.6 21 79 88
anno 1999 1721 47.8 21 79 92
anno 2000 1600 48.9 22 78 99
anno 2001 1680 50.5 21 79 98
anno 2002 1784 51.4 27 73 98

La percentuale media di provenienza dalle Regioni Piemonte e Lombardia è del 69%.
Raccolta ed inserimento dati (attività 2): l’accertamento del grado di informatizzazione già
disponibile dei dati richiesti dalla ricerca è stato piuttosto lungo e laborioso, in quanto ha
richiesto la conversione in ambiente tecnico specialistico esterno di un database anagrafico
già esistente presso l’Istituto in un formato adeguato agli scopi dello studio (Access). E’ stato
tuttavia possibile recuperare al 100% i parametri anagrafici (nome, cognome, sesso, data
ricovero, luogo di nascita e di residenza, codice fiscale, codice patologia principale e
secondaria secondo ICD-IX) dall’anno 1997 in poi. Per quanto riguarda i dati clinici (peso,
altezza, indice di massa corporea, circonferenza vita, circonferenza fianchi, fumo di sigaretta,
consumo di alcool, glicemia, uricemia, insulinemia, HOMA, colesterolo totale, colesterolo
LDL, colesterolo HDL, trigliceridi, utilizzo di antidiabetici orali, pressione arteriosa
diastolica e sistolica).
Pulizia database (attività 3)
E’ stata completata ed il database è stato consegnato all’Istituto di Epidemiologia dei Tumori
– Centro Prevenzione Oncologica – Università di Torino.
Linkage con i database delle SDO delle Regioni Piemonte e Lombardia e rilevazione
degli eventi di ricovero (attività 4): questa attività è in corso presso l’Istituto di
Epidemiologia dei Tumori – Centro Prevenzione Oncologica – Università di Torino.
Analisi statistica dei dati (attività 5)
Questa verrà effettuata non appena conclusa la attività 4.
RISULTATI
La realizzazione del progetto permetterà di:
1. valutare la incidenza di carcinoma colo-rettale associata all’obesità;
2. stimare l’impatto relativo dell’insulino-resistenza e dell’eccesso ponderale sullo sviluppo
di tale patologia.
Una stima di rischio attribuibile basata su dati locali sarà estremamente utile per la
pianificazione di strategie di prevenzione del carcinoma colo-rettale nei soggetti a rischio.
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Cristiana Barbera Filone tematico B3
Identificazione di casi di celiachia attraverso sintomi tipici e atipici e
nelle patologie a rischio.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze pediatriche
CONTESTO E RAZIONALE
La celiachia, finora considerata malattia rara, si è rivelata in realtà una delle più frequenti
patologie croniche autoimmuni di cui sono noti sia l'agente scatenante sia il terreno genetico
predisponente. Nonostante queste premesse a tuttoggi la malattia risulta sottodiagnosticata e
le sue temibili complicanze (in ordine di gravità, neoplasie, infertilità, osteoporosi, carenze
nutrizionali) che non sarebbero insorte se la diagnosi fosse stata tempestiva si manifestano
raggiunta l'età adulta. Con l'età si accresce anche il rischio di malattie autoimmuni ma su
questo il tempismo diagnostico sembra ininfluente. Considerato l'estremo polimorfismo della
malattia, la diagnosi di celiachia atipica non è sempre semplice e solo avendo presenti le
possibili manifestazioni è possibile eseguire i test diagnostici che indirizzano verso una
conclusione diagnostica certa.
OBIETTIVO
Il nostro studio aveva come obiettivo il recupero del maggior numero di diagnosi di celiachia
attraverso la diffusione tra i pediatri di base di una scheda contenente le principali
manifestazioni e le principali patologie a cui la celiachia si associa per facilitarne la
individuazione precoce.
METODI E RISULTATI
Per il ridotto organico del nostro Servizio (le borsiste che si sono avvicendate si sono dovuti
impiegare anche nella assistenza e in altre ricerche riguardanti questa malattia) e per la non
riuscita attivazione dei pediatri di base la scheda è stata applicata secondo la metodologia
prevista solo nell’ASL n 8 dove è primario il copresentatore del progetto Prof Umberto De
Vonderweid. Presso quella Azienda sono stati identificati 17 celiaci su 881 sieri esaminati dal
novembre 2002 al marzo 2004. In quella realtà l'Odds Ratio di celiachia ottenuto con la
scheda è risultato superiore a 4 con differenza statisticamente significativa rispetto al valore
teorico atteso. All’interno della nostra struttura la attività di informazione è stata svolta
sfruttando al massimo le risorse disponibili:
a) attraverso la informazione dei pazienti già diagnosticati (esortandoli allo screening dei
consanguinei di I°, a maggior rischio di essere a loro volta affetti);
b) attraverso la azione educativa a riconoscere la malattia nelle sue varie forme tipiche,
atipiche ed extraintestinali rivolta agli: studenti di medicina del corso di Laurea, studenti
infermieri afferenti al diploma universitario di pediatria odontoiatri, specializzandi in
Pediatria;
c) attraverso Convegni divulgativi destinati a medici di base pediatri e medici generici,
neurologi, medici laboratoristi, biologi, tecnici di laboratorio.
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Grazie a questo sforzo attuato soprattutto attraverso la collaborazione con la associazione AIC
(Associazione Italiana Celiaci) il numero di nuove diagnosi/anno è passato progressivamente
da 74 nel 2000 a 130 nel 2004 e nel 2005. Il nostro Servizio di gastroenterologia, Centro di
riferimento per Torino e parte della Provincia per l’esecuzione della biopsia digiunale, tappa
conclusiva dell’iter diagnostico per la celiachia, rappresenta un “Osservatorio” per il
monitoraggio delle caratteristiche epidemiologiche e cliniche della malattia in età pediatrica.
L’analisi della casistica ottenuta nel periodo del progetto di ricerca ha dimostrato,
analogamente a quanto segnalato in altre popolazioni pediatriche, un incremento di diagnosi
per screening familiare, l'aumento di forme presenti in pazienti sempre meno sospetti di
malattia perché nei percentili più alti di altezza e peso e con modestissimi sintomi
gastrointestinali. La percentuale di celiaci diagnosticati per esempio a seguito di Dolori
Addominali Ricorrenti, una delle patologie più comuni in età pediatrica è risultata pari al
16%, quella degli anemici con resistenza al trattamento marziale intorno all'8%.
Curiosamente si è riscontrata nel tempo anche una tendenza alla riduzione di incidenza di
dermatite erpetiforme che pure è considerata la manifestazione cutanea di celiachia.
Proponiamo che l’utilizzo della scheda rimanga attivo e che la sua diffusione venga estesa a
tutti i pediatri di base di Torino e Provincia e ci offriamo di effettuare una verifica costante
della medesima scheda, basata sui dati in letteratura e sull’esperienza del nostro
"osservatorio".
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Alberto Bardelli Filone tematico A2
Il ruolo dei cancerogeni ambientali nell'insorgenza di instabilità
genomica dei tumori
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Oncologiche - I.R.C.C. di Candiolo
OBIETTIVI
La popolazione piemontese è esposta ad una serie di cancerogeni presenti negli ambienti
lavorativi, nella dieta, oppure associati a specifici stili di vita (tabagismo, alcolismo etc).
L’interazione con queste sostanze è associata all’insorgenza e alla progressione delle
patologie neoplastiche. Diverse ricerche sperimentali ed epidemiologiche suggeriscono che
tra i più importanti fattori di rischio per i tumori vi sono sostanze capaci di interagire con il
DNA. Come risultato si ritiene che gli individui esposti possano sviluppare alcune forme di
instabilità genetica fra cui l’instabilità cromosomica (CIN) e quella dei microsatelliti (MIN)
che favoriscono lo sviluppo di neoplasie. Questo progetto si propone di chiarire attraverso
quali meccanismi molecolari l’esposizione ai cancerogeni ambientali causa l’insorgenza di
instabilità genetica nei tumori umani.
MATERIALI E METODI
In linea con gli obiettivi del progetto abbiamo creato un database di cancerogeni ambientali
rilevanti da un punto di vista epidemiologico. Abbiamo quindi deciso di concentrare la nostra
attenzione sulle ammine eterocicliche e i nitrosocomposti che sono fra i più rappresentativi
per quello che riguarda l’esposizione della popolazione piemontese. Abbiamo analizzato una
serie di linee cellulari corrispondenti a vari tessuti umani fra cui colon e vescica come modelli
sperimentali per lo studio della relazione fra esposizione ai cancerogeni e insorgenza di
instabilità genetica. Si è quindi verificato che le linee cellulari fossero geneticamente stabili e
adatte all’analisi sperimentale proposta. Da un lato abbiamo valutato il livello di aneuploidia
dei diversi cloni utilizzando tecniche citogenetiche classiche in modo da escludere la presenza
di instabilità di tipo CIN. Dall’altro i livelli di instabilita nucleotidica (MIN) sono stati
misurati utilizzando un sequenziatore automatico per valutare la sequenza di alcuni regioni
del genoma che sono soggette a rimodellamento (microsatelliti). Queste indagini hanno
dimostrato che le linee cellulari prescelte erano adatte allo studio avendo un corredo
cromosomico diploide e assenza di instabilità di tipo microsatellitare.
Le linee cellulari sono state esposte a differenti dosaggi della forma attiva dei cancerogeni in
modo da identificare i corrispondenti effetti biologici. Si sono quindi stabilite le
concentrazioni in grado di determinare un danno genetico ed il corrispondente effetto
citotossico.
Le linee cellulari sono state ripetutamente trattate con i cancerogeni in modo da generare cloni
resistenti, utilizzando una strategia sperimentale da noi precedentemente messa a punto. In
particolare abbiamo utilizzato fra gli altri composti 4-aminobiphenyl (4-ABP) e N-Methyl-N'-
Nitro-N-Nitrosoguanidine (MNNG).
Questi approcci ci hanno consentito di ottenere una serie di linee cellulari nelle quali
l’esposizione ai carcinogeni ha indotto una specifica resistenza in modo analogo a quanto
accade a seguito dell’interazione con i cancerogeni ambientali.
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Infine le cellule trattate con i cancerogeni sono state sottoposte ad analisi molecolare in modo
da valutare se l’esposizione a specifiche sostanze chimiche fosse correlata con l’insorgenza di
diversi meccanismi di instabilità genetica, che sono alla base della progressione delle
neoplasie. A questo scopo abbiamo verificato sia la presenza di instabilità cromosomica (tipo
CIN) sia quella di microsatelliti (tipo MIN).
RISULTATI
I risultati ottenuti sono stati estremamente interessanti. Abbiamo infatti scoperto che
l’esposizione al carcinogeno 4-aminobiphenyl (4-ABP) determina l’insorgenza d’instabilità di
tipo cromosomico ma non quella di tipo microsatellitare. Al contrario l’esposizione a N-
Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine (MNNG) determina l’insorgenza di instabilità dei
microsatelliti ma non quella di tipo cromosomico.
Questi risultati sono di particolare rilevanza in quanto stabiliscono un legame di causa-effetto
fra esposizione a cancerogeni ambientali e sviluppo di instabilità genetica. I modelli cellulari
generati rappresentano un’importante tappa per comprendere le cause molecolari del ruolo dei
carcinogeni ambientali nello sviluppo delle neoplasie. Potrebbero inoltre consentire lo
sviluppo di nuovi metodi di screening molecolare dei osggetti esposti
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Giuseppina Barrera Filone tematico A4
Carcinoma del colon: regolazione della crescita da parte di prodotti della
perossidazione lipidica e di ligandi dei PPAR
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale – Sezione di Patologia Generale
I risultati ottenuti durante il biennio 2003-2005 hanno dimostrato l’efficacia dei ligandi dei
PPAR gamma (15d-PGJ2 e rosiglitazone) da soli o in associazione con il 4-idrossinonenale,
uno dei principali prodotti della perossidazione lipidica, nel modulare il differenziamento,
l’apoptosi e l’espressione di alcuni geni correlabili a questi processi, nelle cellule di
carcinoma del colon umane CaCo-2. Il lavoro sperimentale è stato condotto esaminando,
durante il primo anno di finanziamento, l’efficacia dei ligandi dei PPAR nell’indurre i
suddetti fenomeni a livello fenotipico, mentre nel secondo anno è stata esaminata
l’espressione genica.
AZIONE DEI LIGNADI DEI PPARγ SU DIFFERENZIAMENTO E APOPTOSI
NELLE CELLULE CaCO-2
Proliferazione delle cellule CaCo-2 trattate con i ligandi dei PPAR γ. La proliferazione
cellulare è stata valutata esponendo le cellule a differenti concentrazioni di due ligandi dei
PPARγ, 15d-PGJ2 e rosiglitazone.
I risultati ottenuti dimostrano che entrambi i composti sono in grado di inibire la crescita
cellulare in maniera dose dipendente. La 15d-PG J2 sembra più attiva del rosiglitazone. Infatti
i rispettivi valori di IC50 a 96 ore erano di 34 microM per la 15d-PG J2 e di 189 microM per
il rosiglitazone.
Citotossicità acuta dei ligandi dei PPAR γ. Per escludere che la risposta anti-proliferativa
potesse essere dovuta a citotossicità acuta è stato effettuato un test specifico in cui le cellule
sono state incubate per un tempo breve (due ore) con diverse concentrazioni dei due ligandi e
con fenolo e cloruro di benzalconio, utilizzati come controlli positivi. L'analisi dei risultati
ottenuti da questo esperimento, porta ad escludere un effetto citotossico della 15d-PG J2 e del
rosiglitazone.
Differenziamento delle cellule CaCo-2. Il differenziamento cellulare delle CaCo-2 è stato
valutato mediante il numero di Domes dopo il trattamento con rosiglitazone e 15d-PGJ2 in un
range di dosi variabili da 50 a 200 µM per il rosiglitazone e da 10 a 100µM per la
prostaglandina. Il rosiglitazone ha fatto registrare un significativo aumento del
differenziamento alle concentrazioni di 50 e 80 µM dopo 48 ore dal trattamento, quasi
paragonabile a quello osservato dopo trattamento con butirrato di sodio, noto agente
differenziante per questa linea cellulare ed utilizzato quale controllo positivo. La 15d-PGJ2
invece non induceva un significativo aumento del differenziamento delle cellule CaCo-2
Apoptosi
Si è anche voluto verificare la possibilità che la riduzione della proliferazione cellulare
potesse esser dovuta a morte per apoptosi. Abbiamo allora esaminato la fluorescenza delle
cellule trattate secondo lo stesso schema utilizzato per misurare il differenziamento,
utilizzando il test del TUNEL. Il trattamento con 15d-PGJ2 alle concentrazioni di 12.5 e 25
µM e con rosiglitazone alle concentrazioni di 80-100 µM inducevano un significativo
aumento delle cellule apoptotiche 24 ore dopo il trattamento (15-20% di cellule in apoptosi).
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Trattamento con 4-idrossinonenale. Durante il secondo anno di esecuzione del progetto è
stata dapprima esaminata l’interazione tra 15d-PGJ2 (10 µM) e rosiglitazone (80 µM) con 4idrossinonenale
(HNE), uno dei più attivi prodotti della perossidazione lipidica,
somministrato alle colture cellulari mediante il protocollo dei trattamenti ripetuti alla dose di 1
µM. Le concentrazioni di rosiglitazone (80 µM) e di 15d-PG J2 (10 µM), utilizzate in
associazione al trattamento con HNE, sono state scelte sulla base degli esperimenti in cui era
valutata la proliferazione cellulare. Tali concentrazioni erano capaci di inibire per circa il 50%
la proliferazione delle cellule CaCo-2. L’HNE da sola inibisce la proliferazione cellulare di
circa il 70% dopo 3 giorni, non induce differenziamento ma induce apoptosi nel 13-20% delle
cellule CaCo-2, 24 ore dopo l’inizio del trattamento. Il trattamento simultaneo con HNE e
rosiglitazone 80 µM oppure con HNE e 15d-PG J2 10 µM non evidenzia alcun effetto
sinergico tra le sostanze sui diversi parametri considerati.
AZIONE DEI LIGNADI DEI PPARγ SULL’ESPRESSIONE GENICA NELLE
CELLULE CaCo-2.
Espressione dell’oncogene c-myc. L’oncogene c-myc è notoriamente coinvolto nel controllo
della proliferazione cellulare del differenziamento e dell’apoptosi. Per questo motivo abbiamo
voluto verificare la sua espressione in seguito al trattamento con diverse concentrazioni di
rosiglitazone, 15d-PG J2 e HNE. Il rosiglitazone inibisce l’espressione della proteina MYC a
partire dalla concentrazione di 25 µM a 48-72 ore dalla sua aggiunta, tale inibizione è più
precoce con dosi più alte. La 15d-PG J2 provoca un transitorio aumento di espressione di cmyc
seguito da una costante inibizione a partire dalle 48 ore dalla sua aggiunta.
Anche HNE ha una duplice azione sull’espressione della proteina MYC: dapprima, a 8 ore si
assiste ad un aumento della proteina MYC seguito da una drastica riduzione a partire dalle 24
ore. Quando si somministrato insieme il rosiglitazone, alla concentrazione di 80 µM e l’HNE
il quadro di inibizione è sovrapponibile a quello ottenuto dopo trattamento con la sola HNE.
Allo stesso modo trattando le cellule con 15d-PG J2 e HNE, l’azione bifasica sull’espressione
di c-myc è paragonabile a quella ottenuta con la sola HNE.
Espressione delle cicline D1 e D2. La ciclina D1 è inibita dalla sola HNE 48 ore dopo la sua
aggiunta, mentre l’espressione della ciclina D2 non è modificata nelle cellule trattate con
l’aldeide. Il trattamento con diverse dosi di rosiglitazone così come con diverse dosi di 15d-
PG J2 non modificano l’espressione di ciclina D1 e D2.
Espressione di p21. L’espressione dell’inibitore del ciclo cellulare p21 è aumentata dopo
trattamento con rosiglitazone e 15d-PG J2 a partire dalle 24 ore. Anche l’HNE induce
l’espressione dell’inibitore p21, in analogia a quanto già osservato in altri modelli cellulari.
Tuttavia il trattamento contemporaneo con HNE e 15d-PG J2 o con HNE e rosiglitazone non
ha evidenziato un sinergismo o un effetto additivo sull’incremento di espressione di p21, né
un’anticipazione nel tempo della comparsa dell’aumento.
Espressione di BAX L’espressione del gene proapoptotico bax è presente nelle cellule CaCo-
2 24 ore dopo il trattamento con 15d-PG J2, rosiglitazone e HNE. Non si osserva effetto
cumulativo o sinergico quando il trattamento con HNE è eseguito in associazione con uno dei
due ligandi.
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Ettore Bartoli Filone tematico A2
Fattori predittivi di resistenza insulinica e patologia degenerativa nel
NIDDM: influenza di età e climaterio
Università del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”
Dipartimento di Scienze Mediche
Gli studi eseguiti con la metodica dello “split hydronephrotic kidney” hanno dimostrato
l’importanza delle proteine Rho, componenti della infiammazione e rilevanti nei fenomeni di
rigetto, nel determinare e deviare in senso patologico le risposte vascolari del glomerulo
renale (1,2).
Gli studi eseguiti mediante isolamento e cultura dei glomeruli in vitro sono terminati.
Quelli relativi allo sviluppo del modello sperimentale sono stati oggetto di una tesi di
Laurea (3), e quelli vertenti sull’azione della Ciclosporina A su Endoteline e Angiotensine
sono stati ultimati e la relativa pubblicazione è stata inviata per stampa (4).
Dall’impegno complessivo derivato dallo studio dei fattori infiammatori del mesangio
glomerulare e loro controllo con Ciclosporina A ed altri farmaci, nonché dallo studio delle
interconnessioni fra meccanismi infiammatori del mesangio e patologia renale del Diabete
Mellito, si sono sviluppate altre pubblicazioni, alcune delle quali in stampa (5-8).
Le pubblicazioni vertenti direttamente sull’influenza del climaterio e dell’età avanzata sulla
resistenza insulinica sono state inviate a riviste scientifiche dalle quali verranno sottoposti
all’iter per la pubblicazione a stampa (9, 10). Questi studi hanno dimostrato che la
Ciclosporina esercita il proprio effetto tossico liberando endotelina dal glomerulo e che
l'endotelina, a sua volta, recluta l'attivazione delle angiotensine, determinando vasocostrizione
ed insufficienza renale.
I nostri studi hanno inoltre dimostrato come diabete e intolleranza al glucosio compaiano
repentinamente in corrispondenza del periodo climaterico nella donna, dove vengono
diagnosticati mediante i test di ISIgly e di HOMA-IR. L’incidenza delle anomalie in questo
periodo è significativamente maggiore nelle femmine rispetto ai maschi e rispetto a quella di
tutte le altre età della vita.
Perciò concludiamo che lo screening per diabete, sindrome metabolica, intolleranza al
glucosio dovrebbe essere eseguito, nella donna, tra i 45 ed i 55 anni di età per ottenere una
efficace prevenzione
PUBBLICAZIONI
1. Cavarape A, Endlich N, Assaloni R, Bartoli E, Steinhausen M, Parekh N, Endlich K. Rho-
Kinase inhibition blunts renal vasoconstriction induced by distinct signaling pathways in
vivo. J. Am. Soc. Nephrol., 13; 37-45, 2003.
2. Cavarape A, Bauer J, Bartoli E, Endlich K, Parekh N. Effects of Ang II AVP and TxA2
in renal vascular bed: role of rho-kinase. Nephrol Dial Trasplant, 18, 1764-1769, 2003.
3. Colli E. Nuovo modello di glomerulonefrite acuta sperimentale ex vivo nel ratto:
valutazione dell’adesione dei polimorfonucleati nello sviluppo del danno glomerulare.
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Tesi di Laurea, Sessione autunnale 2003, Università del Piemonte Orientale “Amedeo
Avogadro”, Facoltà di medicina e Chirurgia.
4. Sainaghi PP, Castello L, Bergamasco L, Letizia G, Bartoli E. Pathways of Cyclosporine A
effects in pig glomeruli isolated in vitro. Inviato per pubblicazione
5. Carnevale Schianca GP, Rossi A., Sainaghi PP, Maduli E, Bartoli E. The significance of
impaired fasting glucose versus impaired glucose tolerance: importance of insulin
secretion and resistance. Diabetes Care, 26,1333-1337, 2003.
6. Sainaghi PP, Castello L, Maduli E, Rossi A, Carnevale Schianca GP, Bartoli E. Il valore
predittivo della glicemia a digiuno nello screening dell’intolleranza glicidica e del rischio
cardiovascolare associato. Ann Ital Med Int, 17, suppl 2, 90S (N° 227), 2002.
7. Fra GP, Avanzi GC, Bartoli E. Remission of refractory lupus nephritis with a protocol
including rituximab. Lupus 12, 783-787, 2003.
8. Bartoli E, Fra GP. Micofenolato o ciclofosfamide nella nefrite lupica. Att Congresso
Interannuale della Società Italiana di Allergologia e Immunologia Clinica, Firenze, 22-25
Settembre 2004, pp 193.
9. Carnevale Schianca P,, Rapetti L, Castello L, Bartoli E. Insulin sensitivity: gender
difference in subjects with normal glucose tolerance. Inviato per pubblicazione
10. Carnevale Schianca P, Sainaghi PP, Bartoli E. The different significance of indeces of
insulin resistance. Inviato per pubblicazione
35

Simona Bastonero Filone tematico C1
Un nuovo marker per lo screening prenatale delle anomalie
cromosomiche: l’osso nasale fetale
A.S.O. O.I.R.M. S. Anna
Centro di Ecografia e Diagnosi Prenatale
Lo screening delle anomalie cromosomiche, in particolare della sindrome di Down, si è basato
negli ultimi decenni, oltre che sull’età materna, sullo studio di diversi parametri biochimici
nel secondo trimestre, uniti a parametri ecografici biometrici specifici.
L’obiettivo dei diversi programmi di screening è quello di ridurre al minimo possibile i
cosiddetti falsi positivi, gravide a cui offrire la diagnosi prenatale invasiva, e incrementare la
detection rate, il numero assoluto di feti affetti individuati con screening e diagnosi prenatale
invasiva.
Il metodo più diffuso anche in Italia è oggi il «Triplo test» (o tri-test), che è nato
dell’associazione della sindrome di Down a bassi valori di alfa-fetoproteina e di estriolo non
coniugato e a alti valori di gonadotropina corionica nel siero materno. Questo metodo ci
consente di calcolare anche il rischio stimato di difetti del tubo neurale, che comprende una
varietà di malformazioni che vanno dall’anencefalia alla spina bifida e che sono correlati con
un elevato valore di AFP nel siero materno. Nell’esperienza del gruppo torinese dell’Ospedale
Sant’Anna (relativa a circa 60.000 test effettuati) il tri-test, eseguito a 16 settimane di età
gestazionale, ha una percentuale di falsi positivi (false positive rate) dell’8-9 %.
E’ argomento di discussione quale sia la migliore politica di screening da attuare, come prima
scelta, o quale nuova scelta eventualmente da modificare rispetto a quanto finora realizzato, in
funzione delle diverse risorse tecnologiche, umane, economiche, delle diverse situazioni
sociali, in funzione delle diverse valutazioni bioetiche, tenendo presente che tutte le
metodiche invasive comportano una percentuale di perdite fetali, dell’ordine dello 0,5 – 1,5%.
Il nostro Centro ha partecipato alla fase di ricerca clinica di un nuovo metodo di screening, il
Test Integrato che consente di ottenere una alta detection rate (92%) con la riduzione del
numero di falsi positivi (3,4%) e quindi di donne che hanno effettuato la diagnosi invasiva. I
dati sperimentali, ottenuti in gran parte su una popolazione a rischio, segnalano che un nuovo
marcatore ecografico, l’osso nasale, potrebbe diminuire ulteriormente i falsi positivi con un
mantenimento/miglioramento della sensibilità.
Allo scopo di valutare l’associazione tra assenza dell’osso nasale all’esame ecografico e
rischio di feto affetto da trisomia 21 sono state reclutate tutte le gravide che, presso il nostro
Centro, hanno effettuato il test integrato e/o il prelievo di villi coriali a 11-14 settimane e che
hanno effettuato il tri-test e/o l’amniocentesi a 15-19 settimane di età gestazionale.
VALUTAZIONE DELL’OSSO NASALE A 11-14 SETTIMANE DI GRAVIDANZA IN
UNA POPOLAZIONE NON SELEZIONATA
Obiettivo: valutare l’associazione tra assenza dell’osso nasale all’esame ecografico e rischio
di feto affetto da trisomia 21 a 11 – 14 settimane di gravidanza.
Materiali e metodi: la valutazione dell’ossificazione dell’osso nasale è stata effettuata su
1906 feti, afferiti al Centro di Ecografia e Diagnosi Prenatale dell'Ospedale S. Anna per
effettuare lo screening ecografico e biochimico (test integrato) del primo trimestre oppure la
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diagnosi prenatale invasiva. Per la valutazione del profilo fetale e della presenza assenza
dell’osso nasale è stato seguito un protocollo standardizzato.
Risultati: una scansione corretta dell’osso nasale è stata ottenuta in 1752 feti su 1906
(91.9%), in 154 casi (8.1%) il profilo fetale non è stato visualizzato correttamente. Tra i 1752
feti nei quali è stato possibile ottenere una scansione adeguata, abbiamo registrato 36 casi di
osso nasale fetale assente o ipoplastico (2.05%). Il cariotipo era normale in 1733 feti; in 19
casi abbiamo registrato un cariotipo patologico. L’osso nasale era presente in 1709 feti
(98.6%) sui 1733 con cariotipo normale e assente in 24 casi (1.4%). Nei feti con aneuploidia
l’osso nasale era ipoplastico o assente in 12 su 19 casi (63%); tra i dieci feti affetti da
sindrome di Down l’osso nasale era ipoplastico o assente in 8 casi.
Conclusioni: la nostra esperienza conferma l’efficacia della valutazione della lunghezza
dell’osso nasale per migliorare lo screening della trisomia 21, anche in una popolazione non
selezionata.
VALUTAZIONE DELL’OSSO NASALE A 15 – 19 SETTIMANE DI GRAVIDANZA
IN UNA POPOLAZIONE A RISCHIO
Obiettivo: misurare la lunghezza dell’osso nasale all’esame ecografico e valutarne
l’associazione con il rischio di feto affetto da trisomia 21 a 15 – 19 settimane di gravidanza.
Materiali e metodi: è stata effettuata la misurazione dell’osso nasale su 198 gravidanze
afferite al Centro di Ecografia e Diagnosi Prenatale dell'Ospedale S. Anna per effettuare
l’amniocentesi. Abbiamo inoltre valutato il rapporto tra la lunghezza dell’osso nasale in
relazione con il valore dal diametro biparietale. Per la valutazione del profilo fetale e della
presenza assenza dell’osso nasale è stato seguito un protocollo standardizzato.
Risultati: il cariotipo era normale in 190 feti e in 8 casi patologico. L’osso nasale era presente
in 189 feti (99.5%). L’osso nasale è risultato assente in un solo caso con cariotipo normale
(5.3%) e in 2 casi dei 5 feti affetti da sindrome di Down (60%). L’osso nasale è risultato
ipoplastico in 3 feti con cariotipo normale (1.57%) e in un caso dei 5 feti affetti da trisomia
21.
Conclusioni: è risultato che 166 feti su 190 sani (87.3%) presentavano rapporto BPD/NBL ≤
a 9, mentre solo 24 (12.7%) presentavano rapporto BPD/NBL > di 9. Tra gli 8 feti con
cariotipo patologico 6 presentavano rapporto BPD/NBL ≤ a 9 e 2 presentavano rapporto
BPD/NBL > di 9; di questi 2 feti uno era portatore di una trisomia 21 e l’altro di trisomia 18.
La nostra esperienza conferma l’efficacia della valutazione dell’osso nasale per migliorare lo
screening della trisomia 21 anche nel secondo trimestre. In conclusione gli studi condotti nel
nostro centro in accordo con i dati presenti in letteratura, dimostrano che l’assenza/ipoplasia
dell’osso nasale correla significativamente con un aumentato rischio di avere un feto affetto
da trisomia 21 e se i nostri studi e quelli condotti negli altri centri dovessero essere validati da
studi successivi su campioni più numerosi, la valutazione della presenza/assenza dell’osso
nasale potrebbe essere introdotta in un nuovo protocollo di screening sia nel primo sia nel
secondo trimestre di gravidanza. In tutti i feti è stata visualizzata una scansione del profilo
fetale con identificazione dell’osso ansale e sua misurazione.
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Mario Bazzan Filone tematico C1
Razionalizzazione di diagnosi e cura delle sindromi mieloproliferative Ph-
mediante creazione di un sito web dedicato
Ospedale Evangelico Valdese
SOC di Ematologia e Malattie Trombotiche
CONTESTO E RAZIONALE
Si è costituito circa 3 anni fa in modo informale il GRUPPO PIEMONTESE PER LO
STUDIO E LA CURA DELLE MALATTIE MIELOPROLIFERATIVE Ph- (GPMMPh-)
formato da medici specialisti provenienti da numerosi Centri Piemontesi. Sin dalle prime
riunioni si è evidenziata l'esigenza di creare un archivio comune per la raccolta dei dati clinici
e di laboratorio dei pazienti affetti da TROMBOCITEMIA ESSENZIALE, nell'ambito di un
sito WEB dedicato a tale patologia. In seguito a diversi incontri fra specialisti è stato definito
un progetto che individuasse gli elementi da raccogliere nel database elettronico e le
caratteristiche del sito WEB.
MATERIALI E METODI
1. E’ stato creato e validato nel corso del 2004 un archivio elettronico con campi contenenti
cenni anamnestici, comorbidità, fattori di rischio trombofilici, caratteristiche cliniche,
istologiche e laboratoristiche alla diagnosi, complicanze correlate, terapia e dati circa il
follow-up del paziente. Un Medico volontario ha proceduto all'inserimento dei dati di
alcuni pazienti-test grazie al materiale messo a disposizione da alcuni Reparti di
Ematologia di Torino (Ospedale Valdese e Ospedale S. Luigi). Contemporaneamente è
stato acquistato un dominio per la registrazione di un sito web ed si è proceduto a creare
un'infrastruttura caratterizzata da pagine grafiche e di animazione Macromedia Flash,
piattaforma di accoglienza del data-base, interfaccia grafica per l'inserimento e
l'aggiornamento dei dati clinici. Si è proceduto inoltre allo sviluppo di un software per la
gestione del data-base, degli accessi riservati degli utenti, di un generatore di
password/username d'accesso, per moduli di registrazione riservati e sistemi di secure
servering.
2. E’ stato creato il sito web (www.gruppotepiemonte.com), inizialmente con caratteristiche
di consultazione, contenente dati di letteratura consultabili, previa registrazione, da
pazienti e medici. Nell’ambito dello stesso sito è in fase di attuazione un Forum che
raccolga le esperienze e le esigenze degli utenti.
3. E’ stata creata un'area riservata ai medici contenente il data base per la raccolta dei dati
clinici (criptato sui dati sensibili secondo le leggi sulla tutela della privacy). E’ stato
individuato un borsista che ha messo a punto il sistema informatico precedentemente
progettato, adeguandolo alle esigenze del compilatore ed eliminando le difficoltà tecniche
insorte. Sono stati inseriti ad oggi i dati clinici di circa 230 pazienti (con diagnosi di
Trombocitemia Essenziale a partire dal 2000) sul database online.
I pazienti provengono da: Unità di Ematologia e Trombosi Ospedale Cellini, Divisione
Universitaria di Medicina Interna Ospedale S. Luigi, Divisione Universitaria e
Ospedaliera di Ematologia Ospedale S, Giovanni Battista, Divisione Universitaria di
38

Ematologia Osp Maggiore di Novara, Divisione di Ematologia Ospedale di Alessandria,
Unità di Ematologia Ospedale Mauriziano, Divisione di Medicina Interna OIRM-S.Anna.
CONCLUSIONI
La creazione di questo sito WEB dedicato alla Trombocitemia Essenziale e la messa a punto
del data base online consentiranno ai vari Specialisti Ematologi Piemontesi di proseguire
l'inserimento delle nuove diagnosi e di aggiornare quelle già inserite. Inoltre i dati già a
disposizione online permetteranno di sviluppare progetti epidemiologici, clinici e di follow-up
nell’ambito di tale patologia.
39

Silvio Bellino Filone tematico A5
Il disturbo borderline di personalità: caratterizzazione della comorbilità
ed esito del trattamento a lungo termine.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Neuroscienze
Nell’ambito del nostro progetto di ricerca, abbiamo approfondito la caratterizzazione della
comorbilità del disturbo borderline di personalità (DBP). La frequente comorbilità tra DBP e
disturbo depressivo maggiore (DDM) ha infatti aperto un acceso dibattito tra i ricercatori,
portando a due posizioni antitetiche: da un lato, l’ipotesi che i due disturbi siano
manifestazioni di un comune meccanismo fisiopatologico; dall’altro, l’ipotesi che essi non
costituiscano una associazione con caratteristiche peculiari, ma possano semplicemente
coesistere. Abbiamo quindi condotto uno studio di confronto delle caratteristiche cliniche del
DDM fra due sottogruppi di pazienti depressi con DBP o con altri disturbi di personalità.
I soggetti sono stati valutati con un’intervista semistrutturata per le caratteristiche cliniche,
l’Intervista Clinica Semistrutturata per i Disturbi Psichici Asse I/II, CGI, scale di Hamilton
per depressione e ansia (HAM-D, HAM-A), scala di Zung per la depressione autovalutata,
SOFAS e DIS Sheehan per il funzionamento socio-relazionale.
L’analisi statistica dei dati raccolti su 119 soggetti indica che i pazienti borderline depressi, in
confronto a pazienti depressi con altri disturbi di personalità, presentano caratteristiche
cliniche peculiari:
un esordio più precoce del DDM;
una maggiore gravità dei sintomi depressivi autovalutati;
una maggior frequenza di comportamenti autolesionistici e tentativi suicidiari;
un decorso clinico più sfavorevole, con maggior compromissione del funzionamento
socio-relazionale;
una maggiore frequenza di disturbi dell’umore fra i parenti di I° grado.
Sulla base dei risultati sopra riportati, il nostro studio suggerisce quindi che la frequente
associazione tra DBP e depressione maggiore è caratterizzata da connotazioni cliniche
distintive e, in accordo con i recenti sviluppi della letteratura, permette di sostenere l’ipotesi
che i due disturbi siano manifestazioni differenti di un comune meccanismo fisiopatologico
sottostante e possano essere inquadrati in una comune entità psicopatologica.
L'individuazione di questa peculiare associazione clinica comporta rilevanti ripercussioni
sulla gestione del paziente borderline ed evidenzia l'importanza di delineare interventi
terapeutici mirati e di valutarne l'efficacia.
Abbiamo quindi sviluppato il nostro programma di ricerca procedendo in uno studio pilota in
aperto su efficacia e tollerabilità nel DBP di un nuovo stabilizzatore dell’umore,
l’oxcarbazepina, cheto-derivato della carbamazepina con minor effetto di induzione
enzimatica epatica, somministrato alla dose di 800-1300 mg/die per 3 mesi. I soggetti sono
stati valutati al baseline, a 4 e 12 settimane attraverso CGI e BPRS per la psicopatologia
globale, HAM-D e HAM-A, il questionario TCI per il temperamento e il carattere, l’AQ per
l’aggressività, il BPD-Severity Index, l’IIP-64 per i problemi interpersonali e SAT-P per la
qualità della vita.
A 3 mesi è stata condotta un’analisi di regressione per individuare i fattori predittivi di
risposta. Dall’analisi dei dati ottenuti sul nostro campione di 17 pazienti emerge l’efficacia del
40

farmaco su: psicopatologia globale, sintomi d’ansia e alcune manifestazioni nucleari del DBP,
quali le difficoltà interpersonali, l’impulsività, l’instabilità affettiva e gli scoppi di rabbia.
L’efficacia su impulsività/aggressività conferma le indicazioni delle linee guida dell’APA per
altri stabilizzatori dell’umore. Per quanto riguarda invece la tollerabilità, non è stato registrato
nessun caso di iponatremia clinicamente significativa (cut-off: Na+ sierico ≤ 125 mmol/l), nè
casi di drop-out per effetti avversi, mentre in una minoranza di pazienti sono stati riscontrati
effetti collaterali minori, quali sonnolenza, vertigini, nausea e cefalea.
I risultati del nostro studio suggeriscono pertanto che l’oxcarbazepina può costituire un
farmaco efficace e sicuro nel trattamento dei pazienti con DBP. E’ proseguito il reclutamento
dei pazienti borderline per lo studio di confronto fra due modalità di trattamento:
farmacoterapia con stabilizzatori dell’umore (acido valproico, 800-1300 mg/die, come
indicato dalle linee guida APA) versus terapia combinata con acido valproico e psicoterapia
interpersonale.
Lo studio è stato condotto per 6 mesi e i pazienti sono stati valutati al baseline, a 12 e 24
settimane con: CGI, HAM-D, HAM-A, BPDSI, il SAT-P e l’IIP-64. L’analisi statistica sul
campione di 35 soggetti prospetta i vantaggi della terapia combinata, soprattutto in termini di
miglioramento degli aspetti psicopatologici nucleari del disturbo, in particolare l’instabilità
delle relazioni interpersonali. I pazienti che hanno completato la fase iniziale dei due studi
(con oxcarbazepina e di confronto acido valproico e terapia combinata) e sono stati
considerati responder sono osservati in uno studio di follow-up di 12 mesi, in cui viene
proseguito il trattamento in corso. L’assessment viene ripetuto con le scale sopraelencate ad
intervalli regolari di 3 mesi. I dati sono attualmente in fase di raccolta e saranno sottoposti ad
analisi statistica, al fine di stimare l’ulteriore progressione della risposta a lungo termine.
Negli ultimi mesi dell’attività di ricerca è stato intrapreso uno studio di confronto fra terapia
combinata con antidepressivi Inibitori Selettivi del Reuptake della Serotonina (SSRI) e
psicoterapia interpersonale a frequenza settimanale e SSRI in monoterapia in un gruppo di
pazienti con DBP e episodio depressivo maggiore lieve-moderato. I pazienti sono stati trattati
per 6 mesi e valutati a 12 e 24 settimane con CGI, BPRS, HAM-A/D, SAT-P e IIP-64. La
valutazione è stata ripetuta dopo la fine del trattamento, a 6 e 12 mesi di follow-up. I risultati
preliminari dello studio indicano la superiorità della terapia combinata in termini di
miglioramento della depressione e di cambiamento di alcuni fattori relativi alla qualità di vita
e alle relazioni interpersonali. Il completamento di questo studio ha richiesto l’attribuzione di
una consulenza a uno psicologo clinico.
I risultati descritti sono stati pubblicati o sono in fase di pubblicazione su riviste scientifiche
nazionali e internazionali e sono stati presentati in recenti congressi di psichiatria. Inoltre, gli
strumenti di valutazione impiegati in queste indagini sono attualmente impiegati di routine
nella valutazione clinica e terapeutica dei pazienti borderline che afferiscono alla SCDU di
Psichiatria dell’Università di Torino e sono a disposizione dei centri clinici della Regione
Piemonte che si occupano di questa patologia, come percorso di inquadramento diagnostico e
di misurazione dell’outcome ad alto livello di specializzazione.
41

Giorgio Bellomo Filone tematico A4
Antiaterogenicità delle HDL ed abitudini alimentari: studio negli studenti
dell’Università del Piemonte Orientale
Università del Piemonte Orientale – Novara
Dipartimento di Scienze Mediche
OBIETTIVI
Fra gli obiettivi della ricerca proposta vi era la caratterizzazione della attività della
paraoxonasi e della sua attività nei confronti dell’ossidazione delle lipoproteine in un gruppo
estremamente omogeneo di controllo (studenti universitari dell’università del Piemonte
Orientale già precedentemente caratterizzati per quanto concerne i fattori di rischio
cardiovascolare, le abitudini di vita e le abitudini alimentari).
METODI E RISULTATI
La ricerca è stata completata mediante caratterizzazione del polimorfismo dei geni della
paraoxonasi di tipo I (PON-I) e della paraoxonasi di tipo II (PON-2). Sono state anzitutto
implementate le metodiche per la caratterizzazione di tali polimorfismi mediante Real-Time-
PCR. Per quanto riguarda PON-I sono stati presi in considerazione la sostituzione
metionina/leucina in corrispondenza del codone 55 e la sostituzione glutamina/arginina in
posizione 192. Per quanto riguarda PON-2 è stata presa in considerazione la sostituzione
cisteina/serina in corrispondenza del codone 311. Sono stati selezionati questi polimorfismi in
rapporto alle segnalazioni della letteratura del maggior rischio aterogeno nei portatori di tali
mutazioni.
Per quanto concerne PON-I/192 è stata riscontrata una prevalenza del 43.75 % di wild-type,
del 42,18 % di eterozigoti e del 14,07 % di omozigoti mutati. Per quanto riguarda PON-I/55 è
stata riscontrata una prevalenza del 56, 22 % di omozigoti wild-type, del 10,93 % di
eterozigoti e del 32,85 di omozigoti mutati. Per quanto riguarda PON-II/311 è stata riscontrata
una prevalenza del 62,50 % di omozigoti wild-type, del 29,68 % di eterozigoti e del 7,82 % di
omozigoti mutati. Non è stata riscontrata alcuna correlazione fra i polimorfismi di PON
indagati ed i parametri presi in considerazione nella prima parte dello studio condotto, fra cui
il quadro lipidico, l’ossidabilità delle lipoproteine a bassa densità (LDL), l’ossidabilità delle
lipoproteine ad alta densità (HDL), l’inibizione della ossidazione delle LDL ad opera delle
HDL, la riduzione dei lipoperossidi formati ad lipoidrossidi, il contenuto in antiossidanti del
plasma e delle singole classi di lipoproteine.
Non è stato possibile evidenziare, come d’altro canto era da aspettarsi, alcuna correlazione fra
le abitudini alimentari ed il polimorfismo genico per PON.
Sulla scorta di tali risultati sembra possibile concludere che il polimorfismo genico della
paraoxonasi, di per sé non sia da mettere in correlazione diretta con la maggiore o minore
suscettibilità delle lipoproteine all’ossidazione, quanto, invece, ad altri steps del
multifattoriale processo aterosclerotico. I risultati ottenuti non sembrano peraltro precludere
altre possibili interpretazioni. In effetti gli studi di metaanalisi non indicano correlazioni
semplici fra polimorfismo di PON (PON-I in particolare) e la presenza di malattia
aterosclerotica coronarica. Al momento attuale sembra che lo status di PON-I (attività e
concentrazione) sia più decisamente correlato con la malattia aterosclerotica.
42

In accordo con i risultati ottenuti nella presente ricerca, un recente studi prospettico ha
dimostrato che l’attività di PON-I piuttosto che il polimorfismo genico sia un fattore di rischio
indipendente per la malattia aterosclerotica coronarica (Mackness M e Mackness B –
Paraoxonase I and atherosclerosis: is the gene or the protein more important ? Free
Radic.Biol.Med. 37, 1317-1323, 2004).
Fra i fattori in grado di modificare l’espressione genica della PON-I vi è sicuramente la
presenza di uno status infiammatorio cronico. L’innesco di una reazione di fase acuta è
associata con una riduzione della espressione della PON-I e della sua attività, così come della
diminuzione della produzione di Apoproteina AI e di HDL. Una analisi preliminare condotta
sul campione di soggetti in esame nel corso di questo studio ha dimostrato come esista una
correlazione inversa fra livelli di proteina C reattiva (misurata con metodi ultrasensibili) e
livelli di colesterolo HDL e di apoproteina AI, così pure come con l’attività della paraoxonasi.
Non sono stati, al contrario, riscontrate correlazioni significative fra contenuto in antiossidanti
ed attività della paraoxonasi.
L’evoluzione naturale della ricerca fino ad ora condotta sarà quella di verificare se, in
rapporto al polimorfismo genico di PON-I, i suoi livelli di attività siano condizionati in modo
differente dalla presenza di uno stato infiammatorio. E’ da segnalare, infine, un importante
aspetto metodologico, emerso nel corso della presente ricerca, che potrebbe inficiare gran
parte dei risultati e degli studi fino ad ora pubblicati. Nella valutazione della attività
enzimatica della paraoxonasi viene misurata la capacità di tale enzima nel metabolizzare due
suoi substrati naturali, il paraoxon ed il fenilacetato. Questo tipo di attività, tuttavia, non
appare avere alcuna relazione con l’attività anti-aterogena della paraoxonasi stessa. I risultati
ottenuti nel corso della presente ricerca dimostrano chiaramente (come dettagliato nelle
relazioni precedenti) che l’attività protettiva della paraoxonasi consista nella riduzione dei
lipoperossidi a lipoidrossidi. Questa attività non presenta alcuna correlazione significativa con
l’attività di idrolisi del paraoxon e del fenilacetato. E’ quindi facilmente ipotizzabile che tutti i
risultati ottenuti fino ad ora siano da re-interpretare misurando l'esclusiva attività antiaterogena
della paraoxonasi.
CONCLUSIONI
I risultati ottenuti complessivamente nel corso della presente ricerca hanno permesso di
concludere che:
1. le abitudini alimentari, l’introito di antiossidanti, la concentrazione plasmatica e
lipoproteica degli stessi antiossidanti, la suscettibilità all’ossidazione delle LDL e delle
HDL, l’effetto protettivo delle HDL nei confronti dell’ossidazione delle LDL, la
concentrazione e l’attività della paraoxonasi ed il suo polimorfismo genico siano del tutto
sovrapponibile agli stessi parametri riscontrabili nella popolazione generale.
2. Lo sviluppo di nuovi metodi per lo studio in vitro dei meccanismi di ossidazione delle
lipoproteina ha permesso di evidenziare come, fino ad ora, si sia seguito un approccio
metodologico non corretto per la valutazione dell’attività anti-aterogena delle HDL legata
alla paraoxonasi.
3. Una ulteriore analisi, peraltro in corso, sul materiale raccolto permetterà di trarre
conclusioni molto più affidabili di quelle riportate in letteratura sui fattori in grado di
modificare la concentrazione e l’attività della paraoxonasi e di correlare tale impatto al
polimorfismo genico della PON stessa permettendo di confermare o di smentire il
coinvolgimento genico e biochimico di PON nel processo di ossidazione delle
lipoproteine.
43

Graziella Bellone Filone tematico A2
Espressione di SKI e SNON come indice di rischio di evoluzione
neoplastica nell'esofago di Barrett
Università degli Studi Di Torino
Dipartimento di Fisiopatologia Clinica
CONTESTO E RAZIONALE
L’importanza della diagnosi di esofago di Barrett (EB) ha assunto un significato clinico
considerevole in base all’osservazioni che ogni anno l’1% dei pazienti affetti sviluppa un
carcinoma dell’esofago con un rischio da 30 a 125 volte maggiore rispetto alla popolazione
generale. Il cancro si evolve da una lesione preneoplastica con una sequenza di alterazioni
genetiche che fanno acquisire alle cellule la capacità di proliferare senza stimolo esogeno, di
resistere ai segnali inibitori di crescita e di evitare l’apoptosi che fisiologicamente elimina le
cellule con vasti danni genetici. Il ruolo del TGF-beta nel processo cancerogenetico dei
tumori epiteliali è stato per lungo tempo elusivo. Ora si sa che la via di trasduzione del
segnale innescata dal fattore viene interrotta dalla famiglia di oncoproteine Ski/SnoN.
Presumibilmente la disregolazione di questo evento è uno dei meccanismi alla base di un’
alterata risposta cellulare al messaggio mediato da TGF-beta nelle cellule epiteliali. Rimane
da stabilire quando e come questi segnali oncogenici vengono attivati nel passaggio da stato
precanceroso a tumore conclamato.
OBIETTIVO
Lo scopo dello studio era quello di stabilire se modificazioni quantitative di Ski e SnoN
possano costituire marcatori precoci del potenziale evolutivo neoplastico soprattutto nei
pazienti portatori di EB negli stadi iniziali di complicanza displastica.
METODI
Sono stati sottoposti ad indagine endoscopica 127 pazienti, osservati consecutivamente. Al
reclutamento si è provveduto a multipli prelievi bioptici per la conferma istologica, la
tipizzazione e la valutazione della eventuale presenza di displasia. Le biopsie sono state
effettuate sui quattro quadranti, iniziando longitudinalmente dalla giunzione gastroesofagea e
ogni 2 cm fino al margine superiore della linea Z. Ai pazienti è stata altresì effettuata una pHmetria
della 24 ore per valutare il reflusso acido. L’indagine istologica ha confermato la
presenza di metaplasia intestinale in sede esofagea (EB) in 87 pazienti (69 maschi e 18
femmine, età media 61,6 anni) di tipo I (5/86) di tipo IIA (30/86) di tipo IIB (50/86). Presenza
di displasia a basso grado è stata osservata nel 16,28% dei casi, di displasia indeterminata
nell’8%,14% e di displasia ad alto grado nel 4,65%. Gli altri 40 pazienti, ai quali è stata
invece diagnosticata esofagite di grado variabile da I a III secondo Savary-Miller, sono stati
usati come gruppo di controllo.
RISULTATI
I risultati definitivi del nostro studio si sono dimostrati particolarmente interessanti perché
hanno ribaltato l’ipotesi iniziale attesa, basata sull’asserzione che Ski e SnoN, in qualità di
44

antagonisti del segnale antiproliferativo innescato da TGF-beta, potesse essere iperespresso
nell’esofago di Barrett destinato ad evolvere in senso neoplastico.
L’analisi immunoistochimica infatti ha evidenziato che il tessuto esofageo normale del gruppo
di controllo (40/40 casi) esprime discreti livelli di Ski e SnoN. Nei pazienti affetti da EB,
invece, si è osservato una progressiva diminuzione dell’espressione degli antigeni passando
dalla base verso l’apice della mucosectomia in particolare da ghiandole metaplastiche a
displastiche. Fortemente positive sono risultate le ghiandole metaplastiche, con riduzione o
completa assenza di espressione nelle ghiandole displastiche. Tutti e 4 gli adenocarcinomi su
EB sono risultati non esprimere né Ski né SnoN. L’intensità e la localizzazione di colorazione
ottenuta con i due anticorpi anti-Ski e anti-SnoN sono risultate sovrapponibili (Figura 1).
L’analisi statistica effettuata mediante test di Spearman ha evidenziato una stretta correlazione
tra intensità di espressione di entrambi le molecole e grado di metaplasia e di displasia.
L’analisi molecolare quantitativa dell'espressione di Ski e SnoN mediante real-time RT-PCR
sugli stessi campioni bioptici di tessuto fresco è stata deludente. Infatti le lesioni displastiche
nell’esofago di Barrett sono circoscritte ad aree molto ristrette e pertanto usando il tessuto in
toto, non sempre è stato possibile confermare i risultati dell’immunoistochimica. Anche il
tentativo di utilizzare l’ibridazione in situ è fallito a causa della degradazione dell’RNAm
molto frequente nei tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina.
CONCLUSIONI
Per quanto i risultati siano stati diametralmente oppositi a quelli attesi, il nostro studio ha
fornito la nuova ed interessante informazione che nell’EB destinato ad evolvere in senso
neoplastico viene persa l’espressione delle molecole che antagonizzano il segnale di TGFbeta,
Ski e SnoN. Questo risultato, dal punto di vista clinico è molto importante, dal momento
che sono stati identificati due marcatori che permetterebbero di identificare precocemente i
pazienti affetti da EB con maggior rischio neoplastico. Questo riscontro consentirebbe di
impostare interventi terapeutici precauzionali appropriati, che dovrebbero portare ad una
riduzione significativa dell’incidenza di adenocarcinomi dell’esofago con evidente vantaggio
sul piano individuale e sociale.
Lo studio ha anche un’importante valenza dal punto di vista biologico. Infatti, mentre i fattori
clinici che possono influenzare lo sviluppo di EB sono praticamente noti, gli eventi
biomolecolari sono per lo più sconosciuti. In qualità di inibitore della proliferazione epiteliale
il TGF-beta è stato inizialmente considerato come fattore antitumorale. Tuttavia la risposta a
questo fattore è altamente condizionata dal tipo di bersaglio cellulare e dipendente da possibili
interazioni di proteine della cascata intracitoplasmatica innescata da TGF-beta con altre vie di
trasduzione del segnale. Pertanto il nostro studio ha aperto un nuovo filone di ricerca sul ruolo
del TGF-beta nella biologia dell’epitelio dell’esofago, che merita di essere ulteriormente
sviluppato.
Un manoscritto è in preparazione, in attesa di inserire analisi di correlazione con i dati
clinicopatologici più approfonditi in fase di esecuzione.
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Chiara Benedetto Filone tematico D4
Prevenzione della preeclampsia con eparina a basso peso molecolare in
gravide portatrici di trombofilie
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Discipline Ginecologiche e Ostretiche
CONTESTO E RAZIONALE
La preeclampsia (PE) è tuttora una delle più comuni complicanze della gravidanza (5-10%) e
una delle principali cause di mortalità e morbilità materna e perinatale. La malattia compare
dopo le 20 settimane di età gestazionale, sebbene le alterazioni fisiopatologiche
caratteristiche, dovute soprattutto al fallimento dell'invasione trofoblastica nelle arterie spirali,
abbiano inizio già nel primo trimestre di gravidanza. Nonostante la precisa eziologia della
sindrome non sia ancora nota, è ormai accertato che alcune condizioni patologiche ne
aumentano il rischio e ne peggiorano la gravità. In particolare, è stato dimostrato anche da
studi condotti dal nostro gruppo che gli stati trombofilici congeniti aumentano l’incidenza sia
di preeclampsia grave sia di sue complicanze materne e perinatali.
Le due mutazioni trombofiliche più frequenti nella nostra popolazione sono la mutazione
G1691A del fattore V e la mutazione G20210A del fattore II, la cui prevalenza complessiva è
del 5% circa. E’ stato suggerito da studi osservazionali e case-reports che nelle donne
trombofiliche con precedenti complicanze ostetriche la profilassi antitrombotica in successive
gravidanze potrebbe ridurre l'incidenza delle recidive o almeno limitarne la gravità.
OBIETTIVO
Per tale motivo ci siamo proposti di valutare l'efficacia della profilassi con eparina a basso
peso molecolare e aspirina a basse dosi nel prevenire la ricorrenza di complicanze ostetriche,
materne e perinatali, in gravide portatrici di mutazioni trombofiliche e con precedenti
anamnestici di esiti sfavorevoli della gravidanza.
METODI
A tutt’oggi sono state incluse nello studio complessivamente 62 gravide portatrici di
mutazioni del fattore II e V della coagulazione, con pregressa preeclampsia o sue
complicanze, selezionate tra le donne afferenti agli ambulatori del Dipartimento di Discipline
Ginecologiche e Ostetriche, Cattedra C, di Torino entro le 12 settimane di gestazione. Le
gravide incluse sono state assegnate in modo randomizzato ai 2 bracci di trattamento previsti:
• n. 31 soggetti sono stati assegnati al trattamento con enoxaparina (4000 U/die sc) e
aspirina a basse dosi (100 mg/die per os);
• n. 31 soggetti sono stati assegnati al trattamento con aspirina a basse dosi (100 mg/die per
os), che viene considerato come trattamento di controllo.
Nel braccio trattato con enoxaparina + ASA a basse dosi il 78 % delle gravidanze (n.24) sono
giunte al termine senza complicanze materne e/o feto neonatali. In questo braccio si sono
verificati 3 aborti spontanei precoci, in tre soggetti si è manifestata una forma di preeclampsia
lieve/moderata, che in due pazienti ha richiesto comunque l’espletamento pretermine del
parto. In una paziente si è verificato un parto pretermine idiopatico a 36 settimane
46

conseguente a rottura prematura delle membrane amniocoriali, comunque in assenza di
complicanze ipertensive della gravidanza. Nel braccio di controllo trattato con ASA a basse
dosi solo il 44 % delle gravidanze (n.14) sono giunte al termine senza complicanze materne
e/o feto neonatali. Nei restati casi si sono registrati 4 aborti spontanei precoci, 8 casi di
preeclampsia lieve/moderata in sei dei quali è stato necessario espletare il parto a < 37
settimane di età gestazionale, 4 casi di preeclampsia grave precoce di cui 3 con iposviluppo
fetale ed espletamento del parto a < 32 settimane, e 1 caso di morte intrauterina del feto.
In nessuno dei soggetti inclusi in ciascun braccio si sono verificati effetti collaterali gravi
dovuti al farmaco impiegato, anche se in due soggetti trattati con enoxaparina si sono avuti
fugaci rush cutanei di probabile natura allergica. Non si sono manifestate complicanze
tromboemboliche. Sebbene all’inizio dello studio si ritenesse necessario un campione più
numeroso, la differenza di incidenza di esiti perinatali sfavorevoli nei due bracci conferisce
allo studio un potere statistico attuale del 95%. Risulta evidente che i soggetti trattati con solo
ASA a basse dosi hanno un rischio significativamente più elevato di ricorrenza di
complicanze gestazionali vascolari, in particolare di preeclampsia, rispetto a quelli sottoposti
a trattamento con eparina basso peso molecolare (p=0.009; OR, 95%CI: 4.16, 1.38-12.50).
RISULTATI
I risultati del nostro studio indicano che:
• nei soggetti con pregressa preeclampsia grave o sue complicanze è indicato lo screening di
mutazioni trombofiliche;
• il trattamento profilattico con eparina a basso peso molecolare in gravide con pregressi
eventi perinatali sfavorevoli portatrici di mutazioni trombofiliche riduce
significativamente l’incidenza di ricorrenze di patologie ostetriche.
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Bruno Bergamasco Filone tematico C1
Valutazione dell’efficacia della terapia chirurugica nella riabilitazione dei
pazienti parkinsoniani in fase avanzata.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Neuroscienze
Sono stati analizzati due gruppi di pazienti affetti da malattia di Parkinson confrontabili per
sesso, età, durata di malattia e complicanze motorie. Ciascun gruppo era composto da 20
pazienti (11 maschi, 9 femmine) con età media di 63 anni, con una media di 17 anni di
malattia e 10 anni di complicanze motorie. Il primo di questi due gruppi è stato avviato all’iter
di selezione per l’intervento di stimolazione cerebrale profonda (SCP) del nucleo subtalamico
(NST). Nel secondo gruppo sono stati invece inseriti pazienti con caratteristiche omogenee al
primo, ma non avviati all’iter di selezione per la SCP e seguiti tramite visite ambulatoriali. I
20 pazienti selezionati sono stati sottoposti ad intervento di SCP del NLT: al momento del
ricovero pre-operatorio, oltre alla routine d’esami pre-intervento, sono stati somministrati:
• il protocollo CAPIT (Core Assestment Program for Intracranial Transplantation),
composto da quattro parti di cui la prima valuta le capacità cognitive del paziente, la
seconda la capacità di svolgere le normali attività della vita quotidiana, la terza prevede
una valutazione motoria, la quarta raccoglie dati anamnestici inerenti le fluttuazioni e le
complicanze motorie inerenti la patologia. Il protocollo CAPIT pre-operatorio viene
somministrato in due momenti: paziente in assenza di farmaci e dopo l’assunzione di una
dose massimale di L-Dopa;
• la scala PDQ-39 che valuta la qualità della vita del paziente affetto da malattia di
Parkinson;
• Test neuropsicologici (abilità visuo-spaziale, funzioni esecutive frontali).
I pazienti sono stati rivalutati dopo tre mesi dall’intervento e successivamente ogni 6 mesi e,
ad ogni controllo, sono stati nuovamente somministrati gli stessi test pre-operatori. Il
protocollo CAPIT nel post-operatorio è stato eseguito in 4 fasi: con la sola stimolazione del
NST, in assenza di stimolazione e farmaci, dopo dose massimale di L-dopa, con dose
massimale di terapia associata alla stimolazione del NST.
Sono state inoltre considerate le terapie farmacologiche e riabilitative prima e dopo
l’intervento, il numero di visite ambulatoriali, il grado di soddisfazione e la qualità della vita
dei caregivers. I dati così ottenuti sono stati elaborati tramite test statistici (test T per dati
appaiati, test di Mann-Whitney) ed è stata osservata una differenza statisticamente
significativa del miglioramento motorio nel post-operatorio (valutato con la UPDRS III), nel
miglioramento nelle attività quotidiane (UPDRS II) ed una riduzione significativa della
terapia dopaminergica (da una media di 751 mg di L-dopa nel pre-operatorio a una media di
243 mg durante il follow-up). Nel gruppo di pazienti operati inoltre viene riferito un
miglioramento sia dal paziente sia dai caregivers in termini di qualità della vita (con associato
miglioramento nei questionari PDQ-39). Nel corso del follow-up, i pazienti operati hanno
seguito un ciclo di riabilitazione motoria solo nel corso dell’immediato periodo postoperatorio.
Il secondo gruppo di pazienti non sottoposti a intervento è stato anch’esso seguito tramite
visite ambulatoriali e sono stati somministrati gli stessi test del primo gruppo (UPDRS II, III
48

valutati con i pazienti in assenza di terapia e dopo dose massimale di L-Dopa). La prima
valutazione è stata seguita da successivi controlli, il primo dopo 3 mesi e i successivi ogni 6
mesi. Questi pazienti, non candidati all’intervento di SCP, seguivano una terapia
farmacologica e un programma di riabilitazione motoria.
I dati ottenuti dall’osservazione di questi pazienti sono stati elaborati e non hanno dimostrato
nessun miglioramento significativo nei risultati dei test somministrati. E’ stato riferito un
iniziale beneficio dovuto alle terapie riabilitative ed un successivo aumento della terapia
farmacologica con progressiva riduzione del beneficio e necessità di ripetere i cicli di terapia
fisica anche con ricoveri in strutture specializzate.
Infine abbiamo confrontato i due gruppi di pazienti, analizzando i punteggi nei diversi items
ottenuti valutando i pazienti in assenza di terapia e stimolazione, con dose sovramassimale di
terapia nei pazienti non operati e con la sola stimolazione nei pazienti operati. Dall’analisi dei
dati è emerso che nei pazienti sottoposti ad SCP vi è un miglior controllo dei sintomi motori e
non motori, un miglioramento nella qualità della vita (anche del caregiver) e nei test di
valutazione cognitiva. Questo porta ad un minore uso di farmaci, minor numero di ricoveri e
minore necessità di terapie riabilitative che si osserva nei pazienti operati rispetto ai pazienti
non operati.
49

Mauro Bergui Filone tematico C1
Sviluppo ed applicazioni cliniche della risonanza magnetica funzionale
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Neuroscienze
CONTESTO E RAZIONALE
La sinergia tra l’evoluzione tecnologica e la sperimentazione clinica ha consentito negli ultimi
anni di realizzare un forte sviluppo delle tecniche di imaging diagnostico funzionale. Tra
queste, particolare importanza, riveste la risonanza magnetica funzionale (fMRI), che utilizza
sequenze di acquisizione estremamente rapide per monitorare l’attivazione cerebrale
responsabile dello svolgimento da parte del paziente di specifici compiti (motori, sensoriali,
ecc.).
L’utilità di tale strumento diagnostico è molto ampia: dalla possibilità di trarre informazioni
su alcune patologie neurologiche alla pianificazione di interventi di neurochirurgia senza il
danneggiamento di specifiche aree funzionali, dallo studio di meccanismi di apprendimento
alla riorganizzazione della funzionalità a seguito di un intervento. La realizzazione delle
mappe di attivazione cerebrale avviene tramite un’accurata elaborazione statistica delle
immagini acquisite con apparecchiature per risonanza magnetica, con la collaborazione di
diverse figure professionali (neurologi, radiologi, psicologi, fisici sanitari, esperti di
statistica).
L’A.S.O. “San Giovanni Battista” di Torino la S.C.D.U. di Neuroradiologia e la S.C. di Fisica
Sanitaria collaborano da circa due anni nella realizzazione di studi di fMRI
sull’apprendimento di compiti motori e nell’ottimizzazione dell’utilizzo dell’imaging fMRI
come strumento diagnostico prechirurgico. Numerosi aspetti della metodica di risonanza
magnetica funzionale sono stati sviluppati e ottimizzati nel corso nell’ambito di questo
progetto. La somministrazione di stimoli di tipo uditivo e visivo avviene con l’utilizzo di
strumentazione compatibile con l’alto campo magnetico dell’apparecchiatura (occhiali
dedicati con connessione a fibra ottica e speciali auricolari). Questi dispositivi sono pilotati da
un software che trasmette gli stimoli con una temporizzazione programmata. La
sincronizzazione della somministrazione degli stimoli con l'acquisizione delle immagini è
stata ottimizzata variando alcuni dei parametri di scansione dell’apparecchiatura RM.
MATERIALI E METODI
Sono stati preparati alcuni modelli di presentazione per studi di vario tipo (coinvolgenti le
aree cerebrale preposte a compiti di tipo visivo, uditivo, cognitivo). Una parte del lavoro
svolto è stato finalizzato alla valutazione e al miglioramento della qualità delle immagini. Le
sequenze di acquisizione utilizzate per questo tipo di studi richiedono tempi molto brevi di
esecuzione (pochi secondi per l’acquisizione di un intero volume cerebrale) che possono
alterare le normali condizioni di funzionamento dell’apparecchiatura. La verifica della
stabilità temporale e spaziale dei segnali forniti, con l'acquisizione di immagini su opportuni
fantocci, ha permesso di effettuare scelte migliori nelle procedure di post processing alle quali
sono sottoposte le immagini per l'estrazione delle informazioni funzionali.
Sono stati implementati in particolare alcuni programmi di elaborazione che hanno consentito
di valutare l'entità e l'affidabilità del segnale funzionale sia per compiti motori che per alcuni
primi esperimenti con compiti cognitivi. L’entità della variazione di segnale conseguente
50

all’attivazione cerebrale è compresa nell’intervallo 1-5 % per gli studi motori e 1-2 % per gli
studi cognitivi. L’accurata elaborazione statistica realizzata e la valutazione del rapporto
segnale rumore consentono di stabilire la significatività delle mappe funzionali realizzate.
Inoltre lo studio delle zone di attivazione per compiti motori in soggetti sani di riferimento ha
permesso di ottenere delle immagini che presentano una struttura di attivazione perfettamente
coerente con la nota organizzazione cerebrale, ulteriore conferma della correttezza dei risultati
ottenibili con la metodica.
Stiamo valuatndola possibilità di integrare le informazioni relative al rapporto segnale rumore
temporale con la presentazione finale delle mappe di inferenza statistica, in modo da limitare
l’insorgenza di artefatti legati a disturbi nel segnale acquisito. La metodica così sviluppata e
ottimizzata è stata applicata per la rappresentazione di mappe di attivazione ottenute in
pazienti candidati ad interventi neurochirurgici di asportazione di lesioni.
E' attualmente in corso uno studio che consentirà di valutare il significato prognostico in
patologie neurodegenerative, in particolare come diagnosi precoce in pazienti non ancora
sintomatici.
PUBBLICAZIONI
I risultati ottenuti sono oggetto delle seguenti pubblicazioni:
"MOTOR AND COGNITIVE EXPERIENCES WITH LOW FIELD BOLD FMRI"
A Boghi, M Bergui, O. Rampado, P Mortara, and GB Bradac. Neurologia e Neuroradiologia,
Dipartimento di Neuroscienze, Università di Torino, SCDO Fisica Sanitaria Ospedale San
Giovanni Battista, Torino.
Lavoro presentato al XX° Congresso nazionale A.I.N.R. 22 - 25 settembre 2004, Milano.
“IS 1 TESLA ENOUGH EXPERIENCES WITH LOW FIELD FMRI”
A Boghi, P. Mortara, M. Bergui, F. Avidano, C. Manzone, M. Coriasco, O. Rampado P.
Caroppo, L. Orsi, G.B. Bradac, R. Mutani. Neurologia e Neuroradiologia, Dipartimento di
Neuroscienze, Università di Torino, SCDO Fisica Sanitaria Ospedale San Giovanni Battista,
Torino.
Lavoro presentato al XXXV Congresso della Società Italiana di Neurologia, 25 - 29 settembre
2004, Genova.
“VALUTAZIONE AUTOMATIZZATA DI PARAMETRI DI QUALITÀ PER
APPLICAZIONI DI RISONANZA MAGNETICA FUNZIONALE CON
UN’APPARECCHIATURA DA 1 TESLA”
O. Rampado, M. Coriasco, A. Boghi, M. Bergui, R. Ropolo
Lavoro inviato al congresso nazionale AIFM (Verona 15-17 giugno 2005)
“FUNCTIONAL MAGNETIC RESONANCE IMAGING AT 1.0 T DURING MOTOR
AND COGNITIVE TASKS”
Lavoro inviato alla rivista Neuroradiology
“LINEA GUIDA PER LA REALIZZAZIONE DI UNO STUDIO STANDARD DI
RISONANZA MAGNETICA FUNZIONALE (FMRI)” A cura di Osvaldo Rampado,
Mario Coriasco, Andrea Boghi. (Ad uso interno).
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Maria Grazia Bernengo Filone tematico A1
La sifilide nel nuovo millennio.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Biomediche e Oncologia Umana
In seguito al recente incremento dei casi di sifilide in Italia e nel mondo è stato effettuato uno
studio di sorveglianza epidemiologica sui pazienti affetti da sifilide recente afferenti ai centri
MST della Rete di Sorveglianza Regionale dall00’aprile 2003 al dicembre 2004.
CARATTERISTICHE dei PAZIENTI con SIFILIDE RECENTE
Nel periodo esaminato sono stati osservati 217 casi di sifilide recente: 184 casi di sifilide I-II
(79 forme primarie, 105 forme secondarie) e 33 casi di sifilide sierologica recente. L’età
mediana è risultata 39 aa; le donne straniere sono più giovani (27 aa) delle donne italiane (38
aa) mentre tra gli uomini l’età è sovrapponibile (stranieri: 37 aa; italiani: 39 aa). Il sesso
prevalente è quello maschile con rapporto F/M pari a 1:7. Tra gli uomini il 46% si dichiara
eterosessuale, 39% omosessuale e 15% bisessuale. Tutte le donne si dichiarano eterosessuali e
7 donne riferiscono di essere prostitute (età mediana 32 aa, tutte italiane tranne una donna
francese e 3 sieropositive già note). Il 29% degli uomini eterosessuali riferisce rapporti con
prostitute. I pazienti non italiani sono l’8% provenienti da: Europa dell’Est (7 casi), Sud
America e Nord Africa (6 casi) e Francia (2 casi). Il test HIV è stato proposto a tutti i nuovi
casi di sifilide eccetto 17 pazienti HIV-positivi mentre tre persone hanno rifiutato il test. Tra i
197 pazienti che hanno eseguito il test 6 sono risultati positivi per un totale complessivo di
11% di HIV-positivi tra i pazienti con sifilide recente.
DINAMICA di DIFFUSIONE
La maggioranza riferisce di aver contratto l’infezione da sconosciuti: 35% da singolo partner
occasionale e 40% da partner occasionali multipli, seguiti dal 19% che riferisce il contagio dal
partner stabile ed il 6% che ignora la fonte di contagio. Tra le donne la metà contrae
l’infezione dal partner stabile mentre tra i maschi il 79% si contagia da partner occasionali.
Tra gli omobisessuali e le prostitute è stato talvolta impossibile individuare il caso fonte per
l’elevata promiscuità di questa popolazione. La via di trasmissione riferita risulta essere il
rapporto non protetto genitale ed oro-genitale negli eterosessuali mentre negli omobisessuali i
rapporti oro-genitali non protetti sono riferiti più frequentemente dei rapporti ano-genitali.
Tra i pazienti con forme sintomatiche l’84% riferisce di essersi contagiato in Italia, l’80% in
Piemonte, il 5% riferisce di essersi contagiato all’estero: 5 stranieri al ritorno dal paese
d’origine e 6 italiani in vacanza o in viaggio di lavoro e l’11% ignora il luogo di contagio. Lo
studio del luogo e delle modalità di contagio ha permesso di identificare come circuiti
significativi i locali gay - bar, discoteca, sauna, cinema - (38 casi), la prostituzione di strada
(17 casi) e internet (10 casi). I motivi di visita dei pazienti giunti alla nostra osservazione sono
stati: 80% presenza di lesioni cutanee; 11% inviati dal partner affetto; 7% esami sierologici;
2% visita per altra MST. Circa un terzo delle donne si presenta inviata dal partner affetto da
sifilide, mentre l’84% degli uomini accede per la presenza di lesioni genitali o cutanee
visibili. Il periodo di contagiosità, compreso tra la comparsa di lesioni e la diagnosi, è stato in
media di 35 giorni. La metà dei pazienti giunti alla nostra osservazione riferisce precedenti
visite mediche: 45% dal medico generico; 22% in ospedale/PS; 33% dallo specialista. Tra
52

questi una diagnosi corretta di sifilide è stata posta nel 32%. Solo 3 persone si sono
autotrattate con antibiotici non prescritti da medici.
“CONTACT-TRACING”
E’ stato possibile rintracciare il partner fonte, definito come il più probabile responsabile del
contagio del paziente, nel 18% dei casi che riferiscono rapporti con partner occasionali e nel
46% dei casi che riferiscono rapporti esclusivi con il partner stabile. Durante il periodo di
contagiosità, in presenza di lesioni genitali o cutanee, il 64% dei pazienti con sifilide ha
continuato ad avere rapporti non protetti: il 65% col partner stabile e 35% con partner
occasionali.
Per agire sulla catena di contagio tutti i pazienti trattati sono stati invitati ad inviare i partner
con cui hanno avuto rapporti negli ultimi 6 mesi (partner esposti). Il colloquio ha permesso di
identificare l’85% dei partner stabili esposti e l’11% dei partner occasionali esposti. Tra i
partner stabili esposti, individuati e visitati è stata riscontrata la sifilide nel 43% ed è stato
somministrato il trattamento on-site. Ai pazienti risultati non affetti è stata offerta la
possibilità di controlli periodici per 2 mesi o la terapia preventiva accettata dalla stragrande
maggioranza.
CONCLUSIONI
La popolazione osservata è costituita prevalentemente da uomini, equamente ripartiti tra
omobisessuali ed eterosessuali, nella grande maggioranza italiani, di età media, tra i quali
l’11% risulta sieropositivo per l’HIV.
Tra gli eterosessuali lo scambio di sesso per denaro interessa il 25% delle donne ed il 29%
degli uomini. Probabilmente vi è una sottostima del fenomeno prostituzione per la reticenza
degli uomini a dichiararsi clienti e per la difficoltà di accedere ai Centri MST da parte delle
prostitute. Dai dati emerge che il mondo omo-bisessuale e della prostituzione dovrebbero
essere i primi circuiti da sensibilizzare tramite l’informazione sanitaria e l’offerta di visita ed
esami sierologici per sifilide ed HIV. Sono invece scarse le informazioni sulla dinamica di
diffusione tra gli eterosessuali estranei alla prostituzione.
I rapporti sessuali non protetti sono la via di trasmissione della malattia. L’assenza di
protezione dei rapporti può essere imputata ad ignoranza o a scarsa consapevolezza della
sifilide ma anche ad un’errata concezione sul sesso sicuro per cui si presuppone che i rapporti
oro-genitali siano a basso rischio.
Il luogo di contagio più frequentemente riferito è risultato il territorio regionale a conferma
che l’infezione è prevalentemente autoctona. Sebbene sia documentabile una certa mobilità, la
sifilide d’importazione sembra poco rappresentata e confinata alle varie comunità etniche
(soprattutto rumeni e moldavi) e non vi è contatto tra la popolazione straniera e italiana se non
attraverso la prostituzione. Il contact-tracing si è rivelato uno strumento utile che ha permesso
di identificare i partner-fonte ed esposti ed effettuare una diagnosi precoce seguita da
trattamento tempestivo. Il recupero dei partner è stato efficace in caso di coppie stabili mentre
si è rivelato scoraggiante in caso di rapporti con partner occasionali. L’alta percentuale di
partner esposti contagiati ci impone di pensare ad alternative al counseling per questi pazienti
come il contact-tracing eseguito da un operatore sanitario su indicazioni del paziente.
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Laura Berta Filone tematico C1
Effetto delle onde d'urto sui fibroblasti umani nell'induzione dei processi
riparativi: implicazioni terapeutiche
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Fisiopatologia Clinica
CONTESTO E RAZIONALE
Lo studio si proponeva di valutare in vitro l’effetto delle onde d’urto ad alta energia (Low
Energy Shock Waves, LESW) su culture di fibroblasti umani al fine di chiarire i meccanismi
di azione e di suggerire modalità di esercizio più puntuali nel trattamento di patologie
osteotendinee.
OBIETTIVI E RISULTATI
Obiettivo 1. Verifica dell’effetto in vitro sulla sopravvivenza e sulla curva di crescita di
fibroblasti umani sottoposti a trattamento con onde d'urto mediante un generatore
piezoelettrico (Piezoson 100, Richard Wolf, Knittlingen, Germania) con livelli di energia
applicata rispettivamente di 0.22 - 1 mJ/mm2 e numero di colpi erogati compreso tra 300 e
1500; frequenza 4 colpi al secondo. Nei fibroblasti umani non sussiste differenza significativa
tra i due livelli di energia, mentre il numero di colpi è il fattore discriminante per definire la
percentuale di sopravvivenza. Nei fibroblasti, 1000 colpi erogati a energia di 0,22 mJ/mm2
consentono di coniugare il massimo stimolo proliferativo con la maggiore percentuale di
sopravvivenza. Il picco di crescita avviene tra il 6° e il 9° giorno, sia nei fibroblasti trattati che
nei non trattati.
Obiettivo 2. Verifica dell’espressione genica del TGFβ-1, del Collageno I e del Collageno III.
Nei fibroblasti non trattati l’espressione genica del TGFβ-1 incrementa progressivamente sino
al 9° giorno per poi decrescere dal 9° al 13° giorno. Andamento analogo è riscontrabile per
l’espressione del Collageno I e del Collageno III che raggiungono la massima espressione: il
primo nella 9° giornata, il secondo nella 13° giornata. Nei fibroblasti trattati con onde d’urto
nella condizione definita ottimale - 1000 colpi a energia di 0,22 mJ/mm2 - l’espressione del
TGFβ-1 è sfasata rispetto a quella osservata nei fibroblasti non trattati, con una crescita dal 6°
al 13° giorno. Estremamente significativa risulta l’espressione del Collageno I in incremento
progressivo dal 6° giorno, con un massimo che perdura dal 9° giorno sino al 13° giorno.
L’espressione del Collageno III risulta quantitativamente ancora più significativa rispetto a
quella del Collageno I con un massimo al 9° giorno e con valori elevati che perdurano ancora
al 13° giorno.
Obiettivo 3. Verifica dei protocolli precedenti su culture di osteoblasti umani. Negli
osteoblasti la percentuale di sopravvivenza dipende sia dal livello di energia che dal numero
di colpi. Negli osteoblasti, 300 colpi a energia 0,11 mJ/mm2 consentono di coniugare un
elevato stimolo proliferativo con la maggiore percentuale di sopravvivenza. Il trattamento con
onde d’urto induce un incremento significativo della espressione genica del TGF-β1 negli
osteoblasti.
54

I dati sopra riportati confermano l’ipotesi che esiste una sensibilità specifica per tipo di cellula
al trattamento con onde d’urto. Nelle culture cellulari testate fibroblasti e osteoblasti umani
presentano diversa sensibilità al trattamento con onde d’urto. Nei fibroblasti, in particolare, è
stata confermata l’attivazione da parte delle onde d’urto del TGFβ-1 come nodo cruciale di
stimolo proliferativo e differenziativo e, soprattutto, un’azione specifica sul Collageno III.
L’incremento così significativo della espressione genica del Collageno III osservato nei
fibroblasti trattati rispetto ai non trattati - e in modo più prolungato nel tempo - è indice di una
significativa induzione della produzione di matrice extracellulare, momento fondamentale dei
processi riparativi di ogni tipo di tessuto. E’ stato così confermato a livello cellulare il dato
clinico di recupero rapido di lesioni osteotendinee sottoposte a trattamento con onde d'urto ad
alta energia.
PUBBLICAZIONI
I dati più significativi del programma di studio sono stati oggetto delle seguenti
comunicazioni a Convegni Scientifici:
“Effetto delle onde d’urto (ESW) sulla citotossicità e sulla proliferazione e/o differenziazione
in vitro di osteoblasti e fibroblasti umani”; Laura Berta, Annamaria Fazzari, Enrica Patrizia
Maurici, Anna Ficco, Marina Berta*, Roberto Frairia. Comunicazione al V Congresso
Nazionale della Società Italiana di Terapia con Onde d’Urto (SITOD), Verona, maggio 2004.
“Extracorporeal shock waves promote growth of osteoprogenitor cells” Martinazzo G. Rizzo
F. Canuto R.A., Muzio G., Berta L., Bassi F., and Frairia R. Comunicazione all’ International
College of Prosthodontists, Creta, maggio 2005.
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Emma Bertuzzi Filone tematico A5
“Legami familiari” Ricerca-intervento per la prevenzione ed il trattamento
dei disturbi relazionali precoci
ASL 5 – Dipartimento Territoriale Continuità delle Cure
UOS Psicologia
OBIETTIVI e RISULTATI
1- Creazione di un gruppo d’intervento
Il lavoro di rete avviato sul Distretto con differenti figure professionali sanitarie e sociali ha
condotto alla creazione dell’Equipe Distrettuale Disturbi Relazionali Precoci (drp) 0-3 anni
“Semi di Senapa” con compiti di:
a) osservazione ed analisi del fenomeno;
b) attivazione e sviluppo delle capacità di rilevazione degli indicatori di drp negli operatori a
contatto con i genitori dei bambini dagli 0 ai 3 anni;
c) ricezione delle segnalazioni provenienti dal territorio, attivazione della rete di sostegno e
cura diretta/indiretta attraverso il confronto sui casi rilevati e/o segnalati.
Il gruppo di lavoro è coordinato da uno psicologo attraverso incontri mensili cui partecipano i
rappresentanti di diverse professioni sanitarie e sociali, del territorio/ospedale. Il lavoro
d’equipe ha portato dal mese di Ottobre 2004 al Dicembre 2005 i seguenti risultati: 20
segnalazioni con successive 8 prese in carico dirette del Servizio di Psicologia, 4 del Servizio
Sociale, 8 tramite monitoraggio indiretto e lavoro di rete. Inoltre su 20 segnalazioni ricevute
dall’Equipe distrettuale drp, 14 sono giunte dall’Ospedale di Susa, le restanti dal Consultorio,
PLS, Servizio Sociale.
2- Formazione degli operatori sanitari.
Si è realizzata attraverso due corsi di formazione: uno in due edizioni (mesi Nov/Dic ’04) e
con accredito ECM dal titolo: “I drp genitore-bambino nella fascia d’età 0-3 anni”. Ha visto la
partecipazione di circa 40 operatori sanitari del D5 Susa e del D1 Collegno. Molti tra i
partecipanti si sono in seguito impegnati nel lavoro di rete prodotto dall’Equipe Distrettuale
del D5 e del D1. In data 3/12/’05 si è poi svolta una giornata di formazione rivolta ai PLS e
ospedalieri dell’ASL5 intitolato: “Screening dei drp”, che ha visto la partecipazione di 45
medici pediatri.
3- Integrazione operativa con l’UOC Nido-Pediatria e l’UOC Ostetricia-Ginecologia.
Si è realizzata attraverso il lavoro di rete dell’Equipe Distrettuale drp ed il lavoro svolto dalla
ricercatrice incaricata, attraverso la ricerca specificata al punto 4. Inoltre l’ADI ha ricevuto 10
richieste di sostegno e monitoraggio relazionale Genitori-bambino a fronte di n. 1 richieste
precedenti l’avvio della ricerca.
56

4- Data l’assenza di elementi che definissero l’incidenza sulla popolazione del D5 dei nuclei a
rischio psico-sociale e della depressione Post-partum, sono stati avviati due filoni di ricerca
quantitativa:
a) somministrazione dell’Intervista sul rischio psico-sociale (Ammaniti e coll. 1999) -
ott 04 / ott 05 - per la definizione quantitativa del campione all’interno del quale poter
individuare le famiglie a doppio rischio, alle mamme consenzienti dell’UOC
Ostetricia-Ginecologia dell’Ospedale di Susa nei giorni seguenti il parto. I risultati
emersi sono di seguito riassunti.
Sono state intervistate 210 donne, il 40% delle quali, pari a 83 donne, sono risultate a
rischio psicosociale. Dai dati e grafici prodotti si evince che nella nostra realtà locale
non rappresentano fattori di rischio significativi i seguenti elementi: l’età delle donne
intervistate, l’età dei padri, lo stato d’immigrato (una donna italiana su tre è a rischio
come una donna immigrata su tre), la presenza dei padri che è risultata una costante
anche nelle situazioni a rischio, il grado d’istruzione, l’occupazione lavorativa ed il
supporto sociale e famigliare che sono risultati positivi. L’83% delle donne intervistate
appariva poco o per nulla sofferente, nessuna è stata valutata molto sofferente. La
sofferenza manifesta non si è quindi rivelata un dato utile ai fini valutativi, in quanto
spesso non sembra rispecchiare la realtà del vissuto individuale. Infine, abbiamo
rilevato che tutte le donne intervistate si sono affidate a medici privati o pubblici
durante la gravidanza. Tale elemento sottolinea la non rilevanza del dato nel verificarsi
dell’evento rischio.
Sono invece risultati fattori significativi nella determinazione del rischio psico-sociale:
i vissuti di violenza (il 46% delle donne a rischio ha riferito vissuti di violenza), la
presenza di situazioni stressanti nell’anno precedente il parto (il 77% delle madri a
rischio ha riportato di aver vissuto esperienze stressanti), la presenza di eventi
stressanti nella storia individuale con particolare riferimento all’infanzia e
all’adolescenza (il 60% delle donne a rischio ha ricordato esperienze stressanti
significative), la storia psichiatrica (il 76% riferisce situazioni patologiche personali o
nelle famiglie d’origine propria o del partner).
b) In collaborazione con il Dipartimento d’Igiene e Prevenzione è stata somministrata
la Scala di Edimburgo alle mamme nel corso della prima vaccinazione dei
neonati.
Il campione della seconda ricerca è composto da 411 donne di cui 181 residenti in Alta
Valle di Susa e 230 in Bassa Valle di Susa. Il 13% dei test è stato annullato perché
incompleto, ne deriva la presenza di 357 test validi. Il 12,8% delle madri che hanno
accettato di partecipare alla ricerca ed i cui test erano validi è risultato sofferente: su
un totale di 357 donne, 46 presentano sintomi significativi.
E’ risultato quindi un dato leggermente superiore ai dati riportati nella letteratura
nazionale che valutano intorno al 10% della popolazione l’incidenza della depressione
post-partum. Si sottolinea che è stato raggiunto un ulteriore risultato complessivo, non
prevedibile a priori. Infatti la ricerca, da esperienza pilota in atto sul D5, ha prodotto
un coinvolgimento metodologico e operativo a livello di tutti e cinque i Distretti
dell’ASL 5, che ha portato il Dipartimento Materno Infantile ed il Dipartimento
Territoriale per la continuità delle cure, nel quale rientra l’UOS Psicologia, a proporre
alla Direzione Aziendale quale Progetto Obiettivo Interdipartimentale per gli anni
2005/2006/2007 il Progetto “RILEVAZIONE e DIAGNOSI PRECOCE dei
DISTURBI RELAZIONALI PRECOCI GENITORE-BAMBINO nella FASCIA 0-3
ANNI”, già in corso d’opera nel 2005.
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Piero Bestagini Filone tematico A2
Screening del cervico-carcinoma nelle donne fra 25 e 64 anni delle
ASL13-14: programmi spontanei, organizzati o assenti
ASL 13 – ASL 14 A. O. Maggiore - Novara
Dipartimento Interaziendale per lo Screening
Lo scopo dell’indagine era di valutare la copertura reale della popolazione delle ASL13 e 14
(dipartimento di screening regionale n.6) in ordine alla prevenzione dei tumori del collo
dell’utero tramite pap-test tradizionale. Essendo l’adesione al programma SERENA
particolarmente bassa (27%) si sono volute indagare anche le motivazioni.
MATERIALE E METODI
Il campionamento viene fatto in modo probabilistico con LC del 5% e Varianza del 50%
(massima per una distribuzione binomiale). Con queste caratteristiche la numerosità del
campione era stabilita in 522 unità suddivisa proporzionalmente fra aderenti e non aderenti al
primo round secondo il programma organizzato, in modo da avere un campione
autobilanciato. Vengono effettuate 498 interviste valide (162 aderenti e 336 non aderenti a
SERENA) con un lieve sbilanciamento (circa 5%) del numero di quelle delle aderenti rispetto
alle non aderenti di cui si è tentuto conto in fase di elaborazione statistica tramite test di
correlazione per ranghi (Kendall; software SPSS).
RISULTATI
Il campione è costituito da donne per il 70% nate nell’area dell’Italia nord-occidentale e per il
19% immigrate dal sud-isole. Il 90% risiede nell’attuale comune di residenza da 20 anni. La
quasi totalità delle donne è in possesso di un titolo di studio, il 64.3% di scuola dell’obbligo.
L’83% circa è sposata o convive con un partner. Solo il 38% è occupata al di fuori delle
attività domestiche. Circa un terzo è pensionato. L’età media è di 52.4 anni.
Se analizziamo l’aderenza a SERENA in ordine a fattori socio-economici, non riscontriamo
differenze statisticamente significative fra aderenti e non: tali fattori quindi sembra non
incidano sulla scelta o meno di aderire al programma Regionale. Il 95% del campione
intervistato dichiara di aver effettuato nella vita almeno un pap-test, e il 62% l’ha fatto solo
fuori dal programma regionale. Del 32.5% che ha aderito al programma regionale, il 31%
aveva fatto un pap-test anche fuori da SERENA. C’è una quota pari al 5% delle donne che
non hanno mai fatto un pap-test in vita loro. Se consideriamo però da quanto tempo è stato
effettuato l’ultimo pap-test, notiamo che il 31% l’ha fatto da più di tre anni o non ricorda.
Una consistente frazione di donne (17,5%) ha effettuato l’ultimo pap-test solo fuori SERENA
e l’ha fatto da più di tre anni (o non ricorda) e sommando anche le donne che non hanno mai
fatto un pap-test si arriva a un 23% di popolazione obiettivo non coperta da prevenzione.
SERENA ha poi arruolato un 17% di donne che avevano fatto l’ultimo pap-test da più di tre
anni. Si può quindi riassumere che la copertura della popolazione femminile 25-69enne in
termini di prevenzione del carcinoma del collo dell’utero raggiunge il 77%, dato
sovrapponibile a quello dello studio Torinese del 1992.
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L’effetto positivo del programma regionale si estende al 17% circa della popolazione
obiettivo, avendo arruolato una frazione che era completamente estranea alla prevenzione e
una che l’aveva praticata saltuariamente. Mentre il 50% delle donne intervistate dice di essersi
rivolto al medico privato nell’esecuzione dell’ultimo pap-test fuori SERENA, ben il 38% si è
rivolto alle strutture pubbliche. Se analizziamo solo le donne non aderenti a SERENA il dato
non varia di molto: rispettivamente costituiscono il 54 e il 36%. Se analizziamo la frequenza
con cui riferiscono di fare il pap-test fuori SERENA, notiamo che solo il 7% accetta un
periodismo triennale, mentre il 54% lo effettua ogni 1-2 anni, contro un 32% che lo effettua
irregolarmente o con un periodismo superiore ai 3 anni. Se selezioniamo coloro che si
rivolgono al medico privato, il periodismo a meno di tre anni sale al 67%, ma il 27% riferisce
comunque una frequenza irregolare.
Dall’analisi degli items che cercano di individuare specificamente i motivi della scarsa
aderenza al programma regionale, appare che delle 336 donne intervistate e non aderenti al
programma, ben 116 (34.5%) dichiarano di non aver ricevuto l’invito e 36 (10.7%) non
ricordano di averlo ricevuto. Considerando tali quote sul totale delle intervistate risulterebbe
che almeno il 23.3% degli inviti non giungono a destinazione. Dai nostri archivi relativi alle
lettere inesitate, la percentuale, per quanto alta, non supera i 5-8%. Il dato riferito dalle
interviste potrebbe essere quindi sovrastimato, ma permane come un punto critico da meglio
analizzare.
Le non aderenti che hanno ricevuto l’invito (=180) non lamentano problemi di accessibilità.
Fra i motivi di non adesione, il 40% circa della voce “altro” comprende donne che non hanno
mai effettuato un pap-test nella loro vita o lo svolgono molto saltuariamente perché si sentono
bene o temono l’esito dell’esame; un altro 15% è da attribuirsi a donne isterectomizzate che
non ritengono utile la prevenzione. Sembra in complesso che i motivi di non adesione siano
legati ad abitudini preventive consolidate e alla percezione di essere già seguiti altrove, più
che alla sfiducia nel programma regionale. Bisogna considerare che l’89% circa delle non
aderenti ha effettuato il suo primo pap-test da più di 5 anni, e il 57% da più di 10. Fra queste
abitudini consolidate c’è quindi da evidenziare anche una certa saltuarietà dei controlli.
Un 5%, che non ha mai fatto pap-test in vita sua né con SERENA né fuori, è costituito da
donne timorose, o tranquille del proprio benessere, o sfiduciate nella prevenzione, o invalide e
affette da altre malattie che assorbono le maggiori attenzioni sulla salute.
Delle 162 aderenti a SERENA, è stata valutata la qualità percepita del servizio. Per il 92% il
luogo del prelievo era comodo, per il 99% anche l’orario era comodo; il 92% non lamenta
attese al consultorio. Il 65% delle donne dichiara che non voleva telefonare, e quelle che
hanno telefonato non hanno avuto difficoltà a trovare la linea telefonica libera nel 79% dei
casi; tutte dichiarano cortesia da parte delle centraliniste. Solo il 10% ha lamentato un pap-test
doloroso, e il 95% ha confermato al cortesia delle ostetriche e dei medici. L’attesa dell’esito è
stata lunga solo per il 15% delle donne; l’esito è risultato comunque chiaro per la quasi
totalità dei casi. Per l’81% delle donne la partecipazione del proprio medico di medicina
generale è stata attiva.
CONCLUSIONI
La copertura preventiva del nostro dipartimento è nella media regionale; la scarsa adesione a
SERENA è da attribuirsi ad abitudini preventive consolidate nel nostro territorio, anche se
non sempre corrette. E’ possibile innalzare l’adesione verificando la effettiva consegna degli
inviti e recuperando una importante quota di attività “spontanea” svolta nelle strutture
pubbliche.
59

Pier-giacomo Betta Filone tematico C1
Fattori di rischio biomolecolari nel cancro del polmone
Università del Piemonte Orientale
Dipartimento di Oncologia – S.O.C. di Anatomia Patologica e Citopatologia
PREMESSA
In considerazione della notevole riduzione del finanziamento ottenuto, rispetto a quello
richiesto il progetto di ricerca si è limitato agli aspetti preliminari inerenti la messa a punto
delle metodiche e lo svolgimento di un’attività di tipo pilota. Sta proseguendo, comunque la
raccolta dei campioni di tumore polmonare NSCLC e di soggetti con patologie respiratorie
benigne (asbestosi, silicosi, BPCO) e soggetti sani, fumatori e non.
METODI E RISULTATI
Dopo la richiesta di un consenso informato, ciascun soggetto é sottoposto a un prelievo di
sangue e a un questionario per raccogliere informazioni su variabili demografiche, abitudine
al fumo, esposizioni occupazionali e non, storia clinica. Il siero di questi soggetti è conservato
a –80°C.
Attività di laboratorio. E’ stata sviluppata una nuova tecnica che rende applicabile l’analisi
di metilazione a quantità minime di DNA, come quelle presenti nel siero dei pazienti affetti da
tumore. Il DNA è stato estratto da alcuni sieri congelati, successivamente è stato modificato
tramite trattamento con sodio bisolfito che converte le citosine non metilate in uracile,
lasciando inalterate quelle metilate permettendo, mediante l’utilizzo di due diversi set di
primers specifici, di amplificarle selettivamente (Methylation Specific PCR). Il DNA viene
poi amplificato mediante primers degenerati contenenti una sequenza specifica presente ad
alta frequenza nel genoma che ammettono l’amplificazione simultanea in loci multipli. Siamo
riusciti, dunque, ad amplificare il DNA dei sieri analizzati, in maniera tale da ottenerne una
quantità tale da poter effettuare numerose analisi di metilazione per diversi geni testati, quali
ad es RASSF1A, p16, DCR2, p73, ecc.
Abbiamo quindi completato la messa a punto di una nuova tecnica, METH-DOP-PCR, che
consente di realizzare un profilo di metilazione a partire da tracce di DNA presente, come
DNA circolante, nei fluidi biologici. Il lavoro, che è in corso di pubblicazione sulla rivista
“Laboratory Investigation”, si è articolato in diverse fasi.
1. la prima fase è consistita nel disegno dei primers, modificando quelli già precedentemente
utilizzati per la DOP-PCR standard. In questi nuovi primers abbiamo sostituito tutte le G
con A per l’amplificazione del DNA non metilato, mentre nel primer per il target metilato,
soltanto le G non seguite dalla C sono state sostituite dalle A. L’amplificazione del DNA
modificato con bisolfito di sodio, consiste in una reazione a 2 steps a diverse temperature
di annealing. Nel primo, a bassa stringenza, condotta a 25° il DNA target viene
uniformemente amplificato in maniera non specifica per aumentare la resa del DNA
“template”. Nel secondo step, a più alta stringenza, il DNA viene esponenzialmene
amplificato. Per determinare lo stato di metilazione di sequenze specifiche, aliquote di
DNA, amplificato mediante DOP, veniva sottoposto a PCR utilizzando primers e
condizioni di reazione identiche a quelle impiegate per l’MSP diretta. Abbiamo
dimostrato, mediante l’utilizzo di diluizioni seriali di DNA che la MET-DOP- PCR
60

ichiede una quantità di DNA di partenza, almeno 25 volte inferiore a quella occorrente
per una MSP standard.
2. Abbiamo in seguito dimostrato la fedeltà di amplificazione mediante DOP-PCR
confrontando il pattern di metilazione ottenuto mediante digestione con enzimi di
restrizione (BRE) di DNA amplificato mediante DOP-PCR e quello di DNA amplificato
mediante MSP e acquisendo, con le due tecniche, risultati pressochè identici.
3. Abbiamo inoltre valutato l’accuratezza di questa tecnica confrontando i risultati ottenuti
con MET-DOP-PCR e con MSP classica, sullo stato di metilazione di diversi geni in
campioni costituiti da linee cellulari e da frammenti di tessuto tumorale polmonare.
4. Abbiamo infine validato tale tecnica per alcuni geni (RASSF1A, TA-p73, deltaN-p73,
MGMT, CDKN2A, DCR2) sui sieri e sui corrispondenti tessuti tumorali di una decina di
pazienti. Durante questo studio preliminare, condotto essenzialmente a scopo
metodologico, nell’ambito dei vari geni analizzati abbiamo ottenuto risultati
particolarmente interessanti riguardanti lo stato di metilazione di P73.
Tali risultati, insieme ad altri (H. Uramoto et al. Clin. Cancer Res. 10; 6905, 2004),
recentemente pubblicati che potevano essere associati ai nostri, ci hanno spinto nella
direzione di approfondire ed estendere l’analisi focalizzandola, in particolare sullo stato di
metilazione di questo gene. P73, un gene che codifica una proteina con omologie
strutturali e funzionali alla p53, è stato identificato come gene oncosoppressore
particolarmente importante nel neuroblastoma in cui è stata anche identificata una forma
troncata del gene, deltaNp73, il cui prodotto è in grado di inattivare funzionalmente p53 e
TA p73, agendo pertanto da oncogene. Sebbene non sia stata osservata la presenza di
mutazioni o amplificazione genica è stata rilevata, nel tumore del polmone, un’aumentata
espressione di p73 che, fino a poco tempo fa, non era stata ricondotta ad una forma
specifica della proteina. Solo recentemente è stato pubblicato un lavoro (H. Uramoto et al.
Clin. Cancer Res. 10; 6905, 2004) in cui veniva dimostrata un’alta espressione, nei
NSCLC, specificamente attribuibile a deltaN-p73 peraltro correlata ad una peggiore
prognosi.
I nostri dati preliminari, mentre non evidenziavano un’alterazione dello stato di
metilazione di TA-p73, rivelavano un’alta frequenza de demetilazione di deltaN-p73,
suggerendo che l’espressione di deltaN-p73 potesse essere controllata dalla metilazione
del promotore di tale gene. Allo stato attuale, abbiamo analizzato lo stato di metilazione di
deltaN-p73 in 32 casi ottenendo un’ incidenza di casi in cui il gene presenta demetilazione
di circa il 75%.
Prospettiva futura di questo studio è rappresentata da:
• analisi immunoistochimica della proteina nelle sezioni di tessuto degli stessi tumori
analizzati per la metilazione allo scopo di capire se la demetilazione di P73 osservata è
associata all’overespressione della proteina;
• analisi dei dati di follow up per verificare l’eventuale esistenza di correlazione tra la
demetilazione di deltaN- P73 e la prognosi del paziente.
61

Alberto Biglino Filone tematico A1
Incidenza e fattori di rischio delle batteriemie nosocomiali cateterecorrelate
in Piemonte
A.s.l. 19 – Dipartimento di Medicina
Struttura Organizzativa Complessa di Malattie Infettive a Direzione Universitaria
CONTESTO E RAZIONALE
Le batteriemie rappresentano circa il 15% del totale delle infezioni nosocomiali, con
un’incidenza variabile tra 1,5 e 18,5 casi / 1000 ricoveri (da 26 a 67 casi / 1000 ricoveri nelle
Unità di Terapia Intensiva. In Italia non esistono dati di incidenza raccolti in modo
sistematico, a livello nazionale o regionale, sulle batteriemie nosocomiali. Si è ritenuto
pertanto opportuno avviare uno studio pilota della durata di 12 mesi sulle principali strutture
ospedaliere del territorio piemontese, avente quali obiettivi la valutazione del tasso di
incidenza delle batteriemie nosocomiali, lo studio dei fattori che ne favoriscono l’insorgenza
-con particolare attenzione al tasso di utilizzo dei dispositivi endovasali- e degli agenti
eziologici con relativi patterns di antibiotico-resistenza.
MATERIALI E METODI
A partire dal 1° ottobre 2004 è iniziata la raccolta prospettica dei dati relativi alle emocolture
eseguite nei 22 ospedali piemontesi aderenti allo studio, all’interno dei quali venivano
sorvegliate le seguenti aree di degenza: Rianimazione e Terapie Intensive Specialistiche
(UTIC + 1 Centro Ustionati) definite nel complesso come Unità di Terapia Intensiva (UTI);
Medicina d’Urgenza; Chirurgia Generale; Medicina Interna (incluse Nefrologia, Geriatria,
Ematologia se presenti) per un totale di 1982 posti letto su 4037 regionali dedicati alle aree
predette. Per la raccolta dei dati sono state utilizzate due schede: la prima relativa ai dati
clinico-anamnestici (segni di sepsi / shock settico, localizzazioni infettive d’organo/apparato,
condizioni immunodeprimenti, dispositivi endovasali, cateterismo urinario a permanenza,
recenti interventi chirurgici, tipo e durata di terapie antibiotiche precedenti) dei ricoverati
adulti cui si fosse reso necessario effettuare almeno una emocoltura (comprendente almeno 2
sets di flaconi) per la comparsa, oltre la 48 a ora dal ricovero, di febbre e/o segni clinicostrumentali
di sepsi o altro processo infettivo acuto non presente all’ingresso in ospedale; la
seconda, relativa a tutti i ricoverati nelle unità predette cui fosse stato posizionato un
dispositivo endovasale centrale, contenente quesiti sul tipo di dispositivo (estemporaneo /
impiantabile; tipo di materiale; numero di vie; impregnazione con sostanze antibatteriche),
sulle modalità di inserzione (sito di inserzione; elezione / urgenza) e sulla durata di utilizzo
(per gli estemporanei, si è considerato il tempo intercorso tra inserzione e rimozione; per gli
impiantabili il numero di giorni di ricovero in cui era stato utilizzato il dispositivo). Le
schede, erano inviate al Centro coordinatore al termine della degenza dei pazienti.
L’isolamento di germi da uno o più sets di emocoltura prelevati nell’ambito di ogni episodio
febbrile o settico è stata riferita a batteriemia o a inquinamento secondo i criteri dei Centers
for Disease Control eliminando ai fini del conteggio gli isolamenti ripetuti del medesimo
germe nell’ambito dello stesso episodio (ridondanze). In caso di presenza di dispositivo
endovasale, veniva sempre prelevato almeno un set di 2 flaconi dal dispositivo
contemporaneamente ad un analogo prelievo periferico, al fine di rilevare -ove possibile- la
correlazione tra il germe causa di batteriemia e il germe colonizzante il dispositivo in base ai
relativi tempi di crescita batterica
62

RISULTATI
Nell’arco dei dodici mesi di svolgimento dello studio, sono stati ricoverati nei 1982 postiletto
oggetto di sorveglianza 51.519 pazienti, per un totale di 515.617 giornate di degenza. In
tale periodo sono state elaborate 1667 schede di raccolta dati, corrispondenti ad altrettanti
episodi febbrili o clinicamente compatibili con batteriemia (v. criteri delineati nel paragrafo
precedente) nel corso dei quali sono state effettuate 2127 emocolture (comprendenti il
prelievo di almeno 2 “sets”, ciascuno dei quali costituito da un flacone per aerobiosi e uno
per anaerobiosi) sulle 5873 effettuate nel periodo di osservazione in tutti i reparti degli
ospedali oggetto di studio. I 1667 episodi si sono verificati in 1371 pazienti di età media 67 ±
15 anni (mediana 71 anni; range 14-99; maschi 798, femmine 573) che presentavano febbre
associata o meno a segni clinici di SIRS o danno d’organo (1082 casi, pari al 79%), sola
febbre (245 casi, 18%) o sintomi mal definiti (44 casi). Sono risultate positive 1105
emocolture delle 2127 eseguite, di cui 531 (48%) riferibili a inquinamenti, 114 (10,4%) non
significative in quanto effettuate unicamente da dispositivo, mentre 460 (41,6%) -secondo i
criteri prima specificati- corrispondevano a vere batteriemie dalle quali, eliminate le
ridondanze, sono stati isolati 711 ceppi batterici. Il 51% delle batteriemie si è verificato in
UTI (Rianimazioni, UTIC, Centro Ustioni), il 33% in strutture di Medicina, il 16% in
Chirurgia.
Incidenza. L’incidenza di batteriemie nosocomiali è risultata pari a 8,9 casi/1000 ricoverati
(37,5 nelle UTI; 4,99 nelle Medicine; 4,97 nelle Chirurgie Generali), corrispondenti a 0,89
casi /1000 giorni-paziente (3,9 nelle UTI; 0,45 nelle Medicine; 0,64 nelle Chirurgie).
Fattori di rischio: 180 batteriemie (39%) erano associate a presenza di un dispositivo
endovasale centrale, con incidenza pari a 2,37 casi /1000 giorni-dispositivo (2,98 nelle UTI;
1,81 nelle Chirurgie generali; 1,64 nelle Medicine. L’intensità media di utilizzo dei dispositivi
endovasali è risultata pari a 0,14 (0,90 nelle UTI). Escludendo i portatori di dispositivi
endovasali, si sono osservate 55 batteriemie (12%) in presenza di cateterizzazione urinaria a
permanenza, 16 (3%) in pazienti sottoposti a recente intervento chirurgico e 9 (2%) in
presenza di polmonite nosocomiale o ventilazione controllata quali unici fattori di rischio;
infine, in 41 pazienti (9%) nessun fattore di rischio era evidenziabile ad eccezione di
condizioni immunodeprimenti (diabete scompensato, cirrosi, neutropenia, emopatie,
immunosoppressori), mentre ai restanti 159 casi (35%) non è stato possibile attribuire una
causa univoca, essendo presenti più fattori tra quelli citati, o nessuno di essi. La mortalità
grezza osservata durante il ricovero nei pazienti studiati è risultata pari al 26,6% (365/1371),
contro il 10,1% (5162/50158) nei restanti pazienti, ricoverati nello stesso periodo nei
medesimi reparti, ma non valutati in quanto non rispondenti ai criteri di inclusione.
Dati microbiologici. Tra i 711 stipiti isolati dalle 460 batteriemie, figurano: 135 Stafilococchi
coagulasi-negativi (19%); 127 S. aureus (18%); 102 K-E-S (14%); 92 Candide (13%), di cui
72 C.albicans e 20 Candida “non albicans”; 61 E.coli (8,5%); 58 Pseudomonas spp (8%); 54
Enterococcus spp. (7,6%); 9 Streptococchi (Viridanti in massima parte) (1,2%); 6 Proteus
spp (0,84%), oltre a 67 altri germi (9,4%), tra cui 16 Citrobacter spp.; 10 Bacteroides
fragilis; 8 S. maltophilia; 6 A. baumanii.
Patterns di resistenza. Analizzando tutti i 711 ceppi batterici isolati da batteriemie, sono
risultati oxacillino-resistenti l’81% degli Stafilococchi coagulasi-negativi ed il 46% dei ceppi
di S. aureus; era invece resistente a Cefalosporine di III generazione (β-lattamasi a spettro
esteso) il 34% dei germi appartenenti al gruppo K-E-S e l’11,5% di E. coli; infine il 24% e il
29% di Pseudomonas spp. erano rispettivamente resistenti a Carbapenemi e a Ciprofloxacina.
Analisi genotipica dei ceppi isolati. Sono stati analizzati mediante PFGE (Pulsed-field Gel
Electrophoresis) 64 ceppi di S. aureus e S. epidermidis isolati da 32 delle 149 batteriemie
catetere-associate. In 26 di tali pazienti sono stati esaminati almeno 2 ceppi (rispettivamente
63

da sangue e da catetere), mentre in 6 pazienti era disponibile solo un ceppo per paziente. Dei
26 pazienti con isolamento di almeno 2 ceppi, i risultati PFGE sono stati i seguenti:
• in 21/26 pazienti (80.8%) i ceppi avevano uguale profilo (sangue – catetere), indice di
correlazione assoluta tra il germe colonizzante il dispositivo e quello in causa nella
batteriemia;
• in 4/26 pazienti (15.4%) i ceppi presentavano diverso profilo, e quindi non erano correlati;
• in 1 paziente il ceppo da emocoltura aveva profilo uguale a quello isolato da
broncoaspirato, ma diverso da quello isolato da catetere.
CONCLUSIONI
I dati presentati in estrema sintesi, riferiti all’intero periodo previsto di osservazione di un
anno, indicano che le batteriemie nosocomiali in Piemonte presentano un’incidenza globale
sensibilmente più elevata rispetto ai più recenti dati della letteratura (8,9 vs. 3,5) mentre il
tasso di incidenza in funzione della durata del ricovero si è rivelato di poco superiore (0,89 vs
0,6/1000 giorni-paziente). Nelle terapie intensive partecipanti al nostro studio, l’incidenza
(37/1000 ricoveri; 3,9/1000 giorni-paziente) si è rivelata simile o lievemente inferiore rispetto
ai dati del sistema NINSS mentre nei restanti reparti si segnala una sostanziale
sovrapponibilità. Per ciò che concerne le batteriemie CVC-associate, benchè il dato di
incidenza osservato (2,7/1000 giorni-catetere) sia comparabile con quello della letteratura, si
rileva nella nostra casistica una differenza di 1,5 volte tra il tasso riscontrato in reparti
intensivistici e nei reparti medico-chirurgici, a fronte di un tasso di utilizzo dei dispositivi
endovasali cinque volte superiore nelle UTI rispetto alle altre strutture: è dunque ipotizzabile
una meno attenta gestione delle linee venose centrali nei reparti non intensivistici. In ogni
caso, i nostri dati confermano il ruolo fondamentale dei dispositivi endovasali come fattori di
rischio di batteriemie nosocomiali (40% dei casi); inoltre l’analisi molecolare dei ceppi di
Stafilococco ha dimostrato la stretta correlazione (80% di identità) tra i germi isolati dai
dispositivi e dal sangue periferico. Emerge infine come un eccesso di rischio di batteriemia
nosocomiale sia correlabile a fattori diversi dai dispositivi centrali; appare rilevante il ruolo
del cateterismo urinario a permanenza, cui risulta imputabile il 12% degli episodi
batteriemici verificatisi in pazienti privi di qualsiasi altro fattore di rischio, ed in misura
minore (9% dei casi) la presenza, quale unico fattore di rischio, di comorbidità (diabete
scompensato, alcolismo, tossicodipendenza, insufficienza renale cronica, cirrosi, asplenia,
trapianto organo / midollo, neutropenia; terapie immunosoppressive). Le altre pratiche
invasive correlate a batteriemia (interventi chirurgici o ventilazione meccanica), come pure la
presenza di gravi infezioni concomitanti in altre sedi (polmoniti nosocomiali, infezioni di
cute e parti molli) si sono rivelate di scarsa importanza quali unica fonte di batteriemia; esiste
invece una rilevante proporzione (35%) di pazienti in cui la batteriemia non è riconducibile a
specifici fattori di rischio, ma al fatto stesso di essere ricoverati. Per ciò che riguarda i dati
microbiologici, si segnala l’importanza preminente di Stafilococchi ed altri Gram-positivi tra
gli agenti causali (responsabili di più del 50% degli episodi batteriemici, con il 46% dei ceppi
di S. aureus meticillino-resistenti), oltre alla preoccupante frequenza di Enterobatteri
produttori di ß-lattamasi a spettro esteso, resistenti a Cefalosporine di III generazione, e di
Pseudomonas resistenti a Carbapenemi e Ciprofloxacina. Particolare allarme suscita l’elevata
frequenza di fungemie da Candida (un quarto delle quali sostenute da Candide “nonalbicans”),
che si collocano al quarto posto in ordine di importanza dopo S. aureus, CoNS e
Klebsiella / Enterobacter quali agenti eziologici, da correlare con l’intensità e durata di
utilizzo dei chemioantibiotici e con altri fattori di rischio quali la nutrizione parenterale
totale.
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Elisabetta Bignamini Filone tematico D2
Micobatteri non-tubercolari e Fibrosi Cistica: indagine di prevalenza e
studio caso-controllo retrospettivo
Azienda Ospedaliera O.I.R.M S. Anna
Centro di Riferimento Regionale Fibrosi Cistica Piemonte e Valle D’Aosta
IDENTIFICAZIONE DEL CAMPIONE
I soggetti partecipanti a questo studio sono stati selezionati tra tutti pazienti affetti da Fibrosi
Cistica (FC) afferenti al Centro di Riferimento Regionale Fibrosi Cistica Piemonte e Valle
d’Aosta - OIRM-S.Anna - Torino. Come principale criterio di inclusione è stata utilizzata la
capacità di produrre spontaneamente un campione valido di escreato. Sono stati identificati 90
pazienti con età superiore ai 6 anni, nati entro il 1998 (47 femmine e 43 maschi).
DETERMINAZIONE DEI PARAMETRI DI INTERESSE
Sono state analizzate le cartelle cliniche dei pazienti selezionati, le schede di controllo
periodico, le schede di controllo annuale e le schede di dimissione ospedaliera (SDO),
corrispondenti al periodo 1.1.2002-31.12.2004. Per ogni paziente sono stati analizzati i
seguenti parametri:
Irreversibili
a) Mutazioni genetiche del gene CFTR.
b) Stato di funzionalità pancreatica
c) Presenza di colonizzazione batterica cronica.
Reversibili (valutazione annuale)
d) terapia topica di mantenimento
e) terapia corticosteroidea (№ dei cicli e № dei giorni per ogni paziente)
f) terapia antibiotica(№ dei cicli e № dei giorni per ogni paziente).
g) Ricoveri Ospedalieri per Riacutizzazione Respiratoria o per altri motivi (№ di ricoveri e №
dei giorni per ogni paziente).
I dati ottenuti sono stati immessi in una base di dati su supporto elettronico. I pazienti
effettivamente inclusi nello studio sono 81 (41 femmine e 40 maschi), di nove soggetti non
erano disponibili i dati necessari e sufficienti da utilizzare nel nostro studio. Tra questi
soggetti, 40 erano in grado di produrre escreato in modo spontaneo e su di essi abbiamo
condotto l’indagine.
DETERMINAZIONI MICROBIOLOGICHE
Dal momento che non è possibile l’identificazione dei micobatteri non tubercolari presso il
laboratorio aziendale, è stato contattato il laboratorio dell’Ospedale Amedeo di Savoia, nella
persona della Dott.ssa Milano, che si è resa disponibile per l’esecuzione degli esami
microbiologici. La determinazione microbiologica comprende l’esame microscopico diretto e
colturale dell'escreato e la tipizzazione di specie dei Micobatteri. Il tempo necessario per
ottenere i risultati dell’ esame colturale è di circa 6 settimane. Tenuto conto della laboriosità
65

delle procedure diagnostiche e dei carichi di lavoro del laboratorio, non è possibile effettuare
più di tre determinazioni al giorno. Dal momento che per ogni paziente vengono sottomessi 3
campioni di escreato, si spediscono i campioni relativi ad un solo paziente ogni giorno
concordato per l’indagine. Contemporaneamente alla spedizione dei campioni si provvede
all’aggiornamento della base di dati elettronica con i seguenti dati:
a) Funzionalità respiratoria, al momento del prelievo del campione (CV, FEV1 e MEF50
valore assoluto e percentuale rispetto al teorico)
b) Stato nutrizionale al momento del prelievo del campione. (peso e altezza riferiti alle curve
di crescita teoriche)
RISULTATI
Finora sono stati analizzati i campioni di 36 soggetti dei 40 che producono escreato
spontaneamente. Due pazienti sono risultati positivi per la ricerca di NTM.
a) Il primo paziente, un maschio da 16 anni, aveva i tre esami microscopici negativi alla
ricerca di NTM, ma due esami colturali dell’escreato sono risultati positivi per
Micobacterium abscessus.
b) L’altro paziente, una femmina da 13 anni, aveva un esame colturale dell’escreato positivo
per Micobacterium fortuitum. Tutti gli altri esami sono risultati negativi.
Trattandosi di due specie diverse, è stata esclusa la possibilità che i pazienti abbiano
trasmesso l’infezione uno all’altro. I soggetti non sono stati messi sotto la terapia specifica,
perché non rispondevano ai criteri raccomandati dall’American Thoracic Society per
cominciare il trattamento e sono clinicamente asintomatici. I campioni dell’escreato di tutti gli
altri pazienti sono risultati negativi sia alla ricerca di NTM all’esame microscopico che a
quello colturale.
CONCLUSIONI
In considerazione di quanto sopra esposto, si può ipotizzare che per i nostri pazienti il rischio
d’infezione da NTM è basso. I casi risultati positivi sono stati messi sotto controllo periodico
per valutare l’evoluzione dell’infezione. In questo momento sono state poste le basi per una
sorveglianza continua, che permette di stimare l'incidenza dell'infezione nella popolazione
affetta da FC, di seguire nel tempo l'andamento del quadro clinico in termini di funzionalità
respiratoria, di stato nutrizionale e microbiologico nei soggetti infettati ed, infine, di valutare
il ruolo della trasmissione nosocomiale dell'infezione ed eventualmente di predisporre misure
preventive.
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Bartolomeo Biolatti Filone tematico B1
Effetti del trattamento con desametazone a dosi terapeutiche ed
anabolizzanti sul sistema immunitario del bovino
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Patologia Animale
CONTESTO E RAZIONALE
Il presente studio concepito come integrazione di un precedente progetto finanziato dalla
Regione Piemonte, rientra nel filone di ricerca che riguarda i trattamenti illeciti con
desametazone. Scopo di tale studio era evidenziare eventuali alterazioni a seguito di
trattamento con desametazone a dosi terapeutiche o anabolizzanti.
MATERIALI E METODI
A tal fine 32 vitelli a carne bianca di razza Frisona e/o Meticcia, allevati nelle medesime
condizioni di stabulazione sono stati divisi in 3 diversi gruppi:
• Gruppo K (13 capi) non trattati;
• Gruppo A (11 capi) trattato con desametazone a dosi terapeutiche (5 mg/capo IM per 2
somministrazioni a distanza di una settimana);
• Gruppo B (11 capi) trattato con desametazone a dosi anabolizzanti (0.4mg/capo/giorno
per via orale per 20 giorni).
Per valutare l’azione del corticosteroide sulla morfologia del timo e sullo stato immunitario
degli animali si è proceduto con la macellazione di 2 soggetti per gruppo ai tempi T0, T3, T7,
T14, T30, T52. Al momento della macellazione tutti i soggetti sono stati sottoposti ad esame
necroscopico. Tutti gli organi considerati potenziali bersagli dei corticosteroidi sono stati
pesati e fotografati. Da ciascun vitello sono stati prelevati campioni di timo, surrene, fegato,
prostata, ghiandole bulbo-uretrali e testicolo su cui sono state eseguite le analisi
istopatologiche di routine.
RISULTATI
Istologicamente, è stato osservato che, nei soggetti del Gruppo A al tempo T7, il timo, in
particolare la porzione toracica, presenta una atrofia diffusa della corticale ed un diradamento
della midollare. Al tempo T14 la riduzione della corticale risulta essere più marcata. La
situazione di normalità risulta essere completamente ripristinata al T52, ovvero 45 giorni dopo
l’ultima somministrazione. Nel gruppo B, si osserva una lieve atrofia iniziale a livello
corticale al T14. Al T52 il timo non presenta nessun tipo di lesione o alterazione riconducibili
a trattamento. Non sono state riscontrate differenze statisticamente significative raffrontando i
tre gruppi ad ogni tempo. E’ stato invece rilevato un trend statisticamente significativo nel
tempo sia nel gruppo A (P=0,0222), come nel gruppo B (P=0,0222).
I risultati dell’analisi citofluorimetrica del primo prelievo di sangue periferico eseguito sui
bovini di controllo, sono stati utilizzati per l’ottimizzazione della metodica e dei protocolli di
acquisizione ed analisi e per ottenere valori basali. I campioni di sangue periferico e di timo,
adeguatamente processati e marcati con anticorpi monoclonali specifici per il bovino e diretti
67

contro antigeni di superficie leucocitari e linfocitari (CD1, CD3, CD5, CD6, CD4, CD8 WC1,
CD21, CD14, CD18, CD11b), sono stati acquisiti al citofluorimetro. L’analisi dei dati è
tuttora in corso.
Per quanto concerne la migrazione dei neutrofili è stato osservato che a seguito di
stimolazione con PMA i neutrofili al tempo T7 presentavano una diminuzione della
migrazione, statisticamente significativa (P=0,0397) nei soggetti del gruppo B rispetto ai
soggetti di controllo. Ad una settimana di distanza (T14) la percentuale di cellule migrate
aumenta in entrambi i gruppi sperimentali. Tale andamento, indicativo di una situazione di
normalità, permane nel tempo fino al termine dell’esperimento. Lo stesso profilo è stato
osservato a seguito di stimolazione con ZAS, anche in questo caso al tempo T7 si osserva una
diminuzione statisticamente significativa (P=0.0238) nei soggetti del gruppo B.
In merito all’apoptosi rilevata mediante citofluorimetria, in entrambi i gruppi sperimentali si
rileva un aumento delle cellule apoptotiche al T14 rispetto ai soggetti di controllo. Al T30 la
quantità di cellule apoptotiche risulta simile in tutti i soggetti in esame. La ricerca di cellule
apoptotiche mediante colorazione TUNEL su sezioni istologiche rileva un aumento
dell’apoptosi già al tempo T3, ovvero dopo solo tre giorni dall’inizio del trattamento sia nei
soggetti appartenenti al gruppo A, trattati per via i.m., sia nei soggetti del gruppo B, trattati
per os. Nonostante non sia stato possibile rivelare differenze statisticamente significative a
causa dell’esiguo numero di capi per ciascun gruppo, questo aumento risulta essere molto
elevato, soprattutto nel gruppo B, dove raggiunge una percentuale del 222,5% rispetto ai
controlli. Al tempo T7 l’incremento rispetto al controllo continua ad essere molto elevato in
entrambi i gruppi di trattamento, anche in questo caso l’apoptosi risulta essere più accentuata
nei soggetti appartenenti al gruppo B, dove raggiunge una percentuale di aumento del 400%.
Al T14 si continua ad avere un aumento della percentuale di apoptosi in entrambi i gruppi,
anche se leggermente inferiore rispetto al tempo di macellazione precedente. In questo caso il
gruppo B presenta una percentuale di area apoptotica leggermente inferiore rispetto al gruppo
A. Al T32 l’apoptosi risulta essere notevolmente inferiore in entrambi i gruppi; nel gruppo A
si può osservare una diminuzione rispetto ai controlli. Questa diminuzione persiste anche nel
tempo T52, dove la percentuale di area positiva nei soggetti trattati appartenenti ad entrambi i
gruppi sperimentali risulta simile a quella dei soggetti di controllo.
In relazione ai dati ottenuti nello studio delle concentrazioni delle IgG determinate mediante
Bovine IgG VET-RID kit (Bethyl Lab., Montgomery, AL, USA), ai tempi 0, 3, 7, 14, 31, 52,
possiamo dire che non sono state evidenziate differenze statisticamente significative (test di
Kruskall Wallis) nella produzione di immunoglobuline durante il periodo sperimentale, come
confermato in letteratura da diversi autori.
CONCLUSIONI
In conclusione tutti i dati ottenuti fanno pensare che la somministrazione di desametazone a
dosi anabolizzanti in vitelli a carne bianca induce modificazioni più marcate rispetto al
trattamento con dosi terapeutiche. Questa ipotesi sembra essere sostenuta sia dalla ridotta
capacità dei neutrofili di rispondere ad uno stimolo esterno, sia dalla maggiore apoptosi a
carico del timo dei soggetti del gruppo B: A livello istologico si osservano delle modificazioni
solo a carico del principale organo bersaglio ovvero il timo. In questo caso l’atrofia risulta
maggiore nei soggetti appartenenti al gruppo trattato per via intramuscolare.
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Giuseppe Boccuzzi Filone tematico A2
Individuazione precoce di markers ematici di danno ossidativo nel
diabete mellito.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Fisiologia Clinica
CONTESTO E RAZIONALE
Il diabete, la cui prevalenza è aumentata nel mondo occidentale dal 4 all'8% negli ultimi dieci
anni, in rapporto al mutato stile di vita, è caratterizzato da elevata morbidità cardiovascolare,
con mortalità coronarica molto più alta che nella popolazione non diabetica, anche in pazienti
senza storia clinica di malattia aterosclerotica. Recenti evidenze sperimentali hanno
dimostrato che i radicali dell'ossigeno attivano le principali vie metaboliche che portano al
danno tessutale e sono coinvolti nei meccanismi molecolari alla base dell'insulino-resistenza:
vi è ormai accordo generale sul ruolo primario del danno ossidativo nelle complicanze
croniche macro- e micro-vascolari del diabete. Tuttavia, a fronte di evidenze sperimentali
incoraggianti, i trials clinici finora condotti con antiossidanti non hanno portato a risultati
conclusivi. L'individuazione precoce e la misurazione dello sbilanciamento ossido/riduttivo è
passaggio preliminare indispensabile per costruire trials clinici più accurati che valutino la
reale efficacia del trattamento antiossidante.
OBIETTIVO
L’obiettivo del progetto era duplice: individuare biomarkers sensibili e di facile esecuzione in
grado di misurare nel paziente diabetico lo stato ossido/riduttivo, e definire in quale misura le
modificazioni dei biomarkers rilevabili nel compartimento ematico riflettano l'equilibrio
redox tessutale e la reale presenza di danno ossidativo.
MATERIALI E METODI
Nel modello animale di diabete sperimentale (ratti maschi Wistar resi diabetici mediante una
singola iniezione di STZ (50 mg/Kg i.v.)) è stato valutato lo stato ossidativo nel
compartimento ematico ed in tessuti bersaglio del danno ossidativo (encefalo, rene), i markers
di perossidazione lipidica e di danno cellulare, la produzione di mediatori del danno
ossidativo e l'attivazione delle vie intracellulari di segnale ad effetto lesivo. La valutazione
dell'equilibrio ossidativo nel compartimento ematico è stata effettuata sul plasma e sui
mononucleati circolanti (PBMCs). I ROS sono stati determinati con metodo fluorimetrico
(Ravindranath, 1994) e la generazione di H2O2 spettrofotometricamente (Zoccarato 1993); il
contenuto degli antiossidanti, glutatione ridotto (GSH) mediante una cinetica enzimatica
(Owens & Belcher,1965) e La SOD, con un metodo cinetico, descritto da Flohe ano Otting
(1984); i prodotti finali della perossidazione lipidica, in termini di 4-idrossinonenale (HNE)
con il metodo descritto da Esterbauer (1986); il TNFalfa ed i sui recettori solubili (sTNF-RI
ed sTNF-RII) tramite analisi immunoenzimatica (ELISA).
Sui PBMCs è stata inoltre valutato:
1. il contenuto di ATP e l'attività dell'ATPasi Na/K-dipendente;
69

2. l'espressione del fattore di trascrizione nucleare NFkB, i suoi livelli citosolici e i livelli
citosolici del suo inibitore fisiologico IkB.
In questa fase della sperimentazione è stata definita la corrispondenza fra le modificazioni dei
parametri di ossidazione rilevabili nel sangue e l'entità del danno tessutale indotto dalle specie
radicaliche nel diabete sperimentale.
RISULTATI
I risultati ottenuti sono stati riportati in sede congressuale e sono stati oggetto di
pubblicazione: - R. Mastrocola, F. Restivo, I. Vercellinato, O. Danni, E. Brignardello, M.
Aragno, G. Boccuzzi. Oxidative and Nitoxidative Stress in Brain Mitichondria of Diabetic
Rats. J. Endocrinology 186, 00-00, 2005. I.F. 3.319 - M. Aragno, R. Mastrocola, M G
Catalano, E. Brignardello, O. Danni, G. Boccuzzi. Oxidative Stress Impairs Skeletal Muscle
Repair in Diabetic Rats. Diabetes 53, 1082-1088, 2004. I.F. 8.848
La seconda parte della ricerca era definire, in pazienti diabetici selezionati per durata e gravità
della malattia, i tempi di comparsa e l'andamento dei markers ematici di squilibrio
ossido/riduttivo per individuare quelli più sensibili e più specifici come indicatori di danno
ossidativo tessutale. Definita la corrispondenza fra le modificazioni dei parametri di
ossidazione rilevabili nel sangue e l’entità del danno tessutale indotto dalle specie radicaliche
nel diabete sperimentale (ratti con diabete indotto da streptozotocina), è stato dato l’avvio ad
uno studio pilota condotto su pazienti con diagnosi certa di diabete mellito di tipo 2
(American Diabetes Association, 2004), in esclusivo trattamento dietetico, privi di altri
elementi caratterizzanti la sindrome metabolica (obesità, ipertensione arteriosa, dislipidemia)
e senza interferenze farmacologiche, per definire un pannel il più completo possibile dei
parametri ematici -plasma e mononucleati circolanti (PBMC)-:
a) di insulino-resistenza;
b) di stress ossidativo;
c) di attivazione delle vie metaboliche che portano al danno vascolare (AGE/RAGE);
d) di attivazione di fattori di trascrizione redox-sensibili che modulano l’espressione genica
di citochine pro-infiammatorie;
e) di flogosi;
f) di danno endoteliale.
I risultati già ottenuti hanno consentito di validare, nell’uomo, l’utilizzo di markers ematici di
squilibrio ossido/riduttivo, di flogosi e di danno endoteliale sensibili e specifici che
permettano la corretta stratificazione del rischio cardiovascolare individuale nel paziente
diabetico e di definire alcune delle vie di trasmissione del segnale lesivo e la sequenza di
eventi che portano al danno vascolare nel diabete. La prosecuzione del protocollo di studio,
già stato sottoposto al Comitato Etico Regionale ed approvato Comm. Reg. Cod: AOGIBAT-
II-2004-003, ha lo scopo di valutare l’efficacia del trattamento con il deidroepiandrosterone
(DHEA) nel modificare i parametri ematici di stress ossidativo, i dati funzionali
dell’endotelio, lo stato infiammatorio ed il grado di insulino-resistenza. L’effetto antiossidante
del DHEA coinvolge meccanismi complessi non legati alla semplice attività “scavenger”: sia i
dati ottenuti in vitro ed in modelli sperimentali animali, sia la segnalazione che nell’uomo che
la somministrazione orale di DHEA migliora significativamente la sensibilità all’insulina e la
funzione endoteliale (Kawano et al., 2003; Villareal & Holloszy, 2004; Dhatariya et al.,
2005), rappresentano il presupposto per la sua utilizzazione. La documentazione dell’efficacia
del DHEA, steroide endogeno privo, alle dosi impiegate, di effetti collaterali rappresenterà il
presupposto per la sua utilizzazione in trial clinici che prevedano un intervento farmacologico,
in associazione ai presidi già conosciuti (alimentazione, attività fisica, ecc.), nella prevenzione
del danno ossidativo da iperglicemia cronica.
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Filippo Bogetto Filone tematico A5
Sintomatologia depressiva e tipizzazione clinica della schizofrenia in fase
acuta: implicazioni per la prevenzione
Università Degli Studi di Torino
Dipartimento di Neuroscienze – Sezione di Psichiatria
CONTESTO E RAZIONALE
La schizofrenia è un disturbo cronico clinicamente caratterizzato da sintomi positivi, negativi
e cognitivi. Inoltre, nel suo decorso spesso insorgono quadri depressivi: sintomi depressivi
quali prodromi di un episodio psicotico, sintomi depressivi durante l’episodio psicotico o dopo
la sua remissione e, infine, sintomi depressivi quali effetti collaterali di un trattamento cronico
con farmaci antipsicotici. La valutazione della depressione in corso di schizofrenia ha
rilevanza clinica per il suo peso sulla prognosi, che sembra dipendere dallo stadio della
malattia. La presenza della sintomatologia depressiva durante la fase acuta sarebbe associata
ad una prognosi favorevole e alla remissione della sintomatologia acuta; viceversa, la
comparsa durante il decorso cronico della schizofrenia sarebbe associata ad una maggiore
gravità del quadro clinico complessivo e ad una compromissione funzionale più accentuata.
Tali osservazioni hanno avuto importanti ricadute pratiche: hanno indotto la ricerca di
strumenti più mirati di rilevazione e di quantificazione della sintomatologia depressiva in
corso di schizofrenia indipendentemente dalle fasi del disturbo e lo studio dell’impatto di
questi nuovi farmaci sui sintomi depressivi.
OBIETTIVO
L’ipotesi di lavoro che ci siamo proposti è la caratterizzazione clinico-nosografica e
neurocognitiva della schizofrenia in fase acuta, la risposta al trattamento farmacologico, che
verrà impostato in base a quanto suggerito in letteratura, e l’individuazione di elementi
predittori dell’outcome. In particolare abbiamo valutato la presenza di sintomi depressivi e
psicotici (deliri e allucinazioni) come fattori predittivi sugli aspetti neurocognitivi e
funzionali.
MATERIALI E METODI
Sono stati reclutati 70 soggetti schizofrenici, 34 in fase acuta e 36 in fase stabile in accordo
con i criteri del DSM-IV-TR, presso SCDU Psichiatria, ASO S.Giovanni Battista di Torino,
SCDO Psichiatria, ASO S. Giovanni Battista di Torino e Casa di Cura “Villa Cristina”.
Gli strumenti di valutazione comprendono: intervista semistrutturata per la raccolta dei dati
demografici, anamnestici e clinici generali; intervista strutturata per la diagnosi di schizofrenia
secondo il DSM-IV (SCID); scale di valutazione e batterie neuropsicologiche specifiche per
un’indagine più ampia possibile su tutte le dimensioni sintomatologiche (distorsione della
realtà, impoverimento ideomotorio, disorganizzazione, affettività), sulle funzioni cognitive
(memoria, attenzione, capacità di astrazione, funzioni visuo-percettive, visuo-costruttive),
sulla depressione (Calgary Depression Scale for Schizophrenia) e sul funzionamento globale
(sociale, occupazionale e qualità di vita). La terapia (neurolettici o antipsicotici atipici ed
eventuale associazione con un inibitore selettivo del reuptake della serotonina) è stata scelta
sulla base delle caratteristiche cliniche/neurocognitive dei soggetti.
71

RISULTATI
Nei pazienti stabili, nel modello di regressione logistica lineare con la CDSS come variabile
dipendente, 4 variabili sono risultate significativamente correlate alla sintomatologia
depressiva: le misure di outcome funzionale percepito dal soggetto (QLS, DISS), una misura
di outcome funzionale valutato dall'operatore (SOFAS) e il genere, con una maggiore severità
di sintomi depressivi nel genere maschile. Abbiamo valutato le correlazioni tra sintomi
psicotici (deliri e allucinazioni) e funzioni cognitive (astrazione e flessibilità cognitiva,
memoria verbale e visuo-spaziale, vigilanza e attenzione, e abilità visuo-spaziali). La
distorsione della realtà è una dimensione psicopatologica grave presente nelle fasi acute.
Applicando il test statistico di regressione lineare per la ricerca di variabili che potessero avere
un valore predittivo nei confronti dei deliri e delle allucinazioni, abbiamo individuato nei
pazienti schizofrenici stabili due variabili come principali predittori della sintomatologia
delirante, la capacità di astrazione/flessibilità cognitiva e l’attenzione, e una variabile per la
sintomatologia allucinatoria, la capacità di astrazione/flessibilità cognitiva. Nei pazienti acuti
le allucinazioni sono correlate alla memoria verbale (numero di intrusioni).
La sintomatologia depressiva è risultata significativamente più grave nei pazienti in fase acuta.
La gravità della depressione è correlata alla consapevolezza di malattia e alla consapevolezza
della necessità di un trattamento in fase acuta, mentre in fase stabile la sintomatologia
depressiva risulta correlata alla consapevolezza delle conseguenze sociali. I dati preliminari,
attualmente disponibili sul trattamento, suggeriscono che i pazienti trattati con gli antipsicotici
atipici presentano un miglioramento dei sintomi depressivi e ansiosi più marcato rispetto ai
pazienti trattati con i neurolettici. I risultati di questa ricerca suggeriscono l’importanza
dell’identificazione della depressione, in quanto fattore rilevante sul funzionamento sociale
dei pazienti e sulla loro consapevolezza di malattia, da cui l’opportunità di un adeguato e
tempestivo intervento terapeutico.
PUBBLICAZIONI
1. Rocca P., Bellino S., Marchiaro L., Patria L., Rasetti R., Bogetto F. La depressione nel
corso della schizofrenia: indagine su un campione di soggetti schizofrenici con l’utilizzo
di scale di valutazione specifiche. Giornale Italiano di Psicopatologia Vol. 9 (2):142-148,
2003.
2. Bellino S., Rocca P., Patria L., Marchiaro L., Rasetti R., Di Lorenzo R., Paradiso E.,
Bogetto F. Relationships of age at onset with clinical features and cognitive functions of a
sample of schizophrenic patients. Journal of Clinical Psychiatry 65: 908-914, 2004.
3. Bogetto F., Rocca P. Attuali orientamenti in tema di diagnosi e trattamento della
schizofrenia. Minerva Psichiatrica, Edizioni Minerva Medica 45:109-113, 2004.
4. Marchiaro L., Lenoci F., Longo P., Montemagni C., Rigazzi C., Rocca P., Bogetto F.
Naturalistic, retrospective comparison between atypical antipsychotics and depot
neuroleptics in schizophrenic patients. The International Journal of
Neuropsychopharmacology 7, Suppl. 1: S235, 2004.
5. Marchiaro L., Bellino S., Marino F., Rasetti R., Rivoira E., Rocca P., Bogetto F.
Caratteristiche della depressione in soggetti schizofrenici paranoidi e non paranoidi.
Giornale Italiano di Psicopatologia, Vol. 10 Suppl.1: 251, 2004.
6. Bogetto F., Rocca P. Depression and quality of life in the early corse of schizophrenia.
World Psychiatry 3, Suppl.1:163, 2004. 7. Rocca P., Bellino S., Marchiaro L., Patria L.,
Rasetti R., Bogetto F. Negative and depressive symptoms in schizophrenia: different
effects on clinical features. Comprehensive Psychiatry (in press).
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Gianni Bona Filone tematico C1
Ruolo dell'analisi genetica e biochimica di ghrelina nella valutazione di
obesi semplici e con sindrome di Prader-Willi.
Università del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”
Dipartimento di Scienze Mediche
CONTESTO E RAZIONALE
La sindrome di Prader-Willi (PWS) è una della cause genetiche più comuni di obesità. Alcuni
studi hanno dimostrato che i soggetti con PWS presentano a digiuno livelli di ghrelina più
elevati rispetto a quelli di soggetti con obesità semplice. In questi pazienti l’aumento delle
concentrazioni di ghrelina totale possono provocare la stimolazione dell’appetito attraverso il
circuito ipotalamico NPY/AGRP, ma i meccanismi coinvolti restano sconosciuti.
OBIETTIVO
Il presente progetto ha lo scopo di valutare se il quadro fenotipico dei soggetti affetti da PWS
possa essere influenzato da modificazioni nella secrezione della ghrelina totale ed acilata o da
alterazioni genetiche a livello delle regioni codificanti e regolative del gene e di stabilire se
queste alterazioni siano tipiche della PSW o se siano presenti anche in soggetti affetti da
obesità semplice.
METODI E RISULTATI
In una prima fase della ricerca sono stati reclutati presso l’Istituto Auxologico Italiano di
Piancavallo, presso l’Ospedale Pediatrico del “Bambin Gesù” di Roma e presso l’Ospedale
Gaslini di Genova 30 soggetti affetti da PWS di età compresa fra i 2 e i 32 anni (13 bambini e
17 adulti; 18 maschi e 12 femmine) e 90 soggetti di pari età e sesso affetti da sovrappeso o
obesità semplice. Nel primo anno di attività sono stati raccolti per ciascun soggetto i dati
anamnestici (età, sesso, andamento dell’accrescimento staturo-ponderale), antropometrici
(statura, peso e stadi puberali) e sono stati eseguiti prelievi ematici a digiuno e dopo pasto
standard di circa 290 kcal (200 ml di latte, 6 g di saccarosio e una brioche standard) per i
dosaggi di ghrelina totale ed acilata e per l’estrazione del DNA genomico.
I soggetti sono stati definiti obesi in base alle carte italiane di riferimento per il body mass
index. Di tutti i soggetti con PWS sono stati raccolti dati sul cariotipo, sulla presenza di altri
disordini endocrinologici, sul tipo e l’efficacia della dietoterapia in corso. I campioni di
plasma per il dosaggio della ghrelina totale ed acilata, sono stati conservati a -80°C fino al
momento della valutazione. La concentrazione di ghrelina totale è stata misurata tramite
metodo RIA, dopo estrazione dei peptidi su colonnine C18. I livelli di ghrelina nella forma
acilata sono stati determinati mediante dosaggio competitivo radioimmunometrico che utilizza
un anticorpo specifico per la forma biologicamente attiva del peptide.
La secrezione basale della ghrelina totale era 1,8 volte più elevata nei soggetti PWS rispetto ai
soggetti obesi/sovrappeso di controllo. Normalmente i livelli plasmatici di ghrelina
diminuiscono dopo pasto; nei 30 PWS studiati questa diminuzione è risultata statisticamente
significativa solo nei bambini e non nei soggetti adulti.
73

I livelli di ghrelina totale a digiuno erano significativamente più elevati nei 13 bambini PWS
rispetto ai 17 adulti PWS, mentre non c’erano differenze dopo pasto standard. Nessuna
differenza legata all’età era invece presente per quanto riguarda la secrezione di ghrelina
acilata.
Nel gruppo dei bambini PWS, 2 casi sono risultati normopeso e 11 obesi, mentre negli adulti
PWS, solo un caso era normopeso e tutti gli altri presentavano un’obesità grave. Vista la bassa
numerosità dei soggetti normopeso, non è stato possibile effettuare confronti tra i livelli di
ghrelina dei soggetti normopeso ed obesi.
L’analisi molecolare del gene della prepro-ghrelina ha permesso di riscontrare nei soggetti
affetti da PWS la presenza di due polimorfismi già noti: la sostituzione C214A, all’interno
dell’esone 2, in condizione di eterozigosi in 4 soggetti (Leu72Met) e in condizione di
omozigosi in un soggetto (Met72Met) e la sostituzione A269T, all’interno dell’esone 3, in
condizione di eterozigosi (Gln90Leu) in 2 soggetti. La sostituzione Arg51Gln a livello del 28°
aminoacido della ghrelina matura non è stata riscontrata in alcun soggetto. Le frequenze
alleliche di questi polimorfismi all’interno del gruppo dei PWS sono risultate sovrapponibili a
quelle del gruppo dei soggetti affetti da soprappeso/obesità semplice con il mantenimento
dell’equilibrio di Hardy-Weinberg.
Nel secondo anno di attività è stata condotta l’analisi molecolare del promotore e le due UTR
(Untranslated Region) della pre-pro-ghrelina. All’interno dell’ UTR-3’, dell’ UTR-5’ e della
parte del promotore che dovrebbe contenere i siti di riconoscimento per i fattori di inizio della
trascrizione e della traduzione, si sono riscontrati 2 polimorfismi: lo SNP 26802, che scambia
una A con una C, posizionato a -501 bp da AUG (dove A=+1) e lo SNP 27647, che scambia
una G con una A, posizionato a -604 bp dal sito di inizio della traduzione.
Il polimorfismo SNP 26802 (A→C) è risultato in equilibrio di Hardy-Weinberg nei due gruppi
analizzati, essendo le frequenze alleliche di C pari a 36% negli obesi e di 37% nei PWS. Il
polimorfismo SNP 27647 (G→A), invece, è fortemente associato con il gruppo dei PWS, che
mostra una frequenza allelica di A pari al 67% rispetto al gruppo di controllo dei soggetti
obesi nei quali la frequenza dell’allele A è pari al 55%.
Non si è evidenziata alcuna associazione significativa tra concentrazione plasmatica di
ghrelina basale e a digiuno e presenza di polimorfismi sia delle regioni codificanti che
regolative del gene della preparo-ghrelina.
Sono in corso ulteriori studi volti a valutare le frequenza alleliche dei vari polimorfismi in
soggetti normopeso e l’analisi molecolare del recettore della ghrelina, che potrebbe essere
implicato nella regolazione del metabolismo energetico e del senso di sazietà.
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Renato Bonardi Filone tematico A3
Le epatiti tossiche tra i lavoratori dell’industria plastica: indagine
epidemiologica nell’area torinese
ASO – San Giovanni Battista
Dipartimento Medico – Chirurgico -Malattie dell’Apparato Dogerente e della Nutrizione
OBIETTIVO
Scopo del lavoro è valutare se l’esposizione a sostanze plastiche e solventi è correlabile con
segni di epatopatia presenti in soggetti esposti o se tale danno va attribuito ad altre cause
(metaboliche, infettive, iatrogene ecc.) A tale scopo sono stati sottoposti a screening di
funzionalità epatica tutti i dipendenti di uno stabilimento che opera nella lavorazione di
materiali plastici, in particolare nella produzione di volanti per autovetture. I materiali
impiegati in tale settori sono principalmente isocianati, polioli e solventi. Soprattutto questi
ultimi hanno una azione tossica a livello epatico principalmente attraverso l’esposizione
inalatoria. L’impiego di aspiratori e mezzi di protezione individuali, nonché i monitoraggi
ambientali hanno ridotto in modo drastico i rischi lavorativi.
MATERIALI E METODI
Sono stati valutati 205 dipendenti, di cui 35 impiegati (non esposti e quindi considerati gruppo
controllo), la cui attività si svolge in locali separati da quelli di produzione e 170 operai
esposti alle sostanze chimiche per 8 ore al giorno in modo continuativo per 18 mesi.
Tutto il personale è stato sottoposto a:
• anamnesi familiare;
• farmacologia;
• valutazione del consumo di alcool;
• esame clinico comprendente determinazione del BMI e della circonferenza addominale;
• Esami di gt, glicemia, creatininemia.
I soggetti che presentavano alterazione anche di un solo parametro di funzionalità epatica
(AST, ALT, gt) o epatomegalia alla visita medica venivano sottoposti ai seguenti ulteriori
accertamenti:
• Ecografia addome superiore;
• Anti HCV, HbsAg;
• Insulinemia;
• Colesterolemia;
• Trigliceridemia;
• Ferritinemia;
• EMA (antiendomisio);
• AMA.
75

Al primo controllo 52 soggetti di cui 45 esposti alle sostanze chimiche e 7 non esposti
presentavano alterazioni degli indici di funzionalità epatica. Il gruppo dei non esposti non
evidenzia, al secondo livello di accertamenti, marcatori virali o di autoimmunità ma, presenta
alterazione dell’indice di HOMA (calcolato con la seguente formula: glicemia x insulinemia
diviso 405). Viene accertata la diagnosi di steatosi epatica in tutti i soggetti, in 2 dei quali
viene attribuita a consumo di alcool superiore ai 60g di alcool/die e a dislipidemia
rispettivamente. I soggetti venivano invitati a seguire una dieta ipocalorica di 1400 calorie, ad
abolire le bevande alcoliche e a seguire attività fisica per almeno 4 ore alla settimana.
Dopo 6 e 12 mesi venivano ricontrollati i parametri bioumorali, BMI e circonferenza
addominale. I pazienti che raggiungevano un calo ponderale di almeno il 5% del loro peso
ottenevano la riduzione o la normalizzazione degli indici di funzionalità epatica. Il gruppo dei
soggetti esposti è costituita da 130 uomini e 55 donne. I soggetti esposti (in totale 45) che
presentano alterazioni degli indici di funzionalità epatica o epatomegalia sono stati
ulteriormente indagati con i seguenti accertamenti:
• Ecografia addome superiore;
• AntiHCV, HBsAg,
• Insulinemia,
• colesterolemia,
• trigliceridemia, ferritinemia,
• EMA(antiendomisio),
• AMA.
Dagli accertamenti eseguiti sono emersi i seguenti risultati:
• 3 casi di infezione da HCV;
• 1 casi di infezione da HBV;
• 1 caso di malattia celiaca;
• 12 casi di consumo di alcol costante da anni, da 30 ai 60 g;
• 4 casi di consumo alcolico di oltre i 60 g die;
• 24 presentavano positività del test di Homa associato a BMI superiore a 25.
I soggetti che presentavano alterazioni degli enzimi epatici o epatomegalia confermata
ecograficamente e che operavano a diretto contatto con le sostanze potenzialmente
epatotossiche venivano rimossi per 6 mesi dal loro posto di lavoro e ricontrollati. Uscivano
dallo studio i pazienti affetti da infezione virale e da malattia celiaca. Tutti gli altri pazienti
con sindrome metabolica venivano invitati a seguire una dieta ipocalorica di 1400-1600
calorie in base al sesso e all’impegno lavorativo e a sospendere o ridurre il consumo di alcol.
Dopo 6 mesi di dieta venivano ricontrollati gli indici di funzionalità epatica e sottoposti ad
esame clinico per valutare BMI e circonferenza addominale.
I pazienti rimossi dall’esposizione diretta non hanno presentato miglioramento dei parametri
di funzionalità epatica. Sono ritornati pertanto al lavoro precedente lavoro e invitati a seguire
una dieta ipocalorica da 1400-1600 calorie. Si è osservato che tutti i soggetti, anche quelli
esposti in modo diretto ai potenziali tossici, che ottenevano con la dieta un calo di almeno 6-8
Kg di peso presentavano la normalizzazione o la riduzione delle transaminasi.
CONCLUSIONI
Dal presente studio non sono emersi casi di epatite da tossici ambientali correlabili all’attività
lavorativa. Viceversa sono state individuate cause differenti nel determinismo della steatosi e
sufficienti a determinare il quadro biochimico rilevato. Inoltre nei pazienti individuati la sola
76

sospensione protratta dell’attività lavorativa non ha dato modificazioni del profilo biochimico.
In accordo con i più recenti dati della letteratura si conferma che la prima causa di citolisi
epatica è, nei paesi industrializzati, la steatosi epatica quale manifestazione di sindrome
metabolica.
Si osserva da questo studio che oltre il 50% dei soggetti presenta obesità di vario grado e il
25% ha segni bioumorali di epatopatia secondaria a sindrome metabolica. Inoltre il solo calo
di peso è gia sufficiente a ridurre o normalizzare la citolisi o la colestasi.
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Luca Bonfanti Filone tematico A5
Il coniglio come modello di plasticità strutturale nel sistema nervoso dei
mammiferi adulti
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Morfofisiologia Veterinaria
OBIETTIVO
Nell’ambito del presente progetto sono stati chiariti gli aspetti morfologici e molecolari
relativi alla genesi ed alla migrazione di cellule nella zona sottoventricolare (SVZ) e nel
telencefalo del coniglio adulto. L’entità e le modalità della genesi di nuove cellule nell’SVZ
del coniglio sono molto simili a quelle precedentemente descritte nei roditori da laboratorio,
in quanto in tutte le specie è osservabile una cospicua migrazione degli elementi neogenerati
verso il bulbo olfattivo. In aggiunta, nel coniglio abbiamo osservato catene di cellule situate
all’esterno dell’SVZ, a diretto contatto con il parenchima cerebrale maturo (catene
parenchimali).
RISULTATI
L’analisi immunocitochimica ha dimostrato che queste cellule sono in prevalenza precursori
dei neuroni. Pertanto, un primo risultato originale ed innovativo di questa ricerca consiste
nella dimostrazione che catene di neuroblasti originanti nell’SVZ adulta non sono sempre
confinate al suo interno, bensì possono attraversare il parenchima cerebrale in zone
sottocorticali. Il fatto che il coniglio sia l’unica specie di mammifero fino ad ora nota in cui è
stato osservato questo fenomeno, giustifica l’interesse di un suo impiego come modello per lo
studio della plasticità strutturale del sistema nervoso centrale (SNC).
Lo studio è stato approfondito mediante analisi ultrastrutturale delle catene parenchimali e
delle cellule che le compongono, confermando la loro natura di neuroblasti. La ricostruzione
seriale di alcuni tratti dimostra inoltre che queste cellule sono unite tra loro a formare catene
analoghe a quelle osservabili all’interno della SVZ, ma più grandi ed organizzate in modo
meno compatto. Anche i rapporti con il tessuto circostante sono diversi, in quanto esse non
appaiono circondate da cellule gliali di tipo astrocitario, risultando pertanto glia-indipendenti.
Cio’ suggerisce che l’eventuale migrazione di precursori neuronali all’esterno dell’SVZ e a
diretto contatto con il parenchima cerebrale sarebbe possibile. Questo rappresenta un’altra
importante acquisizione in quanto si è sempre ritenuto che la migrazione in catene tipica del
cervello adulto potesse avvenire soltanto all’interno di un’avvolgimento gliale. Il fatto che
possa esistere in vivo una migrazione in catene ‘glia-indipendenti’ rende pensabile, per il
futuro, una mobilizzazione endogena di precursori neuronali all’interno dell’encefalo dei
mammiferi.
Come primo passo in questa direzione, è stata testata in vivo l’eventuale presenza di
migrazione nelle catene parenchimali, utilizzando doppie marcature delle cellule neogenerate
(con BrdU somministrata per tempi di sopravvivenza variabili e marcatori neuronali). Questi
esperimenti hanno dimostrato che all’interno delle catene parenchimali non esiste
proliferazione locale, ma che alcune cellule neogenerate transitano al loro interno per
raggiungere zone corticali e subcorticali. Pertanto la migrazione all’interno del parenchima
cerebrale del coniglio esiste, anche se il tipo e l’entità sembrano assumere caratteristiche
diverse da quella presente all’interno dell’SVZ.
78

Nel corso di questo studio, anche se non previsto nell’ambito del progetto, è stata riscontrata
una terza area germinativa all’interno del cervelletto del coniglio adulto. Questa parte del
SNC, nota per essere caratterizzata dalla genesi postnatale di una categoria di neuroni
(granuli), ma completamente sprovvista di fenomeni neurogenetici i tempi successivi,
conferma l’esistenza di un’insolita plasticità nel sistema nervoso di questa specie animale. E’
quindi possibile affermare che il coniglio può costituire un modello accattivante per lo studio
dei fenomeni neurogenetici adulti dei mammiferi. Nell’ultima fase di questo progetto è stata
analizzata l’eventuale presenza di cellule staminali neurali nell’SVZ del coniglio adulto, al
fine di compararle con quelle già descritte nei roditori da laboratorio. I risultati ottenuti
studiando in vivo la proliferazione cellulare nell’SVZ e la migrazione dei precursori verso il
bulbo olfattivo, indicano che il processo di genesi continua in questa regione dell’encefalo del
coniglio è perfettamente comparabile a quelle descritte nei roditori, suggerendo che anche
l’SVZ del coniglio adulto contenga elementi di tipo staminale. Tuttavia la ricerca di cellule
staminali in questa specie ha presentato alcune difficoltà relative al loro isolamento. In
particolare, a parità di procedure sperimentali e quantità di tessuto prelevato, nel coniglio è
stato ottenuto un numero inferiore di neurosfere, che preclude una sufficiente espansione in
vitro. Studi futuri saranno rivolti a chiarire le procedure metodologiche che vanno adottate per
ottenere gli stessi risultati descritti per i roditori.
CONCLUSIONI
I risultati ottenuti nell’ambito del presente progetto indicano la presenza di una via di
migrazione in forma di catene di precursori neuronali situate all'esterno della SVZ, in grado di
collegare quest’area germinativa a regioni corticali. Inoltre, essi dimostrano la possibile
esistenza di un nuovo tipo di migrazione sulla lunga distanza, diversa da quella oggi
conosciuta all’interno delle zone neurogenetiche adulte, in quanto non legata alla presenza di
strutture gliali, bensì in diretto contatto con il parenchima nervoso maturo.
Entrambi questi punti sono di estrema importanza per la comprensione dei meccanismi che
permettono lo spostamento di precursori neo-generati all'interno dell'encefalo adulto, e di una
loro eventuale manipolazione in vista di una futura riparazione endogena delle patologie e
lesioni nervose.
PUBBLICAZIONI
F. Luzzati, P. Peretto, P. Aimar, G. Ponti, A. Fasolo, L. Bonfanti (2003) Glia-independent
chains of neuroblasts through the subcortical parenchyma of the adult rabbit brain. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 100:13036-13041.
L. Bonfanti, F. Luzzati, G. Ponti, P. Peretto (2005) Adult neurogenesis in mammals: a
comparative apptroach. Curr. Trends Neurol. (in press) Bonfanti L. & Ponti G. (2005)
Tangential chains of neuroblasts in the subpial layer of the adult rabbit cerebellum. Vet. Res.
Comm. (in press)
L. Bonfanti (2004) Glia-independent chains of neuroblasts in the adult brain parenchyma.
FENS Forum, Lisbona (conferenza su invito)
G. Ponti, P. Peretto, L. Bonfanti (2004) A subpial germinal layer persists in the adult rabbit
cerebellum after transformation of the postnatal EGL. Meeting of the International Society for
Developmental Neuroscience, Edimburgh, UK (abstract)
G. Ponti, P. Peretto, L. Bonfanti (2004) A neurogenetic layer sharing features with the
forebrain SVZ persists in the adult rabbit cerebellum. Abstracts Society for Neuroscience San
Diego, USA (abstract)
79

Alberto Borraccino Filone tematico D1
Valutazione dei determinanti del ritardo alla diagnosi nei pazienti con
deficit patologico di ormone della crescita
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica
CONTESTO E RAZIONALE
Si stima che l’incidenza di deficit staturale interessa, in Europa, un numero variabile di
soggetti compreso tra 1 ogni 4000 e 1 ogni 10000 giovani in età inferiore ai 15 anni di età. Il
deficit di GH è una patologia rara, per la quale sono ancora scarse stime attendibili intorno
alla sua distribuzione (di tassi di Prevalenza) e impatto annuale (stime di Incidenza). Di fronte
alla difficoltà di stimare prevalenza ed incidenza del fenomeno si discute però apertamente
dell’efficacia della terapia sostitutiva, che interessa interamente la popolazione in età
pediatrica. È in età pediatrica infatti che, proprio in relazione alle fasi di accrescimento
fisiologico, la somministrazione di GH esogeno può consentire un corretto completamento
dello sviluppo corporeo. Il deficit staturale, sospettato sulla base di una ridotta velocità di
crescita in relazione all’età del soggetto, può essere trattato con GH esogeno. La massima
efficacia terapeutica si raggiunge nei soggetti che giungono all’osservazione clinica in tempo
utile per consentire loro di sfruttare l’intero accrescimento osseo. Il concetto di “tempo utile”
non è rigorosamente definito in ambito clinico, anche a fronte delle più recenti consensus
conference degli ultimi anni. Attualmente tale valutazione viene legata, in sede diagnostica
allo sviluppo sessuale (SS), attraverso due parametri fondamentali la presenza di peluria
pubica e lo sviluppo, volumetrico, della ghiandola mammaria, per il sesso femminile, e lo
sviluppo dei genitali per il sesso maschile. La maggiore efficacia dal trattamento sostitutivo
con GH si ottiene quando il soggetto si trova in uno stadio 1 o 2 secondo Tanner. Soggetti in
stadio puberale più avanzato vengono trattati comunque ammettendo una ridotta efficacia del
trattamento. La valutazione del deficit staturale viene affidata quasi interamente al pediatra, il
quale, in caso di anomalie di sviluppo, richiede un approfondimento diagnostico presso un
centro auxologico di riferimento dove, dopo accertamento di deficit di GH, viene impostato il
protocollo terapeutico. Alcuni bambini giungono all’osservazione troppo tardi per poter
beneficiare delle potenzialità della terapia.
OBIETTIVO
Obiettivo del presente lavoro è quello di descrivere la dimensione del fenomeno nella
popolazione adolescente, stimare quale è la proporzione di soggetti, oggi in terapia, che però
sono giunti in ritardo alla diagnosi di deficit di GH e descrivere tipologia e frequenza di
ritardo diagnostico nella Regione Piemonte.
MATERIALI E METODI
Dal 1 Gennaio 2000, è attivo un registro per la sorveglianza del deficit staturale della
popolazione piemontese. Il registro GH (RGH), ha fornito l’elenco dei soggetti e dei centri
regionali presso quali recuperare le informazioni utili. Dalla base dati regionale sono stati
estratti tutti i casi diagnosticati e trattati con GH esogeno (periodo 2000-03). Sulla base della
valutazione dello SS sono state identificate due categorie di soggetti secondo Tanner:
1. in tp con una diagnosi occorsa in uno stadio di sviluppo

2. in tp con diagnosi occorsa in uno stadio di sviluppo >4 (ritardi di tipo 1).
Per ogni centro, sono stai identificati i soggetti che, giunti all’osservazione con stadio
puberale completo non sono stati inseriti in trattamento (ritardo di tipo2). Erano eleggibili i
soggetti con deficit di GH in assenza di patologie concomitanti. Per tutti i soggetti eleggibili è
stata effettuata una ricerca dei dati anagrafici. Ai genitori dei casi è stato somministrato un
questionario telefonico. Obiettivo del questionario era identificare momento e modalità con le
quali la famiglia aveva rilevato la patologia in oggetto di valutazione. Il questionario era
organizzato in tre sezioni: una parte dedicata alle informazioni sociali e auxologiche della
famiglia; una parte clinica dedicata alla modalità con cui i genitori sono venuti in contatto con
il centro specialistico; una parte valutativa dedicata alla frequenza e tipologia delle visite
pediatriche. Il questionario è stato somministrato telefonicamente alle famiglie ed imputato su
software specifico.
RISULTATI
Sono stati considerati 859 pazienti (593 maschi). Tra questi erano in stadio puberale 1-3 un
totale di 819 pazienti (il 73% circa in stadio puberale 1) e 35 individui (il 4% circa della
popolazione trattata) in stadio puberale 4 o 5. L’età anagrafica media per i pazienti in stadio
puberale 1-3 era di circa 11.5 anni contro un età media di 13.01 anni per i soggetti in stadio 4
o 5. Dalla ricerca sistematica sono emersi un totale di 30 soggetti con probabile deficit di GH,
in assenza di altre patologie significative, non trattati a causa dello sviluppo puberale
terminato. Complessivamente sono state controllate per centro di appartenenza:
Centro 1: esaminate 1500 schede, selezionati n° 2 soggetti;
Centro 2: esaminate 1000 schede, selezionati n° 18 soggetti;
Centro 3: esaminate 500 schede non è stato selezionato nessuno soggetto;
Centro 5: esaminate 300 schede, selezionati n° 4 soggetti;
Centro 6: esaminate 500 schede, non è stato selezionato nessun soggetto;
Centro 8: esaminate 350 schede, selezionati n° 4 soggetti;
Centro 9: esaminate 400 schede, non è stato selezionato nessun soggetto
Centro 10: esaminate 300 schede, non è stato selezionato nessun soggetto;
Centro 11: esaminate 500 schede, non è stato selezionato nessun soggetto;
Centro 13: esaminate 200 schede, selezionati n° 2 soggetti.
CONCLUSIONI
I centri regionali che gestiscono unicamente la patologia dell’adulto non sono stati considerati
nella ricerca. Discussione Le fasi di ricerca attiva dei soggetti non in terapia hanno
comportato un investimento in termini di tempo superiore alle attese. Inoltre, a differenza di
quanto dichiarato dai responsabili nelle fasi preliminari allo studio, non tutti i centri
dispongono di archivi (cartacei) dei pazienti con probabile deficit non inseriti in terapia. Da
una analisi preliminare delle caratteristiche dei 30 soggetti recuperati ne emerge una
sovrapponibilità quasi completa con i soggetti in terapia ma con sviluppo puberale 4 o 5. La
somministrazione dei questionari, in relazione alle difficoltà ed ai tempi incontrati nella
ricerca dei soggetti è attualmente in fase di completamento. La rispondenza è quasi del 100%,
non sono rilevati rifiuti. Il numero dei soggetti non contattati è imputabile alla irreperibilità
telefonica. Nella totalità dei casi ad accorgersi del problema sono sempre i genitori, solo dopo
viene interpellatoli pediatra. Il fattore scatenante è sempre il confronto con i coetanei
(compagni di scuola). Non sembra essere mai il pediatra o l’educatore a spingere il genitore
ad un controllo. La maggior parte dei bambini con ritardo alla diagnosi è stata in cura con un
pediatra che non misurava il bambino.
81

Amalia Bosia Filone tematico A2
Le basi molecolari e gli indicatori della insulino-resistenza
Università degli Studi di Torino,
Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica
FASE I – materiali e metodi
In una prima fase della ricerca è stato valutato e confrontato il trasporto di glucoso, dopo
stimolazione con citochine/LPS, in VSMC (vascular smooth muscle cells) insulino-sensibili e
insulino-resistenti, sia umane, sia di ratto Zucker, al fine di verificare l’esistenza di un
possibile coinvolgimento di NO nel meccanismo dell’insulino-resistenza. I ratti Zucker magri
e obesi sono modelli noti di normale sensibilità all’insulina e di insulino-resistenza
accompagnata da iperinsulinemia. Utilizzando VSMC di ratti Zucker normali, sensibili
all’insulina, ed obesi, insulino-resistenti (fa/fa), si è osservato che nei ratti obesi, così come in
VSMC umane insulino-resistenti, sono assenti sia il trasporto di glucoso che le fosforilazioni
di PKB/Akt e di ecNOS indotte da insulina, il che testimonia condizione di resistenza
all’insulina. In VSMC di ratti insulino-resistenti è presente il trasporto di glucoso indotto dal
donatore di NO, GS-NO, e dall’analogo del cGMP, 8-Br-cGMP, il che indica che sia sGC
(guanilato ciclasi solubile) che PKG (cinasi cGMP-dipendente)sono intatte e funzionanti.
FASE I – risultati
I risultati più rilevanti di questa parte dello studio sono che:
1. la sintesi di NO ed il trasporto di glucoso indotti da citochine/LPS (24 ore di incubazione)
in hVSMC e rVSMC sono significativamente potenziati nelle cellule insulino-resistenti;
2. la pre-incubazione con il mix citochine/LPS, potenti insulino-mimetici, inibisce l'entrata
di glucoso indotta da una successiva stimolazione con insulina.
Questi risultati dimostrano che in cellule muscolari lisce vascolari insulino-resistenti le
citochine/LPS inducono maggior aumento di attività ed espressione di iNOS e di trasporto di
glucoso NO-dipendente. E’ possibile che l’aumentata espressione di IKKß e/o la sua
maggiore attivazione in ratti Zucker fa/fa porti ad un’aumentata attivazione di NF-kB che è
causata dalla fosforilazione e dalla conseguente degradazione proteolitica della proteina
inibitrice IkB. La traslocazione di NF-kB al nucleo aumenta l’espressione del gene iNOS e
quindi la sintesi di NO. Il trattamento di VSMC, ottenute da soggetti obesi o da ratti obesi
insulino resistenti, con aspirina o salicilato, inibitori dell’attività di IKK, è in grado di
correggere e revertire le mancate risposte metaboliche all’insulina (trasporto di glucoso e
fosforilazione di Akt e ecNOS). Questo suggerisce un effetto anti-infiammatorio di aspirina e
salicilato ed un potenziale legame tra infiammazione cronica subacuta, insulino-resistenza e
complicanze aterosclerotiche.
FASE II – materiali e metodi
Nella seconda fase della ricerca, condotta su colture di VSMC di ratti Zucker insulinosensibili
e insulino-resistenti, e’ stato evidenziato un ruolo di NO nel trasporto di glucoso
indotto da statine ed un parallelismo tra stato di insulino-resistenza (in cui iNOS è
iperespressa) ed effetto delle statine (capaci di aumentare la trascrizione di iNOS e creare “in
vitro” una condizione di resistenza all’insulina).
82

FASE II – risultati
I nostri dati dimostrano che:
1. il trattamento delle cellule insulino-sensibili ed insulino-resistenti con statine, farmaci
inibitori di HMG-CoA riduttasi, causa aumento di attività e di trascrizione di iNOS, e
potenzia l’effetto attivatore di citochine/LPS, in modo maggiore nelle cellule insulinoresistenti;
2. il trattamento con statine induce trasporto di glucoso in modo NO-dipendente nei due tipi
cellulari e potenzia l’effetto attivatore di citochine/LPS influenzando la risposta
all’insulina;
3. l’aumentata attività di iNOS e l’aumentato trasporto di glucoso causati da statine in cellule
insulino sensibili e resistenti è revertita dalla presenza di mevalonato, che elimina l’effetto
dell’inibizione di HMG-CoA riduttasi;
4. la risposta all’insulina (trasporto di glucoso) dopo trattamento con mevalonato, è
potenziata nelle cellule sensibili e ripristinata nelle resistenti.
Il meccanismo di induzione della iNOS da parte di statine è ancora poco noto, ma le evidenze
sperimentali fanno pensare a un diretto coinvolgimento di proteine G,GTPasi della famiglia
Rho, e fattori di trascrizione come AP-1 e NF-kB (quest’ultimi direttamente responsabili
dell’attivazione di fattori di trascrizione di iNOS). Le statine infatti funzionano bloccando la
isoprenilazione di Rho e la sua conseguente traslocazione alla membrana plasmatica. Poiché è
noto che le proteine Rho regolano negativamente la sintesi di NO, l’interruzione della via Rho
aumenta la sintesi di NO indotta da stimoli infiammatori in vari tipi cellulari: infatti Rho non
isoprenilata non regola negativamente la iNOS.
Infine i nostri risultati mostrano che l’aumento della sintesi di NO indotta da citochine/LPS e
statine è accompagnato, nelle stesse condizioni sperimentali, anche da un aumentato trasporto
di glucoso, NO-mediato, che blocca la risposta all’insulina somministrata successivamente. E’
da notare che si assiste ad un recupero dell’azione dell’insulina allorché, dopo trattamento con
statine, si utilizza il mevalonato, anche nelle cellule insulino-resistenti. Inoltre il trasporto di
glucoso è revertito dall’utilizzo di mevalonato, che corregge l’effetto dell’inibizione della
HMG-CoA riduttasi. L’insulina mantiene attiva la HMG-CoA riduttasi e attiva le
isopreniltransferasi, quindi promuove l’attività inibitrice di Rho. In questo studio è emersa
un’analogia tra lo stato di insulino-resistenza e le modificazioni indotte da statine rispetto
all’aumentata trascrizione di iNOS. Indirettamente questi esperimenti possono evidenziare
l’importanza della prenilazione di proteine G, promossa da insulina, nel meccanismo
dell’insulino-resistenza. E' possibile infatti che in VSMC insulino-sensibili incubate in
presenza di statine e in VSMC insulino-resistenti ci sia una diminuzione dei livelli della
proteina RhoA nella membrana plasmatica: la mancata isoprenilazione di Rho ed il mancato
controllo negativo dell’induzione di iNOS potrebbe essere una delle basi molecolari
dell’insulino-resistenza, reversibile in presenza di mevalonato.
PUBBLICAZIONI
Aldieri E, Orecchia S, Ghigo D, Bergandi L, Riganti C, Fubini B, Betta PG, Bosia A. Simian
virus 40 infection down-regulates the expression of nitric oxide synthase in human
mesothelial cells. Cancer Res (2004) 64: 4082-4084.
Doronzo G, Russo I, Mattiello L, Anfossi G, Bosia A, Trovati M. Insulin activates vascular
endothelial growth factor in vascular smooth muscle cells: influence of nitric oxide and of
insulin resistance. Eur J Clin Invest (2004) 34: 664-673.
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Giovanni Botta Filone tematico C1
Impiego della telepatologia nella diagnostica fetoplacentare finalizzata
alla costituzione di un registro epidemiologico
ASO O.I.R.M. Sant’Anna
U.O.A. Anatomia e Istologia Patologica
CONTESTO E RAZIONALE
La perdita spontanea di gravidanza, le malattie del feto e della madre causa di esiti sfavorevoli
della gravidanza e le patologie neonatali, acquisite e congenite, coinvolgono ogni anno in
Italia almeno 100.000 soggetti. La loro molteplicità e frequente complessità diagnostica
richiedono un elevato grado di esperienza del personale medico che le affrontano
(anatomopatologi, ostetrici, neonatologi, genetisti medici, radiologi, ecc.). Questo grado di
competenza non è facilmente raggiungibile se non in quei Centri che possono concentrare
ampie casistiche. Tuttavia ogni Punto Nascita in Italia può registrare più o meno
occasionalmente casi di patologia prenatale o neonatale, trovandosi, così, esposto ad una
diagnostica a cui è spesso solo superficialmente preparato. L’errata o incompleta diagnosi in
questo campo della medicina può produrre conseguenze assai rilevanti.
OBIETTIVO
Realizzazione di un’esperienza pilota per la standardizzazione delle procedure diagnostiche e
tecniche utili alla costituzione di una Web Community a cui possano partecipare i Centri di
Diagnostica delle Patologie del Feto, della Placenta e del Neonato, per lo scambio di pareri
diagnostici (teleconsulto) e la condivisione di archivi dati ed immagini (know-how).
MATERIALI E METODI
La realizzazione del progetto è passata attraverso le seguenti fasi:
1. realizzazione del programma che viene utilizzato dalle unità periferiche per la
classificazione dei casi.
2. Realizzazione del portale al quale confluiscono tutti i casi raccolti in periferia e che
vengono utilizzati per la creazione di un biblioteca di casi didattici a disposizione degli
operatori clinici e di quelle associazioni della società civile che vorranno in seguito
aderirvi (associazioni di genitori ?)
Il flusso del progetto va analizzato in due distinte fasi, la prima è la creazione della banca dati
e a questa fase partecipano le unità sanitarie periferiche accreditate dal progetto. La redazione
del portale effettua una prima analisi del caso e decide se farlo rientrare nei casi didattici,
perché di interesse generale, o se semplicemente avviarlo al percorso del tele-consulto
attribuendolo ad un componente del comitato scientifico; pubblicazione del caso (se ritenuto
di interesse generale); risposta personalizzata al proprietario del caso, da parte del comitato
scientifico, sia che il caso sia stato inserito nei casi didattici sia in caso contrario. Nell’ipotesi
in cui il caso sia ritenuto, oltre che di interesse generale, anche raro, viene inserito, oltre che
tra i casi didattici, anche nell’atlante virtuale delle malformazioni.
84

La seconda fase del progetto è la consultazione della banca dati. A questa fase possono
partecipare sostanzialmente tutti coloro che ne abbiano interesse per scopi professionali
(operatori della sanità).
La componente informatica del progetto ha rivestito, come ovvio, un’importanza strategica e
contemporaneamente l’impegno più gravoso in termini di tempi, articolandosi in sviluppo
delle applicazioni e sicurezza dei dati. L’applicazione informatica, supporto del progetto, può
essere suddivisa in due blocchi principali: applicazione locale e via web. La prima viene
utilizzata dalle strutture sanitarie periferiche per la raccolta e la classificazione dei casi clinici.
Le caratteristiche dell’applicazione, così come il layout delle form progettate per la raccolta
dei dati scientifici dei casi catalogati, sono descritte nel paragrafo successivo (Programma
Archimede). L’applicazione si compone sostanzialmente di due parti distinte: la parte di
archiviazione multimediale (immagini, testi, filmati ecc,) e le form progettate per la raccolta
dei dati scientifici.
Applicazione Web. Si tratta dell’applicazione che verrà utilizzata dai fruitori dei servizi
offerti dal portale su piattaforma internet. Alcune caratteristiche dell’applicazione sono
contenute nel paragrafo Archimed.org.
Programma Archimede. La logica di archiviazione è basata sulla classica struttura ad albero.
I rami dell’albero, che sono denominati nodi. L’utente può variare la struttura dei nodi
(crearne di nuovi, eliminare quelli già esistenti) per meglio adeguarla ad eventuali, nuove
esigenze che potranno insorgere durante l’evoluzione del progetto. La soluzione, essendo stata
progettata con il criterio delle architetture open, offre la possibilità di generare i nodi
importandoli da un qualunque data base purchè sia in possesso della tecnologia ODBC. In
altre parole Archimede è in grado di acquisire informazioni (senza alcuna implementazione)
dalle procedure utilizzate dalle varie strutture ospedaliere. Gli oggetti da archiviare possono
essere acquisiti da file o direttamente da scanner, foto-camera digitale, da video-camera e più
in generale da qualunque fonte che sia in possesso di una interfaccia digitale di
comunicazione. Archimede è infatti in grado di colloquiare facilmente con qualsiasi
strumento Hardware di ultima generazione. Agli oggetti, nel momento in cui vengono
acquisiti per essere archiviati, vengono attribuite delle proprietà che vengono poi essere
utilizzate in fase di ricerca.
Aree del portale Archimede.org. Le Aree contenute nel portale e sono da considerare
funzionali al nostro progetto sono:
1. Area Riservata alle Consulenze Diagnostiche: attraverso questa sezione è possibile
caricare le immagini e le specifiche dei casi clinici senza essere in possesso
dell’applicazione locale Archimede.
2. Area Didattica composta dalle seguenti sotto-aeree:
• Atlante Virtuale: contiene un elenco di patologie a monte del quale è disponibile un
“SEARCH ENGINE” per parole chiave. Dopo aver selezionato la patologia di interesse,
comparirà una breve descrizione della patologia stessa, una breve bibliografia e una
gallery di immagini Corsi.
• Casi didattici: sono contenuti i casi trasmessi dal programma Archimede (solo alcuni casi
esemplificativi).
3. Area Registri (Epidemiologica): è un’area nella quale è possibile consultare la
consuntivazione di tutti i casi raccolti raggruppati per patologia e aree geografiche.
L’utilità di queste informazioni cresceranno proporzionalmente con lo sviluppo della
banca dati.
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Salvatore Bozzaro Filone tematico A1
Meccanismo d’azione del gene Nramp1 nella resistenza alle infezioni e
identificazione di mutazioni geniche deleterie
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche
Nramp1 agisce da esportatore di ferro dal fagolisosoma con un meccanismo di simporto
alimentato dalla V-ATPasi
E' generalmente accettato che Nramp1 trasporti metalli, in particolare ioni ferro, nei
fagolisosomi, ma è dibattuto se esso pompi fuori dal lisosoma gli ioni insieme a protoni, o se
importi nei lisosomi il ferro.
Per determinare il meccanismo di trasporto, abbiamo purificato fagosomi da cellule controllo
di Dictyostelium e mutanti knock-out per Nramp1, previamente generati in laboratorio. Il
grado di purificazione dei fagosomi è stato chiarito con una batteria di anticorpi contro vari
marcatori cellulari. I fagosomi isolati sono stati incubati con Fe radioattivo complessato con
citrato ed è stata determinata la quantità di radioisotopo incorporato nei fagosomi.
In assenza di ATP è stato riscontrato accumulo di ferro in fagosomi di cellule controllo, ma
non in fagosomi isolati dai mutanti knock-out. Il trasporto di ferro nei mutanti è riscattato
dalla trasfezione con un vettore contenente il gene Nramp1 fuso con la GFP. Ciò suggerisce
che Nramp1 sia essenziale per il trasporto di ferro nei fagosomi. Se gli esperimenti sono
eseguiti in presenza di ATP, l'ATP blocca il trasporto di ferro. Per chiarire meglio il
meccanismo d'azione dell'ATP, i fagosomi sono stati pre-caricati con ferro prima di
aggiungere ATP. In questo caso, l'ATP provoca un efflusso di ioni ferro dal fagosoma. Un
risultato simile si ottiene se si innalza il pH nella sospensione contenente i fagosomi.
Questi esperimenti ci portano a concludere che Nramp1 trasporta ioni ferro dai fagosomi al
citosol, agendo da simporto, se viene attivato un gradiente protonico. In assenza del gradiente
protonico, il ferro fluisce all'interno dei fagosomi. Gli esperimenti ci permettono anche di
spiegare risultati diversi ottenuti da altri ricercatori sui macrofagi con esperimenti simili ai
nostri, ma nei quali non era mai stato saggiato l'effetto di ATP. Ciò spiega la loro
interpretazione del trasporto come antiporto. In effetti, abbiamo trovato anche noi che in
assenza di ATP il ferro è importato nei fagosomi. I risultati suggeriscono anche che batteri
patogeni possano interferire con la funzionalità di Nramp1 agendo non direttamente su di
essa, ma neutralizzando la V-ATPasi.
V-ATPasi e Nramp1 sono localizzati in compartimenti separati ma reclutati
rapidamente nel fago-lisosoma.
La funzione di Nramp1, descritta nel punto precedente, esige che la proteina si trovi nello
stesso compartimento con la V- ATPasi. Per studiare la localizzazione intracellulare abbiamo
utilizzato cellule trasfettate con Nramp1, o la subunità vatB della V-ATPasi, fuse con GFP.
Abbiamo, inoltre, usato anticorpi contro la subunità vatA, contro comitina, vacuolina e Vti1 in
esperimenti di co-immunofluorescenza. I risultati dimostrano, in sintesi, che Nramp1 e la V-
ATPasi sono localizzate per lo più in compartimenti diversi in cellule in riposo. Nramp1 é
localizzata in vescicole sparse nella cellule e in un cluster perinucleare che corrisponde al
trans-Golgi, dove essa co-localizza con la comitina e con Vti1. La V-ATPasi é invece
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localizzata in lisosomi e nel vacuolo contrattile. A seguito di macropinocitosi o fagocitosi,
entrambe le proteine sono reclutate rapidamente nel macropinosoma o fagosoma, dapprima la
V-ATPasi e subito dopo Nramp1. E' molto probabile che Vti1 sia responsabile della fusione
tra le vescicole contenenti Nramp1 e i fagosomi appena formati nella cellula. Nella via postlisosomica,
Nramp1 identifica una stadio in cui le vescicole contengono Nramp1 e vacuolina,
ma non la V-ATPasi.
In relazione alle infezioni batteriche, dunque, i dati ottenuti permettono di concludere che la
funzionalità di Nramp1 può essere compromessa, se i batteri patogeni neutralizzano la V-
ATPasi o bloccano la fusione dei fagosomi con vescicole contenenti Nramp1.
L'espressione costitutiva di Nramp1 protegge contro infezioni da legionelle e non da
micobatteri.
Nel tentativo di capire come i batteri patogeni neutralizzino Nramp1, ci siamo chiesti se una
possibile via non possa essere la repressione dell'espressione del gene e, in tal caso, se
l'espressione costitutiva di Nramp1 non possa proteggere le cellule da agenti infettivi.
Gli esperimenti dimostrano che la Legionella reprime in maniera selettiva l'espressione di
Nramp1, mentre non ha alcun effetto sulla subunità vatB della V-ATPasi, l'enzima chiave per
l'acidificazione del fago-lisosoma. I micobatteri invece stimolano l'espressione di Nramp1.
Abbiamo, quindi, studiato gli effetti dell'espressione costitutiva di Nramp1, trasfettando il
gene fuso con GFP sotto il controllo di un promotore costitutivo. Legionelle e micobatteri
sono in grado di crescere in cellule di Dictyostelium come nei macrofagi. In mutanti knockout
per Nramp1 la crescita intracellulare dei batteri è favorita. Se Nramp1 è espresso
costitutivamente, sia nel ceppo selvatico sia nel mutante knock-out, esso impedisce la crescita
di legionelle. Al contrario, micobatteri crescono meglio in assenza di Nramp1, ma sono anche
in grado di crescere se Nramp1 è espressa costitutivamente.
Questi risultati suggeriscono che legionelle e micobatteri usano meccanismi diversi per
neutralizzare l'azione di Nramp1, e che uno di questi passa per la repressione dell'espressione
genica di Nramp1. E' possibile che la differenza tra micobatteri e legionelle sia dovuta a
esigenze diverse per il ferro tra i due agenti patogeni.
Valutazione degli effetti del ferro su fagocitosi e crescita intracellulare di batteri.
Il ruolo di Nramp1 come trasportatore di ferro e il fatto che mutanti in Nramp1 siano più
suscettibili a infezioni da batteri patogeni induce a supporre che il ferro sia importante per la
funzionalità del fagolisosoma. Il ferro è un importante fattore di difesa contro le infezioni, ma
nel contempo agisce da cofattore per molti fattori di virulenza batterica. Questo spiega come
sia in caso di anemia che di emocromatosi si possa essere più sensibili alle infezioni.
Abbiamo eseguito esperimenti preliminari per determinare il ruolo del ferro durante
l'infezione da legionelle o micobatteri, incubando cellule controllo, mutanti knock-out e
mutanti iperesperimenti Nramp1 con batteri in presenza di concentrazioni variabili di ferro
oppure di deferoxamina, un chelante del ferro.
In questi esperimenti, non ancora definitivi, non sono state osservate differenze tra i tre ceppi
cellulari. Il ferro sembra avere un'azione inibente, ma l'effetto è paragonabile nei tre ceppi. I
risultati ottenuti, ad eccezione di quelli descritti nell'ultima sezione, sono in corso di stampa in
un articolo accettato dalla rivista Traffic.
87

Enrico Bracco Filone tematico A2
Identificazione di molecole interattrici del recettore per il fattore di
crescita delle cellule staminali: c-kit/SCFR.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche
OBIETTIVO
Lo studio condotto durante questo periodo si prefigge come obiettivo finale la comprensione
dei meccanismi molecolari attraverso i quali SCFR/c-kit -un membro dei recettori tirosina
chinasi di classe III- media i segnali che controllano la crescita e il differenziamento nelle
cellule della linea ematopoietica. Il bilanciamento di questi due processi (crescitadifferenziamento)
è alla base di una corretta ematopoiesi. Per contro, uno sbilanciamento tra
questi due processi comporta la comparsa di disordini a carattere neoplastico. A nostro avviso,
una comprensione completa di come questo recettore trasmette segnali di diversa natura è
possibile qualora si individuino le molecole coinvolte nella trasduzione del segnale a valle del
recettore e attraverso la comprensione del loro ruolo giocato, dal recettore stesso, nel mediare
diverse risposte cellulari. E’ abbastanza chiaro che una cellula della linea staminale
ematopoietica per differenziare a linfocita piuttosto che macrofago seguirà percorsi
differenziativi diversi i quali differiranno a loro volta da quelli che una cellula parzialmente
differenziata intraprende per dare vita, per esempio, ad un clone leucemico. La comprensione
dei “pathways” molecolari che portano allo sviluppo del clone leucemico può sicuramente
fornire il razionale per nuovi approcci terapeutici mirati, disegnati sul singolo paziente.
METODI E RISULTATI
Il nostro impegno è stato quindi rivolto all’identificazione di molecole coinvolte in queste vie,
avvalendosi della tecnica del “Two-Hybrid System” (THS) dove, come esca per lo screening
di una genoteca a cDNA umano di midollo osseo, è stata utilizzata la porzione citoplasmatica
del SCFR. Siamo riusciti a preparare una esca funzionalmente attiva in lievito che consiste
nella porzione citoplasmatica del SCFR con una mutazione puntiforme del codone 816
(D816V) che la rende costitutivamente attiva. Terminata questa fase preliminare, abbiamo
intrapreso lo screening estensivo di una genoteca a cDNA di midollo osseo umano
analizzando complessivamente circa 1x107 cloni.
I cloni positivi risultati a questo massiccio screening possono essere raggruppati
essenzialmente in due grosse famiglie:
a) quelli che codificano per proteine la cui interazione con c-kit è già stata ampiamente
descritta in letteratura;
b) molecole la cui interazione con il recettore risulta sconosciuta.
Il primo gruppo rappresenta una sorta di controllo positivo indicando che il sistema ha
funzionato con successo. Tra questi cloni abbiamo identificato per esempio la subunità
regolativi della PI3K che probabilmente rappresenta l’interattore più “forte” di c-kit. I cloni
che appartengono al secondo gruppo possono essere ulteriormente suddivisi in due
sottocategorie:
1. quelli che codificano per proteine la cui funzione è conosciuta;
88

2. quelli che codificano per proteine la cui funzione è sconosciuta.
La stragrande maggioranza dei cloni appartenenti alla “famiglia b” codificano per proteine
che hanno una caratteristica strutturale comune rappresentata da un modulo capace di legare
con elevata affinità le tirosine fosforilate (ex: SH2 o PTB). Questo dato indica che gli
interattori che abbiamo pescato sono interattori che vengono reclutati soltanto quando il
recettore è attivato, sia in seguito a stimolazione col proprio ligando che in seguito a
mutazioni che lo rendono costitutivamente attivo in modo ligando-indipendente.
Otto di questi interattori (Grb10, Slap, CSK, c-fgr, SH3BP2, ShcB, Nck beta e Spred) sono
attualmente oggetto di studio più approfondito nel nostro laboratorio per confermarne
l’interazione in cellule di mammifero, valutarne una eventuale modificazione posttraduzionale
in seguito a reclutamento da parte del recettore (nel caso specifico siamo
interessati a fosforilazioni in tirosina) ed una eventuale distribuzione sub-cellulare in vivo con
la generazione di proteine di fusione con GFP.
Di uno di questi interattori (un membro della famiglia di Sprouty) abbiamo anche iniziato a
studiarne l'espressione genica in pazienti affetti da Leucemie Mieloidi Acute (LAM). Risultati
preliminari indicano che l'espressione del gene in questione risulta significativamente regolata
in modo negativo in pazienti a cui è stata diagnostica un esordio di LAM. Il dato acquista
maggior peso se si considera è che la proteina codificata da questo gene è un modulatore
negativo della cascata di trasduzione del segnale scatenato dall'attivazione di un RTK. Questo
risultato aprirebbe nuove porte alla comprensione dei meccanismi molecolari che determinano
la comparsa di neoplasie a carattere ematico quali per es: le LAM e di conseguenza la
possibiltà di fornire le basi per sviluppare nuovi approcci terapeutici mirati, disegnati sul
singolo paziente.
PUBBLICAZIONI
1. “Absence of Spred1, a negative regulator of Ras/MAPK pathway, as a mechanism
responsible for thye costitutive activation of RTK mediated signalling in acute leucemia”
Cilloni D., Bracco E., Defilippi I., Messa F., Carturan S., Di Giovanni D., Arruga F.,
Rosso V., Catalano R., Messa E., Morotti A., Serra A. and Saglio G. Blood(ASH Annual
Meeting Abstract) 2005 106:Abstract 2287
2. “A novel RasGEF involved in Dictyosteliyum chemotaxis and development” Arigoni M.,
Bracco E., Kae H., Lusche D., Weeks G. and Bozzaro S. BMC Cell Biol. 2005 6:43 3
3. “The NF-kB pathway blockade by the IKK inhibitor PS1145 can overcome Imatinib
resistence” Cilloni D., Messa F., Aruga F., Defilippi I., Morotti A., Messa E., Carturan S.,
Giugliano E., Pautasso M., Bracco E., Rosso V., Sen A., Martinelli G., Baccarani M. and
Saglio G. Leukemia (2006) 20, 61–67. doi:10.1038/sj.leu.2403998
4. “The clinically available histone deacetylase inhibitor valproate enhances IMATINIB
induced growth arrest and apoptosis in IMATINIB sensitive and resistant chronic myeloid
leukaemia cells” A Morotti, D Cilloni, F Messa, F Arruga, I Defilippi, S Carturan, R
Catalano, V Rosso, A Chiarenza, C Pilatrino, A Guerrasio, R Taulli, E Bracco, M
Pautasso, D Baraban, E Gottardi and G. Saglio Cancer 2006 106:1188-96.
89

Gianni Boris Bradac Filone tematico C1
Trombolisi intra-arteriosa nello stroke ischemico acuto: creazione di una
rete regionale di selezione pazienti
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Neuroscienze
METODI
L’attività si è svolta in 2 fasi.
1. Extraospedaliera
I referenti per lo stroke degli ospedali Torinesi e dei centri vicini (entro i 50 Km) sono
stati messi al corrente del trattamento, sia con incontri ad personam che in occasione di
corsi monotematici sullo stroke tenuti presso il dipartimento di Neuroscienze e l’A.O. San
Giovanni Battista. La possibilità di trattamento endovascolare è stata divulgata anche
presso i medici di base attraverso comunicazioni sul bollettino dell’OdM di Torino.
2. Intraospedaliera.
E’ stato definito un percorso preferenziale per i pazienti all’interno dell’ospedale, che
include sia le fasi pre che post-trattamento, definendo le competenze ed il timing di
trasferimento dei malati. Il percorso intraospedaliero rimane ancora estremamente critico
sia per l’assenza di una stroke-unit dedicata, sia per la scarsità di risorse, in particolare
letti di Neurorianimazione
RISULTATI
Il tentativo di estendere ai pazienti di altri ospedali il trattamento è stato proficuo, tanto che
nel corso dell’ultimo anno oltre il 70 % dei pazienti trattati proveniva da ospedali esterni.
Rimane da megli definire il prercorso interno di questi malati.
L'aumento dei trattamenti e la scarsità delle risorse pongono serissimi problemi di gestione
del paziente durante ed immediatamente dopo la procedura
90

Paolo Branca Filone tematico B2
Metodica per la determinazione quantitativa del colorante liposolubile
Sudan I nei prodotti contenenti peperoncino
ARPA Piemonte
Polo Chimico Regionale Alimenti
OBIETTIVO
Con il presente lavoro ci si è proposti di mettere a punto un metodo analitico capace di
rispondere ai requisiti richiesti dalla norma europea, ed in grado di raggiungere i limiti di
rivelabilità previsti per la contaminazione degli alimenti a livello di contaminazione
ambientale per tutte le molecole SUDAN.
MATERIALI E METODI
La preparazione del campione è legata alla matrice da analizzare.
Polveri e prodotti secchi. A 5 grammi di peperoncino in polvere si addizionano 25 mL di
acetonitrile, si agita per 1 ora. Dopo filtrazione si recupera la fase organica. Si porta a secco
l’estratto su evaporatore rotante a temperatura del bagno < 60°C. Il residuo ripreso con 2 mL
di acetonitrile viene filtrato su filtro da 0.20 micron e iniettato in HPLC.
Salse e prodotti con alto contenuto di grasso. A 20 grammi di campione sminuzzato,
addizionare 20 grammi di terra di diatomea, mescolare e trasferire il tutto in colonna
cromatografica. Eluire con 150 mL di acetonitrile. Seccare con sodio solfato anidro, si filtra e
si porta a secco; se l’estratto si presenta sottoforma di residuo secco si riprende con 2 mL di
acetonitrile, si filtra su filtro da 0.20 micron e si inietta in HPLC. Se l’estratto presenta un
residuo oleoso si procede alla sua purificazione mediante cromatografia a permeazione di geli.
La purificazione, effettuata mediante cromatografia a permeazione di geli, permette la
separazione dei coloranti Sudan I, II, III e IV dai lipidi coestratti. Parametri statistici relativi
alla validazione del metodo Calibrazione La calibrazione avviene mediante standardizzazione
esterna su 7 livelli di calibrazione da 0,1 a 1,0 mg/l.
RISULTATI
Calcolo ed espressione del risultato.
Il responso analitico viene fornito direttamente dallo strumento in rapporto alla equazione
della retta: x = ((y-a)/b)*f x = concentrazione analita y = area picco b = pendenza curva
(slope) a = intercetta (vale 0 per curve forzate e passanti per l’origine) f = fattore di
concentrazione
Precisione e accuratezza.
Sono stati valutati eseguendo 6 prove di ripetibilità su due livelli di concentrazione pari a 50
µg/kg e 500 µg/kg. Nelle tabelle da 1 a 2 sono riportati i valori statistici ottenuti in fase di
convalida per i due livelli di concentrazione, tali valori sono stati ottenuti previa verifica della
normalità dei dati sottoposti ai test di Shapiro-Wilk al 5% e Dixon 1%.. La precisione del
91

metodo, sulla scorta delle indicazioni ricavate dall’equazione di Horwitz per i livelli di
concentrazioni indagati (CV%

Dove
yi = valore del responso strumentale alla concentrazione i-esima
yi = valore del responso strumentale estrapolato dalla curva di calibrazione
n= numero di punti della curva di calibrazione
Considerando la curva di calibrazione, i parametri statistici ad essa correlati sono riportati in
tabella 3.
Tabella 3: Parametri statistici della curva di calibrazione e calcolo dell’LOD ed LOQ
Composto
Coefficiente
angolare
Sy/x LODµg/kg LOQµg/kg
Sudan I 0.9970 25194 5.7 56.6
Sudan I 0.9974 21022 3.4 33.7
Sudan I 0.9977 21800 8.4 84.0
Sudan I 0.9951 19579 4.0 40.4
Selettività e specificità
Viene valutata in rapporto ai tempi di ritenzione dei singoli analiti e comparando lo spettro
ottenuto dalla frammentazione.
Incertezza
L’incertezza viene calcolata ricorrendo al metodo empirico di Horwitz, tale relazione trova
riscontro nella formula:
CVR% = 2
93
(1 - 0.5logC)
Dove CVR% è lo scarto tipo e C la concentrazione dell’analita espresso in g/100.
Sulla scorta di tale indicazione, l’incertezza estesa, ad un grado di copertura del 95% (t=1.96)
risulta essere per i due livelli di concentrazione indagati 23.5 e 174 µg/kg
CONCLUSIONI
Grazie all'esperienza acquisita sinora, il Polo Chimico Regionale Alimeti dell’ARPA del
Piemonte è stata in grado di fornire un adeguato supporto analitico agli organismi di controllo,
il metodo analitico proposto rispetta tutti i criteri di accettabilità e pertanto risulta validato ed
è utilizzato in laboratorio con risultati soddisfacenti.

Enrico Brignardello Filone tematico C1
Potenziamento della terapia radiometabolica del carcinoma tiroideo
mediante pre-trattamento differenziante
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Oncologia – S. C. Endocrinologia Oncologica
OBIETTIVO
L’obiettivo dello studio era di verificare se, in pazienti già sottoposti a tiroidectomia totale per
carcinoma della tiroide ed in attesa di ablazione del residuo tiroideo, l’assunzione di valproato
nel mese precedente la somministrazione della dose terapeutica di 131-I poteva migliorare
l’efficacia della terapia radiometabolica. L’ipotesi di lavoro era basata su risultati preliminari
ottenuti dal nostro gruppo di ricerca “in vitro”, che sono stati pubblicati nel 2004 (J Clin
Endocrinol Metab 89: 1006-1009, 2004). I dati dimostravano che l’acido valproico, farmaco
abitualmente utilizzato come agente anticonvulsivante, antiemicranico e stabilizzatore del
tono dell’umore, è in grado di aumentare significativamente l’espressione genica del NIS
(Na/I Symporter) e l’internalizzazione dello iodio radioattivo in colture cellulari di carcinoma
differenziato della tiroide. Ciò è dovuto all’attività inibitoria sull’enzima istone deacetilasi,
che è propria dell’acido valproico, il che consente di migliorare il grado di differenziazione
cellulare.
MATERIALI E METODI
Sono stati arruolati 30 pazienti, suddivisi in due gruppi. Quindici pazienti (VPA +) hanno
assunto valproato alla posologia di 1 g / die (Depakin chrono 500 mg 2 cpr alla sera) nei
trenta giorni precedenti il trattamento radiometabolico. Gli altri quindici pazienti (VPA -), che
sono serviti come gruppo di controllo, sono stati trattati in modo convenzionale (cioè, senza
assumere valproato prima della somministrazione di 131-I). La terapia con valproato è stata
ben tollerata ed in nessun caso è stato necessario sospenderla, per intolleranza o per
alterazione degli esami di laboratorio. In entrambi i bracci dello studio (VPA + e VPA -),
alcuni pazienti hanno lamentato una sintomatologia soggettiva chiaramente riferibile
all’ipotiroidismo iatrogeno. Questa condizione, necessaria per la buona riuscita del
trattamento radiometabolico, è stata indotta mediante la sospensione della terapia sostitutiva
con l-tiroxina nei 30 giorni precedenti la somministrazione della dose terapeutica di 131-I
(cioè, per tutto il periodo di assunzione del valproato nel gruppo VPA +).
RISULTATI
I livelli sierici medi di acido valproico ottenuti nei pazienti del gruppo VPA + sono risultati di
107 +/- 23,6 µg / ml, adeguati per ottenere l’effetto desiderato (inibizione della istone
deacetilasi) e ben al di sotto della soglia di tossicità (200 µg/ml), che non è stata raggiunta in
nessun caso. L’entità del parenchima tiroideo residuo dopo l’intervento di tiroidectomia
totale, misurata ecograficamente e calcolata secondo la formula del modello ellissoidale, è
risultata simile nei due gruppi e quindi ininfluente ai fini della captazione di 131-I. Anche il
livello sierico di TSH, che può influenzare la percentuale di captazione dello iodio radioattivo
da parte del residuo tiroideo, non è risultato significativamente diverso nei due gruppi. Infatti
94

nella condizione di massimo ipotiroidismo iatrogeno indotto dalla sospensione della terapia
sostitutiva con l-tiroxina (cioè il giorno del trattamento radioiodiometabolico con 131-I) il
livello sierico di TSH è risultato 56,6 +/- 29,5 mUI/l nel gruppo trattato con valproato (VPA
+) e 90,4 +/- 72,1 mUI/l nel gruppo di controllo (p = 0,211938). Anche la joduria / 24 ore,
espressione del contenuto iodico dell’organismo (che può anch’esso modificare notevolmente
la captazione del 131-I da parte del parenchima tiroideo residuo), è risultata del tutto
sovrapponibile nei 2 gruppi.
La capacità di concentrare lo iodio radioattivo nel parenchima tiroideo residuo non è risultata
significativamente diversa nei due gruppi di pazienti. Rispetto alla dose totale somministrata,
la captazione in loggia tiroidea è infatti risultata 2,54 +/- 1,71% nel gruppo trattato con
valproato (VPA +) e 3,07 +/- 1,77% nel gruppo di controllo (media +/- deviazione standard; p
= 0,53085). Lo studio ha cioè dimostrato che il pre-trattamento con acido valproico non
aumenta la captazione dello iodio radioattivo (e quindi l’efficacia del trattamento
radiometabolico per l’ablazione del residuo tiroideo) nei pazienti precedentemente sottoposti
ad intervento chirurgico di tiroidectomia totale per carcinoma della tiroide.
Il risultato ottenuto, che è contrario all’ipotesi di lavoro, è dovuto con ogni probabilità al il
fatto che l’acido valproico, per il suo effetto inibitorio sull’istone deacetilasi, consente la redifferenziazione
di cellule trasformate in senso neoplastico (e quindi il recupero di alcune loro
caratteristiche funzionali, nel caso specifico, la capacità di concentrare lo iodio all’interno
della cellula), ma non ha alcuna efficacia sui tireociti normali, quali sono quelli del residuo
tiroideo di un paziente operato per carcinoma della tiroide, che sono già completamente
differenziati. Non si può pertanto escludere in modo definitivo che gli interessanti risultati
ottenuti “in vitro” possano essere traslati sul piano clinico. A tal fine, partendo dai risultati
ottenuti, è stato disegnato ed avviato un nuovo studio clinico (condotto in collaborazione con
la S.C. Medicina Nucleare dell’Ospedale SS. Antonio e Biagio di Alessandria) che ha
l’obiettivo di verificare se il pre-trattamento con VPA può aumentare la capacità di
concentrare lo iodio radioattivo nelle metastasi (quindi in cellule tumorali) di carcinoma
tiroideo papillifero o follicolare, migliorando così l’efficacia del trattamento radiometabolico
in questo sottogruppo di pazienti.
95

Guido Brizio Filone tematico B1
“Benessere animale": alternativa all'eccessiva medicalizzazione
dell'allevamento cunicolo
ASL 17 Fossano - Saluzzo – Savigliano
Dipartimento di Prevenzione - Servizio Veterinario 17/2
Area "C": Igiene degli Allevamenti e delle Produzioni Zootecniche
MATERIALI E METODI
Quattro allevamenti cunicoli del Saluzzese (A1-4) sono stati monitorati per 200 gg. da maggio
a novembre 2004. Gli elementi raccolti in 8 sopralluoghi erano di tipo:
• strutturale (planimetria, tipologia e capienza delle gabbie, sistemi di circolazione
dell’aria);
• ambientale (T°, UR, NH3, CO2, H2S al centro e presso gli estrattori);
• gestionale (tipo genetico, mortalità, rimonta, peso di vendita, terapie, mangimi);
• diagnostico (esami batteriologici, parassitologici, ricerca di Clostridi ed inibenti,
necroscopie su complessive 61 carcasse (IZS-Cuneo), analisi dell’acqua (ARPA-Cuneo),
analisi ematiche e di pelo su 146 soggetti in vita o deceduti (ISZ-Torino)).
Le aziende adottano gabbie standard, ibridi commerciali, trattamenti vaccinali, antielmintici,
ormonali e mangime medicato di routine (A2,3,4 anche zincobacitracina), smaltimento delle
deiezioni con fossa bassa e raschiatore (A1,3,4) o fossa profonda (2), ventilazione forzata
trasversale (3) o longitudinale (A1,2,4), acqua di pozzo (3) o acquedotto (1,2,4).
RISULTATI
Per A1 la mortalità monitorata è stata del 4%, l’intervallo interparto maggiore, con rimonta al
96%/anno ed i soggetti sono macellati a 90 d (peso medio 3 Kg); per gli altri il ritmo
riproduttivo è apparso più spinto, vendono prima (85 d a 2,7 kg) con mortalità oscillanti da
1% (A4) a 6% (A2,3). Le 30 analisi ambientali hanno evidenziato valori conformi di T°(13°-
25°) e UR (80-40%); tassi di NH3>10 ppm nel 50% dei rilievi a metà capannone per A2 e A4,
nel 25% per A3 e solo nel 12% per A1, ma valori medi costantemente superiori (spesso >20
ppm) presso i ventilatori in funzione. Nel solo A3 l’NH3 ha superato 30 ppm per un errato
regime di ventilazione intermittente programmata ad ore invece che su T° (prontamente
corretto); in A4 il riposizionamento delle sonde ha migliorato l’efficienza del sistema.
Globalmente i riscontri microclimatici più stabili, nonostante la variabilità stagionale, sono
stati osservati in A1 strutturalmente più vecchio e polveroso; per A2 hanno inciso
negativamente l’ampiezza ed altezza della struttura ed il tipo di fossa (trattata in itinere con un
sanitizzante); per A4 una grande escursione termica del luogo e la struttura-tunnel.
Relativamente alla CO2 valori>1300 ppm (peraltro conformi) si sono registrati in metà
rilevazioni presso A2 e A3, mai in A1 e A4. L’H2S è stata costantemente conforme (

Gli allevatori hanno mostrato grande sensibilità per gli aspetti sanitari, con adeguamento della
terapia antibatterica in funzione degli esiti di laboratorio, osservandosi una riduzione della
mortalità ove elevata. Nel dettaglio:
A1: 17 autopsie, 17 enterocolite enzootica, 7 broncopolmoniti, 1 polmonite, 1 endometrite; 16
E. coli, 3 Proteus, 2 Clostridium perfringens, 6 Pasteurella multocida, 4 non identificati;
A2: 6 autopsie, 6 enterite enzootica; 4 E. coli, 4 Clostridium spiriforme, 1 Citrobacter
freundii, 1 Clostridium perfringens, 3 non identificati; 3 coccidi 4 saccaromicosi. Ricerca
inibenti: 1 positività;
A3: 13 autopsie, 13 enterite enzootica, 1 tiflite emorragica, 3 broncopolmoniti, 1 polmonite;
13 E. coli, 2 Proteus, 6 Pasteurella multocida, 1 non identificato; 2 coccidi, 4 saccaromicosi;
A4: 25 autopsie, 19 enterite enzootica, 5 enteriti mucose, 2 polmoniti; 15 E. coli, 4 Proteus, 3
Clostridium spiriforme, 1 Clostridium sordellii, 1 Clostridium perfringens, 1 Pasteurella
multocida, 3 Staphylococcus aureus, 2 non identificati; 9 coccidi, 13 saccaromicosi.
Ricerca inibenti: 4 positività. Secondo le attese il quadro degli antibiogrammi è apparso
estremamente variegato, anche nello stesso allevamento: dei 14 antibatterici testati (anti
Gram+ e Gram-) di comune impiego nella specie, nessuno ha dimostrato un’efficacia
significativamente superiore. In particolare la resistenza alla bacitracina è stata elevata: 50%
in A2, 65% in A3 e A4. Dall’indagine emerge la temuta correlazione fra fattori stressanti (A3:
gas nocivi; A4 sbalzi termici) e patologie polifattoriali (enterite, dermatofitosi,
broncopolmonite). Ne consegue che l’elevata mortalità da enterocolite nel coniglio trova
come possibile difesa l’uso mirato ed alternato di antibiotici (sulfadimetossina, amminosidina,
colistina, zincobacitracina attivi contro i Gram-) ed anticoccidici (Diclazuril e Robenidina),
soli o in combinazioni multiple. Emerge peraltro chiaramente la tendenza all’uso improprio
del farmaco, ma soprattutto il circolo vizioso creatosi fra trattamenti, patologia e mortalità
(A3, A4). Uno studio originale condotto sul pelo di 151 soggetti ha evidenziato risultati
innovativi per associare allo spettro NIR il presumibile stato di salute dell’individuo,
codificato fra 1 morto e 2 vivo (R2 validazione=0,67) nonché sull’originalità dell’allevamento
(R2 validazione =0,64). Una valutazione oggettiva del benessere in giovani soggetti sani,
realizzata mediante parametri emo-gas, elettrolitici e metabolici, ha evidenziato situazioni
significativamente diversificate. In primavera-estate sono incrementati Na+ (142 vs 139) ed
urea (51 vs. 35) mentre sono ridotti divario anionico, pCO2 e glicemia (135 vs 144). Fra
allevamenti sono comparse deviazioni relativamente a: Na+, Urea, divario anionico, HCO3-,
Eccesso base (BEecf) e pCO2, confermate da un’originale analisi di spettrometria-NIR del
micro-capillare (R2validazione=0,93). Variazioni multifattoriali di origine ambientale,
compreso l’effetto genetica-allevamento, possono dunque incidere sugli apparati digerente
(ingestione solida/liquida), escretorio (urina) e respiratorio (eliminazione di CO2) con riflessi
sul livello energetico (glicemia) e specialmente di uremia. Il profilo del migliore allevamento
(A1) potrà servire di riferimento ad altre situazioni prodromiche di tecnopatie e di enteriti,
sempre incombenti.
CONCLUSIONI
In conclusione, una riduzione dei trattamenti antibiotici in questo allevamento neotecnologico
(al 4° posto nella zootecnia italiana, ma al 1° nel mondo) è obiettivo ragionevole,
purché lo stato di salute sia monitorato nelle fasi critiche (post-svezzamento, inizio lattazione)
e purché le condizioni nutrizionali-ambientali (non sinonime di modernità, ma “parenti” del
benessere) garantiscano un corretto stato fisiologico. L’augurio è che probiotici nuovi o
rinnovati possano in futuro dare risultati efficaci (soluzione del problema) ed efficienti (costo
sostenibile).
97

Sandra Brunelleschi Filone tematico A4
Recettori PPAR-gamma in monocito/macrofagi umani: loro rilevanza
nell'aterosclerosi, in particolare nei fumatori
Università degli Studi del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”
Dipartimento di Scienze Mediche
CONTESTO E RAZIONALE
Monocito/macrofagi svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo dell’aterosclerosi. I
monociti circolanti aderiscono all’endotelio attivato e migrano nella parete arteriosa; quindi
differenziano in macrofagi che esprimono i geni per i recettori “scavenger” che mediano
l’uptake delle LDL ossidate. I recettori scavenger SR-A e CD36, espressi sulla superficie dei
macrofagi, legano e internalizzano il colesterolo-LDL, con trasformazione dei macrofagi in
“foam-cells” pro-aterogene. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-gamma (PPAR-g) è
un recettore nucleare in grado di regolare il metabolismo lipidico e glucidico. E’ espresso nel
tessuto adiposo e in diverse popolazioni cellulari, compresi monocito/macrofagi e “foam
cells”. PPAR-g è attivato da ligandi endogeni (ad es., 15-deossi PGJ2, ox-LDL) e da ligandi
sintetici, quali, ad es. gli antidiabetici orali della classe dei tiazolidindioni ed alcuni peculiari
anti-infiammatori non steroidei. E’ stato ipotizzato che l’attivazione di PPAR-g in
monocito/macrofagi sia in grado di esercitare un ruolo anti-aterogeno, ma le informazioni in
letteratura sono ancora assai controverse e largamente incomplete.
OBIETTIVO
Obiettivo prioritario del progetto è stato quello di valutare l’espressione di PPAR-g nei
monociti (M) e macrofagi (MDM: monocyte-derived macrophages, preparati dai monociti
coltivati per 7-10 gg in RPMI 1640 arricchito con siero bovino al 20%) di pazienti con
aterosclerosi documentata (fumatori, non fumatori ed ex-fumatori) confrontandola con quella
di donatori sani di pari età ed analogo stile di vita. Questo progetto (che ha rappresentato la
“base” per un successivo Progetto Cofin tuttora in corso, finanziato nel 2004, e di cui la
scrivente è coordinatore nazionale) si proponeva, inoltre, di valutare l’espressione di
scavenger receptors (soprattutto, CD36) e la liberazione di citochine pro-infiammatorie.
MATERIALI E METODI
Sono stati valutati 15 donatori sani (8 non fumatori e 7 fumatori) e 31 pazienti (24 uomini e 7
donne) afferenti alla Divisione di Cardiologia Universitaria dell’Ospedale Maggiore della
Carità di Novara. Di questi, 7 pazienti presentavano infarto miocardio acuto, 4 pazienti angina
stabile, 14 angina instabile e 4 ischemia silente. Alla coronarografia, 12 pazienti presentavano
malattia monovasale, 5 pazienti malattia bivasale, 3 malattia trivasale e 4 malattia plurivasale.
Ipertensione era presente in 25 pazienti, dislipidemia in 17 pazienti e diabete NIDDM in 8
pazienti. Ovviamente, tutti i pazienti erano in terapia farmacologia. Inoltre, 5 pazienti erano
fumatori, 12 ex-fumatori e 14 non fumatori. PPAR-g è stato valutato come proteina (Western
blot), con lettura al Versadoc (BioRad, strumento in grado di valutare la chemiluminescenza
direttamente dalla membrana di nitrocellulosa): le bande relative a PPAR-g e b-actina sono
state quantificate e l’espressione di PPAR-g è stata valutata come rapporto PPAR-g/b-actina.
In alcuni casi, l’espressione è stata valutata anche con real-time quantitativa.
98

RISULTATI
I risultati ottenuti dimostrano che:
a) PPAR-gè costitutivamente espresso (rapporto PPAR-g/b-actina = 0.426 + 0.08; n = 8), nei
monociti (M) isolati da donatori sani non fumatori. La sua espressione aumenta
significativamente con la differenziazione a macrofagi: l’espressione basale di PPAR-g,
già aumentata dopo 4 gg di differenziamento è assai rilevante (0.88 + 0.04; n = 8; p < 0.01
vs M) negli MDM.
b) Sia nei M che negli MDM, l’espressione di PPAR-g è significativamente aumentata
quando le cellule sono cimentate con 15d-PGJ2 (5 uM, 6h) o con ciglitazone (50 uM, 6h):
nei M, ciglitazone e 15d-PGJ2 aumentano di circa 2 volte l’espressione di PPAR-g. Negli
MDM di donatore sano non fumatore, 15d-PGJ2 aumenta l’espressione di PPAR-g di
circa 3 volte, il ciglitazone solo di 1.8 volte. Entrambi gli agonisti aumentano
l’espressione di PPAR-g mRNA di circa 1.5 volte (n = 4; p < 0.05 vs M) negli MDM di
donatore sano.
c) L’espressione di PPAR-g sia basale che indotta da ligandi agonisti, è aumentata di 2 – 3
volte nei monocito/macrofagi di fumatori sani, rispetto ai non fumatori.
d) Agonisti PPAR-g inibiscono potentemente il “release” di citochine sia nei M che negli
MDM, il ciglitazone dimostrandosi più potente (85% e 75% di inibizione della liberazione
di TNF-a e di IL-6, rispettivamente) della 15d-PGJ2 (circa 60 % di inibizione della
liberazione di TNF-a e circa 50% di inibizione della liberazione di IL-6). Come noto, M e
MDM di fumatori sani liberano quantità significativamente più elevate di TNF-a rispetto
ai non fumatori.
e) 15d-PGJ2 aumenta l’espressione dello scavenger receptor CD36 negli MDM, soprattutto
se ottenuti da fumatori sani, ma non nei M di non fumatori.
f) Nei M di pazienti, l’espressione basale di PPAR-g, sempre ben documentabile, presenta
una ampia variabilità (rapporto PPAR-g/b-actina = 0.93 + 0.3; n = 31) e non si osservano
differenze, statisticamente significative, nell’espressione di questo recettore tra pazienti
fumatori, non-fumatori ed ex-fumatori, probabilmente attribuibili alla scarsa numerosità
(solo 5 pazienti) dei fumatori. Negli 8 pazienti con diabete non-insulino dipendente, il
rapporto PPAR-g/b-actina è pari a 2.06 + 0.5 (p < 0.05 rispetto ai donatori sani): questa
osservazione merita ulteriori approfondimenti.
g) Al contrario, l’espressione di PPAR-g è significativamente aumentata negli MDM dei
pazienti con coronaropatia rispetto ai donatori sani. Infatti, negli MDM ottenuti da
donatori sani l’espressione di questo recettore è aumentata di 1.87 + 0.3 volte (n = 8), nei
pazienti con coronaropatia l’incremento di espressione è anche di 12-15 volte.
h) L’espressione basale di PPAR-g negli MDM ottenuti da pazienti non fumatori o exfumatori
(significativamente aumentata rispetto al donatore sano) risulta più elevata di
quella riscontrata nei pazienti fumatori; il dato, però, è “falsato” dall’esiguo numero di
pazienti fumatori valutati.
i) L’’espressione basale di PPAR-g negli MDM ottenuti da pazienti ipertesi è
significativamente aumentata (p < 0.05) rispetto ai non-ipertesi; pazienti affetti da diabete
e ipertensione (n = 5) presentano in assoluto la più elevata espressione di questo recettore
(aumento di 18 + 4 volte).
Lo studio sta proseguendo per aumentare la casistica e, dunque, consentire una migliore
valutazione statistica per i fattori di rischio. Sono stati presentati 2 abstracts e 1 manoscritto è
in preparazione Amoruso A, Gunella G, Vassanelli C, Brunelleschi S. Espressione del
recettore PPAR-g in monocito/macrofagi di volontari sani, fumatori e non. IV Congresso
Regionale della SISA, Milano 16.10.2004, pag. 3. Amoruso A, Viano I, Brunelleschi S.
PPAR-g and CD-36 receptor expression in monocyte/macrophages of healthy smokers and
non-smokers. XXIII Congresso Nazionale SISA, Palermo 26-29 novembre 2004; P51.
99

Benedetto Bruno Filone tematico A1
Ricostituzione anticorpale dopo trapianto allogenico di cellule
emopoietiche e prevenzione delle infezioni
Università degli Studi di Torino
Dipartimento Assistenziale di Oncologia
OBIETTIVO
Valutazione della ricostituzione immunologica del compartimento B dopo trapianto
allogenico non mieloablativo
MATERIALI E METODI
Pazienti e Donatori - Criteri di inclusione: pazienti di età inferiore ai 65 anni affetti da
mieloma multiplo e sottoposti a trapianto non mieloablativo da donatore familiare
(fratello/sorella non gemello) HLA-identico di età compresa tra i 12 e i 75 anni.
Terapia e Trapianto Allogenico. I pazienti vengono sottoposti a cicli di chemioterapia di
induzione tipo VAD e a trapianto autologo ai fini di ottenere un’iniziale riduzione della
malattia. Viene poi eseguito il trapianto allogenico con regime di condizionamento non
mieloablativo caratterizzato dalla somministrazione di irradiazione corporea totale (TBI) a
basse dosi, 200 rads.
Raccolta di PBSC dal donatore. Il protocollo di mobilizzazione di PBSC dal donatore
prevede la somministrazione di G-CSF alla dose di 16µg/kg/die s.c. per 5 giorni consecutivi
dal giorno -4 dal trapianto al giorno 0. La raccolta di PBSC allogeniche avviene tramite
procedure di leucaferesi, eseguite nel pomeriggio del giorno -1 dal trapianto e al mattino del
giorno 0. La prima raccolta viene conservata a 4° C per 24 ore circa. Al termine della seconda
raccolta, il prodotto delle due raccolte viene unito in un’unica sacca, ed infusa nel ricevente,
previa analisi citofluorimetrica del contenuto delle cellule CD34+ e CD3+.
Citofluorimetria e nefelometria. L’assetto immunofenotipico dei linfociti B periferici è stato
definito citofluorimetricamente attraverso l’espressione degli antigeni di superficie CD 19,
CD20 su sangue midollare e periferico. I livelli di Ig sono stati valutati con metodo
nefelometrico. La nefelometria è un metodo ottico di microanalisi che permette di dosare la
concentrazione di sostanze finemente disperse in un liquido. Il principio su cui si basa
consiste nel misurare comparativamente la quantità di luce dispersa dalla sospensione in
esame. La misurazione nefelometrica viene eseguita mediante un fotometro. Il siero dei
pazienti, ottenuto per centrifugazione, è stato fatto reagire con anti-sieri noti specifici per le
varie classi di Ig. In base alla quantità di luce dispersa dagli immunoprecipitati formatisi, si è
poi andati a misurare quante Ig erano presenti nei sieri prima del trapianto, dopo il trapianto e
a 3, 6, 12 mesi post-trapianto. In contemporanea si è eseguito un quadro elettroforetico
proteico per valutare l’assetto proteico nel siero dei pazienti. Inoltre, come parte integrante
dello studio, è stata valutata con metodo ELISA la ricostituzione anticorpale specifica contro
Tetano, Difterite e Poliovirus.
Correlazioni cliniche Dati clinici e di laboratorio sono stati raccolti dalle cartelle cliniche.
Sono state valutate possibili correlazioni tra ricostituzione anticorpale ed incidenza di
complicanze trapiantologiche quali la GVHD. Inoltre, si è correlata la produzione anticorpale
con la risposta della malattia post-trapianto dividendo i pazienti in due gruppi:
100

a) ottenimento della remissione completa clinica post trapianto;
b) non ottenimento della remissione.
RISULTATI
Diciotto pazienti affetti da mieloma multiplo sottoposti a trapianto allogenico non
mieloablativo sono stati sinora valutati. La risalita dei linfociti B post trapianto è risultata
simile a quello dei soggetti in eta’ neonatale e pediatrica. Nell’immediato periodo post
trapianto i valori di linfociti B CD19-pos CD20-pos circolanti sono risultati mediamente
molto bassi rispetto agli individui normali nei quali i valori di riferimento sono considerati dai
50/µl ai 500/µl. Si è notato un graduale recupero che diventa pero’ consistente solo a due-tre
anni dal trapianto non mieloablativo indicando un prolungato periodo di immunosoppresione.
Il rialzo delle classi G, A ed M delle immunoglobuline segue l’andamento dei linfociti B.
Rimane pero’ importante il fatto che lo stato della malattia mielomatosa, in remissione (RC) o
non in remissione, ha giocato un ruolo fondamentale. Il recupero anticorpale è stato
policlonale nei pazienti in RC ed è stato quindi qualitativamente più efficace. Inoltre, pur
rimanendo tendenzialmente ai valori inferiori della norma, le IgG1 e IgG3 ricalcano la
normale ontogenesi. Le IgG4 rimangono notevolmente ridotte rispetto ai valori normali
durante tutto il periodo di osservazione. Nei pazienti che non hanno raggiunto la remissione è
costituito in buona parte dalla componente monoclonale del mieloma. Inoltre, si nota la
riduzione delle IgA ed IgM che caratterizza la retroinibizione della produzione delle
immunoglobuline policlonali da parte del clone neoplastico. Inoltre, nei pazienti che hanno
raggiunto la RC, c’e’ un trend statistico per un aumento dell’incidenza di malattia da trapianto
contro l’ospite (graft versus host disease, GVHD) (p=0.06) che denota la presenza di un
potente effetto antitumorale, ma potrebbe anche confermare l’osservazione di alcuni autori
dell’implicazione del compartimento cellulare B nella patogenesi della GVHD.
In un sottogruppo di 10 pazienti si è valutata la risposta umorale specifica contro antigeni
comuni prima e dopo vaccinazione contro il tossoide tetanico, la difterite ed i poliovirus. Si è
notata una buona risposta a tutte le stimolazioni antigeniche sottolineando l’importanza di
programmi di vaccinazione specifica post-trapianto avvenuti a circa un anno dal trapianto nei
pazienti studiati
CONCLUSIONI
La ricostituzione del compartimento B nei pazienti affetti da mieloma sottoposti a trapianto
allogenico non mieloablativo ricorda l’ontogenesi dei linfociti B. La ripresa del numero dei
linfociti B post trapianto è graduale e raggiunge valori normali solo dopo parecchi mesi dal
trapianto. Inoltre, il rialzo ricorda quello fisiologico notato nei neonati e nei soggetti in età
pediatrica che hanno raggiunto la remissione della malattia. La ricostituzione anticorpale
dipende fortemente dallo stato della malattia di base. Nel caso di malattia in remissione vi è
un incremento policlonale delle immunoglobuline che segue quello dei linfociti B con
recupero dei valori di IgG, IgA ed IgM. La vaccinazione si è rivelata utile per stimolare la
produzione anticorpale contro difterite, tetano e poliovirus. Pur rimanendo tendenzialmente ai
valori inferiori della norma, le IgG1 e IgG3 ricalcano la normale ontogenesi. Le IgG4
rimangono notevolmente ridotte rispetto ai valori normali durante tutto il periodo di
osservazione. Nel gruppo di pazienti studiato, la remissione completa ha portato ad un buon
recupero della funzionalità umorale che ha ridotto significativamente gli episodi infettivi.
Essi, salvo altre indicazioni cliniche, non necessitano di infusione di immunoglobuline a
scopo profilattico con un notevole risparmio della spesa sanitaria.
101

Graziella Bruno Filone tematico D1
Incidenza di retinopatia diabetica nella coorte di popolazione del registro
diabete tipo 1 della provincia di Torino
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina Interna
CONTESTO E RAZIONALE
Le complicanze oculari del diabete rappresentano la principale causa di cecità in età
lavorativa nei paesi industrializzati. In uno studio condotto nella Provincia di Torino - basato
sull’archivio delle indennità erogate per cecità - la retinopatia diabetica è risultata la seconda
causa di cecità, preceduta solo dalla cataratta. La fotocoagulazione mediante laser si è
dimostrata efficace nel ridurre la cecità conseguente a retinopatia in almeno il 60% dei casi,
ma un numero ancora maggiore di pazienti ne potrebbe trarre beneficio se il trattamento fosse
somministrato in stadi sufficientemente precoci della malattia. Tuttavia, la retinopatia ad alto
rischio non causa sintomi visivi e quando questi ultimi si manifestano è spesso troppo tardi
per correggerli. Un periodico programma di screening riduce il rischio di evoluzione in
retinopatia proliferante.
Il diabete tipo 1 interessa soggetti in giovane età nei quali le complicanze della malattia hanno
un elevato costo sociale e pesanti conseguenze sulla capacità lavorativa. Studi condotti negli
Stati Uniti e in Europa hanno evidenziato come il 40% dei soggetti con diabete tipo 1 sia
affetto da retinopatia diabetica non proliferante e il 10% da retinopatia proliferante. I
principali fattori di rischio identificati sono il compenso glicemico e la durata di malattia.
Secondo alcuni autori, inoltre, la retinopatia è associata a insulino-resistenza ed ad alterazioni
del quadro lipidico. Tuttora controverso è invece il ruolo della durata di malattia nella fase
prepuberale, definita da età < 11 anni nei maschi e

soggetti sono stati reclutati tramite la collaborazione dei servizi diabetologici di riferimento.
Ogni soggetto è stato quindi invitato presso il Centro della Retina del Dipartimento di
Medicina Interna dell’Università di Torino (Ospedale Molinette) dove sono state effettuate
due fotografie retiniche. Uno specialista esperto nel settore ha provveduto quindi alla lettura e
alla classificazione delle immagini. Rispetto all’esame del fondo dell’occhio, la fotografia
consente una documentazione permanente e documentabile nel tempo; tale procedura è
indispensabile per garantire la validità della lettura effettuata, secondo modalità standardizzate
a livello internazionale.
Sono stati desunti retrospetticamente dalla documentazione clinica di ogni caso della coorte i
valori di HbA1c al fine di calcolare l’HbA1c individuale cumulativa media; sono inoltre stati
valutati dati clinici attuali (pressione arteriosa, peso, circonferenza vita).
Sono stati esaminati finora 346 soggetti con diabete mellito tipo 1, di età 26 ± 7 anni, durata
di malattia 10± 3 anni. In questi, la prevalenza di retinopatia diabetica è risultata bassa (3.1%),
con soli 2 casi affetti da retinopatia proliferante. Il compenso glicemico è mediamente
risultato ottimo(HbA1c 7.2 ± 0.4). Nell’insieme, questi dati sottolineano l’elevata qualità della
cura erogata ai diabetici nella nostra area geografica. Al completamento dell'analisi statistica,
i dati verrano utilizzati per produrre una pubblicazione scientifica internazionale.
103

Alfredo Brusco Filone tematico A2
Biologia dei metalli pesanti in linee e modelli cellulari di malattie
neurodegenerative ereditarie
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica
CONTESTO E RAZIONALE
Tra i metalli pesanti, il cadmio (Cd) è stato recentemente coinvolto come inibitore diretto dei
meccanismi di riparazione del DNA di tipo “mismatch repair” (MMR). In particolare si è
dimostrato come nel lievito l’incubazione con concentrazioni di CdCl2 di 5 uM causi una
ipermutabilità inibendo direttamente il sistema MMR. Sia nell’uomo che nel lievito, due
distinti complessi eterodimerici si occupano di correggere i mismatch: MSH2/MSH6
riconosce mismatch di singola base, mentre MSH2/MSH3 riconosce piccoli loop. E’ noto che
mutazioni in uno dei geni di queste proteine causa un’instabilità genomica, visibile come
instabilità dei microsatelliti, ed aumenta drasticamente l’incidenza di alcuni tumori umani,
quali il tumore al colon. Mutazioni nei geni MMR sono la causa genetica principale di un
gruppo di tumori noti come HNPCC (Hereditary Non Polyposis Colon Cancer). Queste forme
di tumore sono ereditarie e vengono diagnosticate anche attraverso l’analisi dell’instabilità di
marcatori microsatelliti, in particolare dei marcatori noti come BAT25, BAT26 e BAT40.
OBIETTIVO
Abbiamo deciso di verificare se il cadmio potesse influenzare l’instabilità di regioni
microsatellite che si trovano espanse ed instabili nella trasmissione famigliare in patologie
neurodegenerative. In particolare, abbiamo selezionato tre patologie, due dovute ad espansioni
di una ripetizione codificante CAG (Atassia Spinocerebellare autosomica dominante di tipo
SCA1 e SCA2), ed una dovuta all’espansione di una ripetizione GAA intronica (Atassia di
Friedreich). Le SCA sono un gruppo di patologie neurodegenerative caratterizzate da atassia
cerebellare progressiva, spesso associata ad altri sintomi neurologici. Le SCA sono
geneticamente eterogenee, e comprendono al momento 23 sottotipi (SCA1-8, SCA10-22, 25 e
SCA-FGF14). L’atassia di Friedreich (FA) è dovuta all’assenza della proteina fratassina,
normalmente localizzata nei mitocondri. La sua funzione è legata al metabolismo del Ferro
all’interno dei mitocondri ed al suo flusso attraverso la membrana mitocondriale.
MATERIALI E METODI
Abbiamo esaminato il comportamento delle ripetizioni espanse in tre linee linfoblastoidi: una
linea SCA1 con 50 ripetizioni CAG, una linea SCA2 con 42 ripetizioni CAG ed una linea FA
con 550/800 ripetizioni GAA. E’ stata inoltre utilizzata una linea derivata da un soggetto sano
come controllo. Le linee sono state divise in quattro aliquote: una non trattata, e tre trattate
con una concentrazione crescente di CdCl2: 0, 2.5 uM, 5 uM, 50 uM. Le linee sono state
recuperate dopo 48h, 96 h, 8 g, 16 g. Per ciascuna aliquota è stato estratto il DNA genomico
usando il kit Nucleospin DNA extraction kit (Macherey-Nagel). L’instabilità delle regioni
microsatellite è stata valutata mediante PCR fluorescente amplificando il marcatore BAT26,
che contiene un omopolimero poly-A. Per ciascuna linea è stata inoltre amplificata la regione
corrispondente alla ripetizione espansa. Gli amplificati delle regioni BAT26, SCA1 e SCA2
104

sono stati corsi su sequenziatore automatico ABI 3100 avant e analizzati mediante il software
Genescan ver 2.6 (Applied Biosystems). La ripetizione GAA del gene FRDA1 è stata invece
verificata su gel di agaroso 0.6%-TBE 1X.
RISULTATI
L’instabilità del microsatellite BAT26 viene definita dall’aumento/diminuzione di almeno tre
basi del picco principale. In nessuna linea, esaminata per i quattro tempi, corrispondenti a 2-4-
8-16 divisioni, e tre concentrazioni crescenti di CdCl2 (2,5, 5, 50 uM), è stata verificata
un’instabilità del microsatellite BAT26. Anche l’analisi delle ripetizioni CAG nei geni SCA1
e SCA2 nelle rispettive linee con espansione, e della ripetizione GAA nella linea FA non
hanno mostrato alcuna instabilità, confrontando la stessa linea nelle 16 aliquote diverse (4
tempi, 4 concentrazioni di cadmio). Alla concentrazione di 50 uM di CdCl2 è stata notata una
forte inibizione della crescita.
CONCLUSIONI
Lunghi tratti omopolimerici sono soggetti a errori di replicazione normalmente corretti dai
sistemi MMR. Il CdCl2 è stato dimostrato essere coinvolto nell’inibizione di questi sistemi in
lievito (Jin et al. 2003). Il sistema utilizzato da questi autori evidenzia le mutazioni frameshift
in un omopolimero di (A)14 nel gene Lys2, con effetti già visibili ad una dose di 0.5 uM e
verificati fino 5 uM. L’effetto mutageno è proporzionale alla concentrazione di CdCl2, e
passa da 10 a 2000 volte. A 12.5 uM la crescita del lievito è inibita. Abbiamo cercato di
esaminare gli effetti mutageni del CdCl2 su linee linfoblastoidi contenenti ripetizioni di
triplette instabili, che nei pazienti tendono a variare spontaneamente di numero sia a livello
somatico che germinale. Siamo partiti dall’analisi di un omopolimero poly-A contenuto nel
microsatellite BAT26, e normalmente utilizzato per verificare l’instabilità dovuta alla
mancanza dei sistemi di riparo MMR in cellule umane. In nessun caso abbiamo potuto notare
un’instabilità di BAT 26. Poiché è stato dimostrato che in vitro CdCl2 inibisce i sistemi
MSH2-MSH6 in lisati di cellule umane (Clark e Kunkel, 2004), la mancanza di un effetto
visibile su BAT26 è inatteso. E’ anche stato dimostrato che linee mancanti di MSH2 non
aumentano in modo apprezzabile l’instabilità dei miscrosatelliti, in linea con l’ipotesi che
CdCl2 inibisca direttamente questo complesso.
I nostri dati e queste considerazioni suggeriscono che solo lunghi periodi di esposizione al
CdCl2 permettano di vedere risultati apprezzabili sull’instabilità delle linee. Inoltre l’uso di
ripetizioni GAA di 500-800 ripetizioni avrebbe dovuto evidenziare un effetto del metallo
sull’instabilità anche lieve, poiché essendo così ampie, queste ripetizioni sono facilmente
soggette ad errori di replicazione dovuti allo slittamento della polimerasi. E’ anche possibile
che i sistemi di riparazione MMR umani, più complessi di quelli del lievito, ritardino l’effetto
delle concentrazioni di cadmio utilizzate, che tuttavia non possono essere ulteriormente
elevate per un effetto tossico diretto del metallo sulla crescita cellulare.
Seguendo queste ipotesi, l’idea proposta da McMurray e Tainer (2003) che il Cadmio formi
all’interno di ripetizioni CAG complessi con il DNA aumentandone l’instabilità non sembra
tuttavia verosimile: ci saremmo attesi un effetto mutagenico marcato del Cadmio, molto più
evidente nei casi di espansione CAG In conclusione riteniamo che l’effetto tossico del CdCl2
sul sistema di riparazione MMR in cellule umane non sia visibile alle concentrazioni utilizzate
entro le 16 replicazioni. Proponiamo quindi ulteriori esperimenti simili a quelli descritti ma di
lungo termine (della durata di 6-8 mesi) per verificare l’effetto inibitore del metallo sui
sistemi MMR e sull’instabilità dei microsatelliti.
105

Carlo Buffa Filone tematico D1
Analisi clinico-epidemiologica, biochimica e molecolare delle malattie da
prioni dell'uomo in Piemonte
ASL3 di Torino
UO di Neurologia
Le malattie da prioni o encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST) sono patologie
neurodegenerative a prognosi infausta correlate al deposito di una proteina normalmente
presente nei tessuti normali che assume una conformazione alterata e precipita nel tessuto
nervoso.
Le EST umane vengono classificate in forme sporadiche (malattia di Creutzfeldt-Jakob
sporadica [sCJD], insonnia fatale sporadica [sFI]), genetiche (malattia di Creutzfeldt-Jakob
genetica [gCJD], sindrome di Gerstmann-Straussler-Scheinker [GSS], insonnia fatale
familiare [fFI]), acquisite o infettive (malattia di Creutzeldt-Jakob iatrogena [iCJD] e variante
di CJD [vCJD] – quest’ultima forma epidemiologicamente correlata all’epidemia di
encefalopatia spongiforme bovina (BSE) degli anni ’90. È noto che una percentuale variabile
tra il 15 ed il 20% di tutte le malattie da prioni sono malattie ereditarie da riferire a mutazioni
del gene PRNP codificante la proteina prionica endogena. Pertanto nell’ambito del corretto
inquadramento diagnostico di queste malattie l’analisi di detto gene è un passo fondamentale.
A ciò si aggiunge l’osservazione che il tipo biochimico di proteina prionica (cosiddetto 2B)
che caratterizza la vCJD è spesso sovrapponibile a quello che si osserva in alcune forme
genetiche e pertanto risulta importante eseguire l’analisi della sequenza del gene tutte le volte
che il dato biochimico post-mortem è controverso.
Dal 2002 è attivo presso l’A.S.L. 3 il Centro per la Diagnosi e l’Osservazione delle Malattie
Prioniche dell’uomo (D.O.M.P.) che ha il ruolo di effettuare gli esami necessari alla diagnosi
di certezza delle EST umane.
Dal 2004 è stata implementata la metodica di sequenza diretta del gene PRNP per la ricerca
delle mutazioni. Si tratta di un gene costituito da due esoni la cui ORF (Open Reading Frame)
è contenuta nel secondo esone. Dal punto di vista metodologico viene effettuata una
amplificazione del secondo esone mediante PCR ed il suo successivo sequenziamento. I dati
vengono quindi analizzati mediante un software ad hoc. In presenza di mutazioni puntiformi il
risultato viene comunque validato mediante PCR-RFLP.
Al marzo 2006 sono stati studiati mediante sequenza dell’ORF 15 pazienti con sospetta EST.
Sono stati idenficati 7 casi genetici (2 con mutazione E200K, 2 con mutazione V210I, 2 con
mutazione P102L, 1 con mutazione D178N). L’esame è disponibile per tutte le strutture del
servizio sanitario ed il tempo massimo di risposta è di circa 3 settimane lavorative. Nei
prossimi mesi la metodica verrà integrata con la messa a punto della determinazione
dell’aplotipo delle varie mutazioni rispetto al codon 129 del gene.
106

Massimiliano Bugiani Filone tematico A1
Incidenza dell’infezione TB latente in lavoratori della sanità
A.S.L 4
Struttura Complessa di Pneumologia B CPA
CONTESTO E RAZIONALE
Il rischio tubercolosi è una importante problema per gli operatori sanitari: il controllo è basato
sullo screening dell’infezione latente. Nel 2000 sono state introdotte linee guida regionali:
obiettivo è misurare l’incidenza dell’infezione tubercolare (TB) in presidi/reparti con
differenti livelli di rischio e l’impatto delle linee guida. Nel 2001 il test QuantiFERON®-TB
(QFT) (prodotto dalla Cellestis Limited, Carnegie, Victoria, Australia) è stato approvato negli
Stati Uniti dalla Food and Drug Administration (FDA) quale valido ausilio nella diagnosi
dell’infezione TB latente. Si tratta di un test diagnostico in vitro che misura una parte della
risposta immune cellulo-mediata al M. tuberculosis. Il test è basato sulla misurazione
dell’interferone-gamma (IFN-γ) rilasciato dai linfociti sensibilizzati del sangue intero
incubato per una notte con antigeni del Mycobacterium tuberculosis (MT) e con antigeni di
controllo: obiettivo stimare la validità del Quantiferon TB GOLD nella diagnosi di infezione
TB.
OBIETTIVI METODI E RISULTATI
Obiettivo I: stima dell’incidenza annua di infezione TB latente
Metodi I: sono stati esaminati ed analizzati i risultati degli screening tubercolinici condotti
sul personale di 3 ASL Torinesi tra il 1/1/1995 ed il 30/9/2004. Sono stati classificati i
reparti/presidi per livello di rischio secondo i criteri dei CDC di Atlanta modificati dal
Protocollo Regione Piemonte e raggruppate le figure professionali per esposizione omogenea.
La “cuticonversione” quale indice di infezione, è stata definita con criteri CDC: incremento di
diametro del TST di 10 mm in 2 successivi controlli nei soggetti con precedente diametro di
TST < 10 mm.
Risultati I: su 300 TST test del 5%
per alcuni reparti, Microbiologia, Veterinaria 5.2 (3.6-7.4). Riguardo all’anno fino al 2000 i
tassi erano in media 3.0% annuo (1.8- 5.0), dopo il 2000 (anno di introduzione delle LG
regionali) 0.5 (0.16- 1.6).
Obiettivo II: validazione della metodica Quantiferon TB GOLD.
Metodi II: è stata utilizzata la metodica Quantiferon TB GOLD (QFTG), basata su antigeni
specifici (ESAT-6 e CFP-10). Previa approvazione del comitato etico ASL 4 su 421 persone è
107

stato eseguito il test QFTG e il test alla tubercolina (TST). Complessivamente sono stati
eseguiti 454 QFTG (33 sono in doppio). I soggetti appartenevano a tre categorie:
1. pazienti affetti da Tubercolosi (18.5% del campione);
2. persone ad alto rischio: immigrati, contatti di casi (43.6%);
3. operatori sanitari (37.9%).
Sono considerati positivi i risultati del TST-Mantoux con indurimento dell’area circostante
alla somministrazione di diametro > 10 mm alla lettura dopo 48-72 ore e QFTG+ i test con
risposta significativa al CFP-10, all’ESAT-6, al controllo positivo e nessuna risposta al
controllo negativo.
Risultati II: risulta positivo il 29.3% dei test QFTG,, il 36.1% nel gruppo 1, il 47.4% nel 2
del 16.5% sono operatori sanitari. Sui 454 test eseguiti in doppio, TST e QFTG, il 35.7%
risultano negativi ad entrambe, il 18.5% positivi ad entrambe Il 35.0% dei soggetti risultano
TST-positivi/QFTG-negativi. Il 10.8% dei soggetti, infine, risultano TST- negativi /QFTGpositivi.
La prevalenza di TST-positivi è del 53.5% mentre quella di QFTG-positivi è del
29.3%.
Per il gruppo degli operatori sanitari, infine, abbiamo le seguenti prevalenze: 36.0% di TSTpositivi
e 12.8% di QFTG-positivi. Escludendo i soggetti BCG vaccinati la prevalenza di
TST-positivi è del 56.3% mentre quella di QFTG-positivi è del 33.6%. Considerando, invece,
i soggetti vaccinati la prevalenza di TST-positivi è del 52.6% mentre quella dei QFTGpositivi
è del 7.9%. Se si considerano i candidati alla Terapia Preventiva (PT) troviamo un
30% di indicazione alla terapia seguendo i risultati del test tubercolinico e un 8.4% di
indicazione alla terapia preventiva seguendo i risultati del QFTG. (Concordanza = 73.09%, k=
0.15, p

Giovanni Bussolati Filone tematico C1
Espressione di mRNA per CgA in neoplasie prostatiche CgA-negative
all’immunoistochimica. Correlazione con la sierologia.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Biomediche e Oncologia Umana
OBIETTIVO
Il programma proposto prevedeva la valutazione dell’espressione di mRNA per
Cromogranina A in neoplasie prostatiche CgA negative all’immunoistochimica e correlazione
coi dati sierologici.
Recentemente un’attenzione sempre maggiore è stata rivolta al carcinoma della prostata, in
particolare alla differenziazione neuroendocrina dell’adenocarcinoma prostatico ed alla sua
rilevanza clinica. Si è infatti ipotizzato che le cellule neuroendocrine possano avere una
funzione regolatoria sia sulla crescita che sulla differenziazione del tessuto prostatico. Alcuni
autori hanno evidenziato il fatto che adenocarcinomi con differenziazione neuroendocrina
della prostata tendono a comportarsi in maniera più aggressiva. Il riconoscimento di tale
differenziazione è quindi molto importante a complemento della diagnosi. I marcatori
neuroendocrini, per esempio Cromogranina, possono essere titolati nel siero dei pazienti
presso il Laboratorio Analisi, ma anche rilevati direttamente sul tessuto istologico delle
biopsie e dei reperti operatori mediante tecniche di Immunoistochimica (per la valutazione
dell’antigene del prodotto) e di RT PCR(per la valutazione del RNA messaggero) presso
l’Anatomia Patologica.
METODI E RISULATI
Nella valutazione di tali parametri comparati in una serie di pazienti provenienti dalla
Patologia Urologica è talvolta emersa una discrepanza tra i dati sierologici ed i dati
immunoistochimici. Infatti alcuni pazienti con titolazione sierologia di Cromogranina sopra il
valore soglia, presentavano una negatività o bassa positività immunoistochimica con
anticorpo anti Cromogranina. E’ stata quindi messa a punto una metodica di amplificazione
del segnale antigenico mediante l’impiego di Tyramide, secondo l’originale procedura
descritta nel nostro laboratorio da Volante et al.
E’ stata selezionata una casistica di pazienti con biopsia positiva per adenocarcinoma
prostatico, titolazione sierologica alta per Cromogranina e negatività o bassa positività
immunoistochimica per Cromogranina sul prelievo bioptico. Inoltre è stata messa a punto la
metodica di RT PCR per la valutazione dell’RNA messaggero per Cromogranina.
Sulla serie selezionata di biopsie prostatiche è stata fatta la valutazione della presenza di
Cromogranina tissutale su sezioni seriate sia con la metodica di immunoistochimica
tradizionale (con e senza microwave pretreatment), e successivamente con amplificazione del
segnale con Tyramide. Il materiale residuo di ciascun campione è stato estratto per la
valutazione dell’Rna Messaggero per la Cromogranina con metodica RT-PCR.
Le stesse indagini sono state condotte su una serie di biopsie prostatiche negative per
carcinoma, su epitelio di tipo transizionale della vescica (come controllo) e su tessuto
neuronale e gangliare periprostatico, al fine di valutare eventuali interferenze nell’espressione
109

della Cromogranina.
Tutti i dati ottenuti sono stati correlati con i valori sierologici dei singoli casi, giungendo così
a conclusioni che stanno per essere inviate per pubblicazione.
In parallelo a questo studio sulla differenziazione neuro-endocrina del carcinoma prostatico
sono state svolte indagini sulla ormono-dipendenza di questo tumore, in particolare sulla
presenza di recettori per Ossitocina e sull’effetto di tale ormone sulla proliferazione di cellule
neoplastiche. I risultati ottenuti prospettano l’impiego di analoghi dell’Ossitocina nel
controllo della crescita del carcinoma.
110

Federico Bussolino Filone tematico A2
Diagnosi e terapia delle metastasi epatiche: un approccio proteomico
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Oncologiche
CONTESTO E RAZIONALE
I carcinomi del colon e del retto sono neoplasie a prognosi severa, spesso infausta, in
relazione al loro potenziale metastatico al fegato, polmone o cervello. Per quanto riguarda le
metastasi epatiche l’attuale chirurgia ne permette la resezione a patto di una diagnosi il più
precoce possibile. Le tecniche istopatologiche o di radiodiagnostica sovente non consentono
la precocità richiesta per il successo terapeutico, esigendo strumenti più sensibili. La terapia
delle metastasi potrebbe inoltre avvantaggiarsi da una miglior conoscenza dell’interazione tra
la cellula tumorale e il microambiente in cui si localizza.
OBIETTIVO
Lo scopo del progetto é stato quello di identificare nuovi e possibilmente specifici marcatori
delle metastasi epatiche di colon-carcinoma utilizzando lo scrrening di una libreria fagica exvivo,
dapprima su tessuto sano e successivamente sulla metastasi dello stesso paziente.
METODI E RISULTATI
Abbiamo isolato la popolazione metastatizzata nel fegato mediante frazionamento tissutale da
20 pazienti con tumore primitivo del colon o del retto e paragonata a tessuto epatico
macroscopicamente indenne. Sono state utilizzate 3 librerie fagiche e in 9 esperimenti
abbiamo osservato un arricchimento statisticamente significativo del legame dei fagi alla
popolazione tumorale rispetto al tessuto normale. Da questo primo screening sono stati
selezionati 7 peptidi.
Successivamente i fagi codificanti per questi peptidi sono stati studiati nella loro capacità di
legare 12 linee tumorali umane generate da tumori primitivi in varia sede o da metastasi. In
questi esperimenti 2 peptidi hanno mostrato una grande e significativa specificità dal punto di
vista statistico per la linea NCI-H630, derivata da una una metastasi epatica secondaria a un
colon carcinoma. Successivamente la specificità di questo peptide é stata ulteriormente
validata studiando il legame (100% di positività) su tessuto fresco di di casi di metastasi
epatiche dell stessa origine. Utilizzando tessuto fresco, abbiamo testato con risultati negativi i
seguenti altri tumori:
- ovaio primitivo (6 casi),
- metastasi all’ovaio (4 casi),
- carcioma della mammella (8 casi).
Stiamo ampliando la casistica reclutando tumori primitivi e secondari dei seguenti tessuti:
polmone, pancreas, stomaco, cervello, rene, vescica e tiroide.
La ricerca si sta ulteriormente sviluppando verso altri 2 obiettivi:
1. messa a punto di un modello animale;
111

2. identificazione della molecola espressa sulla membrana delle cellule tumorali che laga il
petide o il fago specifico.
Per la messa a punto del modello animale stiamo utilizzando l’inoculo nella milza, in topi
nudi, di linee di carcioma del colon. Grazie al sistema portale la prima sede di diffusione é il
fegato.
Lo scopo di questo approccio é sia di ricapitolare in un modello più semplice quanto possa
avvenire nell’uomo, sia di predisporre uno strumento per utilizzare il peptide come strumento
diagnostico e come mezzo per veicolare selettivamente un farmaco nella sede della lesione.
Risultati preliminari tuttavia suggeriscono che nel topo la selettività per la metastasi epatica é
persa in quanto il peptide continua a non legare il tumore primitivo, ma lega anche metastasi
polmonari, suggerendo come le caratteristiche dell’ospite modifichino e condizionino la
risposta della cellula tumorale. Il peptide coniugato con tecnezio 199 si é dimostrato un
capace di visualizzare le lesioni metastatiche in SPECT.
Per quanto riguarda il punto l’identificazione del recettore (punto 2) stiamo utilizzando una
tecnica proteomica. Le proteine presenti nelle membrane cellulari delle cellule tumorali delle
metastasi epatiche sono state isolate, solubilizzate e sottoposte a cromatografia di affinità con
il peptide. In questo mdo abbiamo isolato 9 proteine e sono in corso gli studi strutturali
utilizzando la spettrometria di massa. Dati preliminari indicano il peptide lega una proteina di
transmembrana simile a quella che lega “angioproietin-like protein”.
112

Anna Maria Cacciatore Filone tematico A3
Studio di coorte storico sui lavoratori dello stabilimento Michelin di
Cuneo: incidenza dei tumori delle vie urinarie.
ASL n. 15 Dipartimento di Prevenzione
Servizio Prevenzione Sicurezza negli Ambienti di Lavoro
MATERIALI E METODI
Nel periodo compreso tra l’1 maggio 2004 ed il 28 febbraio 2005 l’Assistente di Ricerca, ha
effettuato l’acquisizione dei dati relativi alle diagnosi di carcinoma transizionale delle vie
urinarie presso la Struttura Complessa di Anatomia Patologica dell'ospedale San Lazzaro,
presidio dell'Azienda Sanitaria Locale n. 18 di Alba - Bra. Ottenuti i dati di interesse per lo
studio, l’Assistente di Ricerca ha inserito gli stessi nel data base specifico utilizzando il
software a disposizione presso il Servizio di Prevenzione e Sicurezza negli Ambienti di
Lavoro dell’Azienda Sanitaria Locale n. 15 di Cuneo.
RISULTATI
La raccolta dei dati ha fornito i seguenti risultati: è stato esaminato il periodo compreso tra il
1980 e tutto il 1997, con la rilevazione di un totale di n. 45263 referti distribuiti in n. 196
volumi e l’individuazione di 881 diagnosi di interesse. Il numero medio annuale degli
istologici ha mostrato un costante incremento; infatti, su base media triennale, tale dato è
salito da un valore di 1404 (1980-82) a 1800 (1983-85) a 2012 (1986-88) a 2061 (1989-91) a
2407/anno (1992-94). Questo valore ha manifestato un forte incremento in corrispondenza
dell'ultimo triennio, con valori corrispondenti a 4967 nel 1995, 5317 nel 1996 e 5926 nel
1997. Parallelamente, l'analisi delle diagnosi di neoplasia dell'epitelio transizionale delle vie
urinarie è passato da 1,1% nel primo triennio considerato a 1,7% nel triennio 1994-97.
Tali osservazioni, rispetto all'attività svolta dalla struttura complessa di Anatomia Patologica
dell'A.S.L. 18, permettono di concludere che l'interesse nei confronti della patologia
neoplastica transizionale delle vie urinarie sia cresciuta in misura relativamente superiore
rispetto all'insieme delle altre istologie, con un incremento del 55%.
Le nuove diagnosi, istologicamente accertate, acquisite presso l’Ospedale San Lazzaro si
aggiungono pertanto all’archivio già presente presso il Servizio di Prevenzione e Sicurezza
negli Ambienti di Lavoro dell’Azienda Sanitaria Locale n. 15 di Cuneo.
Per completare la rilevazione finora condotta direttamente nelle Strutture di anatomia ed
istologia patologica, e portare la rilevazione allo stesso livello di aggiornamento in tutti gli
Ospedali di nostro interesse, sono stati utilizzati gli archivi informatizzati delle Schede di
dimissione ospedaliera, in possesso della SCDU di Epidemiologia dei Tumori, Università
degli Studi di Torino e ASO San Giovanni Battista di Torino. Sono stati estratti in particolare
i record relativi ai ricoveri avvenuti negli istituti ospedalieri già oggetto della rilevazione
diretta nelle Strutture di anatomia ed istologia patologica, con codice nosologico
corrispondente ad una diagnosi di tumore maligno delle vie urinarie.
L’estrazione include per tutti gli Ospedali in studio l’intero insieme di anni disponibili, vale a
dire dal 1996 al 2003. Il dataset così ottenuto sarà utile per:
113

1. convalidare mediante i risultati della ricerca diretta quelli della ricerca basata su SDO,
negli anni ed ospedali in cui vi è sovrapposizione delle due strategie di rilevazione da noi
seguite;
2. valutare di conseguenza se è possibile accodare direttamente al nostro archivio delle
diagnosi i nuovi casi rilevati solo tramite la ricerca basata su SDO, oppure se occorre un
ulteriore sforzo per recuperare la documentazione istologica a loro relativa.
114

Ennio Cadum Filone tematico A3
Predisposizione di un modello previsionale per l’identificazione delle
ondate di calore e valutazione epidemiologica
ARPA Piemonte – Area di Epidemiologia Ambientale
CONTESTO E RAZIONALE
Le condizioni di caldo estremo e l’impatto sulla salute sono un problema attuale specie dopo
gli eventi dell’estate 2003. Studi epidemiologici hanno identificato tra i soggetti più a rischio
le persone affette da malattie cardio-respiratorie e gli anziani con ridotta capacità di
termoregolazione. La possibilità di prevedere variazioni meteorologiche a breve periodo,
consente la pianificazione e la gestione di interventi di prevenzione e riduzione del danno.
OBIETTIVO
L’Area Previsione e Monitoraggio Ambientale e l’Epidemiologia Ambientale hanno condotto
un progetto di analisi e studio di dati storici climatologici ed epidemiologici finalizzato alla
realizzazione di un modello previsionale delle criticità dovute a condizioni meteorologiche
avverse per la presenza di ondate di calore nella città di Torino.
MATERIALI E METODI
Il progetto è stato così sviluppato:
Analisi dei dati climatologici (1990-2003) per l’individuazione delle variabili meteorologiche
che maggiormente influenzano al salute umana in condizioni di caldo estremo.
Studio degli indici biometeorologici più utilizzati in letteratura per una valutazione del disagio
fisiologico dovuto a condizioni di caldo estremo. Sulla base dei risultati della ricerca sono
stati individuati come indici ottimali quattro diversi indici di “benessere”: Discomfort Index,
Humidex, Heat Index e Heat Stress Index. L’HSI è un indice relativo che valuta la risposta
fisiologica della popolazione alle variabili meteorologiche e che tiene conto delle peculiarità
della zona in esame e dell’acclimatazione della popolazione. Gli studi effettuati nel progetto
su questo indice ne hanno apportato migliorie e l’hanno implementato.
Modello matematico per la valutazione dell’impatto delle ondate di calore sulla mortalità. Il
modello è stato studiato per l’area di Torino di cui erano a disposizione i dati di mortalità. I
parametri meteorologici utilizzati sono: temperatura massima, temperatura apparente massima
e minima, numero di giorni consecutivi con temperatura apparente elevata, livello di ozono ed
altri parametri meteorologici necessari al calcolo degli indici di “benessere” presi in esame.
Scelta dell’albero decisionale più idoneo ad individuare i diversi livelli di rischio derivanti da
condizioni meteorologiche di caldo estremo.
Realizzazione “Bollettino previsionale delle ondate di calore per la città di Torino”. Sulla base
degli studi meteorologici ed epidemiologici effettuati è stato realizzato un bollettino
previsionale delle ondate di calore per Torino, sul quale vengono diverse informazioni:
- METEOROLOGICHE: tipo di caldo, temperatura massima, umidità media giornaliera,
temperatura apparente (massima e minima), livello di ozono massimo giornaliero ed
indice sintetico di stress da calore (Heat Stress Index);
- SANITARIE: numero di eventi sanitari in eccesso;
115

- LIVELLI DI RISCHIO: “Nessun Allarme”, “Attenzione”, “Allarme” od “Emergenza”.
Illustrazione di alcuni dei dati presenti nel bollettino
“Eccesso di eventi sanitari”: intesi come numero di decessi giornalieri di persone con più di
64 anni. L’eccesso è stato definito come differenza tra il numero di eventi atteso e il numero
stimato dal modello. Gli eventi attesi giornalieri sono stati calcolati sulla base della serie
storica maggio-settembre 1990-2002, con metodi di regressione non parametrica. Il modello
multivariato ha poi suggerito i parametri da inserire nell’algoritmo di stima del numero di casi
in eccesso, intorno ai quali sono state definite quattro classi possibili: nessuno, basso, medio o
alto e tiene conto anche di variabili di input relative ai giorni precedenti la data di previsione:
è stato infatti osservato frequentemente un intervallo di tempo tra le condizioni
meteorologiche severe ed i conseguenti eccessi di mortalità.
Livelli di Rischio, indice sintetico che unisce le informazioni meteorologiche e sanitarie
previsionali. Il livello di rischio (0-1-2-3) è definito attraverso un albero decisionale che tiene
conto dei valori di Heat Stress Index e dei valori assunti dagli indici di “benessere” nonché
degli eccessi sanitari previsti dal modello. Il livello di rischio individuato può quindi derivare
o da condizioni meteorologiche critiche o da un eccesso di eventi sanitari o da entrambi.
Validazione e Test del modello revisionale. Prima di rendere operativa l’emissione quotidiana
del Bollettino previsionale, il modello previsionale realizzato è stato testato sul periodo 1990-
2003, in particolare sui dati meteorologici ed epidemiologici registrati durante l’estate 2003.
L’Heat Stress Index ha evidenziato la sua peculiarità di fornire informazioni aggiuntive
rispetto gli altri più comuni indici biometeorologici in quanto valutando le condizioni
meteorologiche estreme sulla base della climatologia locale permette di individuare situazioni
estreme anche nei mesi meno caldi, quali maggio e settembre. In tali mesi temperature
superiori al valore medio climatologico, seppur non proibitive, possono determinare disagio
fisiologico alla popolazione anziana ed un incremento di morbilità e mortalità.
Emissione quotidiana dei bollettini previsionali delle ondate di calore dal 1 giugno al 15
settembre 2004.
Analisi dei risultati. sono state effettuate diverse verifiche sul modello previsionale allo scopo
di individuare eventuali sovrastime e/o sottostime del modello e apportare eventuali possibili
migliorie. Tra le verifiche effettuate:
- confronto tra valori di Heat Stress Index registrati e previsti a +24, +48, +72. Le previsioni
sono risultate in buon accordo con gli osservati.
- Confronto tra eventi sanitari in eccesso previsti ed osservati. Il modello previsionale ha
dato buoni risultati.
- Confronto tra livelli di rischio emessi ed eventi sanitari in eccesso registrati. Il modello
mostrato dalle verifiche effettuate di avere buone performance previsionali.
Studio dei risultati del 2004, e di possibili migliorie da apportare al modello, all’albero
decisionale ed al layout dei bollettini in previsione del 2005.
CONCLUSIONI
Nell’estate 2004 non si sono verificate situazioni estreme come quelle verificatesi nel 2003,
ma la disponibilità di un bollettino previsionale si è comunque rivelata utile, come rilevato da
indagini a posteriori effettuate mediante interviste con direzioni Sanitarie di Ospedali,Case di
Cura e Assistenziali per anziani, e ai servizi socio-assistenziali, per mettere in opera misure
preventive e interventi verso le popolazioni più a rischio, contribuendo, insieme a condizioni
climatiche meno estreme, a ridurre l’impatto sulla salute delle ondate di calore
116

Maria Costanza Calia Filone tematico C2
L'interfunzionalità comunicativa nella partnership tra Ospedale e
Hospice
ASO S. Giovanni Battista
Dipartimento Oncologico – S.C. Terapia del Dolore e Cure palliative
CONTESTO E RAZIONALE
Gli obiettivi e le azioni Le linee guida regionali inerenti l’applicazione delle cure palliative in
Piemonte identificano nell’UOCP (Unità Operativa di Cure Palliative), la struttura di
coordinamento della rete di cure palliative che si pone come “punto di sintesi e di svincolo fra
cure specialistiche e cure primarie, garantendo continuità terapeutica, assistenziale e
organizzativa…” (DGR 14/10/2002, n. 15-7336). Rispetto alle indicazioni precedenti, questa
delibera contiene elementi di conferma ed elementi di novità. Vengono ribaditi come criteri di
valore l’interdisciplinarietà e l’interfunzionalità nella cura del paziente in fase avanzata di
malattia, confermando la necessità di una presa in carico globale, continua e competente.
OBIETTIVO
La ricerca si è posta come obiettivo quello di studiare e individuare elementi di forza e di
debolezza del processo di comunicazione tra ospedale e hospice, sviluppando in due direzioni
l’analisi:
1. l’aspetto della comunicazione, relativo al trattamento e alla cura, tra i diversi operatori
coinvolti;
2. l’aspetto della comunicazione informativa verso i pazienti e i familiari.
All’interno dell’ospedale, oltre alla Struttura Complessa di Terapia del Dolore e di Cure
Palliative (UOCP), sono stati individuati i reparti di: Medicina Generale, Oncologia Medica e
COES (Centro Oncologico ed Ematologico Subalpino). Gli hospice coinvolti sono quello di
Busca presso l’ASL 15 di Cuneo e l’hospice gestito dalla Fondazione FARO presso
l’Ospedale “S. Vito” di Torino.
RISULTATI
La ricerca ha evidenziato come la comunicazione scritta e orale è essenzialmente
autoreferenziale, nel senso che dai documenti esaminati e dalle interviste svolte risulta molto
chiaro cosa avviene all’interno delle singole strutture ma poco su come interagiscono.
L’evidenza empirica di questa riflessione è data, anche, dall’esame dei materiali scritti censiti.
In realtà dall’analisi dei diari e delle cartelle cliniche non è evidente il percorso di cura e di
trattamento del paziente oncologico in fase terminale. Il percorso lo si desume dagli esami
fatti e dai risultati ma non esiste l’esplicitazione del programma terapeutico che preveda
l’intervento dei diversi reparti o di altre istituzioni. All’interno dei documenti clinici non sono
evidenti le parti del sistema. Per essere più precisi il sistema lo si evince da una
“comunicazione informativa”, quale:
- la richiesta di esami strumentali o di consulenze e i referti segnano “la comunicazione” tra
diversi reparti,
- la lettera di dimissioni segna “la comunicazione” tra l’ospedale e l’hospice,
- i materiali divulgativi con la descrizione del singole parti del sistema che “comunicano”
l’esistenza e le funzioni delle diverse strutture;
117

tuttavia non sembra esistere una programma terapeutico prodotto da una “comunicazione
relazionale” tra le diverse parti.
In più occasioni in questa ricerca si sono sottolineate le componenti fondamentali della
comunicazione, quali il passaggio di informazione e la costruzione della relazione.
Dall’analisi dei documenti e delle interviste realizzate è emerso come esiste con qualche
difficoltà il passaggio unidirezionale dell’informazione da un reparto all’altro, più difficile da
una struttura all’altra, ma del tutto inesistente lo scambio di informazioni (passaggi
bidirezionali delle informazioni) tra le parti se non in casi particolari dove esiste una
conoscenza personale del responsabile dell’altro reparto o dell’altra struttura. Date queste
premesse, un sistema che basa la propria esistenza e funzionalità solo sul passaggio di
informazioni non garantisce un buon servizio per il trattamento e la cura di pazienti così
complessi come i malati oncologici in fase terminale. Il sistema per funzionare deve
prevedere una comunicazione basata sulla costruzione e consolidamento delle relazioni
personali tra gli operatori dei reparti e tra i responsabili delle strutture che costituiscono il
sistema stesso. Per realizzare il passaggio da un “sistema informativo” ad un “sistema
relazionale” per la cura del paziente oncologico in fase terminale si dovrebbero prevedere
accordi e rispettare alcuni accorgimenti:
1. comunicazione scritta:
- prevedere accordi e atti tra i reparti e le istituzioni per definire i ruoli, le azioni e gli
obiettivi per la progettazione del piano di cura e del trattamento secondo le indicazioni del
DGR 14/10/2002, n. 15-7336;
- prevedere un inserimento all’interno del sistema degli RSA e dei reparti di geriatria degli
ospedali per ottimizzare l’invio dei paziente alle diverse strutture secondo le
caratteristiche del caso;
- prevedere all’interno della documentazione esistente specifiche sezioni che si riferiscono
ai reparti e alle strutture facenti parte del sistema;
- prevedere all’interno della cartella clinica la programmazione degli interventi previsti dai
diversi reparti.
2. Comunicazione orale
- prevedere incontri mensili tra i responsabili dei reparti e delle strutture;
- favorire, attraverso corsi di aggiornamento gli incontri tra operatori sanitari dei reparti e
delle strutture, una diffusione più capillare attraverso momenti istituzionali delle cure
palliative presso i vari presidi ospedalieri;
- prevedere momenti istituzionali per promuovere la cultura delle cure palliative con la
cittadinanza e con altre strutture socio-sanitarie (RSA, reparti di geriatria, ecc.) anche
attraverso la diffusione delle brochure.
CONCLUSIONI
Questo lavoro di analisi della comunicazione di sistema ha indagato solo un piccolo segmento
e quindi non consente generalizzazioni o traslazioni. Sono stati rilevati aspetti problematici o
meglio critici al livello della fase di progettazione del sistema stesso. Le informazioni qui
riportate rappresentano possibili elementi di riflessione relativi alla gestione del cambiamento
del sistema in atto e prevedibile nel prossimo futuro. Si è in presenza di sistemi che
confliggono e di interlocutori che si informano ma che non sono in relazione. Il passaggio da
un sistema informativo ad un sistema relazionale lo si realizza se si favorisce e si progetta un
sistema di contesto organizzativo, cioè un sistema di persone e di relazioni che supporti tale
passaggio. L’efficacia e l’efficienza del sistema, come dimostra la ricerca condotta, è
dimostrata dal grado di comunicazione che esiste tra le parti.
118

Ferdinando Canavese Filone tematico A2
Il criptorchidismo quale fattore di rischio di infertilità e di tumori
testicolari
A.S.O. O.I.R.M. S. Anna
Ospedale Infantile Regian Margherita – Chirurgia Pediatrica B
MATERIALI E METODI
In base al finanziamento è stato possibile finanziare lo studio di 67 pazienti. E’ stata avviata e
completata sugli archivi operatori e su quelli relativi alle degenze ordinarie la ricerca dei
nominativi e degli indirizzi di pazienti operati in passato (anni 90’) per testicolo ritenuto che
hanno raggiunto la maggiore età. Sono stai individuati 200 pazienti, ai quali è stata inviata una
lettera di invito a partecipare allo studio.
La parte operativa è iniziata a novembre 2004 e si è conclusa nel marzo 2005. In totale sono
stati esaminati 18 pazienti, ricoverati in regime di day hospital presso U.O.di Endocrinologia
dell’O.I.R.M: dove hanno effettuato dosaggio di FSH, LH testosterone plasmatici e
consulenza chirurgica. Hanno effettuato inoltre (17 pazienti) spermiogramma presso l’U.O. di
Andrologia dell’Ospedale Sant’Anna in regime ambulatoriale.
RISULTATI
In generale i risultati sono poco significativi per le seguenti ragioni:
1. la scarsa numerosità del campione (difficoltà di raggiungere pazienti dopo quasi 20 anni
dal trattamento e probabile scarso interesse dei pazienti raggiunti);
2. difficoltà di trarre conclusioni significative per il lungo periodo di follow-up - probabile
vizio di selezione dei pazienti (si sono presentati prevalentemente quelli con problemi
andrologici aggiuntivi, intervenuti durante il follow-up).
Tenendo conto di questi limiti si evidenzia:
- normalità degli esami ormonali in tutti i casi;
- riduzione di volume del testicolo criptorchide in circa la metà dei casi;
- oligoastenoteratozoospermia nel 41,1% dei casi;
- astenoteratozoospermia nel 35,2% -astenospermia nell’11%;
- azoospermia nel 5,8%;
- normale spermiogramma nel 5,8%
I risultati di questo studio saranno integrati nel tempo con il raggiungimento dell’età adulta
dei pazienti operati in passato. Sarà rilevante valutare la funzione testicolare in quelli operati
prima dei due anni di vita poiché dati indiretti suggeriscono la possibilità di prevenire
l’ipofertilità e ridurre il rischio carcinogenetico mediante questo trattamento precoce.
119

Pier Luigi Canonico Filone tematico C1
La farmacogenomica/genetica come strumento diagnostico/terapeutico
nelle cefalee
Università del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”
Dipartimento di Scienze Chimiche, Alimentari, Farmaceutiche e Farmacologiche
CONTESTO E RAZIONALE
Il sequenziamento del genoma umano, associato ad una miglior comprensione delle influenze
genetiche nelle patologie e nella risposta ai farmaci, favorirà nel prossimo futuro lo sviluppo
di protocolli farmacologici ottimizzati per i singoli pazienti, creando un risparmio
considerevole allo stato, sia in termini economici, sia in termini sanitari. Infatti, un regime di
terapia concepito su base genetica porterà ad un migliore utilizzo dei farmaci e quindi ad una
aumentata efficacia terapeutica e ad una diminuzione degli effetti collaterali. Per dare un
esempio dei possibili vantaggi che ne trarrebbe il sistema sanitario, basti pensare che negli
Stati Uniti vi sono circa 18 milioni di ospedalizzazioni annue a causa degli effetti collaterali
dei farmaci. Malgrado che le conoscenze attuali non permettano ancora una farmacogenetica
ad ampio raggio, è fondamentale stabilire dei centri che siano in grado di recepire
velocemente qualunque novità in questo campo e siano in grado di riversarne i frutti sul
territorio. Per questo motivo, abbiamo proposto di creare un laboratorio di farmacogenetica
ed, utilizzando l'expertise sulle cefalee proposta dal Centro UCADH, di cui facciamo parte, di
studiare le possibili implicazioni farmacogenetiche nella terapia nei triplani.
RISULTATI
Per poter effettuare lo studio proposto, abbiamo messo a punto diverse metodiche che
utilizzino la PCR per potere individuare single nucleotide polymorphisms (SNPs) nei geni di
interesse. Nello specifico abbiamo generato protocolli che utilizzino la real-time PCR con
probe fluorescenti e protocolli che utilizzano la capacità degli enzimi di restrizione di digerire
sequenze specifiche all'interno di un amplificato. I pazienti sono stati reclutati dal Centro
Cefalee dell'Ospedale Maggiore di Novara diretto dal Dott. Diego Bettucci, e dal centro
Mondino di Pavia, dopo presentazione di domanda ai rispettvi Comitati Etici e previo
consenso informato da parte dei pazienti.
Al momento sono stati reclutati 90 pazienti, in terapia con farmaci per il trattamento acuto
dell'attacco emicranico (triptani) e/o con farmaci per la prevenzione dell'attacco (flunarizina,
amitriptilina). Abbiamo valutato 3 polimorfismi sul gene 5-HT1B: lo SNP T-261G e lo SNP
A-161T, localizzati nella regione non codificante del gene e probabilmente responsabili del
controllo della sua espressione, e G861C, localizzato sulla regione trascritta e che non risulta
in una sostituzione aminoacidica (Val - Val). Gli ultimi due SNP non sembrerebbero essere
associati con una variazione nella risposta clinica. Lo SNP T-261G, invece, merita un
discorso a parte. Dall'analisi dei pazienti con risposta clinica nota sembrerebbe che i pazienti
omozigoti GG in questa posizione sono altamente favoriti nella risposta ai triptani. Malgrado
gli effetti collaterali sembrerebbero essere più frequenti in questa popolazione, la loro entità è
risultata lieve e transitoria e quindi non influenza la terapia. Al momento, siamo in procinto di
ultimare gli studi clinici per ampliare la nostra casistica. Inoltre, ci proponiamo di reclutare
almeno altri 110 pazienti, per arrivare ad una casistica di 200.
120

CONCLUSIONI
Gli studi sin qui svolti hanno permesso di postulare che una componente genetica moduli la
risposta ai triptani da parte di pazienti emicranici. D'altra parte, l'esiguità dei pazienti reclutati
non pemette di trarre conclusioni certe. Per ovviare a questo si sta attivando una
collaborazione e convenzione con l'Istituto Mondino di Pavia che dovrebbe reclutare oltre 200
pazienti. Tale sbocco, permetterà, inoltre di poter presentare domanda di finanziamento per la
continuazione del centro ed altri Enti, tra cui la Comunità Europea. Il lavoro svolto nel
contesto di questo finanziamento ha permesso di aprire un filone i ricerca nuovo nel
Dipartimento ed è servito per creare un laboratorio di farmacogenetica, che nel prossimo
futuro potrebbe anche essere utilizzato come servizio per la Sanità. Ad esempio, la Regione
Toscana negli ultimi mesi ha inserito la genotipizzazione a scopi farmacogenetici nel suo
nomenclatore tariffario. In ultimo, ci proponiamo di sottomettere questo lavoro per la
pubblicazione nei prossimi mesi, quando la casistica sarà completa.
121

Roberto Cantello Filone tematico C1
Potenziali evocati motori e diagnostica della malattia di Parkinson
Università del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”
Facoltà di Medicina e Chirurgia – Clinica Neurologica
CONTESTO E RAZIONALE
La malattia di Parkinson (MP) è un processo neurodegenerativo cronico, caratterizzato dalla
perdita di neuroni dopaminergici della sostanza nera. La conseguente disfunzione della via
nigrostriatale altera il complesso circuito dei gangli della base determinando un’inadeguata
attivazione delle aree motorie corticali. La stimolazione magnetica transcranica (TMS)
permette di esplorare l’eccitabilità corticale. Infatti la TMS consente di eccitare a cranio
intatto le aree motorie corticali, ottenendone risposte elettriche nei muscoli scheletrici,
denominate Potenziali Evocati Motori (PEM). La misura dei PEM consente di determinare
vari aspetti dell’eccitabilità del sistema corticospinale. La TMS è stata applicata allo studio
della MP (Cantello et al 2002). Il periodo silente corticale (PS), un periodo di silenzio
elettrico registrabile per alcune centinaia di millisecondi (ms) dopo il PEM in un muscolo
tonicamente contratto, è stato ripetutamente trovato accorciato nella MP. Il PS esplora
fenomeni inibitori corticali probabilmente mediati dal neurotrasmettitore GABA. Con la TMS
è possibile misurare anche altri fenomeni corticali, quali l’“inibizione intracorticale a lunga
latenza (LICI)”. Vi sono alcune indicazioni che la LICI sia alterata nella MP. Del resto, anche
alla base della LICI si riconoscono meccanismi trasmettitoriali di tipo GABAergico. Con il
presente studio si è voluto studiare l’eccitabilità corticale e i fenomeni inibitori GABAergici a
lunga latenza (PS e LICI) in un gruppo di pazienti affetti da MP di recente diagnosi.
MATERIALI E METODI
Abbiamo selezionato 18 pazienti (10 maschi e 8 femmine, età media 63,3±12,7 anni, range
36-84 anni) con diagnosi di probabile MP idiopatica secondo i criteri clinici
internazionalmente riconosciuti (Gelb et al 1999). Tutti i pazienti presentavano una sindrome
parkinsoniana asimmetrica e nessuno aveva mai assunto in precedenza farmaci
antiparkinsoniani. Tutti erano in uno stadio iniziale di malattia (stadiazione clinica secondo
Hoehn & Yahr media 1,5±0,5). Tutti i pazienti sono stati studiati in fase off. Il punteggio
medio dell’UPDRS III (off) era di 19,8±7,4. Abbiamo selezionato anche 10 soggetti sani di
controllo (7 maschi e 3 femmine, età media 59,2±7,7 anni, range 47-66 anni). TMS La TMS è
stata ottenuta mediante due stimolatori Magstim 200 connessi con un modulo Bistim. Gli
stimoli magnetici sono stati erogati per mezzo di un coil focale “a otto” posizionato sullo
scalpo in corrispondenza dell’area motoria della mano di entrambe gli emisferi. I PEM sono
stati registrati dal muscolo I interosseo dorsale (FDI) durante contrazione muscolare (~20%
dello sforzo muscolare massimale).
In tutti i soggetti sono stati studiati i seguenti parametri di eccitabilità corticale: soglia di
stimolazione durante contrazione muscolare (soglia attiva o AT), PEM massimale, periodo
silente corticale (PS) e la cosiddetta inibizione corticale a lunga latenza (LICI). La AT era
stabilita come la minima intensità (espressa come % della massima capacità dello stimolatore)
in grado di evocare un PEM di circa 100 µV d’ampiezza in almeno il 50% di 10 stimoli
consecutivi. Il PEM massimale è stato ottenuto usando stimoli magnetici pari a 200%AT.
L’ampiezza dei PEM massimale veniva espressa come rapporto tra PEM e ampiezza
122

dell’onda M ottenuta mediante stimolo elettrico sovramassimale del nervo motorio. Il PS è un
periodo (espresso in ms) di silenzio elettrico che fa seguito ad un PEM ottenuto in un muscolo
tonicamente contratto; è stato ottenuto mediante stimoli magnetici pari a 150%AT. La LICI è
stata studiata mediante la tecnica del “doppio” stimolo, originalmente descritto da altri autori
(Valls-Solè et al 1992, Claus et al 1992). In breve, uno stimolo magnetico (definito
“condizionante”) è in grado di ridurre l’ampiezza del PEM ottenuto con un secondo stimolo
magnetico (definito “test”) erogato tramite lo stesso coil e separato dal primo stimolo da un
intervallo di tempo (intervallo interstimolo o ISI). Nel nostro studio abbiamo usato due
stimoli magnetici di uguale intensità (150%AT) e abbiamo valutato i seguenti ISI: 50 ms, 100
ms, 150 ms, 200 ms and 250 ms. Per ciascun ISI il PEM “condizionato” è stato espresso come
rapporto con il PEM test.
RISULTATI
Tutti i risultati riportati sono espressi come Media ±1 Dev. St. I dati sono stati analizzati
mediante ANOVA; per la significatività statistica è stato usato un test t con valore di
significatività di p0,05). Il PEM massimale risultava di 0,42±0,13 e
di 0,37±0,23 rispettivamente per l’emisfero più affetto e meno affetto nei pazienti
parkinsoniani. Nei soggetti sani questo parametro era di 0,31±0,11 per l’emisfero dominante e
0,46±0,09 per l’emisfero non dominante. Il PEM massimale risultava significativamente più
ampio nell’emisfero affetto dei pazienti con MP rispetto all’emisfero dominante dei controlli
(p=0,042). Lo studio della LICI ha permesso di evidenziare una differenza significativa
limitatamente all’ISI 250 ms tra l’emisfero più affetto nei pazienti con MP (0,687±0,395%) ed
entrambe gli emisferi dei controlli sani (emisfero dominante 1,048±0,222%, p=0,012;
emisfero non dominante 1,035±0,208%, p=0,019). Abbiamo poi analizzato la relazione
esistente tra PS e LICI. Abbiamo quindi suddiviso pazienti e controlli in base alla durata
mediana del PS, ottenendo così per ciascun gruppo (emisfero più affetto, emisfero meno
affetto, emisfero dominante, emisfero non dominate) due sottogruppi (PS > o < della
mediana). La LICI era significativamente ridotta all’ISI 100 ms nei pazienti che presentano un
PS di breve durata sia per l’emisfero più affetto (< mediana: 0,878±0,305%; > mediana:
0,503±0,348%; p=0,029) che per quello meno affetto (< mediana: 0,783±0,328%; > mediana:
0,490±0,213%; p=0,039).
CONCLUSIONI
Nel presente studio l’eccitabilità corticale non era significativamente diversa tra pazienti e
controlli. Ciò potrebbe dipendere dall’esecuzione dello studio durante contrazione muscolare
e dal conseguente uso di stimoli d’intensità “minore” (150%AT) rispetto ad analoghi studi
presenti in letteratura. È stato comunque possibile stabilire una correlazione tra i fenomeni
inibitori a lunga latenza. Infatti i pazienti con MP, in fase iniziale e senza terapia
dopaminergica, che possiedono un PS di breve durata presentano anche una significativa
riduzione della LICI all’ISI 100 ms. Tale correlazione è evidente in entrambe gli emisferi.
Dunque, in un sottogruppo di pazienti affetti da MP in fase iniziale, l’inibizione corticale a
lunga latenza risulta significativamente ridotta. Questo dato sembra inoltre concordare con
l'ipotesi di una analoga genesi GABAergica di PS e LICI.
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Rosa Angela Canuto Filone tematico B3
Dieta e prevenzione del tumore del colon: ruolo degli acidi grassi
linoleico coniugato e docosaesaenoico
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale
OBIETTIVO
Nella presentazione del progetto sono stati posti 2 obiettivi:
1. valutare gli effetti dei principali isomeri dell’acido linoleico coniugato (CLA) e dell’acido
docosaesenoico (DHA) sullo sviluppo del tumore del colon, utilizzando la linea cellulare
CaCo2;
2. valutare il contenuto degli acidi grassi e, in particolare, del CLA e del DHA nel plasma e
in campioni di tessuto tumorale prelevato da pazienti affetti da carcinoma del colon e, nel
caso in cui sia disponibile materiale dopo l’analisi anatomo-patologica, anche su biopsie
prelevate da pazienti affetti da poliposi;
3. paragonare i risultati ottenuti sul plasma con quelli ottenuti in individui sani;
4. paragonare i risultati ottenuti sul tessuto tumorale con quelli ottenuti su mucosa non
neoplastica prelevata dagli stessi pazienti portatori del tumore.
METODI
Avendo a disposizione per alcuni pazienti campioni di tumore del colon e il plasma, ci si è
concentrati sul secondo, terzo e quarto obiettivo, tenendo conto anche dell’entità del
finanziamento ottenuto. Si è ritenuto importante esaminare la concentrazione percentuale
degli acidi grassi nei tumori del colon in associazione con alcuni parametri di proliferazione e
morte cellulare, in quanto diverse evidenze epidemiologiche e sperimentali mostrano che
l’alimentazione ha un impatto sia positivo che negativo sul processo di cancerogenesi del
colon e non è chiaro se i supplementi nutrizionali possano avere un ruolo nel trattamento
adiuvante di tale tumore.
RISULTATI
Sono stati esaminati 12 pazienti e in generale si sono ottenuti i risultati di seguito descritti.
1. l’analisi del contenuto di acidi grassi nei fosfolipidi del plasma per quanto riguarda i
pazienti portatori dei tumori rispetto ad individui sani ha evidenziato un aumento degli
acidi grassi saturi e una dimunzione degli acidi grassi poliinsaturi, in particolare del 18:2
(acido linoleico) e del 20:4 (acido arachidonico).
2. L’analisi del profilo degli acidi grassi dei fosfolipidi del carcinoma in rapporto con la
corrispondente mucosa non neoplastica del colon ha evidenziato un aumento degli acidi
grassi saturi e una dimunzione degli acidi grassi poliinsaturi, in particolare del 20:4 (acido
arachidonico). Le diminuzioni sembrano in rapporto con il grado di deviazione del
tumore. La diminuzione del 20:4 può essere spiegata con la presenza della COX-2 nella
mucosa, dove normalmente non è espressa, oppure con il fatto di essere considerata un
124

meccanismo di difesa utilizzato dal tumore per proteggersi dagli stress ossidativi e
dall’apoptosi. I farmaci antiinfiammatori non steroidei, che inibiscono la COX-2, possono
prevenire il tumore del colon e causare apoptosi, bloccando la sintesi di PGE2, che è
considerata un fattore favorente lo sviluppo del tumore, e favorendo l’accumulo di acido
arachidonico, che è, invece, un segnale di apoptosi.
3. L’analisi del contenuto dei trigliceridi nella mucosa normale del colon e del carcinoma ha
evidenziato una diminuzione massiva nel carcinoma rispetto alla mucosa normale.
4. Dal momento che gli effetti degli acidi grassi sull’espressione genica possono essere
mediati dai PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor), recettori nucleari che
agiscono come fattori di trascrizione, l’analisi in western blot ha messo in evidenza un
aumento della isoforma gamma e una diminuzione della isoforma alfa. L’aumento
dell’isoforma gamma potrebbe spiegare la diminuzione del fattore di trasduzione del
segnale di proliferazione, pErk1,2. Infatti nei carcinomi del colon la proliferazione
cellulare non è aumentata rispetto alla mucosa normale. La diminuzione della isoforma
alfa potrebbe essere correlata ad una minore suscettibilità del tumore all’apoptosi e quindi
ad una maggiore sopravvivenza delle cellule, fatto che con ogni probabilità contribuisce
alla crescita tumorale.
5. La minore suscettibilità all’apoptosi è confermata dall’aumento di alcune proteine antiapoptotiche,
come bcl-2 e bcl-xL, che legandosi a proteine pro-apoptotiche ne
impediscono l’azione. La presenza del PPARgamma nei tumori potrebbe indurre a mettere
a punto un ligando di tale isoforma in grado di indurre il differenziamento delle cellule
tumorali, mentre la mancanza del PPARalfa potrebbe indurre a trovare un induttore di tale
isoforma in modo da indurre le cellule tumorali ad entrare in apoptosi.
PUBBLICAZIONI
• Maggiora M., Bologna M., Cerù M.P., Possati L., Angelucci A., Cimini A., Miglietta A.,
Bozzo F., Margiotta C, Muzio G, and Canuto R.A. An overview of the effect of linoleic
and conjugated-linoleic acids on the growth of several human tumor cell lines. Intern. J.
Cancer, 112: 909-919, 2004.
• Muzio G., Biasi F., Canuto R.A. Tra lipidi, dieta e predisposizione genetica. La
prevenzione della cancerogenesi. Torino Medica, 10, 49-55, 2004.
• Canuto RA. Dieta e cancro: ruolo degli acidi grassi poliinsaturi (PUFA) nella prevenzione
e progressione dei tumori. Meccanismi molecolari. Importanza dei fattori nutrizionali. In
“Prevenzione della cancerogenesi: ruolo dei lipidi della dieta e della predisposizione
genetica”. (RA Canuto and G Muzio editors), Stampa AGIT, Beinasco (Torino), aprile
2004, pagg. 5-30.
• Canuto Ra, Bertetto O, Maggiora M, Martinasso G, Napoletano R, Muzio G, Trombetta
A. Susceptibility to apoptosis and fatty acid profile in human colon cancer in comparison
with normal mucosa. Tumori (supplemento), 4, 23, 2005.
125

Maria Teresa Capucchio Filone tematico B1
Espressione del sistema Plasminogeno-Plasmina (PG-PL-PA) e PrP
cellulare nella ghiandola mammaria e nel latte bovino
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Patologia Animale
OBIETTIVO
Il presente progetto si e’ posto come obiettivo la valutazione della localizzazione cellulare
della PrPc e della possibile co-localizzazione di eventuali complessi PrPc-plasminogeno.
METODI E RISULTATI
A inizio della ricerca si è deciso di valutare l’interazione tra sistema PG-PL-PA e PrP
dapprima su un modello cellulare in vitro e poi, in secondo luogo, in vivo, su campioni di
tessuto mammario. Come modello in vitro è stata scelta una linea cellulare bovina
rappresentata da cellule epiteliali di ghiandola mammaria bovina (BME-UV1) che mantiene le
caratteristiche tipiche delle cellule epiteliali mammarie di bovino e che produce tutti i
componenti del sistema plasminogeno-plasmina. A riguardo dell’identificazione a livello
tissutale sono stati raccolti al macello n° 44 di campioni di tessuto mammario appartenenti ad
animali in diverso periodo di lattazione (0-45 giorni; 45-90; 90-210; 210-300 e oltre 300
giorni) che sono stati fissati in doppio sia in formalina per le indagini istologiche, che in una
miscela di glutaraldeide 1%- paraformaldeide 4% per le ricerche ultrastrutturali. Sulle cellule
BME-UV1 si è provveduto a individuare la localizzazione della PrPc mediante
immunofluorescenza e immunoistochimica utilizzando anticorpi marcatori monoclonali
(12F10, CEA; 248, INRA). Come è ben noto la PrPc è una sialoglicoproteina di membrana
osservata in numerosi tipi cellulari oltre al sistema nervoso centrale, correlata ad organuli
cellulari di tipo secretorio. Le nostre indagini hanno rivelato la presenza di questa proteina in
particolare a livello di membrana citoplasmatica e questa localizzazione e’ stata confermata
anche sui tessuti. Al fine di rendere maggiormente evidente la localizzazione della PrPc, la
linea cellulare e’ stata incubata per tempi diversi e con diverse concentrazioni di PrP sintetica
senza comunque ottenere risultati diversi da quelli precedentemente descritti.
In secondo luogo le cellule in monostrato sono state incubate con PG a diverse concentrazioni
(30, 50, 80 µg/ml) e per tempi diversi (10', 25', 40', 60'); si è quindi provveduto a valutare
l’eventuale assorbimento del plasminogeno da parte delle cellule mediante impiego di
immunofluorescenza utilizzando anticorpi antiplasminogeno 7336 (Pab, ABCAM) e 359
(Mab, INRA). Tuttavia, le reazioni condotte non hanno permesso di identificare in alcun
punto la localizzazione cellulare del plasminogeno, dato che lascia presumere che la sua
attivazione in plasmina avvenga per semplice contatto con la superficie cellulare in tempi
estremamente rapidi.
Vista l’impossibilità di rilevare la presenza del plasminogeno sulle cellule, la ricerca è stata
focalizzata a evidenziare la localizzazione di un altro componente del sistema PG-PL-PA,
ovvero del recettore di tipo urokinasico per l’attivatore del plasminogeno (uPAR), comunque
coinvolto nella reazione di conversione del plasminogeno in plasmina. Sulla linea cellulare si
sono pertanto eseguite ulteriori indagini immunologiche utilizzando un anticorpo contro il
recettore u-PAR umano garantito anche come marcatore dell’u-PAR bovino in
immunoprecipitazione (n. 3936, DBA). Tale anticorpo anti u-PAR, però, non si è rivelato
126

abbastanza specifico, in quanto né su sezioni di tessuto mammario bovino, né sulle cellule in
coltura si è riscontrata alcuna marcatura del recettore oggetto dello studio. Data l’impossibilità
di rinvenire in commercio altri anticorpi anti u-PAR specifici per il tessuto bovino, è stato
prodotto un anticorpo policlonale diretto contro il recettore uPAR bovino. L’antigene u-PAR
da inoculare è stato ottenuto in collaborazione con il Laboratorio di Virologia della Facoltà di
Medicina Veterinaria ingegnerizzando ceppi di E. coli col gene codificante l’u-PAR bovino,
la cui sequenza è nota e servendosi dell’m-RNA estratto dalla linea cellulare BME-UV1
provvista come suddetto di recettore u-PAR. La proteina ottenuta e’ stata successivamente
purificata ed utilizzata per inoculare alcuni conigli da cui è poi stato ricavato l’anticorpo
specifico per il recettore u-PAR bovino in questione. Suddetto anticorpo, dopo un numero
notevole di prove di laboratorio, ha permesso di ottenere buoni risultati dimostrandosi
specifico per identificare il recettore bovino in vitro ed in vivo. Le indagini
immunoistochimiche ed in immunogold hanno permesso di valutare la sua localizzazione
cellulare prevalentemente citoplasmatica a carico delle cellule epiteliali alveolari ed in minor
misura a livello di dotti e di cellule interstiziali. Molto interessante e’ stato il riscontro di un
segnale positivo che aumenta con il procedere della lattazione fino a 9 mesi circa per poi
ridursi leggermente. Relativamente alla co-localizzazione PrPc-PG, vista l’impossibilita’ di
localizzare il PG l’indagine si e’ decisamente spostata come suddetto sul recettore. Purtroppo
tutte le ricerche condotte in merito non hanno rivelato nessun tipo di interazione tra le due
proteine che sembrano avere prevalentemente una diversa localizzazione cellulare: la PrPc pur
essendo prodotta in sede citoplasmatica e’ risultata prevalentemente espressa a livello di
membrana cellulare, mentre il recettore u-PAR e’ una proteina essenzialmente citoplasmatica,
che presumibilmente raggiunge la membrana solo per tempi brevissimi al fine di consentire la
conversione del plasminogeno in plasmina. La presenza di inibitori specifici fa si’ che il
complesso recettore ed enzima dopo la conversione venga subito internalizzato dentro la
cellula per essere degradato.
Per quanto riguarda le indagini sul latte sono stati raccolti n° 70 campioni in un’azienda di
Frisone. I campioni di latte appartenenti anch’essi alle diverse fasi di lattazione sono stati
sottoposti a ripetute centrifugazioni onde separare le diverse frazioni (panna, siero, pellet di
caseine e pellet di cellule somatiche). Test colorimetrici mediante l’uso di spettrofotometro
sono stati eseguiti sul siero e sulle caseine al fine di determinare l’attivita’ della plasmino, del
plasminogeno e dell’attivatore enzimatico del sistema (u-PA). Tutte le determinazioni hanno
rivelato un incremento dell’attivita’ con il procedere della lattazione con un massimo intorno
al sesto-decimo mese analogamente a quanto osservato relativamente al recettore nei tessuti.
Dopo questo periodo l’attivita’ del sistema diminuisce per poi presumibilmente risalire
durante la lattazione successiva.
Obiettivi futuri di questa ricerca sono l’esame di tessuti mammari affetti da mastite per
valutare l’entita’ dell’incremento del sistema in caso di flogosi e l’esecuzione di indagini sul
latte raccolto in un unico gruppo di animali campionati per tutta la lattazione al fine di
accertare l’andamento del sistema nella lattazione tardiva spinta.
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Maria Caramelli Filone tematico B3
Progetto pilota per un piano di monitoraggio per la ricerca di tessuto
nervoso negli ambienti di macellazione
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta
Centro di Riferimento per le Encefalopatie Animali
OBIETTIVO
I provvedimenti adottati a livello comunitario per garantire la tutela della salute pubblica dal
rischio BSE prevedono (Regolamento CE 1139/2003, che modifica il Regolamento 999/2001)
che a partire dal 1° ottobre 2003 vengano introdotti sistemi diagnostici atti a rilevare la
possibile contaminazione delle carni di spolpo, provenienti dalla testa di bovini e destinate al
consumo umano, da parte di materiale specifico a rischio (SRM) non adeguatamente rimosso.
Al fine di valutare l’affidabilità dei test diagnostici disponibili per questo monitoraggio, è
stata effettuata la validazione di 2 sistemi ELISA per il rilievo del tessuto nervoso nelle carni.
Il Ridascreen® Risk Material (RRM) è studiato per l’applicazione sui prodotti carnei mentre
il Ridascreen® Risk Material 10/5 (RRM 10/5) è un metodo specifico per le carni di spolpo.
In una seconda fase è stata valutata la presenza di “punti rischio” di contaminazione da SRM
in diverse tipologie di impianti di macellazione sul territorio piemontese ed è stata verificata
la presenza ed il grado di contaminazione da SRM nelle carni provenienti da disosso. E’ stato
infine effettuato uno studio volto a una prima valutazione della presenza di tessuto nervoso in
alcune tipologie di prodotti carnei.
MATERIALI E METODI
Messa a punto e validazione dei test
1. Preparazione dei campioni RRM 10/5:
Preparazione dei campioni negativi: 503 campioni di muscolo profondo della coscia di 2
bovini, morti in stalla le cui carcasse non sono state divise meccanicamente in mezzane e
per questo considerati a minor probabilità di contaminazione.
Preparazione dei campioni positivi: 568 omogenati di muscolo bovino ottenuti nelle stesse
condizioni, cui sono stati aggiunti dosi crescenti di sistema nervoso centrale (SNC), in
ragione dello 0.1%, 0.2% e 0.4%.
Per validare il test RRM sono stati utilizzati 532 campioni negativi e 654 campioni
positivi con una concentrazione di 0,5%, 1%, 2% di SNC.
2. Scelta del cut-off: le letture sono state raggruppate in classi di valori di concentrazione per
stabilire un cut-off e relativa sensibilità e specificità del metodo da applicare nell’ambito
dei piani di monitoraggio. Partendo dalle classi di valori è stata ottenuta la relativa curva
ROC (Receiver Operative Curve) per dati parametrici, con la quale è stato identificato il
livello di concentrazione cut off che garantisce la miglior capacità discriminante in termini
di specificità e sensibilità.
3. Valutazione della reliability: scelto il valore ottimale di cut-off sono poi state valutate
riproducibilità e ripetibilità dei due kit diagnostici, espresse come K di Cohen.
128

Monitoraggio carni di spolpo
Rilevamento punti di rischio e Campionamenti Sono stati visitati 5 macelli del territorio
piemontese: è stata valutata e documentata fotograficamente la presenza di punti di rischio per
la contaminazione da SRM della carne proveniente dallo spolpo delle teste lungo la catena di
macellazione. E’ stato realizzato un piano di campionamento pilota finalizzato a verificare
l’ipotesi di accumulo di SNC per passaggio dall coltello o banco di lavorazione alle teste. I
prelievi sono poi stati eseguiti su 498 teste provenienti da impianti di macellazione a diversa
capacità. La dimensione del campione è stata calcolata in modo da identificare almeno un
caso positivo nel caso in cui la prevalenza di contaminazione fosse superiore o uguale allo
0.6%. In tal caso ci si è consentiti un errore massimo del 2.6% nella successiva stima della
prevalenza con una confidenza del 95%. Il test utilizzato è il RRM 10/5. Il campionamento è
stato eseguito strofinando un tampone sulla superficie muscolare (circa 10 cm 2 ) a livello della
linea di resezione della testa (decapitazione) alla fine delle operazioni di scuoiatura o, nel caso
sia stato eseguito, alla fine del disosso.
Monitoraggio prodotti carnei. Sono stati raccolti 500 campioni (in aliquote da 100 gr),
suddivisi nelle seguenti categorie ripartite per fasce di prezzo: ripieno di pasta fresca, wurstel,
hamburger, carni in scatola, mortadella ed omogeneizzati.
RISULTATI
Messa a punto e validazione dei test. Le aree delle curve ROC ottenute sono indicative di
altissimi valori di sensibilità e specificità per entrambi i test. Nel punto di massimo valore di
sensibilità e di minimo tasso di falsi positivi è stato individuato il cut-off che quindi risulta
pari a 0.049 per il test RRM 10/5 corrispondente a Se=97.9% e Sp=97.4% e pari a 0.297 per il
test RRM corrispondente a Se=99.5% e Sp=99.8%. Dopo aver stabilito il valore soglia, i test
sono stati considerati di tipo qualitativo anche per condurre lo studio di reliability.
Quest’ultima ha fornito i seguenti valori di k:
Riproducibilità intra-operatore
Test Operatore 1 Operatore 1
RRM 10/5 0.78 (IC95%0.38-1.00) 1 (IC95%1.00-1.00)
RRM 0.91 (IC95%0.73-1.00) 0.92 (IC95%0.76-1.00)
Riproducibilità inter-operatore
Test Giorno1 Giorno 1
RRM 10/5 1 (IC95% 1.00-1.00) 0.78 (IC95% 0.38-1.00)
RRM 0.92 (IC95% 0.76-1.00) 0.91 (IC95% 0.73-1.00)
Monitoraggio carni di spolpo
Nel corso dei sopralluoghi effettuati al macello sono stati individuati i seguenti punti di
rischio: stordimento dell’animale con il proiettile (possibile inquinamento dei tessuti adiacenti
il foro frontale); piano di lavoro nell’esecuzione delle procedure di prelievo dell’obex e
apposizione del tappo nel foramen magnum; asportazione delle corna, apposizione del gancio,
separazione dei masseteri (disosso), scuoiamento delle teste: eliminazione della pelle
adiacente al foro frontale ed intorno ai masseteri, separazione tramite sega elettrica dello
splancnocranio dal neurocranio (rischio di contaminazione delle carni di spolpo per incisione
dell’occhio dell’animale), trasporto su carrello (rischio di contaminazione per distacco dei
tappi), depilazione delle teste a mano e in centrifuga e successivo raffreddamento in vasca
(testine rasate).
129

I risultati del progetto pilota hanno dimostrato che non vi è una contaminazione crescente
delle teste con SNC nella sequenza di macellazione, ma che risulta del tutto casuale. La
prevalenza grezza è risultata pari a 14.7% (IC95% 11.7%-18.1%).
Monitoraggio prodotti carnei La prevalenza grezza nei prodotti carnei è risultata pari al
2.2% (IC95% 1.1-3.9) e i positivi erano tutti concentrati nel gruppo dei wurstel (prevalenza
10.3, IC95% 5.7-20.1) eccetto uno tra le paste farcite (prevalenza 0.42, IC95% 0.1-2.3).
CONCLUSIONI
I metodi presi in esame dimostrano un elevato livello di validità e di precisione. Ciò li rende
affidabili per l’applicazione in piani di monitoraggio per la ricerca di SRM nelle carni. I
risultati preliminari indicano la potenziale presenza di contaminazione da SRM sia negli
impianti di macellazione che nei prodotti carnei.
130

Pietro Caramello Filone tematico D4
Studio di suscettibilità e farmacodinamico dei ceppi di P.falciparum
importati
A.s.l. 3 – Ospedale Amedeo Savoia
U.O.a. Malattie Infettive “divisione”
CONTESTO E RAZIONALE
La sorveglianza della suscettibilità agli antimalarici dei ceppi di P.falciparum può permettere
di ottimizzare le strategie di prevenzione e trattamento della infezione nei viaggiatori diretti
nei paesi di endemia malarica. Il trattamento della malaria si basa tradizionalmente
sull’impiego del chinino; diversi studi hanno mostrato come i derivati dell’artemesinina
possano ridurre la clearance dei parassiti, permettere una minore morbidità e ridurre gli effetti
collaterali.
OBIETTIVO
Lo studio è consistito nella sorveglianza della suscettibilità “in vitro” a diversi chemioterapici
dei ceppi di P.falciparum importati nel nostro paese, e in una valutazione farmacodinamica
“in vivo” dei farmaci utilizzati in terapia della malaria da P.falciparum non complicata.
MATERIALI E METODI
Studio di suscettibilità “in vitro”: la valutazione è stata condotta con il test “WHO Micro-test
Mark III” che si basa sulla valutazione al microscopio della crescita dei plasmodi coltivati in
presenza di concentrazioni differenti di farmaco; erano quindi calcolate la IC50 e la IC90 con
il WHO Log-probit. Sono stati testati i seguenti farmaci: clorochina, meflochina, chinino,
alofantrina, pironaridina e amodiachina.
Studio di farmacodinamica “in vivo”: il trattamento non è stato randomizzato; i pazienti sono
stati trattati, secondo il giudizio del Medico che aveva in cura il paziente, sulla base dello
stato clinico, del livello di premunizione e della parassitemia con uno dei seguenti
chemioterapici: chinino (e.v.), meflochina (os), beta-arthemeter (os o e.v.). Sono stati misurati
i seguenti parametri: parassitemia alle ore 0, 6, 12, 24 e quindi ogni 24 ore sino alla
negativizzazione; sono stati quindi calcolati il tempo per la riduzione della parassitemia del
50%, 90% e 100% [PC(50), PC(90), e il tempo di clearance parassitaria PCT]; il tasso della
riduzione parassitaria a 24 e 48 ore o Paraste Reduction Rate (PRR), la percentuale di pazienti
con parassitemia non dimostrabile a 48 ore [PPUP(48)] ed il tempo necessario alla
eradicazione della infezione.
RISULTATI
Tutte le infezioni erano acquisite in Africa. Tutti i pazienti sono stati curati con successo.
Studio di suscettibilità “in vitro”: nel corso dello studio sono stati analizzati 94 isolati di
P.falciparum. L’origine degli isolati era così ripartita: Africa orientale 10 (10,6 %); Africa
occidentale 84 (89,4 %). I dati di suscettibilità sono riferiti ai primi 67 campioni esaminati;
per gli altri 27 campioni l’analisi non è ancora completa. Le IC50 e le IC90 (micromol/L)
131

sono state le seguenti per i diversi farmaci: clorochina: 0.129 e 0.648; amodiachina: 1.134 e
5.445; meflochina: 0.38 e 0.868; chinino: 0.193 e 0.478; alofantrina: 3.27 e 25.35;
pironaridina: 11.504 e 51.996. Le IC sono risultate maggiori per gli isolati ottenuti dall’Est
Africa rispetto a quelli dell’Africa occidentale. Tutti i ceppi erano suscettibili a chinino e
meflochina; resistenza alla clorochina si è osservata nel 14% dei ceppi (inferiore rispetto ai
tassi osservati in occasione di precedenti ricerche condotte negli anni ’85-’90), alla
amodiachina nel 33% dei casi (con cross-resistenza alla clorochina (r = 0.93; P < .0001); si è
osservata anche bassa suscettibilità alla pironaridina (66,7%).
Studio di farmacodinamica “in vivo”: sono stati studiati 99 casi di infezione malarica. 63
pazienti (63,6%) erano immigrati dall’Africa [più del 50% (38) dalla Nigeria], mentre 33
erano di nazionalità italiana. Trentasei pazienti sono stati trattati con chinino, 42 con
meflochina, 21 con beta-arthemeter. I dati sono stati elaborati sino ad ora per i primi 73 casi:
l’analisi farmacodinamica è stata focalizzata sul confronto tra il chinino e il beta-arthemeter.
La clearance parassitaria [PC(50), PC(90), e PCT] è risultata più rapida per il beta-arthemeter
rispetto al chinino: rispettivamente: 16.8, 42.6, e 72 h per chinino vs 7.9, 12.2, e 48 h per betaarthemeter;
p: 0.02, < .0001, e .008, rispettivamente. Il numero di pazienti che ha ottenuto una
PPUP(48) con il beta-arthemeter è stato maggiore rispetto al chinino (66.7 vs 9.1%, p < .003),
mentre il PRR(24) è stato significativamente maggiore nel gruppo dei pazienti trattati con
beta-arthemeter (617 vs 3.15, p = .0001). Il PRR(48) ed il tempo di eradicazione non erano
misurabili nel gruppo del beta-arthemeter in quanto nella maggior parte dei casi la
parassitemia era negatova prima delle 48 ore. Si sono osservate due recrudescenze nei
pazienti trattati con beta-arthemeter trattati rispettivamente per 5 e 7 giorni.
CONCLUSIONI
Studio di suscettibilità “in vitro”: sulla base dei risultati osservati il chinino conferma la
propria indicazione nel trattamento della malaria; la meflochina mantiene le indicazioni nel
trattamento della malaria non complicata e nella profilassi in Africa.
Studio di farmacodinamica “in vivo”: i parametri farmacodinamici della meflochina e del
chinino sono risultati sovrapponibili a quelli pubblicati in letteratura. Il beta-arthemeter ha
dimostrato una più rapida clearance parassitaria e parametri farmacodinamici migliori rispetto
a quelli del chinino tanto da farlo considerare di prima scelta nella malaria non complicata;
l’osservazione di due recrudescenze entro un mese dal trattamento consiglia di cosoministrare
il beta-arthemeter alla meflochina.
Altre attività svolte nel corso della sorveglianza e dell’analisi farmacodinamica ·
collaborazione con l’Istituto Superiore di Sanità per una analisi genetica delle mutazioni
(K67T e A220S) caratteristiche della resistenza alla clorochina; · collaborazione con la rete
europea TropNet Europe per la sorveglianza delle malaria di importazione.
PUBBLICAZIONI ·
Caramello P et al. Chemosusceptibility analysis of Plasmodium falciparum imported malaria
in Italy. Diagn Microbiol Infect Dis 2005 Jun;52(2):107-12 ·
Caramello P et al. Pharmacodynamic analysis of antimalarials used in Plasmodium falciparum
imported malaria in northern Italy Travel Med. 2005 May-Jun;12(3):127-32 · Severini C, …
Caramello P, Canta F et al. Prevalence of pfcrt point mutations and level of chloroquine
resistance in Plasmodium falciparum isolates from Africa. Infect Genet Evol. 2005 Sep 7
132

Nicola Carlone Filone tematico C1
Attivita’ antimicotica e immunomodulante di fitoterapici nei confronti di
lieviti agenti di candidosi
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia
CONTESTO E RAZIONALE
Nell’ultimo decennio l’aumento dell’incidenza delle micosi da Candida spp. rappresenta un
problema terapeutico emergente e preoccupante. Negli ultimi anni si ha una maggior
disponibilità di farmaci attivi verso i miceti, ma la farmaco-resistenza, la tossicità degli
antimicotici e le problematiche associate alle terapie a lungo termine, stanno orientando la
ricerca verso soluzioni alternative o di sostegno alla terapia classica con l’uso di fitoterapici.
Benché diano minori effetti collaterali dei farmaci sintetici, i fitoterapici non sono innocui e la
loro attività deve essere accompagnata da una valida base scientifica che ne garantisca
validità, sicurezza, efficacia e uso adeguato. Poiché l’efficacia terapeutica di un agente
antimicrobico non dipende solo dall’azione diretta sul microrganismo, ma anche
dall’influenza esercitata sulle funzioni e sull’attività del sistema immune dell’ospite, è bene
conoscere le interazioni che si instaurano tra miceti, fagocita e antimicrobico per favorire
farmaci che siano in grado di stimolare i meccanismi di difesa dell’ospite. In questo studio si è
valutata l’azione antimicotica di alcuni oli essenziali (OE) nei confronti di ceppi clinici di
C.albicans e, successivamente, l’azione immunomodulante del timo, paragonandola a quella
di fluconazolo (FLU), sui PMN isolati da soggetti sani verso C.albicans timo-sensibile.
MATERIALI E METODI
I ceppi di C.albicans, provenienti da pazienti afferenti agli Ospedali di Torino sono stati
identificati c/o Lab. di Batteriologia e Micologia del Dip. di Sanità Pubblica e Microbiologia
mediante il sistema API ID 32C. L’attività antimicrobica (MIC) degli OE (pino, salvia,
garofano, timo, melissa, finocchio, lavanda) è stata eseguita in brodo RPMI 1640 (senza
bicarbonato, contenente glutammina, MOPS 0.165mol/L, pH 7) secondo la metodica del
CLSI. Le soluzioni degli OE al 40% sono state preparate in etanolo, mentre le successive in
RPMI 1640 (range 2-0,0039%). Le prove sono state effettuate in piastre a 96 pozzetti,
inoculando ogni pozzetto con 100microl della concentrazione di riferimento. L’inoculo
fungino (5x10*6ufc/ml) è stato preparato da brodocolture di 24h in Sabouraud dextrose agar
(SAB), incubato a 30°C e risospeso in RPMI 1640+MOPS. L’inoculo è stato diluito alla
concentrazione di 5x10*4/ml in fisiologica. I due inoculi sono stati aggiunti ai pozzetti
contenenti gli oli, la cui concentrazione finale è risultata variare dall’1 allo 0,0019%. Nel
saggio sono stati inclusi un controllo di crescita (RPMI+lievito) e uno per il terreno RPMI.
Test di fagocitosi. C.albicans (2x10*6ufc/ml), marcata con 3H-uracile in RPMI 1640, è stata
aggiunta ai PMN (10*6cell/ml) e incubata a 37°C in agitazione per 30’, 60’e 90’.
Parallelamente sono state preparate provette senza PMN contenenti lieviti marcati e RPMI
1640. Ai vari tempi, i PMN sono stati centrifugati a 160g per 5’, risospesi in tampone e
ricentrifugati per rimuovere i lieviti non fagocitati. Le cellule sono state sottoposte a lisi
osmotica addizionando 1 ml di acqua distillata sterile per 5’. Aliquote di 100microl della
sospensione sono state poste in vials contenenti 1 ml di liquido di scintillazione e lette con lo
spettrofotometro a scintillazione liquida. La radioattività misurata è stata espressa come
133

c.p.m./campione (colpi per minuto). L’attività fagocitaria è stata espressa ai vari tempi di
osservazione come % di fagocitosi pari al rapporto percentuale tra i c.p.m. dei lieviti
intraPMN e quelli dei lieviti in toto.
Test di killing. Aliquote di 1 ml di lieviti (2x10*6 ufc) e di PMN(10*6 cellule) in RPMI 1640
sono state incubate a 37°C in agitazione per 30’affinché avvenisse la fagocitosi. Dopo vari
lavaggi per rimuovere i lieviti non fagocitati, un’aliquota di PMN è stata lisata per il
conteggio al t0 dei lieviti fagocitati e sopravvissuti, dopo 30’di fagocitosi, all’azione litica dei
PMN. 500microl del lisato sono stati diluiti e aliquote di 100microl sono state spatolate su
SAB agar per la conta delle ufc. Le provette rimaste sono state incubate e la conta dei lieviti
intracellulari è stata effettuata ai tempi stabiliti (tx=30’, 60’, 90’). L’attività di killing è stata
espressa, ad ogni tempo, come Indice di Sopravvivenza (IS), definito dal rapporto tra la
somma delle ufc/ml al t0 e al tx, e le ufc/ml al t0. Se il rapporto è uguale a 1, l’attività di
killing è del 100%, mentre se è = o >2 non si ha effetto fungicida. Gli effetti del timo e del
FLU sull’attività fagocitaria e fungicida intracellulare dei PMN sono stati valutati incubando i
lieviti e i fagociti a 37°C in presenza di 0.03microg/ml di timo (MIC) e di 8microg/ml di FLU
(picco sierico). I test di fagocitosi e di killing sono stati condotti secondo gli schemi
precedenti. Ogni esperimento è stato effettuato in quadruplicato e confrontato con i sistemi di
controllo senza farmaco. La valutazione statistica delle differenze tra i risultati delle prove
eseguite con e senza farmaci è stata effettuata mediante il test di Tukey.
RISULTATI
I dati relativi all’attività antifungina degli OE, mediante la determinazione della MIC, con i 2
diversi inoculi fungini, mostrano una ottima sensibilità dei ceppi di C.albicans studiati, alle
due diverse concentrazioni, nei confronti di tutti gli OE saggiati. In particolare, timo,
finocchio, garofano, lavanda hanno mostrato una attività maggiore (0.03-0.06 microg/ml)
rispetto a pino, melissa e salvia (0.06-0.25microg/ml). Poichè il timo ha mostrato la MIC più
bassa si è deciso di utilizzare questo olio per valutare la sua influenza sull’attività fagocitaria e
microbicida paragonandola con quella del fluconazolo. I dati ottenuti mostrano che i PMN di
controllo senza farmaco sono in grado di fagocitare le candide secondo valori che rimangono
costanti nei 90’di osservazione e che si attestano intorno al 70%. In presenza di timo e di FLU
l’attività fagocitaria subisce un leggero incremento soltanto ai 30’(75, 8% e 81,7%,
rispettivamente; p

Laura Cavallarin Filone tematico B1
La filiera avicola piemontese: contaminazione da ocratossina A e
individuazione di un marker per l’allevamento biologico
Consiglio Nazionale delle Ricerche
Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari
MATERIALI E METODI
L’indagine é stata svolta nell’arco di due anni monitorando due allevamenti di galline ovaiole,
uno convenzionale ed uno biologico e due allevamenti di polli da carne, uno convenzionale ed
uno biologico. In ogni allevamento sono stati effettuati prelievi di campioni rappresentativi di
alimenti e di sangue. I metodi adottati per la quantificazione di ocratossina A (OTA) nel siero
(Zimmerli B. et al, 1995) e nel mangime (Entelwise A.C. et al., 2000), sono stati leggermente
modificati per renderli compatibili con le strumentazioni presenti in laboratorio e con le
matrici in esame. Sono stati definiti accuratezza e precisione dei metodi analitici prescelti,
mediante contaminazione artificiale con quantità note (tre repliche per tre livelli di
concentrazione) di OTA. Per ogni esperimento di contaminazione sono stati calcolati: la
percentuale di recupero dell’OTA, la deviazione standard e la deviazione standard relativa.
Per il siero, il recupero è risultato sempre al di sopra dell’80%, con una media pari a 83,3%. Il
coefficiente di variazione (RSD) é risultato basso per tutti i livelli considerati (in media
3,1%). Per le prove di contaminazione del mangime, la percentuale di recupero media
ottenuta è stata pari al 80,6 ± 5,8% con un coefficiente di variazione medio del 7,3%. I
coefficienti di variazione di tutti i livelli considerati rientrano nei range raccomandati. Si é
quindi proceduto alla determinazione dell’OTA nei campioni di siero e di alimenti prelevati
nelle diverse aziende.
RISULTATI
Dei 19 campioni di siero prelevati in aziende convenzionali, 13 sono risultati positivi con
valore massimo di contaminazione pari a 0,118 ng OTA/ml siero. Nelle aziende biologiche, in
13 dei 15 campioni analizzati è stata rivelata la presenza di OTA, con una contaminazione
massima pari a 0,165 ng/ml siero. Nel mangime convenzionale, 7 campioni su 8 sono risultati
positivi, con livelli massimi pari a 3,31 ng/g. I risultati ottenuti nei mangimi biologici
riguardano solo 2 campioni, poiché non è stato possibile raccoglierne un numero superiore.
L’OTA è stata rilevata in entrambi i campioni analizzati, con livelli massimi di 4,98 ng/g;
analisi effettuate su glutine di mais e su un nucleo extraziendale, impiegati per la produzione
del mangime completo biologico, hanno fatto registrare i livelli più elevati di OTA (9,18 e
6,96 ng/g rispettivamente). Attualmente i livelli massimi di ocratossina A sono normati dal
regolamento CE 472/92, che fissa il limite massimo nei cereali destinati al consumo umano in
5 ng/g. Non esistono al momento normative che regolamentino la contaminazione in alimenti
zootecnici. A causa del limitato numero di campioni a disposizione non è stato possibile
elaborare statisticamente i dati.
CONCLUSIONI
E’ tuttavia possibile fare alcune considerazioni preliminari. I campioni di siero che hanno
mostrato i valori di contaminazione maggiore, sono provenienti da aziende biologiche, con
135

livelli massimi di OTA pari a 0,165 ng/ml. La percentuale di campioni positivi è stata più alta
nei campioni provenienti da animali di allevamenti biologici rispetto a quelli convenzionali
(86,7% vs 68,4%). Il siero di polli da carne biologici sono risultati meno contaminati rispetto
a quelli convenzionali (60% vs 71,4%). I sieri delle galline ovaiole biologiche hanno mostrato
una percentuale di positività superiore a quella delle galline convenzionali (100% vs 66,7%).
Per quanto riguarda gli alimenti, i campioni risultati positivi sono il 90%. I valori di
contaminazione medi osservati sono stati di 0.88 ng/g per i mangimi convenzionali e di 3.17
ng/g per i mangimi biologici. Il valore di contaminazione più elevato corrisponde al mangime
delle galline ovaiole biologiche (4,98 ng/g), in cui successivamente sono stati riscontrati i
livelli più alti di OTA nei sieri. I risultati ottenuti mostrano una diffusa presenza di OTA, a
livelli molto bassi, nel siero di animali allevati sia in aziende biologiche che convenzionali,
che rispecchia la diffusa contaminazione di OTA nei relativi mangimi. I dati indicherebbero
maggiore incidenza e più alto livello di contaminazione negli allevamenti biologici, sia per
quanto riguarda gli alimenti che il sangue degli animali. Per quanto riguarda l’individuazione
di un marker per l’allevamento biologico, nella prima parte dell’attività di ricerca é stata
messa a punto una metodica per la quantificazione, nell’uovo, dell’ antiossidante di sintesi
butilidrossitoluene (BHT) di derivazione alimentare. La molecola é stata individuata come
potenziale marker poiché l’allevamento biologico presuppone un disciplinare molto rigido per
quanto riguarda la fonte di alimentazione ed esclude l’utilizzo di integratori di sintesi. Sono
stati quindi analizzati campioni di uova provenienti dalle aziende tradizionali e biologiche per
determinare il contenuto in BHT. Tutti i campioni sono risultati negativi. E’ possibile che tali
sostanze non siano eliminate a livello del tuorlo da parte delle specie avicole. Se così fosse
resta da definire quali tessuti possano rappresentare sedi di accumulo e in quale entità queste
sostanze si possano accumulare. Per questo motivo é nostra intenzione effettuare una
sperimentazione ad hoc che preveda l’alimentazione di galline ovaiole con diete
supplementate artificialmente con antiossidanti e la verifica di eventuali trasferimenti di
queste molecole nei diversi tessuti.
136

Federica Cavallo Filone tematico C1
Prevenzione dei carcinomi squamosi della cavità orale mediante
vaccinazione a DNA: sperimentazione preclinica
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche
CONTESTO E RAZIONALE
I progressi ottenuti in campo oncologico negli ultimi anni non sono stati in grado di ridurre
significativamente la mortalità legata al carcinoma squamoso della cavità orale (OSCC) che è
rimasta per lo più stabile. La terapia normalmente adottata per gli OSCC, che prevede una
combinazione di trattamenti chirurgici, radioterapici e chemioterapici, infatti non ha dato i
risultati attesi e soprattutto non ha contribuito a migliorarne la prognosi estremamente
infausta. I dati epidemiologici evidenziano la necessità di identificare e promuovere nuovi
trattamenti farmacologici specifici per il carcinoma del cavo orale.
OBIETTIVO
Scopo della presente ricerca è stato valutare l’efficacia antineoplastica di una vaccinazione a
DNA specifica diretta nei confronti della proteina p185 su uno dei modelli animali più
utilizzati per lo studio degli OSCC.
METODI E RISULTATI
L’innovazione apportata dalla tecnica della vaccinazione a DNA deriva dal fatto che la
molecola utilizzata per vaccinare non è direttamente il bersaglio della risposta immunitaria,
bensì il DNA codificante la proteina antigenica. La scelta della proteina p185, recettore
tirosin-chinasico della famiglia dell’epidermal growth factor codificata dal gene Her-2/neu, è
motivata dal fatto che essa è iperespressa in circa il 60% dei casi di OSCC. Inoltre è stato
dimostrato che questo antigene rappresenta un buon bersaglio per l’immunoterapia anche
quando le stesse cellule che lo esprimono riducono drasticamente la loro capacità di esprimere
le glicoproteine MHC I, per fenomeni di instabilità genetica. Lesioni neoplastiche ben
apprezzabili sono state indotte nelle tasche buccali di criceti siriani, mediante inoculo nella
sottomucosa, di cellule tumorali (HCPCI) derivate da un OSCC indotto chimicamente e
forniteci dal Prof. D.T. Wong.
Caratterizzazione della linea cellulare HCPCI per l’espressione della p185. L’espressione
della p185 sulle cellule HCPCI è stata valutata mediante western blot. La presenza della
banda a 185 kDa ha confermato l’espressione della proteina p185. Mediante tecniche
immunoistochimiche si è valutata sia la localizzazione (prevalentemente di membrana) sia
l’intensità (corrispondente al livello medio-alto nella valutazione anatomopatologica di cerbB2
in campioni di carcinoma della mammella). Inoltre l’espressione di p185 è stata
esaminata mediante analisi al FACscan: in questo caso è stato possibile dimostrare che il 98%
delle cellule è p185+ ed il 92% di queste esprime p185 sulla membrana cellulare.
Induzione tumorale mediante inoculo delle cellule HCPCI nel gruppo di controllo. Le
cellule HCPCI sono state iniettate nella sottomucosa della tasca destra di 19 animali di
controllo; 14 di essi (73.7%) hanno sviluppato delle lesioni neoplastiche, con un diametro
compreso tra i 3 e gli 11 mm al momento del sacrificio. Di questi, 6 animali presentavano
137

masse nodulari, tre delle quali ulcerate, mentre i rimanenti 8 presentavano lesioni similleucoplasiche
di forma irregolare. In tutti i casi l’analisi istologica ha evidenziato la presenza
di focolai multipli di cellule epiteliali neoplastiche localizzate nel tessuto connettivo. Sono
state inoltre rilevate perle cornee, cellule atipiche con ipercromatismo e pleomorfismo ed
alcune cellule multinucleate. In molti casi erano presenti foci di necrosi. L’origine epiteliale
delle cellule infiltrate è stata confermata mediante immunoistochimica dall’espressione delle
citocheratine. Le stesse cellule tumorali sono risultate positive anche per la p185, con una
colorazione preferenzialmente di membrana. Le tasche dei 5 animali che al sacrificio non
avevano sviluppato tumori presentavano, all’analisi istologica, un infiltrato infiammatorio con
una capsula fibrosa tipica della reazione da corpo estraneo. In due animali è stato riscontrato
un nodulo di fibre dense, contenente alcune cellule infiammatorie ma non cellule tumorali. La
vaccinazione a DNA induce un’immunità protettiva contro le cellule HCPCI nei criceti
siriani. Una significativa e specifica inibizione della crescita tumorale è stata riscontrata nei
criceti immunizzati con i plasmidi p185EC-TM, 21 e 7 giorni prima dell’inoculo delle cellule
tumorali HCPCI. Solo 7 dei 19 animali vaccinati (36.6%, p

Maria Rita Cavallo Filone tematico C2
Realizzare il governo clinico attraverso i percorsi diagnostico terapeutico
assistenziali
Asl 10
Struttura Complessa di Staff – Ricerca, Formazione e Qualità
OBIETTIVO
Il progetto si poneva principalmente i seguenti obiettivi:
• realizzare inpratica quel governo clinico, di cui tanto si parla, attraverso la stesura,
l’attuazione e la valutazione dei percorsi che il cittadino svolge nel sistema sanitario,
attraverso i servizi messi a disposizione, come il continuum assistenziale per risolvere il
suo bisogno di salute;
• trasferire l’esperienza ad altre aziende che intendessero cimentarsi in tali attività.
METODI E RISULTATI
Come da progetto i percorsi redatti, nel 2003 dagli specialisti dell’ASL 10 (K mammella e K
colon, BPCO, Diabete, Scompenso Cardiaco, Depressione maggiore e Percorso nascita) sono
stati oggetto di revisione in focus group con i Medici di Medicina Generale (MMG). Questi
percorsi definiti “profili di cura” in quanto descrivevano il percorso del paziente nei soli
momenti di cura delle strutture ospedaliere, sono stati trasformati in “profili di assistenza”
descriventi il percorso effettivo del paziente sia in ospedale che negli ambulatori del MMG e a
domicilio. I percorsi effettivi così descritti, sono stati confrontati con evidenze scientifiche di
provata efficacia ottenute attraverso ricerche documentali realizzate dopo formazione mirata a
far acquisire consapevolezza dell’importanza di utilizzare linee guida e competenze per la
ricerca. Dal confronto si sono ottenuti i percorsi di riferimento intesi come percorsi ottimali,
per la realtà locale in termini di efficacia ed efficienza, compatibilmente alle risorse
disponibili.
I percorsi di riferimento descritti con l’ausilio di un diagramma di flusso corredato da note
esplicative, sono poi stati condivisi e successivamente diffusi a tutti gli operatori coinvolti e
sono da inizio anno attuati in fase sperimentale per sei mesi. Tutte le fasi del progetto sono
state sostenute da interventi formativi mirati ad acquisire elementi metodologici per la
costruzione di un percorso ed in particolare per acquisire le necessarie abilità per descrivere
sia l’intero percorso sia ogni episodio dello stesso evidenziando per ognuno le modalità di
misura e monitoraggio dei risultati. In una serie di slide sono stati riportati gli elementi
caratterizzanti la metodologia utilizzata per la stesura e tale materiale potrebbe essere
utilizzato per esportare l’esperienza in altre aziende sanitarie.
Nella fase di revisione dei percorsi effettivi e nella costruzione di quelli di riferimento i gruppi
di lavoro, una volta evidenziati in diagramma di flusso gli episodi più significativi, li hanno
descritti tenendo presente come guida per la stesura delle note le nove categorie assistenziali
proposte dalla Joint Commission declinate secondo le classiche domande per l’analisi di un
processo: CHI, COME, COSA, DOVE,QUANDO e PERCHÈ. Le nove categorie assistenziali
utilizzate come guida per garantire cure efficaci e sicure a tutti senza tralasciare aspetti che
potrebbero essere determinanti sull’esito finale del trattamento sono:
• valutazione del paziente;
• educazione del paziente e/o della famiglia;
139

• pianificazione del percorso e della dimissione;
• esami;
• interventi, procedure;
• consulenze;
• terapia;
• nutrizione;
• attività e sicurezza del paziente.
Non sempre il risultato ottenuto risponde a questi requisiti tant’è che come azione correttiva il
coordinatore di progetto ed i tutor dei gruppi hanno pensato che nella prossima revisione dei
documenti di percorso, prevista post sperimentazione, fosse meglio far riformulare, le note
descrittive degli episodi con matrici obbligate.
Grosse difficoltà si sono incontrate inoltre nella definizione di uno specifico sistema di
indicatori per il controllo dell’attuazione del percorso e delle performance, tant’è che
l’obiettivo di realizzare un sistema di indicatori da utilizzare per redigere report di
rendicontazione alla Direzione è stato raggiunto solo in parte. Nei documenti di descrizione
dei percorsi di riferimento sono infatti riportati unicamente indicatori desunti dalle linee guida
o già utilizzati da flussi informativi preesistenti. Sicuramente questi indicatori inseriti in un
quadro sistemico come quello di un percorso forniscono informazioni preziose, ma sarebbe
opportuno proseguire lo studio individuando per ogni percorso i punti critici e per ognuno gli
opportuni indicatori mirati alla realtà locale. Non riuscendo almeno in questo momento a
definire indicatori specifici, ma essendo nel contempo certi della necessità e dell’importanza
di usare uno strumento di valutazione si è ipotizzato che potesse essere utile condurre degli
audit specifici per percorso, realizzati con una metodologia simile a quella dell’audit clinico,
che però non escludesse gli aspetti gestionali ed organizzativi. A tal proposito è stato
realizzato uno percorso formativo e si è giunti a definire una modalità di audit, sperimentata
nel percorso “diabete”, tale da permettere un reale monitoraggio del percorso.
La metodologia di conduzione dell’audit è stata definita in un corso di formazione, realizzato
nel mese di febbraio 2004, proprio con l’obiettivo di fornire competenze specifiche per la
conduzione di questa attività. Tale metodologia prevede incontri specifici per ogni episodio
condotti con la tecnica del focus group dal team dei professionisti che intervengono nello
svolgimento delle attività. Scopo di ogni incontro è la verifica:
• dello stato di applicazione del percorso analizzando concretamente dei “casi” mediante
l’esame della documentazione sanitaria (cartelle, referti, schede terapia);
• dell’appropriatezza del percorso;
• dell’adeguatezza dei risultati ottenuti rispetto agli obiettivi di salute prefissati.
Nel corso della sperimentazione si è evidenziato come sia importante che la conduzione del
focus group sia affidata ad un facilitatore e che tale attività sia condotta a fronte di specifica
check-list predefinita al momento della stesura del percorso. Il facilitatore ha il compito di:
• concentrare l’attività del gruppo sul compito;
• consentire una buona comunicazione fra i professionisti incoraggiando o stoppando la
partecipazione a seconda dei casi;
• supportarli con contributi metodologici di problem solving;
• garantire il rispetto delle scadenze e delle modalità progettate per la conduzione dell’audit.
Sono stati calendarizzati due audit per ogni percorso: uno all’inizio della sperimentazione di
attuazione e uno al termine. Concludendo i risultati conseguiti con il progetto si considerano
positivi e si valuta che soddisfino gli obiettivi che ci si era prefissati.
140

Paolo Cavallo Perin Filone tematico A2
Sindrome metabolica: nuovi marcatori di danno endoteliale
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina Interna
CONTESTO E RAZIONALE
La patologia cardiovascolare (CVD) è la principale causa di mortalità e morbilità nei Paesi
industrializzati. Ipertensione arteriosa, dislipidemia, diabete o intolleranza glicidica e obesità
sono fattori di rischio cardiovascolare frequentemente associati. Tale associazione,
denominata sindrome plurimetabolica (SPM) è un importante fattore indipendente di rischio
cardiovascolare. La molecola di adesione ICAM-1, le Heat shock Proteins (HSP) e gli
anticorpi diretti contro le HSP (aHSP) sono stati recentemente proposti come marcatori di
danno endoteliale. Inoltre, la formazione di addotti covalenti tra è 4-idrossi-nonenale (HNE) e
le proteine del siero è considerata espressione di danno ossidativo endoteliale.
OBIETTIVO
Scopo del presente studio era di misurare in soggetti affetti da SPM e non, i livelli circolanti
di ICAM, Hsp60, Hsp70, Hsp27, anti-Hsp60 e anti-HSP70 e la presenza di addotti dell’HNE.
MATERIALI E METODI
Casistica. Un totale di 1373 soggetti non diabetici, afferenti agli ambulatori di Medicina
Generale di Casale Monferrato, sono stati sottoposti a screening per la diagnosi di SPM
(gennaio 2005-febbraio 2006). Sono stati reclutati in modo consecutivo tutti i soggetti affetti
da SPM secondo i criteri NCEP-ATPIII. Nel gruppo di controllo sono stati reclutati soggetti
paragonabili per età e sesso ai casi e che non presentano nessuno dei criteri diagnostici della
SPM. Sono stati esclusi i soggetti con età 70 anni, patologie infiammatorie/infettive,
insufficienza renale o epatica, diabete, ed evidenza clinica di CVD. Sono stati raccolti i dati
anamnesi e fisici (pressione arteriosa, circonferenza addominale, BMI, esame fisico
cardiovascolare).
Dosaggi. Un campione di sangue a digiuno è stato raccolto per la determinazione di glicemia,
trigliceridemia, colesterolo totale e HDL e creatininemia. I livelli serici di sICAM-1, Hsp60,
Hsp70, Hsp27, anti-HSP60 ed anti-Hsp70 sono stati misurati con metodica ELISA. La
presenza di addotti proteine-HNE è stata condotta sul siero di 15 soggetti con SPM e 10 di
controllo mediante immunoblotting e su 5 soggetti con SPM e 5 di controllo mediante
elettroforesi bidimensionale.
Risultati. Su un totale di 1373 soggetti sottoposti a screening 59 soggetti sono stati arruolati
nello studio. Tra i soggetti reclutati l’85% presentava 3 criteri positivi per la SPM e il restante
15% 4 criteri. I soggetti nel gruppo di controllo (C) (n=29) erano paragonabili ai casi (S)
(n=59) per età (S:57,49 ± 0,9; C: 54,69 ± 1,28, media ± ESM) e sesso (S: 39M e 20F; C: 18M
e 11F). Circonferenza addominale, pressione sistolica e diastolica, trigliceridi e glicemia
erano significativamente più elevati nei soggetti con SPM che nei controlli, mentre i livelli di
colesterolo HDL erano maggiori nei controlli. I livelli circolanti di Hsp60 erano misurabili
solo in una minoranza dei soggetti studiati (S:12%, C:17%) e non vi era differenza
141

significativa tra i due gruppi. Analogamente, non si sono riscontrate differenze significative
tra soggetti con SPM e soggetti di controllo nei livelli serici degli anticorpi anti-Hsp60 [S:
29,7 (4,4-348,6) vs C: 28,3 (4,56-305,2); mediana(range)].
I livelli di Hsp70 erano misurabili in tutti i soggetti studiati [S:1,8 (0,0-7,3), C:1,4 (0,00-6,19)
p=ns] e quelli degli anticorpi anti-Hsp70 erano più elevati nei controlli che nei soggetti con
SPM [S: 178,6 (7,5-1132,8), C: 247,8 (91,20-5127,5) p=ns], ma tale differenza non
raggiungeva la significatività statistica. I livelli di sICAM-1 erano significativamente
maggiori nei soggetti con SPM [S: 245,8 (152,7-500); C: 199.9 (91,20-387,1) p=0.010],
mentre i livelli di Hsp27 erano significativamente ridotti nei soggetti con SPM rispetto ai
soggetti di controllo [S: 9,7. (0-132,0); C: 98,2 (0-1357,4) p=0,036], tuttavia l’analisi dei
livelli di Hsp27 è stata eseguita solo in un sottogruppo di 37 soggetti (S:25, C:12).
Nel controllo positivo e nei sieri SPM si sono individuate all’elettroforesi bidimensionale ~15
addotti proteici dell’HNE: 10 spots di ~68 kDa ad elevata intensità e 5 spots di peso
molecolare < 30 kD e di bassa intensità. I sieri di controllo ed il controllo negativo mostrano
invece un minor numero di addotti visibili (5 spots con bassa intensità di ~68 kD e nessuno
spot nell’area inferiore ai 30 kDa). Paragonando le nostre mappe con mappe delle banche
proteiche, si può ipotizzare che IgA e transferrine siano tra le proteine che legano HNE nei
sieri SPM.
CONCLUSIONI
Si sono riscontrare differenze significative tra i due gruppi nei livelli serici di ICAM-1 ed
HSP27. L’ICAM-1, una molecola di adesione espressa dall’endotelio in risposta a citochine
infiammatorie, è stata implicata nella patogenesi dell’aterosclerosi e studi prospettici hanno
dimostrato che i livelli circolanti di ICAM-1 sono un fattore predittivo indipendente di
coronaropatia.
L’associazione tra i livelli circolanti ICAM-1 e la presenza di SPM, dimostrata in questo
studio, suggerisce che l’ICAM-1 possa essere un precoce marcatore di danno/disfunzione
endoteliale. L’Hsp27 è una proteina ad azione citoprottetiva, la cui espressione è ridotta a
livello della placca aterosclerotica. Il riscontro di ridotti livelli circolanti di Hsp27 in soggetti
con SPM, in assenza di patologia cardiovascolare conclamata, suggerisce che l’Hsp27 possa
essere un indice precoce di ridotta protezione endoteliale. Infine, si può ipotizzare che la
quantità elevata di addotti HNE-proteina nel siero di soggetti con SPM possa essere
l’espressione di una produzione elevata di HNE da parte dell’endotelio in condizioni di stress
ossidativo.
SVILUPPI FUTURI
Lo studio verrà completato misurando i livelli di Hsp27 in tutti i soggetti reclutati. Si eseguirà
quindi un’analisi statistica univariata e multivariata al fine di stabilire se esistano associazioni
tra i marcatori studiati e i tradizionali fattori di rischio cardiovascolare e quali siano i maggiori
determinanti nelle variazioni dei livelli di sICAM-1 e Hsp27. Si prevede che ciò richiederà
ancora circa un mese di lavoro. Una volta completato lo studio verrà inviato in forma di
articolo originale alla rivista scientifica Diabetes Care, inoltre un estratto del lavoro svolto
verrà presentato al European Association for the Study of Diabetes in aprile. Lo studio sugli
addotti proteina-HNE verrà ampliato mediante analisi di un numero maggiore di casi e si
procederà all’identificazione delle proteine che legano HNE.
142

Pietro Cazzola Filone tematico B3
Contenimento dell’ingresso di radionuclidi nella catena alimentare:
applicazioni in campo
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta
OBIETTIVO
Le minacce terroristiche di questi ultimi tempi e l'incidente occorso a Chernobyl nel 1986, che
provocò la contaminazione di vaste aree anche lontane dal luogo dell'incidente, evidenziano la
necessità di disporre di piani di emergenza che consentano anche un intervento specifico nel
settore veterinario e tali da prevenire, bloccare o ridurre l'ingresso dei radionuclidi nella
catena alimentare attraverso impedendone l'arrivo all'uomo. Per l’organizzazione dei sistemi
di intervento sanitario per la prevenzione di tale rischio ed in particolare dell’ingresso di
radioisotopi nelle filiere produttive degli alimenti di origine animale, è stato iniziato un
programma di collaborazione con i Veterinari dell'ASL 12, area C, di Biella, Dott.ri Luca Sala
e Carlo Brini, con il Dott. Paolo Manzone, Fisico Sanitario ed E.Q., e con il Fisico Sanitario e
Matematico Dott. Andrea Chiecchio costituendo un gruppo operativo con l'obiettivo della
stesura di una bozza di piano di intervento sanitario specifico nel settore zootecnico per il
territorio di competenza dell'Azienda Sanitaria.
METODI E RISULTATI
In cooperazione col gruppo si è completata la raccolta dei riferimenti bibliografici circa gli
interventi di Protezione Civile e dei Servizi Veterinari come previsto nei Piani di Intervento
già approntati nella nostra Regione e le documentazioni inerenti. Inoltre si è provveduto alla
stesura di una prima bozza di documento che schematizza un programma preventivo di
interventi volti a valutare la reale distribuzione, la tipologia e la consistenza numerica degli
allevamenti presenti nella zona di competenza, le aree agricole correlate per la produzione di
alimenti per gli animali nonché la formazione e l'organizzazione necessaria nei Servizi
Veterinari territoriali. Si è infatti ritenuto prioritario stabilire quali parametri e qual tipo di
informazione debbano essere rilevati preventivamente ed aggiornati regolarmente per
costituire la base informativa immediatamente disponibile in caso di emergenza e che deve
indirizzare le varie fasi della stessa.
Sono state effettuate prove per la messa a punto di metodi per la determinazione della
radioattività in scintillazione liquida su campioni di terra e di latte valutando
comparativamente i risultati con quelli ottenuti in spettrometria gamma, metodo previsto
ufficialmente per rilevare la contaminazione degli alimenti, dimostrando la possibilità di
utilizzare questa tecnica per la valutazione generica del livello di contaminazione lasciando
alla spettrometria l'identificazione dei radionuclidi e la loro quantizzazione.
L'impiego razionale dei metodi dovrà essere previsto in funzione delle caratteristiche
produttive del territorio, per ciò che concerne gli alimenti per animali, nonchè la disponibilità
e distribuzione di attrezzature analitiche dei due tipi.
Con lo sviluppo di tale programma si ritiene di poter prevedere tempi molto ridotti per
l’ottenimento dei primi risultati analitici e funzionali dal momento in cui scatta il piano di
intervento (identificazione delle aree contaminate, valutazione del rischio di ciascuna ed
interventi di sequestro, bonifica o impiego controllato delle materie prime in tempi atti a
garantire un livello di sicurezza accettabile).
143

Per l'applicazione sul territorio dei metodi di intervento già proposti nella precedente ricerca
finalizzato regionale "Controllo dell’ingresso di radionuclidi nello catena alimentare in coso
di contaminazione ambientale" si è proseguito con lo studio dell’influenza del trattamento con
liscivia acida degli strati superficiali del suolo per far scendere in profondità i radionuclidi
sulla fertilità dei terreni; si è potuto dimostrare che tale operazione non cambia
sostanzialmente le caratteristiche di fertilità né riduce la capacità germinativa dei semi di
piante erbacee presenti al momento dell'irrorazione ma si rileva solamente un ritardo nella
nascita delle piantine ed il raggiungimento tardivo della biomassa ottenibile.
Un ulteriore lavoro sperimentale, mirato alla individuazione di un metodo per ridurre la
contaminazione presente nel latte durante le operazioni di caseificazione, è stato allestito e
concluso; la sperimentazione, nata a seguito delle necessità osservate nella gestione dei
prodotti delle aziende agricole bielorusse ed ai problemi sanitari legati ai latticini, ha
permesso di mettere a punto un protocollo in grado di bonificare l'alimento da Cesio 137 e
Stronzio 90 facilmente applicabile in azienda.
144

Luisella Cesari Filone tematico A4
Modello di intervento per promuovere una sana alimentazione e l’attività
fisica in bambini e adolescenti in soprappeso
Asl 5 - Dipartimento di Prevenzione
Servizio Igiene degli Alimenti e Nutrizione
CONTESTO E RAZIONALE
Il preoccupante trend di sovrappeso e di obesità in età pediatrica, riportato dalla letteratura
scientifica nazionale ed internazionale, rende necessari approcci innovativi all’educazione ad
un corretto comportamento alimentare e, più in generale, ad uno stile di vita più salutare.
L’ASL di Brescia - Palazzolo ha attivato un “Corso di addestramento teorico pratico ad una
sana alimentazione per prevenire o trattare le oscillazioni del peso” rivolto agli adulti. Il
presente è un progetto pilota rivolto alla popolazione con eccesso ponderale delle fasce di età
comprese tra i 5 e gli 18 anni, impostato tenendo in considerazione le “prove di efficacia” in
tema di educazione alimentare riportate dalla letteratura scientifica, e cioè:
• per i bambini, interventi di educazione alimentare indirizzati a tutta la famiglia.
• Per gli adolescenti, interventi rivolti ai ragazzi separatamente dai genitori.
• Abbinamento a programmi di esercizio fisico.
• Uso di sistemi visivi tridimensionali (dietetica per volumi), invece della pesatura, per una
migliore memorizzazione delle porzioni e per evitare l’isolamento rispetto alla famiglia.
• Attenzione alla percezione dei gusti
Inoltre il progetto è stato supervisionato da DoRS – Centro Regionale Documentazione per la
Promozione Salute, da un Medico Igienista e da un Sociologo del Dipartimento Sanità
Pubblica Università di Torino alla luce del modello teorico di cambiamento dei
comportamenti di Prochaska e Di Clemente.
METODI
Per controllare l’eccesso ponderale in età evolutiva appaiono prioritarie l’attività fisica e
idonei consumi di ortaggi, frutta (almeno 400 g/die), snack (non più di 3/settimana con
kcal>180 e lipidi>6g). Il percorso educativo - iniziato prima dell’approvazione del progetto -
è durato 6 mesi, e si è svolto in 5 incontri di gruppo a cadenza mensile intervallati da 4
incontri individuali. Hanno partecipato 14 genitori (suddivisi in due gruppi) i cui bambini
erano per il 64% (9) obesi e per il 36% (5) in soprappeso, e 8 ragazzi (1 gruppo), di cui 6
(75%) obesi e 2 in soprappeso, inviati dai Medici e dai Pediatri convenzionati con l’ASL 5,
cui l’iniziativa era stata presentata nel settembre 2004. All’accoglienza sono state effettuate
visita medica ed anamnesi alimentare secondo la tecnica della dietetica per volumi e sono stati
somministrati un questionario predisposto dalla Medicina dello Sport ed uno dal Servizio di
Psicologia dell’Assistenza Sanitaria Territoriale (AST) dell’ASL 5 di Collegno. Tra gli
incontri di gruppo, 3 sono stati gestiti dal Dietologo e dalla Dietista del Servizio Igiene
Alimenti e Nutrizione per l’addestramento alla porzionatura, che ha utilizzato una tecnica
basata sul confronto dei cibi con volumi di oggetti di uso comune (palla da tennis, CD ecc.) o
della mano del soggetto stesso (pugno, palmo, dita ecc.), con prova pratica finale. Sono state
usate strategie di educazione alla percezione del gusto amaro, per favorire il consumo di
ortaggi e frutta, dopo suddivisione dei partecipanti in 3 categorie secondo la percezione del
145

gusto amaro, seguendo le classificazioni di Drewnowski e Bartoshuck: supertaster, medium
taster, non taster, con percezione rispettivamente elevata, intermedia, bassa. In base alla
classificazione, ognuno riceveva consigli personalizzati, e presentava in seguito al gruppo le
strategie attuate per aumentare i consumi di ortaggi e/o frutta. I 4 incontri individuali
valutavano la compliance agli obiettivi personalizzati, assegnati volta per volta in base
all’anamnesi alimentare. Gli ultimi 2 incontri di gruppo, gestiti 1 dagli Psicologi ed 1 dal
Medico dello Sport, stimolavano alla riflessione rispettivamente sulle relazioni tra emozioni e
cibo e sull’importanza dell’attività fisica discrezionale, oltre a quella sportiva.
All’accoglienza, 9 bambini (64%) e 7 (87%) adolescenti svolgeva attività fisica extrascolatica
strutturata; 10 bambini (71%) erano sedentari nel tempo libero, il 29% talvolta facevano
giochi di movimento. Tra gli adolescenti, 4 (50%) preferiva attività sedentarie, 3 (37,5%) le
alternava con il movimento, 1 preferiva attività di movimento.
RISULTATI
Dei 14 genitori e degli 8 ragazzi reclutati, rispettivamente il 50% ed il 75% ha partecipato a
tutti e 3 gli incontri relativi all’alimentazione. Al termine del percorso educativo (6 mesi) si
sono registrati 7 drop out (50%) nel gruppo genitori, nessuno nel gruppo ragazzi. I consumi di
ortaggi e frutta sono risultati insufficienti: ·
• al reclutamento in 7 adolescenti su 8 (87,5%) e 8 bambini su 14 (57%); ·
• a fine percorso in 1 adolescente su 8 (12,5%) e 2 bambini su 7 (28%).
I consumi di snack sono risultati eccessivi: ·
• al reclutamento in 5 adolescenti su 8 (62,5%) e 12 bambini su 14 (86%); ·
• a fine percorso in 3 adolescenti su 8 (37,5%) e 3 bambini su 7 (43%).
Gli adolescenti ed i bambini obesi registravano a 6 mesi dall’accoglienza un calo ponderale
(media+ds) rispettivamente del 6+2% e del 4+5%. Non è stato possibile valutare le eventuali
variazioni di attività fisica.
CONCLUSIONI
La dietetica per volumi, per le sue caratteristiche di semplicità e facile comprensione appare
nella nostra casistica utile alla promozione dei consumi di ortaggi e frutta ed al calo ponderale
nei bambini e soprattutto negli adolescenti. Occorre invece rivalutare le strategie per
promuovere un corretto apporto di snack in entrambe le fasce di età e per ridurre il numero dei
drop out nei genitori dei piccoli. A tal fine sono stati effettuati una revisione dei materiali
educativi presentati ai genitori dei bambini (Educatore DoRS) ed un intervento di counselling
sul personale che ha condotto i gruppi (Sociologo Universitario), in vista della prosecuzione
dell’attività con altri gruppi. DoRS inoltre ha evidenziato la necessità che i materiali utilizzati
venissero raccolti per la ripetizione dell’attività in altre ASL del Piemonte. Il progetto è stato
presentato al Laboratorio di valutazione in Promozione della Salute DoRS il 14 ottobre 2004.
Grazie alla collaborazione dell’AST, al Convegno Nazionale SitI 2004, è stato inoltre
presentato nel giugno 2005 ai Pediatri di Libera Scelta dell’ASL 5, per diffondere la tecnica
fra i Medici del territorio e mettere a punto indicatori che alimentino un flusso informativo
bidirezionale tra ASL e pediatri convenzionati. Il progetto ha sperimentato una nuova
strategia per il controllo dell’eccesso ponderale in età evolutiva con un approccio di ricerca
multidisciplinare, che ha preso in particolare considerazione gli aspetti educativi, grazie
all’apporto di Dors e del Dipartimento Sanità Pubblica Università di Torino. Altra ricaduta
importante è stata la creazione di una rete di collaborazione stabile tra diversi Servizi
dell’ASL 5 di Collegno, nonostante le scarse risorse, e l’alleanza con i Pediatri di Libera
Scelta.
146

Maria Pia Chianale Filone tematico C2
Informatizzazione e lettura dei dati provenienti dai bilanci di salute dei
Pediatri di Libera Scelta.
Asl 5 – Dipartimento territoriale per la Continuità delle Cure
CONTESTO E RAZIONALE
La raccolta informatizzata dei dati statistico-epidemiologici provenienti dai Bilanci di Salute
effettuati dai 45 Pediatri di Libera Scelta dell’ASL 5 ha richiesto un notevole sforzo
gestionale ed organizzativo nel coinvolgere figure professionali e modelli operativi complessi.
Dalla ditta che scansisce per conto dell’Azienda le ricette e le richieste mediche abbiamo
ottenuto un comodato d’uso per l’installazione e la manutenzione di un software di gestione
(comprendente lettura ottica previa traduzione in codice a barre dei Bilanci di Salute e
successiva rielaborazione in pagine Excell compattate in CD ROM) da inviare periodicamente
alla Pediatria di Comunità per l’elaborazione dei dati finali. Questi saranno visibili ai Medici
A.S.T. per ciò che riguarda le loro competenze mentre alla Pediatria di Comunità è permesso
l’accesso generale in qualità di gestore applicativo del sistema col compito di rielaborare i
contenuti e correggere gli eventuali errori formali. La raccolta e l’invio dei Bilanci di Salute
avviene a livello dei 5 Distretti dell’ASL 5 dove fanno ritorno una volta scansiti.
METODI
Pertanto col finanziamento erogato si è proceduto ad identificare i momenti strutturalmente
carenti del progetto richiedendo per il 50% apparecchiature informatiche (allo scopo di servire
come terminali periferici e rielaborazione dei dati pervenuti dalla scansione) con possibilità di
correzione e nuovi inserimenti.
Con il restante 50% si è cercato di non vanificare gli sforzi sopracitati finanziando un corso
dallo stesso titolo del progetto con presentazione dello stesso in forma multimediale ed
interattiva, inviti, locandine, schede plastificate e relative dispense rilegate e stampate a colori
con CD ROM da consegnare ad ogni singolo Pediatra con breve manuale di compilazione. Il
corso svoltosi in data 9 Ottobre 2004 a Collegno sede ASL è stato il momento formativo
(amministrativo, tecnico, scientifico) dove sono stati illustrati i dati scansiti nel semestre
2004.
La formazione aveva come obiettivi generali quelli di:
a) migliorare la qualità della compilazione dei Bilanci di Salute
b) alimentare registro dei cronici
c) costruire statistiche di popolazione che fornissero indicatori sullo stato di salute e sulla
domanda di servizi
d) appropriatezza degli invii al II livello.
RISULTATI
I Pediatri hanno risposto in maniera unanime al corso e si sono impegnati per una
compilazione più accurata e precisa permettendo di: alimentare il registro sopracitato,
costruire statistiche, grafici e torte percentili evocabili in tempo reale dal programma con % di
147

alimentati al seno, % vaccinati, % con disturbi psicomotori e neurologici, % con problemi
ortopedici, oculistici, odontoiatrici, % inviati al II livello in toto. La registrazione
informatizzata dei Bilanci di Salute permette un costante confronto con la letteratura al fine
d’inquadrare la maggiore o minore incidenza di patologie in un range statistico nazionale e ne
determina le deviazioni standard per individuarne le possibili cause: dall’errore diagnostico a
quello di trascrizione, alla maggiore incidenza in senso assoluto. La priorità data alla raccolta
dati “patologie croniche rilevanti” serve per costruire una rete di servizi attivi ed integrati tra
loro (partecipano al corso ed al progetto sia P.L.S. che ospedalieri) a significare che l’agenda
della salute è il testimone della continuità delle cure tra ospedale e territorio.
L’intero progetto è visitabile nell’intranet aziendale tramite accesso con password dai singoli
distretti per quanto riguarda le loro competenze, mentre la gestione generale è affidata alla
Pediatria di Comunità afferente al DTCC ASL 5. Il software permette report di tutti i Bilanci
di Salute per periodo, per fasce d’età, per medico, per distretto e la possibilità di inserire
manualmente nuove schede qualora eseguite in ospedale, in consultorio o dal Pediatra privato
per il verificarsi di una carenza sul territorio. Le patologie croniche sono visibili con le
medesime modalità sopracitate, anche per loro vale la possibilità d’inserimento manuale
qualora provenissero da altre fonti. Il sofware permette altresì (sezione non ancora attivata) la
gestione delle schede dal punto di vista amministrativo – contabile prevedendo il calcolo degli
emolumenti per singolo pediatra e per distretto.
Il progetto prevede alla fine di ogni anno solare l’invio dei dati al Responsabile Settore
Programmazione Sanitaria Assessorato alla Sanità Regione Piemonte ed un libro bianco di
ritorno ai P.L.S. con report dell’attività da loro svolta. Così le varie voci che compongono i
Bilanci di Salute possono diventare spunto importante per futuri corsi di formazione aventi
per obiettivo la conoscenza e l’appropriatezza della compilazione di tutti i primi livelli, e la
costruzione di una rete di collegamento con gli specialisti di II livello e le strutture
ospedaliere.
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Livio Chiandussi Filone tematico C2
Studio sull’utilizzo di markers ormonali nella predizione e
razionalizzazione della risposta ai farmaci antipertensivi.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale
MATERIALI E METODI
Si sono esaminate le cartelle cliniche informatiche di circa 6000 pazienti ipertesi seguiti
presso il Centro per la Cura e la Terapia dell’Ipertensione Arteriosa di Torino dal 1989 al
2003. Ai fini dell’analisi statistica, sono stati inseriti in un programma software dedicato
creato con programma DBASE3 i seguenti dati clinici:
• valori pressori misurati durante le visite ambulatoriali ed al domicilio, in regime di wash
out farmacologico e dopo impostazione di terapia antipertensiva;
• durata dell’ipertensione arteriosa;
• parametri antropometrici (peso, altezza, indice di massa corporea) ed abitudini di vita in
grado di modificare il rischio cardiovascolare (con particolare attenzione al grado di
tabagismo);
• terapia antipertensiva intrapresa (categoria farmacologica, dosaggio) e sue modificazioni
nel tempo;
• dosaggio di attività reninica plasmatica ed aldosterone in clinostatismo ed ortostatismo.
Si sono esaminati i dati clinici relativi ai singoli pazienti, con particolare riguardo ai livelli di
attività reninica plasmatica (PRA) ed aldosterone, ai fini di escludere dalla successiva analisi
statistica i soggetti affetti da iperaldosteronismo primitivo. Si sono selezionati circa 600
pazienti con rapporto aldosterone plasmatico/attività reninica plasmatica >400. Tra questi,
circa 200 sono risultati affetti da iperaldosteronismo primitivo, e sono stati pertanto esclusi
dall’analisi successiva. Sono stati al contrario inclusi nell’analisi i pazienti con ipertensione
arteriosa a bassa renina. I dati relativi agli altri soggetti sono stati analizzati tramite il software
di analisi statistica SAS. Al fine di analizzare le variazioni temporali del compenso pressorio e
dei regimi terapeutici dei soggetti afferenti al Centro tra il 1989 ed il 2003, si sono suddivisi i
pazienti in tre gruppi in base all’epoca di afferenza (1989-93, 1994-98, 1999-2003). Inoltre,
per valutare l’effetto della PRA sulla risposta terapeutica ai diversi regimi terapeutici, si sono
selezionati, tra i 3000 soggetti sottoposti a dosaggi ormonali, coloro in cui la valutazione della
PRA era priva di interferenze farmacologiche (soggetti in wash out o trattati con calcioantagonisti/alfalitici).
Secondo l’ipotesi di Laragh, i pazienti sono stati suddivisi in: soggetti con ipertensione
volume-dipendente (a “bassa renina”, in presenza di una PRA=0.65 ng/mL/h),
valutando nei 2 gruppi di soggetti la risposta pressoria alla monoterapia con farmaci ad azione
prevalente sul sovraccarico di volume (diuretici, calcio-antagonisti, alfa-bloccanti) o sulle
resistenze periferiche e sull’attività reninica (beta-bloccanti, antagonisti recettoriali dell’AT1,
ACE-inibitori, farmaci ad azione centrale).
I pazienti sono stati quindi suddivisi in 2 gruppi:
a) trattati con un farmaco appropriato per il proprio assetto reninico
149

) trattati con una farmaco inadatto all’assetto reninico.
RISULTATI
Dal 1989-93 al 1999-2003 si sono osservati un significativo incremento dell’età (da 50.3
anni±14.1 a 52.6±13.6), della percentuale di soggetti in terapia (da 75.7 a 77.3%) e del
numero di farmaci per soggetto (da 1.35±1.1 a 1.50±1.18), ed una riduzione significativa dei
valori pressori al momento dell’afferenza (PAS da 161.8±24.0 a 155.4±22.9, PAD da
99.7±11.6 a 93.9±11.3) Si è significativamente ridotta la percentuale di pazienti trattati con
ACE-inibitori (da 42.0 a 34.8%), farmaci ad azione centrale (da 6.2 a 4.9%) e
calcioantagonisti (da 30.9 a 24.2%), a vantaggio dei bloccanti recettoriali dell’AT1 (da 0.1 a
15.2), dei beta-bloccanti (da 18.3 a 26.2%) e degli alfa-bloccanti (da 7.8 a 14.7%). Non è
mutato il consumo di diuretici (28.7%) e di vasodilatatori diretti (0.05%). I valori pressori in
wash out non sono risultati significativamente diversi nei pazienti “a bassa renina” ng/mL/h -
che rappresentavano il 41.7% del campione – rispetto ai pazienti “ad alta renina” – che
costituivano circa il 58.3% (154.9/100.7 mmHg vs 152.9/98.9 mmHg). Risultati simili si sono
osservati dopo il trattamento farmacologico (140.7/90.9 mmHg vs 141.7/90.4 mmHg). La
riduzione dei valori pressori sistolici e diastolici è risultata simile nei pazienti trattati con
farmaci in accordo (gruppo A) o in contrasto (gruppo B) con l’assetto reninico (riduzione di
PAS 7.5% nel gruppo A, 7.6% nel gruppo B -p=0.91- riduzione di PAD 8.9% nel gruppo A,
8.0% nel gruppo B -p=0.49). Tuttavia, il raggiungimento del compenso pressorio sistolico in
monoterapia era più frequente nel gruppo A rispetto al gruppo B (43% e 31%
rispettivamente), anche se la differenza non raggiungeva la significatività statistica (p=0.12).
Il target pressorio diastolico veniva raggiunto con una frequenza maggiore mediante una
monoterapia con farmaci ad azione prevalente sull’attività reninica piuttosto che con farmaci
farmaci ad azione prevalente sul sovraccarico di volume, sia nei pazienti a “bassa renina”
(55.3% vs 32.7%, p=0.03) che nei pazienti ad “alta renina” (47.2% vs 25.5%, p=0.02). Un
trend simile si osservava per i valori pressori sistolici.
CONCLUSIONI
In conclusione il dosaggio della PRA non riveste una importanza determinante ai fini della
scelta del trattamento antiipertensivo nel soggetto iperteso essenziale, poiché non sembra
modificare in misura significativa la risposta pressoria alla monoterapia. Lo studio evidenzia
inoltre, dal 1989 al 2003, un miglioramento del compenso pressorio dei soggetti ipertesi al
momento dell’accesso ad un centro specializzato, suggerendo un potenziamento delle
strategie terapeutiche attuate dai Medici di Medicina Generale.
PUBBLICAZIONI
I risultati emersi dalla ricerca hanno rappresentato l’oggetto delle seguenti pubblicazioni:
• Leotta G., Rabbia F., Mulatero P., Naso D., Canadè A., Veglio F. Compenso pressorio e
regimi terapeutici degli utenti di un centro per la cura dell’ipertensione arteriosa tra il
1989 ed il 2003. (Poster presentato al “XXII Congresso Nazionale” della “Società Italiana
dell’Ipertensione Arteriosa”, Torino, 27-30 settembre 2005);
• Leotta G., Rabbia F., Mulatero P., Naso D., Canadè A., Veglio F. Blood Pressure Control
and use of Antihypertensive Agents in the Subjects Referred to a Hypertension Unit
between 1989 and 2003. High Blood Press Cardiovasc Prev 2005;12:115-7. Per la
seguente pubblicazione è in corso il processo di revisione: - Leotta G, Rabbia F, Canadè
A, Papotti G, Mulatero P, Veglio F. Impact of Hypertension Guidelines on hypertension
management by primary care physicians (inviato all’American Journal of Hypertension il
10/2/06).
150

Roberto Chiarle Filone tematico C1
La nuova tecnologia dell’"Interferenza a piccoli RNA" per l'eliminazione
di proteine oncogeniche nei linfomi umani
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Biomediche e Oncologia Umana
Lo scopo principale del nostro progetto è stato quello di eliminare l’espressione della proteina
di fusione oncogenica NPM-ALK attraverso un silenziamento stabile e specifico del gene con
la metodica di “RNA interference” (RNAi).
Gli obiettivi prefissati nel progetto erano tre:
OBIETTIVO 1. selezione degli oligonucleotidi con specifica attività di rna interferenza per
NPM-ALK.
OBIETTIVO 2. conferma degli effetti biologici delle sequenze selezionate.
OBIETTIVO 3. studio in vivo sulla crescita cellulare e sulla diffusione linfomatosa.
OBIETTIVO 1.
Diciannove oligonucleotidi sono stati disegnati come da piano sperimentale. Di questi, sei
sono stati disegnati a cavallo della porzione di fusione tra il gene NPM e quello del ALK. I
rimanenti riconoscono sequenze proprie della regione intracitoplasmatica della chinasi. Tutti
gli oligonucleotidi sono stati clonati nel plasmide pSUPER sotto forma di “small hairpin
RNA” (shRNA). Per studiare quale di queste sequenze potesse inibire o modulare
l’espressione della proteina di NPM-ALK, abbiamo co-trasfettato le cellule 293T con un
plasmide esprimente NPM-ALK, in cui l’espressione della proteina di fusione è controllata
dal promotore del CMV, con il plasmide pSUPER in cui è stato clonato un singolo
oligonucleotide per il gene NPM-ALK or ALK, con un rapporto di 1:4. In tal modo abbiamo
dimostrato che nessuna delle sequenze a cavallo del punto di fusione era in grado di diminuire
in modo significativo (>50%) l’espressione della chimera. In aggiunta siamo stati in grado di
identificare un solo oligonucleotide (1 su 13, chiamato per semplicità ALK-A5) specifico per
la regione citoplasmatica di ALK capace di abbassarne la sua espressione in maniera rilevante
(>80%).
OBIETTIVO 2.
Per studiare gli effetti biologici dovuti alla diminuzione dell’espressione della fusione NPM-
ALK, abbiamo usato una linea di fibroblasti murini (MEF) in cui l’espressione della proteina
di fusione è regolata da un promotore inducibile da tetraciclina in maniera “tet-off”. In
assenza di tetraciclina le cellule esprimono NPM-ALK che trasforma le MEF, rendendole
capaci di crescere in soft agar e in topi immunocompromessi (nu/nu). In MEF positive per
NPM-ALK, ALK-A5 è stato in grado non solo di abbatterne l’espressione proteica ma anche
di bloccarne la trasformazione cellulare e la loro crescita in animali nu/nu. Per studiare gli
effetti di shRNA contro l’ALK in cellule linfoidi umane derivate da malati con ALCL,
abbiamo subclonato la cassetta esprimente shRNA (promotore H1 con ALK-A5) in un vettore
retrovirale (EGFP-pSuperior). In tale modo, siamo riusciti ad infettare più del 40% delle
151

cellule di molte linee umane di ALCL (Karpas 299, TS, DHL) e di alcune linee mancanti del
gene di fusione come controllo (CEM, Jurkatt). L’introduzione di ALK-A5 shRNA via
retrovirus è stata in grado di diminuire significativamente ma non completamente
l’espressione di NPM-ALK. Nonostante ciò, ALK-A5, ma non le sequenze di controllo, può
indurre un blocco della proliferazione (arresto parziale in G0-G1) che porta a uno svantaggio
biologico delle cellule ALCL. Inoltre, in queste condizioni l’espressione di ALK-A5
sensibilizza le cellule ALCL a stress cellulari o a chemioterapici. Infatti queste cellule, in
presenza di percentuali subottimali e decrescenti di FCS o di dosi normalmente non tossiche
di ciclofosfamide, vanno incontro a morte cellulare e/o ad un sostanziale rallentamento della
crescita. Poichè questo potrebbe essere dovuto alla non completa inibizione di NPM-ALK a
causa dei bassi livelli di espressione di ALK-A5 shRNA, abbiamo deciso di utilizzare una
cassetta lentivirale. Come controllo abbiamo usato un oligonucleotide corrispondente ALK-
A5, ma con 4 mutazioni nucleotidiche. Con questo sistema più del 98% delle cellule bersaglio
può essere trasdotto con una espressione della EGFP molto più alta di quella ottenuta con
preparazioni retrovirali. La specificità di ALK-5 è ancora una volta confermata dal fatto che
nessun cambiamento si è verificato in cellule infettate con la sequenza di controllo. In questo
sistema sperimentale con lentivirus le cellule di ALCL esprimenti ALK-A5 shRNA, a
differenza dei controlli, vanno incontro a morte apoptotica e ad arresto del ciclo cellulare non
appena i livelli della proteina NPM-ALK calano in maniera superiore all’80%, cioè in
corrispondenza di 96 ore circa. Tali fenomeni biologici sono accompagnati da alterazioni dei
livelli di espressione di proteine coinvolte in questi processi, come la diminuzione di survivin
e l’attivazione di caspasi per quanto riguarda l’apoptosi e la diminuzione di ciclina A, ciclina
B1, Retinoblastoma fosforilato e PCNA, cui corrispondono l’aumento di p27 e p21 per quanto
riguarda il ciclo cellulare.
OBIETTIVO 3.
Con esperimenti in vivo abbiamo dimostrato che le cellule ALCL trasdotte con ALK-5, ma
non con il controllo ALK-A6, iniettate (dopo 24 ore dalla trasduzione) in topi non sono in
grado di crescere e generare xenotrapianti. Questi esperimenti sono stati ulteriormente
confermati usando il costrutto inducile per l’espressione del shRNA ALK-A5. Infine abbiamo
dimostrato che l’introduzione di preparazioni concentrate di lentivirus ALK-A5 in masse
tumorali di animali trapiantati sono in grado di indurre morte cellulare e inibire la crescita
neoplastica in vivo. I dati ottenuti con il vettore inducile ALK-A5A confermano che
l’ablazione dell’ALK e’ seguita dall’apoptosi. Infatti l’attivazione del shRNA ALK-A5 in
cellule neoplastiche costituenti larghe masse di tumori (>1cm), cresciute in animali
immunocompromessi, porta la morte di queste ultime, e la guarigione degli animali
trapiantati.
PUBBLICAZIONI
1. CHIARLE R; SIMMONS WJ; CAI J; DHALL G; ZAMO A.; KARRAS J.; LEVY D.E.;
INGHIRAMI G. (2005). Stat3 is required for ALK-mediated lymphomagenesis and
provides a viable therapeutic target NATURE MEDICINE vol. 11 pp. 623-629.
2. AMBROGIO C; VOENA C; MANAZZA AD; PIVA R; RIERA L; BARBERIS L;
COSTA C; TARONE G; DEFILIPPI P; HIRSCH E; ERBA EB; MOHAMMED S;
JENSEN ON; PALESTRO G; INGHIRAMI G.; CHIARLE R. (2005). p130Cas mediates
the transforming properties of the anaplastic lymphoma kinase BLOOD vol. 106 pp.
3907-3916
3. PIVA R; CHIARLE R; MANAZZA A; TAULLI R; SIMMONS W; AMBROGIO C;
D'ESCAMARD V; PELLEGRINO E; PONZETTO C; PALESTRO G; INGHIRAMI G.
(2006). Ablation of oncogenic ALK is a viable therapeutic approach for anaplastic large
cell lymphomas. BLOOD vol 107:689-97.
152

Elena Chiarpotto Filone tematico B3
Effetto della restrizione calorica sul processo di fibrosi durante
l’invecchiamento e in patologie ad esso associate
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche
CONTESTO E RAZIONALE
A partire dalle ricerche di McCay e coll. (1935), numerosi studi hanno dimostrato che la
restrizione calorica (RC), è in grado di fornire un’adeguata nutrizione, e mantiene molti
processi fisiologici a livello giovanile anche in età molto avanzata, ritarda e rallenta la
progressione di una serie di malattie età-associate, incluse diabete, malattie cardiovascolari e
neoplasie, ed estende la durata massima di vita nei roditori di laboratorio. L’effetto antiinvecchiamento
è stato osservato in diversi organismi, dagli invertebrati ai mammiferi, ma
studi di osservazione suggeriscono che la RC abbia effetti benefici anche sulla longevità
umana. Tuttavia, i meccanismi anti-invecchiamento della RC non sono ancora ben chiari. Un
meccanismo potrebbe essere la protezione contro lo stress ossidativo ed il conseguente danno
cellulare. In parallelo, in diversi organi è stata dimostrata una correlazione tra danno
ossidativo e fibrosi. Nella fibrosi, i fibroblasti o cellule fibroblasto-simili sono attivate a
proliferare e produrre elevati livelli di matrice extracellulare e collagene grazie all’azione di
varie citochine, tra cui la più importante è il transforming growth factor beta1 (TGFbeta1).
Alti livelli di TGFbeta1 sono stati riscontrati in patologie umane di organi differenti
caratterizzate da marcata fibrosi. E’ importante sottolineare che la fibrosi può essere
considerata come un indice significativo di invecchiamento tessutale.
OBIETTIVO
Dal momento che la RC si è dimostrata efficace contro il danno ossidativo età-correlato e
quest’ultimo potrebbe essere responsabile della fibrosi tessutale attraverso la stimolazione
delle citochine fibrogeniche, abbiamo studiato se la RC possa prevenire la fibrosi inibendo le
vie di segnale indotte dallo stress ossidativo ed il conseguente stimolo fibrogenico.
MATERIALI E METODI
Si sono utilizzati ratti Sprague Dawley di diverse età (giovani: 3-6 mesi; adulti: 12-13 mesi;
vecchi: 22-24 mesi). La RC è stata ottenuta mediante alimentazione a giorni alterni (EOD:
Every Other Day) o con una dieta ristretta del 40% (40% RC). L’aorta è stata presa come
tessuto di riferimento a causa dell’importanza delle alterazioni fibrosclerotiche di
quest’organo nell’ambito dell’insorgenza delle malattie cardiovascolari. Pur non essendo il
ratto un modello sperimentale particolarmente adatto allo studio del processo aterosclerotico,
in quanto non sviluppa l’ateroma, la lesione caratteristica dell’aterosclerosi nell’uomo, si è
comunque ritenuto che tale modello sperimentale fosse valido almeno per la parte relativa al
processo di fibro-sclerosi, assimilabile all’uomo in quanto vede coinvolti molecole e
meccanismi simili.
153

RISULTATI
Anzitutto abbiamo riscontrato un aumento significativo del danno ossidativo, in termini di
addotti fluorescenti tra aldeidi derivate dalla perossidazione lipidica e proteine tessutali
(addotti HNE-proteine: aumento del 23%; addotti MDA-proteine: aumento del 36%), e della
fibrosi, in termini di contenuto di TGFbeta1 (23 volte più elevato nelle aorte dei ratti di 24
mesi rispetto a quelli di 6 mesi) e collagene (x 1,7 a 24 mesi) nelle aorte dei ratti anziani
rispetto a quelle dei ratti giovani. La fibrosi età-correlata è associata a modificazioni della
composizione cellulare della parete arteriosa, con una diminuzione dello spessore ed
un’alterazione generale dello strato endoteliale, una diminuzione ed una distribuzione non
uniforme dell’a-actina, ed un aumento delle cellule tipo miofibroblastiche vimentina-positive
nei tessuti degli anziani. Tutti questi fenomeni sono protetti dalla RC comunque ottenuta
(EOD: Every Other Day cioè alimentazione a giorni alterni; o 40% RC: dieta ristretta del
40%).
Per chiarire il/i possibile/i meccanismo/i responsabili dell’effetto antifibrotico della RC,
abbiamo quindi studiato l’effetto della RC sulla via di segnale protein chinasi attivate da
mitogeno (MAPK), implicata sia nell’espressione sia nelle trasduzione del segnale
intracellulare del TGFbeta1. La chinasi Jun-N-terminale (JNK) e p38 mostrano un
progressivo aumento di attività con l’età, ed ancora una volta la RC, comunque ottenuta,
protegge da questo aumento età-correlato. Al contrario, le chinasi regolate da segnale
extracellulare, ERK1 ed ERK2, non hanno mostrato alcuna modulazione da parte
dell’invecchiamento e della RC. L’attività di legame al DNA di AP-1, e cioè del principale
fattore di trascrizione redox-sensibile implicato nell’espressione di TGF beta1, aumenta con
l’età (1,8 volte a 24 mesi) ed è ridotta dalla RC.
Anche l’espressione della vimentina, un altro gene la cui trascrizione dipende da AP-1,
aumenta con l’età e la RC protegge completamente questo effetto. Questi dati avvalorano
ulteriormente l’ipotesi che un aumento dei processi ossidativi abbia un ruolo nell’abnorme
deposizione di tessuto fibrotico in corso di diverse patologie umane caratterizzate da
evoluzione in sclerosi e nell’invecchiamento. L’ipotesi da noi formulata è che la protezione
esercitata dalla RC contro la fibrosclerosi possa essere dovuta alla diminuzione dello stress
ossidativo, con conseguente calo di attività delle MAPK ed ipo-regolazione dell’espressione e
del segnale del TGFbeta1. La iporegolazione da parte della RC delle vie di segnale e della
fibrosi dipendenti dallo stress ossidativo potrebbe essere presa in considerazione nel
trattamento delle patologie età-associate ad evoluzione sclerotica, aprendo nuovi orizzonti
terapeutici in questo ambito.
154

Laura Chiavacci Filone tematico D2
La sorveglianza della Brucellosi bovina in Piemonte: elaborazione di uno
strumento di analisi decisionale
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta
Osservatorio Epidemiologico
OBIETTIVO
In Piemonte la brucellosi bovina, patologia causa di ingenti danni economici agli allevamenti
e pericolosa zoonosi che può essere contratta a seguito di ingestione di alimenti contaminati o
per contatto diretto con animali infetti, si può considerare eradicata nella maggior parte del
territorio regionale, ma persiste il rischio di insorgenza di focolai in particolare in alcune aree.
Nell’attuale situazione epidemiologica i test sierologici ufficiali segnalano talvolta come
positivi dei capi che risultano poi essere dei falsi positivi. Per fornire uno strumento di aiuto e
sopporto a chi deve prendere delle decisioni in caso di insorgenza di positività sierologiche
per brucellosi è stato proposto il presente progetto che aveva per obiettivo di mettere a punto
un albero decisionale che, a fronte di positività, indicasse quale scelta fosse più opportuno
prendere, sulla base di informazioni disponibili e di dati oggettivi.
MATERIALI E METODI
Per costruire un albero decisionale è necessario analizzare tutti gli elementi che concorrono al
processo decisionale. In particolare è stato necessario prendere in considerazione:
• le misure previste dalle normative in vigore.
• Le caratteristiche dei test impiegati (sensibilità e specificità).
• La situazione epidemiologica regionale (prevalenza) per aree geografiche della infezione e
delle reattività aspecifiche; a tal fine sono stati utilizzati i dati storici degli ultimi 10 anni
archiviati presso l’Osservatorio Epidemiologico (mappa di rischio).
• I fattori di rischio di malattia a livello regionale: sono stati studiati attraverso uno studio
caso-controllo che ha confrontato 41 schede epidemiologiche compilate dai veterinari
ASR per i focolai di brucellosi confermati con l’esame batteriologico negli anni 2001-
2003 con le schede di 390 allevamenti ufficialmente indenni per brucellosi estratti
casualmente tra quelli presenti in regione. Sono stati valutati come potenziali fattori,
utilizzando la PROC LOGISTIC del software SAS, la localizzazione geografica, la
tipologia di allevamento, la consistenza, la razza allevata, la movimentazione dei capi, il
pascolo, l’alpeggio, il tipo di stabulazione, di fecondazione e di rimonta, la compresenza
di altre specie animali.
• L’intervista con un esperto di riferimento che ha seguito lo sviluppo della situazione
epidemiologica regionale dal 1992 ha consentito di ‘ordinare’ e dare un peso ai fattori che
si devono considerare quando si classifica un focolaio come tale; sono stati individuati, in
ordine decrescente: esito dell’esame colturale e riprova degli esami sierologici, titolo
anticorpale e numero di capi positivi, area geografica sede dell’allevamento, scambi
commerciali e movimentazioni, vicinanza ad altri focolai.
155

RISULTATI
Mappa di rischio. La mappa del rischio è stata effettuata a livello di ASR. Questa unità
territoriale è stata scelta perché da un punto di vista epidemiologico rappresenta un’area
abbastanza omogenea rispetto alla morfologia del territorio e per la gestione degli
allevamenti. Sono state individuate tre classi di rischio diverse:
1. a basso-rischio: il rischio è rappresentato essenzialmente dall’introduzione di capi infetti
provenienti da altre aree. Il rischio di introdurre un capo infetto non individuato dagli
esami sierologici in zone con bassi scambi commerciali è pari a 1/100.000. Le ASR 11 12
13 14 20 21 22 rientrano in questa classe.
2. a basso-medio rischio: sono aree a forte commercializzazione e scambi. In queste aree il
rischio di introdurre capi non individuati come infetti dalle prove ufficiali è 1/10.000. Le
ASR 4 5 6 7 8 9 10 18 19 rientrano in queste area.
3. a medio-alto rischio: sono aree in cui si sono avuti ancora di recente dei focolai di
brucellosi. In queste aree il rischio è legato oltre alla possibile introduzione di capi anche
al valore predittivo dei test (1/1000). Appartengono a questa classe le ASR 15 16 17/1
17/2.
Fattori di rischio: nel modello di regressione logistica sono stati confrontati 4 modelli; il
modello migliore considera 5 fattori (pascolo, introduzione capi, tipologia produttiva,
presenza di aborti e rimonta esterna) (Wald significativo p

Adriano Chiò Filone tematico C2
Gruppo multidisciplinare per la SLA: valutazione dell'efficacia
dell'organizzazione di un modello di cure palliative
Università degli Studi di Torino - A.O. S. Giovanni Battista
Dipartimento di Neuroscienze - II Divisione di Neurologia
CONTESTO E RAZIONALE
Lo studio si colloca nel quadro di un progetto finalizzato allo studio di un modello alternativo
di cure palliative per pazienti con sclerosi laterale amiotrofica (SLA). I concetti fondamentali
che ruotano attorno al moderno movimento riferito alle cure palliative si evidenziano
attraverso una serie di principi, nozioni e caratteristiche assistenziali che sono ormai ben note
alla comunità scientifica internazionale. Principalmente il programma di cure palliative ruota
attorno a tre concetti fondamentali:
1. l’idea della multidimensionalità dell’intervento allo scopo di fornire ogni tipo di risposta
ai diversi bisogni del malato e della sua famiglia;
2. l’impostazione dell’organizzazione del lavoro finalizzata all’efficacia dell’intervento;
3. la costituzione di una équipe multidisciplinare composta da figure professionali e
appartenenti alle diverse discipline mediche, paramediche, psicologiche, assistenziali e
sociali.
La traduzione in pratica di questi concetti si è realizzata a partire dal 1996 presso il
Dipartimento di Neuroscienze della UOADU Neurologia 2 dell’Azienda dell’Ospedaliera S.
Giovanni Battista di Torino che comprende un gruppo multidisciplinare per la Sclerosi
Laterale Amiotrofica. Tramite una serie di sotto-programmi integrati l’equipe ha sviluppato
una serie di piani terapeutici orientati verso il miglioramento della qualità della vita del
paziente e della famiglia. L’insieme di tali programmi prevede procedure, prassi, tecniche,
protocolli e un’organizzazione del lavoro che necessitano di strumenti di valutazione interna
ed esterna dei processi riferiti alla cura e all’assistenza, verificati soprattutto in funzione di
qualità della vita e attivati nei confronti del malato, dei familiari e del personale impegnato
nella cura.
OBIETTIVO
Lo studio si configura come ricerca di valutazione dei molteplici fattori che influiscono sulla
qualità della vita del paziente SLA. Tra le differenti modalità di valutazione standardizzata,
nell’ambito delle cure palliative del malato affetto da una malattia inguaribile, lo STAS
(Support Team Assessment Schedale) ha mostrato di avere un utile campo di impiego. Lo
STAS è stato utilizzato nella ricerca come strumento multidimensionale per valutare i diversi
sotto-programmi erogati dalla nostra struttura quali: ·
• il programma di cura e assistenza;
• il programma di comunicazione e informazione,
• il programma di sostegno psicologico e accompagnamento;
• il programma di prevenzione e preparazione;
157

• il programma di sostegno al lutto.
METODI E RISULTATI
La diversità del contesto di applicazione dello STAS ha evidenziato la necessità di apportare
allo strumento delle modifiche. A tal fine, presso la nostra struttura, abbiamo adottato una
forma modificata dello strumento (secondo le indicazioni degli autori) in cui i cambiamenti
apportati alla versione originale sono si sono basati soprattutto sulla necessità di adattare lo
STAS alla particolare realtà del paziente sla. Ogni item viene misurato con una scala Likert a
5 punti (da 0 a 4) in cui ai punteggi più alti corrispondono bisogni più elevati e a quelli più
bassi bisogni limitati. Il punteggio scelto dall’équipe attraverso la discussione di gruppo non
corrisponde alla media dei punteggi, ma ad un risultato condiviso dello staff. I dati sono
completi e sono monitorati nel corso del processo terapeutico, permettendo un rapido
feedback del lavoro svolto.
Sono stati seguiti sperimentalmente, da ottobre ’04 a ottobre ’05, un totale di 30 pazienti con
diagnosi SLA clinicamente definita superiore a sei mesi e di questi 4 sono deceduti. Nel corso
della ricerca abbiamo avuto modo di constatare, che la comunicazione tra
équipe/paziente/familia migliora durante il decorso della malattia. Tale dato riflette quanto è
stato osservato sull’accresciuta consapevolezza del paziente in correlazione significativa con
l’evolvere delle relazioni tra famiglia/paziente/équipe e sembra essere espressione di un
dialogo aperto tra operatori sanitari e sistema familiare. Ci è sembrato importante che tale
aspetto trovasse uno spazio di valutazione prioritario in quanto gli obiettivi di qualità che il
nostro centro cerca di conseguire, oltre alla cura, sono l’informazione e la relazione che si
instaurano con il paziente e con i famigliari.
L’evolvere delle dinamiche relazionali è stato osservato attraverso la valutazione degli item
“Consapevolezza del paziente, Consapevolezza della famiglia, Comunicazione paziente e
famiglia, Comunicazione professionisti e paziente e Comunicazione professionisti e famiglia,
Capacità di previsione e comunicazione con l’équipe”. Similmente, i ridotti livelli di
ansia/stato emotivo/depressione del paziente e del familiare con l’aumentare della
consapevolezza sono da mettere in relazione con la programmazione degli interventi:
informazione/comunicazione elaborazione e sostegno psicologico, cure e ausili da utilizzare
durante il decorso della malattia e assistenza e sostegno domiciliare nello stato avanzato. Nel
primo stato della malattia (punteggio 3-4 di incertezza sulla malattia, aspettative non
realistiche corrisponde a un punteggio 3-4 di ansia e stati emotivi per tutto il nucleo familiare)
si assiste ad un progressivo decremento del punteggio dell’ansia, espressione di una
accresciuta consapevolezza che induce il paziente e la sua famiglia ad un atteggiamento
programmatorio a un’aumentata capacità di previsione degli eventi (il punteggio si riduce
significativamente negli stati più avanzati della malattia p.

Giovannino Ciccone Filone tematico D1
Determinanti individuali, sociali e ambientali di ospedalizzazione nella
coorte dei bambini e dei genitori SIDRIA
A.S.O. S. Giovanni Battista di Torino- Servizio di Epidemiologia
CPO, Centro di Riferimento per la Prevenzione oncologica in Piemonte
CONTESTO E RAZIONALE
Il progetto SIDRIA (Studi Italiani sui Disturbi Respiratori nell’Infanzia e l’Ambiente), studio
trasversale di popolazione, si è svolto in 2 fasi. La prima è stata condotta nel 1994-95 in 10
centri italiani, eterogenei per latitudine e livello di urbanizzazione. La seconda fase (2002) ha
coinvolto 13 centri (di cui 8 già partecipanti alla prima fase) ed ha incluso circa 15.000
bambini di età 6-7 anni e circa 10.000 di età 13-14 anni. Il centro di Torino ha partecipato ad
entrambe le fasi dello studio, includendo oltre 2000 bambini (6-7 anni) e oltre 1100 ragazzi
(13-14 anni) in ciascuna delle due fasi. SIDRIA ha consentito di stimare la prevalenza di
patologie respiratorie e allergiche infantili, e di raccogliere per un cospicuo campione di
bambini/ragazzi numerose informazioni su fattori di rischio individuali, sociali e ambientali.
La grande quantità di dati raccolti e la numerosità dei soggetti coinvolti nello studio SIDRIA
rappresentano un patrimonio informativo con notevoli potenzialità di utilizzo in una
prospettiva di studio di coorte, il cui follow-up può essere condotto in modo efficiente
attraverso procedure di record-linkage con archivi sanitari informatizzati.
OBIETTIVO
Obiettivo principale dello studio è stata la ricostruzione delle coorti dei bambini/ragazzi e dei
rispettivi genitori inclusi nelle due fasi dello studio SIDRIA (1994 e 2002) nella città di
Torino attraverso procedure di record-linkage con basi di dati facenti parte dello studio Studio
Longitudinale Torinese (SLT); quest’ultimo raccoglie dati sui residenti nel comune di Torino
dal 1971. I soggetti arruolati sono contenuti in un’anagrafe storica composta di più di 2
milioni di soggetti. Gli individui descritti tramite l’Anagrafe comunale e i Censimenti ISTAT
sono seguiti, tramite codice identificativi univoci nei vari esiti rilevati dalle banche dati
presenti in SLT, tra cui le cause di morte (dal 1981) e le schede di dimissione ospedaliera (dal
1995). Gli sviluppi successivi dello studio, in relazione alle risorse rese disponibili,
prevedevano il completamento del follow up dei soggetti attraverso ulteriori archivi sanitari
(es. prescrizioni farmaceutiche) e l’effettuazione di analisi sui possibili determinanti
individuali, sociali e ambientali del rischio di ospedalizzazione nella coorte dei genitori
inclusi nello studio SIDRIA torinese.
METODI E RISULTATI
Le operazioni di linkage automatico sono avvenute in prima istanza costruendo, per ogni
bambino/ragazzo incluso nello studio, il codice fiscale (CF) presente nell’Anagrafe: la
strategia individuata per raggiungere il massimo livello di collegamento, con una verifica e
una ricerca attiva, è costituita da una parte automatica e una manuale di ricerca attiva sui
singoli record. Il risultato dell’operazione di linkage automatico ottenuto utilizzando l’intero
codice fiscale e, per i non linkati, il CF costruito escludendo l’informazione del comune di
nascita, è risultato pari a quasi il 90%. I record non linkati sono stati sottoposti parallelamente
159

ad un ulteriore numero di passi automatici e ad una ricerca attiva tramite l’anagrafe del
Comune di Torino. Un numero molto esiguo di soggetti (1-2%) è stato rintracciato solo grazie
alla ricerca manuale. Il risultato finale delle procedure di linkage adottate è risultato
globalmente pari ad oltre il 95%.
Una volta costruite le due coorti dei bambini/ragazzi (relative al campione del 1994 e del
2002), sono state quindi ricostruite le rispettive coorti dei genitori dei soggetti campionati. In
totale, la coorte costituita nel 1994 a Torino risulta composta da 3370 bambini e ragazzi e da
6418 genitori con informazioni anagrafiche complete. Nel 2002 la coorte è costituita da 3359
bambini e adolescenti e da 6141 genitori. Ad ognuna delle coorti identificate sono state infine
linkate tutte le informazioni disponibili derivanti dal questionario autocompilato SIDRIA e
dall’archivio delle dimissioni ospedaliere (dal 1/1/1996 al 31/12/2004), e per la coorte di
bambini/ragazzi del 2002 le informazioni derivate dall’archivio delle prescrizioni
farmaceutiche relative al 2001. Le analisi statistiche condotte finora riguardano la coorte dei
genitori dei bambini e ragazzi partecipanti a SIDRIA nel 1994, in modo da disporre di un
periodo di follow-up relativamente lungo (nove anni). Attraverso l’utilizzo di diversi modelli
di Cox è stato possibile stimare i rischi di ospedalizzazione (RR e intervalli di confidenza al
95%, CI95%) in funzione delle condizioni di salute preesistenti (asma, rinite, bronchite), della
abitudine al fumo, dell’occupazione, del livello di istruzione, di esposizioni ambientali.
Infine, mediante l’utilizzo della banca dati farmaceutica del 2001, è stata condotta una analisi
descrittiva del consumo di farmaci antiasmatici e antibiotici relativamente alla coorte di
bambini a adolescenti del 2002, volta ad una prima valutazione del livello di appropriatezza
del trattamento farmacologico dell’asma. Per la coorte di genitori del 1994, nell’arco di 9 anni
di follow up (1996-2004) la stima del rischio di ricovero (almeno 1 ricovero per tutte le cause
esclusi i parti) è risultata aumentata significativamente nelle femmine (RR=1.12 CI95% 1.03-
1.21), all’aumentare dell’età (RR=1.11 CI95% 1.02-1.21 e RR=1.64 CI95% 1.43-1.89,
rispettivamente per le classi di età 40-49 anni e 50 anni e più), nei fumatori (RR=1.11 CI95%
1.01-1.22), e in presenza di preesistenti patologie respiratorie (asma: RR=1.16 CI95% 0.95-
1.42; bronchite: RR=1.17 CI95% 0.99-1.39). Il rischio di ricovero è maggiore tra i soggetti
non occupati (RR=1.43 CI95% 1.15-1.79) e nelle categorie occupazionali più basse (es.
operai, RR=1.24 CI95% 1.03-1.49) rispetto alla categoria dirigenziale di riferimento. Nella
coorte dei bambini/ragazzi del 2002 sono infine disponibili i primi risultati sul consumo dei
farmaci: su 3178 bambini e ragazzi, il 57.2% hanno ricevuto almeno una prescrizione, e il
47,4% almeno una prescrizione di un farmaco antiasmatico (beta-agonisti, antileucotrienici,
anticolinergici, corticosteroidi, antistaminici, cromoglicati, derivati xantinici) o antibiotico. Il
consumo di farmaci è risultato sempre superiore tra i bambini rispetto agli adolescenti, sia in
generale (61.8% vs 47.3%) che per i farmaci più strettamente correlati alle patologie
respiratorie (51.4% vs 38.8%).
Lo studio ha fornito utili indicazioni per la prevista estensione del progetto su scala nazionale
nei centri già partecipanti a SIDRIA ove sono disponibili archivi sanitari informatizzati di
buona qualità. I primi risultati dello studio sono oggetto di una Tesi per il Master
Universitario di II livello in Epidemiologia dell’Università di Torino. I risultati saranno
oggetto di pubblicazione su riviste scientifiche.
160

Tiziana Civera Filone tematico B1
Caratterizzazione mediante PFGE di ceppi di Listeria monocytogenes
isolati da alimenti e mappatura regionale.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Patologia Animale
MATERIALI E METODI
Nel corso del 2003 sono stati esaminati 90 ceppi di Listeria monocytogenes isolati, presso il
Laboratorio Controllo Alimenti dell’IZS del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta, da campioni
di carni e derivati (n=60), formaggi freschi e latticini (n=14), preparazioni gastronomiche
(n=4), paste farcite (n=2), prodotti della pesca (n=3), tamponi ambientali (n=6) e 1 alimento
non identificato. Tutti i campioni sono stati sottoposti ad analisi microbiologiche effettuate
utilizzando il metodo normato AFNOR V08-055/1997.
I ceppi di L. monocytogenes, previa estrazione del DNA mediante bollitura, sono stati
sottoposti a PCR di conferma, utilizzando primers in grado di amplificare un frammento del
gene prfA, seguendo il protocollo descritto nel Listeria Phase III Ring Trial (www.pcr.dk). Gli
ampliconi sono stati risolti in elettroforesi su gel d’agarosio al 2.5%. I ceppi sono stati quindi
caratterizzati mediante sierotipizzazione ed elettroforesi in campo pulsato (PFGE) seguendo il
protocollo proposto da PulseNet. Il DNA genomico è stato digerito con gli enzimi di
restrizione ApaI ed AscI e successivamente sottoposto ad elettroforesi. Le immagini dei
profili ottenuti sono state analizzate con il software BioNumerics (Applied Maths) e
normalizzate in base alle corse di almeno 3-5 standard per gel. I valori di similarità vengono
calcolati tramite il metodo UPGMA con medie matematiche e coefficiente Dice dal software
Bionumerics (1% optimization e 1,2% position tolerance per AscI, 1,4% position tolerance
per ApaI). Per la sierotipizzazione si sono utilizzati Listeria Antisera "SEIKEN" (Denka
Seiken, Tokyo, Japan) secondo il protocollo fornito dalla ditta produttrice.
RISULTATI
I primers hanno generato un frammento specifico di lunghezza pari a 274 bp in tutti i
campioni. I risultati della PFGE hanno permesso di suddividere, in base ai profili di
restrizione ottenuti, i 90 ceppi analizzati in 44 pattern di restrizione per ApaI e in 30 pattern di
restrizione per AscI. Analizzando i profili di restrizione, è stato possibile raggrupparli,
scegliendo come valore minimo di similarità l’80%, in 10 cluster per ApaI e 8 cluster per
AscI. All’interno di uno stesso cluster è stato isolato un numero variabile di ceppi.. Il cluster
più rappresentato comprende 34 ceppi prevalentemente isolati da carne, 2 ceppi isolati da
formaggi e 2 da tamponi ambientali.
Per quanto riguarda l’origine, 15 ceppi provenivano da campioni dell’ASL 18 Alba-Bra e 10
ceppi dall’ASL 3 Torino, questi ultimi isolati da uno stesso prodotto a base di carne
proveniente da altra regione. Un altro cluster ampiamente rappresentato comprende 18
campioni provenienti da matrici e territori estremamente diversificati. In alcuni campioni sono
stati evidenziati più pulsotipi, in particolare in alcuni formaggi (da 2 a 3) e in un wurstel ad
uso industriale (n=9). Si tratta per lo più di campioni massivamente inquinati, come
evidenziato dall’analisi microbiologica quantitativa (MPN). La sierotipizzazione ha permesso
di individuare una prevalenza di isolati appartenenti a sierotipi 1/2c (circa 48%), 1/2a (circa
29%). E’ stato possibile dividere gli isolati in 8 O:H sierotipi: 1/2a (10 carni, 8 formaggi e
161

latticini, 3 pesce, 2 pasta alimentare, 2 preparazioni gastronomiche, 1 tampone ambientale);
1/2b (4 carni, 2 preparazioni gastronomiche, 1 alimento non identificato); 1/2c (37 carni, 4
tamponi ambientali, 2 formaggi e latticini); 3a (1 carne); 3b (1 carne); 3c (1 formaggi e
latticini, 1 carne); 4a (1 carne); 4b/4e (3 carni, 3 formaggi e latticini, 1 tampone ambientale);
4c (2 carni). I ceppi di L. monocytogenes isolati da carne sono per il 61% sierotipo 1/2c, 16%
sierotipo 1/2a e 7% sierotipo 1/2b. Si è osservata inoltre la presenza del sierotipo 4b/4e nel
5% dei campioni e la presenza di un ceppo di sierotipo 3a, 3b, 3c e 4a. Per quanto riguarda i
formaggi si è osservata la presenza del sierotipo 1/2a e 4b/4e rispettivamente nel 58% e nel
21% dei campioni.
I risultati della sierotipizzazione sono simili a quelli riportati in letteratura per le matrici
alimentari, con oltre l’84% degli isolati appartenenti al sierogruppo 1/2. Il sierogruppo più
rappresentato è 1/2c, isolato principalmente in carni fresche e trasformate e negli ambienti di
lavorazione. La combinazione dei risultati delle analisi sierologiche e dei profili di restrizione
permettono di dividere i ceppi isolati in 2 principali gruppi. All’interno del gruppo più grande
ricadono i ceppi aventi antigeni flagellari non ABC (sierotipo 1/2a, 1/2c, 3c). Il secondo
gruppo, al quale appartengono i ceppi aventi antigeni flagellari ABC (1/2b, 3b, 4a, 4b/4e, 4c),
contiene ceppi che risultano più distanti da un punto di vista filogenetico. Tale distribuzione è
molto simile a quella già osservata da altri autori. Le tecniche utilizzate hanno dimostrato una
buona riproducibilità in quanto i profili dei ceppi isolati nel corso dell’analisi di prima istanza,
corrispondono a quelli provenienti dall’analisi di seconda istanza. Alcuni profili sembrano
presentarsi con maggior frequenza, indipendentemente dalla matrice e dalla zona di
provenienza. Tale rilievo può essere correlato a particolari caratteristiche di questi ceppi, quali
un’estrema capacità di aderire alle superfici e resistere ai disinfettanti, già individuate da altri
autori. Per la maggior parte dei ceppi non si è evidenziata una correlazione con il territorio di
provenienza, anche se alcuni ceppi sono stati ritrovati più volte nell’ambito dello stesso
territorio, in particolare per quanto riguarda l’ASL di Bra-Alba. Infatti molti ceppi
provengono da un solo impianto di macellazione e da stabilimenti di trasformazione limitrofi,
facendo presupporre che la carne fresca sia all’origine della presenza diffusa di pochi ceppi
strettamente correlati su questo territorio.
PUBBLICAZIONI
1. Caratterizzazione di Listeria monocytogenes: confronto fra due metodiche biomolecolari-
Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP) e Pulsed Field Gel Electrophoresis
(PFGE). Civera T., Bottero M.T., Lomonaco S., Grassi M.A., Decastelli L. 1 Forum
interlaboratorio sulla Listeria Monocytogenes, Roma 11-12 ottobre 2004, pag.56-57. ·
2. Tipizzazione di ceppi di Listeria monocytogenes isolati da alimenti ed industrie alimentari
mediante PFGE - Lomonaco S., Civera T., Gallina S., Decastelli L. Atti VII Congresso
Nazionale S.I.DI.L.V., Torino, 26-28 ottobre 1005, pag.6-7
162

Donato Colangelo Filone tematico A2
Telomerasi e virus e come marcatori prognostici e diagnostici delle
neoplasie polmonari umane
Università “A. Avogadro” del Piemonte Orientale
Dipartimento di Scienze Mediche
CONTESTO E RAZIONALE
Il carcinoma del polmone è la prima causa di morte per cancro nei paesi industrializzati. Per i
pazienti in stadio III e IV i fattori prognostici indicativi sono l’istotipo, il performance status,
la presenza di metastasi e la loro localizzazione. Particolarmente importante, soprattutto per lo
stadio avanzato IV, risulta la possibilità di effettuare diagnosi precoce e definire parametri e
metodiche analitiche per ottenere un quadro prognostico affidabile, necessario per stabilire il
regime terapeutico appropriato e la sua opportunità. La ricerca di tecniche d’indagine poco
invasive, specifiche e sensibili, e l’ottimizzazione del rapporto costo-beneficio, sono i
principali criteri da rispettare nello sviluppo di nuove metodiche diagnostiche.
OBIETTIVO
Ci è sembrato quindi interessante verificare, nel Laboratorio di Farmacologia dell’Università
degli Studi del Piemonte Orientale, l’efficacia prognostica della misura dell’attività
telomerasica, enzima coinvolto nello sviluppo tumorale, in campioni di lavaggi
broncoalveolari (BAL) di pazienti con sospetta neoplasia polmonare, effettuati dal Dott.
Balbo presso il reparto di Pneumologia dell’Ospedale Maggiore della Carità di Novara. In
questo progetto abbiamo anche valutato se la determinazione dell’attività telomerasica potesse
garantire alta sensibilità e specificità diagnostica e una possibile correlazione tra i suoi livelli
e l’aggressività della patologia. Inoltre, abbiamo valutato l’attività della telomerasi in
funzione della risposta ai differenti regimi terapeutici, soprattutto nei pazienti in stadio
avanzato.
METODI E RISULTATI
Sono state utilizzate tecniche di biologia molecolare (real-time PCR) e di immunoistochimica.
I dati relativi ai trattamenti chemioterapici effettuati presso il reparto di Oncologia (Direttore
Prof. Alabiso), sono stati correlati con quelli della telomerasi. I pazienti considerati sono stati
54 (45 maschi e 9 femmine). Un primo dato importante indica che i risultati dell’analisi
immunoistochimica dell’enzima contribuiscono notevolmente alla specificità diagnostica,
limitatamente ai pazienti operati, e che nei campioni a bassa stadiazione di malattia (Ia) esiste
una buona correlazione tra il referto anatomo-patologico ottenuto dalle metodiche tradizionali
e l’analisi dell’attività telomerasica su BAL. E’ interessante sottolineare che la positività
TRAP era indipendente dalla dimensione della neoplasia e che il tumore di tipo carcinoide ha
dimostrato negatività telomerasica. La localizzazione apicale di 4 neoplasie ha dimostrato
un’analisi broncoscopica e telomerasica negativa e sembra quindi che vi siano limiti
anatomici e limiti strumentali che condizionano il prelievo di materiale significativo per
l’analisi telomerasica. L’analisi di istotipi a stadiazione superiore ha permesso di evidenziare
alcune potenzialità del dosaggio telomerasico e alcuni suoi limiti legati. Bisogna premettere
che il numero dei pazienti esaminato per gli stadi IIb (2 casi), IIIa (1caso) e IIIb (5 casi), non
163

era tale da permettere di trarre conclusioni definitive. L’analisi ha rilevato una patologia come
il microcitoma (SCLC), mentre l’istotipo spinocellulare, sia nelle stadiazioni II che III, è
risultato negativo al BAL, in contrasto con i dati ottenuti dai pazienti con lo stesso tipo di
neoplasia con stadiazione Ia. I casi allo stadio IV (11/14, 79%) presentavano attività
telomerasica misurabile e tra questi 5 erano ad alta, 2 a media, e 4 a scarsa positività. Questa
metodica sembra quindi avere un significato diagnostico importante per tutte le differenti
neoplasie allo stadio IV. Bisogna segnalare l’alta positività delle neoplasie bronchioloalveolari
(2 casi), solitamente non facilmente diagnosticabili. Nei pazienti che avevano avuto
indicazione al trattamento farmacologico, tutte le neoplasie di stadiazione IV che non
esprimevano positività significativa per la telomerasi, indipendentemente dall’istotipo e dalla
terapia farmacologica, avevano un decorso più favorevole. Questi pazienti hanno avuto una
risposta obiettiva con stazionarietà della malattia (4/6, 67%).
Se si prende in considerazione la positività telomerasica, si può osservare che tutti i pazienti
telomerasi negativi o scarsamente positivi, indipendentemente dal tipo di patologia e dallo
schema terapeutico, sopportano un numero di cicli chemioterapici superiore ed hanno
un’aspettativa di vita più lunga. Due pazienti classificati come molto positivi sono deceduti
entro un mese dalla diagnosi, e non hanno portato a termine alcun ciclo chemioterapico. Si
può quindi supporre che la positività telomerasica, più che alla diagnosi, sia collegata alla
capacità invasiva della neoplasia stessa. Queste ipotesi saranno comunque validate con studi a
lungo termine. Il limitato numero di pazienti, anche in questo caso, non permette di fare
ulteriori correlazioni.
L’espressione dell’enzima telomerasi è regolata positivamente o negativamente a livello
trascrizionale, mediante l’azione di fattori di trascrizione che agiscono direttamente sul suo
promoter. Tra questi vi sono alcuni fattori virali che sono in grado di interagire direttamente
sui suoi siti regolatori sul promoter, inducendone la trascrizione. Alcuni virus sono in grado di
indurre un fenotipo cellulare immortale che predispone la cellula a fenomeni di
trasformazione neoplastica.
Il progetto proseguirà, quindi, indagando in modo approfondito se alcuni virus possono essere
considerarsi fattori di rischio per l’insorgere di alcuni istotipi tumorali polmonari e se i dati
ottenuti verranno correlati con la stadiazione della patologia, il suo istotipo, l’abitudine al
fumo, l’esposizione a particolari cancerogeni. Si valuterà complessivamente se vi siano dati
per valutare la presenza di fattori di rischio predisponenti le varie patologie neoplastiche
polmonari.
Ricadute per il Servizio Sanitario Regionale: oltre ad aumentare le conoscenze di base sui
meccanismi molecolari e fisiopatologici delle neoplasie polmonari, il dosaggio della
telomerasi, fornendo un approccio prognostico innovativo a basso costo che si affianca alle
metodiche diagnostiche tradizionali, potrebbe contribuire a migliorare il quadro anamnesico
dei pazienti. Questo si rifletterebbe in una scelta più razionale della terapia da utilizzare
(farmacologica, radioterapica o chirurgica), sull’ottimizzazione del tipo di associazioni
chemioterapiche da utilizzare e quindi sui costi complessivi degli interventi terapeutici.
164

Rosanna Coppo Filone tematico C1
Rete Regionale Piemontese di insufficienza d’organo in età pediatrica:
diagnosi, cura, trapianto e follow-up domiciliare
A.S.O. O.I.R.M. S. Anna
Ospedale Infantile Regian Margherita – SC Nefrologia, Dialisi e Trapianto
OBIETTIVO
Il Progetto si è prefisso l’obiettivo di istituire in Piemonte una rete di informazioni relative ai
bambini con insufficienza d’organo (rene, fegato, cuore e polmoni) dalla fase iniziale di
rilievo della patologia cronica, all’identificazione dei casi progressivi in insufficienza
funzionale d’organo più o meno avanzata, fino all’iscrizione in lista trapianto e/o al
trattamento sostitutivo di dialisi per l’insufficienza renale cronica.
MATERIALI E METODI
E’ stata attivata la rete di funzionamento cominciando dalla periferia, coinvolgendo le Unità
Materno-Infantili sul territorio regionale, in quanto deputate all’identificazione della casistica
e alla sorveglianza del percorso diagnostico-terapeutico pre-trapianto. Sono stati individuati
Referenti in ogni Unità Materno-Infantile e un Referente di Quadrante suddividendo il
territorio della Regione Piemonte in 4 grandi quadranti
1. Torino, Pinerolo, Ivrea,ecc
2. Novara, Verbania, Vercelli, Biella.
3. Cuneo, Savigliano,ecc
4. Asti, Alessandria, ecc.
Sono state effettuate quattro riunioni con i Pediatri del territorio di ogni quadrante per
illustrare il funzionamento della Rete con partecipazione di Nefrologi, Urologi, Cardiologi,
Cardiochirurghi, Cardiorianimatori, Epatologi, Epatochirurghi e Pneumologi Pediatri
dell’OIRM di Torino. E’ stata attivata la raccolta dati a scopo iniziale epidemiologico e di
start-up della rete funzionale con la messa a punto di schede di raccolta dati per i vari organi
in condizioni di insufficienza funzionale. Le schede contenevano notizie anagrafiche,
territorio e Medico di competenza, organo interessato, patologia di base e grado
dell’insufficienza funzionale. La raccolta delle schede inviate da medici del territorio è stata
integrata con una ricerca capillare negli archivi dei reparti Specialistici relativi ai vari organi
dei casi che erano direttamente afferiti all’Ospedale Regina Margherita. Le schede sono state
inserite in un data-base informatico tipo Excel che ha permesso l’analisi statistica.
RISULTATI
Sono state raccolte, inserite in data-base ed elaborate 182 schede relative ad altrettanti
soggetti con insufficienza cronica d’organo residenti nella Regione Piemonte. La
distribuzione per quadranti mostrava, come atteso dalla numerosità della sua popolazione, una
prevalenza del quadrante 1 (69%), con distribuzione simile fra gli altri quadranti (2: 9%, 3:
15%, 4: 7%). Il rapporto M/F mostrava una leggera prevalenza del sesso maschile (1. 25).
L’età media dei soggetti in insufficienza d’organo registrati era 12 anni (range 0-34). Di
questi, 146 (80%) erano compresi nell’età pediatrica (

della Regione Piemonte. Ipotizzando totalità di completezza di raccolta, è possibile una stima
di prevalenza di 238 casi di bambini in insufficienza d’organo /milione di popolazione
pediatrica. Insufficienza d’organo grave è stata rilevata in 36 soggetti (20%) di cui 6 (3%)
iscritti in lista attiva di trapianto d’organo. Analizzando i singoli organi, i casi di insufficienza
di rene sono risultati 88 (49%), di cui pediatrici 68 (77%), insufficienza di fegato 39 (21%), di
cui pediatrici 29 (74%), insufficienza di cuore 22 (12%), di cui pediatrici 21 (95%),
insufficienza di polmone 33 (18%), di cui pediatrici 28 (85%).
RENE La patologia di base dell'insufficienza renale cronica più frequente è stata
l’ipodisplasia renale con uropatia malformativa (40 casi, 46% dei casi relativi al rene),
maggiormente frequente nel maschio (9/1), seguita da ipodisplasia renale senza uropatia
malformativa (17%), glomerulonefrite cronica (6%), rene policistico (5%), lupus eritematoso
sistemico (3%), nefrite interstiziale idiopatica (3%), sindrome emolitico-uremica (2%),
sindrome nefrosica congenita (1%), altre patologie 17%. La gravità dell'insufficienza,
graduata secondo le linee guida internazionali, rilevava in 22 casi (25%) un quadro avanzato
(7 pazienti in dialisi di cui 2 in lista trapianto attiva, 2 in fase avanzata di inserimento in lista,
2 molto piccoli ed un bambino non idoneo al trapianto), in 24 casi (27%) un deficit funzionale
di grado medio e in 42 (48%) di grado iniziale.
FEGATO Le più frequenti patologie di base dell'insufficienza epatica cronica sono state
l’atresia delle vie biliari (20%), l’epatite autoimmune (20%) e il morbo di Wilson (20%),
seguiti dalla colangite sclerosante primitiva (15%), dalla glicogenosi (13%), dal deficit di
alfa-1 antitripsina (3%), dalla fibrosi cistica (3%), dalla sindrome di Budd-Chiari (3%) e dalla
trombosi della vena porta (3%). La gravità dell'insufficienza, graduata secondo le linee guida
internazionali, rilevava in nessun caso un quadro avanzato, in 7 casi (18%) un deficit
funzionale di grado medio e in 32 (82%) di grado iniziale.
CUORE La patologia di base dell'insufficienza cardiaca cronica più frequente è stata la
cardiomiopatia dilatativa (49%), seguita dalla cardiomiopatia congenita operata (27%), dalla
cardiomiopatia ipocinetica post-chemioterapia (9%), dalla cardiomiopatia congenita nativa
(5%), dal cuore univentricolare operato (5%) e dal ventricolo sinistro ipoplasico (5%). La
gravità dell'insufficienza, rilevava in 5 casi (23%) un quadro avanzato, in 7 casi (32%) un
deficit funzionale di grado medio e in 10 (45%) di grado iniziale.
POLMONE La più comune patologia di base dell'insufficienza cardiaca cronica è stata la
fibrosi cistica (91%), seguita dalla bronchiolite obliterante post-morbillo (3%),
dall’emosiderosi polmonare (3%) e dalla pneumopatia interstiziale aspecifica fibrotica (3%).
La gravità dell'insufficienza, graduata secondo parametri internazionali, rilevava in 9 casi
(27%) un quadro avanzato, in 20 casi (61%) un deficit funzionale di grado medio e in 4 (12%)
di grado iniziale.
CONCLUSIONI
La Ricerca ha ottenuto risultati significativi sotto molti profili.
1. Ha permesso di rendere nota capillarmente a livello regionale l’attività delle equipes
mediche e chirurgiche che curano le varie fasi funzionali dell’insufficienza d’organo
favorendo l’istituzione e la futura funzione di un vero network regionale.
2. Ha fornito dati epidemiologici sulla casistica raccolta d'insufficienza funzionale d’organo
esordita in infanzia nella nostra Regione con distribuzione territoriale. Il confronto fra i
dati rilevati e quelli attesi può fornire spunti di individuazione di casi che fanno
riferimento a Centri extra-regionali.
3. Ha fornito un panorama della gravità del difetto funzionale rilevato attualmente, con
spunti offerti alla politica sanitaria regionale per prevedere le necessità di trapianto nei
giovani.
166

Giorgio Cortesina Filone tematico C1
Basi precliniche per un vaccino a DNA contro recidive di carcinomi
squamosi HER-2/neu positivi
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Fisiopatologia Clinica
CONTESTO E RAZIONALE
Scopo del progetto di ricerca è stato porre le basi precliniche per la messa a punto di un
vaccino a DNA da usare nella prevenzione delle recidive di carcinomi squamosi del distretto
cervico-facciale, HER-2/neu positivi, di stadio II-IV, del cavo orale, orofaringe, e laringe. La
messa a punto di questo vaccino a DNA e la preparazione razionale di un protocollo di
prevenzione delle recidive, che comunemente condizionano in maniera sfavorevole la
prognosi di questi tumori, richiede un complesso studio preclinico basato sullo sviluppo di
idonei modelli sperimentali in grado di mimare in maniera opportunamente riprogrammata gli
eventi biologici della cellula neoplastica e le sue interazioni col sistema immunitario del
paziente.
OBIETTIVI
1. Definire le condizioni per correggere la reattivita’ del paziente verso la molecola HER-
2/neu al fine di indurre un’intensa risposta immunitaria.
2. Valutare, mediante analisi immunoistochimica, la percentuale di tumori esprimenti la
proteina p185 neu, su una casistica retrospettiva di 100 pazienti affetti da carcinoma
squamoso del distretto cervico-facciale afferiti negli ultimi anni alla Clinica ORL II diretta
dal Prof. Cortesina.
METODI
Il sistema sperimentale è costituito da linfociti umani ottenuti da donatori sani, su cui abbiamo
definito le condizioni ottimali di attivazione in vitro della risposta specifica anti HER-2/neu.
La mancanza o scarsa efficacia della presentazione degli antigeni tumorali da parte delle
cellule presentanti l’antigene (APC) professioniste può costituire il problema principale nel
generare una resistenza ai tumori mediata dai linfociti T. Adiuvanti naturali come citochine e
chemochine possono stimolare le APC ad attivare i linfociti T più efficientemente. Partendo
dal razionale che:
1. l’HER-2/neu è una proteina self, tollerata dal sistema immunitario e la proteina di ratto
cross-reattiva, omologa per l’88% con quella di uomo a livello aminoacidico, può fornire
nuovi epitopi per i linfociti T helper in grado di coadiuvare una risposta specifica contro il
vero bersaglio antigenico;
2. la chemochina CCL16 si è dimostrata in grado di ottimizzare la presentazione degli
antigeni tumorali da parte di APC in un modello murino,
abbiamo allestito co-colture di linfociti T con cellule dendritiche (DC) autologhe caricate con
cellule tumorali esprimenti l’HER-2/neu di ratto e successivamente indotte a maturare con la
chemochina CCL16. Le DC sono state generate coltivando per 6 giorni con GM-CSF + IL-4
cellule CD14+ separate dal sangue di donatori sani mediante bigliette magnetiche coniugate
con anticorpi anti-CD14. Le DC immature così ottenute sono state caricate con cellule
167

tumorali apoptotiche esprimenti l’HER-2/neu di ratto. Abbiamo anche utilizzato cellule
tumorali umane Jurkat, HER-2/neu negative, trasfettate con DNA codificante la parte
transmembrana-extracitoplasmatica della proteina HER-2/neu di ratto, che il Prof. Forni ha
approntato in collaborazione con il Dr. Amici dell’Università di Camerino. Le DC caricate
sono state indotte a maturare coltivandole per ulteriori 24 ore con stimoli classici, come l’IL-
1β e il TNF-α, o con la chemochina CCL16. I linfociti attivati sono stati ristimolati per due
volte, settimanalmente, nelle stesse condizioni. La risposta contro l’HER-2/neu umano è stata
rilevata dopo la stimolazione primaria e le due ristimolazioni, valutando la generazione di:
a) attività citotossica;
b) linfociti T specifici producenti IFN-γ mediante ELISPOT.
Abbiamo riscontrato un maggior numero di cellule producenti IFN- γ nelle colture di linfociti
T attivati da DC caricate con gli antigeni tumorali e poi fatte maturare con CCL16, rispetto
alla condizione in cui le DC caricate venivano fatte maturare con l’IL-1β e il TNF-α (100/105
cellule verso 50/105 cellule rispettivamente, dopo 7 giorni di coltura e 200/105 cellule verso
120/105 cellule rispettivamente dopo le due ristimolazioni). Inoltre i linfociti T CD8 ottenuti
dalle co-culture allestite con le DC fatte maturare con CCL16 presentano una maggiore
quantità di perforine e granzimi nel citoplasma, che dovrebbe correlare con una maggiore
attività citotossica nei confronti delle cellule tumorali umane HER-2/neu +.
Contemporaneamente, abbiamo condotto l’analisi dell’espressione di p185neu su fettine
incluse in paraffina derivate da carcinomi primari squamosi del distretto cervico-facciale (anni
1992-1997) mediante tecnica immunoistochimica utilizzando l’ anticorpo CB11 (Novocastra).
Il metodo di valutazione dell’espressione di p185neu è stato il seguente: 0 =negativo, assenza
di espressione o positività di membrana in meno del 10% delle cellule neoplastiche;
1+=negativo, debole segnale solo in parte della membrana cellulare in più del 10% delle
cellule neoplastiche; 2+=debolmente positivo, moderato segnale su tutta le membrana in più
del 10% delle cellule neoplastiche; 3+=fortemente positivo, intenso segnale su tutta le
membrana in più del 10% delle cellule neoplastiche.
RISULTATI
I risultati ottenuti dimostrano che è possibile:
1. indurre una migliore reattività dei linfociti T CD4+ e CD8+ contro tumori umani HER-
2/neu+ utilizzando cellule esprimenti l’HER-2/neu di ratto;
2. potenziare l’induzione della reattività facendo maturare le DC con CCL16.
Inoltre, i risultati dell’analisi immunoistochimica, effettuata fino ad oggi su 87 campioni
inclusi in paraffina ottenuti da pazienti portatori di carcinomi del cavo orale (23%), orofaringe
(8%), laringe (62%) ed ipofaringe (7%), stadio pT1 (14%), pT2 (33%), pT3 (35%), pT4
(17%), ha dimostrato che la percentuale di tumori esprimenti la p185neu è del 37%
considerando come positivi quelli classificati come 1+, 2+, 3+ verso gli 0, e del 22%
considerando i 2+ e 3+ (0+=63%; 1+=15%; 2+=20%; 3+=2 %). Nel loro complesso i risultati
ottenuti hanno consentito un avanzamento delle conoscenze per la messa a punto e
valutazione dell’efficacia in vitro dei nuovi vaccini a DNA e costituiscono le premesse per un
loro rapido utilizzo in clinica in pazienti operati di carcinomi squamosi stadio II-IV del cavo
orale, dell’orofaringe e laringeali con evoluzione faringea, esprimenti Her2/neu (circa il 30%
dei casi) che con una frequenza del 30-40% vanno incontro a recidive entro i tre anni
dall’operazione chirurgica. Tali incoraggianti evidenze costituiscono pertanto la base di
partenza per la messa a punto dei successivi protocolli clinici di vaccinazione per la
prevenzione dei tumori HER-2/neu positivi.
La messa a punto di nuove strategie terapeutiche per pazienti a grave rischio, come quelli con
carcinomi squamosi, e la loro validazione in modelli preclinici in vitro, ha un’immediata ed
importante ricaduta applicativa nella terapia dei tumori in generale.
168

Paolo Cotogni Filone tematico B3
L’apporto di lipidi nella prevenzione dell’evoluzione del danno
polmonare acuto in pazienti in alimentazione artificiale.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale – S. C. Anestesia e Rianimazione
CONTESTO E RAZIONALE
L’insufficienza respiratoria acuta (IRA) costituisce una condizione clinica frequente nei
pazienti critici ricoverati nelle Unità di Terapia Intensiva e presenta un'elevata mortalità (dal
34 al 59% negli ultimi 5 anni). Tuttavia, la mortalità è correlata più all’insufficienza di altri
organi che alla gravità della malattia polmonare stessa. Nell’IRA la patogenesi e l’evoluzione
del danno polmonare acuto (da acute lung injury –ALI ad acute respiratory distress syndrome
–ARDS) riconoscono come fattore fondamentale la presenza di un’intensa risposta
infiammatoria a livello alveolare. Aumentati livelli alveolari di citochine pro-infiammatorie
all’esordio dell’ALI, come il riscontro di uno squilibrio tra mediatori pro- ed antiinfiammatori,
correlano con un’aumentata mortalità. Inoltre, la persistenza di un processo
infiammatorio alveolare può determinare il passaggio dagli spazi alveolari danneggiati nella
circolazione sistemica di citochine pro-infiammatorie che possono risultare importanti fattori
patogenetici della disfunzione/insufficienza di altri organi. I pazienti con ALI presentano un
elevato rischio di sviluppare una malnutrizione e per questo vengono sottoposti ad
alimentazione artificiale. Quest’ultima prevede un apporto di lipidi pari al 30-35% delle
calorie non-proteiche. Diversi autori hanno ipotizzato che la somministrazione di
formulazioni lipidiche a minore concentrazione di acidi grassi polinsaturi (PUFA) omega-6
(n-6) ed a maggiore concentrazione di PUFA omega-3 (n-3) possa essere una delle terapie
non ventilatorie dei pazienti con ALI/ARDS. Il razionale è costituito dal dato che gli n-3 sono
considerati agenti anti-infiammatori, mentre gli n-6 producono effetti pro-infiammatori. Il
rapporto ottimale tra n-3 e n-6 nei programmi nutrizionali di pazienti con ALI/ARDS è ancora
da determinare. Abbiamo precedentemente dimostrato che la somministrazione di PUFA in
un rapporto 1:1 tra n-3 e n-6 riduce significativamente il rilascio di citochine proinfiammatorie
(TNF-α, IL-6 e IL-8), nonché determina la maggiore secrezione della citochina
anti-infiammatoria IL-10, da parte di cellule epiteliali umane (cellule alveolari di tipo II –
A549) precedentemente stimolate con lipopolisaccaride (LPS). Al contempo, abbiamo
osservato che nel caso di rapporti n-3/n-6 maggiormente sbilanciati a favore degli n-6 (1:4 e
1:7) il rilascio di citochine pro-infiammatorie è significativamente aumentato rispetto ai
controlli. In questa successiva fase della ricerca si sono effettuati esperimenti volti a
consentire il progressivo passaggio dalla fase sperimentale a quella clinica. L’obiettivo
primario di questo studio è di verificare se ci siano differenze nei livelli di citochine pro- ed
anti-infiammatorie secrete da cellule alveolari umane stimolate con liquido di lavaggio
bronco-alveolare (BALF) di pazienti con IRA grave, in relazione ad un diverso rapporto tra n-
3 e n-6 nella somministrazione di PUFA.
METODI
Lo studio prospettico, randomizzato e controllato si è svolto nel laboratorio di Patologia
Generale del Dipartimento di Medicina ed Oncologia Sperimentale dell’Università di Torino e
nella Terapia Intensiva della SC Anestesia e Rianimazione 3 dell’Ospedale S. Giovanni
Battista - Molinette, Università di Torino. Criteri di inclusione per la raccolta del BALF.
169

Pazienti di età >18 anni, con IRA grave (rapporto PaO2/FiO2

Sandra D'Alfonso Filone tematico A2
Associazione genetica della Sclerosi Multipla con polimorfismi del gene
MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein)
Università “A. Avogadro” del Piemonte Orientale
Dipartimento di Scienze Mediche
CONTESTO E RAZIONALE
La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune demielinizzante del sistema nervoso
centrale alla cui suscettiblita contribuiscono fattori ambientali e genetici. L’unico fattore
genetico dimostrato con certezza risiede nella regione HLA. L’associazione più forte è con
HLA-DRB1*1501 (DR15). Tuttavia, nella regione HLA sono stati ipotizzati altri geni di
suscettibilità ad SM. Infatti, è stata osservata un’associazione con marcatori che mappano a 3
Mb telomerici a DR che sembrano avere un effetto indipendente o sinergico rispetto a DR.
OBIETTIVO
Per confermare e identificare geni HLA con effetto indipendente da DR nella popolazione
dell’Italia continentale, abbiamo condotto uno studio di associazione intrafamiliare con 15
marcatori della regione HLA localizzati fino a 7Mb telomerici al gene DR. Tra questi erano
inclusi 4 microsatelliti tra classe I e HFE (emocromatosi) e 11 marcatori nel gene MOG
(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein) comprendenti 2 microsatelliti localizzati
rispettivamente al 5’ del gene e nel 3’UTR, e 9 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) di cui
5 nel promotore (nelle posizioni -1077, -918, -910, -875, -93), 1 variazione sinonima
(Ser5Ser), 2 variazioni missenso (Val142Leu, Val145Ile) e una delezione di un aminoacido
(del22Leu) nel peptide segnale. MOG e’ un gene candidato per suscettibilita’ ad SM per
funzione (è un costituente della mielina) e per posizione (mappa nella regione HLA a circa 3
Mb telomerico a DR proprio nella regione evidenziata dai precedenti studi).
MATERIALI E METODI
Per tutte queste variazioni e’ stato condotto uno studio di associazione caso-controllo su 273
pazienti e 430 controlli e di associazione intra familiare su 210 famiglie simplex (il paziente e
i suoi genitori). Lo studio di associazione intra-familiare è stato condotto con metodo TDT
(Transmission Disequilibrium Test) che utilizza nuclei famigliari comprendenti un singolo
paziente e i genitori (famiglie simplex o trios). Il principio su cui questo test è basato è quello
di confrontare in numerose famiglie quante volte un dato allele è stato trasmesso o nontrasmesso
dai genitori al paziente. Ogni allele ha, in base al caso, 50% di probabilità di essere
trasmesso e 50% di non essere trasmesso. Una deviazione significativa dal rapporto 50:50
indica associazione fra l’allele e la malattia. L’analisi delle famiglie permette anche di
ricostruire le combinazioni aplotipiche dei polimorfismi esaminati.
Casistica. Sono stati analizzati pazienti affetti da Sclerosi Multipla reclutati nel Centro di
Sclerosi Multipla dell'Ospedale Maggiore della Carità di Novara e da centri clinici in altre
regioni (Milano, Firenze, Roma, Bari). A tutti i pazienti, previo consenso informato, e’ stato
prelevato un campione di sangue da cui e’ stato purificato il DNA con metodi standard. Sono
stati raccolti i campioni di DNA di 483 pazienti di cui 210 con entrambi i genitori e 430
controlli (studenti, personale dell'Università e ospedaliero, donatori di sangue).
171

Tipizzazione degli SNP. E’ stata utilizzata la metodica commerciale ABI PRISM ®
SNaPshot Multiplex (Applied Biosystems). I prodotti della reazione sono stati analizzati al
sequenziatore automatico a 16 capillari.
Tipizzazione dei microsatelliti. I diversi alleli che differiscono per peso molecolare sono
stati discriminati mediante corsa elettroforetica sui capillari del sequenziatore di DNA a 16
capillari (ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer). Lo stesso approccio e’ stato applicato anche
per evidenziare la delezione di 3 nucleotidi (64-66) nell'esone 1 che provoca la delezione di
un aminoacido (del22Leu) nel peptide segnale. I dati sono stati raccolti con il programma
3100 Data Collection 1.0.1 e i frammenti misurati usando il software Genescan 3.7.
Tipizzazione dell’allele HLA-DRB1*1501. E’ stato utilizzato un processo in due passaggi di
amplificazione "nested" comprendente una prima amplificazione "generica" dell'esone 2 del
gene DRB1 seguita da un'amplificazione specifica incentrata su sequenze caratteristiche
dell'allele DRB1*1501.
Analisi statistica. Le frequenze nei pazienti e nei controlli sono state paragonate per mezzo di
tavole 2x2. La significatività statistica delle differenze e’ stata valutata con X² con correzione
di Yates. Il LD tra gli alleli ai diversi polimorfismi e’ stato calcolato con il programma
Arlequin 2.0. Per l’analisi di associazione intrafamiliare e’ stato utilizzato il “Transmission
Disequilibrium Test” (TDT) con il programma TRANSMIT.
RISULTATI
L’analisi TDT in 210 famiglie trio ha evidenziatouna trasmissione preferenziale dell’allele
Val142 (64% trasmissione, p=0.003) e -875A (70% trasmissione, p=0.034) rispettivamente
nell’esone 3 e nella regione 5’ di MOG. Queste associazioni erano indipendenti da DR15.
L’associazione di Val142 e’ stata confermata in uno studio caso-controllo su 273 pazienti e
430 controlli: la frequenza dell’allele Val142 era significativamente piu’ frequente nei
pazienti che nei controlli [0.831 vs 0.776, p=0.022, OR= 1.42 (1.05-1.92)]. Inoltre le
frequenze genotipiche erano significativamente diverse (p= 0.036): in particolare, i pazienti
mostravano un aumento significativo del genotipo omozigote Val142/ Val142 (0.68 vs 0.60,
p=0.037, 3.17 (1.08-11.25). L’associazione con il polimofismo -875A/G non e’ stata
confermata con lo studio caso controllo. L’analisi delle combinazioni aplotipiche degli alleli
ai diversi loci esaminati non ha mostrato un’associazione significativa con la SM.
CONCLUSIONI
In conclusione e’ stata identificata l’associazione dell’allele MOG Val142 con la SM. Tale
associazione e’ stata confermata in due casistiche indipendenti con due diversi studi di
associazione (caso-controllo e associazione intrafamiliare) e inoltre conferma in una grande
casistica un’osservazione precedentemente riportata in una piccolo gruppo di 59 pazienti
italiani (J.Neuroimmunol 133: 241, 2002). Al contrario, nessuna altra di tutte le variazioni
nucleotidiche note nella sequenza codificante e nel promotore di MOG sono risultate
associate con la malattia.Questo lavoro avra’ i seguenti sviluppi futuri:
1. Analisi del ruolo funzionale di questa variante nella patogenesi della SM.
2. Analisi del coinvolgimento della variante Val142 con la gravita’ della malattia. E’ in
corso il completamento della raccolta di informazioni cliniche per tutti i pazienti studiati.
3. Correlazione tra la presenza della variante MOG Val 142 con la produzione di anticorpi
anti-MOG.
172

Paola Dalmasso Filone tematico A4
Le diseguaglianze di salute nell’infanzia e nell’adolescenza in Piemonte
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia
CONTESTO E RAZIONALE
Se lo stato di salute delle popolazioni dei Paesi industrializzati è andato progressivamente
migliorando nel corso degli ultimi cinquant’anni, è stata tuttavia registrata l’esistenza di
significative disuguaglianze sociali di mortalità e morbosità. Le disuguaglianze sociali nella
salute sono presenti sin dall’infanzia e adolescenza e assumono una notevole rilevanza di per
sé e in vista dell’impatto sulla vita adulta, nonché sulle opportunità di successo scolastico e
lavorativo. Va inoltre sottolineato come queste fasi della vita costituiscano periodi critici nei
quali si struttura l’assunzione di comportamenti e stili di vita correlati alla salute che si
protraggono in età adulta. Un’associazione inversa con le condizioni socio-economiche è
emersa sia per la mortalità infantile, in particolare con la sindrome da morte bianca (SIDS) e
gli incidenti, sia con alcune patologie non letali che stanno sempre più segnalandosi quali
problemi di salute pubblica emergenti, come ad esempio i disturbi mentali, tra cui i disordini
alimentari. Le disuguaglianze sociali documentano l’esistenza di un potenziale di salute che
potrebbe essere recuperato con opportuni interventi mirati ai gruppi sociali maggiormente
sfavoriti. In questa prospettiva assume particolare importanza l’estensione delle analisi a
nuove dimensioni di salute e il monitoraggio della loro associazione con le condizioni socioeconomiche
individuali e contestuali.
METODI E RISULTATI
La presente ricerca, svolta in collaborazione tra il Dipartimento di Sanità Pubblica e il servizio
Sovrazonale di Epidemiologia ASL 5, presenta un approccio multidisciplinare, coinvolgendo
sociologi ed epidemiologi, e si prefigge di descrivere, in termini di disuguaglianze sociali, le
condizioni di salute e gli stili di vita nell’infanzia e nell’adolescenza attraverso la
valorizzazione di alcune basi dati attualmente esistenti. Diverse basi dati rispondono
all’obiettivo di descrivere le dimensioni di salute nei bambini e negli adolescenti, ognuna con
peculiari limiti e potenzialità.
A questo scopo sono utilizzati lo studio longitudinale torinese (SLT), le schede di dimissione
ospedaliera (SDO) della Regione Piemonte e l’indagine “Health Behaviour in School-aged
Children (HBSC). L’SLT, insieme a quello toscano, è l’unico studio longitudinale sulla salute
attualmente disponibile in Italia e in quanto tale consente la conduzione di studi di coorte, la
propagazione a livello individuale di attributi familiari e consente il linkage con altre fonti
informative, come le SDO. Questa base dati tuttavia è limitata al solo Comune di Torino e
non considera i comportamenti correlati alla salute per la cui analisi occorre ricorrere ad altre
fonti informative. Attraverso i dati dell’SLT sono state arruolate le coorti di bambini e
adolescenti (1-14 anni) che erano in questa fascia di età al momento dei censimenti ed è stata
analizzata la loro esperienza di mortalità nei cinque anni successivi secondo le caratteristiche
socio-economiche della famiglia di appartenenza. A tale scopo sono state considerate
l’istruzione famigliare, la tipologia abitativa, la tipologia famigliare, il quartiere e l’area di
nascita. La stima del rischio di mortalità è stata calcolata attraverso l’SMR (Rapporto
Standardizzato di Mortalità) che esprime il rapporto tra il numero di morti osservato in un
173

determinato gruppo ed il numero di morti atteso nello stesso gruppo se su questo agissero gli
stessi tassi di mortalità specifici per alcune variabili di confondimento che agiscono su di una
popolazione assunta come riferimento. L’SMR esprime infatti l’eccesso o il difetto di
mortalità esistente tra un gruppo sociale e la popolazione di riferimento al netto delle
influenze esercitate dalla diversa composizione per età e per le altre variabili di
confondimento dei due gruppi. La disponibilità delle schede di dimissione ospedaliera
permette di individuare i principali gruppi di cause di ricovero (eccetto i tumori) nel periodo
1995-2001 nelle classi di età considerate (0-14 anni).
Sono stati pertanto selezionati tutti i ricoveri di soggetti residenti nel Comune di Torino nel
periodo considerato e della classe di età analizzata, con particolare attenzione per i disturbi
psicologici e mentali, tra cui anoressia e bulimia. Effettuata tale operazione, la coorte così
individuata è stata linkata con i dati socio-demografici disponibili grazie all’SLT ed è stata
effettuata la stima del rischio relativo di sviluppare un determinato evento. L’HBSC è uno
studio trasversale che nel 2002 ha rilevato informazioni dettagliate sui comportamenti a
rischio per la salute in un campione nazionale rappresentativo di 11, 13 e 15enni e che
consente di confrontare la loro associazione con le caratteristiche socio-economiche della
famiglia (livello di istruzione, condizione occupazionale, professionale e tipologia familiare) e
con quelle relative alla rete dei pari. Attraverso questa fonte informativa sono controllate
alcune ipotesi sui meccanismi generativi delle disuguaglianze sociali in diversi
comportamenti a rischio, tra cui l’abitudine al fumo, il consumo di alcolici, di droghe, i
comportamenti sessuali e le abitudini alimentari.
Sono stati confrontati i 15enni (categoria più numerosa) che dichiarano di fumare (o bere
alcolici) tutti i giorni con il gruppo di pari età che invece è non fumatore (o non bevitore).
Attraverso un’analisi logistica multivariata in cui il livello di istruzione più elevato tra i
genitori è stato considerato indicatore di classe sociale, è emersa una relazione positiva tra
istruzione dell’obbligo e rischio che i ragazzi fumino. Tale relazione è emersa anche
nell’analisi relativa al consumo di alcolici, anche se risulta essere non statisticamente
significativa.
Tra i dati più interessanti, è stato rilevato quello relativo al divario tra l’effettivo peso
corporeo e l’immagine di sé. In generale infatti sembra emergere un’insoddisfazione ed una
inadeguatezza della propria immagine corporea che potrebbe essere sintomo di un malessere
psicologico in parte probabilmente veicolato dai modelli culturali prevalenti, la cui adozione o
meno potrebbe essere in parte spiegata dalle condizioni socio-economiche di partenza.
Attualmente è in corso la stesura di un report conclusivo in cui sono riportate le analisi
effettuate e che sarà nostra cura distribuire appena ultimato.
174

Rosa D'Ambrosio Filone tematico D4
Il Profilo di salute della città di Torino
ASL 1 - Unità Operativa di Epidemiologia ed Educazione Sanitaria
OBIETTIVO
Una ricerca-azione esplorativa sullo star bene, parte di un più ampio progetto presentato
dall’Unità Semplice di Educazione Sanitaria del Dipartimento di Prevenzione di Torino per
l’elaborazione e sperimentazione di interventi consapevoli nella comunità.
METODI
Sono stati svolti 10 focus group nel periodo ottobre-dicembre 2004. Sei con la popolazione: 1
con uomini e 1 con donne da 65 anni in su; 2 con uomini e 2 con donne tra 35 e 64 anni,
reclutati dal servizio stesso. Inoltre due gruppi con operatori, uno con dirigenti nei servizi alla
persona- ospedalieri e territoriali ed infine uno con i politici della IV Commissione Sanità e
Servizi Sociali del Comune di Torino. Si è puntato sull’espressione e condivisione di
esperienze, per poi passare a individuare i problemi principali e suggerire le soluzioni
possibili.
RISULTATI
Un dato sembra accomunare tutti i 10 focus group: la necessità di una trasformazione
culturale che permetta di affrontare la vita quotidiana con strumenti adeguati.
Star bene, indipendentemente da condizioni sociali e di vita diverse, comprende una o più
dimensioni – fisica, psichica, ambientale o socio-economica – come sue pre-condizioni: una
sorta di impliciti aut-aut verso la vita quotidiana. Al di là dell’età emergono delle differenze
tra uomini e donne: le seconde tendono ad una maggiore attenzione all’ascolto di sé, degli
altri e all’approfondimento. Inoltre, al di là delle condizioni sociali e del tipo di divisione del
lavoro in famiglia, le donne sottolineano la diversa sensibilità culturale di genere nella vita
quotidiana e, soprattutto i due gruppi tra 35 e 64 anni, affrontano almeno tre fasi difficili:
“disegnarsi” ed esprimere il proprio disegno di sé, realizzarlo, mantenerlo. Comune a tutti i
gruppi, seppure con intensità e forme diverse, è la consapevolezza del susseguirsi di
cambiamenti dovuti in parte all’età, in parte a vicende di vita delle quali si cerca il senso. Nei
due gruppi di donne tra 35 e 64 anni emerge la rilevanza della differenza tra una condizione di
vita normale ed una affetta da malattia grave. In quest’ultima condizione, in entrambi i generi
per questo gruppo d’età, alcuni indicano la dimensione spirituale come elemento determinante
della gestione, caratterizzata per tutti da due strategie dominanti, combattere o accettare.
Le relazioni sociali rivelano la loro centrale importanza per tutti. In positivo sono un efficace
nutrimento alla propria esistenza. In negativo, le pre-definizioni della situazione date dagli
altri sono un ostacolo nel gestire la malattia cronica o una disabilità; esse sono comuni sia
nella cerchia familiare che nei rapporti con i professionisti della salute e più in generale.
L’amicizia emerge come una forma di legame quasi onnipresente, plasmabile, flessibile ed
adatta a Jsopportare e trascendere l’evolversi, a volte turbinoso, a volte stagnante, delle
situazioni di vita. Per le donne tra i 35 ed i 64 anni, l’amicizia comprende la confidenza, la
complicità e l’aiuto.
175

In tutti i gruppi emergono insicurezza e forme di ansia e paura connesse ai più vari motivi ed
esperienze. Tali condizioni sembrano lenite o del tutto assorbite da chi, uomo o donna,
manifesti una propria fede spirituale. Si ha però anche difficoltà a riconoscere che di fatto un
lato dell’insicurezza odierna sembra nascere dall’avere molte più opzioni rispetto al passato;
ad esempio disporre di più conoscenze sulla salute aumenta l’incertezza sulla strada da
percorrere, che resta sempre di più nelle mani del “paziente”.
Priorità e forme di intervento
Oltre a suggerimenti per l’azione, c’è in tutti i focus group una disponibilità variabile per
forma ed intensità, a dare le energie a disposizione per il benessere della comunità. I nodi
critici su cui c’è consenso tra i gruppi sono tre:
1. verso il personale sanitario, necessità di maggior ascolto, più trasparenza e
coinvolgimento dei pazienti per superare forme di “aiuto senza relazione”; promuovere
una diagnostica più efficace, che riduca incertezze, trascuratezze od errori.
2. porre maggiore attenzione alla formazione delle giovani generazioni.
3. inadeguatezza della cultura del ceto dirigente per rispondere alle sfide odierne; ciò è
connesso alla convinzione diffusa in modo pressoché generale che le risorse finanziarie ed
umane non scarseggino. Per alcuni (uomini tra 35 e 64 anni) manca la passione e l’amore
per fare le cose; altri sostengono che non vengono riconosciute le capacità di autogoverno
della comunità, mantenendo, in una società complessa, una costosa ed inefficace cultura
del controllo.
Soluzioni:
1. Selezione più efficace e formazione del personale sanitario (medici e infermieri, personale
OTA) e volontario; un aiuto professionale su richiesta degli operatori per affrontare
situazioni difficili sul piano emozionale.
2. “fare una campagna a favore dell’essere”; formare gli insegnanti a vedere il bambino
come essere umano e non “macchina per apprendere”; valorizzare il lavoro educativo dei
genitori, aiutandoli a fare meglio.
Tra gli ultra 65enni, le donne sono concordi su un punto prioritario: non finire nelle case di
riposo, mentre gli uomini sollevano aspetti dell’organizzazione dell’assistenza sanitaria e
sociale -ticket, liste di attesa -.; mentre sostengono che all’eccessiva spesa sanitaria e agli
esami inutili contribuiscono le stesse persone ed i medici di base; gli uomini chiedono inoltre
la valorizzazione delle abilità degli anziani in due sensi: trasmetterle ai giovani ciò che sanno
e arricchire la propria esperienza con nuove conoscenze.
Operatori, dirigenti e politici dei servizi alla persona
Armonia e senso di utilità sono i termini più usati per rimandare la propria immagine di star
bene nei tre gruppi. Tra operatori e dirigenti emerge:
a) un’immagine della medicina critica per tutti, medici e non: paternalista, sintomatologica e
orientata all’acuzie, con difficoltà di ascolto e relazione, tecnologica;
b) esperienza personale dell’operatore e del dirigente, anche della propria malattia, come
risorsa preziosa, essa si manifesta come il fattore più profondo di comprensione delle
situazioni, aiuta ad affinare la conoscenza ed a sviluppare l’attenzione.
I politici rispetto allo star bene della popolazione individuano elementi contingenti e non. I
primi sono connessi a condizioni specifiche: l’essere anziani con difficoltà economiche o di
176

salute e senza adeguato aiuto, oppure famiglie senza reddito adeguato. I secondi sono
connessi ad una cultura dell’avere.
Priorità e forme dell’intervento
Tra operatori e dirigenti emerge:
a) la necessità di sviluppare l’ascolto dei pazienti, riconoscendone meglio le risorse.
b) evitare che il paziente sia la pallina di un ping-pong tra servizi diversi;
c) valorizzare l’esperienza personale, anche di malattia, per comprendere meglio i pazienti;
d) alta dirigenza e politici appaiono inadeguati alle sfide di oggi, mentre le risorse non
mancano del tutto, ma spesso sono impiegate male.
Tra le soluzioni emerge la promozione di una formazione del personale efficace e la
distribuzione selettiva delle risorse secondo il merito. Entrambi lamentano la diffusa assenza
di vision, mission a volte solo formali o contraddittorie e una diffusa cultura della netta
separatezza tra dire e fare, che nessuno mette in questione. Gli operatori esprimono la
necessità di non essere lasciati soli; mentre i dirigenti lamentano che sovente le soluzioni ai
problemi siano spesso malviste ed osteggiate.
Per i politici i nodi sono due: stabilire delle priorità ed un metodo con cui costruire le politiche
locali. Essi percepiscono una pressione sociale per far fronte all’incertezza, ma con sincerità
affermano di non avere risposte pronte. Ostacoli quotidiani all’azione politica sono la
burocrazia della P.A. ed una cultura economicista, che alloca le risorse per favorire il
consenso elettorale. Il progetto Città Sane è visto da qualcuno come un’azione significativa
che può andare in una nuova direzione.
177

Oliviero Danni Filone tematico A5
Protezione da parte di estrogeni sull'induzione di beta-secretasi (BACE)
indotta da stress ossidativi
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale
CONTESTO E RAZIONALE
La malattia di Alzheimer (AD) è un disordine neurodegenerativo caratterizzato da un declino
psico-fisico irreversibile e dalla comparsa di placche senili e grovigli neurofibrillari in regioni
del cervello sensibili, che rappresentano le manifestazioni tipiche dell’AD. Un crescente
numero di studi dimostra che le reazioni di tipo ossidativo giocano un ruolo centrale nella
patogenesi dell’AD. Le strategie terapeutiche nell’AD derivano da due approcci. La
valutazione del grado di neuropatia e delle anomalie biochimiche nel cervello è sempre stata
la maggior sorgente di idee per la terapia. Studi epidemiologici e, più recentemente, studi dei
fattori di rischio genetico hanno suggerito approcci di tipo farmacologico. Bisogna comunque
osservare che la maggior parte dei trials clinici sono stati diretti contro i sintomi della
malattia; solo recentemente sono stati eseguiti studi mirati a prevenire o ritardare la malattia.
Recenti studi epidemiologici hanno evidenziato che le terapie a base di estrogeni ritardano la
comparsa e la progressione dell’AD e migliorano le funzioni cognitive dei pazienti affetti. In
ogni caso, rimane da risolvere la questione se questi effetti siano mediati da un loro globale
effetto benefico sul metabolismo cerebrale o possano essere riferiti ad una loro specifica
azione sui meccanismi biochimici coinvolti nella patogenesi dell’AD.
OBIETTIVO
Lo scopo di questa ricerca è quello di verificare se composti estrogenici siano capaci di
prevenire l’induzione della BACE e quindi la produzione di frammenti tossici derivati dal
taglio beta secretasico. Studi precedenti condotti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che i
prodotti aldeidici terminali della perossidazione lipidica sono in grado di aumentare i livelli
proteici e l’attività di BACE, che è direttamente responsabile della produzione di b amiloide
(Abeta).
MATERIALI E METODI
Per questa ricerca abbiamo scelto come modello sperimentale i neuroni NT2, derivati da una
linea di teratocarcinoma umano, Ntera2/c1.D1, un modello sperimentale molto utilizzato per
lo studio dell’APP e della patogenesi dell’AD. Noi abbiamo iniziato lo studio sull’eventuale
neuroprotezione da parte degli estrogeni dal 17beta estradiolo, estrogeno dotato di attività
antiossidante. La nostra attenzione è quindi stata posta sulla ricerca della più bassa
concentrazione capace di ridurre significativamente la perossidazione lipidica. Per innescare
la perossidazione lipidica sono stati utilizzati due classici sistemi pro-ossidanti quali
Ascorbato/FeSO4 (500microM/5microM) e H2O2/FeSO4 (10microM/100microM) posti a
contatto con le cellule per 3 e 6 ore. Tra i vari protocolli sperimentali trovati in letteratura
abbiamo testato l’efficacia di due schemi di trattamento l’uno che prevedeva l’incubazione
delle cellule con 17beta estradiolo alla concentrazione di 5 e 10 microM per 24 ore e un
trattamento sub-cronico che prevedeva l’utilizzo dell’estrogeno alla concentrazione di 200nM
per 6 giorni. Per questo secondo protocollo il terreno e quindi il 17beta estradiolo sono stati
178

sostituiti ogni 48 ore. Entrambi i protocolli sperimentali si sono rivelati efficaci nel proteggere
le cellule dalla perossidazione lipidica indotta dai due pro-ossidanti, anche se con un
differente grado di efficacia. La perossidazione lipidica è stata valutata in termini di rilascio di
sostanze reagenti con l’acido tiobarbiturico (TBARS), di 4-idrossinonenale (HNE), di
produzione di cromolipidi fluorescenti e di specie radicaliche dell’ossigeno. Il 17beta
estradiolo è stato capace di inibire significativamente la perossidazione lipidica sia posto a
contatto con le cellule per 24 ore a concentrazioni dell’ordine del micromolare, sia per 6
giorni alla concentrazione di 200 nM. Il protocollo che prevedeva l’esposizione delle cellule
neuronali per 24 ore a concentrazioni più elevate, nell’ordine del micromolare, si è rivelato
comunque molto più efficace nella protezione nei confronti degli agenti pro-ossidanti. Per
valutare gli effetti del pre-trattamento estrogenico sui livelli proteici di BACE abbiamo
utilizzato il trattamento sub-cronico, che ci permetteva cioè di lavorare con concentrazioni
notevolmente più basse di estrogeno e più vicine a situazioni di tipo fisiologico, spesso infatti
vengono utilizzate in letteratura concentrazioni molto elevate di estrogeni e quindi senza
alcuna rilevanza fisiologica.
RISULTATI
I dati ottenuti con tecnica western blot, suggeriscono che il pretrattamento con il 17beta
estradiolo posto a contatto delle cellule per 6 giorni alla concentrazione di 200nM, svolge una
blanda e non significativa protezione sull’aumento dei livelli proteici di BACE mediato dai
due sistemi proossidanti. Questi risultati suggericono che il benefico effetto della terapia
estrogenica in vivo nei pazienti affetti da AD non sia da riferire ad un’azione di protezione
sull’induzione, mediata dallo stress ossidativo, della beta secretasi.
Nonostante questo risultato negativo sulla protezione del taglio beta secretasico, abbiamo
valutato i livelli intracellulari e secreti di Abeta1-40 e Abeta1-42 nei neuroni NT2 esposti allo
stress ossidativo con e senza pretrattamento con beta estradiolo. I risultati ottenuti hanno
dimostrato che mentre lo stress ossidativo è in grado di determinare un significativo aumento
dei livelli intracellulari e secreti di beta proteina il pretrattamento con il beta estradiolo, pur
non proteggendo l’aumento dei livelli di BACE, è capace di prevenire efficacemente tale iperproduzione.
Per spiegare questo dato abbiamo valutato l’attività dell’ alfa secretasi come
rilascio nel medium di coltura del frammento solubile dell’APP derivato dal taglio a
secretasico, l’aAPPs. I risultati ottenuti suggeriscono che mentre lo stress ossidativo “shifta” il
metabolismo cellulare verso il taglio beta secretasico e la produzione di beta amiloide a
discapito del taglio fisiologico mediato dalla alfa secretasi, il pretrattamento con gli estrogeni
è in grado di aumentare il taglio alfa secretasico proteggendo in questo modo l’iperproduzione
di beta amiloide.
I dati ottenuti sostengono l’ipotesi che i benefici della terapia estrogenica in vivo nei pazienti
affetti da AD sia dovuta ad un effetto sul metabolismo dell’APP e la produzione di b
amiloide, mediata però non da una protezione dell’induzione della beta secretasi quanto
piuttosto da una induzione dell’a secretasi, con un netto decremento della produzione di beta
proteina.
179

Antonella De Francesco Filone tematico C1
Qualita' di vita dei pazienti in nutrizione parenterale domiciliare (NPD) di
lunga durata e dei loro caregivers familiari
ASO S. Giovanni Battista
SCDO di Dietetica e Nutrizione Clinica
CONTESTO E RAZIONALE
La nutrizione parenterale domiciliare (NPD) è il trattamento sostitutivo di funzione d’organo
nei pazienti con insufficienza intestinale, determinata da ampie resezioni intestinali e da danni
anatomici funzionali estesi della parete intestinale. La NP si attua attraverso un catetere
posizionato in una vena centrale. Le infusioni sono effettuate nelle ore notturne per facilitare
il reinserimento socio-lavorativo del paziente e possono essere autogestite o richiedere l’aiuto
di un caregiver. La dipendenza da tale sopporto nutrizionale artificiale diventa permanete per
la maggiorparte dei paziente che supera i 2 anni di trattamento. In questo studio ci si è
proposti di eseguire una valutazione della qualità di vita e dell’equilibrio psicorelazionale.
MATERIALI E METODI
Il campione esaminato finora si compone di 21 pazienti (10 M,11 F), di età media 59 anni
(r.30-76), in NPD da un tempo medio di 7 anni (r.1-17.) I suddetti sono stati sottoposti a
colloqui psicodiagnostici, test sulla qualità di vita (Questionario sullo Stato di Salute SF36,
Satisfaction profile/SAT-P, Scala di disabilità DISS di SHEEHAN, Scala di Valutazione del
Funzionamento Sociale e Lavorativo SVFSL), scale specifiche per i vissuti depressivi
(SCALA ZUNG e HAMILTON RATING SCALE FOR DEPRESSION), scale per
evidenziare eventuali quote d’ansia libera (S.T.A.I., HAMILTON ANXIETY SCALE), test
specifici per aspetti interpersonali (IIP32), test di personalità (TCI). Le due scale Hamilton
(per la depressione e per l’ansia), nonché la scala di Valutazione del Funzionamento Sociale e
Lavorativo prevedono, a differenza degli altri test utilizzati compilati con le risposte fornite
dai soggetti in esame, la compilazione da parte dello psicologo e del medico di riferimento. I
risultati ottenuti dai singoli pazienti nel SF36 e nel SAT-P sono stati confrontati con valori
normativi ponderati per sesso ed età.
RISULTATI
SF36: - ATTIVITÀ FISICA Il 71% è nella norma, il 19% entro 2 dev.st., il 10% oltre 2 dev.
st. - RUOLO E SALUTE FISICA (limitazioni nel vivere quotidiano conseguenti alla
patologia fisica). L’86% è nella norma, il 5% entro 2 dev. st, il 9% oltre 2 dev.st. - DOLORE
FISICO. Il 90% è nella norma, il 10% entro 2 dev.st. - Percezione della propria SALUTE
GENERALE. Il 62% è nella norna, il 33% entro 2 dev.st - VITALITA’. L’86% è nella norma,
il 14% entro 2 dev.st - ATTIVITA’ SOCIALI. Il 76% è nella norma, il 14% entro 2 dev.st, il
10% oltre 2 dev.st - RUOLO E STATO EMOTIVO. L’81% è nella norma, 9,5% entro 2
dev.st, 9,5% oltre 2 dev.st - SALUTE MENTALE. L’81% è nella norma, il 14% entro 2
dev.st, il 5% oltre 2 dev.st. SAT-P: - FUNZIONALITA’ PSICOLOGICA. Il 100% è nella
norma. - FUNZIONALITA’ FISICA. Il 76% è nella norma, il 24%entro 2 dev.st. - LAVORO
(e situazione economica). Il 90% è nella norma, il 10% è entro 2 dev.st – SONNO /
180

ALIMENTAZIONE/ TEMPO LIBERO. IL 100% è nella norma -
FUNZIONALITA’SOCIALE. Il 90% è nella norma, il 10% entro 2 dev.st.
La media del campione nella scala Diss di Sheean è di 2,41 ± 2,26. Ciò indica una leggera
interferenza dei problemi legati alla NPD con la vita quotidiana (nelle sfere relazionali,
familiari e lavorativa). La scala SVFSL, con media 70,14 ± 11,18, descrive un campione con
qualche difficoltà nel funzionamento sociale, lavorativo, che in generale funziona bene,
mantiene delle relazioni interpersonali significative. Vissuti depressivi: La Hamilton Rating
Scale for depression, con media 14,36 ± 5,20, evidenzia una forma depressiva lieve del
campione in esame. La scala Zung, con media 38,24 ± 8,26, rileva la volontà dei soggetti in
esame di attribuirsi dei vissuti depressivi piuttosto rilevanti. Da ciò è possibile dedurre una
buona consapevolezza e insight di patologia per ciò che concerne i vissuti depressivi da loro
esperiti.
Quote d’ansia libera: La Hamilton Anxiety Scale, con media 14,83 ± 7,48 (cut off di
Patologia =18), rileva una moderata quota d’ansia libera; mentre lo S.T.A.I, nelle sue
componenti ansia di stato con media 50,33 ± 9,24 (nella norma) e ansia di tratto con media
46,19 ±10,06 (nella norma),(norma con media 50 ± 10) mette in evidenza una scarsa
consapevolezza sui propri disturbi d’ansia da parte del campione e l’uso della negazione come
difesa psichica. Aspetti interpersonali: Dai risultati derivanti IIP32 su 20 pazienti (1 è risultato
non valido) si deduce che: il 40% dichiara di non avere nessuna difficoltà interpersonale (tra
quelle in esame), il 50% di riscontrarne una, il 5% 2 e il 5% 3. Tra le difficoltà riscontrate il
25% ha un problema con la necessità di mantenere un controllo sulla relazione con l’Altro; il
10% è troppo centrato su Sé stesso e propenso a vendicare i torti subiti, il 10% ha una
socialità piuttosto inibita; il 10% ha un problema di intrusività e di dipendenza con l’Altro; un
altro 10% tende ad annullare i propri bisogni e necessità per soddisfare l’Altro in tutto; il 5%
ha un atteggiamento poco risoluto, con scarsa fiducia in Sé stesso, un altro 5% è troppo
accomodante nelle relazioni (nessuno dichiara di avere un atteggiamento troppo freddo e
distante nella sua sfera interelazionale).
TCI: - RICERCA DELLA NOVITA’ Il 14% è sopra la media, il 67% è sotto la media (il
19% nella media) - EVITAMENTO DEL DANNO Il 33% è sopra la media (il 67% nella
media) - DIPENDENZA DALLA RICOMPENSA Il 5% è sopra la media, il 7% è sotto la
media (il 24% è nella media) - PERSISTENZA Il 10% è sopra la media, il 52% è sotto la
media (il 38% è nella media) - AUTODIRETTIVITA’Il 33% è sopra la media, il 38% è sotto
la media (il 29% è nella media) - COOPERATIVITA’ Il 10% è sopra la media, il 38% è sotto
la media (il 52% è nella media) - TRASCENDENZA Il 28,5% è sopra la media, il 43% sotto
la media (il 28,5% nella media). Inoltre esiste il rischio di presenza di disturbo di personalità
nel 29% dei casi, mentre non vi sono indicazioni di immaturità nel campione in esame.
CONCLUSIONE
Le conclusioni di tale studio sono ancora preliminari in quanto la borsa di studio utilizzata per
l’attuazione è stata erogata solo dal 1/7/2004; il campione finale dei pazienti. studiati sarà più
numeroso (27 pz.) e sarà espletato il colloquio restituivo. Dai dati raccolti finora sembra
comunque emergere la necessità di focalizzare l’attenzione terapeutica nell’ambito
dell’approccio riabilitativo anche sugli aspetti psicosociali ed emozionali allo scopo di
favorire un miglioramento generale della loro Qualità di Vita.
181

Mario De Marchi Filone tematico A2
Studio pilota di geni implicati nella suscettibilità al carcinoma prostatico
ASO S. Luigi
Struttura semplice dipartimentale di Genetica Medica
CONTESTO E RAZIONALE
Si ritiene che numerosi fattori predisponenti sia genetici sia non genetici giochino un ruolo
nell’insorgenza del carcinoma della prostata. Nonostante in studi sulla concordanza in coppie
di gemelli la componente di suscettibilità genetica sia risultata maggiore che in altri tumori
comuni quali in particolare il carcinoma del colon e della mammella, non è stato fino ad ora
possibile riconoscere geni maggiori di suscettibilità paragonabili a quelli che in queste
patologie consentono l’offerta di test genetici nelle famiglie ad alto rischio. Analisi di linkage
dei casi familiari ha definito svariate regioni di suscettibilità al carcinoma prostatatico, dette
HPC (Hereditary Prostate Cancer) localizzate su cromosomi diversi. La ricerca dei geni
coinvolti potrebbe da una parte contribuire alla conoscenza dei meccanismi che danno origine
alla malattia, e d’altra parte fornire marcatori molecolari informativi che, integrati al test PSA,
potrebbero migliorare la specificità dei programmi di screening e di diagnosi precoce. Il
primo gene come “candidato” nella suscettibilità al carcinoma prostatico, ELAC2, è stato
identificato nella regione HPC2 sul cromosoma 17p11 da Tavtigian et al.(2001). In questo
gene, la cui funzione non è nota, sono state identificate rare mutazioni ad alta penetranza in
famiglie ad alto rischio, mentre le due sostituzioni aminoacidiche Ser217Leu e Ala541Thr,
presenti con elevata frequenza nella popolazione, sono risultate associate con il carcinoma
sporadico solo in alcuni studi. Un secondo gene “candidato” è RNASEL, mappato nella
regione di suscettibilità HPC1 sul cromosoma 1q23-25. Esso codifica per la ribonucleasi L,
2’-5’-oligoadenilato-dipendente, un enzima espresso costitutivamente in forma latente, che
media la risposta del sistema 2’-5’ adenilato indotta dall’interferone, attivando funzioni
antivirali e proapoptotiche. Anche in questo gene sono state osservate mutazioni inattivanti in
singole famiglie ad alto rischio Il poliformismo comune Arg462Gln è stato oggetto di
numerosi studi di associazione con risultati contrastanti in popolazioni diverse. E’ comunque
significativa la dimostrazione di una ridotta attività funzionale a carico dell’allele 462Glu Per
quanto di nostra conoscenza, nessuno di questi polimorfismi è mai stato analizzato in pazienti
Italiani con carcinoma prostatico.
OBIETTIVO
Questo studio pilota si proponeva di:
1. attivare una collaborazione tra genetisti e urologi nel contesto interdisciplinare del Centro
Prostata costituito presso L’ASO S.Giovanni Battista, in vista dei successivo progetto
prospettico più esteso;
2. verificare la presenza e la frequenza dei polimorfismi comuni dei tre geni ELAC2,
RNASEL e MSR1 nella popolazione piemontese;
3. costituire una raccolta di campioni di DNA utile sia per futuri studi su nuovi geni di
suscettibilità.
MATERIALI E METODI
Dopo la fase di avvio nei primi mesi del 2004 il reclutamento dei casi è avviata in maniera
regolare nei diversi reparti di Urologia. Tutti i pazienti operati con diagnosi istologica di
182

carcinoma prostatico vengono informati sugli obiettivi della ricerca e viene loro proposto un
consenso informato. Sono stati a tutt’oggi raccolti campioni di sangue di più di 300 pazienti e
ne è stato estratto il DNA genomico. Come controlli della popolazione sono stati utilizzati i
campioni di DNA di 253 studenti di Medicina, che l’avevano volontariamente donato
consentendone l’uso per scopi di didattica e ricerca. Tutti i campioni sono codificati e raccolti
in osservanza delle norme sulla riservatezza dei dati genetici. In base ai dati più recenti della
letteratura, invariabilmente negativi, l’analisi del gene MSR1 è stata procrastinata. La
definizione del genotipo dei due polimorfismi RNASEL Arg462Gln e ELAC2 Ser217Leu è
stata effettuata mediante amplificazione con PCR e analisi DHPLC, usando l’apparecchiatura
WAVE della ditta Transgenomic nel laboratorio di Genetica medica presso l’ASO S.Luigi.
RISULTATI
Le frequenze geniche sono risultate: allele ELAC2 217Leu 0.28 nei pazienti e 0.315 nei
controlli (n.s.), allele RNASEL 462Gln 0.4386 nei pazienti e 0. 3682 nei controlli(X2.8,
p=0.033. Frequenze genotipiche ELAC2: SS 106 (49.1%), SL 99 (45.8%) e LL 11 (5.1%) tra
i pazienti, SS 95 (44,6%), SL 102 (47,9%) e LL 16 (7,5%) tra i controlli. RNASEL RR 69
(30,3%), RQ 118 (51.8%) QQ 41 (17,98%) tra i pazienti, e RR 100 (41,84%), RQ 102
(42,67%), QQ 37 (15.48%). Tali valori sono in equilibrio di Hardy-Weinberg per i due geni in
entrambi i gruppi. Mentre nel gene RNASEL l’allele 462 Gln dimostra una associazione
modesta ma statisticamente significativa, il polimorfismo ELAC2 non è risultato associato
con il carcinoma prostatico nella nostra popolazione. L’età di insorgenza non è risultata
correlata con il polimorfismo RNASEL Arg462Gln, mentre gli omozigoti per l’allele comune
217Ser nel gene ELAC2 avevano un’età media di insorgenza inferiore.
CONCLUSIONI
Questo studio pilota ha conseguito l’obiettivo di attivare la fattiva collaborazione tra i centri
coinvolti e di costituire una rccolta di campioni utili per studi successivi. I risultati
suggeriscono che il polimorfismo Arg462ln di RNASEL possa avere un ruolo modesto ma
significativo nella suscettibilità alla malattia, in parziale accordo con studi precedenti in
alcune popolazioni (Casey et al 2002, Wang et al 2002), mentre altri studi in diverse
popolazioni hanno osservato un’associazione negativa (Wang et al 2002, Nakazato et al
2003), ed altri ancora non hanno riscontrato deviazioni significative rispetto ai controlli
(Maier et al 2005, Wilklund et al 2005).
PUBBLICAZIONI
1. Van Duist MM, Penachioni J, Giachino D, Zitella A, Destefanis P, Graziano ME, Cracco
C, Scarpa R, Ferrando U, Fontana D, Tizzani A, De Marchi M “RNASEL Arg462Gln in
Italian Prostate Cancer patients: preliminary results” Presentato al 7° Congresso nazionale
della Società Italiana di Genetica Umana SIGU, Pisa 1-15 Ottobre 2004
2. M.M. van Duist, D. Giachino, A. Zitella, P. DeStefanis, M.E. Graziano, C. Cracco, R.
Scarpa, U. Ferrando, D. Fontana, A. Tizzani, M. De Marchi. “RNASEL Arg462Gln is
significantly associated with Prostate cancer in the Italian population” presentato alla
European Society of Human Genetics Conference, Praga 7-10 maggio 2005
3. Van Duist MM, Giachino D, Zitella A, Destefanis P, Graziano ME, Cracco C, Scarpa R,
Ferrando U, Fontana D, Tizzani A, De Marchi M “RNASEL Arg462Gln and ELAC2
polymorphisms in Italian Prostate Cancer: a progress report” Riassunto inviato all’8°
Congresso nazionale della Società Italiana di Genetica Umana SIGU, Cagliari, 28-30
Settembre 2005
183

Lucia Decastelli Filone tematico B1
Modello di valutazione dell’assicurazione della qualita’ dei risultati dei
laboratori di autocontrollo
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta
OBIETTIVO
L’obiettivo del progetto è stato la creazione di un modello di valutazione dell’assicurazione
della qualità dei risultati microbiologici dei laboratori di autocontrollo attraverso la creazione
di una check list che permetta la valutazione e l’individuazione di indicatori del corretto
funzionamento del laboratorio e della assicurazione qualità dei risultati microbiologici.
MATERIALI E METODI
La pianificazione è così articolata:
• creazione di una lista di riscontro idonea alla verifica del Sistema Qualità nei laboratori di
autocontrollo che effettuano analisi microbiologiche.
• Messa a punto di una lista di riscontro a partire da liste di riscontro di alcuni enti di
certificazione.
• Creazione di indicatori di efficacia.
• Discussione preliminare con i responsabili dei laboratori di autocontrollo sui contenuti
della stessa.
• Riesame del piano di validazione.
• Collaudo della lista con verifica in campo in laboratori che effettuano analisi
microbiologiche.
• Approvazione della lista di riscontro: “modello di valutazione dell’assicurazione della
Qualità dei laboratori di autocontrollo”.
Sono stati considerati come elementi in ingresso alla progettazione e allo sviluppo le
norme ISO e leggi vigenti rappresentate da:
- ISO 17025 “Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura”.
- ISO serie 9000.
- ISO 30012.
- ISO 1901.
- UNI 11097.
- D. lvo 155/97.
- D. lvo 120/92.
- Check list per la valutazione dei laboratori (SINAL).
- Lista di riscontro ORL
Al fine di creare gli indicatori di efficacia sono stati considerati i seguenti parametri
strutturali
• Qualificazione del personale,
• Adeguatezza strumentale.
• Sensibilità, specificità e accuratezza dei metodi di prova microbiologici utilizzati
(ufficiali, normati, con validazioni commerciali).
184

• Qualifica dei fornitori.
• Criteri di individuazione e di scelta dei reagenti impiegati.
• Adeguatezza dei locali e condizioni ambientali.
• Controllo delle attività non conformi.
• Prove interlaboratorio o di valutazione (accuratezza, ripetibilità, riproducibilità).
• Indicatori di efficacia.
Gli elementi in uscita dalla progettazione e dallo sviluppo sono rappresentati dall’
allestimento di una lista di riscontro così strutturata
REQUISITI GESTIONALI
- Organizzazione
- Sistema qualità
- Approvvigionamento di servizi e forniture
- Reclami
- Controllo delle registrazioni
REQUISITI TECNICI
- Personale
- Metodi di prova e validazione dei metodi
- Apparecchiature Riferibilità delle misure
- Campionamento
- Manipolazione dei campioni e degli oggetti sottoposti a prove
- Assicurazione della qualità dei risultati in accordo con quanto riportato nella ISO 17025
Sono stati identificati come fondamentali i seguenti indicatori:
• Rapporto costo/qualità prestazione delle prove di tipo microbiologico, sia qualitative che
quantitative.
• Incidenza positività per tipo di prova e matrice.
• Rapporto tra numero prove eseguite e quantitativo reagenti acquistati.
• Rapporto tra numero prove eseguite e Kg.
• Rifiuti Speciali smaltiti.
• Rapporto tra numero prove eseguite e personale addetto (abilitazioni e iter formativo).
• Rapporto tra numero accettazione e n. reclami dei clienti - Rapporto tra numero di prove e
percentuale di positività.
• Prove di confronto (circuiti di partecipazione, errori, prove interlaboratorio)
185

Paola Defilippi Filone tematico A2
Studio dell'adattore p130Cas nelle preneoplasie e nei tumori della
mammella: meccanismo molecolare e studio in vivo
Università degli Studi di Torino,
Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica
CONTESTO E RAZIONALE
La nostra ricerca, che coniuga l’esperienza di biologi cellulari e molecolari con le competenze
degli anatomo patologici e degli oncologi clinici, è incentrata sullo studio dell’espressione e
del significato molecolare della proteina p130Cas nell’insorgenza e nella progressione del
tumore alla mammella. L’adattatore p130Cas è una proteina ubiquitaria modulare identificata
come il maggior substrato fosforilato dei virus oncogeni v-Src e v-Crk. La struttura modulare
della proteina è caratterizzata da domini proteici che permettono l’aggancio con proteine della
trasduzione del segnale e la formazione di un complesso multi-molecolare coinvolto nella
proliferazione e nel movimento cellulare. Nel nostro laboratorio abbiamo dimostrato che nelle
cellule di carcinoma mammario T47D p130Cas si complessa con la chinasi c-Src ed è
coinvolto nell’attivazione della chinasi stessa in risposta agli estrogeni. La sovra-espressione
di p130Cas induce l’attivazione di c-Src e di vie di segnalazione a valle.
MATERIALI E METODI
In questo progetto abbiamo:
1. preparato e caratterizzato due anticorpi monoclonali contro p130Cas per l’uso diagnostico.
2. Iniziato lo studio dell’espressione della proteina p130Cas in immunoistochimica su
sezioni da biopsie di tessuto mammario sano e patologico.
3. Prodotto un modello murino di topi transgenici per la sovra-espressione di p130Cas nella
ghiandola mammaria: analisi dello sviluppo della ghiandola mammaria e dell’insorgenza
di tumori.
Preparazione degli anticorpi monoclonali: gli anticorpi monoclonali sono stati preparati nel
topo immunizzando gli animali con una proteina ricombinante rivolta contro il dominio
carbossi terminale della p130Cas. La proteina è stata preparata in due versioni:
• come prodotto di fusione con la Glutatione-S-Transferasi (GST), purificata su colonna di
glutatione ed usata per l’immunizzazione,
• come prodotto di fusione con la Maltose Binding Protein (MBP), purificata su colonna di
maltoso ed usata per lo screening ELISA dei cloni positivi.
Abbiamo sinora caratterizzato due anticorpi specifici per p130Cas (mAb 1H9 e mAb 9D5),
che abbiamo utilizzato nella messa a punto dello screening delle biopsie umane. I due cloni da
noi prodotti (1H9 e 9D5) sono stati confrontati ad un anticorpo commerciale p27820 con
risultati assolutamente paragonabili. Inoltre la specificità e stata testata su cellule ECV304
(campione positivo) e MEF da Cas-/- (controllo negativo) coltivate in vitro, staccate con
tripsina, centrifugate, fissate in formalina e incluse in paraffina. Le sezioni sono state colorate
con l’anticorpo anti p130Cas 9D5 a 10 microgrammi/ml seguito da reazione PAP. La
mancanza di segnale nelle cellule p130Cas -/- dimostra la specificità dell’anticorpo.
186

Utilizzo degli anticorpi monoclonali anti p130Cas per l’analisi di biopsie tumorali. In
collaborazione con la Prof.ssa A. Sapino abbiamo iniziato a valutare l’espressione di p130Cas
con metodiche di immunoistochimica utilizzando l’anticorpo 9D5 su tessuti fissati e inclusi
paraffina. Abbiamo finora valutato 100 biopsie da: mammelle umane normali in varie fasi di
sviluppo mammelle con patologia benigna non evolutiva (fibroadenomi/ ectasie duttali)
mammelle con patologia benigna proliferativa/preneoplastica (iperplasie) carcinomi mammari
di diverso grado istologico ed istotipo ed evoluzione La casistica è in via di valutazione
retrospettiva sul follow-up delle pazienti oncologiche.
Preparazione del modello di topi transgenici: il cDNA codificante per la p130Cas murina è
stato inserito a valle del promotore del Mouse Mammary tumor virus (MMTV), che veicola
specificamente l’espressione della proteina nella ghiandola mammaria. Per distinguere la
proteina esogena da quella naturale del topo, è stata inserita nel cDNA una corta sequenza di
12 aminoacidi corrispondente all’epitopo Myc riconosciuto da un anticorpo specifico, già
disponibile in laboratorio. Da una prima microiniezione del costrutto si sono generate due
linee di topi espressori, che sono in via di definizione. Le ghiandole mammarie di topoline
transgeniche sono state sezionate al terzo giorno di allattamento. Il tessuto è stato
omogeneizzato e le proteine estratte in soluzione denaturante ed analizzate per SDS-PAGE
elettroforesi e western blot con anticorpi anti myc per valutare l’espressione del trangene.
Nella figura sono indicate tre linee indipendenti che sovra-esprimono p130Cas a livelli
diversi.
Caratterizzazione del fenotipo transgenico: il promotore MMTV è attivo nella ghiandola
mammaria in fasi specifiche: a partire dal 12 giorno di gravidanza, con un picco al terzo
giorno di allattamento, mentre l’espressione si spegne con l’involuzione della ghiandola al
termine dell’allattamento. A questo punto del progetto le femmine delle linee positive sono
state valutate al 3° giorno dopo il parto. Le ghiandole prelevate sono state analizzate per
inclusione in “whole mount” per l’analisi della struttura complessiva dei lobuli epiteliali e
montate in paraffina per l’analisi per immunoistochimica dell’espressione e della
localizzazione di p130Cas e di vari marcatori proliferativi e di apoptosi.
RISULTATI
I risultati di questa prima analisi indicano che i topi transgenici per la proteina p130Cas
presentano un’estesa iperplasia epiteliale. La sovra espressione di p130Cas altera quindi il
profilo di proliferazione dell’epitelio ghiandolare. Ulteriori studi sono in corso per l’analisi
biochimica e immunoistochimica di marcatori di proliferazione.
PUBBLICAZIONI
Cabodi S., Tinnirello A., Di Stefano P., Bisaro B., Ambrosin E, Castellano I., Sapino A.,
Arisio R., Cavallo F., Forni G., Glukhova M., Turco E., Silengo L., Altruda F., Turco E.,
Tarone G. and Defilippi P. p130Cas as a new regulator of mammary epithelila cell
proliferation, survival and HER2-Neu oncogene dependent breast tumorigenesis in via di
accettazione sulla rivista internazionale Cancer Research
187

Maurizio Degiuli Filone tematico C1
Gastrectomia D2 VS D1 nel trattamento del carcinoma gastrico. studio
prospettico multicentrico randomizzato
ASO S. Giovanni Battista
The disadvantages of D2 gastrectomy have been mostly related to splenopancreatectomy.
Unlike two large European trials, the MRC and the Ducth trials, we have recently showed the
safety of D2 dissection with pancreas preservation in a one-arm phase I-II trial. This new
randomised trial was set up to compare postoperative morbidity and mortality and survival
after D1 and D2 gastrectomy among the same experienced centres that participated into the
previous trial.
In a prospective multicenter randomised trial, D1 gastrectomy was compared to D2
gastrectomy. Central randomisation was performed following a staging laparotomy in 253
patients with potentially curable gastric cancer. Findings Of 253 patients randomised, 116
were allocated to D1 and 137 to D2 gastrectomy. The two groups were comparable for age,
sex, site, TNM stage of tumours, and type of resection performed. In particular, the average
age was 64,21 and 61.65 in D1 and D2 patients respectively; D1 and D2 groups tumors were
located in upper, medium and distal stomach in 10.3 and 9.8 %, 22.4 and 24.0 and 67.2 and
64.9 % of the cases. There was a large amount of T1 tumors, which accounted for 38.8% of
D1 pts and 27.0% of D2 patients. This difference was significant. Also the distribution of T2
cases was significant different in the two groups of patients, being 41.6 % in D2 and 30.1 %
in D1 patients. The type of gastrectomy performed was depending on the location of tumors;
about 25% of patients in both arms received a total gastrectomy while the remnant 75% had a
subtotal gastrectomy. The overall postoperative morbidity rate was 15.01%. Complications
developed in 12.06% of patients after D1 and in 17.51% of patients after D2 gastrectomy.
This difference was not statistically significant (p

Marcello Dei Poli Filone tematico A2
Espressione di Endoglina come fattore di rischio di recidiva nel
carcinoma dell'esofago
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Fisiopatologia Clinica
CONTESTO E RAZIONALE
La prognosi del cancro dell’esofago è solitamente infausta, con una sopravvivenza a 5 anni
inferiore al 10%. La terapia d’elezione è quella chirurgica. Tuttavia la recidiva è la principale
causa di insuccesso. Si valuta che circa il 70% dei pazienti, dopo resezione completa,
sviluppino rapidamente un tumore secondario e di questi il 75% muoia entro due anni. Dal
punto di vista biologico, l’aggressività della neoplasia può dipendere dalla capacità, -
precocemente acquisita- della cellula trasformata di staccarsi dal tumore primario, di entrare
nel torrente circolatorio e di migrare, dando origine a metastasi a distanza. Studi sperimentali
hanno dimostrato che la formazione di nuovi vasi è un fenomeno cruciale negli stadi iniziali
della cancerogenesi, intimamente correlato con la progressiva crescita e diffusione tumorale.
Recentemente è stato dimostrato che l’endoglina o CD105 (una glicoproteina omodimerica di
membrana capace di legare con alta affinità due isoforme del Transforming Growth Factor
beta1 e beta3), è preferenzialmente espressa dalle cellule endoteliali attivate o proliferanti, ma
non da quelle quiescenti dei vasi precostituiti. Pertanto questa caratteristica dell’endoglina
offre l’opportunità unica di valutare con maggior accuratezza l’angiogenesi associata e indotta
dalla neoplasia, rispetto a marcatori panendoteliali come CD34.
OBIETTIVO
Il progetto di ricerca si proponeva di valutare l’espressione dell’endoglina, in confronto a
quella di CD34, in pazienti affetti da carcinoma dell' esofageo, mettendo in relazione lo studio
biomolecolare di questa proteina con l’andamento clinico della malattia al fine di stabilire il
suo valore come indicatore di rischio di recidiva.
MATERIALI E METODI
Sono stati studiati 47 casi di carcinoma dell’esofago (22 squamosi e 25 adenocarcinomi). Le
caratteristiche clinicopatologiche dei pazienti sono riassunte nella Tabella 1. La durata del
follow-up era compresa dalla data dell’intervento alla morte, alla fuoriuscita dallo studio o a
giugno 2005. In questo lasso di tempo il 64.8% dei pazienti sono deceduti: di questi il 79.2%
a causa della malattia e 20.8% per altre cause. 13 pazienti (27.6%) erano viventi liberi di
malattia, ma 3 di questi (23.1%) hanno sviluppato una recidiva durante il periodo di follow
up.
RISULTATI
L’analisi biomolecolare quantitativa eseguita mediante real-time RT-PCR, su campioni di
tessuto neoplastico prelevati durante l’intervento chirurgico, ha dimostrato una
iperespressione del trascritto per l’endoglina (fattore di iper-regolazione di 2,19) rispetto alla
mucosa dell’esofago normale di controllo (p

tra i due tipi istologici del tumore (fattore di iper-regolazione per gli adenocarcinomi = 2,31;
fattore di iper-regolazione per i carcinomi a cellule squamose = 2,07, p>0,05). E’ da notare
che nella mucosa adiacente il tumore, il fattore di iper-regolazione sale, rispettivamente, a 3,4
per gli adenocarcinoma e a 3, 31 per i carcinomi a cellule squamose. L’analisi
immunoistochimica ha evidenziato che le cellule neoplastiche non esprimono né CD34 né
CD105. Nei tessuti neoplastici, solo un piccolo sottogruppo di microvasi (valutati al
microscopio ad ingrandimento 200x come numero medio/ mm2, dopo selezione di aree ad
elevato grado di vascolarizzazione“hot spots”) è risultato esprimere CD105 nell’86% dei casi,
mentre tutti i microvasi esaminati in sezioni consecutive hanno mostrato positività per
l’anticorpo anti-CD34. Il valore mediano di microvasi marcati è stato di 5/mm2 (range: 15-0)
per l’anticorpo anti-CD105 e di 16,33/mm2 (range: 32.33-6) per l’anticorpo anti-CD34. In
particolare, CD34 è risultato espresso su piccoli e grandi vasi con aspetto sinusoidale, mentre
le gemmazioni endoteliali ed i piccoli vasi preferenzialmente vengono marcati con anti-
CD105. In entrambi i tipi di tumori i pattern di localizzazioni sono simili. Esiste una
correlazione significativa fra i valori di microvasi esprimenti CD105 e i microvasi esprimenti
CD34 osservati (adenocarcinomi: p=0.042, r=0.544; carcinomi a cellule squamose: p=0.046,
r=0.556, test di Spearman), anche se il numero di microvasi/mm2 marcati era
significativamente più basso per l’anticorpo anti-CD105 rispetto all’anticorpo CD34
(Wilcoxon signed-rank test, p

Vittorio Demicheli Filone tematico D4
Revisione sistematica sull’efficacia e sicurezza della vaccinazione
antinfluenzale degli anziani e dei bambini
Asl 20 – SeREMI
MATERIALI E METODI
La ricerca è stata svolta seguendo la metodologia delle revisioni sistematiche adottata dalla
Cochrane Collaboration. Sono stati inclusi studi randomizzati, quasi-randomizzati, studi di
coorte e caso-controllo. E’ stata valutata la efficacia della vaccinazione dei bambini con
qualsiasi vaccino antinfluenzale (indipendentemente da dose, ciclo o preparazione)
confrontato con placebo o con nessun intervento. Le misure di risultato sono i casi di
sindrome influenzale definiti clinicamente, i casi clinici di influenza confermati con diagnosi
di laboratorio, i morti, i ricoveri ospedalieri e le complicazioni dovute all'influenza; inoltre
misure di impatto (giornate lavorative perdute, visite mediche, ecc.).
Sono state esaminate le seguenti banche di dati: Cochrane Library (contenente: The Cochrane
Database of Systematic Reviews; The NHS Database of Abstracts of Reviews of
Effectiveness; The CENTRAL/Cochrane Controlled Trials Register) Medline (OvidWeb
1969- oggi) EMBASE (Dialog 1974-1979; SilverPlatter 1980-oggi) Biological Abstracts
(SilverPlatter 1969-oggi) Science Citation Index (Web of Science 1974-oggi) Utilizzando le
seguenti combinazioni di parole chiave: - INFLUENZA-VACCINE; VACCINES;
VACCINATION; IMMUNIZATION - CROSS-OVER STUDIES; INTERVENTION-
STUDIES; latin square or factorial MULTICENTER-STUDY - COHORT STUDIES; CASE-
CONTROL STUDIES; PROSPECTIVE STUDIES; LONGITUDINAL STUDIES - Adverse
events Or Adverse (tw) near (effect* (tw) or event* (tw)) Or side effect* (tw) or
hypersensitiv* (tw) or sensitiv* (tw) or safe* (tw) or pharmacovigil* (tw) or explode Product-
Surveillance-Postmarketing (mh) or Drug-Monitoring (mh) or Drug-Evaluation (mh) or
explode Risk (mh) or Odds-Ratio (mh) or explode Causality (mh) or relative risk (tw) or risk
(tw) or causation (tw) or causal (tw) or odds ratio (tw) or etiol* (tw) or aetiol* (tw) or etiology
(fs) or epidemiology (fs) Le ricerche hanno considerato tutte le lingue. Al fine di identificare
altri studi, anche non pubblicati, sono inoltre stati consultati: Pubmed related articles; The
Vaccine Adverse Event Reporting System website; i produttori di vaccini elencati
dall'Organizzazione Mondiale della Sanità, gli autori degli studi e ricercatori attivi in materia.
RISULTATI
Le ricerche elettroniche hanno prodotto 1204 titoli di studi che sono stati esaminati in base ai
contenuti del riassunto. 125 lavori sono stati recuperati ed esaminati globalmente perché
potenzialmente includibili. 100 lavori sono stati esclusi (nel 44% dei casi per l’assenza di
gruppi di confronto).
Sono stati inclusi 14 RCT, uno studio sulla vaccinazione intraepidemica, 8 studi di coorte e
uno studio caso- controllo, 8 degli studi inclusi sono stati tradotti dal russo. Dei 14 RCT, 11
utilizzano il confronto con placebo e 3 il confronto con nessun intervento; 7 utilizzano vaccini
viventi attenuati, 2 il vaccino inattivato e 5 entrambi. Degli otto studi di coorte 2 usano il
confronto con placebo e 6 il confronto con nessun intervento. Solo uno studio valuta il
vaccino vivente.
L’unico studio caso-controllo incluso valuta il vaccino inattivato.
191

Sono state identificate le seguenti misure di risultato: influenza, sindrome influenzale, sintomi
respiratori, casi secondari, assenze scolastiche, otite media acute e giornate di ricovero.
Due studi sperimentali sono di elevata qualità metodologica, 9 hanno randomizzazione
adeguata, 6 hanno un buon mascheramento dell’allocazione e 8 documentano le perdite al
follow-up.
Coorti e caso controllo sono realizzati in modo adeguato e ben riportati.
Efficacia della vaccinazione: la capacità di evitare l’influenza confermata è pari al 79% per i
vaccini attenuati e 65% nei vaccini inattivati. Nessuna evidenza di efficacia è disponibile per i
bambini di meno di due anni d’età. Uno studio di coorte mostra 44% di efficacia per i vaccini
viventi e 64% per i vaccini inattivati sotto i sei anni d’età.
Efficacia di popolazione: la capacità di evitare la sindrome influenzale è pari a 39% nei
vaccini viventi e 28% negli inattivati. Nessuna evidenza di effetto sotto i due anni di età. Gli
studi di coorte mostrano nessuna efficacia di popolazione per i viventi e 52% per gli inattivati.
Nessuna evidenza sotto i due anni d’età.
Misure di impatto: il vaccino si rivela più efficace del placebo nel ridurre le assenze
scolastiche, sulla base dei risultati di un singolo studio. Nessuna altra misura di impatto si
rivela significativa.
L’esclusione degli studi in lingua russa modifica in modo non significativo i risultati e non
influisce sulle conclusioni. Non esistono ragioni per ritenere che i vaccini prodotti nell’ex
URSS fossero differenti da quelli occidentali e questo è dimostrato anche dall’unico studio
che confronta direttamente i due tipi di vaccino.
Lo studio d’uso intraepidemico del vaccino rivela una significativa differenza di incidenza nei
due bracci.
CONCLUSIONI
La revisione mostra una significativa differenza tra l’elevata efficacia teorica e la bassa
efficacia di popolazione dei vaccini antinfluenzali e limitate evidenze di impatto sulle altre
misure di risultato. Anche se l’impatto dell’influenza su questa fascia di età appare rilevante le
prove di efficacia disponibili non sono sufficienti per raccomandare la vaccinazione
universale dei bambini.
192

Paola Di Giulio Filone tematico C2
Studio prospettico sull'appropiatezza dei ricoveri in hospice
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica
CONTESTO E RAZIONALE
In Regione Piemonte esistono 4 Hospice, due a gestione pubblica e 2 privata, per un totale di
40 posti letto. L’Hospice dovrebbe rappresentare una delle tappe del percorso del paziente e
non necessariamente la struttura di ricovero finale, dove il paziente accede perché non più
gestibile in ospedale o a domicilio. Una recente indagine su un campione di 54 strutture di
cure palliative sul territorio nazionale ha fatto emergere come il 17% dei pazienti muoiano
entro una settimana dalla prima presa in carico da parte del servizio (Peruselli et al, 1999).
Questi dati fanno sospettare un uso inappropriato di questi servizi, che dovrebbero invece
costituire uno dei momenti di una presa in carico programmata.
OBIETTIVI
1. Descrivere la tipologia dei pazienti che hanno accesso all’hospice;
2. documentare entro quanto tempo avviene il decesso dal momento del ricovero;
3. descrivere il percorso curativo-assistenziale nei 2 mesi precedenti (precedenti ricoveri,
assistenza in ADI, Cure palliative etc);
4. identificare i motivi del ricovero in hospice e da chi questo è stato suggerito.
MATERIALI E METODI
I dati sono stati raccolti negli Hospice del Piemonte, su tutti i nuovi ingressi, per un periodo
minimo di 2 mesi, tramite intervista al caregiver e/o al paziente, entro 3 giorni dall’ingresso,
non appena le condizioni lo consentivano; quando necessario, sono state consultate le cartelle
cliniche. Sono stati raccolti i seguenti dati: dati anagrafici sul paziente; motivo di accesso;
condizioni generali (ADL); precedenti ricoveri negli ultimi 2 mesi; situazione assistenziale a
domicilio (MMG e numero di accessi; ADI, altre forme di assistenza); principali difficoltàproblemi
a domicilio; controllo dei sintomi; conoscenze ed aspettative rispetto al ricovero in
Hospice. Consenso e privacy. Le schede d raccolta dati, anonime, sono state analizzate
centralmente, e cumulativamente senza fare riferimento al singolo paziente.
RISULTATI
I dati sono stati raccolti per 3 mesi (novembre-febbraio) nell’Hospice di Torino (FARO) e per
2 mesi (giugno e luglio) negli Hospice di Biella e Busca. Sono stati intervistati
rispettivamente 100 pazienti (46, 29 e 25). La metà delle interviste (47) sono state fatte
direttamente al paziente. Le caratteristiche del campione sono riportate nella tabella 1.
L’età media degli uomini era di 69.5 anni, mentre per le donne di 72.9 anni.
Caratteristiche dei 100 pazienti:
193

Tabella 1:
Caratteristiche dei 100 pazienti N°
uomini 55
donne 45
età media in anni 71
età media in anni (range 38-97) 36
vive solo
Sede della neoplasia
Polmone
Colon-retto
Cavo-orale
Altro
Presenza di metastasi 70
Condizioni cliniche
pessime (Norton 4-8) 17
scadente (Norton 9-12) 32
discrete (Norton 13-16) 31
buone (Norton 17-20) 20
Per la quasi totalità dei pazienti (97) l’attuale ricovero era il primo in Hospice.
40 pazienti provenivano dal domicilio, 8 da una struttura di lungodegenza (RSA) e 52
dall’ospedale. Tra i 40 pazienti seguiti a domicilio 11 erano in carico ad un’Unità di Cure
Palliative. Nei 3 mesi precedenti il ricovero in Hospice, 68 pazienti sono stati ricoverati: 48
una volta (70.5%); 15 2 volte (22%) e 2 pazienti rispettivamente 3 o 4 volte. La media
complessiva delle giornate di ricovero, indipendentemente dal numero dei ricoveri è di 27
giorni (22 per chi è stato ricoverato una sola volta). Il motivo prevalente di ricovero era la
situazione familiare/abitativa (47%) ed il controllo dei sintomi (28%). In quasi la metà dei
casi (46%) il ricovero è stato consigliato dal medico referente del reparto/day hospital di
provenienza. Solo in 19 casi è stato consigliato dal Medico di Medicina Generale. Medici,
infermieri o personale della RSA hanno segnalato il paziente alla segreteria dell’hospice in 46
casi, mentre la telefonata è stata eseguita da uno dei familiari in 14 casi e solo 16 casi sono
stati segnalati dal MMG. 81 pazienti sono deceduti in hospice. Il loro ricovero in hospice è
durato da 0 giorni per 3 pazienti provenienti dall’ospedale, a 90 giorni (media 16gg). Dei 55
pazienti che hanno espresso le proprie aspettative: 30 desideravano stare meglio per poter
tornare a casa, 11 che venissero controllati i sintomi. 2 che il ricovero potesse sollevare i cari
dall’assistenza e 1 di morire con dignità e11 di guarire per poter tornare a casa. Dei 35
familiari che hanno espresso le proprie aspettative, 14 si aspettavano di avere un aiuto
nell’assistenza, 8 che venissero controllati meglio il dolore e la sofferenza anche psicologica,
6 desideravano un miglioramento delle condizioni generali del proprio caro; 7 che il loro caro
venisse seguito in maniera più professionale e umana, rispetto ai precedenti ricoveri
ospedalieri.
CONCLUSIONI
Anche se su un campione limitato, e generalizzabile alla sola realtà regionale, il lavoro mette
in luce alcuni aspetti originali ripetto alle conoscenze sul tema. Il campione di pazienti può
essere considerato rappresentativo rispetto ai pazienti ricoverati negli hospice partecipanti. Le
condizioni dei pazienti al ricovero non sono sempre scadenti: 51 pazienti sono in condizioni
discrete/buone. Le condizioni dei pazienti possono variare durante il decorso e lo stesso
ricovero, come anche l’eleggibilità al ricovero.
194
20
18
11
51

E’ innegabile l’importanza e l’utilità di questo tipo di ricovero: infatti l’effetto negativo sulla
famiglia delle cure di un congiunto in fase terminale è stato ampiamente documentato, come
anche l’effetto positivo di un sostegno nelle cure. La maggioranza dei pazienti viene inviata in
hospice dall’ospedale. Il consiglio e la segnalazione del ricovero vedono coinvolte più figure:
va ulteriormente indagatolo scarso coinvolgimento del MMG che consiglia il ricovero ed
effettua la segnalazione solo in 1/3 dei pazienti assistiti a domicilio. I pazienti continuano ad
essere inviati in hospice molto tardi: il dato era già noto in letteratura e documentato sia
nazionale che internazionale; spesso le famiglie non sono consapevoli del ritardo.
I pazienti considerano l’hospice un luogo di cure specialistiche: infatti 41 desideravano
ottenere un maggior controllo dei sintomi per poter tornare a casa. Lo stesso desiderio è
condiviso anche dalla maggioranza dei familiari. Desta un certo stupore il fatto che 11
pazienti affermino di voler guarire per poter tornare al proprio domicilio. Domandare a
pazienti e parenti le aspettative sul ricovero è un aspetto molto delicato e richiederebbe
interviste approfondite.
195

Marco Di Monaco Filone tematico A4
Vitamina D e recupero funzionale dopo frattura prossimale di femore
Presidio Sanitario San Camillo
UO Malattie Osteometaboliche
CONTESTO E RAZIONALE
In via preliminare è stata valutata la correlazione tra tassi circolanti di 25-idrossivitamina D e
autonomia nelle attività di base di vita quotidiana determinata mediante indice di Barthel,
dimostrando la presenza di una correlazione positiva significativa tra le due variabili,
indipendente da numerosi fattori confondenti ad analisi multivariata.
Un ruolo di rilievo è stato osservato anche per i livelli circolanti di ormone paratiroideo, che
risultano inversamente associati al punteggio Barthel indipendentemente dai tassi circolanti di
vitamina D: l’ipovitaminosi D agirebbe sfavorevolemnte sul recupero dell’autonomia
personale sia direttamente sia indirettamente, tramite l’iperparatiroidismo secondario.
L’azione di vitamina D e paratormone è verosimilmente mediata dagli effetti che i due ormoni
esercitano sul tessuto muscolare, la cui performance è ottimale in presenza di adeguati livelli
di vitamina D e bassi livelli di paratormone. L’azione sul muscolo non si realizza attraverso
variazioni della massa muscolare, parametro che non condiziona i livelli di autonomia
personale negli anziani dopo frattura di femore e che non correla con i livelli circolanti di
vitamina D e paratormone, ma attraverso variazioni “qualitative” del muscolo.
OBIETTIVO
Il nostro trial d’intervento si proponeva di valutare l’efficacia di una precoce correzione del
deficit di vitamina D nel migliorare la forza muscolare e il recupero dell’autonomia personale
in un campione di donne anziane con frattura prossimale di femore (il campione comprendeva
100 donne, randomizzate a ricevere o non ricevere il trattamento precoce con vitamina D per
os in aggiunta all’usuale protocollo di rieducazione intensiva di post acuzie).
METODI E RISULTATI
I risultati mostrano come la precoce correzione del deficit di vitamina D non abbia indotto
variazioni significative nè della forza muscolare (forza dell’handgrip misurata con
dinamomemtro) nè dell’autonomia personale (indice di Barthel). Alcune considerazioni
possono essere utili per interpretare il dato. Innanzitutto si sono incontrate difficoltà nella
determinazione della forza muscolare del cingolo pelvico e degli arti inferiori. L’analisi dei
risultati della misura della forza muscolare ha mostrato l’elevato errore di precisione
dell’esame (con coefficiente di variazione > 20%), verosimilmente come conseguenza
dell’interferenza esercitata sulla forza loco regionale da fattori legati alla recente frattura
(dolore, strategie di mobilizzazione). Si è scelto allora di basare lo studio sulla determinazione
della forza dell’handgrip, che ha mostrato un basso coefficiente di variazione (=3%), ma
l’impossibiltà di ottenere misure affidabili della forza nei distretti di maggiore interesse è
sicuramente un limite maggiore dello studio.
Del resto, anche variazioni di forza muscolare dei distretti di maggiore interesse potrebbero
non tradursi in modificazioni dell’autonomia personale, come ho mostrato in una recente
196

evisione sistematica. Ciò in accordo con la complessità dei fattori che condizionano sia la
performance muscolare, sia, in modo indipendente dalla performance muscolare, l’autonomia
personale. Bisogna poi tenere conto della breve durata dello studio, che può avere impedito di
rilevare effetti significativi della correzione del deficit di vitamina D. Del resto in letteratura i
trials d’intervento condotti somministrando vitamina D non hanno dato risultati univoci in
termini di miglioramento della forza muscolare, di miglioramento di perform ance e di
riduzione del rischio di caduta.
CONCLUSIONI
In conclusione i nostri dati di tipo osservazionale suggeriscono un ruolo della deplezione di
vitamina D sia diretto, sia tramite l’induzione di iperparatiroidismo secondario, nel favorire la
perdita di autonomia personale dopo frattura di femore. Tuttavia i dati del trial di intervento
non hanno potuto confermare l’utilità della precoce correzione del deficit nel migliorare forza
muscolare e abilità funzionale delle pazienti. Le dosi utilizzate per il trattamento, la durata
dello studio nel tempo e i parametri valutati andranno rivisti in studi futuri.
PUBBLICAZIONI
1. Di Monaco M et al: SERUM LEVELS OF 25-HYDROXYVITAMIN D AND
FUNCTIONAL RECOVERY AFTER HIP FRACTURE. Arch Phys Med Rehabil 86: 64-
68, 2005.
2. Di Monaco M et al: 25-HYDROXYVITAMIN D, PARATHYROID HORMONE, AND
FUNCTIONAL RECOVERY AFTER HIP FRACTURE IN ELDERLY PATIENTS. J
Bone Miner Metab 24, 2006, in stampa.
3. Di Monaco M et al: MUSCLE MASS AND FUNCTIONAL RECOVERY IN HIP-
FRACTURE WOMEN. Am J Phys Med Rehabil 85, 2006, in stampa.
4. Di Monaco M: FACTORS AFFECTING FUNCTIONAL RECOVERY AFTER HIP
FRACTURE IN THE ELDERLY. Critical Reviews in Physical and Rehabilitation
Medicine, M. Grabois, E.J. Henley Eds, Begell House Ed, New York, NY, USA, 16: 151-
176, 2004.
197

Giovanni Di Perri Filone tematico C1
Ruolo dei test rapidi per HIV e lue associati all'approccio sindromico in
una popolazione a rischio di MST
Università degli Studi di Torino
Clinica Malattie Infettive
CONTESTO E RAZIONALE
Nell’Unione Europea, Italia compresa, dalla metà degli anni ’90 l’incidenza delle Infezioni
Sessualmente Trasmissibili (IST), soprattutto gonorrea, sifilide e Chlamydia è aumentata in
modo significativo. La maggior parte dei casi è concentrata nei soggetti giovani, minoranze
etniche e omosessuali maschi. Tali aumenti d’incidenza si stanno verificando nel quadro di un
continuo aumento dei casi di infezione da HIV, per la quale la trasmissione sessuale è sempre
più importante e non accenna a calare. In questo contesto sono di cruciale importanza:
• nelle patologie curabili diagnosi e terapia più rapide possibili per interrompere la catena di
contagio;
• l’educazione sanitaria ed il counselling associato alla eventuale cura per l’infezione da
HIV.
OBIETTIVI
Obiettivi finali dello studio sono stati:
1. la valutazione del ruolo e della validità delle tecniche immunocromatografiche rapide
(TR) (Determine Sifilide TP e Determine HIV (Abbott Laboratories, Chicago, USA) per
la diagnosi di lue ed HIV in soggetti a rischio;
2. la valutazione dell’applicabilità di tali metodiche come test di screening all’interno dei
servizi erogabili da una struttura sanitaria di base dedicata alla prevenzione, diagnosi e
cura delle IST.
METODI E RISULTATI
Sono stati analizzati i sieri (in parte stoccati, in parte prelevati direttamente) di 94 persone
esaminate presso l’Ambulatorio IST della Clinica Universitaria – Ospedale Amedeo di Savoia
– per patologia ulcerativa genitale o per altri segni dermatologici o per contatto con luetici. In
questo campione sono rappresentati sia omosessuali maschi, sia persone che si prostituiscono,
identificati come target negli obiettivi iniziali del progetto. La prevalenza di lue primosecondaria
nella popolazione studiata è stata del 63% (59 pazienti: numero attesi = 20 circa!)
mentre l’infezione da HIV era già nota o è stata diagnosticata nel 32% dei casi; due casi erano
prime diagnosi (attesi = 3).
28 soggetti erano affetti da patologia ulcerativa genitale o altre lesioni dermatologiche 7 erano
contatti di soggetti luetici. La validità dei TR per sifilide ed HIV è risultata molto buona
(TPPA ed ELISA HIV sono stati assunti a test di riferimento), essendo sensibilità (Se) e
specificità (Sp) assai vicine ai dati elaborati dall’OMS. I risultati dubbi sono stati considerati
come falso positivo nel caso del gruppo di controllo e come falsi negativi nei tre casi del
gruppo dei pazienti luetici. Per la sierologia HIV, i due risultati border line sono stati
considerati come falsi positivi.
198

Nel gruppo in studio di sintomatici ad alto rischio i TR possono essere considerati un valido
strumento diagnostico. La loro applicabilità nella routine di un centro IST può essere
seriamente presa in considerazione in quanto:
• sono test molto rapidi (diagnosi in 15 minuti contro 4-24 ore ordinarie).
• Non richiedono attrezzature complicate o costose.
• Non richiedono particolare abilità: la lettura era perfettamente concordante tra gli
esecutori.
• L’accettabilità da parte dei pazienti è molto buona.
I risultati del TR per lue sono stati ottimi anche nelle fasi più precoci dell’infezione, mentre la
percentuale di risultati negativi del test RPR è stata del 23.3% nei soggetti affetti da lue
primo-secondaria. Tutti i risultati del test ELISA per HIV sono stati correttamente identificati
dal test immuno-cromatografico. Da segnalare che i due pazienti con la prima diagnosi di
sieropositività per HIV erano entrambi luetici in stadio primo-secondario. Analogamente a
quanto viene segnalato dalla letteratura, tutti e tre i risultati dubbi al test rapido nel gruppo dei
luetici sono stati ottenuti in maschi con sifilide secondaria, due dei quali sieropositivi per
HIV.
Considerando i punti di cui sopra riteniamo pertanto raggiunti i seguenti obiettivi del progetto:
1. riduzione rilevante dei tempi di diagnosi.
2. Diminuzione degli errori di diagnosi differenziale.
3. Diminuzione dei tempi d’accesso ai trattamenti successivi (= immediati) con riduzione
della contagiosità e quindi dei casi secondari.
Gli aspetti negativi del TR sono stati:
1. nel test per lue si è osservata una discreta labilità della banda del paziente mentre il
controllo interno è buono; nel TR per HIV le bande sono d’ottima visibilità. La
coinfezione HIV-Lue può interferire col risultato del test per Lue.
2. Una discreta quota di persone con ulcera genitale aveva anche una patologia erpetica: il
solo ricorso ai test rapidi rischia di far sottovalutare altre diagnosi.
3. Costo troppo elevato: oltre 10-15 volte il costo dei test tradizionali.
Applicando i nostri valori di Se e Sp ad un gruppo di 1261 pazienti IST osservati (anni 2003-
2004: prevalenza di lue = 12%; infezione da HIV =8%) si ottiene:
TR sifilide: VPP = 70% e VPN = 99%; TR HIV:VPP = 73% e VPN = 100%.
Usando gli stessi valori di Se e Sp del TR applicati ad un’ipotetica popolazione di 100.000
donatori abituali di sangue italiani (prevalenza di positività del TPHA =0.12% e prevalenza da
HIV = 0.013%) i risultati sarebbero i seguenti:
TR lue: VPP = 2% e VPN = 99.9% - TR HIV VPP = 4% e VPN = 100%.
Se può essere considerata la loro applicabilità a fini diagnostici in popolazione a media
prevalenza, tuttavia l’uso come test di screening in popolazioni a bassa prevalenza deve essere
attentamente valutato per i costi indotti dal notevole numero di test di conferma richiesti.
L’elevato costo dei test pone inoltre un serio dubbio al loro utilizzo su vasta scala. La
fornitura del microscopio per la diagnosi diretta di lue da lesione genitale (pur essendo di
notevole importanza) è avvenuta con enorme ritardo rispetto ai tempi dello studio; l’analisi è
stata possibile in soli 4 soggetti luetici: non è stato così possibile eseguire lo studio
comparativo tra osservazione diretta e tecniche di biologia molecolare. Un sicuro limite dello
studio è costituito dalla numerosità limitata del campione osservato. In conclusione, i test
199

apidi immunocromatografico Determine Syphilis TP e Determine HIV sono validi per la
diagnosi precoce d’infezione luetica e la diagnosi rapida d’infezione da HIV in una
popolazione sintomatica ad alto rischio, pur essendo eccessivamente costosi. Al momento il
loro utilizzo come test di screening in popolazioni a prevalenza intermedia o bassa necessita
di studi più ampi e saranno dirimenti le conclusioni di studi su ampia scala che l’ OMS ha in
atto.
200

Maria Flavia Di Renzo Filone tematico A2
Fattori genetici di predisposizone al carcinoma renale: ricerca e studio
funzionale di mutazioni dei geni MET e fumarasi
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Oncologiche - I.R.C.C. di Candiolo
CONTESTO E RAZIONALE
La predisposizione ereditaria a sviluppare tumori e’ un fattore di rischio la cui conoscenza
salva vite umane. Nei soggetti predisposti la prevenzione secondaria (identificazione precoce
della lesione neoplastica o pre-neoplasitca) ha registrato notevoli successi. A tutt’oggi sono
noti fattori di rischio genetico che interessano un numero piccolo di soggetti, che in
percentuale molto alta sviluppano tumori. Questo ci dice che molti dei geni di predisposizione
non sono ancora stati identificati e che combinazioni di alterazioni geniche singolarmente a
bassa penetranza possono avere un peso altrettanto, se non piu’, importante. Stiamo studiando
due geni le cui mutazioni predispongono all’insorgenza dei tumori renali: l’oncogene MET e
il gene, sospettato onco-soppressore, fumarasi. Le mutazioni di entrambi i geni predispongono
al carcinoma renale papillifero ereditario. Le mutazioni d i MET raramente predispongono a
carcinomi di altri organi. La presenza di mutazioni germinali di MET si sospetta quando il
tumore renale si presenta in piu’ membri della stessa famiglia o in eta’ giovanile oppure
quando è multiplo o bilaterale. Quelle dell’enzima mitocondriale fumarasi sono responsabili
alla predisposizone ereditaria all’insorgenza di leiomiomi cutanei e uterini che si manifestano
nelle famiglie con ancora maggiore frequenza dei carcinomi renali.
METODI E RISULTATI
Il primo scopo di questo lavoro era scoprire se e come le lesioni dei due geni (MET e
fumarasi) coesistessero nelle famiglie (attraverso analisi mutazionale dei casi sospetti) e
come queste lesioni nelle cellule contribuissero alla trasformazione neoplastica.
Usando diversi protocolli di analisi mutazionale, abbiamo esaminato tutti i nuovi casi di
sospetto carcinoma papillifero ereditario che ci sono stati proposti non solo da centri della
Regione Piemonte, ma anche da centri veneti, lombardi, friulani ed emiliani. Abbiamo
identificato tre famiglie portatrici di mutazioni del gene MET che, sorprendentemente, in tutti
i casi interessavano lo stesso codone. E’ in corso un’analisi di marcatori per rivelare un
eventuale effetto “fondatore” da parte di un comune avo, che abbia trasmesso la mutazione, e
percio’ la malattia, in una vasta area geografica. Inoltre abbiamo identificato una mutazione
germinale del gene fumarase nel codone 77, mai descritta prima, in un caso di carcinoma
renale papillifero “sporadico”, cioe’ in un paziante senza storia familiare. Per la definzione
della patogenicita’ di questa mutazione sono stati essenziali i successivi studi funzionali.
La seconda parte del progetto prevedeva gli studi funzionali, in vitro degli effetti delle
mutazioni di MET e fumarasi.
Abbiamo espresso le forme mutate di MET e dimostrato il loro potenziale trasformante
(Lorenzato et al., sottomesso per la pubblicazione). Lo studio del gene fumarase, sospettato
onco-soppressore e’ stato piu’ complesso. Per valutarne il potenziale trasformante ci siamo
avvalsi di fibroblasti deficienti degli enzimi mitocondriali le cui mutazioni predispongono ai
tumori (fumarase stessa e succinico deidrogenasi) lavorando in collaborazione con il prof
201

Rustin dell’INSERM dell’ospedale Debre’ di Parigi. Con lui abbiamo in corso di
pubblicazione un lavoro sull’argomento (Briere et al., 2005, Hum Mol Genet). Esprimendo le
forme mutate di fumarasi in questi fibroblasti abbiamo potuto dimostrare che la nuova
mutazione del codone 77 da noi identificata non ha effetti sull’attivta’ enzimatica della
fumarasi e percio’ ha un ruolo patogeno. Invece studiando un’altra mutazione, che colpisce il
codone 190, abbiamo dimostrato il suo potere non solo di annullare l’attivita’ enzimatica
endogena ma addirittura di trasformare la fumarasi in una forma ad attivita’ dominante
negativa (Lorenzato et al., in preparazione).
202

Irma Dianzani Filone tematico A2
Fattori genetici di rischio per lo sviluppo del mesotelioma maligno da
esposizione all'amianto
Università del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”
Dipartimento di Scienze Mediche
Il progetto rappresenta l'evoluzione di quello finanziato dalla Regione Piemonte l’anno
precedente di cui era prevista l'estensione.
CONTESTO E RAZIONALE
La maggior parte dei tumori presenta un'ereditarietà di tipo multifattoriale: viene ereditata la
predisposizione, ma è chiaro il ruolo svolto dall'esposizione a cancerogeni ambientali. Ogni
individuo presenta una differente risposta a tali agenti, controllata da una serie di geni di cui
ognuno ha un proprio pannello di alleli. Geni chiave sono quelli coinvolti nella riparazione del
DNA danneggiato da agenti genotossici chimici o fisici: hanno un ruolo essenziale nel
proteggere il genoma dalle mutazioni potenzialmente oncogene. E' probabile che
polimorfismi a livello di più geni abbiano effetti sinergici (come osservato in topi transgenici)
e che il particolare genotipo di ogni individuo abbia un ruolo cruciale nella definizione della
suscettibilità ai tumori.
OBIETTIVO
Ci siamo proposti di determinare i genotipi compositi a loci coinvolti nel DNA repair in
soggetti esposti ad un singolo fattore genotossico, l'amianto, che abbiano o meno sviluppato
un mesotelioma.
MATERIALI E METODI
La nostra ipotesi è che una sottile alterazione dei meccanismi di controllo del restauro del
DNA possa ridurre la protezione di individui esposti ad insulto genotossico cronico ad opera
delle fibre di amianto. L'esposizione all'asbesto è un noto fattore di rischio per il mesotelioma.
Si ritiene che le fibre di amianto siano cancerogene tramite differenti meccanismi:
1. effetti meccanici, quali l'interferenza con la formazione del fuso mitotico e la
segregazione dei cromosomi;
2. la generazione di specie reattive dell'ossigeno o dalla stessa superficie delle fibre a seguito
di reazioni che coinvolgono il ferro come catalizzatore o per effetto della fagocitosi
frustrata;
3. effetti locali e sistemici di immunosoppressione.
Le conseguenze del danno ossidativo includono rotture del filamento di DNA e modificazioni
delle basi. Solo 5-10% degli individui con elevata esposizione all'asbesto sviluppa il
mesotelioma. Si ritiene ciò dipenda dallo specifico background genetico.
In una prima fase dello studio, finanziata da altri progetti, abbiamo analizzato polimorfismi in
6 geni coinvolti nel restauro del DNA (XRCC1, XRCC3, ERCC2-XPD, OGG1, ATM,
NBS1), selezionati in base alle seguenti considerazioni:
203

a) sono tutti coinvolti nei sistemi preposti alla riparazione dei danni del DNA determinati
dall'amianto;
b) alcuni polimorfismi sono già stati associati ad un incremento della sensibilità al danno del
DNA in altri modelli di studio;
c) alcuni sono geni le cui mutazioni sono coinvolte in malattie ad ereditarietà mendeliana
associate ad alto rischio di tumori.
Un polimorfismo nel gene SEP15, codificante per una seleno-proteina, è stato aggiunto in
base al riscontro di un'associazione con lo sviluppo di mesotelioma. I pazienti e i controlli
sono stati selezionati tra i residenti di Casale Monferrato. I controlli sono stati scelti tra gli
iscritti al Sistema Sanitario Nazionale (controlli di popolazione). Tutti sono stati intervistati da
un'esperta epidemiologa e la loro esposizione all'amianto è stata accuratamente valutata.
L'intera casistica è stata studiata per i 7 polimorfismi, valutando singolarmente il genotipo di
ciascun individuo. Obiettivi e metodi utilizzati. Scopo del presente progetto era di continuare
la raccolta dei pazienti e dei controlli per incrementare la casistica e di studiare ulteriori
polimorfismi noti su tutti i soggetti, utilizzando lo stesso disegno dello studio. Nel corso
dell’anno la casistica è giunta a comprendere 81 casi e 110 controlli di popolazione. Il DNA è
stato estratto con protocollo standard da prelievo di sangue periferico dopo consenso
informato. In particolare, sono stati studiati i seguenti polimorfismi noti (sono inclusi nella
lista anche quelli già studiati nello studio preliminare su un numero minore di soggetti):
XRCC1-R399Q; XRCC3-T241M; ERCC2-XPD-K751Q; ERCC2-XPD-D312N; OGG1-
S326C; NBS1-E185Q; ATM D3003N; SEP15-1125 (G/A); APEX D148E; ERCC1 N118N
(C/T). Per l'analisi statistica è stata utilizzata la regressione logistica, metodo standard per gli
studi caso-controllo.
RISULTATI
Lo studio ha riscontrato un incremento dell’OR tra i soggetti esposti all’amianto relativamente
alla variante XRCC1-399Q sia negli eterozigoti che negli omozigoti. In particolare, è
suggestivo l’incremento dell’OR negli omozigoti rispetto agli eterozigoti (trend P=

Umberto Dianzani Filone tematico A1
Ricerca di marcatori immunologici utili nella valutazione prognostica
della sepsi
Università del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”
Dipartimento di Scienze Mediche
OBIETTIVO
Obiettivo dello studio era ricercare nuove molecole coinvolte nell’evoluzione del quadro
settico e valutare il loro possibile utilizzo nel monitoraggio e valutazione prognostica della
malattia. In particolare lo studio si è focalizzato sulla citochina proinfiammatoria OPN e sul
recettore di membrana H4/ICOS coinvolto nella differenziazione degli effettori T helper.
RISULTATI
Sono stati reclutati 29 pazienti con quadri settici ricoverati presso il reparto di rianimazione
dell’Ospedale Maggiore di Novara: 9 sono stati valutati in corso di SIRS o Sepsi non grave
(gruppo a), 9 in sepsi grave (gruppo b), 9 in shock settico (gruppo c), 10 in corso di
risoluzione (gruppo d); alcuni pazienti sono stati valutati in varie fasi successive della
malattia. In questi pazienti è stato effettuato
1. il dosaggio sierico delle citochine OPN, IL2, IL4, IL5, IL10, TNFα e IFNγ;
2. l’analisi immunofenotipica dell’espressione dei marcatori di attivazione H4/ICOS, CD69,
CD25 e HLA-DR sui linfociti T di sangue periferico.
L’analisi delle citochine ha evidenziato che tutti i pazienti presentavano livelli estremamente
elevati di OPN, mentre i livelli di IL10, IFNγ e TNFα erano variabili e IL4 e IL5 erano
assenti. I gruppi b) e c) presentavano livelli di OPN significativamente più elevati rispetto ai
gruppi a) e d) (a=780ng/mL; b e c = >2500; d=607; controlli=125). Inoltre nei gruppi b) e c)
erano ben evidenti due categorie distinte di pazienti, uno con livelli di OPN solo modicamente
aumentati, l’altro con livelli talmente elevati da risultare fuori scala nel test ELISA. Dati
preliminari su un primo gruppo di pazienti che sono stati monitorati longitudinalmente
confermano questo trend di variazione nelle diverse fasi della malattia. Per valutare se la
produzione di elevati livelli di OPN potesse essere favorita da fattori genetici, abbiamo
sequenziato il gene di OPN dai 29 pazienti e 688 donatori sani ottenendo i seguenti risultati.
• Abbiamo identificato 4 polimorfismi (single nucleotide polymorphisms, SNP),
corrispondenti alle posizioni +282T/C e +750C/T della regione codificante, e +1083A/G e
+1239A/C del 3’ UTR, che formano 3 combinazioni aplotipiche che abbiamo denominato
A, B e C. La loro distribuzione genotipica complessiva era statisticamente differente nei
pazienti e nei controlli (p

modicamente aumentato solo nel gruppo c); nel gruppo d) i valori di questi marcatori
tornavano verso la normalità, specialmente nel caso di HLA-DR. Queste variazioni
sembrano marcare l’attivazione del sistema immunitario nel corso della sepsi. Il dato di
maggior interesse è stato ottenuto su H4/ICOS la cui espressione era aumentata nei gruppi
a), b) e c), ma sorprendentemente, aumentava a livelli ancor più elevati nel gruppo d) (%
di linfociti T ICOS+: a=40%, b=36%; c=45; d=75; controlli:=11%) Questa variazione
peculiare suggerisce che l’espressione di H4/ICOS non si limiti a marcare l’attivazione
linfocitaria e suggerisce che i linfociti T H4/ICOS+ possano avere un ruolo attivo nella
risoluzione della sepsi. In effetti nostri studi in vitro dimostrano che la stimolazione di
H4/ICOS su linfociti T umani potenzia soprattutto la produzione di IFNγ che potrebbe
avere un ruolo nel superamento della fase di anergia immunologica delle fasi avanzate
della sepsi. E’ interessante notare che un effetto simile in vitro sui linfociti T si osserva
anche per opera del glutammato i cui livelli aumentano nel corso della sepsi (5,6).
CONCLUSIONI
Questa studio pilota ha identificato due nuovi marcatori dell’evoluzione della sepsi:
1. i livelli sierici di OPN, che sembrano marcare la progressione della malattia;
2. i linfociti T H4/ICOS+ che sembrano marcarne la risoluzione. Poiché entrambi questi
sistemi sono dotati di una potente attività immunomodulatoria, potrebbero anche avere un
ruolo diretto nell’evoluzione della malattia.
Lo studio proseguirà reclutando un maggior numero di pazienti ed estendendo l’analisi genica
al promotore di OPN e al gene di H4/ICOS.
PUBBLICAZIONI
1. Chiocchetti A, Indelicato M, Bensi T, Mesturini R, Giordano M, Sametti S, Castelli L,
Bottarel F, Mazzarino MC, Garbarini L, Giacopelli F, Valesini G, Santoro C, Dianzani I,
Ramenghi U, Dianzani U. High levels of osteopontin associated with polymorphisms in
its gene are a risk factor for development of autoimmunity/lymphoproliferation. Blood
103:1376-82, 2004.
2. Clementi R, Dagna L, Dianzani U, Dupré L, Dianzani I, Ponzoni M, Cometa A,
Chiocchetti A, Sabbadini MG, Rugarli C, Ciceri F, Maccario R, Locatelli F, Danesino C,
Ferrarini M, Bregni, M. Inherited Perforin and Fas Mutations in a Patient with
Autoimmune Lymphoproliferative Sindrome and Lymphoma. N Engl J Med 351:1419-24,
2004.
3. D'Alfonso S, Barizzone N, Giordano M, Chiocchetti A, Magnani C, Castelli L, Indelicato
M, Giacopelli F, Marchini M, Scorza R, Danieli MG, Cappelli M, Migliaresi S, Bigliardo
B, Sabbadini MG, Baldissera E, Galeazzi M, Sebastiani GD, Minisola G, Ravazzolo R,
Dianzani U, Momigliano-Richiardi P. Two single-nucleotide polymorphisms in the 5' and
3' ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus
erythematosus. Arthritis Rheum. 52:539-47, 2005.
4. A Chiocchetti, C Comi, M Indelicato, L Castelli, MC Mazzarino, M Giordano, S
D’Alfonso, P Momigliano-Richiardi, M Liguori, M Zorzon, A Amoroso, M Trojano, F
Monaco, M Leone, C Magnani, and U Dianzani. Osteopontin gene haplotypes correlate
with multiple sclerosis development and progression. J Neuroimmunol in press
5. Lombardi G, Miglio G, Dianzani C, Mesturini R, Varsaldi F, Chiocchetti A, Dianzani U,
Fantozzi R. Glutamate modulation of human lymphocyte growth: in vitro studies.
Biochem Biophys Res Commun. 318:496-502, 2004. 6)Arimura Y, Shiroki F, Kuwahara
S, Kato H, Dianzani U, Uchiyama T, Yagi J. Akt is a neutral amplifier for Th cell
differentiation. J Biol Chem. 279:11408-16, 2004.
206

Savina Ditommaso Filone tematico A1
In tema di infezioni ospedaliere: valutazioni teorico pratiche del lavaggio
delle mani
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia
CONTESTO E RAZIONALE
Il lavaggio delle mani è universalmente giudicato efficace per la prevenzione delle infezioni
ospedaliere ma nonostante questa consapevolezza tale pratica è ampiamente disattesa ed
inoltre esiste una certa confusione riguardo alla terminologia usata per specificarne la
tipologia. Le linee guida dei CDC pubblicate nel 2002 hanno contribuito a fare chiarezza
definendo: -hand wash il lavaggio “sociale”, con acqua e sapone, senza impiego di antisettici -
hygienic handwash: il lavaggio “igienico” implicante l’impiego di sapone o soluzione
medicata. -hygienic hand rub: lo strofinamento delle mani, in assenza di acqua, con un
prodotto battericida, generalmente un alcool. L’Italia non ha linee guida nazionali
sull’argomento; esistono tuttavia protocolli regionali o di singole aziende ospedaliere che lo
affrontano.
OBIETTIVI
1. verificare quali procedure sono proposte negli ospedali della regione Piemonte.
2. Individuare le indicazioni prevalenti emanate dalle Direzioni Sanitarie per realizzare
l’igiene delle mani.
3. Effettuare una prima verifica sul campo della compliance degli operatori sanitari di una
Casa di Cura accreditata dalla Regione Piemonte
MATERIALI E METODI
Il conseguimento dei primi due obiettivi ha previsto l’invio di un questionario alle Direzioni
Sanitarie ed ai Responsabili delle infezioni ospedaliere delle ASO, dei Presidi Ospedalieri
appartenenti alle 22 ASL piemontesi e di 4 Case di Cura. Il terzo obiettivo è stato realizzato
mediante una sorveglianza diretta sul comportamento del personale dell’Ospedale Cottolengo
durante i turni diurni. La sorveglianza, durata 4 mesi, è stata affidata ad una infermiera
opportunamente formata che, raccolte le osservazioni in forma anonima e all’insaputa degli
osservati ha compilato le schede appositamente predisposte. Sono stati presi in considerazione
2 aspetti: l’utilizzo dei guanti ed il lavaggio delle mani. I dati raccolti sono stati trasferiti su
supporto informatico (programma Epinfo) e successivamente elaborati.
RISULTATI
Obiettivi 1 e 2. Tutte le strutture cui è stato spedito il questionario, con una sola eccezione, lo
hanno compilato e restituito. Dalle risposte relative alle procedure indicate nella prima parte
del questionario emergono alcuni elementi interessanti: la pratica handrub è relativamente
poco raccomandata, anche in quelle situazioni, quale l’indisponibilità di lavandini che ne
costituiscono una indicazione elettiva; alcune Direzioni Sanitarie (3,5%) si limitano a
raccomandare anche per le situazioni a maggior rischio il solo lavaggio sociale (handwash),
mentre il 16,8% degli intervistati raccomanda il lavaggio igienico anche in occasione di
207

ischio limitato; la compliance del personale sembra fornire l’indicazione del ricorso
prevalente al lavaggio sociale Anche le risposte date alla seconda parte del questionario
riconfermano la scarsa propensione all’impiego dello sfregamento alcolico e la
raccomandazione da parte di un certo numero di Direzioni Sanitarie alla pratica del lavaggio
sociale in situazioni a maggior rischio.
Obiettivo 3. La sorveglianza diretta del personale ha consentito di raccogliere 490
osservazioni relative all’impiego dei guanti. La popolazione osservata era costituita per il 40%
da infermieri, per il 42% da personale di supporto, per il 10% da studenti e per l’8% da
medici. Da questi risultati emerge che i più scrupolosi utilizzatori dei guanti risultano gli
operatori di supporto (91%), seguiti dagli infermieri (87%) e dai medici (62%). Più difficile
inquadrare il comportamento degli studenti che risultano totalmente osservanti al mattino
(100% di utilizzatori, ma risultano essere i peggiori al pomeriggio (50%). I guanti sono stati
indossati nel 84,5% delle situazioni che lo richiedevano e la modalità di utilizzo è risultata
corretta nel 93,4% dei casi. L’utilizzo dei guanti per sesso non rivela differenze significative
(85% delle femmine e 80,3% dei maschi), mentre il turno di lavoro influenza in modo
significativo il ricorso ai guanti (88% di utilizzo al mattino verso il 68% al pomeriggio
(c2=11,66; p

Marilena Durazzo Filone tematico A4
Effetti di un intervento alimentare nel decorso della steatosi epatica e
steatoepatite non alcolica
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina Interna
CONTESTO E RAZIONALE
La steatosi epatica non alcolica si inserisce in uno spettro di patologie definite NAFLD
(nonalcholic fatty liver diseases) la cui importanza è data dall’alta prevalenza nella
popolazione occidentale (5.4% nella popolazione generale adulta, 20-40 % in pazienti con
ipertransaminasemia cronica di ndd) e dalla possibile progressiva evoluzione della patologia
da steatosi semplice ad un quadro irreversibile di cirrosi e talvolta epatocarcinoma. La
necessità di intervenire sulla steatosi è dimostrata dal rischio di sviluppare fibrosi entro 5 anni
e cirrosi. I provvedimenti principali mirano a:
a) elaborare una dieta in grado di modulare l’azione insulinica;
b) programmare un’attività fisica adeguata;
c) ridurre i livelli di colesterolo e trigliceridi con farmaci non potenzialmente epatotossici.
Al momento non vi sono dimostrazioni sulla reale efficacia di terapia farmacologica in grado
di ridurre l’attività citolitica; vi sono alcune segnalazioni che riportano un potenziale
beneficio dell’acido ursodesossicolico e di farmaci antiossidanti come la vitamina C e la
vitamina E. Stile di vita e abitudini alimentari, in particolare tipo e introito di carboidrati e
grassi nella dieta, possono modulare:
1. l'azione insulinica, incidendo sullo sviluppo delle varie componenti della sindrome
metabolica;
2. la capacità di metabolizzare un pasto grasso.
Dati preliminari di uno studio trasversale indicano la presenza nella NAFLD di anomalie
qualitative nell'introito alimentare di grassi (eccesso di grassi saturi e carenza di poliinsaturi) e
sostanze antiossidanti (carenza di vitamina C ed E), correlabili con i livelli di transaminasi
sieriche, con il grado di insulino-resistenza e con le alterazioni del metabolismo postprandiale
dei trigliceridi. Scopo del nostro studio è stato quello di valutare l’impatto sul metabolismo
insulinico e lipidico di un trattamento volto a modificare le abitudini alimentari di un gruppo
di soggetti con NASH.
CASISTICA E METODI
Nell’arco di 12 mesi sono stati arruolati 20 soggetti con diagnosi di NASH verificata con la
biopsia epatica, riscontro di fegato iperriflettente all’ecotomografia, transaminasi aumentate
da almeno 6 mesi e introito alcolico quotidiano non significativo; sono stati inoltre arruolati
45 soggetti di controllo confrontabili per sesso ed età. Sono stati esclusi dall’arruolamento
soggetti obesi (BMI > 30 kg/m2), diabetici e/o dislipidemici. In tutti i soggetti sono state
valutate le abitudini alimentari quotidiane per una settimana con la guida di un dietologo
esperto, formulando una dieta atta a correggere le anomalie dietetiche sopra menzionate
tipiche di tali soggetti. Ogni 3 mesi sono stati effettuati un controllo clinico/dietistico ed i
prelievi ematochimici di base per valutare l'adesione al programma dietetico. Sono stati dosati
209

oltre agli enzimi epatici, anche il TGF-b1, il TNF-a e l’adiponectina mediante metodica
ELISA, quali indicatori del grado di infiammazione-fibrogenesi epatica. Sono stati effettuati
un carico di glucosio endovena con prelievi ravvicinati per il dosaggio di glucosio, insulina e
C-peptide plasmatici ed elaborazione con la metodica computerizzata dei MINIMAL
MODELS per ottenere l'indice di sensibilità insulinica e i parametri relativi al metabolismo
glicidico ed un test da carico lipidico orale con dosaggio dei trigliceridi e del colesterolo,
totali e veicolati dalle VLDL, delle apolipoproteine B48 e B100, quali marcatori origine
intestinale od epatica delle lipoproteine ricche in trigliceridi; dosaggio dei dieni coniugati
quali marcatori delle modificazioni ossidative.
RISULTATI
I risultati del nostro studio hanno confermato la presenza di alterato metabolismo dei
trigliceridi in fase postprandiale, associato ad incremento dei markers di stress ossidativo nei
soggetti con NASH. Inoltre tali soggetti presentavano un peggioramento della funzione delle
cellule beta pancreatiche rispetto ai controlli così come livelli sierici di adiponectina più bassi,
correlabili con la gravità della steatosi epatica, della necroinfiammazione e della fibrosi. Le
modifiche dietetiche instaurate hanno portato ad un parziale miglioramento dei parametri
metabolici e degli indici di citolisi, tuttavia l’ipoadiponectinemia potrebbe avere un ruolo
patogenetico indipendentemente dall’insulino-resistenza, l’accumulo di grasso viscerale e le
abitudini dietetiche.
CONCLUSIONI
In conclusione, un intervento dietetico mirato a correggere specificamente gli errori alimentari
(eccesso di grassi saturi e colesterolo a scapito dei grassi poliinsaturi e delle vitamine
antiossidanti) può influenzare in positivo la sensibilità insulinica, riducendo le anomalie
aterogenetiche proprie della sindrome metabolica e modificare la storia naturale della
NAFLD, riducendo la percentuale di evoluzione in cirrosi ed in epatocarcinoma. Comunque
un trattamento farmacologico, ad esempio mirato ad accrescere i livelli di adiponectina,
potrebbe essere necessario a completamento terapeutico.
210

Giorgio Emanuelli Filone tematico A2
Ruolo delle cicloossigenasi 1 e 2 nella trasformazione neoplastica dei
polipi del colon
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Fisiopatologia Clinica
OBIETTIVO
La nostra ricerca, di durata biennale, si proponeva di analizzare, mediante Real Time Reverse
Transcription Polymerase chain reaction (RT -PCR) ed immunoistochimica i livelli di
espressione di cicloossigenasi (COX)-l e COX-2 e dei recettori delle Prostaglandine nei polipi
adenomatosi del colon a vario grado di displasia rispetto sia alla mucosa normale sia alla
lesione neoplastica, allo scopo di individuare marcatori intermedi nella sequenza mucosa
normale-adenoma-carcinoma da utilizzare per metodiche di screening, interventi di
prevenzione ed eventualmente di cura.
Pazienti arruolati. Allo studio hanno partecipato 156 pazienti dei quali 71 affetti da poliposi,
50 affetti da carcinoma e 35 non affetti da neoplasie o da malattie infiammatorie, usati come
gruppo di controllo. La tabella 1 riassume le caratteristiche clinicodemografiche dei pazienti.
Tabella 1. - Caratteristiche demografiche e patologiche della popolazione studiata
Pazienti Controlli Adenomi Carcinomi
N. 35 (22%) 71 (46%) 50 (32%)
Sesso maschile 17 (48%) 47 (66%) 26 (51%)
Età in anni 52 (25-85) 63 (44-78) 63 (31-87)
Adenomi (grado di displasia) lieve moderata grave Totale
N. 15 (21%) 36 (51%) 20 (28%) 71 (100%)
Carcinomi (stadi secondo
Dukes)
A¹ B¹ B² C1 – C3³ D 4 Totale
N. 8 (16%) 7 (14%) 14 (27%) 12 (25%) 9 (18%) 50 (100%)
I dati sono presentati come mediana (range) per variabili continue e come frequenza (%) per
variabili categoriche
RISULTATI
L’analisi quantitativa dell’espressione di RNAm per COX-1 e COX-2, eseguita mediante realtime
RT-PCR ed effettuata sui campioni di tessuto prelevati endoscopicamente o durante
l’intervento chirurgico, ha dimostrato in generale che l’accumulo di trascritto per COX-1 e
per COX-2 è aumentato nei polipi rispetto alla mucosa normale (rispettivamente p

presentano valori di messaggio per COX-2 uguali o lievente inferiori rispetto alla mucosa
normale. Per quanto riguarda i carcinomi in generale i valori di RNAm per COX-1 non si
discostano molto da quelli osservati negli adenomi (p>0.05), mentre i livelli di trascritto per
COX-2 sono superiori in modo statisticamente significativo sia nei conronti della controparte
normale che degli ademoni (p

Tabella 5. Distribuzione secondo l'estensione e l'intensità di immunoreattività per COX-2
nei carcinomi
Estensione della colorazione
Intensità di colorazione 0% 1-25% 26-50% 51-75% 76-100% Totale
Negativa 4 4
Debole 2 3 2 3 10
Media 6 2 0 5 13
Forte 2 4 2 15 23
Totale 4 10 9 4 23 50
Per quanto riguarda i recettori delle prostaglandine EP, i livelli di espressione dell’RNAm per
EP1 ed EP2 è risultata aumentata nei carcinomi e nei polipi (soprattutto a displasia grave)
rispetto sia alla mucosa normale sia ai polipi meno displastici. Non sono state notate
differenze per quanto riguarda l’espressione di RNAm per EP4. Il risultato più interessante
sembra essere quello ottenuto dall’analisi dell’RNAm per EP3 che risulta marcatamente
diminuito nei carcinomi e nei polipi rispetto alla mucosa normale (p=0.019 e p=0.03,
rispettivamente)
CONCLUSIONI
Le conclusioni che si possono trarre da questi risultati sono:
1. l’iperespressione di COX-1 nei polipi e nei carcinomi è inattesa perché si riteneva che
questa isoforma fosse espressa costitutivamente ed associata al mantenimento
dell’omeostasi tissutale. Pertanto il significato biologico in questo contesto deve essere
ulteriormente approfondito.
2. L’iperespressione negli adenomi di COX-2 (isoforma indotta da infiammazione e stimoli
mitogenici) dimostra che gli fenomeni scatenanti sono eventi precoci nella sequenza
adenoma-carcinoma, suggerendo che la chemioprevenzione con gli inibitori di COX-2
potrebbe essere potenzialmente presa in considerazione per ridurre il rischio di
cancerizzazione dei polipi sporadici.
3. La conferma su una casistica relativamente ampia dell’ ipoespressione di EP3 sia nei
polipi che nei carcinomi rende interessante l’indagare ulteriormente il ruolo del recettore
EP3 nella trasformazione neoplastica dei polipi, perché essendo coinvolto nell’inibizione
della crescita cellulare, una sua ridotta espressione potrebbe contribuire allo sviluppo del
tumore.
Attualmente sono in fase di esecuzione i test statistici per confermare la validità clinica dei
risultati.
213

Carola Eva Filone tematico A4
Ruolo del NPY e della sua interazione con il GABA nella farmacologia
dell’etanolo
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Anatomia, Farmacologia e Medicina Legale
In questa ricerca abbiamo studiato il ruolo dell’interazione tra GABA e NPY su alcune azioni
acute e croniche dell’etanolo in modelli murini mutati.
1. L’effetto dell’intossicazione acuta con etanolo, del consumo volontario di etanolo e del
trattamento acuto con GHB sull’espressione genica del recettore Y1 e del NPY
nell'amigdala è stato studiato su i topi Y1R/LacZ della linea 62 (ceppo puro FVB). Il
trattamento acuto con etanolo (2g/Kg) non modifica l’espressione del transgene
Y1R/LacZ nell’amigdala centrale e mediale. L’attività della beta-galattosidasi non è
modificata dal consumo volontario di etanolo per 4 settimane (in dosi crescenti dal 3 al
20%), ma aumenta in modo significativo dopo 48 ore di astinenza nell’amigdala
suggerendo che la riduzione dell’espressione di NPY indotta dall’astinenza da etanolo
induce un aumento compensatorio del recettore Y1R. Inoltre il trattamento con finasteride,
inibitore selettivo della 5-alfa redattasi, previene l’aumento dell’espressione della betagalattosidasi
dopo 48 ore di astinenza, suggerendo che gli effetti dell’etanolo sulla
trasmissione NPY-Y1R siano mediati dall’aumento delle concentrazioni corticocerebrali
di steroidi neuroattivi. Il trattamento acuto con GHB induce una riduzione dosedipendente
dell’espressione del Y1R nell’amigdala che è accompagnata da un aumento
della densità delle fibre immunoreattive al NPY. Il trattamento con l’antagonista selettivo
del recettore GABAB SCH50911 (50 mg/Kg) blocca sia l’aumento dell’immunoreattività
al NPY sia la down regulation del transgene indotte dal GHB.. Abbiamo infine dimostrato
che il trattamento cronico per 15 giorni con GHB aumenta l’espressione del transgene
nell’amigdala mediale e centrale dei topi Y1RLac/Z. Non abbiamo potuto estendere i
nostri studi ai topi transgenici Y1R/LacZ della linea 1027, (ceppo puro BXD) in quanto
nel genoma di questi animali il transgene Y1R/LacZ è stato perduto durante l’espansione
della linea, probabilmente a causa di una mutazione spontanea. Per ottenere una nuova
linea di topi Y1R/LacZ in un ceppo puro C57BL/6 abbiamo re-incrociato i topi transgenici
derivanti dalla linea 62 con topi wild type C57BL/6 e abbiamo ottenuto la generazione F6.
I topi potranno essere usati per lo studio della farmacologia dell’etanolo solo a partire
dalla prossima generazione (F7).
2. Nella prima fase della ricerca abbiamo ottenuto per ricombinazione omologa due topi con
il gene floxato del Y1R (topi Y1Rlox) che sono stati incrociati con femmine di topi CRE
deleter, che esprimono Cre negli oociti, per verificare l’efficienza del sistema Cre/loxP.
Tuttavia l’analisi del genotipo di questi animali ha rivelato essi non esprimevano il gene
floxato nella posizione corretta, suggerendo che, al momento della microiniezione, era
probabilmente avvenuto accidentalmente un errore. Abbiamo quindi effettuato una nuova
microiniezione, presso il Max Plank Institute di Heidelberg, ottenendo una nuova linea di
topi Y1Rlox che stiamo attualmente genotipizzando ed ampliando. Abbiamo inoltre
generato e caratterizzato i topi transgenici che saranno utilizzati per ottenere il knock-out
condizionale del Y1R controllato nel tempo e tessuto-specifico nelle regioni limbiche e
nell’ipotalamo. Per i motivi descritti sopra, non è stato possibile eseguire l’analisi
comportamentale. Abbiamo analizzato le linee di topi transgenici da utilizzare per la
214

delezione condizionale del recettore Y1R paragonando l’espressione del Y1R endogeno
con quella della ricombinasi Cre in topi che esprimono tre transgeni:
a) il transgene contenente il cDNA della ricombinasi Cre sotto il controllo di una
regione TRE (Tet Responsive Element) che è attivata da tTA (topi TRE-Cre);
b) il transgene contenente la regione codificante del transattivatore tTA sotto il
controllo del promotore della alfaCAMKII (topi alfaCAMKII/tTA);
c) il gene LacZ diretto da un promotore attivato dalla ricombinasi Cre (topi Rosa26R).
In questi topi è così possibile visualizzare l’attività di Cre mediante una doppia
colorazione di fettine coronali di encefalo: immunoistochimica, per rivelare l’espressione
del recettore Y1R con un anticorpo specifico, e istochimica, per rivelare l’espressione del
LacZ. Questi esperimenti hanno evidenziato la coespressione del Y1R con la ricombinasi
Cre in tutti i neuroni delle regioni del proencefalo, dimostrando la validità di questo
modello per ottenere la delezione tessuto-specifica del Y1R. Poichè il trattamento
prenatale con doxiciclina riduce l’espressione della ricombinasi Cre alle regioni limbiche
(CA1, giro dentato, corteccia cerebrale, striato ed amigdala), sarà possibile ottenere la
delezione temporalmente regolata del Y1R selettivamente in questi nuclei cerebrali
Abbiamo infine generato una linea di topi (Tg Y5RhtTA/Y1RVenus) che contengono il
transgene Y5RhtTA/Y1RVenus, formato dal gene dell’attivatore umano tTA diretto dal
promotore del gene Y5R ed dal gene della proteina fluorescente Venus diretto dal
promotore del gene Y1R. Il transgene Y5RhtTA/Y1RVenus è stato ottenuto utilizzando
un sistema di modificazione cromosomica, per ricombinazione omologa, in E.coli di un
clone BAC contenente, con orientamento opposto,entrambi i geni Y1R eY5R che
condividono un promotore di 25Kb localizzato tra essi. L’analisi istochimica
dell’espressione della ricombinasi Cre in questi animali ha dimostrato che l’enzima è
altamente espresso nell’ipotalamo, nel nucleo soprachiasmatico, ippocampo, amigdala,
corteccia cerebrale e nucleo olfattorio anteriore. L’incrocio di questi animali con i topi
Y1R/lox permetterà di ottenere la delezione del Y1R anche nell’ipotalamo e quindi di
paragonare il ruolo della trasmissione NPY-Y1R nel comportamento emozionale ed in
quello alimentare. Inoltre poichè questi topi esprimono la proteina Venus con una
distribuzione sovrapponibile a quella del Y1R in tutte le regioni dell’encefalo, sarà
possibile effettuare l’analisi elettrofisiologica nei neuroni che contengono il Y1R prima e
dopo la delezione del Y1R.
3. Dal momento che i fondi assegnati non erano sufficienti a coprire le spese per l’intero
progetto di ricerca, non siamo stati in grado di sviluppare anche gli studi inerenti al
polimorfismo genetico del NPY in pazienti etilisti. Questo studio verrà comunque iniziato
nei prossimi mesi e coinvolgerà anche il Reparto Psichiatrico dell’Ospedale Fatebene
Fratelli.
Questi risultati, che sono stati presentati a due congressi scientifici internazionali, sono in
parte descritti nel manoscritto: Eva C., Serra M., Mele P., Panzica G.C. and Oberto A., Front.
Neurendocrinol, in press e saranno raccolti in altre tre pubblicazioni in corso di preparazione.
215

Claudio Fabris Filone tematico A1
Toxoplasmosi: costruzione di una rete per la sorveglianza dell’infezione
nella gravida e nel neonato (Prosecuzione)
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze pediatriche e dell’Adolescenza
OBIETTIVI E METODI
In risposta all’obiettivo generale che prevedeva l’attuazione di un’opera di Prevenzione
Terziaria è stato stimata l’incidenza di infezione-malattia congenita con l’identificazione del
neonato infetto alla nascita e/o con follow-up nel primo anno e il trattamento specifico del
neonato infetto per prevenire l’evoluzione e/o la comparsa dei segni clinici di malattia
congenita.
1. Per la diagnosi e il follow-up dell’infezione congenita sono state proposte le indicazioni
pubblicate dalla S.I.N.
2. Nel neonato alla nascita e nei primi mesi sono stati ricercati gli anticorpi specifici di
neosintesi con la tecnica WESTERN-BLOT utilizzando laboratori di riferimento in grado
di applicarla correttamente.
3. Il protocollo del neonato prevede che in caso di infezione congenita asintomatica,
confermata sierologicamente, venga somministrato pirimetamina (1mg/Kg/die in unica
somministrazione) + sulfadiazina (100 mg/Kg/die in 2 sommministrazioni) + acido
folinico (5mg a giorni alterni) per la durata di 4 settimane alternate a 4 settimane di
spiramicina alle dosi sopra indicate per tutto il primo anno di vita. Nel neonato infetto
sintomatico il trattamento prevede la somministrazione di pirimetamina + sulfadiazina +
acido folinico alle dosi sopra indicate continuativamente per 6 mesi, quindi per i restanti 6
mesi a mesi alterni con spiramicina. In caso di corioretinite in fase acuta può essere utile
associare una terapia cortisonica con prednisone (1mg/Kg/die).
4. Sono stati correlati i trattamenti eseguiti dalle gravide con infezione documentata da
sieroconversione e il passaggio e gli esiti dell’infezione congenita.
RISULTATI
Nel 1° anno dello studio hanno partecipato 31 punti nascita sorvegliando circa 28700 gravide
e corrispondenti neonati rappresentativi dell’82% delle nascite piemontesi. Sono state raccolte
complessivamente 126 segnalazioni di infezione in gravidanza definite certe, probabili e
possibili su 28700 nati vivi sorvegliati (0,44%): in particolare 39 (0.13%) sieroconversioni
accertate e infezioni probabili ad alto rischio di trasmissione e 88 casi (3,03%) di infezioni
possibili a rischio di trasmissione molto basso. Nei due anni successivi di proseguimento dello
studio, per un totale di 3 anni di raccolta dati, sono stati inviate le segnalazioni regolarmente
da 20 neonatologie con un totale di 74205 nati in 3 anni. Sono stati segnalati 113 (0,15%)
coppie madre-neonato per le quali sono state inviate notizie sull’infezione materna, sul
trattamento eseguito e sulla trasmissione dell’infezione ai figli. In questo gruppo 46 (40,7%)
erano sieroconversioni (0,06% della popolazione osservata), 37 (32,7%) erano infezioni
probabili e 30 (26,6%) erano infezioni possibili. I neonati infetti sono stati 13 di cui 5
sintomatici tutti nati dalle 46 madri con sieroconversione e pertanto in questo gruppo la
trasmissione è stata del 28,7%. Nessuna delle madri con infezione probabile o possibile ha
216

trasmesso l’infezione ai figli. I neonati infetti sintomatici sono stati 5 (38,4% degli infetti e
10,8% dei nati da sieroconversione). Il follow-up clinico degli infetti, per quanto riguarda le
sequele, è ancora in corso. Nei neonati a rischio non sempre sono state ricercate le IgM e le
IgA specifiche in particolare rispettivamente nel 95% e nel 74% e negli infetti esse sono
risultate positive soltanto nel 62,5% dei casi. In 55 casi si conosce dettagliatamente il
trattamento eseguito in gravidanza ed è stato eseguito correttamente nell’85,5% dei casi senza
che ci siano differenze significative tra le classi di rischio considerate. Non è stato possibile
ottenere risultati statisticamente significativi dalla correlazione tra i protocolli attuati in
gravidanza e la trasmissione dell’infezione ai figli per il piccolo numero di casi raccolti (46
sieroconversioni e 13 infetti). In 75 casi nelle madri è stato eseguito in gravidanza anche il test
di avidità per le IgG in associazione alle comuni tecniche di indagine (ELISA e ISAGA).
Delle 12 infezioni definite come probabili in 11 casi è stata confermata la classificazione e in
un solo caso l’infezione è stata definita come probabile; invece delle 38 infezioni definite
possibili secondo Lebech 23 sono state riclassificate come probabili e 15 come improbabili.
CONCLUSIONI
E’ stato possibile fornire dati epidemiologici riferiti a 74205 coppie madre-bambino. Il primo
accesso al laboratorio in corso di gravidanza è spesso tardivo e rende difficile la definizione di
caso di infezione primaria materna quando si deve orientare la decisione tra infezione
probabile o possibile sulla base della modificazione dei titoli nella prima metà della
gravidanza. Inoltre soltanto nel 40,7% dei casi è stata fatta segnalazione di sieroconversione
con conseguente messa in atto di una efficace profilassi nella madre e nel neonato; in tutti gli
altri casi di infezione materna probabile e possibile, che peraltro non hanno trasmesso
l’infezione ai figli, è stato comunque inevitabile eseguire in gravidanza e nei neonati ulteriori
accertamenti evitabili con una più precoce e puntuale definizione dell’infezione in gravidanza
con il maggior utilizzo del test di AVIDITY precocemente in gravidanza. Sui neonati non
vengono effettuate tutte le determinazioni che consentirebbero di avvicinarsi ad una diagnosi
sufficientemente precoce: i test per IgM e per IgA non sono richiesti o effettuati in tutti i casi
anche se sarebbe invece auspicabile che tutti i laboratori disponessero del Kit per la
determinazione delle IgM e IgA specifiche da determinare ogni qualvolta ci si trovi di fronte a
un neonato da madre con sieroconversione o con infezione in gravidanza definita probabile. I
nostri dati, anche se su un piccolo numero di neonati infetti, confermano quanto riferito in
letteratura sulla insufficiente sensibilità dei test sierologici sul neonato per la determinazione
delle IgM e IgA specifiche che sono risultate presenti rispettivamente soltanto nel 62,5% e nel
50% dei casi. A tale proposito l’utilizzo del test di WESTERN BLOT per IgG dovrebbe
essere incoraggiato dai neonatologi presso i laboratori in considerazione del fatto che tale test
è risultato possedere in studi sperimentali una elevata specificità (> 95%) alla nascita ed una
elevata sensibilità (>90%) a 3 mesi di vita. Nella nostra casistica è stato eseguito, ad oggi, in
pochi casi non sufficienti per portare un nostro contributo a riguardo.
217

Fabrizio Faggiano Filone tematico D4
Fattibilità di uno studio controllato e randomizzato sull'acido folico per la
prevenzione delle gravidanze Down
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia
CONTESTO E RAZIONALE
Vi sono numerosi studi sperimentali che suggeriscono una relazione causale tra l’assunzione
materna di acido folico (vit B9) e lo sviluppo di difetti del tubo neurale (DTN). Nel 1992
Czeizel stimò in 0.3 il RR di DTN nei figli di donne che assumevano ac. Folico. Inoltre
Barkai ha recentemente osservato come i DTN e la Sindrome di Down si manifestino nella
stessa famiglia con frequenza superiore all’atteso, comportandosi come eventi non
indipendenti. Questi studi ipotizzano che un’integrazione vitaminica della dieta materna possa
ridurre il rischio di tali malformazioni. Vi sono ormai solide evidenze di efficacia [Lumley
2004 ] per quanto concerne le ricorrenze di malformazioni del tubo neurale, mentre per le
occorrenze la letteratura non ha ancora prodotto un risultato definitivo anche se si sospetta un
effetto protettivo sia per la sindrome di Down che per le malformazioni cardiache [Al-Gazali
2001; Barkai 2003; James 1999; Ray 2003 ]. Tali evidenze, se pure parziali, hanno indotto
alcune nazioni a promuovere l’uso di acido folico in donne che desiderino una gravidanza
(Berry 1999, MMWR 2004), con risultati apparentemente positivi; tuttavia sussistono alcuni
problemi di metodo e differenze tali nella dieta delle popolazioni considerate rispetto a quella
italiana, da suggerire un atteggiamento cauto nel promuovere l’adozione di tale integratore a
livello di popolazione. In effetti ad oggi non è possibile stimare quale effetto questo possa
avere in popolazioni ad elevato consumo di verdura cruda e basso tasso di incidenza, come
quella italiana ed un ulteriore elemento di incertezza dalla quasi totale assenza di studi
metodologicamente solidi che valutino l’efficacia di campagne informative/educative sulla
popolazione generale.
OBIETTIVO
Obiettivo dello studio era la valutazione della fattibilità di uno studio randomizzato per la
valutazione dell’efficacia della supplementazione con acido folico a livello di popolazione.
Nella nostra regione però, in linea con un’iniziativa nazionale, è stato deciso di attuare una
campagna di comunicazione sull’uso dell’acido folico, e, quindi diviene infattibile uno studio
randomizzato. Obiettivo dello studio è quindi divenuto la valutazione di impatto di questa
campagna. Sulla base delle attuali conoscenze scientifiche, si considera irrinunciabile
procedere alla valutazione, utilizzando metodi adeguati dell’effetto che tale campagna
produrrà su:
• le conoscenze sull’effetto dei folati;
• la riduzione delle malformazioni ipotizzate come associate alla concentrazione di folati.
MATERIALI E METODI
Due distinti studi permetteranno di raggiungere l’obiettivo sopra citato: mentre gli indicatori
di esito verranno misurati mediante survey ripetute prima e dopo l’intervento (studio 1 e 2),
218

l’indicatore di impatto verrà misurato mediante l’analisi dell’archivio malformazione (studio
3).
Studio 1 – Abitudini alimentari delle donne in età fertile
Obiettivo specifico: Valutare l’efficacia della campagna informative piemontese rispetto a:
• grado di conoscenza del problema (valutazione di processo)??
• consumi alimentari (valutazione di processo)
• livelli sierici di folati e di omocisteina (valutazione di esito)
Disegno dello studio: studio di prevalenza effettuato all’inizio della campagna informativa ed
a un anno di distanza dal termine della campagna stessa.
Definizione della popolazione in studio: campione delle donne residenti nella Regione
Piemonte di età compresa fra 15 e 49 afferenti al laboratorio analisi dell’ospedale Mauriziano
di Torino (contesto urbano) e al consultorio dell’ASL 17 (contesto extraurbano) per eseguire
esami laboratoristici (che non siano relativi alle condizioni fisiologiche e patologiche sotto
riportate nei criteri di esclusione). Le donne eligibili per lo studio verranno reclutate in
ragione di 70-100 presso il laboratorio analisi dell’ospedale Mauriziano di Torino e di 70-100
presso il consultorio dell’ASL 17.
Raccolta delle informazioni: il questionario per la raccolta delle informazioni verrà
somministrato da un operatore dell’ASL e da alcuni borsisti adeguatamente formati. I
questionari eseguiti verranno sequenzialmente numerati e lo stesso numero verrà riportato
sulla provetta contenente il campione di sangue. Dopo il questionario verrà effettuato il
prelievo aggiuntivo ed i campioni saranno analizzati mediante opportuno kit acquistato dalla
ditta Bayer presso il laboratorio dell’Ospedale Mauriziano.
Studio 2 – Abitudini prescrittive dei ginecologi
Obiettivo specifico: valutare l’efficacia della campagna informativa rispetto alle abitudine
prescrittive dei ginecologi.
Disegno dello studio: studio di prevalenza effettuato all’inizio della campagna informativa
(ottobre 2004) ed a un anno di distanza dal termine della campagna stessa.
Definizione della popolazione in studio: medici ginecologi, iscritti alle varie associazioni
(AOGOI, SIEOG,SIGO, AGUI) regionali piemontesi negli anni 2003-4. Si stima che tale
popolazione comprenda tutti i ginecologi della regione Piemonte.
Raccolta delle informazioni: questionario autosomministrato ed inviato via posta corredato di
francobollo per la risposta. Nel caso di non risposta verrà inviata una seconda lettera di
sollecito.
Gli strumenti per la rilevazione dati: le abitudini prescrittive dei ginecologi verranno rilevate
mediante questionario autosomministrato, volto ad indagare la storia professionale e le
modalità di prescrizione dell’acido folico.
Studio 3 – valutazione degli esiti
La costruzione dell’archivio malformazioni è attualmente in corso da parte del Servizio di
Epidemiologia di Alessandria. Essendo gli studi partiti nel periodo finale del progetto, la fase
di elaborazione verrà effettuata nell’ambito del progetto “Valutazione di processo e di esito di
una campagna informativa sull’uso dell’acido folico”, resposabile la drssa Elisabetta Versino,
finanziato nell’ambito della ricerca finalizzata 2004.
219

Secondo Fassino Filone tematico A5
Prevenzione della cronicizzazione nell’anoressia. Studio dei predittori
precoci mediante f-rmi e test neuropsicologici
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Psichiatria
CONTESTO E RAZIONALE
Da alcuni anni l’applicazione della neuropsicologia allo studio dei Disturbi Psichici ha fornito
interessanti risultati permettendo di migliorare la definizione dei fenotipi e di correlare
alterazioni di funzionamento neurocognitivo a sintomi e dimensioni cliniche. Nei Disturbi del
Comportamento Alimentare (DCA) l’applicazione delle metodiche neuropsicologiche e di
indagini strumentali funzionali è ancora in fase preliminare.
OBIETTIVO
Lo studio si proponeva inizialmente di valutare in pazienti affette da Anoressia Nervosa le
modalità di attivazione delle aree cerebrali coinvolte nelle cosiddette funzioni esecutive e
nella capacità di astrazione e “problem solving”, confrontando un campione clinico con uno
non clinico di soggetti di sesso femminile accoppiate per caratteristiche socio-demografiche.
In particolare altri obiettivi erano:
1. verificare se esiste una correlazione tra gravità delle condizioni fisiche (stato di
denutrizione) e della sintomatologia alimentare e presenza di particolari pattern di
attivazione cerebrale sottostimolo.
2. Indagare l’eventuale presenza di modalità di funzionamento cerebrale e di pensiero già
riscontrate nei soggetti affetti da DOC, sia con metodiche neuropsicologiche e sia con la
Fmri.
3. Valutare se esistano aree cerebrali attivate peculiarmente da prove di “provocazione”
rispetto ai nuclei psicopatologici nucleari nella patologia anoressica (distorsione
dell’immagine corporea e paura del grasso).
In relazione all’entità del finanziamento, ridotto rispetto alla richiesta, non è stato possibile
effettuare le indagini di Neuroimaging, ma si è potuto provvedere a portare a termine un
lavoro preliminare che farà da base per la realizzazione del progetto iniziale nella sua
interezza. L’equipe di lavoro ha ridefinito gli obiettivi del Progetto ridimensionando e
ricalibrando il progetto stesso. Quindi è stato individuato come scopo della presente ricerca:
correlare i risultati a test neuropsicologici che indagano la capacità di astrazione, di problem
solving e le funzioni esecutive in genere, ad aspetti psicopatologici e di personalità peculiari
nell’Anoressia Nervosa (attitudini alimentari, temperamento e carattere, consapevolezza di
malattia, immagine corporea) e alla gravità dello stato nutrizionale.
MATERIALI E METODI
Lo studio ha per cui previsto il reclutamento di 15 pazienti anoressiche con indice di massa
corporea inferiore a 17.5, reclutate presso il Centro DCA ed un gruppo di controllo formato da
15 donne con indice di massa corporea compreso tra 18 e 21, associate per età, scolarità e
livello socio-culturale alle pazienti. Il progetto di ricerca si è articolato in tre fasi (di cui
l’ultima ancora in corso)
220

1. Training dei valutatori sulla somministrazione dei test neuropsicologici usati.
2. Valutazione psichiatrica-nutrizionale iniziale, effettuata tramite colloquio e test etero- ed
auto-somministrati:
a) EDI-II (disturbi del comportamento alimentare), TCI (personalità), STAXI (rabbia),
SCL-90 (sintomatologia psichiatrica generale), BSQ (immagine corporea), come test
autosomministrati.
b) CGI (gravità clinica), HAM-A (ansia), HAM-D (depressione SUMD (consapevolezza
di malattia), come test eterosomministrati.
c) La valutazione degli indici nutrizionali e del quadro metabolico-nutrizionale tramite
visita dietologica ed esami ematochimici e strumentali.
d) La valutazione neuropsicologica: Wisconsin Card Sorting Test (WCST), Prove di
fluenza verbale (orale-scritta); Trail Making A e B, Continuous Performance Test
(CPT), N-Back Test;
3. Elaborazione dei dati e sintesi dei risultati ottenuti.
RISULTATI
1. I due gruppi di soggetti si differenziano nel BMI, essendo le pazienti anoressiche più
magre (media = 15.3 SD= 1.7) rispetto ai controlli (media = 19.8 SD = 2.5), ed in molte
variabili dell’EDI-2 e nel punteggio totale del BSQ. Inoltre le pazienti AN mostrano una
tendenza a reprimere la rabbia ed un temperamento portato alla rabbia. I livelli di
depressione al BDI e all’HAM-D sono più elevati che nel gruppo controllo. L’SCL 90
rileva tratti ossessivi e depressivi. Al TCI le pazienti mostrano differenze significative
rispetto ai controlli nelle dimensioni HA (più elevata) e SD e C (più basse).
2. Le pazienti affette da AN hanno mostrato deficit nelle capacità di astrazione e di problem
solving rispetto ai controlli sani. Infatti in tutte le prove che indagano tali aspetti (WCST,
N-BACK, CPT, Prove di fluenza verbale e trail-making) le pazienti hanno ottenuto in
genere risultati peggiori rispetto ai controlli sani.
3. Dal punto di vista nutrizionale sono state raccolti parametri bio-umorali che potessero
essere correlati sia alla gravità della sintomatologia psichica che al funzionamento
neurocognitivo. Data però la molle di indagini e l’esiguo numero di soggetti, è stato
possibile riscontrare differenze rispetto ai controlli sani, mentre non è stato possibile
reperire associazioni significative tra tali alterazioni ed le prestazioni nell’esecuzione dei
test neuropsicologici.
4. Rispetto alle correlazioni tra rigidità di pensiero come misurata dai test neuropsicologici e
consapevolezza di malattia sono emerse alcune preliminari evidenze: le pazienti con
minore consapevolezza di malattia sono anche le pazienti con peggiori risultati nei test
neuropsicologici, vale a dire con una maggiore rigidità di pensiero.
CONCLUSIONI
Nonostante i risultati ottenuti siano da considerarsi come preliminari, bisogna sottolineare
come lo studio abbia evidenziato come le pazienti affette da AN presentino un quadro
psicopatologico spesso grave e complicato che sembra solo in parte correlato al quadro
nutrizionale. O ancora per lunghi periodi le pazienti anoressiche nonostante la magrezza
patologica possono vivere periodi di discreto compenso nutrizionale e psicologico, ma il
disturbo con il passare del tempo diventa sempre più difficile da trattare: questo perché le
alterazioni nelle modalità di pensiero astratto tendono a divenire più gravi, a compromettere la
capacità di critica, minando la consapevolezza di malattia e quindi riducendo la motivazione
verso le cure proposte.
221

Elisabetta Fea Filone tematico B1
Valutazione della diffusione di alimenti contenenti sostanze ad azione
estrogenica commercializzati in Piemonte
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Fisiologia Clinica
RAZIONALE ED OBIETTIVI
Gli alimenti risultano una potenziale via espositiva ad alcune sostanze presenti nell'ambiente
definite “Endocrine Disruptors” (ED), interferenti del sistema endocrino: i fitoestrogeni di
origine naturale e i fitofarmaci di origine antropica. Gli ED hanno la capacità di legarsi ai
recettori degli estrogeni (ERs) e iniziare (agonisti) o inibire (antagonisti) l’azione estrogenosimile.
Al fine di indagare questa potenziale attività si è proceduto alla messa a punto del test
in vitro E-screen su cellule MCF-7. Questo è un saggio di screening specifico, in quanto
focalizzato alla determinazione di sostanze con attività estrogenica, e si basa sulla semplice
valutazione dell’attività proliferativa di cellule di tumore mammario (naturalmente ricche di
ERs) capaci di crescere in presenza di estrogeni naturali e sintetici. L’estradiolo, utilizzato
come controllo positivo, consente di esprimere, attraverso il confronto con i risultati di
proliferazione rilevati nei campioni, una “concentrazione equivalente di estradiolo” (EEQ)
fornendo una quantificazione ipotetica delle sostanze estrogeniche presenti nel campione
testato; tale valore si esprime tramite il rapporto tra l’EC50 dell’estradiolo e quella del
campione analizzato (EC50 è la concentrazione in grado di determinare il 50% dell’effetto
proliferativi massimo). In una prima fase si è verificata la specificità del metodo e determinato
il protocollo di lavoro; sono state selezionate due estrazioni per i campioni alimentari: la
prima permette di estrarre in modo specifico gli isoflavoni, una delle categorie di composti
chimici classificati come fitoestrogeni che insieme ai lignani hanno un effetto sull’organismo
umano. La seconda estrae in modo aspecifico dall’alimento molecole di diversa origine,
naturale ed antropica, che potenzialmente possono mimare l’ormone estrogenino.
METODI E RISULTATI
Sono stati analizzati 14 diversi alimenti freschi, provenienti dalla grande distribuzione
organizzata (GDO) e 27 diversi alimenti freschi, provenienti dal Polo Chimico Regionale
Alimenti – ARPA Piemonte di La Loggia (TO), sui quali era stato eseguito il controllo per
valutare la presenza di residui fitosanitari. Su ogni campione sono state eseguite le due
estrazioni: si parte da una quantità nota di alimento (50 g) che, dopo essere stata
opportunamente estratta, viene testata sulle colture cellulari a diverse concentrazioni
(1mg/mL, 100 µg/mL, 10 µg/mL, 1 µg/mL). L’EC50 delle diverse curve di 17b-estradiolo
eseguite tramite E-screen ha un valore medio di 1.01 ng/L (± 0.94 ng/L), mentre per i controlli
positivi effettuati con i due isoflavoni genisteina e daidzeina l’EC50 è risultata
rispettivamente 1.51 µg/L e 0.16 µg/L: come riportato in letteratura i due isoflavoni risultano
essere almeno 3 - 4 ordini di grandezza meno potenti dell’estradiolo. Il primo gruppo di
alimenti esaminati, provenienti dalla GDO e rappresentati da 9 tipi di verdura e legumi e 5 di
frutta presenta un EC50 variabile tra 3 e 390 mg/L (6 - 9 ordini di grandezza meno potenti
dell’estradiolo). L’EEQ media è di 3.79 ± 8.31 µg/Kg di alimento, per gli alimenti sottoposti
ad estrazione specifica per gli isoflavoni, e di 2.38 ± 2.80 µg/Kg di alimento, per gli alimenti
estratti in modo aspecifico. L’alimento che ha mostrato la maggiore attività proliferativa, a
222

seguito dell’estrazione specifica, è la soia che in termini di EEQ ha valori di 24.3 µg/Kg
alimento; altri alimenti di cui è nota la presenza di isoflavoni e che hanno risposto
positivamente al test sono: broccoli (0.5 µg/Kg alimento), fagioli (1.0 µg/Kg alimento), carote
(0.2 µg/Kg alimento), prugne (2.1 µg/Kg alimento), mele (1.1 µg/Kg alimento); altri alimenti
hanno dato risposta positiva al test nonostante siano noti più per la presenza di lignani che non
di isoflavoni: zucchine (0.2 µg/Kg alimento) e uno dei due campioni di limoni (0.5 µg/Kg
alimento); infine per cavolfiori, per i quali si segnala la presenza in tracce di isoflavoni, non
c’è stata risposta con il test applicato.
Gli alimenti ottenuti dall’ARPA, rappresentati da 13 tipi di verdura e 14 di frutta, hanno un
EC50 variabile tra 4 e 240 mg/L (6 - 9 ordini di grandezza meno potenti dell’estradiolo).
L’EEQ media è di 3.11 ± 2.90 µg/Kg di alimento per gli alimenti sottoposti ad estrazione
specifica per gli isoflavoni e 10.06 ± 4.17 µg/Kg di alimento per gli alimenti estratti in modo
aspecifico (tale differenza è significativa applicando il T-test, p

Riccardo Ferracini Filone tematico C1
Nuovo modello clinico per la quantificazione dell’attivazione degli
osteoclasti da parte delle cellule metastatiche.
ASO S. Giovanni Battista
Struttura Complessa Ortopedia e Traumatologia
CONTESTO E RAZIONALE
Le metastasi ossee, tradizionalmente classificate come osteolitiche (che determinano
riassorbimento osseo) od osteoblastiche (con neo-deposizione ossea), rappresentano una delle
più gravi complicazioni per i pazienti oncologici e possono avere esiti fortemente invalidanti.
La qualità di vita (QOL) dei pazienti affetti da tumori solidi peggiora a causa delle metastasi
ossee e gran parte di essi accusano forti dolori o fratture patologiche. Le metastasi osteolitiche
sono caratteristiche di alcuni tipi di tumori, più frequentemente i carcinomi polmonari,
mammari, renali, e tiroidei. Il controllo della localizzazione primitiva con interventi
chirurgici, radioterapia e terapia medica ha prolungato la vita dei pazienti affetti da tumore del
polmone, pertanto sempre più frequentemente si assiste allo sviluppo di metastasi osteolitiche
in tali pazienti. Attualmente, non esistono sistemi diagnostici in grado di prevedere l’insorgere
della lesione ostreolitica, che è normalmente evidenziata mediante esami radiologici. Le
cellule deputate alla degradazione del tessuto osseo sono gli osteoclasti (OC), originati dalla
fusione di cellule mononucleate midollari circolanti nel sangue periferico, i precursori degli
osteoclasti (OCP).
METODI E RISULTATI
E’ stato proposto che un aumento del numero di OCP circolanti sia responsabile di un
riassorbimento patologico dell’osso. Questa ipotesi è stata confermata dall’osservazione che
un numero elevato di OCP è stato rilevato nel sangue periferico di pazienti affetti da mieloma
multiplo, malattia di Paget ed artrite psoriasica. In questa fase dello studio abbiamo
focalizzato la nostra attenzione sullo studio dei carcinomi del polmone non a piccole cellule,
in quanto tale patologia presenta un’elevata potenzialità metastatica, sostenuta da almeno tre
fattori: la ricca vascolarizzazione; l’estesa rete linfatica del polmone; la costante motilità del
torace che facilita la diffusione. I siti metastatici più frequenti sono l’osso, il fegato, le
ghiandole surrenali ed il cervello. Una prima serie di dati raccolti dall’analisi di sangue
periferico di pazienti affetti da tumori polmonari con metastasi osteolitiche, ha evidenziato
anche in questo modello patologico, un aumento di OCP circolanti che sembrano correlare
direttamente col decorso clinico della malattia. I pazienti inclusi nel progetto di ricerca, sono
stati sottoposti ad un prelievo ematico dal quale sono state separate le cellule mononucleate di
sangue periferico (PBMC). I PBMC sono stati coltivati in presenza ed in assenza dei fattori di
differenziamento M-CSF e RANKL e dopo 15 giorni gli OC maturi sono stati identificati
mediante colorazione immunoistochimica per la fosfatasi acida tartrato resistente (TRAP). Per
valutare l’effettiva capacità di riassorbimento degli OC, i PBMC dei pazienti sono stati
coltivati su matrice inorganica simile all’osso. Le cellule sono state piastrate in presenza e in
assenza dei fattori di crescita, al termine sono stati identificati e contati gli OC e rimosse tutte
le cellule dal substrato, rendendo evidenti le lacune di riassorbimento. Il saggio di
osteoclastogenesi spontanea è definita come la formazione di OC regolata positivamente e
negativamente da un complesso sistema di segnali che coinvolge l’attivatore del recettore del
224

fattore di trascrizione NF–kB (RANK) ed il ligando dell’attivatore del recettore di NF-kB
(RANKL), membri della famiglia del fattore di necrosi tumorale (TNF-alfa). I dati raccolti su
questo saggio in vitro hanno permesso di osservare il rapporto causa-effetto tra
osteoclastogenesi spontanea e la presenza di lacune di riassorbimento, indice di un attivo
rimodellamento osseo a carico degli OC. I sieri ed i surnatanti delle colture, raccolti durante il
periodo di crescita degli OC in vitro, sono stati testati per valutare la presenza di fattori proosteoclastogenici.
In particolar modo l’interleuchina-7 è presente a livelli elevati nei sieri dei
pazienti con metastasi ossee rispetto ai controlli normali; e nei surnatanti questa citochina
svolge un ruolo fondamentale nel differenziamento degli OC. Inoltre, il fatto che la citochina
infiammatoria TNF-alfa sia presente ad alti livelli nei surnatanti delle colture, mentre RANKL
(noto fattore di controllo dell’osteoclastogenesi classica) sia presente in minime quantità,
suggerisce che l’osteoclastogenesi spontanea è regolata da un meccanismo TNF-alfa
dipendente e RANKL indipendente. I parametri emato-chimici standard comunemente usati
per monitorare il metabolismo osseo dei pazienti sono: Calcemia, Fosforemia, Fosfatasi
Alcalina, Cross-links del collagene e PTH. I pazienti sono stati sottoposti a questi esami alla
diagnosi e durante i follow-up. I dati degli esami emato-chimici sono confrontati con i risultati
ottenuti dal saggio di osteoclastogenesi sugli stessi pazienti. Dati preliminari dimostrano che il
saggio di osteoclastogenesi sembra avere un riscontro diagnostico, e può essere usato per una
diagnosi preventiva di metastasi ossee. Se tale saggio si confermerà utile nel predire la
formazione di lesioni ossee, esso potrà rapppresentare un importante strumento, assieme alla
terapia precoce con bisfosfonati, per il trattamento dei pazienti affetti da cancro con elevato
rischio di metastatizzazione ossea. Al fine di ottenere un valore statisticamente significativo
sulle capacità predittive del saggio di osteoclastogenesi, stiamo raccogliendo un’ampia
casistica e quindi i dati conclusivi di questo studio non sono ancora disponibili.
PUBBLICAZIONI
Le attività svolte dal gruppo di ricerca di Osteoncologia del Dr. Ferracini Riccardo sono
relazionate nelle seguenti pubblicazioni:
Roato I, Grano M, Brunetti G, Colucci S, Mussa A, Berretto O, Ferracini R “Mechanisms of
spontaneous osteoclastogenesis in cancer with bone involvement” FASEB J, 2005
Roato I, Brunetti G, Gorassini E, Grano M, Colucci S, Buffoni L, Ruffini E, Manfredi R,
Mussa A, Bertetto O, Ferracini R “IL-7 up-regulates TNF-alpha-dependent osteoclastogenesis
in patients affected by solid tumor”submitted 2006.
225

Ezio Ferroglio Filone tematico D2
Indagine sul reale status dell'echinococcosi/idatidosi in Piemonte
Università degli Studi di Torino
Dipartimento diProduzioni Animali, Epidemiologia ed Ecologia
OBIETTIVO
Lo studio ha ampliato, considerando i risultati ottenuti e la comparsa di nuove emergenze
sanitarie, il proprio spettro d’interesse andando ad analizzare anche la situazione nel
patrimonio bovino, estendendo la ricerca alla volpe per la ricerca di Echinococcus
multilocularis, e valutando anche, tramite l’analisi delle SDO, la situazione nell’uomo.
METODI E RISULTATI
Per valutare la reale prevalenza dell’idatosi negli ovini sono state analizzate 88 pecore adulte
regolarmente macellate presso i macelli della regione. Di queste 34 provenivano da
allevamenti regionali e 8 (24%) sono risultate positive. Le restanti 54 pecore provenivano
dalla Francia e di queste solamente 3 (5.6%) sono risultate positive. Per quanto riguarda i cani
sono stati testati con un test ELISA per la ricerca del coproantigene di Echinococcus spp. 114
cani da pastore provenienti da 29 allevamenti ovini della regione. Trentadue cani appartenenti
a 19 allevamenti sono risultati positivi (28.1%) secondo i parametri del test. La positività di
uno di questi soggetti, deceduto per altre cause, è stata confermata all’esame necroscopico del
tratto digerente. Per valutare il rischio legato alla presenza del lupo sono stati inoltre analizzati
210 campioni fecali di lupo provenienti dalla Valle Stura (34), Val Susa (55) e Val Pesio
(121) di cui 55 (26.9%) sono risultati positivi al test del coproantigene. Nessuno dei 7 lupi
analizzati è risultato positivo al test del coproantigene, alla PCR ed alla ricerca diretta del
parassita. L’indagine è stata estesa ai bovini e tramite attivazione contatti con macelli
autorizzati (INALCA) sono stati reperiti i dati relativi a 43838 bovini piemontesi macellati
nell’ultimo triennio di cui 133 (0.30% sono risultati positivi). Considerata la costanza di
segnalazioni da Echinococcus multilocularis in aree alpine italiane si è provveduto ad attivare
un sistema di sorveglianza sulle volpi nel Verbano-Cusio-Ossola che è l’area confinante con il
focolaio svizzero a noi più vicino. Sono state raccolte ed analizzate 89 volpi di cui 7 positive
al test del coproantigene. Nessuno dei 7 soggetti positivo al test ELISA per la ricerca del
coproantigene è risultato positivo alla ricerca del DNA del parassita con la PCR ed all’esame
diretto effettuato sul pacchetto intestinale dei soggetti.
CONCLUSIONI
L’analisi delle SDO ha permesso di evidenziare un marcato aumento dei casi umani che si
erano mantenuti al disotto della decina dal 1998 al 2002, mentre nel 2003 e 2004 sono saliti
rispettivamente a 29 e 37. In molti casi i pazienti sono di origine extracomunitaria e quindi
non è possibile ad ora conoscere se ritratta di infestazioni acquisite in Piemonte. Sono in corso
gli approfondimenti del caso per chiarire anche questo punto. L’analisi dei risultati ottenuti
mostra chiaramente come l’echinococcosi/idatidosi sia una zoonosi che, nonostante l’ormai
più che trentennale normativa, è ancora presente in Piemonte con dei valori assolutamente
non trascurabili. In particolare emerge come i dati rilevati, sia pur ottenuti su campioni ridotti
siano significativamente superiori a quelli ufficiali. In particolare discordano fortemente i dati
226

delle positività al macello, che per gli ovini sono inferiori allo 0.05%, e quanto da noi rilevato
sul campo. A supporto dei dati da noi ottenuti va segnalato come oltre il 30% delle pecore
predate da lupi siano comunque positive per la presenza di almeno un’idatide e questo
giustifica le positività al test del coproantigene rilevate nelle feci di lupo. Il dato rilevato negli
ovini macellati, già di per se preoccupante, e ulteriormente suffragato dalle positività rilevate
nei cani. Anche se il test del coproantigene fornisce una sovrastima, a causa delle possibili
cross-reattività con altri Tenidae, il valore riscontrato è comunque elevatissimo. L’assenza di
un capillare controllo e di un’anagrafe ovi-caprina affidabile, la crescente presenza di cittadini
di origini extracomunitarie per le quali la carne di pecora rappresenta un alimento ricercato,
nonché il costo della macellazione presso macelli ufficiali favoriscono probabilmente una
diffusa pratica di macellazioni clandestine. L’importanza della macellazione clandestina nel
mantenimento del ciclo del parassita e infatti ben conosciuta e documentata. La segnalazione
di positività negli ovini al macello attiva le disposizioni di legge vigenti, ma il trattamento del
cani aziendali non viene controllato e spesso è eseguito in modo inappropriato (nessuno tiene
il cane in ambiente confinato e provvede alla distruzione delle feci). Questo giustifica il
mantenimento, con i valori individuati, di questa parassitosi nelle aree piemontesi. Le
tipologia delle positività riscontrate nei bovini, su un campione di 130 le cisti esaminate erano
tutte sterili, lascia supporre come questa specie appaia come vittima piuttosto che come
serbatoio dell’infestazione. E’ presumibile che le positività nei bovini siano riconducibili ad
ingestione di alimenti contaminati dalle feci di cani al seguito delle greggi ovine transumanti.
L’assenza di positività per E.multilocularis nelle volpi indica come questa grave zoonosi non
abbia ad oggi ancora varcato l’arco alpino. La segnalazioni di decine di casi in Trentino-Alto
Adige, indica però come il rischio di una sua diffusione verso il versante italiano delle Alpi
sia una reale minaccia per la salute pubblica. Per quanto riguarda i casi umani andrà
approfondita l’analisi epidemiologica, anche con l’aiuto ove possibile della genetica
molecolare, dei casi per verificare se si tratta di casi importati o se sono effettivamente casi
autoctoni.
227

Giorgio Fezia Filone tematico D2
Indagine sierologica sulla presenza di infezione da BIV (Bov
Immunodeficency Virus) in bovini da latte in Piemonte
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta – Sezione di Alessandria
CONTESTO E RAZIONALE
La positività sierologica nei confronti della Biv è stata segnalata in molte nazioni del mondo.
La prevalenza dell’infezione nel sud degli Stati Uniti ed in Francia si attesta attorno al 4%,
mentre in Canada ed Olanda è del 5.5 %. In Italia esiste un unico studio condotto
dall’Università di Parma del 1998 dove si segnala una percentuale di positività sierologica
valutata al 5.8 %. E’ stata inoltre osservata una più elevata prevalenza in vacche da latte
rispetto a quella da riproduzione o da carne. Il Virus dell’immunodeficienza bovina (BIV)
appartiene ai lentivirus ed è stato isolato per la prima volta nel 1969 in una vacca da latte. Il
soggetto presentava linfocitosi, linfoadenopatia, e lesioni al sistema nervoso centrale.
L’impatto della BIV sulla salute dei bovini è ancora un argomento discusso ed uno delle
difficoltà nell’assegnarle un ruolo patogeno è legata alle metodiche utilizzate. Sebbene sia
stata segnalata in diverse parti del mondo, le performances dei metodi utilizzati spesse volte
sono inattendibili per la presenza di falsi positivi e per la circolazione negli allevamenti di più
ceppi virali (Biv –R29, Biv Fl112, Biv Fl 491). Per tale motivo è nata la necessità di utilizzare
un metodo che riconosca i principali gruppi. La metodica immunoenzimatica (EIA) per la
ricerca di anticorpi anti peptidi transmembrana di molti lentivirus si è dimostrato molto
utile per individuare le infezioni da FIV del gatto, da HIV nell’uomo, per EIAV(Anemia
infettiva equina) e CAEV (artrite encefalite caprina). In base a queste considerazioni,
recentemente, il Central Veterinary Laboratory inglese, adottando questa strategia, ed
utilizzando la TM glicoproteina dell’envelope del virus BIV, ha isolato il determinante
antigenico immunodominante che è stato utilizzato per questa ricerca.
MATERIALI E METODI
La prova è stata effettuata presso i laboratori del dipartimento di Biotecnologie della sede di
Torino. Sono stati utilizzati n°261 sieri di bovino provenienti dalle province di Alessandria e
Torino, appartenenti a 4 diversi allevamenti. Si tratta di soggetti di sesso femminile, altamente
selezionati e di età superiore ai 3 anni, da stalle indenni da Leucosi bovina enzootica.
L’antigene utilizzato, costituito dai peptici sintetici (TM) è stato fornito dal Dipartimento di
virologia del Central Veterinary Laboratory (CVL) - Surrey (GB), così come i sieri positivi,
negativi ed il protocollo operativo. Non esistendo in commercio kit adatti alla ricerca si è
proceduto alla preparazione delle piastre a 96 pozzetti secondo lo “Standard Operative
Procedure” del “Veterinary Laboratory Agency” con l’utilizzo di siero di capra per preparare
la soluzione di bloccaggio e coniugato di topo anti IgG bovine. La preparazione delle piastre
ha richiesto l’incubazione per una notte a temperatura di refrigerazione, mentre i risultati della
prova si sono ottenuti durante la giornata. I campioni di siero sono stati testati- replicati in
doppio per evitare possibili errori di dispensazione ed in ogni piastra sono stati aggiunti i
campioni sicuramente positivie negativi. I sieri ed i controlli sono stati preventivamente diluiti
1:10. La lettura è stata effettuata utilizzando un fotometro con filtri a lunghezza d’onda di
405nm. Per l’interpretazione dei risultati è stato stabilito un valore soglia così determinato:
(valore di assorbanza del bianco – valore assorbanza controllo negativo) / (valore assorbanza
controllo positivo – valore di assorbanza del controllo negativo).
228

I campioni con un valore superiore alla soglia (cutt-off) individuato sono stati riconosciuti
come positivi, mentre gli inferiori come negativi.
CONCLUSIONI
Sono stati testati n° 261 campioni di sangue bovino. Sono risultati positivi n° 2 sieri
corrispondenti ad una percentuale del 0.7 %. La ricerca conferma la presenza di infezione
anche nella Regione Piemonte, sebbene con una bassissima prevalenza. L’indagine iniziata
meriterebbe ulteriori approfondimenti sullo stato di salute degli animali colpiti, per valutare la
presenza di manifestazioni cliniche riportate in letteratura.
229

Dario Fontana Filone tematico C1
Ricerca di nuovi markers e antigeni di possibile utilità diagnostica
mediante approccio proteomico nei tumori urologici
Università degli Studi di Torino - Dipartimento di Discipline Medico-Chirurgiche
Divisione Universitaria di Urologia II
CONTESTO E RAZIONALE
La disponibilità di markers specifici, soprattutto se dosabili su liquidi biologici di facile
prelievo quali sangue o urine, può influenzare profondamente i protocolli diagnostici e
terapeutici permettendo diagnosi precoci e quindi tassi di guarigione più elevati; ne è stato un
esempio l’enorme incremento delle diagnosi di carcinoma prostatico in stadi iniziali,
suscettibili quindi di terapia con intento radicale, promossa dalla diffusione del dosaggio
dell’Antigene Prostatico Specifico (PSA). Per la maggior parte dei tumori non sono ancora
noti antigeni specifici; in particolare, non sono noti markers tumorali clinicamente utilizzabili
per neoplasie urologiche di ampia diffusione ed elevato impatto sociale quali il carcinoma
uroteliale della vescica e il carcinoma a cellule renali.
OBIETTIVO
L’obiettivo del nostro lavoro è stata la messa a punto di tecniche che consentissero lo studio
delle modificazioni del proteoma nelle cellule di tessuti tumorali rispetto a quelle provenienti
da tessuti sani, la caratterizzazione delle proteine identificate e lo studio dell’espressione in
PCR quantitativa di alcuni RNA messaggeri relativi a proteine correlate con il fenotipo
tumorale.
METODI E RISULTATI
Sono stati utilizzati campioni di 12 neoplasie renali e di 10 neoplasie vescicali prelevati da
pezzi operatori di nefrectomia radicale e cistectomia radicale (il prelievo è stato eseguito in
modo da non inficiare per nulla la qualità del campione da inviare all’esame istopatologico);
dagli stessi pezzi operatori sono stati prelevati campioni (di analoghe dimensioni) di tessuto
sano. I campioni sono stati trasportati al laboratorio in ghiaccio secco e qui conservati in
congelatore in attesa del processing. Uno degli scopi del nostro lavoro è stato di approntare
una metodica che consentisse di migliorare i protocolli di studio di espressione proteomica e
genomica su piccoli campioni bioptici. Abbiamo quindi messo a punto una tecnica di
estrazione miniaturizzata per purificare proteine ed acidi nucleici dallo stesso campione.
Inoltre, per ridurre la quantità di proteine necessarie per l’analisi, abbiamo ottimizzato una
separazione mediante elettroforesi 2D di piccolo formato e ne abbiamo confrontato
l’efficienza con il formato normalmente utilizzato. I risultati ottenuti hanno indicato che
utilizzando un quinto delle proteine che normalmente si utilizzano nell’elettroforesi a largo
formato, abbiamo ottenuto, con l’elettroforesi di piccolo formato, lo stesso numero di spots
con una risoluzione molto simile. Le proteine separate nei gel sono state identificate mediante
MALDI-TOF peptide mass fingerprinting. L’identificazione è avvenuta in seguito a proteolisi
”in situ” degli spots elettroforetici. Il digerito triptico è stato depositato e fissato su matrice
solida. I digeriti triptici sono stati quindi analizzati ed il “peptide map” ottenuto è stato
confrontato con le mappe peptidiche predette dalle sequenze geniche. Considerando solo le
proteine con abbondanza relativa alta, le metodiche utilizzate hanno consentito di identificare
circa 300 proteine su gel convenzionale e 140 con gel a formato ridotto. Tuttavia è stato
230

possibile ottenere livelli di sensibilità simili tra le due tecniche analizzando le proteine con
abbondanza relativa più bassa con le tecniche di spettrometria di massa (Q-TOF). La misura
quantitativa dell’espressione genica è stata fatta, sugli mRNA ottenuti dagli stessi prelievi di
tessuto, alfine di caratterizzare meglio le proteine identificate utilizzando la Real-Time RT-
PCR. Si è utilizzato il SYBR-Green come marcatore fluorescente poiché possiede una buona
sensibilità. La specificità si è ottenute grazie all’utilizzo delle curve di melting. Ogni reazione
di PCR è stata ottimizzata in modo da ottenere la migliore efficienza. Gli mRNA estratti da 10
mg di tessuto sono risultati sufficienti per eseguire circa 1000 tests di Real-time PCR.
CONCLUSIONI
L'utilizzo del protocollo per lo studio del corredo proteomico e dell'espressione genica da noi
utilizzato ha fornito quindi risultati tecnici soddisfacenti, pur effettuando prelievi di tessuto di
minima entità (al massimo 10 mg), senza ostacolare l'esecuzione del normale esame
istopatologico. Il confronto tra tessuti sani e tessuti tumorali attraverso l’analisi
bidimensionale e l’analisi mediante MALDI-TOF ha consentito di evidenziare proteine
espresse in maniera differenziale tra tessuti sani e tumorali. La definizione di proteine
specifiche sarà seguita dalla valutazione della loro utilità diagnostica (ovviamente maggiore
se dosabili in liquidi biologici quale sangue o urine). Le tecnologie proteomiche possono
peraltro fornire dati utilizzabili anche in altre direzioni, quali lo studio delle modificazioni di
alcune proteine indotte da mutazioni correlate all’insorgenza e crescita della neoplasia o la
caratterizzazione di antigeni tumorali utilizzabili oltre che per fini diagnostici anche per il
possibile sviluppo di vaccini tumorali.
231

Ettore Fontana Filone tematico B1
Prevalenza di Listeria monocytogenes nel gorgonzola della Regione
Piemonte
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta
La ricerca bibliografica ha permesso di conoscere il processo produttivo del gorgonzola, per
identificare i punti a rischio per la permanenza di Listeria monocytogenes (L.m.). I dati
bibliografici dimostrano che raramente alla positività per L.m a livello ambientale e in crosta
si accompagna una positività nella pasta, il che fornisce una valida motivazione alle analisi
effettuate nel nostro Paese, che richiedono l’assenza di L.m dalla sola pasta, trattandosi di un
formaggio a crosta non edibile. In altre nazioni viene invece richiesta l’assenza in crosta e
pasta, il che, in passato, ha comportato allerte internazionali a carico di produttori italiani.
Inoltre, da studi precedenti, si evince che i fattori correlati alla presenza di Listeria sono
dovuti non solo all’ambiente ma anche a caratteri morfologici della forma. Queste ed altre
caratteristiche sono state considerate e annotate al momento del prelievo, allo scopo di
evidenziare l’eventuale presenza di fattori di rischio. In base ai dati regionali ed a quelli
forniti dal consorzio, sono stati prelevati campioni di costa consistenti in pool di almeno 5
forme, da tutti i lotti a fine stagionatura presenti nelle celle.
In particolare sono stati prelevati quelli ad uno stadio di 10-15 giorni dal momento della
commercializzazione. Contestualmente è stata prelevata anche la pasta, conservata in cella
frigo e analizzata nel caso in cui la crosta fosse risultata positiva. Il prelievo dei tamponi
ambientali è stato effettuato nei locali di stagionatura individuando da 15 a 25 punti per ogni
impianto, in relazione alle dimensioni ed alla struttura dello stesso. È stato infine conservato
ed utilizzato come tampone un calzare degli operatori che hanno effettuato i prelievi. Poiché
un lavoro analogo era in corso presso l’IZS di Brescia l’elenco degli stagionatori è stato
concordato, in modo da eseguire i prelievi una sola volta presso ogni stabilimento. Pertanto in
Piemonte sono stati visitati 14 stabilimenti di stagionatura. Tutti i campioni sono stati
prelevati con strumento sterile e conservati in sacchetti per stomacher sterili e sigillati,
all'interno di contenitore termico. I prelievi sono stati effettuati dal borsista accompagnato da
personale dell’ASL 13 e ASL 17. Allo scopo di uniformare le tecniche di prelievo è stato
seguito il protocollo concordato con i colleghi dell’ IZS di Brescia, già allegato allo stato di
avanzamento. In aggiunta a questo è stata creata una check list avente l’obiettivo di
evidenziare caratteristiche peculiari dei singoli prodotti o ambienti, da mettere in relazione
con eventuali positività per L. monocytogenes. Le analisi sono state effettuate presso il
laboratorio Controllo Alimenti dell’ Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta con il metodo VIDAS L.m II (July 3rd, 2002 - Attestation Bio-12/9-
07/02), o con metodica tradizionale; la conferma ha seguito il metodo AFNOR e conta della
L.m con metodo ISO 11290/2:1997.
I ceppi identificati su base biochimica come L.monocytogenes sono stati conservati in
criobank, e sottoposti a PFGE e sierotipizzazione da parte del Settore di Ispezione degli
alimenti- Dipartimento di Patologia Animale - Università degli Studi di Torino. Per quanto
riguarda la PFGE, l’analisi è stata condotta seguendo il protocollo proposto da PulseNet
(Graves et Swaminathan, 2001). Il DNA genomico è stato digerito con gli enzimi di
restrizione ApaI ed AscI e successivamente sottoposto ad elettroforesi. Le immagini dei
profili ottenuti sono state analizzate con il software BioNumerics (Applied Maths) e
normalizzate in base alle corse di almeno 3 standard per gel. I valori di similarità sono stati
232

calcolati tramite il metodo UPGMA con medie matematiche e coefficiente Dice dal software
Bionumerics (1% optimization e 1% position tolerance per AscI, 1,2% position tolerance per
ApaI).
Per la sierotipizzazione si sono utilizzati Listeria Antisera "SEIKEN" (Denka Seiken, Tokyo,
Japan) secondo il protocollo fornito dalla ditta produttrice. È stata apportata una modifica per
la determinazione degli antigeni flagellari i microrganismi vengono seminati in BHI semisolido
(0,2% agar) a 37°C per 3-4 volte e quindi inoculati in BHI liquido e incubati a 25°C
per 48-96h. I risultati evidenziano nella maggior parte dei casi l'assenza del patogeno nella
pasta, mentre in alcuni stabilimenti sono state riscontrate positività sia a livello ambientale sia
a livello di crosta. Sono stati analizzati 57 campioni di formaggio – crosta: sono risultati
positivi per L.m con metodo VIDAS 19 campioni, ma solo in 2 casi è stata confermata la
presenza con metodo tradizionale. Uno di questi è risultato positivo anche su pasta. A livello
ambientale sono stati analizzati 201 campioni, di cui 10 calzari e 191 tamponi. Sul totale sono
risultati positivi per L.m con metodo VIDAS 59 campioni variamente dislocati, ed in 10 casi
sono stati confermati. Percentuali così basse di identificazione di L. m. con il metodo
tradizionale possono essere riconducibili alla contemporanea presenza di L. innocua, che ha
capacità di replicazione superiore alla L. m., mascherandone a crescita. È stata riscontrata la
presenza di L.m confermata con metodo tradizionale in asse stagionatura (2,5 %), ruota
carrello (16,6 %), salamoia/salinatrice (11,11 %), ma la contaminazione ambientale risulta
comunque forte se si osservano i dati in VIDAS (si va da una positività del 66,7% delle
fascette al 7% dell’impianto di condizionamento, con una media del 36,7%).
È stata osservata una correlazione tra la positività VIDAS ed il colore della crosta: croste
arancioni risultano contaminate più frequentemente di quelle chiare: risultano infatti positive
il 90% delle arancioni, il 60% di quelle bianche con muffa, 0% di quelle chiare, 25% di quelle
gialle e 16,7% di quelle rosa chiaro. Sono state raccolte altre informazioni riguardanti la
crosta, quali umidità, durezza, compattezza, presenza di fascette in legno o plastica allo scopo
di evidenziare la presenza dei fattori di rischio per la presenza di L.m; tuttavia tale dato non
sembra statisticamente correlato alla positività. I risultati della tipizzazione molecolare hanno
permesso di suddividere, in base ai profili di restrizione ottenuti, i 9 ceppi analizzati in 4
PFGE-types per ApaI e in 5 PFGE-types per AscI. Si sono ottenuti 3 cluster per AscI e 4
cluster per ApaI scegliendo come valore minino di similarità l’80%. Per quanto riguarda la
sierotipizzazione, si sono riscontrati 2 sierotipi 1/2a (n°7) e 3a (n°2). Non è stata osservata
correlazione tra pulsotipi e sierotipo; infatti pulsotipi identici sono stati ritrovati in sierotipi
diversi.Si segnala che per la realtà in cui si è isolata L.m dai tamponi (n=3) e dalla pasta, si
tratta di un unico pulsotipo.
233

Marco Forni Filone tematico C1
Espressione dell’MGMT (enzima riparazione DNA) nei gliomi maligni e
correlazione con la risposta alla chemioterapia.
A.S.O. O.I.R.M. S. Anna
Servizio di Anatomia Istologia Patologica
MATERIALI E METODI
Lo studio ha permesso di analizzare oltre cinquanta tumori cerebrali, prevalentemente di
individui adulti con prevalenza dei glomi maligni (astrocitomi anaplastici e gliobastomi).
L’estrazione del DNA da tessuto fissato ed incluso in paraffina è stata effettuata su un numero
maggiore di casi ma la qualità del DNA estratto, pur risultando soddisfacente in quasi il 90%
dei campioni, non ha permesso di analizzare l’intera casistica clinica. La collaborazione con
altre strutture ha permesso di analizzare tumori di pazienti operati in sedi anche lontane e
riferiti solo per il trattamento chemioterapico. Il decorso clinico e il follow-up era valutabile
in un numero più ridotto di casi. Il numero dei casi analizzati ha tuttavia permesso una
valutazione statistica del significato prognostico della metilazione del promoter del gene
MGMT.
RISULTATI
Sono stati studiati 43 casi di glioma maligno (33 dell’adulto e 10 del bambino), sottoposti a
resezione chirurgica, seguita da radioterapia e chemioterapia a base di agenti alchilanti. Per
quanto riguarda i glioblastomi, la metilazione del promoter del gene per la MTMT è stata
ritrovata nel 42% dei casi dell’adulto contro solo il 10% del bambino, mentre nel caso degli
astrocitomi anaplastici nel 60% dei casi dell’adulto e in nessun caso del bambino. É stato
inoltre possibile effettuare nel sottogruppo dei glioblastomi dell’adulto una correlazione
preliminare tra risposta/outcome dopo terapia con agenti alchilanti e la metilazione del
promoter del gene MGMT.
Sia la mediana di sopravvivenza (16 mesi) che la percentuale di sopravviventi a due anni
(47%) nei pazienti con metilazione del promoter sono sovrapponibili a quella dello studio
EORTC (21,7 mesi e 46%). Solo pazienti “metilati” sopravvivono tre anni. Appare
ragionevole l’ampliamento dello studio in modo da comprendere non solo i glioblastomi, ma
anche gli astrocitomi diffusi (grado II e III) e i tumori oligodendrogliali (grado II e III).
La curva di sopravvivenza dei pazienti con promoter metilato appare significativamente
migliore dei casi con promoter non metilato. Questa significatività statistica, pur con un
numero limitato di casi indica l‘importanza della metilazione del promoter dell’MGMT come
fattore prognostico nei gliomi maligni.
CONCLUSIONI
Il progetto ha permesso di valutare:
1. la possibilità di ricercare importanti fattori prognostici molecolari da materiale diagnostico
fissato e incluso in paraffina;
2. la fattibilità di studi collaborativi tra diverse strutture regionali e nazionali;
234

3. l’importanza di individuare fattori prognostici robusti come base razionale per trattamenti
efficaci e per la ricerca di strategie terapeutiche innovative.
I dati ottenuti sono stati presentati in forma di relazione al Congresso della Società Italiana di
Neuro-Oncologia tenutosi a Napoli lo scorso novembre:
a) I.Morra, M. Forni, M. Muscio, F. Pulerà, P. Cassoni, A. Ducati, M. Naddeo, G. Faccani,
P. Peretta, L. Todisco, M. Nobile, R. Rudà, E. Trevisan e R. Soffietti. ”Correlazione tra
metilazione del promoter del gene MGMT e aspetti prognostici nei gliomi dell’adulto e
del bambino: risultati preliminari di uno studio retrospettivo del polo oncologo
“Cittadella” di Torino””
E’ in corso la stesura di un lavoro scientifico dettagliato sui dati ottenuti da questo progetto di
ricerca.
235

Paola Francia Di Celle Filone tematico C1
Utilizzo della Real Time PCR per la quantificazione della MMR in pazienti
con LLC-B sottoposti a terapia con Campath-1
Azienda Ospedaliera S. Giovanni Battista di Torino
CeRMS, Centro di Ricerca in Medicina Sperimentale
CONTESTO E RAZIONALE
La Leucemia Linfatica Cronica a cellule B (LLC-B) rappresenta la forma di leucemia
dell’adulto più frequente nel mondo occidentale. Il decorso clinico è assai variabile e non
esiste una strategia terapeutica uniforme ma piuttosto un atteggiamento nella cura che dipende
dallo stadio clinico e dall’inquadramento prognostico dei pazienti. Una terapia convenzionale
con Fludarabina e Ciclofosfamide (FC) può non essere sufficiente nel mantenere la
remissione clinica e in alcuni casi si tentano nuove terapie più aggressive in grado di
eliminare le cellule tumorali residue responsabili della ricaduta.
Sono proprio la sperimentazione nella LLC-B di nuovi approcci terapeutici e di nuovi metodi
di rilevazione della Malattia Minima Residua (MMR) i due fronti di approfondimento del
nostro progetto: da un lato l’impiego in seconda linea terapeutica di un anticorpo monoclonale
anti-CD52 (Campath-1) in pazienti con LLC-B resistenti a chemioterapia convenzionale o in
progressione;dall’altro il disegno di una metodica affidabile di valutazione quantitativa
molecolare della MMR tramite Real Time PCR.
MATERIALI E METODI
Sono stati arruolati 10 pazienti con LLC-B (età media 50-65) di cui 3 in stadio B Binet, 5 in
stadio C e 2 in stadio A in progressione.Tutti i pazienti risultano resistenti o in ricaduta dopo
terapia con agenti alchilanti. La sperimentazione consiste di 4 cicli con FC (F:25mg/m2;
C:250mg/m2) ogni 4 settimane; Campath-1 (Alemtuzumab, Schering AG) alla dose di 30 mg
viene somministrato endovena due mesi dopo la chemioterapia, tre volte la settimana, per 4-8
settimane. La risposta viene valutata in base a parametri clinici, immunofenotipici e
molecolari dopo i 4 cicli di FC, dopo ogni ciclo di 4 settimane di Campath-1 e durante il
follow-up.
Analisi molecolari: il riarrangiamento clonale delle Immunoglobuline (Ig) di ciascun
paziente è stato caratterizzato tramite studio delle regioni Ig FR1-JH in PCR e separazione
delle bande homoduplex su gel di poliacrilamide. La componente monoclonale è stata
sequenziata con metodo Big Dye Terminator su strumento AB310 (Applied Biosystems,USA)
e sulla sequenza IgH sono stati disegnati primer specifici per le regioni CDR2 e CDR3 utili
per lo studio qualitativo di MMR. Lo stesso disegno di PCR è stato allestito utilizzando il
SYBR Green I come intercalante fluorescente per Real Time PCR e l’analisi quantitativa è
stata condotta su strumento iCycler BIORAD, USA. Ogni riarrangiamento Ig è stato clonato
nel plasmide pTZ57R e diluito a concentrazioni note (107-1) per generare una curva standard
di calibrazione e misura del segnale. Analogamente è stato clonato un frammento del gene
GAPDH che è stato impiegato come normalizzatore.
236

RISULTATI
Al termine della terapia con FC la valutazione clinica è stata di 4 pazienti in remissione
completa (RC), 4 in remissione parziale (RP) e due pazienti stabili. Per tutti i pazienti è stato
sequenziato il clone IgH ma soltanto i quattro casi (RC o RP) per cui l’analisi molecolare di
primo livello ha dato risultato negativo sono andati allo studio qualitativo mediante primer
sequenza specifica e quantitativo in Real Time PCR. L’analisi qualitativa ha evidenziato in
due casi una risposta molecolare completa o parziale dopo Campath-1 seguita da recidiva
molecolare con PCR positiva, non ha mostrato risposta in un terzo paziente mentre per il
quarto ha documentato una remissione molecolare mantenuta nei tempi di valutazione del
follow-up (5 mesi). Il metodo di Real Time PCR con SYBR Green ha mostrato un elevato
grado di specificità (linfociti B policlonali sempre negativi e curve di melting costantemente
uniche) e sensibilità (6,0 x 10-1). Analogamente all’analisi qualitativa, la quantificazione
della MMR (numero di copie su mg di DNA e normalizzazione con GAPDH) ha mostrato per
due pazienti una riduzione importante del segnale (1-2 log) fino alla negativizzazione dopo
Campath-1 seguita da una ripresa di positività in PCR durante il follow up a 5 e 10 mesi.
Il terzo paziente ha mantenuto positività in tutti i punti studiati (1-2 log) mentre il quarto
paziente negativizzatosi già dopo FC è rimasto negativo fino all’ultimo punto di follow up
analizzato.
CONCLUSIONI
La MMR nella LLC-B viene solitamente valutata con metodi qualitativi basati sulla
specificità del riarrangiamento clonale delle Ig. L’introduzione di terapie aggressive in grado
di eradicare le cellule tumorali residue ha reso necessario considerare sistemi quantitativi di
monitoraggio della risposta molecolare cercando di standardizzare metodi altamente sensibili
e riproducibili ma con costi contenuti e realizzabili nella routine diagnostica. Il nostro studio
ha come finalità l’impiego in Real Time PCR del Sybr Green I come intercalante fluorescente
del DNA per analisi molecolare quantitativa di un protocollo sperimentale terapeutico con
Campath-1 per casi di LLC-B resistenti a chemioterapia convenzionale. In quattro dei dieci
pazienti arruolati sono state condotte in parallelo la metodica qualitativa di riferimento e
quella quantitativa utilizzando per entrambe come punti di specificità clonale le regioni CDR2
e CDR3 del riarrangiamento IgH. La Real Time PCR con Sybr Green ottimizzata ha mostrato
una buona specificità e una sensibilità 10-5-10-6, migliorativa rispetto ai metodi quantitativi
comunemente basati su sonda e primer riarrangiamento specifici. Il metodo si è dimostrato di
facile esecuzione e economico. L’impiego del Campath-1 nei quattro pazienti con LLC-B
analizzati ha portato a risultati eterogenei ma promettenti e in un caso ha determinato la
remissione molecolare. E’ necessario allargare lo studio all’intero gruppo di pazienti per una
valutazione conclusiva del protocollo terapeutico e del nuovo metodo di analisi in Real Time
PCR ideato.
237

Gianluca Gaidano Filone tematico A2
Varianti polimorfiche dei geni di riparazione del dna nei linfomi non-
Hodgkin B: implicazioni patogenetiche e cliniche
Università “A. Avogadro” del Piemonte Orientale
Dipartimento di Scienze Mediche
CONTESTO E RAZIONALE
La patogenesi dei linfomi non-Hodgkin B (LNH-B) è caratterizzata dall’accumulo di lesioni
genetiche somatiche, acquisite progressivamente dal tumore. Lesioni genetiche provocate da
agenti mutageni endogeni ed ambientali possono essere prevenute mediante attivazione dei
meccanismi di riparazione del DNA. Alcuni polimorfismi costituzionali dei geni di
riparazione del DNA alterano l’attività delle proteine codificate da questi geni e rappresentano
un fattore di rischio per sviluppo di tumori. Varianti polimorfiche implicate nella
tumorigenesi comprendono: i polimorfismi S326C di hOGG1, R399Q di XRCC1 e C8092A
di ERCC1, tre geni implicati nel meccanismo di riparazione del DNA “Base Excision Repair”
(BER); il polimorfismo L751G del gene XPD, coinvolto nel “Nucleotide Excision Repair”
(NER); il polimorfismo T421M di XRCC3, gene coinvolto nella riparazione delle lesioni a
doppia elica del DNA; e il polimorfismo I219L di hMLH1, gene implicato nel mismatch
repair (MMR). I polimorfismi dei geni della riparazione del DNA possono favorire
l’accumulo di lesioni genetiche somatiche, favorendo quindi la linfomagenesi. Inoltre,
l’efficacia clinica di numerosi agenti chemioterapici può essere modulata dai polimorfismi dei
geni di riparazione del DNA.
METODI E RISULTATI
Abbiamo eseguito l’analisi del rischio relativo per LNH-B associato alle varianti polimorfiche
di tre geni coinvolti nel meccanismo di riparazione del DNA tipo BER: XRCC1, hOGG1 e
ERCC1 ed alle varianti polimorfiche del gene XPD, coinvolto nel NER, del gene XRCC3,
implicato nella riparazione delle lesioni a doppia elica del DNA e del gene hMSH2, implicato
nel MMR. L’analisi delle varianti polimorfiche è stata eseguita su un totale di 261 LNH-B
suddivisi nelle varianti clinico-patologiche riconosciute dalla classificazione REAL/WHO. In
particolare, abbiamo analizzato 150 linfomi diffusi a grandi cellule B (LDGCB), 10 leucemie
a cellule capellute, 20 linfomi marginal a tipo MALT, 10 linfomi splenici della zona
marginale, 10 linfomi linfocitici, 10 linfomi linfoplasmacitici, 30 linfomi follicolari, 21
linfomi mantellari.
Il gruppo di controllo è consistito in 400 campioni di DNA da sangue periferico di donatori
sani matched per sesso, età e provenienza geografica. Mediante analisi PCR-RFLP del gene
XRCC1, abbiamo identificato la presenza in omozigosi del polimorfismo G28152A in una
rilevante frazione di LNH-B (34/204; 17%), mentre questo stesso polimorfismo è risultato
essere significativamente meno frequente nei controlli sani (34/392; 8.7%; p=0.004).
In particolare, il polimorfismo G28152A in omozigosi ha una prevalenza statisticamente
significativa nei linfomi con andamento clinico aggressivo, quali il linfoma mantellare (6/21;
29%; p=0.013) e il LDGCB (19/110; 17%; p=0.014), mentre è raro nella leucemia a cellule
capellute (1/10; 10%), nel linfoma tipo MALT (1/18; 6%) e nel linfoma linfocitico (1/15;
7%). Nel contesto dei geni coinvolti nel meccanismo di riparazione del DNA tipo BER, anche
per il gene hOGG1 abbiamo potuto osservare una prevalenza statisticamente significativa nei
238

pazienti con LNH-B. In particolare, la presenza in omozigosi del polimorfismo C1245G è
stata riscontrata in 19/203 (9%) pazienti con LNH-B ma solamente in 10/307 (3.3%) controlli
sani (p=0.0054). Analogamente a quanto osservato per il gene XRCC1, la variante
polimorfica C1245G del gene hOGG1 è risultata significativamente più frequente nei LNH-B
con andamento clinico aggressivo, quali i LDGCB e il linfoma mantellare (13/130; 10%;
p=0.008). Nel contesto dei LNH-B ad andamento clinico indolente, abbiamo riscontrato
un’incidenza significativamente superiore all’atteso della variante polimorfica C1245G del
gene hOGG1nel linfoma marginale tipo MALT (3/18, 17%; p=0.029). Questa variante
polimorfica, invece, risulta rara nel linfoma della zona marginale (0/6), nel linfoma
linfoplasmacitico (0/8) e nel linfoma follicolare (1/16; 6%).
A differenza di quanto osservato per i geni XRCC1 e hOGG1, la variante polimorfica
C8092A del gene ERCC1 presenta una incidenza nei LNH-B (12/206; 6%) analoga a quella
osservata nei controlli sani (30/362; 8.3%), anche se la frequenza di questo polimorfismo
risulta essere eterogenea nelle varianti clinico-patologiche di LNH-B. La presenza in
omozigosi di questo polimorfismo, infatti, risulta assente nella leucemia a cellule capellute
(n=10), nel linfoma linfocitico (n=15) e nel linfoma marginale del MALT (n=18), mentre è
rara nel LDGCB (6/112; 5.4%). Nel linfoma mantellare (2/21; 9.5%) e nel linfoma follicolare
(2/16; 12%), la variante polimorfica C8092A del gene ERCC1 è presente in una percentuale
di casi simile a quella attesa. Nel corso di questo progetto abbiamo analizzato, inoltre,
l’incidenza di varianti polimorfiche di geni coinvolti in altri meccanismi di riparazione del
DNA diversi dal BER.
In particolare, abbiamo studiato la variante polimorfica A35931C del gene XPD, coinvolto
nel NER; la variante polimorfica T421M di XRCC3, coinvolto nella riparazione delle lesioni
a doppia elica del DNA; e la variante polimorfica I219L di hMLH1, implicato nel MMR.
Complessivamente, la prevalenza della variante polimorfica A35931C del gene XPD è
relativamente elevata nei pazienti con LNH-B (42/203; 21%), ma non è significativamente
differente dalla prevalenza riscontrata nei controlli sani (58/386; 15%; p=0.085). Nelle
diverse categorie clinico-patologiche di LNH-B, l’incidenza di casi con variante polimorfica
A35931C è prevalente nel linfoma linfocitico (5/15; 33%) e nella leucemia a cellule capellute
(3/10; 30%), mentre è ridotta nel linfoma mantellare (3/21; 14%) e nel linfoma follicolare
(1/16; 6%). La variante polimorfica T421M di XRCC3 è stata riscontrata con una frequenza
sovrapponibile nei pazienti con LNH-B (31/203; 15%) e nei controlli sani (51/368; 14%;
p=0.71). Nel contesto dei LNH-B, inoltre, l’incidenza di casi con variante polimorfica T421M
è simile nelle diverse categorie clinico-patologiche della malattia. Analogamente, anche per la
variante polimorfica A676G del gene hMLH1 abbiamo potuto osservare una prevalenza
simile nei controlli sani (45/369; 12%) e nei pazienti con LNH-B (31/203; 15%; p=0.61). In
questi ultimi, inoltre, l’incidenza di questa variante polimorfica è simile nelle diverse
categorie clinico-patologiche della malattia.
Nel complesso, quindi, i risultati ottenuti dimostrano un significativo aumento del rischio
relativo a sviluppare linfoma associato a polimorfismi dei geni XRCC1 e hOGG1, coinvolti
nel meccanismo di riparazione del DNA tipo BER. In particolare, un deficit nella capacità
delle cellule di riparare le alterazioni delle basi nucleotidiche è associato ad una maggiore
probabilità di sviluppare LDGCB, il piu’ comune tipo di linfoma nel mondo occidentale.
239

Alberto Gambino Filone tematico C1
Modello sperimentale di Acute Pain Service a basso costo dell'A.O. San
Giovanni Battista di Torino
ASO S. Giovanni Battista – S.C.D.O. Anestesia e Ranimazione
METODI E RISULTATI
Il numero totale di interventi eseguiti, nel periodo studiato, nelle quattro SS.CC. è stato di
489. Il numero complessivo di schede che sono state compilate è di 392, pari all’81% rispetto
al numero di interventi totale: questa discrepanza è giustificata dal fatto che in due SS.CC. le
rilevazioni sono state effettuate inizialmente su tutti i pazienti per poi essere riservate, su
indicazone dell’anestesista, solo agli interventi di chirurgia laparotomica al fine di limitare il
carico di lavoro gravante sul personale infermieristico. In due SS.CC. la rilevazione è stata
effettuata prevalentemente da personale infermieristico; in una esclusivamente da personale
infermieristico mentre, nella quarta, da una in collaborazione continua diurna mediciinfermieri
e solo da infermieri durante le ore notturne.
Dall’analisi dei dati emerge una notevole varianza nei costi sostenuti dalle diverse SS.CC. La
spesa globale media/die per paziente ammonta a 96,78 €. In realtà, esiste uno spartiacque di
spesa molto ampio tra i reparti, i quali possono grossolanamente essere divisi in due gruppi. Il
primo di questi gruppi comprende due reparti (S.C.D.U. Chirurgia Plastica e S.C.D.O.
Urologia 3), “virtuosi” che hanno registrato una spesa/paziente/die inferiore alla media
aziendale finanche del 58%. Il secondo di questi gruppi comprende gli altri due reparti
(S.C.D.O. Chirurgia 7 e S.C.D.U. Chirurgia Oncologica) che si discostano al rialzo dalla
media, fino a + 69,90%. Le ragioni di questa disomogeneità sono essenzialmente due:
1. il numero delle rilevazioni;
2. le modalità terapeutiche e la durata del trattamento
Non a caso, ai due estremi di una ipotetica linea di spesa troviamo la S.C.D.O. Urologia 3 e la
S.C.D.U. Chirurgia Oncologica. La prima “stanzia” solo 40,28 € per paziente/die (pari al
41,62% della spesa media aziendale/paziente/die), pur facendo ricorso con elevata frequenza a
modalità di controllo del dolore di un livello più alto secondo le linee guida aziendali
(analgesia peridurale continua con o senza morfinici con PCA e morfinici con PCA con o
senza backflow): il contenimento della spesa è giustificato dal fatto che vengono utilizzato
pompe elettroniche per PCA, che hanno un costo/paziente inferiore e che la rilevazione è stata
fatta esclusivamente da infermieri e per il numero di giorni strettamente indispensabile a
rispettare quanto previsto dalle linee guida. All’estremo opposto si colloca la S.C.D.U.
Chirurgia Oncologica, che destina ben 164,43 € per paziente (169,90%), pur utilizzando
metodiche farmacologiche di controllo del dolore di livello più basso: viene tuttavia dedicato
molto più tempo al contatto col malato (fino a sei rilevazioni al giorno per sette giorni), il che
conferma l’elevato costo del lavoro. Nessuna S.C. ha segnalato difficoltà nella compilazione
della scheda di rilevazione, ma, dopo il termine del periodo di rilevazione, soltanto una di esse
ha introdotto tale scheda come strumento di rilevazione sistematica. Una S.C. ha continuato la
rilevazione utilizzando esclusivamente una scala numerica inserita in cartella infermieristica.
Una S.C. ha dovuto sospendere la rilevazione per cause di organizzazione aziendale. Una S.C.
ha utilizzato la scheda di rilevazione solo come strumento sperimentale per il periodo limitato
dello studio.
240

I protocolli ai quali si è ricorsi più di frequente, sono stati sono stati il 2B (analgesia epidurale
continua, in regime di infusione continua, o in regime di PCEA o a boli programmati con
anestetici locali e/o oppiacei e/o adiuvanti) ed il 3A, infusione continua endovenosa di
oppiacei ad alte dosi e/o in pazienti a rischio (pazienti di età > 70 anni, ASA > III). In tutte le
SS.CC. il controllo del dolore è stato sufficiente, con un VASR medio di 3.3 ed un VASD
medio di 4.18. A fronte dei risultati ottenuti (riduzione della sintomatologia dolorosa), risulta
che tutte le singole SS.CC. sono concordi nel sostenere l’utilità del modello di APS proposto
segnalando: 1. la riduzione del numero di chiamate dei p.ti 2. l’aumento della collaborazione
fra i vari membri dell’equipe 3. la risoluzione precoce di problematiche inerenti il dolore
mediante la presenza di referenti sul dolore 4. la riduzione dell’intervallo di tempo tra
chiamata del p.te e somministrazione dell’antidolorifico.
CONCLUSIONI
Un efficace controllo del dolore postoperatorio può essere affrontato solo attraverso la
costituzione di un servizio di dolore acuto: l’attività piena di un tale servizio non può
prescindere da un’assegnazione di fondi ad hoc. Naturalmente, il costo può essere mantenuto
basso affidandone la gestione ad infermieri particolarmente addestrati e con costanti input da
parte degli anestesisti; occorre, a tal fine, intraprendere un’azione di formazione e
motivazione di tutto il personale coinvolto nella gestione del paziente chirurgico e
l’organizzazione di tali iniziative non può prescindere dalla creazione di una Task Force
stabile che si occupi a tempo pieno delle problematiche accennate. Il problema dei costi del
personale sanitario è aggravato infine dalla necessità di garantire il servizio anche durante la
ore nutturne ed i giorni festivi: a questo proposito, riteniamo valida anche per la nostra A.O. la
proposta di una reperibilità telefonica che copra i periodi non lavorativi. Il presente studio
esurisce la propria finalità nell’analisi dell’impatto economico grezzo di un servizio
strutturato di trattamento del dolore acuto postchirurgico. Sono auspicabili ulteriori studi che
approfondiscano il reale impatto di una tale iniziativa; ogni valutazione di costi condotta in
modo rigoroso, deve necessariamente tenere conto non solo delle spese grezze, bensì anche
dei risparmi derivanti dalla minore morbilità fra i pazienti seguiti da un APS, in termini di
minore incidenza di complicanze e riduzione dei giorni di degenza: le esperienze europee
indicano infatti che, qualora applicato in modo integrato, un APS non solo si paga da sè, ma
consente anche di ottenere riduzioni di spesa.
Si auspica, inoltre, l’affiancamento, alla rete informatica aziendale già in essere, di un
network riservato alle problematiche del dolore acuto.
241

Armando Genazzani Filone tematico C1
Nuove strategie terapeutiche: la calcineurina come bersaglio nella
terapia delle malattie cardiache e neurodegenerative
Università del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”
Dipartimento di Scienze Chimiche, Alimentari, Farmaceutiche e Farmacologiche
CONTESTO E RAZIONALE
Studi recenti hanno evidenziato che molte patologie di elevato interesse sociale, quali
l'ipertrofia cardiaca e parte del danno cerebrale, possono essere ricondotte ad esagerate
attivazioni dei meccanismi classici di trasduzione del segnale (e.g. calcio, cAMP, etc). Queste
attivazioni aberranti hanno come conseguenza il cambiamento della stato di fosforilazione
(tramite un'alterazione dell'equilibrio tra attività di chinasi e fosfatasi) di proteine importanti,
che quindi ne modifica l'attività biologica. In teoria, quindi, l'intervento farmacologico su
queste vie di trasduzione potrebbe essere centrale nella terapia di molte patologie, nel caso si
trovassero siti bersaglio specifici. Sarebbe limitante asserire che le chinasi siano l'interruttore
ON mentre le fosfatasi siano l'interruttore OFF di questi sistemi. Ad esempio, durante
l'attivazione dei linfociti T, un aumento di calcio provoca l'attivazione di una fosfatasi, la
calcineurina, che, a sua volta, defosforilando il fattore di trascrizione NFAT, ne provoca
l'importo nucleare. L'obiettivo di questo progetto è quindi di smascherare possibili
meccanismi nel sistema nervoso centrale che utilizzino la calcineurina per poterli sfruttare
come siti bersaglio aggredibili farmacologicamente.
RISULTATI
I risultati più interssanti ottenuti durante questo progetto sono stati fatti su neuroni primari di
granuli cerebellari, in collaborazione con l'Università di Cambridge. In breve, abbiamo
scoperto che la calcineurina durante lo sviluppo del cervelletto controlla sia i livelli di
somatostatina (positivamente), sia i livelli del recettore per la somatostatina di tipo 2 (sst2,
negativamente). Durante la caratterizzazione di questo processo, abbiamo dimostrato che
questi 2 processi sono distinti l'uno d'altro, e quindi che gli aumenti nei livelli di somatostatina
non sono sufficienti per diminuire quelli del recettore. Tale fenomeno richiede la sintesi de
novo di nuove proteine, e quindi è probabile che la calcineurina attivi un fattore di
trascrizione che controlli a sua volta un'ulteriore proteina. Inoltre, l'attivazione della
calcineurina non sembrerebbe essere uno stimolo sufficiente da solo per attivare questa via,
poiché infezione delle cellule con una calcineurina costitutivamente attiva non è in grado di
mimare l'effetto indotto dall'ingresso di calcio tramite i canali L voltaggio-dipendenti. Tale
via parallela non è rappresentata dalla via del cAMP o dalla via delle MAP chinasi. Poiché la
somatostatina e il recettore sst2 sono centrali nella migrazione neuronale, è probabile che la
calcineurina svolga un ruolo fondamentale nel decidere il momento della terminazione del
movimento del neurone, o, in altre parole, nel controllare la destinazione finale dei neuroni.
Tale ipotesi è stata confermata dall'osservazione che la calcineurina è in grado di controllare
altri geni (e.g. TAG-1, BDNF, TrkB) coinvolti in questo fenomeno. Nell'ultimo anno abbiamo
cercato di applicare queste conoscenze ad un modello nel quale il ruolo della calcineurina
potesse essere direttamente valutato. Abbiamo quindi usato cellule immortalizzate di
derivazione neuronale per valutare il ruolo della calcineurina nella migrazione neuronale.
Queste cellule denominate GN11 sono GnRH secernenti e sono in grado di migrare in vitro in
242

isposta al siero. Con queste cellule, abbiamo osservato che la calcineurina è responsabile di
modulare l'espressione genica e che la sua inibizione porta ad una ridotta capacità migratoria.
Abbiamo anche dissezionato le vie di trasduzione coinvolte. In breve, la calcineurina viene
attivata da una via 2-APb sensibile ed a sua voltA attiva il fattore di trascrizione NFAT.
Inoltre, tale studio, che non è ancora completato, si avvale anche di animali transgenici e
knockout in collaborazione con l'Università di Cincinnati. In ultimo, un recente studio ha
descritto che una mutazione su una isoforma della calcineurina può determinare una sindrome
psicotico-simile in topi. Poiché la schizofrenia è determinata da un disturbo della migrazione
dei neuroni corticali durante lo sviluppo, i nostri dati sembrerebbero suggerire che farmaci
che interagiscono con la calcineurina potrebbero avere un ruolo terapeutico o teratogenico.
In collaborazione con il Dott. Tron nel nostro dipartimento stiamo anche cercando
sintetizzando antagonisti specifici per le diverse isoforme della calcineurina per avvalorare
questa ipotesi. Il lavoro sulla linea neuronale GN11 sarà sottomesso per la pubblicazione nei
prossimi mesi.
PUBBLICAZIONI
Kramer D, Caruso A, Nicoletti F, Genazzani AA (2005) Somatostatin and the somatostatin
receptor are reciprocally controlled by calcium during cerebellar granule cell maturation. J.
Neurochem, 94(5):1374-83.
243

Massimo Geuna Filone tematico C1
Trapianto allogenico non mieloablativo di cellule staminali nel carcinoma
colorettale: studio dell’assetto immunologico.
A. S. O. Ordine Mauriziano di Torino
Laboratorio di Immunologia Oncologica
OBIETTIVO
Il progetto è uno studio traslazionale prospettico volto all'analisi della ricostituzione
immunologica in pazienti affetti da carcinoma colorettale sottoposti a trapianto allogenico di
cellule staminali (allo-HSCT) non mieloablativo.
METODI E RISULTATI
L'arruolamento dei pazienti e il follow up clinico sono stati completati nel dicembre 2004. Le
indagini di laboratorio, eseguite in occasione dei controlli di follow up, sono state completate
ad eccezione dell’analisi dei TREC (T-cell receptor excision circle) attualmente in corso. Tra
lo 01/01/2002 e il 31/06/2004 presso l'Unità di Trapianto della Divisione di Oncologia
Medica dell'IRCC di Candiolo sono stati sottoposti ad allo-HSCT non mieloablativo 12
pazienti affetti da carcinoma colorettale metastatico chemiorefrattario e/o chemioresistente. Il
condizionamento pre trapianto è stato eseguito in tutti i pazienti secondo il protocollo di
Seattle. Tutti i pazienti presentavano progressione di malattia prima del trapianto con una
mediana di 2 siti metastatici (range 1-5). L'età media dei pazienti era di 54 anni (36-66). Il
follow up mediano è di 280 giorni (62-780). Il trapianto di cellule staminali proveniva per
tutti i pazienti da un fratello HLA-identico. In tutti i pazienti vi è stato attecchimento del
trapianto con ottenimento di un chimerismo stabile. Nel midollo il chimerismo era del 95, 95,
95, 99% al giorno +30, +60, +90, +180 rispettivamente, mentre nel sangue periferico era per
le cellule CD15+ (granulociti) del 90, 95, 95, 97% e per i linfociti CD3+ del 63, 65, 75, 97%
agli stessi tempi. Un solo paziente è deceduto per mortalità trapianto-relata al giorno 230 a
causa dell'interruzione della terapia immunosoppressiva dovuta a progressione di malattia. In
termini di incidenza di graft versus host disease (GVHD), 6 pazienti hanno sviluppato una
GVHD acuta: di grado I (1 paziente), di grado II (3 pz.) di grado III (1 pz.) e di grado IV (1
pz.). In termini di risposta si è osservata una stabilizzazione di malattia dopo il trapianto in 8
pazienti, in uno si è osservata riduzione delle metastasi polmonari (risposta parziale)
concomitante allo sviluppo di una GVHD intestinale di grado II, in 2 pazienti la presenza di
una GVHD cutanea di grado I era correlata con una prolungata stabilizzazione di malattia (9 e
3 mesi rispettivamente). Tutte le altre risposte erano di breve durata e 10 pazienti sono
deceduti per progressione di malattia.
Complessivamente i dati clinici indicano che la procedura di allo-HSCT non mieloablativo in
pazienti con carcinoma colorettale metastatico è fattibile, non incrementa il rischio di morte e
genera un effetto di graft versus tumor (GVT) clinicamente apprezzabile. L'analisi
immunofenotipica delle sottopopolazioni linfocitarie del sangue periferico e del repertorio
delle regioni variabili beta del T-cell receptor dei linfociti T CD4+ e CD8+ è stata condotta in
tutti i pazienti ai giorni +30, +60, in 11 pazienti al giorno +90, e in 8 al giorno +180 dopo il
trapianto. Oltre alle sottopopolazioni linfocitarie T (CD4+ e CD8+), B e NK, sono stati
analizzati i subsets di cellule naïve e memoria nell’ambito dei linfociti CD4+ e CD8+. Alle
stesse scadenze temporali è stato analizzato il pattern di produzione di citochine (IL-2, IL-4,
244

IL-5, IL-10, IFN-g and TNF-a) da parte dei linfociti T CD4+ e CD8+ dopo stimolazione con
SEB+CD28 a 16-18 ore di coltura delle cellule mononucleate del sangue periferico. Lo studio
molecolare dei "T-cell receptor excision circle" (TREC) su popolazioni purificate di linfociti
T è stato eseguito finora in 7 pazienti su 12.
Il materiale per il completamento di questa indagine è stato criopreservato ed è attualmente in
corso l’analisi. La ricostituzione immunologica in questi pazienti è relativamente rapida e
sostanzialmente procede secondo quanto descritto in letteratura per analoghe procedure
trapiantologiche in pazienti con neoplasie ematologiche (precoce ricostituzione dei linfociti
NK, seguita dai linfociti T CD8+ e CD4+, mentre permane ridotto il numero di linfociti B),
tuttavia al giorno +180 si assiste a una caduta dei valori di cellule CD4+ e CD8+. Nel contesto
dei “subsets” T linfocitari funzionali (cellule naive, cellule della memoria centrale e cellule
effettrici) si osserva un accumulo di cellule effettrici nel comparto CD8+, mentre i rapporti tra
i vari subsets risultano stabili nel comparto CD4+. Il repertorio T linfocitario che si genera nel
post trapianto è sostanzialmente sovrapponibile a quello ritenuto "normale", salvo rare e non
significative eccezioni: ciò potrebbe indicare che nell’allo-HSCT non mieloablativo, accanto
alla situazione di chimerismo misto, la procedura trapiantologica consente un buon
mantenimento del repertorio T linfocitario, quantomeno nel periodo immediatamente
successivo al trapianto. Il profilo citochinico dei linfociti T ricalca quanto detto a proposito
dei subsets funzionali; con una progressiva riduzione delle cellule secernenti citochine di tipo
naive (IFN-g e IL-2 per CD8 e CD4 rispettivamente).
Complessivamente i risultati ottenuti sembrano indicare che almeno nei primi sei mesi dopo il
trapianto la ricostituzione immunologica in questi soggetti sia sostenuta prevalentemente dalle
cellule immunocompetenti trapiantate insieme alle cellule staminali, che verosimilmente
vengono in gran parte reclutate e attivate da parte di antigeni minori di istocompatibilità e/o
da antigeni virali. L’esaurimento funzionale di queste cellule immunocompetenti, che si può
ipotizzare in base ai dati funzionali, ne spiega la riduzione numerica peraltro non ancora
controbilanciata dall’immissione in periferia di linfociti neoformati e derivanti dai progenitori
staminali trapiantati, come sembrano indicare i dati preliminari ottenuti dall’analisi dei TREC.
Il breve follow up, dovuto alle condizioni cliniche di base dei pazienti arruolati nello studio e
le transitorie risposte cliniche osservate, non consentono in questa fase di valutare l’impatto
della ricostituzione immunologica sulla GVT e sulla GVHD a lungo termine, tuttavia, dai dati
ottenuti sembra possibile ipotizzare che in questo specifico contesto la pratica clinica
dell’infusione di linfociti del donatore (DLI) a partire dal giorno +100, il cui scopo principale
è quello di “rinforzare” il chimerismo, trovi una ulteriore giustificazione biologica nel fornire
un supporto di cellule immunocompetenti “fresche” che possono integrare il pool di quelle
originariamente trapiantate e andate incontro ad esaurimento funzionale.
I risultati dello studio clinico sono stati sottoposti per la pubblicazione (Carnevale-Schianca F,
Cignetti A, Capaldi A, Geuna M. et al. Allogeneic Nonmyeloablative Stem Cell
Transplantation as a Novel Immune Approach for the Treatment of Metastatic Colorectal
Cancer. Lancet. Submitted).
245

Dario Ghigo Filone tematico A3
Ricerca di test per predire la tossicità di materiali fibrosi e di modalità di
detossificazione delle fibre di asbesto
Università degli Studi di Torino,
Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica
CONTESTO E RAZIONALE
Con il termine asbesto o amianto si indicano sei diverse fibre minerali di silicati, suddivise in
due categorie: serpentino (crisotilo) e anfiboli (crocidolite, amosite, antofillite, tremolite,
actinolite). Il crisotilo rappresenta circa il 90% della produzione mondiale di asbesto ed è stato
oggetto di una intensa attività estrattiva in Canada e in Russia. L'esposizione alla polvere di
questi minerali può far insorgere un'ampia varietà di malattie polmonari, tra cui si annoverano
patologie tumorali (carcinoma bronchiale, mesotelioma pleurico) e non tumorali (fibrosi
polmonare). Nonostante il numero crescente di studi sull'argomento, non è ancora chiara la
patogenesi delle malattie associate all'esposizione ad asbesto.
La sua natura fibrosa è stata la prima caratteristica dell'asbesto considerata come causa di
tossicità, ma successivamente anche altre proprietà chimico-fisiche sono state indicate
svolgere un ruolo chiave nei meccanismi patogenetici molecolari: dimensioni, cristallinità,
morfologia, reattività di superficie e composizione chimica. In corrispondenza degli ioni
metallici presenti alla sua superficie può infatti aver luogo, tramite una reazione di Fenton, la
generazione di radicali liberi, che sono ritenuti agenti importanti dell’azione citotossica e
genotossica dell’amianto. A differenza di altre forme di asbesto, nel crisotilo il ferro non è un
componente stechiometrico, ma è presente insieme ad altri ioni estranei come contaminante in
sostituzione del magnesio.
OBIETTIVO
Per determinare il ruolo giocato dagli ioni ferro e dalle caratteristiche morfologiche delle fibre
nella patogenesi da amianto, è stato sintetizzato un crisotilo con struttura e morfologia
costante e privo di ioni ferro.
METODI E RISULTATI
La generazione di radicali liberi e gli effetti tossici su cellule epiteliali umane polmonari A549
sono stati comparati con quelli causati da un crisotilo naturale a tossicità nota (UICC A).
Dopo 24 ore di incubazione, il crisotilo naturale ha determinato un effetto citotossico sulle
cellule A549, misurato come rilascio di lattato deidrogenasi nel mezzo extracellulare, mentre
il crisotilo sintetico non ha causato effetti tossici significativi. Allo stesso modo, solo il
crisotilo naturale, ma non quello sintetico, ha determinato la rottura omolitica di legami C-H
in molecole organiche (segno di attitudine ad indurre la produzione di radicali liberi) e la
produzione di lipoperossidi (risultato dell’interazione di radicali liberi con lipidi di
membrana).
Il ciclo dei pentosofosfati (PPP), una delle principali vie metaboliche con cui la cellula si
protegge dagli stress ossidativi, e la glucoso-6-fosfato deidrogenasi, enzima chiave del PPP,
sono risultati significativamente inibiti dal crisotilo naturale, e non da quello sintetico. In
246

maniera analoga, il solo crisotilo naturale ha causato una diminuzione del contenuto di
glutatione ridotto (principale molecola antiossidante intracellulare).
Questi risultati per la prima volta suggeriscono che:
1. il crisotilo, analogamente a quanto già da noi osservato per la crocidolite (Riganti C.,
Aldieri E., Bergandi L., Fenoglio I., Costamagna C., Fubini B., Bosia A., Ghigo D.
Crocidolite asbestos inhibits pentose phosphate pathway and glucose 6-phospate
dehydrogenase activity in human lung epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 32:938-949,
2002) e per l’amosite (Riganti C., Aldieri E., Bergandi L., Tomatis M., Fenoglio I.,
Costamagna C., Fubini B., Bosia A., Ghigo D. Long and short fiber amosite asbestos
alters at a different extent the redox metabolism in human lung epithelial cells. Toxicol.
Appl. Pharmacol. 193:106-115, 2003), ha un effetto citotossico riconducibile ad un danno
ossidativo, che a sua volta deriva, almeno in parte, dalla capacità delle fibre di inibire le
difese antiossidanti della cellula;
2. un crisotilo artificiale privo di ioni ferro non è invece citotossico e non induce stress
ossidativo, confermando che il ferro gioca un ruolo importante nella tossicità cellulare del
crisotilo naturale, non solo in quanto favorisce la generazione di radicali liberi, ma anche
in quanto determina l’inibizione del metabolismo ossidoriduttivo.
Sono ora in corso studi volti a determinare l’effetto citotossico di crisotili sintetici contenenti
quantità crescenti di ferro e di altri ioni. Allo stato attuale delle conoscenze, comunque, le
fibre sintetiche prive di ferro possono già essere proposte come standard negativi (non tossici)
in studi tossicologici.
PUBBLICAZIONI
Gazzano E., Foresti E., Lesci I.G., Tomatis M., Riganti C., Fubini B., Roveri N., Ghigo D.
Different cellular responses evoked by natural and stoichiometric synthetic chrysotile
asbestos. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2005 (in press; doi:10.1016/j.taap.2004.11.021).
247

Valeria Ghisetti Filone tematico C1
Diagnosi rapida di infezioni da patogeni emergenti
Azienda Sanitaria Ospedaliera San Giovanni Battista di Torino
S. C. Microbiologia
CONTESTO E RAZIONALE
Le infezioni delle alte vie respiratorie sono causate per il 50-90% dei casi da virus e
principalmente (80%) da 6 famiglie di virus: il virus respiratorio sinciziale (RSV), i virus
parainfluenzali 1, 2 e 3 (PIV 1, 2, e 3) ed i virus dell’influenza A e B. La tempestività della
diagnosi microbiologica è fondamentale per una valutazione epidemiologica ed una corretta
impostazione terapeutica in particolare per pazienti ad alto rischio di complicanze a livello
delle basse vie respiratorie come i soggetti immunocompromessi. Le difficoltà insite
nell’approccio diagnostico tradizionale sono superabili dall’utilizzo delle tecniche molecolari,
che consentono di identificare microrganismi difficili e loro varianti con elevatissima
sensibilità e specificità, senza doverli isolare, con enormi vantaggi in termini di rapidità di
risposta.
OBIETTIVO
L’obiettivo del progetto è quello di definire un modello di diagnosi molecolare rapida per
identificare patogeni responsabili d’ infezioni respiratorie sia noti sia emergenti. Il modello
diagnostico si articola nel seguente modo:
a) diagnosi rapida dei principali patogeni virali delle vie respiratorie (Adenovirus, virus
dell’Influenza A e B, virus respiratorio sinciziale, virus parainfluenzali 1, 2 e 3) mediante
metodi molecolari di seconda generazione, rappresentati dai sistemi real-time PCR con
tecnologia TaqMan e da RT-PCR (reverse transcriptase) associata ad analisi di frammenti
mediante elettroforesi capillare e analisi con software Gene Scan (Applied Biosystems);
b) confronto tra tecniche molecolari classiche e di amplificazione rapida e IF. Il modello di
diagnosi rapida viene costruito per infezioni delle vie respiratorie che interessano due
tipologie di pazienti: pazienti immunocompetenti con infezioni alte/basse vie respiratorie
di tipo comunitario e pazienti immunocompromessi (trapiantati di organo solido e di
midollo) affetti da infezioni delle vie respiratorie che oltre ai comuni virus respiratori,
possono essere determinate anche da virus latenti che si riattivano in condizioni di
immunocompromissione (es. Citomegalovirus, Herpesvirus)
MATERIALI E METODI
Nel progetto e’ stato sviluppato in particolare il modello per l’ospite immunocompromesso.
Sono stati analizzati 42 campioni di lavaggi bronco-alveolari (BAL) provenienti da pazienti
immunocompromessi (trapiantati di organo solido e di midollo) e 21 campioni delle alte vie
respiratorie (tamponi naso-faringei e nasali) provenienti da pazienti immunocompromessi dei
reparti di ematologia presso l’ospedale S. Giovanni Battista di Torino. Sono state utilizzate
tecniche molecolari basate su sistemi di PCR end-point al fine di individuare la prevalenza dei
virus dell’influenza A e B (Inf-A e B), il virus respiratorio sinciziale (RSV), l’Herpes Simplex
virus (HSV), ed il Citomegalovirus (CMV). E’ stata utilizzata una PCR nested multiplex
248

specifica per il gene della proteina di matrice dei virus dell’Influenza A e dell’influenza B e
per il gene della proteina di fusione di RSV partendo dal cDNA prodotto della reazione di
trascrizione inversa ottenuto dall’RNA estratto da campioni respiratori. Per la determinazione
dei sottotipi H1N1e H3N2 dei campioni positivi al virus dell’Influenza A è stata utilizzata una
PCR nested multiplex specifica per il gene virale dell’emagglutinina (HA). Il CMV è stato
ricercato e quantificato utilizzando il metodo commerciale di PCR end-point COBAS
Amplicor CMV Monitor Test test basato sull’amplificazione della sequenza nucleotidica di
362 bp della DNA polimerasi virale. L’Herpes simplex virus (HSV) è stato analizzato
amplificando una corta sequenza nucleotidica (91bp) della DNA polimerasi virale. La
tecnologia di real-time PCR è stata utilizzata per sviluppare una piattaforma di analisi
multipla che prevede di identificare contemporaneamente il virus dell’influenza A e quello
dell’influenza B, insieme ad un controllo della competenza del materiale costituito dall'
amplificazione di un gene endogeno (Rnasi P). Sono state studiate le sequenze della matrice
virale (M) di strain di riferimento dei virus A e per il virus B le regioni NS1-NS2 e sono stati
costruiti due sistemi di primers e sonde specifici per A e B, in grado di amplificare la maggior
parte degli strain presenti nelle nostre regioni. Il protocollo di real-time PCR è stato validato
su strain di riferimento ATCC. Risultati. Nel caso dei lavaggi broncoalveolari dei pazienti
immunocompromessi, 22 su 42 (52%) erano positivi per il Citomegalovirus con una carica
virale compresa tra 50 e 22840 copie di DNA per ml e tra questi un solo paziente presentava
coinfezione con l’Herpesvirus. Nessun campione è risultato positivo per la ricerca dei virus
dell’influenza A e B ed RSV. Dei 21 campioni nasofaringei provenienti, il 28,5% e’ risultato
positivo al virus dell’Influenza A, il 5% a quello dell’Influenza B e nessuno al virus
respiratorio sinciziale. I 6 campioni positivi al virus dell’influenza A erano nell’ 83% dei casi
dei sottotipi H3N2 e nel rimanente 7% dei sottotipi H1N1. Con la piattaforma multipla di
real-time PCR 8 su 21 (38%) campioni sono risultati positivi per il virus dell'influenza A
mentre 2 su 21 (9,5%) erano positivi a quello dell'influenza B.
CONCLUSIONI
Questi risultati dimostrano quanto sia importante valutare, nell’analisi di infezioni respiratorie
virali in pazienti immunocompromessi, la presenza sia dei virus respiratori principali ma
anche altri virus più specifici dello stato di immunocompromissione quali i virus latenti CMV
e HSV che possono riprendere a replicarsi con quadri d’organo importanti come le polmoniti,
in condizioni di scarsa difesa immunitaria cellulo-mediata. La tecnologia TaqMan ha
consentito di sviluppare una piattaforma multipla di real-time PCR per i principali virus
respiratori (virus dell’influenza A e B) che consente di identificare molto rapidamente la
presenza dei virus influenzali e di utilizzare questo dato per il controllo della diffusione
dell’infezione nei reparti ad alto rischio e per iniziare una terapia antivirale specifica nei
pazienti immunodepressi, come una profilassi negli eventuali contatti. A questa piattaforma in
real-time PCR si prevede di affiancare un modello di analisi di frammenti, mediante
elettroforesi capillare utilizzando specifici primers marcati con fluorocromi diversi con
rilevazione automatica della fluorescenza mediante sequenziatore ABI 310 e analisi mediante
software Gene Scan Analysis, per identificare più strains sullo stesso campione e studiarne le
sequenze per identificare la presenza di eventuali nuove varianti virali.
249

Maria Michela Gianino Filone tematico C1
Indagine conoscitiva sulla diffusione dell'attività di Risk Management
nelle Aziende Sanitarie Piemontesi
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia
METODI E RISULTATI
L’ indagine è stata condotta mediante l’utilizzo di un questionario realizzato attingendo da
fonti di letteratura e grazie alla preziosa collaborazione del Prof. Kieran Walshe
dell’Università di Manchester. E’ costituito da 89 domande, di cui 85 a risposta chiusa e 4,
nelle quali si è chiesto ai destinatari del questionario di indicare la loro opinione sul sistema di
Risk Management, a risposta aperta. È organizzato in modo tale da guidare il compilatore
nella sequenza delle risposte, facendogli saltare domande che non necessitano di risposte e
rimandandolo alle domande coerenti con quanto affermato sino a quel punto del questionario.
Il questionario si compone di 4 sezioni in cui sono state indagate in successione:
1. il concetto di Risk Management adottato e le delineazione di come vengono gestite le
diverse tipologie di rischio;
2. la quantificazione degli accadimenti verificatesi e sulla caratteristiche dei contratti
assicurativi;
3. la struttura organizzativa del Risk Management;
4. il sistema informativo predisposto a supporto della gestione del rischio, a cui se ne
aggiunge una quinta volta ad indagare, mediante un processo di autodiagnosi, le critiche
ed i pregi del RM delle diverse aziende.
Il questionario è stato compilato da undici aziende sanitarie piemontesi (pari al 38% del
totale) di cui sette ASL e quattro ASO. I risultati sono espressi per singola sezione.
Prima sezione: concetto di risk management applicato. Solo tre delle undici aziende di cui si è
avuto risposta al questionario hanno effettivamente messo in pratica un sistema di risk
management. Di queste, due hanno fornito la risposta corretta ovvero concetto di risk
management come identificazione, valutazione e gestione degli eventi / azioni che possono
colpire la capacità dell’azienda sanitaria di raggiungere i propri obiettivi, mentre una ha
identificato il risk management come applicazione di un sistema di gestione della salute e
sicurezza sul lavoro nonché come approccio globale al rischio clinico e organizzativo. Per
quanto riguarda la gestione delle diverse tipologie di rischio (clinico, patrimoniale, persone,
cose, animali) a cui l’azienda sanitaria è esposta, tutte le aziende dichiarano di gestirli con
coperture assicurative. Solo cinque attuano anche campagne preventive, mentre una prevede
l’accantonamento di somme a fine anno (ritenzione) per il pagamento di sinistri di piccola
entità.
Seconda sezione: quantificazione del risk management. Non è stato possibile sviluppare il
primo punto di questa sezione - l’analisi del numero delle denunce ed accadimenti - in quanto
il campione di dati disponibili è troppo piccolo e non significativo per rappresentare la realtà
piemontese. Per quanto riguarda l’analisi delle polizze assicurative a copertura dei rischi
dall’analisi del questionario si evince che le polizze RCT stipulate coprono tutte le tipologie
di danni quindi non esiste una differenziazione dei contratti assicurativi in base alla tipologia
di rischio medico - sanitario e altro. Nel periodo preso a riferimento dell’analisi 1997-2002 si
250

evidenzia un cambiamento nella formula assicurativa utilizzata. Fino al 1999 praticamente
tutte le aziende sanitarie analizzate avevano stipulato contratti con formula loss occurence con
la quale si ha la copertura di tutti i sinistri che si sono verificati nel periodo di validità della
polizza assicurativa, con il vincolo che la denuncia sia stata effettuata nel termine di
prescrizione di legge, nel 2000 si segnalano 50% di polizza nella formula loss occurance, 25%
nella formula claims made dove si ha la copertura di tutti i sinistri che si sono verificati e sono
stati denunciati nel periodo di validità della polizza assicurativa e 25% nella formula claims
made temporato dove viene offerto un periodo di efficacia della polizza assicurativa oltre la
sua scadenza, nel 2002 le aziende sono assicurate per il 50% con formula claims made
temporato (CMT) e 50% formula claims made (CM). Per quanto riguarda la durata delle
polizze si ha la scomparsa delle polizze decennali che vengono sostituite da polizze di durata
triennale o biennale. In tre casi le aziende sanitarie si sono viste disdettare la propria polizza
assicurativa prima della naturale scadenza contratto. Per altre tre aziende nel 2002 è comparsa
nei contratti l’applicazione di una franchigia.
Terza sezione: Struttura del Clinical Risk Management. In solo tre aziende esiste una vera e
propria struttura per gestire il Clinical Risck Management. In ognuna di queste la struttura ha
una connotazione diversa. Nella prima azienda esiste una struttura semplice dipartimentale
costituita nell’agosto 2002, posta all’interno della struttura complessa della direzione
sanitaria, con responsabilità di gestione del clinical risk management. Al diretto responsabile
è riconosciuta anche la responsabilità per l’accreditamento istituzionale; la figura è esperto
della salute e della sicurezza. Egli relaziona direttamente con il Direttore Generale e Sanitario.
L’azienda non ha ritenuto necessario far seguire un corso di formazione in CRM, ed è questa
la prima carica ricoperta con responsabilità di CRM. Nella seconda azienda esiste da gennaio
2002 una commissione preposta al Risk Management quindi non solo CRM. La commissione
relaziona direttamente con il Direttore Generale. Le qualifiche rappresentate sono quelle del
medico (6), IP (3), amministrativo (3), assistente tecnico (1), farmacista (1). Le strutture
rappresentate sono quelle della Direzione Sanitaria, UPRI, URP, Ufficio Legale, Farmacia
Ospedaliera, Dipartimento Tecnico Logistico, Medicina Legale, RSSPP, Ufficio Qualità,
Dipartimento dell’Assistenza. Nel corso del 2002 sono state tenute cinque riunioni in cui si è
discusso di rischi organizzativi. Nella terza azienda nell’ottobre 2002 è stato istituito il
comitato gestione sinistri, che relaziona direttamente con la direzione generale, esso è
costituito da medici (2), amministrativi (4). Le strutture rappresentate sono la Medicina
Legale, la Direzione Sanitaria, il Servizio Legale, l’URP, l’Ufficio Patrimoniale. Nell’ultimo
anno il comitato si è riunito cinque volte con all’ordine del giorno la discussione dei fatti
individuali degli incidenti clinici che sono occorsi. In nessuna delle aziende intervistate esiste
un sistema informativo a cui i clinici possano accedere per poter registrare informazioni
riguardanti gli incidenti clinici.
251

Marilena Gili Filone tematico B3
Sviluppo e validazione di metodi per la determinazione quantitativa di
coccidiostatici e avilamicina in mangimi
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta
CONTESTO E RAZIONALE
Essendo stato ampliato negli ultimi anni l’elenco delle sostanze vietate in zootecnia, a partire
dal 2003 sono stati inseriti nei Piani di Monitoraggio nuovi antibiotici e coccidiostatici; ciò
comporta da parte dei laboratori degli II.ZZ.SS. preposti ai controlli di tipo chimico lo
sviluppo di metodi di prova atti a far fronte alle richieste del Ministero della Salute. Inoltre, in
accordo alla norma ISO 17025 e al regolamento CE n. 882/04, al fine di garantire qualità e
uniformità dei risultati, i metodi sviluppati devono essere sottoposti a validazione.
OBIETTIVO
Attraverso la presente ricerca è stato possibile sviluppare e validare metodi di prova per la
determinazione quantitativa di Robenidina, Nicarbazina, Metilclorpindolo e Avilamicina in
alimenti ad uso zootecnico e, dal secondo semestre del 2004, eseguire analisi su campioni
ufficiali per la ricerca analitica delle prime tre molecole; queste tre metodiche sono state
inserite, nell’ambito del sistema qualità, in accordo alla norma ISO 17025, tra le Procedure
Operative Standard accreditate.
METODI E RISULTATI
La ricerca si è svolta durante i 12 mesi previsti nel progetto e si è articolata per ciascuna
molecola attraverso le seguenti fasi:
1. Sviluppo e definizione di un metodo che soddisfa i requisiti richiesti dal PNAA ed
armonizzato con altri II.ZZ.SS. La programmazione ha portato alla stesura di un Piano di
Validazione che rispettasse, come elementi in ingresso al processo, i limiti di sensibilità e
le tecniche analitiche richiesti dal PNAA.
2. Validazione del metodo Per ciascun analita sono stati verificati i seguenti indici di
prestazione::linearità (3 curve di taratura indipendenti a 7 livelli. Verifica della linearità
attraverso la valutazione del coefficiente di correlazione e della dispersione dei fattori di
risposta nel range y/x medio ± 10%), specificità (su 6 campioni di mangime per ogni
specie, tra cui alcuni medicati o additivati con altri principi attivi. L’assenza di segnali al
tempo di ritenzione dell’analita permette di escludere che la presenza di interferenti porti a
esiti falsi positivi o precluda la determinazione quantitativa della molecola), limite di
rivelazione e di quantificazione (6 prove indipendenti su campioni di mangimi per
ciascuna specie (volatili, suini e conigli) e 6 campioni di acqua di abbeverata), accuratezza
(recupero medio di 18 prove a tre livelli del campo di misura compreso il LOQ effettuate
in condizioni di ripetibilità), precisione (RSD% medio di 18 prove a tre livelli del campo
di misura compreso il LOQ effettuate in condizioni di ripetibilità), robustezza (fattori
critici quali il volume di estrazione, la temperatura di concentrazione e la tipologia di
colonne SPE utilizzate in fase di purificazione), stabilità (analisi a intervalli di tempo della
stessa soluzione di standard), incertezza di misura (valutazione dei contributi di tipo ”a” e
“b”, dell’incertezza composta e dell’ incertezza estesa del metodo). In particolare, essendo
la robenidina e l’avilamicina permessi in determinate matrici, lo studio della metodica e la
252

validazione sono stati svolti tenendo conto dei livelli di utilizzo indicati nella G.CEE C/50
del 25.02.2004.
3. Stesura della Procedura Operativa Standard del metodo di prova da utilizzare nella attività
di routine
4. Emissione della scheda con i risultati della validazione e la dichiarazione di idoneità del
metodo agli utilizzi previsti, conformemente ai requisiti della ISO 9001/2000
5. Predisposizione di carte di controllo del recupero per la verifica del mantenimento delle
condizioni di ripetibilità e accuratezza: in esse sono riportate la media del recupero e gli
intervalli di attenzione (± 2s) e di accettabilità (± 3s)
6. Applicazione del metodo a campioni di mangime pervenuti al laboratorio: i metodi sono
già applicati in routine su campioni ufficiali, inserendo come controllo di qualità dei
risultati un campione positivizzato in ogni lotto di analisi. L’accettabilità del lotto di
analisi è verificata quando il recupero nel campione fortificato rientra nell’intervallo di
accettabilità della carta di controllo.
253

Giorgio Gilli Filone tematico A3
Applicazione di campionatori passivi e test biologici nella valutazione dei
rischi in ambiente produttivo
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia
CONTESTO E RAZIONALE
I Semipermeable Membrane Devices (SPMDs) rappresentano una nuova tecnica di
campionamento passivo creata per il monitoraggio degli inquinanti idrofobici nelle matrici
acquose. La particolarità di questo sistema di campionamento è rappresentata dal fatto che il
passaggio delle sostanze attraverso l’SPMD è in grado di mimare il processo di diffusione dei
contaminanti organici biodisponibili attraverso le membrane biologiche, mentre l’accumulo di
tali sostanze nel mezzo sequestrante (trioleina) è in grado di mimare il meccanismo della
bioconcentrazione nei tessuti adiposi degli organismi viventi. L’utilizzo dell’SPMD nel
monitoraggio ambientale è di grande utilità in quanto presenta numerosi vantaggi tra i quali
quello di poter eseguire su uno stesso campione sia analisi chimiche (GC-MS) che analisi
biologiche (di tossicità, mutagenesi e/o genotossicità), garantendo in questo modo l’utilizzo di
identiche modalità di campionamento. I test biologici offrono interessanti potenzialità per
valutare gli effetti sulla salute associati alle esposizioni ambientali in quanto permettono di
ottenere una visione complessiva del fenomeno espositivo (effetto globale) consentendo di
superare i limiti insiti nelle valutazioni effettuate con la sola analisi chimica. La maggior parte
degli studi condotti fino ad oggi con gli SPMDs ha riguardato il monitoraggio degli inquinanti
presenti nelle acque di fiumi e laghi, e nei sedimenti. Per le sue caratteristiche, sembra
possibile applicare questo campionatore anche ad altre matrici ambientali tra cui l’aria.
OBIETTIVO
Obiettivo di questo lavoro è stato, quindi, quello di verificare l’applicabilità al monitoraggio
degli inquinanti aerodispersi degli SPMDs in associazione a test di genotossicità (Saggio
Comet e Test di Ames). Con questo fine è stato effettuato un campionamento in un ambiente
occupazionale con inquinamento rilevante, una cokeria. In questo ambiente sono presenti
polveri di carbone di coke diffuse e gas contenenti composti organici volatili, compresi
Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA), che si originano dai processi di trattamento termico
del carbone in batterie di forni per la sua trasformazione in coke metallurgico.
MATERIALI E METODI
I campionatori SPMDs sono stati collocati in 6 siti di campionamento: un sito di controllo
(Sito 1), in un ufficio posto in una palazzina adiacente all’impianto, e 5 siti localizzati in zone
differenti dell’impianto di produzione del coke (Siti 2-3-4-5 e 6). Dopo 24 giorni di
esposizione all’aria nel periodo dicembre 2004 – gennaio 2005 gli SPMDs sono stati lavati
per rimuovere il particolato dalla superficie e sottoposti a dialisi (in esano per 72 ore) per
recuperare gli inquinanti sequestrati nel campionamento. L’estratto così ottenuto è stato
concentrato ed è stato in parte destinato all’analisi chimica (GC-MS) degli IPA. La parte
restante è stata trasferita in dimetilsolfossido ed è stata impiegata per valutare le potenzialità
genotossiche degli inquinanti campionati con il Saggio Comet su linfociti umani (linea
cellulare Jurkat)) (Tice et al., 2000) e con il test di Ames. Contemporaneamente al
254

campionamento degli inquinanti aerodispersi con gli SPMDs, in tre siti (Siti 2, 3 e 6) sono
state campionate le polveri e sono stati quantificati gli IPA adsorbiti (GC-MS-SIM).
RISULTATI
I siti campionati sono risultati tutti, ad esclusione del controllo, contaminati in modo e misura
variabile da IPA e particolato. I risultati del Saggio Comet ottenuti esponendo le cellule Jurkat
agli estratti degli SPMDs hanno mostrato la presenza di danno al DNA in tutti i campioni
prelevati nell’impianto di produzione del coke. E’ stato anche osservato un incremento
dell’effetto, dose-dipendente (0,6-0,9-1,2-1,8 m³ o 0,15-0,3-0,45 m³ di aria equivalenti),
statisticamente significativo (p

Maria Teresa Giordana Filone tematico C1
Validazione di un nuovo metodo di indagine nella diagnosi delle
leucodistrofie dell'adulto: il proteoma della mielina
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Neuroscienze
CONTESTO E RAZIONALE
Lo studio si proponeva di puntualizzare l’approccio diagnostico di una leucodistrofia
ereditaria che colpisce una vasta famiglia piemontese e nella quale le indagini cliniche e
neuroradiologiche non erano state dirimenti nel chiarire la patogenesi, le cause della
distruzione progressiva della mielina del sistema nervoso centrale e dell’esordio della
malattia, con sintomi neurologici altamente invalidanti (paraparesi, atassia, tremori), nell’età
adulta e progressione nell’arco di una diecina di anni. Nella famiglia oggetto di questo studio
nessuna indagine eseguita in vivo ha dato risultati positivamente identificativi di alcuna delle
forme di leucodistrofia dell’adulto suddette. Solo lo studio neuropatologico e biochimico su
materiale post mortem ha potuto fornire informazioni sulla natura della malattia e sul processo
patogenetico che porta alla sintomatologia. Tale studio è stato fatto con il pieno consenso dei
componenti della famiglia, i quali hanno messo a disposizione il tessuto per tale studio e sono
giustamente interessati all’approfondimento della loro malattia, nella speranza di una terapia.
La famiglia in studio presenta da circa 4 generazioni una malattia neurologica ad esordio
adulto, ereditarietà autosomica dominante, con decorso subacuto ed ingravescente di atassia e
paraparesi senza demenza, caratterizzata da un’immagine neuroradiologica di distruzione
progressiva della sostanza bianca cerebrale. Nel nostro lavoro abbiamo affiancato allo studio
neuropatologico con le tecniche più attuali lo studio biochimico della componente proteica
della mielina utilizzando tecniche all’ avanguardia nella chimica delle proteine, nello studio
del proteoma e dei geni. Riportiamo i risultati ottenuti nell’ambito degli obbiettivi proposti.
OBIETTIVO (I) Individuare il fenotipo neuropatologico di questa leucodistrofia autosomica
dominante ad esordio adulto presente nella famiglia piemontese.
RISULTATI (I) Lo studio neuropatologico al microscopio ottico ed elettronico, anche su
sezioni di intero encefalo, con tecniche istologiche, immunoistochimiche, istochimiche, di
ibridazione in situ, ha mostrato che si tratta di una leucodistrofia non-metacromatica,
definibile come ortocromatica o sudanofila. Tale denominazione sottende un processo di
distruzione mielinica non infiammatorio, con conservazione delle cellule oligodendrogliali, e
quindi non riferibile ad un processo elettivo di questa linea cellulare. L’assenza di apoptosi
conferma che il processo non è degenerativo cellulare. Sulla base di questo fenotipo è stato
possibile interpretare i risultati dello studio biochimico.
OBIETTIVO (II) Analizzare la composizione proteica della mielina centrale e periferica
(nervo) nei due casi, con l’obiettivo di individuare il danno molecolare.
RISULTATI (II) Il Western blot delle proteine della mielina ha mostrato che una di queste
proteine, la glicoproteina associata alla mielina, nota come MAG, è di massa molecolare
minore del normale nella mielina centrale dei due pazienti studiati. In base ai risultati della
proteolisi possiamo affermare che il difetto strutturale risiede nella porzione C-terminale della
isoforma di MAG espressa nel sistema nervoso centrale, detta L-MAG. L’estremo C-
256

terminale è quello che svolge la funzione di trasduttore del segnale nella via che, tramite Fyn,
attiva la trascrizione di MBP, e quindi la sintesi della principale proteina della mielina. In
effetti, nei pazienti la quantità di MBP è inferiore che nei controlli. E’ noto da studi su animali
transgenici che MAG interviene principalmente nel mantenimento della mielina più che nella
sua deposizione durante il periodo embrio-fetale e nello sviluppo. Alla luce di tutto ciò, noi
ipotizziamo che il difetto di MAG sia responsabile della distruzione della mielina nei nostri
pazienti. Il difetto geneticamente determinato produce il danno alla mielina ed i sintomi e
segni neurologici della malattia in età adulta, probabilmente perché sono transitoriamente
attivi meccanismi di compenso alla MAG difettosa; comunque la mielina dei soggetti
portatori del gene alterato è più suscettibile a danni acquisiti ed agli effetti
dell’invecchiamento. Non è stato ancora possibile studiare la mielina del nervo periferico.
OBIETTIVO (III) Da queste analisi, cercare di risalire al difetto genico ed al meccanismo
patogenetico della sofferenza mielinica, cioè alla causa ed agli eventi biochimico-tissutali che
producono la malattia.
RISULTATI (III) L’analisi delle sequenze degli esoni del gene di MAG e del mRNA di
MAG non hanno mostrato alterazioni. E’ perciò molto probabile che l’evento genico
responsabile della malattia non sia sul gene di MAG, bensì su un altro gene che codifica una
proteina o un enzima coinvolti in eventi posttraslazionali che producono una MAG alterata.
Lo studio proseguirà con l’analisi di linkage per il gene di MAG e ad ampio spettro sul sangue
di 10 pazienti affetti.
PUBBLICAZIONI
1. M.T.Giordana, L.Palmucci, M.Piccinini, B. Buccinna,C Ramondetti, M.T.Rinaudo
Myelin-associated glycoprotein is defective in a familial orthochromatic leukodystrophy.
56th Annual Meetin American Academy of Neurology, San Francisco, April 24- May 1,
2004, Neurology, Suppl.5, 62A274.
2. M.T.Giordana, L.Palmucci, M.Piccinini, B. Buccinna,C Ramondetti, M.T.Rinaudo A
defective L-MAG (large myelin-associated glycoprotein) is responsible for an adult-onset,
autosomal dominant orthochromatic leukodystrophy. 8th Congress of the European
Federation of Neurological Societies, Paris, September 4-7, 2004. European Journal of
Neurology 11, Suppl 2, 20.
3. M.Piccinini, B. Buccinna, C. Ramondetti, M.T. Giordana, M.T.Rinaudo Anomalous
myelin-associated glycoprotein (MAG) is a feature of a familial adult-onset autosomal
dominant orthochromatic leukodystrophy. Società Italiana di Biochimica 2004, Riunione
annuale, Riccione, 28 sett-1ott 2004, Ital J Biochem 53 (3), 257, 2004
4. M.T.Giordana, L.Palmucci, S.Leombruni, G.Vaula, C.D’Agostino, M.Piccinini, B.
Buccinna,C. Ramondetti, M.T.Rinaudo. Myelin-associated glycoprotein is altered in a
familial orthochromatic leukodystrophy. XXXV Congress of the Italian Neurological
Society, Genova, 25-29 settembre 2004, Neurological Sciences 25 Suppl S92, 2004.
5. MT Giordana, M.Piccinini, L.Palmucci, B.Buccinnà., C Ramondetti, A.Brusco,
T.Mongini, S.Leombruni, G.Vaula, MT Rinaudo MYELIN-ASSOCIATED
GLYCOPROTEIN IS ALTERED IN A FAMILIAL LATE- ONSET
ORTHOCHROMATIC LEUKODYSTROPHY. Brain Pathology 15: 116-123, 2005
257

Maria Gabriella Giuffrida Filone tematico D3
Indagini epidemiologiche sull’insorgenza di allergie ad alimenti
geneticamente modificati
C.N.R. – Istituto di Scienze delle Produzioni Animali
MATERIALI E METODI
Il Lavoro è stato condotto con due modalità parallele: da una parte i clinici hanno provveduto
al reclutamento dei pazienti adulti e pediatrici sospettati di allergia ad alimenti, dall’altra i
biochimici hanno messo a punto una buona estrazione e separazione delle proteine della soia
al fine valutare se l’inserzione di un gene eterologo potesse indurre maggiore o minore
reazione con le IgE seriche dei pazienti indagati.
A - Indagine clinica e preparazione del prodotto da testare
Dai tre Ospedali cittadini coinvolti nel progetto (Ospedale Infantile Regina Margherita,
Ospedale Evangelico Valdese ed Ospedale Koelliker) e dalla pratica privata di uno dei medici
coinvolti sono stati selezionati 142 soggetti per un sospetto di allergia ad alimenti dei quali 78
adulti e 64 bambini.
All’inizio della ricerca il laboratorio dell’ARPA di Ivrea ha testato i due campioni di soia
(WT e GM Roundup ReadyTM) per la presenza e l’assenza del gene eterologo tramite PCR
mediante l’amplificazione del promotore CaMV 35S e del terminatore NOS. La soia
transgenica è risultata 100% positiva e quella naturale assente da modificazioni transgeniche.
I semi di soia sono stati poi finemente macinati in modo da ottenere una polvere che è stata
suddivisa in aliquote da 0,1mg da risospendere con 1 ml di soluzione fiosiologica e
consegnate agli ospedali coinvolti nel progetto per eseguire il prick-by-prick sui pazienti
selezionati. A seguito di una riunione di tutti i partecipanti al progetto, il laboratorio
dell’ARPA ha eseguito una nuova preparazione disperdendo la farina di soia in acqua e
scaldando la soluzione fino ad ottenere un “latte di soia”. Si era infatti notato che la soia WT
si scioglieva con difficoltà nella soluzione fisiologica probabilmente perché più ricca in grassi
di quella GM.
In particolare i soggetti testati sono così suddivisi:
• Dott.Fiorucci: 66 soggetti testati dei quali 62 adulti e 4 bambini di età inferiore ai 12 anni.
• Dott.ssa Monti: 40 soggetti testati tutti bambini di età inferiore ai 12 anni.
• Dott. Ricca: 36 soggetti testati dei quali 20 bambini compresi fra i 6 mesi e i 12 anni e 16
adulti.
Tutti i soggetti sono risultati negativi alla soia sia WT che GM eccetto 2 bambini ed 1 adulto
positivi alla soia WT e non a quella GM ed un bambino positivo ad entrambi i tipi di soia.
B - Proteomica
Il laboratorio per lo Studio del Proteoma dell’ISPA.CNR di Torino si è occupato della messa
a punto di un metodo fine per identificare quali proteine presenti nella soia GM fossero
reattive alle IgE dei pazienti allergici. A tal proposito sono state utilizzate le tecniche della
Proteomica con la messa a punto di mappe bidimensionali di estratti proteici di soia WT e
GM.
258

Si è deciso di realizzare sia mappe molto piccole di soli 8X7 cm per poter incubare la
membrana blottata su nitrocellulosa con il siero dei pazienti allergici che mappe più grandi
dalle quali poter ritagliare gli spot che dovessero risultare presenti o differentemente espressi
nella mappa GM o WT e procedere all’identificazione della proteina corrispondente mediante
spettrometria di massa. Per la preparazione degli estratti proteici per le successive separazioni
elettroforetiche si sono testati 3 metodi di estrazione: uno che contiene urea e tiourea e che è
compatibile con la prima dimensione dell’elettroforesi bidimensionale, un altro che ha in
aggiunta oltre ai componenti del primo anche il detergente ASB14 e infine il tampone PBS.
Tutti i tamponi di estrazioni sono stati testati utilizzando strip per la prima dimensione con un
gradiente da 3 a 10 di pI. La seconda dimensione è stata realizzata utilizzando gel a gradiente
4-12%T già pronti o gel al 12% T realizzati in laboratorio. Sia la preparazione con PBS che
quella con urea/tiourea hanno dato buoni risultati ottenendo mappe con spot proteici ben
definiti in buona parte del gel. Si sono anche realizzate mappe di 13X16cm sia della soia WT
che di quella GM.
RISULTATI
Buona parte degli obiettivi che il presente progetto si proponeva sono stati raggiunti.
1. Sono state ottenute le mappe bidimensionali dei due tipi di soia (Roundup ReadyTM GM
e WT) ed è in corso l’analisi di immagine di queste mappe per poter selezionare gli spot
che differiscono fra le due mappe e caratterizzare i 2 tipi di semi più approfonditamente e
poter proporre un metodo più raffinato per definire la sostanziale equivalenza fra soia
originale e geneticamente modificata.
2. Da questi dati epidemiologici preliminari non sembra essere rilevabile una maggiore
sensibilizzazione IgE mediata alla soia transgenica. Sui 142 soggetti testati solo un adulto
e due bambini sono risultati debolmente positivi alla soia WT e solo un bambino ad
entrambe. La percentuale di positività (1,3% adulti e 4,6% bambini) si attesta con quanto
presente in letteratura. Nessuno dei soggetti è stato giudicato idoneo per ulteriori indagini
molecolari a livello di proteine reattive alle IgE seriche.
In conclusione non sembra che l’introduzione sul mercato di soia transgenica abbia causato un
aumento nella sensibilizzazione da parte della popolazione a questo alimento. Per contro i
primi dati di confronto della mappe proteiche sembrano evidenziare differenze
nell’espressione di alcune proteine. Sia la natura delle proteine che la loro eventuale
implicazione a livello biochimico sono ancora in corso di studio.
259

Mariella Goria Filone tematico D2
Approfondimenti diagnostici ed epidemiologico-molecolari della
tubercolosi da M.bovis nell'uomo e negli animali
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta
Lab. di Biotecnologie
CONTESTO E RAZIONALE
Al fine di conseguire l’eradicazione della tubercolosi bovina dal territorio piemontese nel
corso degli ultimi anni un notevole sforzo è stato compiuto in sinergia dalle Istituzioni
(Servizi Regionali, Istituto Zooprofilattico, ASL) che, per competenze differenti, sono
coinvolte nelle operazioni di controllo e risanamento. La progressiva riduzione della
prevalenza della malattia registrata a partire dagli anni ‘90, ha generato la necessità di
sviluppare protocolli diagnostici più sensibili, con l’introduzione di moderne metodiche
molecolari in ausilio sia alle prove in vita che a quelle post-mortem (Gamma-IFN test e
ricerca diretta di micobatteri con PCR). Essendo la tubercolosi una malattia molto complessa,
sia per le peculiarità eziopatogenetiche, sia per il carattere antropozoonotico che per le
interazioni con malattie immunosoppressive, gli studi epidemiologici risultano di grande
supporto per la comprensione delle dinamiche infettive negli interventi di eradicazione in
campo veterinario e di prevenzione in campo umano.
OBIETTIVO
Questo studio si prefiggeva quindi di approfondire le valutazioni circa l’affidabilità ed
l’impiego nella lotta alla tubercolosi delle tecniche molecolari, basate sull’analisi del DNA,
che si sono rivelate promettenti dal punto di vista della sensibilità e delle informazioni, anche
di tipo epidemiologico, che possono fornire (identificazione e caratterizzazione su base
molecolare dei microrganismi).
MATERIALI E METODI
In ordine al conseguimento degli obbiettivi proposti, l’azione operativa si è sviluppata su due
aspetti principali:
Aspetti diagnostici
• Valutazione di sensibilità dei metodi diagnostici post mortem attraverso il confronto del
metodo molecolare per la ricerca diretta di micobatteri tb complex nei tessuti con l’esame
colturale riferiti ad un gold standard definito sulla base delle prove in vita.
• Caratterizzazione molecolare dei ceppi di M.bovis isolati da bovini e da pazienti ricoverati
presso le strutture ospedaliere regionali, rivolta a descrivere ed inquadrare la natura
genetica dei ceppi isolati.
Aspetti epidemiologici
• Sviluppo di strumenti informatici idonei all’analisi dei dati raccolti in questo studio, in
modo caratterizzare le dinamiche che, nel triennio 2002-2004, hanno connotato
l’infezione tubercolare negli allevamenti piemontesi e in alcuni episodi infettivi che hanno
coinvolto anche soggetti umani.
260

RISULTATI
Esame colturale e ricerca diretta di micobatteri da tessuto
La ricerca diretta di micobatteri da tessuti è stata svolta mediante una heminested PCR,
parallelamente all’esame colturale con il quale sono state isolate le colonie cresciute per le
successive analisi di caratterizzazione molecolare.
L’amplificazione ha come target la regione mobile IS6110 per il rilevamento dei micobatteri
appartenenti al Mycobacterium tuberculosis complex.
Per la valutazione della sensibilità diagnostica delle prove di conferma post mortem, gli esiti
della PCR e dell’esame colturale, sono stati rapportati ad un gold standard così definito:
soggetti provenienti da allevamenti dichiarati infetti (almeno due positività consecutive alle
prove ufficiali o segnalazione di lesioni al macello) e positivi alle prove in vita.
Riferendo l’analisi dei dati al biennio 2003-2004, in cui la metodica molecolare è stata
ulteriormente migliorata dal punto di vista tecnico, la sensibilità media dell’esame colturale
risulta pari a 37%, quella del metodo molecolare pari al 41%, mentre se valutate in parallelo,
il valore sale a 52%.
In tabella sottostante i dati di sensibilità sono stratificati rispetto al tipo di lesione riscontrata:
se nei campioni con lesione i valori di sensibilità sono elevati, essi si riducono notevolmente
nei campioni NLV, ma deve essere rilevato il contributo, in termini di migliore sensibilità
analitica, reso dai metodi molecolari nei campioni non altrimenti diagnosticabili post-mortem.
CAMPIONI TEST SENSIBILITA’%
PCR 71.2
con lesioni
Colturale 91.5
PCR+Colturale 96.6
PCR 33.3
NV
Colturale 23.3
PCR+Colturale 41.5
Differenziazione molecolare
Le principali metodiche impiegate per definire il profilo genetico di ceppi M.bovis isolati da
bovino e uomo sono state lo Spoligotyping e il VNTR-typing. Sono stati caratterizzati con
entrambi i metodi 346 ceppi di origine bovina isolati dal 2002 fino al primo semestre del 2004
e, mediante il coinvolgimento della Clinica Universitaria delle Malattie infettive – Ospedale
Amedeo di Savoia, 6 ceppi M.bovis isolati da pazienti umani nel medesimo periodo. Sono
stati evidenziati 24 spoligotipi differenti: il più diffuso è risultato essere BCG-like (64.3%): a
questa informazione si associa la considerazione che la tecnica di spoligotyping ha una
capacità limitata nel differenziare i ceppi. La variabilità osservata con il VNTR-tipo è risultata
più elevata (37 VNTR-tipi differenti, di cui il più diffuso, 54433, rappresenta il 20.1% del
totale). L’associazione dei due metodi aumenta notevolmente il potere di differenziazione:
all’interno del gruppo con spoligotipo BCG-like i profili VNTR riscontrati sono stati infatti
27. Questo studio ha inoltre svelato nuovi casi di trasmissione dell’infezione da animale a
uomo: i profili di caratterizzazione spoligotyping e VNTR dei ceppi isolati in tutti i casi sono
risultati reciprocamente identici. Le informazioni ricavate dalla caratterizzazione molecolare
dei ceppi ha costituito la base dati del programma informatico creato ad hoc per l’analisi
epidemiologica.
261

Strumenti informatico-epidemiologici
Al fine di analizzare le informazioni raccolte grazie alle metodiche molecolari, è stato
sviluppato un sistema informatizzato di gestione dati, in grado di associare alle informazioni
provenienti dall’indagine epidemiologica classica (collocazione dell’allevamento, numero di
capi infetti, eventuali movimenti di stalla ecc..) i profili molecolari dei ceppi isolati. Lo
sviluppo del database ha consentito non solo l’organizzazione dei dati significativi in forma
tabellare, ma anche l’elaborazione di cartine geografiche che associano i profili molecolari,
raggruppati in cluster, al territorio regionale in modo da poter monitorare la diffusione di
particolari ceppi, verificare le dinamiche diffusive di definiti stipiti, agevolare la
comprensione di nuovi episodi infettivi.
CONCLUSIONI
Lo studio condotto ha permesso di acquisire valutazioni positive sulle prestazioni dei metodi
molecolari che affiancano quelli tradizionali nelle operazioni di eradicazione della tubercolosi
bovina e nella conoscenza delle dinamiche di trasmissione dell’infezione all’uomo; la
trasferibilità dei risultati a SSN è mediata dall’Osservatorio Epidemiologico Veterinario
Regionale e dal lab. di Epidemiologia molecolare della Clinica Universitaria di Malattie
Infettive, ove risiedono i database sopra descritti.
262

Maria Ausilia Grassi Filone tematico B1
Profilo microbiologico di verdure di IV gamma destinate alla ristorazione
collettiva.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Patologia Animale
METODI E RISULTATI
Scopo della presente ricerca era valutare il livello igienico di verdure di IV gamma prodotte e
commercializzate sul territorio e destinate alla ristorazione collettiva. Al fine di acquisire tali
informazioni, è stata identificata una realtà produttiva, sita nel territorio della regione
Piemonte, che permettesse di eseguire i campionamenti lungo la filiera produttiva. La realtà
esaminata è risultata essere, peraltro, il maggior fornitore regionale di tali derrate. Sono stati
inoltre prelevati campioni sia dal commercio sia da punti di ristorazione collettiva (mense
scolastiche). In totale sono stati analizzati 123 campioni così suddivisi
1. commercio: 10 campioni di insalata verde e mista di cui 3 provenienti da coltivazione
biologica ed una da coltivazione con lotta integrata;
2. ristorazione: 12 campioni provenienti dallo stabilimento di produzione oggetto dei
campionamenti (3 campioni di carote, 2 di finocchi e 7 di insalata mista e verde);
3. stabilimento di produzione: 101 campioni prelevati nei differenti momenti produttivi
(prima mondatura, precentrifugazione e prodotto finito) e precisamente:
• carote 18 campioni
• finocchi 16 campioni
• insalata mista 15 campioni
• indivia 16 campioni
• verza 17 campioni
• insalata verde (pandizucchero) 19 campioni.
Per ogni prelievo veniva compilata una scheda al fine di ottenere informazioni relative ad:
azienda di provenienza, modalità di coltivazione, livello di imbrattamento da residui di terra,
scarti per pectinolisi. L’analisi di tale schede ha permesso di stabilire che indipendentemente
dalla tipologia del vegetale, la percentuale di scarto è superiore al 30%, mentre
l’imbrattamento risulta ridotto (

analizzati ha permesso inoltre di evidenziare una variazione nei valori delle cariche,
verosimilmente legata ad una maggior permanenza di tali prodotti alle temperature di
refrigerazione. Le cariche più contenute infatti (rispettivamente per enterobatteri e cbt pari a
103 e 105 ufc/g), sono quelle relative ai campioni prelevati in stabilimento ed analizzati subito
dopo il confezionamento; sia per i campioni del commercio (10 5 ufc/g enterobatteri e 10 6
ufc/g cbt) sia per quelli prelevati nelle celle frigo delle mense (10 6 ufc/g enterobatteri e 10 8
ufc/g cbt) si è rilevato un incremento delle cariche. Per quanto riguarda i germi patogeni sono
stati ricercati i seguenti microrganismi: Salmonella spp, Listeria monocytogenes, E. coli
patogeni, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila e Yersinia enterocolitica.
L’identificazione dei ceppi isolati, è stata eseguita tramite metodica di PCR. In nessuno dei
campioni analizzati è stato isolato Campylobacter jejuni, mentre Salmonella spp è stata isolata
da 1 campione di indivia dopo mondatura proveniente dallo stabilimento (positività pari allo
0,8%). Per Listeria monocytogenes sono risultati positivi due campioni di insalata mista del
commercio (1,6%). Per quanto riguarda Yersinia enterocolitica su 323 ceppi ”sospetti” 51
sono risultati positivi, pari al 25,74% (26 campioni); l’isolamento è avvenuto in 1 campione di
insalata mista del commercio e 8 campioni di verza (3 dopo la prima mondatura, 3 prima della
centrifuga e 2 prodotti finiti), 4 pan di zucchero (1 prima della centrifuga e 3 prodotti finiti), 4
indivie (2 prima della centrifuga e 2 prodotti finiti), 3 carote (1 dopo la prima mondatura, 1
prima della centrifuga e1 prodotto finito), 3 campioni di insalata mista (2 dopo la prima
mondatura e1 prodotto finito) e 3 finocchi (2 dopo la prima mondatura ed 1 prodotto finito)
tutti prelevati dallo stabilimento di produzione. Il 7.84% dei ceppi pari a due campioni (carote
dopo la mondatura ed indivia confezionata) è risultato positivo per i geni espressione di
patogenicità (ail – fattore di invasione e yst- codificante per l’elaborazione di una tossina
termolabile). La positività per E. coli è risultata pari all’ 1.6% (1 campione di indivia dopo
mondatura e un’insalata pandizucchero prima della centrifuga). Nessun ceppo è risultato
positivo per la presenza dei geni codificanti la produzione di tossine (stx1 – stx2. La PCR
eseguita sulle colonie non ha tuttavia evidenziato la presenza dei geni responsabili della
produzione di tossine (stx1 ed stx2). Anche nei confronti di Aeromonas spp. si è riscontrata
una bassa percentuale di positività pari allo 0.8% (1/123 - verza confezionata proveniente
dallo stabilimento). Le analisi eseguite presso lo stabilimento, su tutti i punti della filiera,
hanno evidenziato come il trattamento delle verdure con ipoclorito in fase di lavaggio, nella
percentuale di 20-40 ppm, permetta un abbattimento delle cariche microbiche nel prodotto
finito di 1 grado logaritmico per tutte le tipologie di verdure analizzate, fatta eccezione per i
finocchi per i quali i valori non subiscono riduzioni significative. Tuttavia, anche a fronte
dell’utilizzo di ipoclorito è stato possibile l’isolamento di germi potenzialmente patogeni
anche nel prodotto finito. Tale trattamento si è rivelato peraltro molto efficace contro
Salmonella spp.; la positività infatti si è riscontrata in un campione dopo prima mondatura e
non nel prodotto confezionato. Le percentuali di positività per i patogeni da noi isolati sono
risultate più contenute rispetto a quanto riportato in bibliografia (Lee T.S. et al.,2004;
Johannessen G.S. et al., 2002; Soriano J.M. et al., 2000) soprattutto relativamente a Listeria
monocytogenes ed Aeromonas spp.
I risultati ottenuti evidenziano come interventi di sanificazione sia sulle apparecchiature sia
sulle materie permettano un controllo dei patogeni presenti nella materia prima.
264

Carla Grattarola Filone tematico D2
Infezione da Brucella suis nel cinghiale in Piemonte: studio della
diffusione in due Ambiti Territoriali di Caccia
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta
Lab. di Biotecnologie
MATERIALI E METODI
La ricerca è stata articolata nelle seguenti fasi:
1. stima delle popolazioni oggetto di studio.
2. definizione del n° di campioni per la stima della prevalenza complessiva dell’infezione del
cinghiale (IC:95%, err. 5%)
3. definizione del n°di campioni per la stima di presenza o assenza di infezione nella lepre
(IC:95%)
4. definizione delle modalità di campionamento
5. predisposizione di modulistica specifica
6. predisposizione di questionario per le categorie professionali coinvolte
7. sensibilizzazione del personale coinvolto
8. applicazione dei test sierologici trb e fdc sulle matrici di siero, e di fdc sullo spremuto
polmonare, e delle metodiche batteriologiche sulle matrici di milza e genitali
9. implementazione del protocollo di isolamento per la lepre
10. valutazione degli apparati riproduttori
11. utilizzo in parallelo dei test sierologici e dell’isolamento per la stima della prevalenza
dell’infezione nel cinghiale.
12. rappresentazione cartografica dei prelievi e dei riscontri di positivita’
13. analisi statistica dei risultati.
14. elaborazione dei questionari.
RISULTATI CINGHIALE
La popolazione nell'ATCCN5 è stata stimata pari a ca. 1500 soggetti, mentre nell’ATCCN4
pari a ca. 600. I capi esaminati sono stati 274 per l’ATCCN5 e 48 per l’ATCCN4.
L’identificazione batteriologica ha dato sempre esito positivo per Brucella suis biovar 2. Tutti
gli organi pervenuti sono risultati privi di lesioni. Per la definizione della prevalenza
complessiva sono stati selezionati tutti i capi di cui erano disponibili esiti conclusivi
sierologici e batteriologici.
ATCCN5: sui capi campionati a fine 2003 la prevalenza risulta pari a 4,67

ATCCN4-L'esiguo n°di campioni pervenuti non consente di effettuare analisi statistiche
appropriate.
RISULTATI LEPRE
Non è possibile esprimere alcuna considerazione sull'ATCCN4 (tutti i campioni pervenuti
appartengono all’ATCCN5); tutti i campioni hanno dato esito negativo;in base all’esito la
massima prevalenza possibile nell’area considerata risulta pari a 6,73, ovvero l’infezione
brucellare nelle lepri, se presente, lo è al di sotto del limite individuato. E’ possibile una
distorsione legata al lungo periodo di congelamento cui sono stati sottoposti i campioni prima
dell’esecuzione degli esami colturali, che potrebbe aver influenzato negativamente la
sopravvivenza di Brucella suis eventualmente presente. Solo in un caso su 43 e’ stata
osservata orchite necrotico-purulenta.
QUESTIONARI
I questionari raccolti sono stati 33. I dati più significativi sono così riassumibili: per le
modalità di dissanguamento 25 (76%) hanno dichiarato “su campo”; per l’eviscerazione 20
(61%) hanno risposto “in locale chiuso”; circa l’utilizzo dei visceri 27 (82 %) hanno
dichiarato che vengono interrati;circa l’utilizzo degli scarti 20 (61%) hanno dichiarato che
vengono interrati; per l’utilizzo di guanti nella manipolazione delle carcasse 22 (67%) hanno
dichiarato di si;riguardo al consumo di carni 30 (94%) hanno dichiarato che esse vengono
cotte; per le modalità di conservazione delle carni 32 (97%) hanno indicato il congelamento, e
le risposte raccolte circa il periodo di tempo indicano fino a 6 mesi in 14 casi (43%) e fino a
12 in 8 casi (24%); circa la cessione di carni ad altri 28 (85%) hanno dichiarato di no.
CONCLUSIONI
Per l'ATCCN5 la prevalenza stimata nel cinghiale, con errore inferiore al 5%, si attesta su un
valore medio del 15%. La considerazione dei test in parallelo e la selezione dei capi positivi in
base alla positività ad almeno un test è stata scelta per l'esigenza di superare i limiti di
sensibilità del test batteriologico. I calcoli effettuati possono aver comportato una sovrastima
della prevalenza d'infezione effettiva (possibili falsi positivi sierologici) ma hanno
sicuramente consentito di individuare tutti I capi positivi presenti. L’isolamento da organi
genitali senza lesioni ha confermato i dati bibliografici relativi a scarse conseguenze
dell’infezione sulla fertilità del cinghiale. Dato il riscontro statisticamente significativo di
positività negli adulti rispetto ai giovani si presuppone che la trasmissione per via sessuale sia
preponderante rispetto alla via orale. Al momento attuale nelle aree esaminate appare
consolidata la circolazione di Brucella suis biovar 2. Per quanto riguarda l'inquadramento
della brucellosi nella lepre, al momento attuale, è possibile solo concludere che l'infezione
potrebbe essere presente, seppur a bassa prevalenza. L'evidenza del congelamento prolungato
delle matrici quale possibile fattore condizionante la sensibilità degli esami batteriologici
induce a non esprimere considerazioni conclusive sull'assenza di un possibile ruolo attivo
della lepre nella trasmissione dell'infezione. Tale criticità dovrà essere attentamente
considerata per futuri controlli, e per eventuali applicazioni del modello d'indagine in altre
aree territoriali regionali. Per quanto riguarda la valutazione della possibilità, per categorie a
rischio, di contatto con materiali infetti, nonostante l'esiguo numero di questionari raccolti si
evince un certo rischio relativo alla manipolazione dei prodotti ma non al consumo delle
carni. L'analisi delle risposte relative alla pratica del dissanguamento e dell'eviscerazione
evidenzia un rischio non trascurabile per la diffusione dell'infezione nel cinghiale. Si auspica
che la divulgazione dei risultati alle categorie a rischio coinvolte nel progetto potrà consentire
un rafforzamento dell'adozione di precauzioni atte a prevenire la diffusione del contagio
all'uomo.
266

Andrea Graziani Filone tematico A2
Studio dell’espressione di Diacilglicerolo cinasi in tumori epiteliali
mediante real time RT-PCR.
Università degli Studi del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro
Dipartimento di Scienze Mediche
Nella prima fase del progetto:
1. è stata messo a punto un saggio di determinazione quantitativa in RT-PCR in real time per
l’espressione di aDgk (1a), ed è stato deciso di soprassedere al punto 1b in quanto
l’anticorpo anti-aDgk a disposizione (non commerciale) non è di qualità sufficiente.
Poiché anche gli anticorpi commerciali sono di scarsa qualità, abbiamo pertanto deciso di
generare nel nostro laboratorio anticorpi monoclinali da utilizzare per questo scopo
(indagine immunoistochimica per l’espressione di aDgk nei tumori) e altri obiettivi di
ricerca. Tuttavia la generazione di anticorpi anti-aDgk costituisce un progetto
indipendente dal presente.
2. mediante inibizione farrmacologica di aDgk, abbiamo dimostrato che l’inibizione
specifica di aDgk riduce quasi completamente la capacità delle cellule tumorigeniche di
invadere la matrice extracellulare in un saggio di invasione in vitro, e abbiamo valutato
l’espressione di aDgk in diverse linee di carcinoma mammario a diversa capacità invasiva.
Complessivamente i dati ottenuti suggeriscono un paradosso: mentre la funzione di aDgk la
cui attività enzimatica è stimolata da HGF e espressione di v-Src, è necessaria per la capacità
di migrare e di invadere la matrice extracellulare, la sua espressione è invece downregolata in
quelle linee maggiormente tumorigeniche e invasive sia in vivo che in vitro. Tuttavia l’analisi
dell’espressione di aDgk in linee derivate da tumori, è scarsamente significativa della
funzione in vivo.
Pertanto abbiamo proseguito il progetto, lavorando in due diverse direzioni. Innanzitutto
abbiamo misurato l’espressione di aDgk in carcinomi di pazienti soggetti a intervento
chirurgico. L’espressione di aDgk nel tessuto tumorale è stata paragonata con l’espressione di
aDgk nel tessuto sano circostante, opportunamente prelevato e congelato in azoto liquido.
Abbiamo pertanto deciso di indagare i livelli di espressione di DGK confrontando tra loro
diverse tipologie di carcinomi della mammella con i rispettivi tessuti sani. I tessuti studiati (30
in totale) sono stati prelevati da 13 pazienti affette da diversi tipi di carcinomi mammari,
pervenute presso l’Ospedale Maggiore della Carità di Novara nell’arco di circa nove mesi.
Dai tessuti in questione si è estratto l’RNA totale per mezzo di TRIZOL e si è quindi valutata
DGK per mezzo di Real Time PCR.
I dati ottenuti hanno messo evidenza diversi aspetti:
• l’espressione di diversi campioni presenta un’elevata variabilità, con campioni che
arrivano ad un’espressione di circa 2000 volte superiore a quella del calibratore;
• non sembra essere presente una correlazione tra espressione di αDgk e patologia, in
quanto i valori in tabella sono distribuiti omogeneamente e non evidenziano differenze
marcate tra sano e malato,
• nei casi in cui i pezzi chirurgici erano più di uno si è potuto notare una differenza di
espressione di αDGK addirittura tra due campioni di tessuto sano o due campioni
neoplastici della stessa paziente.
267

Ciò può essere dovuto a diverse variabili quali differenze a livello di estrazione, di
conservazione oppure a livello chirurgico. Quindi il livello di espressione di Dgk nei
campioni presi in esame e’ estremamente variabile e non sembra correlare con la presenza di
tumore. Confrontando l’espressione di αDgk tra i tessuti appartenenti allo stesso caso
emergono ancora meglio differenze sostanziali riguardanti tessuti teoricamente tra loro
identici, dimostrando una disomogenea distribuzione di Dgk nella totalità deicasi.
Avendo osservato un’assenza di correlazione tra i livelli d’espressione di Dgk e la presenza di
tumore, ci siamo chiesti se la correlazione potesse sussistere con il grado di invasività. A tal
scopo abbiamo raccolto i risultati le indagini isto-patologiche condotte su campioni prelevati
dalle medesime pazienti prese in esame per il nostro studio e abbiamo cominciato a
completare una tabella in cui raccogliere tutte le informazioni a nostra disposizione, quali il
grado di malignità del tumore o la presenza di metastasi linfonodali. Inoltre altri parametri che
indicano l’assetto recettoriale e la frazione proliferante quali: recettore nucleare per estrogeno,
recettore nucleare per progesterone, proteina estrogeno-associata, cellule in fase attiva del
ciclo cellulare, prodotto dell’oncogene HER-2/neu e prodotto del gene oncosopressore mutato
p53. Dall’analisi dei dati sembra non emergere correlazione tra l’espressione di aDgk e lo
stadio del tumore o l’invasività. Sebbene questi dati non sembrino incoraggianti, non
smentiscono necessariamente un ruolo di aDgk nella tumorigenesi e come possibile target
farmacologico. L’assenza di correlazione può dipendere dalla scarsa numerosità del gruppo di
pazienti e dalla loro eterogeneità. Invece che continuare su questa direzione si è deciso
a) di continuare l’analisi dell’espressione di aDgk nei tumori consultando periodicamente i
diversi database che riportano le analisi di espressione genica mediante microarray di
gruppi di pazienti,
b) di valutare l’espressione di aDgk in un modello di cancerogenesi mammaria nel topo
indotto dalla sovraespressione dell’oncogene Neu/ErbB2 (in collaborazione con prof.
Guido Forni e Prof. Raffaele Calogero, Univ di Torino).
Da una prima analisi l’espressione di aDgk è aumentata nella prima fase dello sviluppo
tumorale, suggerendo un ruolo di aDgk nella tumorigenesi.
Allo scopo di dimostrare in modo inequivocabile il ruolo di aDgk nei tumori, abbiamo deciso
di generare un reagente molecolare che permettesse di downregolare l’espressione di aDgk in
vivo. Allo scopo abbiamo generato un RNAi subclonato in un vettore lentivirale. Abbiamo
quindi generato delle linee di carcinoma gastrico e di carcinoma mammario, in cui
l’espressione di aDgk è effettivamente downregolate. Abbiamo quindi valutato la capacità di
tali linee di proliferare edi invadere la matrice extracellualre in vitro e le abbiamo saggiate in
alcuni saggi di trafromazione tumorale in vitro, quali il soft agar assay e il focus formation
assay. Le linee prive di aDgk erano assolutamtye incapaci di sostnere crescita in soft agar e
capacità di formare foci. Pertanto queste linee sono al momento saggiate in diversi saggi di
tumorigenesi e metastasi in vivo in topi nudi.
268

Dario Gregori Filone tematico C1
Sviluppo e validazione di modelli previsivi di mortalità in pazienti con
diabete di tipo II
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia
OBIETTIVI
1. l’individuazione di adeguati modelli statistici che pennettano, attraverso un utilizzo più
intensivo dei dati esistenti, una maggiore accuratezza predittiva dell'evento morte. I
modelli considerati sono le Reti Neurali, i Classificatori Bayesiani Robusti, i K -nearest
neighbor, la projection pursuit regression;
2. lo sviluppo di modelli ad hoc riferiti alla patologia diabetica di tipo II su una coorte di
pazienti dell'Ospedale Molinette
RISULTATI DELLA RICERCA
La fase di ricerca metodo logica è stata portata a termine, e le varie tecniche comparate su una
popolazione, readyavailable, di soggetti cardiopatici. Il lavoro è stato accettato per la
publicazione sulla rivista lnternational Journal of Cardiology.
Il database dei soggetti diabetici è stato acquisito e validato. Le analisi preliminari e la
costruzione dei validation e test sets sono state effettuate. Primi modelli di regressione robusta
sono stati testati su un outcome di costo e verranno spediti quanto prima ad una rivista di
settore.
Il modello di mortalità è stato validato con le metodologie indicate nel progetto e ha dato
come risultato una migliore performance della projection pursuit regression, che in effetti
mostra una accuratezza ed una sensibilità maggiore rispetto alle altre tecniche previsive.
Gli indici vi adattamento valutati sono il Dxy di Somer, Il Brier e il Discrimination Index (per
tutti e tre il valore minimo è zero e quello massimo, indicante adattamento perfetto è pari ad
1), l'indice Q di qualità della previsione (valori vicini a zero indicano una migliore
previsione).
Model Brier Dxy D Q PPV PPV PPV NPV NPV NPV MR MR MR AUC
(50%) (75%) (ROC) (50%) (75%) (ROC) 50 75 ROC
LR 0.1926 0.5366 0.2621 0.2752 0.6901 0.8571 0.8947 0.6790 0.5649 0.5639 0.3158 0.3947 0.3947 0.7700
GAM 0.1935 0.5442 0.2603 02735 0.6812 0.8696 0.9091 0.6627 0.5736 0.5769 0.3289 0.3816 0.3750 0.7700
PPR 0.1035 0.8769 0.7543 0.7200 0.9041 0.9492 1.0000 0.8861 0.7957 0.6210 0.1053 0.1447 0.3092 0.9400
KNNI 1.5116 0.2480 -0.007 -0.060 0.4928 0.5083 0.4928 0.5000 0.5625 0.5000 0.5066 0.4803 0.5066 0.6200
KNN2 0.2745 0.0802 -0.004 -0.103 0.4966 0.2500 0.5105 0.6667 0.4931 0.7778 0.5000 0.5197 0.4737 0.5400
LDA 0.1931 0.5384 0.2551 0.2648 0.6667 0.8947 1.0000 0.6892 0.5639 0.5704 0.3224 0.3947 0.3816 0.7700
QDA 0.2015 0.7586 0.4762 -0.107 0.6923 0.7158 0.7412 0.9375 0.8772 0.8209 0.2303 0.2237 0.2237 0.8800
ANN 0.1503 0.7327 0.4808 0.4951 0.8026 0.9000 0.9286 0.8158 0.6518 0.6048 0.1908 0.2829 0.3355 0.8700
269

Le capacità previsive sono state valutate con tecniche di ricampionamento basate sul
bootstrap (10000 replicazioni per ogni modello/indice), per eliminare l'ottimismo nella
predizione basata sul solo campione interno, esaminando i valori predittivi positivi (PPV) con
un cut-off sulle probabilità predette pari al 50%, 75% e senza cut-off rispetto all'Area Under
Curve (ADC) delle curve ROC. Stessi cut-off sono stati valutati per il Potere predittivo
negativo (NPV) e per il tasso di errata classificazione (mis-classificazion rate MR).
Come si vede nella tabella, rispetto in particolare agli indici più importanti, il Dxy e l'ADC
delle curve ROC, le Projection Pursuit Regression (PPR) permettono un guadagno di capacità
previsiva del 63% (0.8769 vs 0.5366) per il Dxy e del 22% (0.94 vs 0.77) per l'ADC, rispetto
al modello standard di regressione logistica. Incrementi minori ma comunque significativi
emergono anche dalle reti neurali, con miglioramenti della capacità previsiva pari al 22%
rispetto al Dxy e del 14% rispetto all' ADC.
L'utilizzo di tecniche maggiormente sofistiche e non-standard, anche su base routinaria come
nel caso analizzato, ovvero senza eccessiva modellazione ad hoc del fenomeno, permettendo
una migliore previsione, ottenibile utilizzando la stessa base informativa dei modelli standard.
270

Giorgio Gribaudo Filone tematico A2
Analisi dei meccanismi dello sviluppo del danno vascolare associato
all'infezione con Citomegalovirus
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia
CONTESTO E RAZIONALE
Evidenze epidemiologiche e studi clinici indicano che l’infezione da Citomegalovirus (CMV)
è associata alla patogenesi dell’aterosclerosi, della trombosi, della restenosi in seguito ad
angioplastica e alla patogenesi del rigetto del cuore trapiantato. Si ritiene che la capacità del
CMV di riattivare da uno stato di latenza con un’infezione produttiva che determina, a sua
volta, uno stato di infiammazione possa rappresentare uno degli eventi scatenanti la
patogenesi del danno vascolare. Inoltre, CMV può determinare alterazioni delle cellule
vascolari attraverso:
• il richiamo di cellule infiammatorie nel sito di infezione;
• la stimolazione della proliferazione di cellule endoteliali e della muscolatura liscia
dell’arteria non controbilanciata da apoptosi.
OBIETTIVI
Gli obiettivi principali della ricerca erano i seguenti:
1. identificazione delle basi molecolari dell’endoteliotropismo del CMV.
2. Identificazione dei meccanismi indotti dal CMV che stimolano i processi infiammatori
vascolari.
RISULTATI
Identificazione delle basi molecolari dell’endoteliotropismo del CMV.
L’inattivazione del gene antiapoptotico M45 del CMV murino determina la perdita
dell’endoteliotropismo virale in vitro. Abbiamo osservato che tre ceppi di MCMV in cui M45
è stato inattivato non si propagano in vivo e non sono in grado di determinare patologie
nell’ospite immunocompetente o immunocompromesso. Queste osservazioni avvalorano
l’ipotesi che l’inattivazione di M45 impedisce la replicazione virale. Al fine di studiare il
rapporto struttura-funzione di M45 e quindi di determinare eventuali domini funzionali che
possano rappresentare il bersaglio di molecole inibitorie, l’intera sequenza codificante di M45
o porzioni di essa sono state inserite separatamente in un vettore di espressione per cellule di
mammifero (pcDNA3). In particolare, mediante PCR e oligonucleotidi specifici, sono state
ottenute dalla proteina M45 intera, forme mutate con delezioni progressive dell’estremità
aminoterminale o carbossiterminale. I vettori che esprimono queste forme tronche di M45
sono stati trasfettati transientemente in linee di cellule endoteliali murine e si è verificato
l’effettivo grado di espressione delle proteine M45 delete mediante l’impiego di anticorpi di
coniglio anti-M45. Con questi costrutti sono state generate linee cellulari che esprimono
stabilmente le singole forme delete. In queste linee cellulari si sta valutando l’attività antiapoptotica
delle varie forme di M45 e la capacità delle stesse di recuperare in trans la
replicazione dei ceppi di MCMV deleti di M45. Questi risultati permetteranno di definire i
domini strutturali di M45 che ne determinano il fenotipo anti-apoptotico.
271

Identificazione dei meccanismi indotti dal CMV che stimolano i processi infiammatori
vascolari.
La trascrizione di molti geni cellulari che codificano proteine proinfiammatorie come alcune
citochine (IL-1, IL-6, TNF-a), alcune chemochine (IL-8, MIP-1a, MCP1, RANTES, IP-10) e
molecole di adesione (ICAM, VCAM, E-selectin), dipende dal fattore trascrizionale NF-kB.
L’espressione di queste proteine proinfiammatorie è aumentata in cellule endoteliali infettate
con CMV. Abbiamo osservato che l’infezione di cellule endoteliali (HUVEC) con isolati
clinici di HCMV induce l’attivazione di NF-kB. Questa attivazione è il risultato della capacità
del virus di stimolare la chinasi cellulare IKK2 necessaria per il rilascio di NF-kB dai suoi
inibitori citoplasmatici e la migrazione nel nucleo, con conseguente attivazione della
trascrizione dei geni NF-kB-dipendenti. Al fine di verificare la rilevanza fisiologica
dell’attivazione virus-mediata di IKK2, è stato generato un vettore adenovirale per
l’espressione ad alta efficienza in cellule HUVEC di una forma di IKK2 (dnIKK2) in cui il
residuo di lisina 44 è mutato in alanina. Questa mutazione conferisce a IKK2 un fenotipo
dominante-negativo in grado di inibire l’attività della controparte endogena. La proteina
dnIKK2 si è dimostrata in grado non solo di bloccare l’attivazione HCMV-mediata di NF-kB,
ma di inibire significativamente la replicazione di un isolato clinico di HCMV (VR1814) nelle
HUVEC. Questa osservazione costituisce la prova di principio che l’attivazione di IKK2 nelle
cellule endoteliali svolge un ruolo essenziale nella replicazione di HCMV. Sulla base di questi
risultati si sono poi valutati gli effetti dell’inibizione dell’attività IKK2 sull’induzione di
molecole infiammatorie in seguito ad infezione virale. Si è così osservato come un inibitore di
IKK2 di nuova generazione, la molecola AS602868, che compete con l’ATP per il legame
alla serina chinasi IKK2, sia in grado di prevenire l’induzione di una molecola di adesione
quale ICAM-1 nelle HUVEC infettate con VR1814. Tale inibizione è conseguenza di un
blocco della stimolazione della trascrizione del gene ICAM-1 da parte di HCMV come
verificato mediante real-time PCR. Il trattamento con AS602868 di cellule endoteliali
infettate, previene inoltre l’aumento dell’espressione di altri geni proinfiammatori quali le
chemochine RANTES, IL8, IP-10 e ITAC-1 e del fattore proangiogenetico PAI-1. Inoltre, la
stimolazione della cicloossigenasi 2 (COX-2) e il rilascio di prostaglandine, indotti
dall’infezione con HCMV, sono inibite da AS60868. Infine, AS60868 è in grado di inibire la
replicazione di HCMV VR1814 nelle HUVEC con una EC50 di 0.01 micromolare. Nel loro
insieme, questi risultati evidenziano il ruolo di IKK2 nella replicazione di HCMV e nella
determinazione dell’infiammazione, e validano l’inibitore AS602868 quale molecola in grado
di inibire non solo la replicazione virale ma anche la deregolazione di proteine cellulari
cruciali nella patogenesi del danno vascolare associato all’infezione con CMV.
PUBBLICAZIONI
1. Caposio P., Dreano M., Garotta G., Gribaudo G., and Landolfo S. Human
cytomegalovirus stimulates cellular IKK2 activity and requires the enzyme for productive
replication. J. Virol., 78, 3190-3195, 2004.
2. Caposio P., Riera L., Hahn G., Landolfo S and Gribaudo G.. Evidence that the human
cytomegalovirus 46 kDa UL72 protein is not an active dUTPase but a late protein
dispensable for replication in fibroblasts. Virology, 325, 264-276, 2004.
3. Zannetti C., Mondini M., De Andrea M., Caposio P., Hara P., Peters P., Gribaudo G.,
Gariglio M.,and Landolfo S. The expression of p16INK4a tumor suppressor is upregulated
by human cytomegalovirus infection and required for optimal viral replication.
Virology, submitted, 2005.
4. Caposio P., Musso T., Luganini, A., Inoue, H., Gariglio M., Landolfo S., and Gribaudo G.
Targeting the NF-kB pathway through pharmacological inhibition of IKK2 prevents
human cytomegalovirus replication and virus-induced inflammatory response in infected
endothelial cells. Antiviral Therapy, submitted, 2005.
272

Bartolomeo Griglio Filone tematico B1
Indagine sulla sicurezza delle carni vendute al dettaglio, in relazione alle
differenti tipologie di vendita
A. S. L. 8 – S. C. Ispezione e Controllo degli Alimenti di Origine Animale
CONTESTO E RAZIONALE
A partire dai primi anni '90, seguendo il trend della distribuzione organizzata, anche nella
tradizionale bottega delle carni o nella vendita su aree pubbliche (mercati), hanno iniziato a
comparire una varietà di preparazioni e prodotti a base di carne, in parte acquistati da fornitori
in possesso di specifici riconoscimenti e requisiti sanitari per la produzione e
commercializzazione di tali prodotti (soprattutto per carni avicole e derivati), in parte prodotti
in modo estemporaneo nel laboratorio annesso allo spaccio nel rispetto di requisiti minimi
sanciti con le circolari n. 15 del 1990 e n. 12 del 1991 del Ministero della Sanità. Inoltre con
l'abolizione delle tabelle commerciali (D.Lvo n° 114 del 31/03/98) è diventato possibile nelle
tradizionali macellerie, seppur in subordine alla verifica dell'idoneità igienico sanitaria dei
locali e delle attività da parte dei servizi veterinari delle ASL la vendita di "altri alimenti”.
All'evoluzione imposta dal mercato, non è corrisposto un adeguata crescita dei servizi
veterinari delle ASL chiamati, attraverso il rilascio delle autorizzazioni sanitarie ed i controlli
in fase di vigilanza, a verificare il rispetto dei requisiti di sicurezza e la qualità igienico
sanitaria delle carni. Gli organi di controllo si trovano quindi ad operare in un contesto
profondamente mutato: da un lato la presenza di lavorazioni complesse che, per evitare
pericolose contaminazioni crociate, richiedono un'elevata attenzione alle condizioni igienico
sanitarie delle materie prime, delle strutture e del personale, dall'altro la presenza di ambienti
di lavoro con ampie aperture a diretto contatto della clientela.
MATERIALI E METODI
Attività previste
Ricerca bibliografica sui rischi microbiologici presenti
nella vendita di carni e prodotti derivati e sulle
modalità di controllo e verifica
Individuazione e formazione del gruppo di lavoro
interaziendale composto da personale dipendente,
personale Universitario e personale consulente scelto
sulla base dell’esperienza già espletata nel campo
delle verifiche ispettive
Individuazione di criteri condivisi basati sulla ricerca
della letteratura scientifica e sui risultati dei controlli
effettuati, inerenti le strutture, le tecnologie ed i
requisiti igienico sanitari minimi su cui basare il
rilascio delle autorizzazioni sanitarie alla distribuzione
organizzata (ipermercati, supermercati, discount) ed
ai classici spacci di vendita
273
Percentuale di
realizzazione
100%
100%
100%
Documentazione di riferimento
Raccolta e aggregazione di 17
pubblicazioni
edite su riviste nazionali ed intenazionali
Nota prot. n. 763 DP/vt/B del 27.09.2004-
Determinazione del Direttore Generale
N.1429 del 23.11.2004
Nota prot. n. 763 DP/vt/B del 27.09.2004-
Determinazione del Direttore Generale
N.1429 del 23.11.2004

Attività previste
Realizzazione di un protocollo di verifica dei requisiti
igienico sanitari per consentire una oggettività di
interpretazioni ed una ripetibilità, su cui formare il
personale ispettivo, al fine di uniformare gli interventi
tra le ASl su cui insistono punti vendita delle stesse
aziende della distribuzione organizzata
Effettuazione delle ispezioni quale attività istituzionale
aggiuntiva sulla base del protocollo di intervento
predisposto
Prelievo di campioni di carni, tamponi ambientali e
verifiche aria ambienti
Aggregazione ed analisi dei dati e redazione della
relazione conclusiva del progetto
RISULTATI
274
Percentuale di
realizzazione
100%
100%
100%
100%
Documentazione di riferimento
Nota prot. n. 763 DP/vt/B del 27.09.2004-
Determinazione del Direttore Generale
N.1429 del 23.11.2004
Verbali di sopralluogo e check list di 32
interventi e Verbali di prelevamento
campioni - n.288 campioni
Campioni carni n.42
Tamponi superfici n. 142
Aria ambienti n. 104
Totale prelievi n. 288
Il gruppo di lavoro interaziendale tra l'ASL8 di Chieri e l'ASL5 di Rivoli, composto da
personale dipendente, personale esterno di supporto e con la collaborazione dell'Istituto di
Ispezione degli alimenti della Facoltà di Medicina Veterinaria di Grugliasco ha realizzato un
protocollo di verifica dei requisiti igienico sanitari inerenti a strutture e personale in forma di
"check list" che sono state compilate dagli operatori per ciascuna tipologia di vendita
ispezionata. Le tipologie di vendita prese in considerazione sono state le seguenti:
• ipermercati, discount/supermercati,
• macellerie
• aree mercatali.
Per ognuna delle quattro tipologie sono stati individuati quattro punti vendita, nei quali sono
stati eseguiti due sopralluoghi in due fasce orarie differenti della giornata (mattinopomeriggio)
per valutare eventuali differenze relative alla contaminazione microbiologica; per
la particolarità della tipologia di vendita, le aree mercatali sono state sottoposte a sopralluoghi
concentrati nella fascia mattutina e sono stati ispezionati due autobanchi per ogni area. Il
totale dei sopralluoghi è stato pertanto pari a 32. Per ogni sopralluogo è stato compilato un
verbale di prelevamento campioni controfirmato da un responsabile dell'impresa presente al
prelievo. I campioni prelevati hanno riguardato sia i prodotti carnei (in produzione e in
vendita) sia superfici a contatto e non. In particolare sono stati effettuati tamponi, utilizzando
il metodo delle sponge, su n.2 taglieri, n.2 affettatrici, n1 parete cella frigorifera. Sono inoltre
stati effettuati campionamenti dell’aria mediante duplice tecnica di prelievo: statica per
caduta, mediante esposizione di piastre petri con terreno di coltura e dinamica, mediante
sistema di aspirazione SAS (Surface Air System) in due punti dei locali identificati con zona
di lavorazione e zona vendita. Il totale dei campioni prelevati è il seguente:
• n. 11 campioni carni in produzione
• n. 31 campioni carni esposte in vendita
• n. 32 tamponi superfici non a contatto con alimenti
• n. 110 tamponi superfici a contatto con alimenti
• n. 104 campioni aria ambientale
Qualità igienica della carne
Le carni in produzione e vendita, presentavano per tutte le tipologie di commercializzazione

valori di carica batterica totale (CBT) elevati (dell'ordine di 10 6 /l0 5 ufc/g); più contenuti i
valori di enterococchi fecali e coliformi totali. Non si evidenziavano differenze significative
tra mattina e pomeriggio. Per quanto riguarda Salmonella spp. veniva riscontrata una
positività in un campione di carne suina prelevato presso una macelleria. Le percentuali di
positività per Listeria Monocytogenes sono state:
• ipermercati: il 50 per cento dei campioni di carne in vendita,
• discount / supermercati il 50 per cento dei campioni di carne in produzione e il 50 per
cento dei campioni di carne in vendita;
• le macellerie è stata riscontrata una positività su un campione di spalla bovina in vendita;
• i mercati il 50 per cento dei campioni di carne in produzione e il 62 per cento dei
campioni di carne in vendita;
Superfici a contatto
Valori piuttosto elevati di carica batterica totale (dell'ordine di 10 6 /l0 5 ufc/g) sono stati
evidenziati in tutte le tipologie di vendita; negli ipermercati e nelle macellerie la carica
batterica risulta inferiore nei campioni prelevati il pomeriggio rispetto a quelli del mattino
mentre nei discount i valori sono invertiti. Un dato significativo si riscontra a carico delle
celle frigorifere i cui valori di carica batterica sono risultati costantemente bassi (nell'ordine di
l0 2 ufc/g). Nessuno dei campioni esaminati è risultato positivo per Salmonella, mentre le
percentuali di positività per Listeria monocytogenes sono risultate essere:
• ipermercati il 25 per cento;
• discount / supermercati il 16 per cento;
• macellerie nessuna positività;
• mercati il 25 per cento.
L'aria degli ambienti
Emerge una sostanziale corrispondenza tra i valori ottenuti con il metodo per ricaduta e il
metodo SAS, con un leggero aumento dei valori ottenuti col metodo SAS. Tutti i valori
osservati (cbt, enterobatteri totali, muffe) si mantengono pressoché costanti da mattina a
pomeriggio. Dall'analisi delle check list utlizzate durante i sopralluoghi, emerge che un
laboratorio annesso ad un ipermercato e un laboratorio annesso ad un discount, presso il quale
non sono state rilevate positività a germi patogeni sulle carni o sulle superfici, sono stati
sanzionati, rispettivamente, per carenze igieniche e presenza di insetti. E' stata rilevata in tutti
i punti vendita ispezionati un utilizzo scarso od inappropriato degli sterilizzatori per coltelli.
Infine, in merito all'applicazione di piani di autocontrollo i venditori ambulanti mostrano
ancora ritardi nel recepire le novità che il DL 155/97 ha apportato.
CONCLUSIONI
Da una prima analisi dei dati ottenuti si evidenzia un quadro generale poco soddisfacente per
quanto riguarda gli aspetti igienico sanitari delle carni nelle fasi di commercializzazione
soprattutto in relazione a 2 tipologie di vendita: la grande distribuzione e la vendita su aree
pubbliche. Emerge in particolare l'esigenza di un'analisi accurata sul riscontro di percentuali
così elevate di contaminazioni da L.monocytogenes negli alimenti e secondariamente dalle
superfici di lavoro che evidenziano da un lato elevate contaminazioni delle superfici a
contatto con le carni, dall'altro carenze nella gestione delle SSOP soprattutto nelle realtà con
elevati ritmi produttivi quali gli ipermercati. Dalla valutazione dei dati emerge, tuttavia, un
dato interessante: la presenza di ambienti di lavoro a diretto contatto con la clientela,
inizialmente ipotizzata come possibile punto critico per la ricaduta microbiologica sulle
produzioni, non pare influenzare negativamente i valori di inquinamento ambientale.
275

Gabriella Gruden Filone tematico C2
Inadeguato trattamento e tardivo riferimento al nefrologo dei pazienti con
nefropatia diabetica: cause e rimedi
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina Interna
OBIETTIVO
Obiettivo generale del presente progetto di ricerca era l’identificazione delle barriere che
ostacolano la prevenzione ed il corretto trattamento della nefropatia in pazienti con diabete di
tipo 2 (DM2). In particolare, abbiamo valutato se il fenomeno del riferimento tardivo al
nefrologo dei pazienti con DM2 è un problema presente nella nostra realtà locale e quale è
l’entità e la causa di tale problema.
METODI E RISULTATI
Lo studio è stato condotto in due coorti di pazienti con DM2 residenti nel territorio dell’ASL4
di Torino. Il primo gruppo è stato identificato selezionando in maniera randomizzata 200
pazienti tra i 5815 che nel periodo dal 1/1/2000 al 30/6/2000 hanno spedito alle farmacie
dell’ASL4 almeno una ricetta di farmaci ipoglicemizzanti orali/insulina. I pazienti sono stati
successivamente convocati telefonicamente o mediante l’invio di una lettera e di questi 171
sono stati reclutati nello studio. Il secondo gruppo era composto da 121 casi reclutati tra gli
assistiti di cinque medici di medicina generale operanti nel territorio della ASL4, che hanno
accettato di partecipare allo studio (72%). In un sottogruppo di pazienti (20 soggetti) con
clearance della creatinina >70 ml/min ed età inferiore ai 65 anni è stata eseguita una biopsia
renale al fine di valutare il tipo di lesioni presenti e correlarle ai parametri clinici. E’ stata
riscontrata una nefropatia diabetica in 15 casi, mentre in altri cinque il reperto era suggestivo
di nefroangiosclerosi o non si discostava significativamente dalla norma. Il tessuto renale è
stato conservato per successive analisi immunoistochimiche. L’invio al nefrologo è indicato
nei pazienti con macroalbuminuria; tuttavia la nostra indagine rivela che il riferimento al
nefrologo avviene soltanto nel 26% di tali pazienti. Questo fatto ha potenziali conseguenze
negative per l’evoluzione della nefropatia; infatti i nostri dati evidenziano che, mentre tutti i
pazienti macroproteinurici sottoposti a visita nefrologica risultavano in trattamento con ACEinibitori
o sartani, ben il 31% dei pazienti non sottoposti a visita nefrologica non assumevano
tali farmaci. La causa è da ricercare nel mancato dosaggio quantitativo della proteinuria, che
non consente di stimare correttamente l’entità dell’escrezione urinaria di albumina.
I due gruppi di pazienti (sottoposti e no a visita nefrologica) differivano significativamente in
quanto i primi avevano età maggiore (77±7 vs 69±9 p=0.005), una più lunga durata di
malattia (27±16 vs 15 ± 9 p=0.003) e sopratutto valori di creatinina più elevati (2,9±2,6 vs
0,9±0,3 mg/dl p=0.006). Sembra, pertanto, che aumento della creatininemia sia il fattore che
induce il curante ad inviare il paziente al nefrologo. Tuttavia, i nostri dati indicano che la
macroproteinuria può essere presente anche in assenza di insufficienza renale e soprattutto
che i valori di creatinina non sono sufficientemente sensibili nell’evidenziare la presenza di
insufficienza renale. La distribuzione dei pazienti normo, micro e macroalbuminurici
all'interno delle classi di funzionalità renale era, infatti, la seguente: normoalbuminuria (I
8,0%, II 36,0%, III 45,5%, IV 10,0%, V 0,5%), microalbuminuria (I 7,0%, II 3,5%, III 3,5%,
IV 19,0%, V 4%), macroalbuminuria (I 5,0%, II 35%, III 35%, IV 15,0%, V 10%).
276

I nostri risultati indicano, pertanto, che il fenomeno del tardivo riferimento al nefrologo è
presente nella nostra realtà locale, che il fenomeno è di notevole entità ed ha un’importante
impatto sul trattamento del paziente con nefropatia diabetica; infine che il mancato dosaggio
della proteinuria ne rappresenta una delle maggiori cause. Tali dati sono di estremo interesse e
saranno oggetto sia di presentazioni scientifiche che di pubblicazioni originali anche al fine di
dare un’adeguata diffusione delle informazioni ottenute sulla applicazione a livello locale
delle linee guida nazionali ed internazionali. Sulla base dei risultati ottenuti si è, inoltre,
progettato un intervento mirato a contrastare il fenomeno del riferimento tardivo al nefrologo
e dell’inadeguato trattamento dell’ipertensione e della nefropatia nel paziente diabetico. Tale
intervento prevede non solo il coinvolgimento dei medici di base, ma sopratutto un'attiva
interazione tra il nefrologo ed il medico di base anche a livello organizzativo.
In un intervento pilota, che ha coinvolto sia il centro nefrologico che 5 medici di base,
abbiamo valutato l’efficacia di una terapia a gradini dell’ipertensione con controlli e
adeguamenti sistematici mensili mediante accessi programmati al medico di base. Cinque
medici di base volontari hanno seguito in modo intensivo 123 (73%) dei loro pazienti con
DM2; di questi 95 (77%) hanno completato 7 visite. Il gruppo di controllo era costituito da 82
pazienti con DM2 selezionati in maniera casuale tra gli assistiti della stessa ASL e non
sottoposti al protocollo intensivo. La pressione arteriosa sistolica e diastolica si è ridotta in
maniera significativa nel gruppo 1, mentre è rimasta invariata nei soggetti del gruppo 2. ACR
è passata da 7.0 (0-2464) a 3.2 (0-1814) nel gruppo 1 e da da 8.7 (0-1711) a 6.5 (0.1-1870) nel
gruppo 2. Al termine del follow-up hanno sviluppato microalbuminuria il 4% dei pazienti nel
gruppo 1 ed il 12.5% dei pazienti nel gruppo 2 e sono passati dallo stadio di microalbuminuria
a quello di macroalbuminuria 0 pazienti nel gruppo 1 e il 12.5% dei pazienti nel gruppo 2. Nel
gruppo 1 si sono osservati 4 eventi cardiovascolari in 4 pazienti contro 13 eventi in 11
pazienti nel gruppo 2. Le analisi farmacoeconomiche preliminari suggeriscono un risparmio
quantificabile in almeno 0,2 euro per euro investito.
Sulla base di questi risultati, se pur preliminari, possiamo affermare che l’attiva
collaborazione del nefrologo con i medici di base favorisce non solo il raggiungimento degli
obbiettivi terapeutici, ma sembra avere un impatto positivo, già a breve termine, sugli eventi
cardiovascolari. Sulla base di queste esperienze positive stiamo cercando di estendere al un
maggior numero di medici di base tale l’iniziativa di collaborazione diretta con il nefrologo e
di includere tra gli obiettivi non solo il trattamento intensivo della pressione arteriosa, ma
anche, sulla base dei dati emersi da questo studio sulle cause del tardivo riferimento al
nefrologo, un protocollo che assicuri in tutti i pazienti la misurazione della proteinuria
(richiesta dal curante, ma eseguita presso il centro nefrologico) e l’invio diretto al nefrologo di
tutti i soggetti macroalbuminurici. Alla data del 28/2/06 120 medici di base hanno già aderito
alla nostra proposta ed è in corso la fase di screening dell’albuminuria e trattamento intensivo
dell’ipertensione.
277

Ornella Guardamagna Filone tematico A4
L’utilità della dieta nell’iperlipemia familiare combinata in età pediatrica
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze pediatriche e dell’Adolescenza
CONTESTO E RAZIONALE
Tra gli errori congeniti del metabolismo lipidico, l’iperlipemia combinata familiare (FCHL)
rappresenta una patologia tanto frequente quanto insidiosa: costituisce infatti, la seconda
causa di malattia coronarica precoce. Difetto non caratterizzato sul piano molecolare e
scarsamente definito su quello biochimico, è tradizionalmente considerato tipico dell’età
adulta, poiché i sintomi sono manifesti in tale fase di vita anche se, recentemente, è stato
dimostrato il possibile manifestarsi del disordine già in età pediatrica. L’espressione
biochimica della malattia è modulata da geni diversi tra cui il gene che codifica
l’apolipoproteina E, di cui sono noti 6 diversi aplotipi: controverso è il ruolo aterogenico
dell’allele ε4. La dieta è considerata efficace nel migliorare l’omeostasi delle lipoproteine, e
ampiamente discusso l’effetto della riduzione dei grassi saturi della dieta nella terapia
dell’ipercolesterolemia o di quello dei polinsaturi nell’ipertrigliceridemia, purtuttavia scarse
sono le evidenze scientifiche al riguardo di pazienti FCHL, particolarmente nei bambini.
OBIETTIVO
Obiettivo di questa tesi è quello di valutare l’efficacia della dieta nel trattamento dell’ FCHL
in età pediatrica.
MATERIALI E METODI
Sono stati esaminati 20 soggetti FCHL (11 maschi e 9 femmine di età media pari a 8,5± 3,9 e
6± 4,1 anni rispettivamente), e sono stati esclusi pazienti affetti da dislipidemia secondaria
(soprappeso/obesità, diabete tipo II, disturbi endocrini, epatici, renali). Tutti i probandi sono
stati sottoposti ad esame clinico (calcolo dell’indice di massa corporea), genetico (analisi
dell’aplotipo apoE con metodo di restrizione enzimatica) e sottoposti a controlli biochimici
(colesterolemia totale, HDL-C, LDL-C, trigliceridi, apolipoproteina B) ripetuti nel corso di
quattro diversi regimi dietetici, ognuno della durata di sei mesi:
1. Dieta libera, ovvero la dieta che il paziente liberamente assumeva al momento della
diagnosi.
2. Dieta controllata, ovvero la proposta dietetica corrispondente ai criteri di dieta STEP I
(lipidi 28% (saturi 6%), glucidi 59%, protidi 15%).
3. Dieta controllata con l’aggiunta di integratore, ovvero la stessa dieta del punto 2 ma con la
sostituzione del 50% dell’olio di oliva quotidianamente consumato, con olio di riso (20
g/die.
4. Dieta normocalorica (lipidi 32%, grassi saturi (9?%), carboidrati 52%, protidi 16%)
integrata con 10 g/die di olio di riso.
278

RISULTATI E CONCLUSIONI
Il programma dietetico non è mai stato restrittivo sul piano nutrizionale, ed ha ottenuto una
buona compliance da parte dei pazienti. La riduzione delle Calorie/die e dei grassi totali della
dieta, a vantaggio di quelli monoinsaturi e polinsaturi (come osservato in corso di Dieta
Controllata e Dieta Controllata+Integratore) ha fornito i primi risultati positivi sulla
colesterolemia, con un decremento del colesterolo totale del 12,1%, ulteriormente diminuito
in seguito ad integrazione con olio di riso (13,0%). Analogamente la frazione LDL-C ha
subito un calo rispettivamente dell’11,6% e del 18,2% rispettivamente. Tali decrementi sono
statisticamente significativi rispetto ai valori basali osservati in corso di dieta libera.
Viceversa le variazioni della trigliceridemia sono state pari al 6,2% e 9,8% rispettivamente
(ns). Il risultato migliore caratterizzato da riduzione di TC (14,1%), LDL-C (15,5%) e
trigliceridi (19,9%) si raggiunge in corso di dieta normocalorica con apporto di lipidi totali
pari al 32%, carboidrati 52%, protidi 15% e integrata con olio di riso. Il rapporto tra le
frazioni di acidi grassi polinsaturi: monoinsaturi: saturi pari a 1:2:1, si è confermato ottimale
nel controllo del profilo lipidico. Nondimeno deve essere trascurato l’effetto dell’integrazione
con olio di riso, che non è limitata ad integrare la quota di grassi insaturi ma anche quella di
fitosteroli ed α-tocoferoli, di cui è nota l’azione di controllo della colesterolemia. La
prevalenza pazienti portatori di aplotipo E3/E4 risulta superiore a quella osservata nella
popolazione generale ed i valori medi riscontrati di colesterolo totale, LDL-C, apoB e
trigliceridi risultano superiori rispetto a quelli osservati in presenza di aplotipo E3/E3.
Inoltre nei primi è stata riscontrata una minore risposta al trattamento e si può pertanto
ipotizzare che l’allele 4 contribuisca a caratterizzare la risposta individuale alla dieta nella
presente casistica pediatrica di soggetti iperlipemici.
In conclusione, la dieta risulta uno strumento efficace nel controllo dell’iperlipemia di
pazienti pediatrici FCHL. Poiché l’espressione della malattia e la prognosi a distanza di tali
pazienti è in funzione dell’equilibrio metabolico, risulta essenziale la precoce individuazione
degli stessi in età pediatrica/adolescenziale, soprattutto se appartengono a famiglie in cui la
penetranza del difetto risulta più elevata, per prevenire il danno vascolare attraverso una
corretta impostazione dello stile di vita.
279

Giovanni Carlo Isaia Filone tematico D1
Fattori di rischio dell'osteoporosi postmenopausale ed incidenza di
osteoporosi secondarie nella popolazione piemontese
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina Interna
MATERIALI E METODI
Abbiamo analizzato 505 donne che afferivano al Servizio Medicina-Malattie metaboliche
dell’osso dell’Aso San Giovanni Battista di Torino. A tutte le donne è stato somministrato un
questionario. Abbiamo raccolto i dati densitometrici di tutte le donne arruolate nello studio. I
soggetti sono stati classificati come osteoporotici, osteopenici o normali secondo i parametri
del WHO (WHO Technical Report Series nr 843 “Assessment of fracture risk and the
application to screening for postmenopausal osteoporosis”, 1994). La densità minerale ossea è
stata misurata con un densitometro Hologic QDR 4500 con tecnica DXA a livello femorale o
lombare a seconda delle caratteristiche cliniche delle pazienti. Il questionario utilizzato è stato
validato dallo studio ESOPO (Adami S, Giannini S, Giorgino R, Isaia GC, Maggi S,
Sinigaglia L, Filipponi P, Crepaldi G (2004) Effect of Age, Weight and Lifestyle Factors on
Calcaneal Quantitative Ultrasound in Premenopausal Women: The ESOPO Study. Calcif
Tissue Int Jan 8).
L’attività fisica abituale è stata definita in base alla durata come: inferiore a 30’, tra 30’ ed un
ora e maggiore di un ora al dì. Le donne fumatrici sono state classificate come attualmente
fumatrici (in questo caso abbiamo registrato il numero di sigarette fumate al dì) ed exfumatrici.
Abbiamo applicato a tale popolazione gli score decisionali più utilizzati in
letteratura: Le linee guida della National Osteoporosis Foundation (NOF), Osteoporosis Risk
Assessment Instrument (ORAI), Osteoporosis Self-Assessment Tools (OST) ed il criterio del
peso. Sulla base delle variabili predittive della densità minerale ossea (BMD) come risultate
dal modello di regressione lineare abbiamo sviluppato un nuovo criterio decisionale che
abbiamo chiamato AMMEB (Age, years after Menopause, age at MEnarche, BMI). Il
punteggio da affidare alle singole variabili è stato basato su un’integrazione dell’ ORAI. Per
indagare l’incidenza delle osteoporosi secondarie in una sottopopolazione di 132 donne che si
sono recate in ambulatorio dopo l’esecuzione dell’esame densitometrico risultato patologico
abbiamo eseguito: anamnesi, esame obiettivo e gli ematochimici di primo livello per
escludere osteoporosi secondarie.
Analisi statistica
Le pazienti classificate come osteoporotiche, osteopeniche o normali sono state paragonate
per tutte le variabili continue analizzate con l’analisi della varianza ad una via (one way
ANOVA) e per le variabili non continue con il test del χ². Abbiamo valutato l’associazione tra
le variabili significative all’ANOVA e la BMD con un modello di regressione lineare con
metodo stepwise. Le variabili risultate predittori indipendenti della BMD sono state utilizzate
per calcolare lo score AMMEB. Gli altri score presi in considerazione dlla letteratura sono
stati applicati alla nostra popolazione per valutarne la sensibilità (SE), specificità (SP), valore
predittivo positivo (PPV) e valore predittivo negativo (NPV) nel riconoscere soggetti
osteopenici e/o osteoporotici.
280

RISULTATI
Nella popolazione analizzata 229 (45.3%) donne sono risultate osteoporotiche, 169 (33.5%)
osteopeniche e 107 (21.2%) normali. La percentuale di osteoporosi in prima diagnosi era
48.5% (50 pazienti), mentre la percentuale di prima diagnosi di osteopenia era 51.5% (40
pazienti). Le uniche variabili significativamente differenti tra le tre categorie densitometriche
erano: l’età, l’età al menarca, periodo di amenorrea dopo la menopausa e il BMI. Il modello di
regressione lineare tra le variabili differenti all’ANOVA e la BMD ha mostrato che età,
periodo postmenopausale, età al menarca e BMI sono predittori di BMD lombare ((R= 0.45);
mentre per quanto riguarda la BMD femorale solo l’età risulta essere un predittore (R= 0.38).
queste variabili sono state utilizzate per calcolare l’AMMEB score.
In particolare la paziente viene considerata ad elevato rischio se il suo punteggio supera gli 11
punti. Il punteggio viene così attribuito:
Età in anni: 15 se 75+, 9 se 65-74, 5 se (55-64), 0 se 55 BMI: 8 se 13.
Anni di menopausa: 5 se>16, 4 se 11-16, 3 se 5-11.
La capacità dell’AMMEB di individuare le pazienti a rischio sui è dimostrata decisamente
maggiore rispetto alle altre linee guida. Per quanto attiene alla prevalenza di osteoporosi
secondarie 17 pazienti (19.5% delle pazienti osteoporotiche) erano affette da un’osteoporosi
secondaria (64.7% ipovitaminosi D, 17.6% iperparatiroidismo primitivo e 17.6%
osteomalacia.
I dati derivati da questo studio sono stati pubblicati su CTI: Effects of lifestyle and risk factors
on Bone Mineral Density in a cohort of Italian women: suggestion for a new decision rule.
D’Amelio P., Tamone C., Pluviano F., Di Stefano M., Isaia G.. Calcif Tissue Int. 2005 Jul 28;
[Epub ahead of print]
281

Ciro Isidoro Filone tematico C1
Espressione di Catepsina D e di FLIP nella progressione dei linfomi non-
Hodgkin: utilità nella diagnosi e nel follow up
Università “A. Avogadro” del Piemonte Orientale
Dipartimento di Scienze Mediche
In questo studio abbiamo valutato in una ampia casistica di Linfomi non-Hodgkin (LNH)
l’espressione di due molecole (Catepsina D e c-FLIP) dal comportamento opposto nell’ambito
della morte cellulare. Catepsina D è una endoproteasi lisosomica riconosciuta fra i mediatori
positivi dell’apoptosi, mentre c-FLIP è un fattore anti-apoptotico noto per interferire nel
meccanismo apoptotico a cascata dipendente dalla caspasi-8.
OBIETTIVI
Gli obiettivi di questo studio erano fondamentalmente due:
1. evidenziare, con vari sistemi di indagine, la localizzazione nei linfomi non-Hodgkin di
catepsina D e c-FLIP;
2. riconoscere una possibile relazione fra espressione della catepsina D e di c-FLIP, e istotipi
di linfomi non-Hodgkin meno o più aggressivi, o in ogni caso che abbiano rivelato una
maggior o minor tendenza alla progressione, indipendentemente dall’istotipo. Lo scopo
dichiarato era quello di verificare se queste due molecole potessero rappresentare validi
marcatori del processo di morte cellulare apoptotica nell’ambito del tumore onde poter la
loro espressione eventualmente essere utilizzata ai fini diagnostici e prognostici.
METODI E RISULTATI
Sono stati analizzati diversi istotipi di linfomi e a diverso grado di malignità, valutato secondo
i classici parametri istopatologici. L’espressione di c-FLIP e di Catepsina D è stata analizzata
con tecniche di immunocitochimica, di immunofluorescenza e di immunoblotting, utilizzando
anticorpi specifici commerciali e di nostra produzione. La presenza di morte cellulare
apoptotica o necrotica nell’ambito del tessuto è stata valutata mediante colorazione della
cromatina con ioduro di propidio o con DAPI, mediante colorazione del citoscheletro con
anticorpi anti-tubuilina e anti-actina, mediante colorazione dei lisosomi con arancio di
acridina e dei mitocondri con rodamina, al fine di valutare l’integrità di membrana di questi
organellu. I dati sono stati correlati con la stadiazione clinica e l’evoluzione della malattia
(responsività al trattamento, chemioresistenza, remissione parziale, recidiva, decesso). Per
l’analisi statistica si è tenuto conto della semplice positività o negatività dei marcatori c-FLIP
e catepsina D. I dati riguardanti il decorso sono stati suddivisi in due gruppi, comprendenti
rispettivamente i casi con remissione completa da una parte, e quelli deceduti o con recidiva o
remissione parziale e malattia stabile dall’altra. I dati sono stati analizzati utilizzando i test
statistici del “chi-quadro”, il “T di Student”, l’analisi delle curve di sopravvivenza di Kaplan-
Meyer, la regressione lineare. Per quanto riguarda l’espressione di c-FLIP sono risultati
positivi 24 casi di linfomi ad alta malignità e 6 a bassa malignità, mentre fra i negativi 21
erano linfomi ad alta malignità e 15 a bassa malignità.
282

Fra i linfomi ad alta malignità, 14 erano positivi per la catepsina D, e di essi 12 su 14
mostravano decorso negativo o mancata risposta alla terapia, mentre 31 erano catepsina Dnegativi,
rispettivamente con 16 casi a decorso negativo e 15 a decorso positivo; il c-FLIP era
positivo in 24 casi, di cui 11 con decorso negativo, mentre dei 21 casi negativi, 17
presentavano un decorso negativo. Dei linfomi a basso grado, 11 erano positivi per la
catepsina D, di cui 9 con decorso favorevole, e 10 erano negativi per questa molecola, con
decorso negativo in 9 di essi. Il c-FLIP era positivo in soli 6 casi, di cui 5 con decorso
negativo, mentre dei 15 casi negativi, 6 presentavano decorso sfavorevole.
L’espressione delle due molecole consentiva di costruire, per ogni gruppo di linfoma, 4
fenotipi diversi: FLIP+ CD+, FLIP+ CD-, FLIP- CD+, FLIP- CD-. Il più rappresentato era
FLIP+ CD- nei linfomi ad alta malignità (22 casi) e FLIP- CD+ in quelli a bassa malignità (11
casi). I più significativi erano FLIP- CD+ nei linfomi ad alta malignità, FLIP+ CD- nei
linfomi a bassa malignità, entrambi correlati negativamente al decorso, e FLIP- CD+ nei
linfomi a bassa malignità, correlato positivamente al decorso.
I nostri dati dimostrano effettivamente che c-FLIP e catepsina D sono inversamente espressi
poiché, considerando la nostra serie di casi nel suo insieme, la positività per una delle due
molecole presenta una correlazione inversa con la positività dell’altra; quindi, più sono alti i
livelli di un marcatore anti-apoptotico come il c-FLIP più sono bassi quelli di un marcatore
pro-apoptotico come la catepsina D (p< 0.0095). Infatti, in soli 2 casi su 66 (3%) c-FLIP e
catepsina D risultavano espressi nelle stesse cellule. Contrariamente a quanto ipotizzabile,
anche a giudicare dai dati della letteratura, l’espressione del c-FLIP non era correlata ad un
particolare rischio di progressione nei linfomi ad alto grado, in cui anzi la negatività comporta
un decorso significativamente peggiore; anche in questo caso l’espressione della molecola era
invece associata a un peggior decorso nei linfomi a basso grado, pur se il numero di casi non
consentiva di indicare, per questo dato, una sicura significatività. Complessivamente sono
stati studiati oltre 100 casi di LNH.
I risultati in sintesi:
1. nei linfomi con malignità intermedia o alta la negatività per c-FLIP è associata a un
maggior rischio di progressione (p< 0.0288);
2. il c-FLIP è associato a un peggior decorso nei linfomi a bassa malignità, tuttavia la scarsa
numerosità del campione non consentiva l’evidenziazione statistica di questo dato (p<
0.093).
In conclusione, nel nostro studio abbiamo dimostrato che l’espressione di catepsina D e c-
FLIP può esercitare un impatto sulla progressione dei linfomi non-Hodgkin. Catepsina D e
FLIP possono quindi essere annoverati tra i marcatori tumorali di potenziale interesse ai fini
diagnostici e prognostici dei LNH.
283

Thomas Oliver Jefferson Filone tematico D4
Revisione sistematica sulla efficacia e sicurezza della vaccinazione
contro il Morbillo, la Parotite e la Rosolia
Asl 20 – SeREMI
MATERIALI E METODI
La ricerca è stata svolta seguendo la metodologia delle revisioni sistematiche adottata dalla
Cochrane Collaboration. Sono stati inclusi studi randomizzati, quasi-randomizzati, studi
comparativi retrospettivi e prospettici che valutano la sicurezza della vaccinazione con
qualsiasi vaccino anti MPR (indipendentemente da dose, ciclo o preparazione) confrontata
con placebo o con nessun intervento. Sono stati indagati eventi avversi locali (irritazione,
rossore del sito di inoculazione) e sistemici (febbre, rash, diarrea, sintomi più severi e
generalizzati inclusi tutti i potenziali eventi avversi come porpora trombocitopenica, parotiti,
sintomi agli arti, malattia di Crohn, colite ulcerosa, autismo, meningite aseptica) osservati
durante il follow up della vaccinazione. Sono state esaminate le seguenti banche di dati:
Cochrane Library (contenente: The Cochrane Database of Systematic Reviews; The NHS
Database of Abstracts of Reviews of Effectiveness; The CENTRAL/Cochrane Controlled
Trials Register) Medline (1966- oggi) EMBASE (1985-oggi) Utilizzando le seguenti
combinazioni di parole chiave: Vaccines-Combined [mesh word (mh)] or Vaccines-
Attenuated (mh) or ((trivalen*[text word (tw)] or combin* (tw) or simultan* (tw) or tripl*
(tw) or trebl* (tw) and (vaccin* (tw) or immuni* (tw) or inoculat* (tw))) and measles (tw) and
mumps (tw) and rubella (tw) orMeasles-Vaccine(mh) and Mumps-Vaccine (mh) and Rubella-
Vaccine (mh) or MMR [title, abstract (ti,ab)] or measles (tw) and mumps (tw) and rubella
(tw) and (vaccin* (tw) or immuni* (tw) or inoculat* (tw) and adverse events [floating subheading
(fs)] or chemically induced (fs) or complications (fs) or contraindications (fs) or
toxicity (fs) or poisoning (fs) or drug effects (fs) or adverse (tw) near (effect* (tw) or event*
(tw)) or side effect* (tw) or hypersensitiv* (tw) or sensitiv* (tw) or safe* (tw) or
pharmacovigil* (tw) or explode Product-Surveillance-Postmarketing (mh) or Drug-
Monitoring (mh) or Drug-Evaluation (mh) or explode Risk (mh) or Odds-Ratio (mh) or
explode Causality (mh) or relative risk (tw) or risk (tw) or causation (tw) or causal (tw) or
odds ratio (tw) or etiol* (tw) or aetiol* (tw) or etiology (fs) or epidemiology (fs).
RISULTATI
La strategia di ricerca applicata alle banche dati ha prodotto circa 4500 titoli di lavori che
sono stati selezionati in base ai contenuti dell’abstract. 120 lavori potenzialmente includibili
sono stati recuperati ed esaminati interamente. Di questi solo 22 sono stati inclusi nella
revisione: 5 RCT, un CCT, 9 studi di coorte, due casi-controllo, tre studi di serie temporali,
uno studio ecologico e uno studio con i casi come controlli di se stessi. Gli studi sperimentali
senza menzione di randomizzazione sono stati classificati come studi di coorte. Il numero
totale di eventi avversi considerati dagli studi inclusi ammonta a 165, variando da 1 a 18 per
singolo studio (media 7.5, mediana 7).
Studi randomizzati (RCT e CCT): due sono stati giudicati a basso rischio di errore, due a
medio e due ad alto. Gli outcome riportati, riguardanti eventi lievi a breve termine, sono
numerosi e definiti in modo così eterogeneo da impedire qualsiasi combinazione matanalitica.
Studi di coorte: uno studio segnala un rischio aumentato di sintomi articolari nelle bimbe sotto
cinque anni. Nessuna differenza di incidenza dei sintomi più comuni tranne che per talune
284

singole segnalazioni (parotite, diarrea, rash e linfoadenopatia). Tutti gli studi di coorte
presentano problemi di reporting e significative limitazioni di metodo.
Studi caso-controllo: uno studio indaga l’associazione con il morbo di Crohn e la colite
ulcerativa e l’altro indaga l’associazione con la meningite asettica. Nessuna evidenza di
associazione identificata, la qualità degli studi è buona. Studi di serie temporali: uno studio
segnala la possibile associazione tra la vaccinazione con il ceppo parotite Urabe e la
meningite asettica ed un altro segnala una maggior incidenza di rash, linfoadenopatia e
congestione nasale. Nessuna differenza di incidenza di autismo e altri disturbi psichiatrici
viene rilevata da uno studio comparativo dedicato a questa analisi. La qualità di questi studi
appare molto variabile.
Studi ecologici: l’unico studio di questo tipo evidenzia la possibile maggior incidenza di
porpora trombocitopenica di tipo benigno e autolimitante (non distinguibile dalla porpora
idiomatica associata all’infezione naturale da morbillo).
Studio di casi: uno studio che utilizza i casi come controlli temporali di se stessi indaga la
possibile associazione con l’insorgenza di autismo e conclude per l’inesistenza di prove
conclusive.
CONCLUSIONI
Le prove di buona qualità riguardanti la sicurezza del vaccino combinato MMR sono limitate
a confronto con quelle disponibili per le singole componenti vaccinali. Gli studi di buona
qualità indicano l’inesistenza di associazione con la meningite asettica e con i sintomi
respiratori. Anche la possibile associazione con il morbo di Crohn e la colite ulcerosa viene
esclusa da uno studio di buona qualità, anche se di piccole dimensioni. Tutti gli altri studi
presentano problemi metodologici significativi, soprattutto la esistenza di possibili errori di
selezione. La validità esterna non è elevata, in generale, ed esistono problemi di
standardizzazione nella definizione degli eventi riportati e nella durata del periodo di
osservazione. La maggior limitazione della presente revisione è rappresentata dall’alto di
numero di studi esclusi a causa dell’assenza di osservazioni comparative. Questo rinvia al
problema più generale della difficile valutazione di sicurezza in caso di interventi di sanità
pubblica che, interessando la maggior parte dalla popolazione, rendono indisponibili gruppi di
popolazione rappresentativi per il confronto.
285

Simonetta Kerim Filone tematico A2
Studio di marcatori biologici di progressione e prognosi nel carcinoma
prostatico localmente avanzato.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento Assistenziale di Oncologia
CONTESTO E RAZIONALE
Nel carcinoma prostatico, la scelta fra differenti e più o meno aggressive strategie
terapeutiche, è tuttora controversa, così come è attualmente imprecisa l’identificazione di
differenti gruppi di rischio da avviare a specifici percorsi terapeutici. Risulta quindi di grande
importanza l’acquisizione di nuovi marcatori prognostici che consentano di assegnare, in sede
diagnostica, un differente potenziale evolutivo a queste neoplasie, permettendo la
discriminazione fra tumori dotati di scarsa aggressività biologica e tumori caratterizzati invece
da un potenziale metastatico più o meno rilevante. I criteri attualmente in uso nella
valutazione prognostica del carcinoma prostatico, quali la stadiazione clinico-patologica ed il
grading isto-patologico, non rispondono pienamente a queste esigenze, poiché non
permettono una previsione sufficientemente precisa circa il decorso clinico e, di conseguenza,
il trattamento più appropriato ai singoli casi.
OBIETTIVO
Come noto, lo sviluppo di neoplasie maligne è legato all’accumulo di mutazioni (delezioni,
amplificazioni, traslocazioni) a carico di diverse porzioni del genoma umano, e la
progressione del tumore dipende dalla successiva acquisizione di ulteriori alterazioni
genetiche. Lo studio si propone di definire la ricorrenza di anomalie genomiche note come
caratteristiche del carcinoma prostatico mediante metodiche di FISH (Fluorescence In Situ
Hybridization) su materiale operatorio fissato in paraffina. Questo lavoro si è proposto di
valutare se determinate alterazioni citogenetiche possano essere utilizzate:
1. come indicatori della aggressività di una neoplasia prostatica e quindi della prognosi di
ciascun paziente;
2. come parametri per monitorarne l’evoluzione correlandoli con il PSA, con lo stadio ed il
grado della neoplasia;
3. come parametri per permettere di ottimizzare il trattamento del singolo paziente;
4. per consentire in un prossimo futuro, lo sviluppo di gene/target therapy personalizzate.
Sono state valutate tre fra le più importanti alterazioni genetiche note nel carcinoma
prostatico: l’amplificazione del proto-oncogene c-myc localizzato nella regione cromosomica
8q24, la delezione del gene LPL (lipoprotein lipasi), mappato in 8p22 e la delezione del gene
onco-soppressore p53 localizzato in 17p13.
MATERIALI E METODI
Nel corso di questa prima fase dello studio, retrospettivo, sono stati analizzati 25 casi di
carcinoma prostatico localmente avanzato operati presso la Divisione di Urologia Ospedaliera
(Dott. Ferrando) dell’Ospedale Molinette di Torino; sono stati selezionati pazienti le cui
286

caratteristiche rispondessero a quelle di soggetti: con un lungo follow-up (da 5 a 10 anni),
sottoposti a prostatectomia radicale (RPP o RRP), con carcinoma localmente avanzato. Per
ciascun paziente sono stati allestiti, presso il laboratorio di citogenetica del Secondo Servizio
di Anatomia Patologica (Prof. Palestro), due preparati in FISH: uno per la valutazione delle
alterazioni a carico di c-myc, e di LPL in relazione al centromero del cromosoma 8 (CEP8);
un secondo per la valutazione del gene p53, in relazione al centromero del cromosoma 17
(CEP17). L’amplificazione e delezione delle regioni cromosomiche di interesse sono state
assegnate sulla base del rapporto LPL/CEP8, c-myc/CEP8, p53/CEP17, per ognuno dei quali
sono stati precedentemente definiti i valori di cut-off. L’entita’ dello scostamento del rapporto
rispetto al cut-off è stata assunta come indicativa della quota di popolazione neoplastica
portatrice dell’anomalia citogenetica. Sono stati quindi raccolti i dati clinici e anatomopatologici
dei 25 soggetti in studio: PSA alla diagnosi e all’ultimo controllo, terapie radianti
od ormonali instaurate prima o dopo l’intervento di prostatectomia radicale, stadio e grado
istologici ed infine lo stato di salute attuale del paziente, eventuali complicanze o malattie
concomitanti.
RISULTATI
Fra i 25 pazienti si contano 6 decessi, di cui solo tre (12%) imputabili all’evoluzione del
carcinoma prostatico, mentre l’altra metà è dovuta ad altre patologie (carcinoma esofageo,
ictus e neoplasia cerebrale). Nel nostro studio, il gene c-myc risulta amplificato nel 48% dei
pazienti (12/25), normale nel restante 52% (13/25); il gene LPL è deleto nel 28% dei casi
(7/25), amplificato nel 36% dei casi (9/25), e normale nella medesima percentuale. Il gene
p53 è risultato deleto nel 32% dei casi (8/25), normale nel restante 68% (17/25). Tuttavia, i
valori del rapporto locus/centromero ottenuti per le tre regioni cromosomiche studiate, si
discostano solo di poco dal valore normale (valutato preliminarmente su campioni non
neoplastici) compreso fra 0.93-1.04 per c-myc ed LPL, 0.87-1.30 per p53, poiché il valore
medio di delezione di LPL era di 0.83 (0.78-0.90), il valore medio di amplificazione di c-myc
era pari a 1.26 (1.11-1.46), mentre il valore medio di delezione di p53 era di 0.83 (0.78-0.86)
nei campioni neoplastici. Questi risultati indicano che solo una piccola percentuale di cellule
neoplastiche risulta portatrice di alterazioni genomiche singole e combinate.
CONCLUSIONI
Nella nostra casistica, limitata numericamente, ma rappresentata da pazienti seguiti secondo
criteri omogenei e di cui è disponibile un follow up significativo (7.44 anni in media, con un
range tra 5 e 10 anni), la sopravvivenza, sia totale che libera da malattia, è risultata superiore a
quanto atteso sulla base del PSA alla diagnosi, dello stadio e del grado istologici. E’ stato
evidenziato come, in questa popolazione di pazienti affetti da carcinoma prostatico, le
mutazioni rilevate a carico dei geni studiati siano limitate ad una piccola quota della
popolazione neoplastica ed associate sia alla mancanza di coinvolgimento linfonodale e di
organi a distanza, sia alla sopravvivenza fino a 10 anni dall’intervento di prostatectomia.
In conclusione, i risultati ottenuti nel corso di questo studio retrospettivo e preliminare,
indicano che:
1. i tradizionali indicatori prognostici non definiscono adeguatamente le differenti categorie
di rischio, poiché nonostante valori di PSA e di Gleason estremamente disomogenei, sono
stati riscontrati tempi di sopravvivenza sovrapponibili anche a dieci anni dall’intervento.
2. L’assetto genomico, come valutato in questo studio, è indicativo dell’aggressività
intrinseca della neoplasia. I nostri pazienti, indipendentemente dal valore di PSA alla
diagnosi, stadio e grado istologici, hanno uniformemente dimostrato una scarsa
287

complessità genetica, con presenza di anomalie combinate in solo 4 pazienti su 25, e
limitate ad una quota trascurabile della popolazione neoplastica. La mortalità per
carcinoma prostatico è risultata estremamente bassa (12%) anche a 10 anni dalla diagnosi,
e solo in 2 casi (8%) è stata rilevata ripresa biologica.
3. E’ necessario stabilire un cut-off di complessità genetica, attribuibile ai tumori analizzati,
oltre il quale il paziente portatore di carcinoma della prostata con fattori prognostici
“classici” (quali stadio e grado istologici) favorevoli, è comunque da considerarsi ad alto
rischio di progressione.
I risultati preliminari dello studio indicano infatti, che quando le mutazioni genetiche si
presentano limitate ad una piccola percentuale della popolazione neoplastica, la neoplasia in
toto mantiene un atteggiamento di scarsa aggressività mentre qualora la o le alterazioni
genetiche fossero estese ad una quota più significativa del tumore ci si dovrebbe attendere un
atteggiamento clinico più aggressivo.
L’estensione dell’analisi genetica, attualmente in corso, ad una casistica più ampia, ci
permetterà di definire con maggiore sicurezza il valore prognostico delle alterazioni
citogenetiche che abbiamo ritenuto informative.
288

Marco Ladetto Filone tematico A2
Riarrangiamenti non neoplastici di BCL-2: un possibile nuovo fattore di
rischio per la genesi del linfoma follicolare
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale
CONTESTO E RAZIONALE
Riarrangiamenti bcl-2/IgH, identici a quello osservati nei linfomi follicolari (LF) (non
lymphoma-associated bcl2/igH rearrangements o NLABR), sono frequentemente osservati nel
sangue periferico dei soggetti normali. Non è noto se esistano nessi epidemiologici o
patogenetici tra NLABR e LF.
OBIETTIVO
Obiettivo di questo studio è di valutare l’epidemiologia di questi riarrangiamenti e la cinetica
evolutiva dei cloni NLABR+.
MATERIALI E METODI
Entrambi gli aspetti del progetto sono stati sviluppati.
1. Valutazione dell’epidemiologia dei NLABR mediante i seguenti studi:
a) valutazione del ruolo del fattore etnico mediante paragone tra l’incidenza di NLABR in
popolazioni ad alto (caucasici) o basso rischio (africani e mediorientali) di sviluppo di LF:
Sono stati analizzati 535 soggetti sani appartenenti a 3 differenti gruppi etnici: 352
caucasici, 53 africani, 130 medioorientali. NLABR sono stati evidenziati nel 12.2% di
soggeti caucasici contro il 5.6% degli africani e il 4.6% dei medioorientali. La differenza
osservata tra il gruppo dei caucasici e gli altri due gruppi (africani + medioorientali) è
significativa (p

follow-up. In 5 soggetti il clone NLABR+ è stato costantemente amplificato in tutte le
successive valutazioni. In 3 soggetti lo stesso clone NLABR+ è stato identificato solo in una
proporzione dei campioni con andamento oscillante. Tutti i NLABRs erano indistinguibili da
quelli amplificati nei linfomi follicolari (tipo di breakpoint, N-insertions, JH-usage, ecc).
Abbiamo usato la PCR quantitativa per monitorare la dinamica dei cloni NLABR+. Il “clonal
cell burden” mediano è di 2.35 x 102cr/106dg. (range: 5.4 x 104 2.8 x 100). Il clonal cell
burden dei cloni persistenti è superiore (p102 cr/106 dg sono persistenti. Il clonal
cell burden dei cloni NLABR+ persistenti è sostanzialmente stabile nello stesso soggetto. Al
contrario, il “clonal cell burden” è molto eterogeneo tra i diversi soggetti (fino a 3 logsw).
Come atteso, i pazienti con riarrangiamento alternante hanno un cell burden ai limiti della
sensibilità delle metodiche di PCR, suggerendo l’ipotesi che si tratti di un clone persistente
dotato di massa cellulare molto esigua. Infine, mediante procedure di selezione cellulare,
abbiamo studiato le caratteristiche fenotipiche dei cloni NLABR+. Dai nostri dati emerge che
si tratta esclusivamente di cloni di natura B-linfocitaria CD19-positivi. Questi cloni si
caratterizzano per la negatività per il CD23 mentre risultano eterogenei per l’espressione di
CD10 e CD5.
CONCLUSIONI
I nostri esperimenti hanno evidenziato che:
1. i NLABRs nel sangue periferico di soggetti sani sono correlati a cellule di origine B
linfocitaria e non sono presenti nelle altre cellule emopoietiche;
2. l’incidenza dei NLABRs nelle differenti etnie correla con l’incidenza del FL. Questo dato
rafforza l’ipotesi del nesso patogenetico tra NLABR e FL;
3. i NLABRs persistono presentando una cinetica differente nel tempo.
In alcuni soggetti sono lesioni transitorie che non vengono riamplificate nei controlli
successivi. Tuttavia, in quasi il 50%, i cloni NLABR+ persistono nel tempo, mantenendo una
massa di cellule clonali costante senza incrementi o decrementi notevoli nel follow-up. Questi
dati indicano che i cloni NLABR+ sono una popolazione clonale di significato incerto
analoga alla MGUS e alla CLUS. In effetti, una popolazione persistente caratterizzata dalla
presenza di un trascritto attivante l’oncogene bcl-2 potrebbe rappresentare un bersaglio per
futuri eventi trasformanti, che consentirebbero lo sviluppo di un LF conclamato. Al contrario,
i casi in cui i cloni NLABR+ appaiono solo transitoriamente, potrebbero costituire situazioni
di efficace controllo immunologico della neoplasia o di efficace induzione di meccanismi
apoptotici da parte dei fisiologici meccanismi regolatori intracellulari (ad esempio p53).
290

Santo Landolfo Filone tematico A2
Ruolo dei Papillomavirus (HPV) nella patogenesi dei tumori del distretto
testa/collo (HNSCC)
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia
CONTESTO E RAZIONALE
I Papillomavirus umani (HPV) sono dei piccoli virus a DNA appartenenti alla famiglia delle
Papovaviridae, che sono stati implicati nello sviluppo di lesioni benigne e maligne localizzate
in vari distretti anatomici del corpo umano, quali l’apparato urogenitale femminile, la regione
perianale, l’apparato digerente ed il tratto respiratorio superiore, in quest’ultimo in
associazione con altri fattori a rischio quali fumo di sigaretta ed alcool. Degli otre 100
genotipi di HPV fino ad oggi caratterizzati, alcuni, quali HPV6 ed 11, sono associati a lesioni
benigne soprattutto della cute e delle mucose del cavo orale, mentre HPV16, 18, 31, 33 ed
altri in frequenza minore sono stati associati a lesioni maligne della regione anogenitale, del
tratto respiratorio (in particolare della laringe) e del tratto digestivo. Per una completa
replicazione del proprio genoma l’HPV deve stimolare la cellula ad entrare nella fase S (fase
di sintesi del DNA) al fine di sfruttare il macchinario di sintesi del DNA cellulare utilizzando
tre proteine precoci (E5, E6, E7). La capacità del virus di indurre la fase S nelle cellule
soprabasali contribuisce alla manifestazione patologica del virus che varia le lesioni
proliferative come verruche e codilomi al carcinoma invasivo. E’ stato recentemente
dimostrato che in seguito ad espressione delle proteine trasformanti E6 e E7 di HPV vengono
attivati numerosi geni cellulari, tra cui molti appartenenti alla famiglia dei geni Interferoninducibili,
quali IFI16, PKR, 2’-5’ Oase.
METODI E RISULTATI
L’analisi immunoistochimica di epiteli stratificati pavimentosi della laringe e della cervice ha
evidenziato che in condizioni normali l’espressione di IFI16 è elevata nello strato basale
proliferante, e diminuisce gradualmente in relazione al processo di differenziamento. Questi
suggeriscono che possa esistere una stretta correlazione tra espressione della proteina IFI16 ed
il controllo dei processi di proliferazione e differenziamento. In carcinomi squamosi della
laringe positivi per HPV si osserva una forte espressione di IFI16 nelle cellule tumorali,
mentre nei carcinomi meno differenziati, negativi per HPV, la proteina IFI16 non viene
espressa, nonostante la presenza di positività nelle cellule endoteliali e nei linfociti infiltranti.
Interessante a questo proposito l’osservazione che i tumori positivi per IFI16 sono negativi o
debolmente positivi per Ki-67 (marcatore di proliferazione) dimostrando in livello di
invasività significativamente inferiore ai tumori negativi per IFI16, fortemente positivi per Ki-
67. E’ noto da tempo che il processo di trasformazione degli epiteli sostenuto da HPV si basa
essenzialmente sull’attività delle proteineE6 ed E7. Per quanto riguarda E6 di HPV-16, è stato
dimostrato che questa proteina lega p53 (uno dei sistemi di controllo del ciclo cellulare
insieme alle proteine del Retinoblastoma, pRb) causandone la degradazione proteolitica. In
parallelo, E7 lega la proteina pRb, inattivandola e rilasciando il fattore E2F, che legandosi al
promotore di alcuni geni quali DHFR, TS, RNR2, stimola la sintesi del DNA e la
proliferazione cellulare. Più recentemente è stato dimostrato che un’altra proteina di HPV-16,
E5, partecipa al processo di trasformazione attivando alcuni recettori per fattori di crescita
quali EGF e PDGF. Da quanto sopraddetto appare chiaro che il processo di trasformazione da
HPV è il risultato di una complessa interazione tra i geni virali e geni cellulari, che da un lato
291

stimola in senso positivo la proliferazione, dall’altro blocca i meccanismi inibitori del
differenziamento cellulare.
Sulla base dell’osservazione che i tumori testa/collo (HNSCC) rappresentano un gruppo
estremamente eterogeneo dal punto di vista dell’invasività, proliferazione, sensibilità alla
radio-o chemio-terapia, capacità di dare metastasi, nel presente programma di ricerca abbiamo
definito i marcatori molecolari cellulari (IFI16, p53, pRb, Ki-67, ed SSRP-1) o virali (E6, E7,
L1) che potessero consentire di suddividere i tumori testa/collo in base alle caratteristiche
suddette. L’approccio metodologico, integrato e multidisciplinare come si può evincere
dall’elenco dei collaboratori che afferivano al presente programma, consisteva da un lato
nell’analisi tramite immunoistochimica di sezioni bioptiche di lesioni precancerose della
laringe (cheratosi e displasie di vario grado) o di carcinomi squamosi della laringe (HNSCC),
fissate in formalina e paraffinate. La presenza del DNA di HPV (geni E5, E6, E7) è stata
invece analizzata con la tecnica della PCR utilizzando primers opportuni. L’espressione di
proteine tardive di HPV, i.e. la proteina dei capside L1, è stata invece evidenziata tramite
anticorpi anti-L1 in immunoistochimica.
Nel loro insieme i risultati ottenuti hanno dimostrato che l’attività proliferativa definita con il
marker Ki-67 correla in modo diretto con lo stato di differenziamento ed il “grading” del
tumore, mentre l’espressione di IFI16 correla in modo inverso con Ki-67 (p=0.039). Inoltre,
tumori fortemente positivi per IFI16 hanno dimostrato una forte positività per pRB e
frequente associazione con HPV determinata tramite PCR. Poiché le proteine HIN200
esercitano una potente azione antiproliferativa, la significativa correlazione tra i livelli
d’espressione di IFI16, pRb, basso grado di malignità, presenza di HPV, potrebbe permettere
di identificare un gruppo di tumori del distretto testa collo meno aggressivi nei confronti di
altri tumori dello stesso distretto negativi per questi marcatori.
292

Maria Agnese Latino Filone tematico A1
Prevenzione delle infezioni da Chlamydia trachomatis nella popolazione
giovanile.
A.S.O. O.I.R.M. S. Anna
OBIETTIVO
Lo studio si propone di stimare la prevalenza dell’infezione da Chlamydia trachomatis nella
popolazione giovanile torinese e di individuare i gruppi a maggior rischio per poter acquisire
elementi utili alla definizione di eventuali politiche di screening da realizzarsi sulla
popolazione piemontese.
METODI E RISULTATI
Dal 1° Marzo 2004 al 28 Febbraio 2006 sono state arruolate 1.180 giovani donne di età
compresa tra i 18 ed i 24 anni: la prevalenza globale dell’infezione da Chlamydia trachomatis
(C.t.) è stata del 10.4% sensibilmente superiore a quanto atteso (circa 5%). Di tali pazienti 369
afferivano ai Consultori familiari delle Usl 1, 4, ANCED e Collegno mentre 811 afferivano ai
Centri IST dell’Ospedale Dermatologico, Amedeo di Savoia e dell’Azienda Ospedaliera
O.I.R.M – Sant’Anna in questo secondo gruppo la prevalenza dell’infezione è stata più
elevata (12.8% versus 5.1%). Onde poter valutare gli eventuali fattori di rischio associati
all’infezione sono stati indagati differenti parametri sia socio-demografici sia
comportamentali elencati nella tabella seguente
Tabella – Dati demografici popolazione in esame
Totale casi Positive p
Numero di casi 1.180 123 (10,4%)
Presenza di sintomatologia
Sì 757 84 (11.1%)
No 423 39 (9.2%) N.S.
Gruppi etnici
Comunitarie 891 80 (9%)
Non comunitarie 289 43 (14,9%) 0,004
Età 1° rapporto
13-15 266 38 (14,3%) 0,003
> 15 871 76 (8,7%)
ND 43 9 (20,9%)
Partner stabile
Sì 982 80 (8,1%)
No 168 34 (20,2%) 1 197 41 (20,8%)

Totale casi Positive p
ND 8 0
Disturbi nel partner
Sì 170 37 (21,8%)
No 879 61 (6,9%)

Giorgio Leigheb Filone tematico C1
Studio del meccanismo di azione di analoghi della vitamina D3 nella
terapia della psoriasi
Università “A. Avogadro” del Piemonte Orientale
Dipartimento di Scienze Mediche
OBIETTIVO
Lo scopo del nostro studio è stato quello di evidenziare eventuali differenze nella risposta
apoptotica tra i cheratinociti lesionali e della cute sana perilesionale dei pazienti affetti da
psoriasi trattati con un analogo della vitamina D3, il calcipotriolo. Poiché l’azione delle
vitamina D3 quale farmaco contro la psoriasi ha un importante target nell’integrità dei
mitocondri è stata poi valutata la via apoptotica attraverso le caspasi associate ai mitocondri
(caspasi-9).
MATERIALI E METODI
E’ stato testato un analogo della vitamina D3, il CALCIPOTRIOLO su cheratinociti isolati da
6 pazienti affetti da psoriasi volgare in chiazze, di età compresa tra 18 e 65 anni, privi di
terapia dermatologica sistemica da un mese e di terapia topica da due settimane, dopo aver
ottenuto consenso informato scritto. I cheratinociti sono stati ottenuti da biopsie cutanee
eseguite ai margini della placca psoriasica e comprendenti sia cute lesionale che perilesionale,
i frammenti dermo-epidermici rispettivamente di cute lesionale e di cute indenne perilesionale
sono stati incubati “overnight” in dispase, una proteasi neutra che agendo come una
collagenasi di tipo IV permette la separazione dermo-epidermica. I lembi cosi’ ottenuti sono
stati immersi in una soluzione di tripsina (0,25%) ed EDTA (0,02%) a 37°C per 15 minuti e
poi dissociati tramite agitazione meccanica. La sospensione di cellule epidermiche isolate è
stata coltivata su chamber slides ricoperte di collagene IV utilizzando terreno per cheratinociti
privo di siero KGM. Le cellule sono state trattate con 100 nM calcipotriolo e coltivate in
ambiente termostatato a 37°C in atmosfera CO2 /O2 95/5% per un tempo di 20 ore. Alla fine
del periodo le cellule utilizzate per la valutazione dell’apoptosi sono state fissate in una
soluzione di metanolo 80% per 5 minuti, lavate con PBS e successivamente colorate con
propidio ioduro per 5 minuti. I vetrini sono stati infine inclusi in glicerolo ed esaminati
mediante microscopia a scansione laser confocale accoppiata ad un sistema di analisi di
immagine (LEICA.TCS SP2). Sono state acquisite da 15 a 18 sezioni lungo l’asse z ad
intervalli di 400 nm, successivamente sovrapposte per ottenere un’immagine ricostruita. Per
ogni campione sono state contate 400 cellule.
Le cellule utilizzate per l’identificazione della Caspasi 9 tramite tecnica immunoistochimica,
sono state fissate in una soluzione all’1 % di formalina tamponata (pH = 7.4) per 30 min.
circa; incubate per 5 min. in una soluzione allo 0,3 % di H2O2 in PBS e poi in una soluzione
allo 0,2 % di Triton X in tampone TBS in ghiaccio. Dopo un’incubazione con siero aspecifico
(dello stesso tipo da cui viene estratto l’anticorpo secondario) per 1 ora a temperatura
ambiente, è stata aggiunta la soluzione di anticorpo primario (20 µg / ml in PBS) per un’ora a
temperatura ambiente. Il prodotto di reazione (antigene –anticorpo) è stato rivelato incubando
le sezioni con un anticorpo secondario complessato con un sistema “ponte” avidina-biotina-
DAB (diamonobenzidina). Tutti i campioni sono stati quindi disidratati in una serie
295

ascendente di soluzioni etanolo/acqua, immersi in xilene e posti su di un vetrino portaoggetti
tramite balsamo per microscopia. Successivamente al processamento immunoistochimico le
sezioni sono state analizzate tramite un sistema computerizzato di Analisi di Immagine (Leica
Qwin) che usa immagini digitalizzate tramite una telecamera collegata al microscopio ottico.
La reazione colorimetrica della DAB è stata analizzata ed espressa in “livelli di colore”
(normalizzato rispetto alla luminosità di fondo = Fondo Ottico). Per ogni campione
sperimentale sono stati analizzati in modo sequenziale 60 campi ottici con obiettivo ad
immersione 100x. I risultati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM)
di 6 esperimenti differenti. L’analisi statistica è stata condotta mediante il test t di Student per
dati non appaiati, e le differenze sono state considerate significative per p < a 0,05.
RISULTATI
All’osservazione al microscopio confocale i criteri morfologici utilizzati, per identificare le
cellule apoptotiche sono stati la condensazione della cromatina e la frammentazione nucleare.
Il calcipotriolo alla dose di 100 nM è risultato essere un efficace stimolo apoptotico per i
cheratinociti umani in coltura dopo 20 ore di trattamento. In particolare è stato in grado di
indurre apoptosi nei cheratinociti psoriasici in modo significativamente maggiore rispetto ai
cheratinociti derivanti da cute perilesionale. La percentuale di cellule apoptotiche nei
cheratinociti psoriasici è risultata del 30,7 ± 10,38 % mentre solo del 6,4 ± 1.26% nei
cheratinociti perilesionali (p= 0,043). L’attivazione della caspasi 9 è stata valutata la
formazione, nelle cellule positive alla reazione immunoistochimica, di un precipitato di
aspetto granulare di colore marrone, concentrato nelle zone perinucleari, compatibile con la
presenza della caspasi 9 attiva proveniente dalle superfici mitocondriali (alla cui membrana
esterna la procaspasi-9 si trova tipicamente associata). Sia nei cheratinociti lesionali che in
quelli perilesionali non è stata osservata una reazione immunoistochimica significativa.
CONCLUSIONI
Questi risultati, pur da convalidare su un numero maggiore di pazienti, aggiungono importanti
informazioni sul meccanismo d’azione di questo analogo della vitamina D3. A livello della
cute lesionale, l’azione apoptotica del calcipotriolo, in associazione al già noto effetto
antiproliferativo e prodifferenziativo sui cheratinociti umani può contribuire alla risoluzione
della lesione psoriasica e al miglioramento del quadro clinico cutaneo. Il meccanismo di
induzione dell’apoptosi cheratinocitaria, contrariamente a quanto ipotizzato, non coinvolge la
caspasi 9 ma potrebbe interessare altre vie quali quella dei protooncogeni della famiglia bcl-2
A livello della cute non lesionale, dove la terapia topica con analoghi della vit. D3 induce
spesso la comparsa di eritema associato a sintomatologia di tipo irritativo, la scarsa entità del
danno apoptotico può solo in parte spiegare gli effetti tossici-irritativi di questi farmaci che
può invece essere principalmente legato all’induzione di flogosi con comparsa di infiltrato
infiammatorio
.
296

Maurizio Leone Filone tematico D4
Farmaci per la prevenzione ed il trattamento delle crisi epilettiche da
sospensione alcolica: una revisione Cochrane.
A.S.O. “Maggiore della Carità” di Novara
Clinica Neurologica
CONTESTO E RAZIONALE
Le crisi epilettiche sono una condizione neurologica comune con un rischio nel corso della
vita variabile da 1 a 3 per cento e una prevalenza tra gli alcolisti almeno tripla rispetto alla
popolazione generale. D’altra parte l’alcolismo è una condizione relativamente comune nella
nostra Regione con una prevalenza intorno a 5/100 abitanti. Di conseguenza, abuso di alcolici
viene riscontrato frequentemente tra i pazienti che si presentano in Ospedale per una crisi
epilettica. Sebbene le crisi epilettiche tra gli alcolisti siano eterogenee, esse avvengono più
frequentemente in corso di sospensione acuta dell’assunzione di alcolici (crisi da astinenza
alcolica). Differenti farmaci sono stati utilizzati sia per la prevenzione primaria (prevenzione
delle crisi nei pazienti che avviano una disassuefazione volontaria o hanno in corso una
sindrome da astinenza alcolica) che secondaria (prevenzione di una recidiva di crisi).
OBIETTIVO
Obiettivo di questa studio è di effettuare una revisione Cochrane per valutare l’efficacia e la
sicurezza dei farmaci utilizzati per la prevenzione primaria e secondaria delle crisi in corso di
sindrome da astinenza alcolica, in particolare:
1. se trattare (con qualunque farmaco) o no;
2. paragonare diversi farmaci verso nessun farmaco o placebo;
3. quale farmaco e quale protocollo di trattamento sia più efficace.
MATERIALI E METODI
Organizzazione dello studio: è stato completato il protocollo della revisione che è uscito sul
primo numero del 2005 della Cochrane Library con menzione del contributo della Regione
Piemonte. Nel 2004 è stata organizzata la riunione dei revisori, durante la quale sono state
discusse le modalità di raccolta dei dati.
Ricerca bibliografica: è stata effettuata una ricerca bibliografica su diverse banche dati,
utilizzando sia la strategia del gruppo “Epilepsy” della Cochrane Collaboration che una ad
hoc. Sono stati così recuperati circa 8000 abstract. Due autori hanno valutato in cieco gli
abstracts, selezionandone circa 500. I relativi articoli sono stati ottenuti e letti dagli stessi due
autori, e inclusi nella revisione se rispondevano ai sottoelencati criteri. Ogni disaccordo è
stato risolto da un terzo autore.
Criteri di inclusione degli studi: sono stati inclusi
1. studi randomizzati controllati /quasi-randomizzati;
2. studi che includevano pazienti alcol-dipendenti trattati per disassuefazione sul territorio o
in ospedale;
297

3. studi comparanti terapia farmacologia vs. non terapia, differenti farmaci tra di loro o vs.
placebo, o differenti protocolli terapeutici.
Si è cercato di ottenere i dati mancanti dagli Autori di ogni singolo studio. Gli studi
selezionati sono stati schedati con la scheda predisposta (metodi di randomizzazione, di
controllo del confounding e della cecità, pazienti esclusi, informazioni demografiche, setting,
numero e tipo di farmaci antiepilettici, tempo di inizio della terapia, fattori di rischio, fattori
relativi all’episodio di astinenza).
Analisi: sono state considerate misure di efficacia (incidenza delle crisi, intervallo tra prima
crisi e recidiva) e sicurezza (incidenza di effetti collaterali, incidenza di grave sindrome da
astinenza alcolica). L’analisi è stata effettuata secondo il principio dell’intention-to-treat. E’
stata testata l’eterogeneità clinica, metodologica e statistica.
RISULTATI
Abbiamo incluso 26 trial di prevenzione primaria riguardanti 20 differenti farmaci e 4 trial di
prevenzione secondaria, riguardanti 2 farmaci. L’incidenza di crisi da astinenza alcolica nei
pazienti non trattati (calcolata dal braccio placebo dei trial) era del 8% ed il rischio di recidiva
nelle prime 12 ore dopo la prima crisi del 17%. Una meta-analisi degli studi clinici
randomizzati e controllati con placebo per la prevenzione primaria delle crisi epilettiche
mostra una riduzione di rischio significativa con le benzodiazepine ed un aumento di rischio
con i neurolettici. I farmaci antiepilettici erano ugualmente efficaci che le benzodiazepine;
anche i barbiturici e il clormetiazolo erano efficaci nei pochi studi inclusi. Ulteriori analisi
sono state effettuate: trattamento (qualunque farmaco) vs. non trattamento, benzodiazepine vs.
neurolettici, benzodiazepine a lunga durata d’azione vs. breve durata, antiepilettici +
benzodiazepine o clormetiazolo vs benzodiazepine o clormetiazolo, clonidina vs
benzodiazepine o clormetiazolo (dati non riportati). Una meta-analisi degli studi clinici
randomizzati e controllati con placebo per la prevenzione secondaria delle crisi epilettiche
mostra che la fenitoina è inefficace (differenza assoluta del rischio: -0.7 casi di crisi /100
pazienti trattati con fenitoina, LC 95% da -10.4 a +9, NNT=150, da 10 a -11). Al contrario, il
lorazepam è efficace: 3/100 pazienti trattati con lorazepam ev. hanno avuto una recidiva
contro 21/86 nel gruppo placebo (riduzione assoluta del rischio = -21.4 casi di crisi /100
pazienti trattati con lorazepam (LC 95% da -31.1 a –11.7, NNT=5, da 3 a 9).
CONCLUSIONI
La prevenzione ed il trattamento delle crisi epilettiche da astinenza alcolica sono importanti,
perchè ulteriori crisi possono risultare in uno stato di male epilettico, una condizione
pericolosa per la vita. La nostra revisione mostra evidenza che la terapia con benzodiazepine è
efficace sia nel prevenire sia la prima crisi epilettica che la recidiva in corso di astinenza
alcolica. Tuttavia resta da chiarificare il regime di trattamento più efficace. I farmaci
antiepilettici devono essere considerati.
298

Antonio Liuzzi Filone tematico A2
Valutazione dell'arteriopatia periferica in pazienti con obesità grave con
sindrome metabolica
Istituto Auxologico Italiano
CONTESTO E RAZIONALE
L’obesità è un fattore di rischio indipendente per lo sviluppo di aterosclerosi, verosimilmente
per disfunzione endoteliale. Infatti l’obesità è associata ad un aumento della vasocostrizione
endotelina-dipendente e dei livelli sierici di varie citokine pro-infiammatorie, correlando tali
alterazioni con la distribuzione del grasso corporeo. Un’importante conseguenza
dell’aterosclerosi, l’arteriopatia obliterante periferica (AOP) risulta a sua volta associata a
stress ossidativo conseguente all’ipossia, causa di attivazione endoteliale e rilascio di sostanze
vasocostrittrici, pro-infiammatorie e di citochine. In questa condizione la valutazione del
flusso ematico arterioso può essere valutato mediante tecniche non invasive, i cui risultati
sono ben correlati con i dati arteriografici.
OBIETTIVO
Lo scopo dello studio è stato quello di verificare se l’obesità di per sé potesse determinare,
tramite un aumento di fattori infiammatori, alterazioni del flusso ematico e dell’ossigenazione
tissutale periferica tali da essere precocemente identificate tramite indagini non invasive quali
l’eco-color-doppler, misurando l’indice pressorio caviglia/braccio (ABI), e l’ossimetria
transcutanea, attraverso l’indice di perfusione regionale (RPI).
MATERIALI E METODI
Sono stati studiati 90 soggetti affetti da obesità non complicata, 22 maschi e 68 femmine, età
(media+DS) 31.6+8.7 anni (IC 95%: 29.7-33.5), BMI 42.8+4.7 kg/m2 (41.7-43.8). In ciascun
soggetto sono stati valutati i seguenti i seguenti fattori di rischio cardiovascolare e metabolico:
colesterolemia totale (COL), LDL, HDL, trigliceridi (TGL), uricemia, AST, ALT, gGT,
proteina C-reattiva (PCR), fibrinogeno, omocisteina, molecole di adesione intercellulare
(ICAM1), insulinemia (IRI) ed insulino-resistenza calcolata mediante HOMA.
Misurazioni. La pressione arteriosa sistolica (PAS) e diastolica (PAD) sono state ottenute
dalla media di tre misurazioni consecutive, a paziente disteso. La pressione transcutanea di
ossigeno (tcpO2) al dorso del piede, in condizioni basali (tcpO2b) e dopo 4’ di compressione
del polpaccio mediante sfigmomanometro gonfiato a pressione sovrasistolica (tcpO2c), ed a
livello toracico (sovraclaveare), nonchè l’indice di perfusione regionale (RPI: tcpO2
piede/tcpO2 torace x 100) sono state determinate mediante ossimetro transcutaneo. L’ABI
(PAS caviglia/PAS braccio) è stato calcolato mediante pletismografia Doppler ed è stato
considerato patologico per valori

all’abitudine al fumo, ai valori di ABI < o > a 0.95, di WHR < o > 0.80. I risultati sono stati
espressi come media + DS. L’ipotesi zero è stata scartata per valori di p

Grazia Lomolino Filone tematico D4
Revisione sistematica efficacia procedure di lavaggio delle mani per la
prevenzione delle infezioni nosocomiali
Azienda Ospedaliera SS Antonio e Biagio di Alessandria
SOS di Igiene Ospedaliera
MATERIALI E METODI
La ricerca è stata svolta seguendo la metodologia delle revisioni sistematiche adottata dalla
Cochrane Collaboration. Sono stati inclusi studi randomizzati e osservazionali che
confrontano una procedura di lavaggio con procedure alternative o con placebo o con nessun
intervento; oppure studi che confrontano tipi o dosi di antisettico utilizzato per il lavaggio.
Sono state prese in considerazione sia le infezioni naturali che quelle sperimentali.
Come misure di risultato primarie sono stati considerati i tassi di infezioni ospedaliere
conseguenti all'uso delle diverse procedure nelle diverse circostanze.
Come misure di risultato secondarie sono state considerate: la conta della flora microbica
cutanea nonché il numero e gravità degli eventi indesiderati
Sono state interrogate le seguenti banche di dati: Cochrane Library (contenente: The
Cochrane Database of Systematic Reviews; The NHS Database of Abstracts of Reviews of
Effectiveness; The CENTRAL/Cochrane Controlled Trials Register) Medline (1966- oggi)
EMBASE (1985-oggi) CINAHL. Sono state utilizzate le seguenti combinazioni di parole
chiave: randomized controlled trial, Clinical Trials, random allocation, research design,
double blind method, placebos, cross over, Follow-Up, prospective studies,
HANDWASHING, handwash*, hand disinfectant, hand wash*, hand decontamin, hand
hygiene, hospitals, Hospital Units, intensive care, ambulator*, emergenc*, facilit*. I medesimi
termini sono stati adattati ad altri databases: Biological Abstracts (1985-oggi) Science
Citation Index (1980-oggi). Al fine di identificare altri studi, anche non pubblicati, sono stati
anche consultati la bibliografia degli studi identificati, le linee guida e le raccomandazioni
esistenti sull'argomenti. I criteri di inclusione sono stati applicati da due revisori in modo
indipendente. I due revisori hanno anche valutato la qualità metodologica degli studi.
RISULTATI
Le ricerche bibliografiche hanno prodotto 535 citazioni che sono state esaminate in base ai
contenuti del titolo e dell’abstract. Complessivamente 115 lavori sono stati recuperati come
potenzialmente includibili. Solo 14 lavori contengono misure di risultato primarie così come
definito dal protocollo. Cinque sono RCT, tre sono studi di tipo cross-over (uno definito come
RCT di equivalenza) due studi di coorte, quattro studi di confronto prima e dopo.
Studi sperimentali. Black (1981) confronta un intervento di educazione al lavaggio delle
mani del personale di una unità di cure intensive pediatriche trovandolo più efficace rispetto a
nessun intervento nella prevenzione delle diarree. Berry (1982) confronta l’uso di Clorexidina
Cloridrato trovandola più efficace nella prevenzione delle infezioni della ferita chirurgica
rispetto allo Iodio Povidone. Slota (2001) rileva una riduzione del tasso generale di infezioni
nosocomiali dopo introduzione di procedure rigorose per il lavaggio delle mani e di norme di
isolamento (uso di mezzi di protezione) ma nessuna differenza significativa tra le due
procedure. Mody (2003) non rileva alcuna differenza nel tasso generale di infezioni
301

nosocomiali conseguente al lavaggio con acqua e sapone rispetto al lavaggio con gel
alcoolico. Lo studio considera anche la contaminazione da S aureus come outcome
secondario.
Studi cross over. Doebbeling (1992) confronta il lavaggio delle mani con clorexidina
gluconato al 4% rispetto ad alcool isopropilico al 60% rilevando la maggior efficacia della
clorexidina nella prevenzione dell’incidenza totale di infezioni delle vie urinarie. Parienti
(2002) confronta l’hand-scrubbing tradizionale (con soluzione di iodio povidone oppure di
clorexidina) con l’hand-rubbing (con soluzione idroalcolica al 75% contenente n-propanolo,
isopropanolo e mecetronio etilsolfato) e non rileva alcuna differenza tra i due metodi nella
prevenzione del tasso totale di infezioni della ferita chirurgica. Hilburn (2003) confronta l’uso
di un antimicrobico (contenente lo 0,3 % di cloroxilenolo) con l’uso di gel alcolico
osservando, durante l’impiego del gel alcolico, una riduzione del tasso totale di incidenza di
infezioni nosocomiali del 36,1% rispetto al periodo basale.
Studi di coorte. Larson (2000) valuta l’impatto di interventi di formazione e di
sensibilizzazione al lavaggio delle mani rispetto a nessuna promozione. Nel gruppo
sperimentale si osservano riduzioni significative delle infezioni da VRE sia nel periodo di
implementazione che in quello di follow-up (RR 0,29 e 0,19). Fendler (2002) valuta l’effetto
differenziale dell’uso di un gel antisettico rispetto ad un sapone antimicrobico per il lavaggio
delle mani. Viene osservata una riduzione significativa pari al 30,4 % (data dal rapporto tra i
due tassi) della incidenza delle infezioni totali nel gruppo trattato con il gel rispetto al gruppo
di controllo.
Studi di confronto prima e dopo. Simmons (1990) valuta l’effetto di una campagna di
sensibilizzazione al lavaggio delle mani con detergente liquido contenente pclorometaxilenolo
non rilevando nessun impatto né in termini di compliance né in termini di
tasso globale di infezioni nosocomiali. Webster (1992) osserva una riduzione del tasso
settimanale di infezioni da MRSA (da 3,4 a 0,14 casi settimanali) in un periodo sperimentale
di 7 settimane d’uso di un prodotto a base di triclorosan rispetto a 39 settimane d’uso di
clorexidina gluconato. Zafar (1995) osserva una drastica riduzione dei casi di infezione da
MRSA nel periodo successivo alla introduzione di un prodotto a base di triclosan in
sostituzione di un tradizionale prodotto a base di clorexidina per il lavaggio delle mani. Pittet
(2000) valuta l’effetto a lungo termine di una campagna di sensibilizzazione al lavaggio delle
mani con acqua e sapone e alla disinfezione con clorexidina gluconato. In quattro anni si
riducono sia la prevalenza totale di infezioni nosocomiali sia l’incidenza totale di infezioni e
di batteriemie da MRSA. I rimanenti 101 studi sono dedicati alla misurazione dell’effetto del
lavaggio sulla carica batterica totale delle mani degli operatori e sono stati considerati
separatamente.
302

Mauro Maccario Filone tematico D1
Iperaldosteronismo primario nell’ipertensione resistente: prevalenza ed
effetti sul danno aterosclerotico precoce
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina Interna
CONTESTO E RAZIONALE
Tra i fattori di rischio cardiovascolare modificabili l’ipertensione arteriosa è probabilmente il
più importante in considerazione dell’alta prevalenza e della frequente associazione con
eventi vascolari multidistrettuali. Tuttavia, a fronte di ciò e nonostante la mole di dati
accumulati sulla fisiopatologia dell’affezione, l’ipertensione arteriosa presenta nell’80-90%
dei casi un’eziologia ignota (ipertensione essenziale) e conseguentemente il trattamento sarà
sintomatico e non causale e forzatamente ‘ad vitam’. Nel restante 10-20% delle forme di
ipertensione (ipertensione secondaria) la causa è potenzialmente modificabile con importante
beneficio per il paziente che non sarà quindi vincolato ad una terapia farmacologia
sintomatica cronica. Nell’ambito dell’ipertensione secondaria, l’iperaldosteronismo primario
(IAP), sostenuto da adenoma o da iperplasia surrenalica, non è più considerato una causa di
scarso rilievo ma, al contrario, secondo le casistiche di importanti centri internazionali di
riferimento, costituirebbe probabilmente la causa più frequente, arrivando a rappresentare
circa il 50% delle forme secondarie di ipertensione (5-15% di tutti gli ipertesi). E’ inoltre
molto verosimile che tale percentuale aumenti in modo rilevante se si considera il ‘subset’ di
ipertensione resistente alla terapia, in cui dati preliminari in altre popolazioni indicano una
prevalenza del 20%. L’ipertensione arteriosa resistente è definita come uno stato ipertensivo
non corretto da tre farmaci a dose piena: una diagnosi di iperaldosteronismo darebbe pertanto
una possibilità terapeutica, medica o chirurgica, efficace in questi pazienti altrimenti esposti
ad un elevato rischio cardiovascolare. Tale rischio sembra inoltre maggiore nei pazienti
ipertesi con eccesso di secrezione di aldosterone in quanto l’aldosterone è considerato un
fattore patogenetico di primo piano nella genesi dell’aterosclerosi e della disfunzione
ventricolare connessi con la malattia ipertensiva.
OBIETTIVO
Scopo del nostro studio è stato quello di
1. verificare la reale prevalenza di IAP negli ipertesi resistenti;
2. valutare un’eventuale associazione tra i più comuni fattori di rischio CVD e l’IAP;
3. quantificare il danno aterosclerotico precoce specificatamente indotto dall’IAP
MATERIALI E METODI
Abbiamo studiato una coorte di pazienti affetti da ipertensione arteriosa, afferenti al Centro
per la Diagnosi e la Terapia dell’ipertensione della SCDU di Endocrinologia, ASO S.
Giovanni Battista di Torino, resistenti al trattamento farmacologico e igienicocomportamentale.
L’IAP era definito da un rapporto aldosterone plasmatico/PRA (ARR) 500
(con PRA inibita,

minuti). Le determinazioni sono state eseguite dopo 'wash out' di almeno tre settimane dei
farmaci e delle condizioni interferenti sulla secrezione di aldosterone e sull'attività renina. Per
ogni paziente sono stati inoltre valutati:
• dati clinico-anamnestici (familiarità per ipertensione e malattia cardiovascolare precoce,
eventi cardiovascolari pregressi, abitudine al fumo, vita sedentaria;esame clinico volto ad
evidenziare eventuali segni di alterato compenso emodinamico o di alterato flusso
vascolare);
• livelli ematici di glucosio, colesterolo totale, col-HDL, trigliceridi, creatinina, albuminuria
24 ore, quale valutazione dei fattori di rischio cardiovascolare più comuni e ‘marker’ di
danno d’organo;
• monitoraggio ambulatoriale della pressione delle 24 ore;
• ecodoppler TSA per misurazione spessore intima media a livello arteria carotide comune
bilateralmente.
RISULTATI
Nel periodo di reclutamento utile (12 mesi) sono stati selezionati 75 pazienti con compenso
insufficiente in terapia plurifarmacologica. Solo 30 di questi sono risultati effettivamente
‘resistenti’ (valori sistolici o diastolici superiori rispettivamente a 140 e 90 mmHg in più del
10% delle misurazioni domiciliari nel corso di un mese), un numero nettamente inferiore a
quello previsto all’inizio dello studio. Tale risultato appare dovuto alla scarsa aderenza del
paziente nei confronti della terapia anti-ipertensiva che connotava la grande maggioranza dei
casi inizialmente ritenuti ‘resistenti’ ma in realtà semplicemente ‘non complianti’. In questa
coorte di pazienti, 15 maschi e 15 femmine di età compresa tra i 26 e i 77 anni, è stato
diagnosticato l’IAP in 7 soggetti, di cui 6 erano maschi. L’età dei soggetti è
significativemente inferiore nel gruppo IAP (45.4±11.9 vs 57±9.9, p

Corrado Magnani Filone tematico D1
Analisi statistica ed epidemiologica dei trends temporali di incidenza dei
tumori infantili
Università “A. Avogadro” del Piemonte Orientale
Dipartimento di Scienze Mediche
CONTESTO E RAZIONALE
Questo studio ha condotto un'analisi sistematica dei trends di incidenza per tumore infantile in
Piemonte nel periodo dal 1967 al 2001. Un aumento dell’incidenza dei tumori infantili è stato
segnalato in diversi paesi, in particolare per le leucemie, i tumori cerebrali ed i neuroblastomi.
In Piemonte questo gruppo di ricerca ha osservato in precedenti indagini relative al periodo
1967-1998 un aumento annuo del 2,6% nell’incidenza delle leucemie linfoblastiche acute tra i
bambini sotto i 5 anni.
MATERIALI E METODI
Il Registro dei Tumori Infantili del Piemonte è su base di popolazione e rileva dal 1967 i casi
di tumore che insorgono tra la popolazione infantile (età 0-14 anni) in Piemonte. Le procedure
per la raccolta dei dati, la codifica e le analisi sono state uniformi per tutto il periodo. La
rilevazione è sempre stata condotta in modo attivo, con la ricerca dei casi nei registri
ospedalieri sia in Piemonte sia in ospedali di altre regioni. I casi sono rilevati anche in banche
dati di interesse, quali gli archivi dei ricoveri ospedalieri, gli archivi delle autorizzazione per
le cure all'estero e la banca dati dell’Associazione Italiana di Ematologia ed Oncologia
Pediatrica (AIEOP). Sono stati calcolati i tassi di incidenza annui, stratificati per sesso e
classe di età. Per il calcolo dei tassi sono state usate le stime della popolazione piemontese
fornte ai densimenti e, per gli anni intercensuali, dall'IRES e dalla BDDE. I trends sono stati
calcolati in modo sistematico per le 'Categorie Maggiori' previste dalla International
Classification of Childhood Cancer e per alcune delle più rilevanti categorie minori. I trends
sono stati stimati usando i modelli di regressione di Poisson, corretti per età e sesso e
presentati come variazione media annua percentuale (APC - annual percent change). E' stata
sperimentata l'applicazione di modelli di regressione di Bayes, più flessibili che i modelli di
Poisson per la descrizione di andamenti non lineari.
RISULTATI
I risultati mostrano incrementi statisticamente significativi dell'incidenza per l'insieme dei
tumori infantili e per alcune categorie nosologiche di rilievo. Per quanto riguarda l'insieme di
tutti i tumori, pari a 3360 casi, si è osservato in incremento medio del tasso di incidenza di
1,3% per anno. L'incremento è statisticamente significativo (95% CI:1.0% a 1.6%).
Incrementi statisticamente significativi si sono osservati anche per le leucemie (1121 casi,
APC: 1.0%, 95% CI: 0.4% a 1.6%), i tumori del Sistema Nervoso Centrale (SNC; 753 casi,
APC: 2.3%, 95% CI: 1.6% a 3.1%) ed il neuroblastoma (254 casi, APC: 2.3%, 95% CI: 1.0%
a 3.5%). Un aumento del tasso di incidenza è stato osservato sia per le Leucemie
Linfoblastiche Acute (LLA; APC 1.2%, 95% CI: 0.2% a 2.3%) che per le Leucemie Acute
non Linfoblastiche (APC 1.7%, 95% CI –0.6%, 4.1) ma per queste ultime a variazione non è
statisticamente significativa. Le analisi per classe di età hanno evidenziato andamenti
differenziati per classe di età per alcune neoplasie, quali il neuroblastoma nei bambini con
305

meno di un anno (aumento del 4.8% per anno), la leucemia nei bambini tra 1 e 4 anni (1.2%
per anno) ed i tumori del SNC tra i bambini di 10-14 anni (3.4% per anno). Analisi
preliminari condotte con metodi di regressione di Bayes hanno evidenziato per le leucemie
che i trend hanno andamenti ciclici mentre l'andamento è lineare per le neoplasie di tipo
solido.
CONCLUSIONI
Questi dati indicano un aumento dell'incidenza di tumore infantile, in generale e per alcune
importanti categorie nosologiche: leucemie, LLA, tumori del SNC e neuroblastoma.
Escludiamo che i trends osservati siano causati da fluttuazione casuale o variazioni nella
qualità dei dati e della rilevazione. Le cause dell'incremento osservato sono verosimilmente
diverse per i diversi tipi di neoplasia: studi come questo non possono che suggerire ipotesi, da
verificare con studi epidemiologici analitici. Per quanto riguarda le leucemie, la letteratura
scientifica ha sottolineato il possibile ruolo di esposizioni esogene ad agenti chimici
(inquinamento da traffico, benzene), fisici (campi elettromagnetici ELF), biologici (collegati
sia a possibili agenti infettivi per ora non identificati sia a risposte anomale a comuni agenti
infettivi). Per quanto riguarda i neuroblastomi sembra invece che l'incremento sia artefattuale,
conseguente a diagnosi ecografica di masse ad evoluzione benigna. Per i tumori del SNC le
ipotesi sono molto limitare ed è possibile che siano presenti sia un aumento reale, da cause
non note, sia un effetto conseguente al miglioramento degli strumenti diagnostici.
Pubblicazioni e presentazioni della ricerca Relazione preliminare alla "XXIX Reunion du
Groupe pour l'Epidemiologie et l'Enregistrement du Cancer dans le Pays de Langue Latine
(GRELL)", Montpellier, France, 19-21 maggio 2004. Relazione con i risultati definitivi
accettata per presentazione alla IX riunione dell'Associazione Italiana dei Registri Tumori.
Sono stati sottoposti per pubblicazione un articolo scientifico di valutazione sistematica del
trend per le diverse neoplasie ed uno sull'applicazione di metodi baiesiani per la valutazione
dei trends di incidenza.
306

Fabio Malavasi Filone tematico C1
Anticorpi monoclonali murini e ricombinanti per la diagnosi e la terapia
in vivo di lesioni neoplastiche
Università degli studi di Torino
Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica
METODI E RISULTATI
Il progetto è mirato al disegno di nuovi farmaci costituiti da anticorpi monoclonali (AcMo)
specifici per lesioni tumorali. Il modello adottato è stato il tumore della prostata, la principale
patologia tumorale del sesso maschile. Lo studio si è articolato come segue:
• produzione di un pannello di AcMo specifici per molecole espresse da tumori prostatici
umani,
• analisi della reattività dei reagenti prodotti su un pannello di linee tumorali e su tessuti
ottenuti da campioni chirurgici,
• caratterizzazione della molecola riconosciuta dai reagenti di interesse,
• disegno di un modello pre-clinico.
Produzione e selezione degli anticorpi di interesse. Topi Balb/c femmine sono stati
immunizzati con cellule umane di tumore prostatico ottenute da campioni chirurgici ed
espanse in vitro in colture a breve termine. Dopo tre inoculi intra-peritoneo di cellule
tumorali, quattro giorni prima della fusione gli animali sono stati inoculati per via endovenosa
con cellule della linea di carcinoma prostatico LNCap, caratterizzata dalla espressione in
membrana dell’antigene prostatico PSMA. Prima della fusione è stato analizzato il titolo
anticorpale specifico sviluppato da ciascun animale ed è stato scelto il topo con la miglior
risposta. I linfociti ottenuti dalla milza sono stati fusi con cellule di mieloma murino NS-1. I
surnatanti delle colture ottenute dopo selezione metabolica, sono stati analizzati per reattività
su un pannello di linee di carcinoma prostatico comprendente LNCaP, DU145 (esprimenti
PSMA) e PC-3 (PSMA-negativa) e su cellule derivate da campioni di tumore prostatico
mantenute in coltura a breve termine. La specificità degli anticorpi è stata confermata
mediante analisi della reattività su sezioni di tessuto prostatico proveniente da lesioni benigne
e maligne. Gli AcMo con le caratteristiche di interesse, sono stati cimentati su linee tumorali
non prostatiche, quali MDA-MB-231 (carcinoma della mammella) e MG63 (linea di
osteoblasti immaturi) e su linfociti ottenuti da sangue periferico, in condizioni quiescenti e in
seguito ad attivazione. Le colture con reattività limitata alle cellule di interesse sono state
clonate per diluizione limite ed espanse. Gli anticorpi sono stati purificati per cromatografia
su colonne di proteina A e idrossilapatite e valutati per assenza di pirogeni.
Analisi della reattività dei reagenti prodotti su un pannello di linee tumorali e su tessuti
ottenuti da campioni chirurgici. La reattività degli anticorpi è stata valutata mediante
immunofluorescenza indiretta e successiva analisi citofluorimetrica su cellule in sospensione.
L’analisi dei reagenti prodotti ha consentito di identificare un gruppo di anticorpi reattivi su
linee di tumore prostatico e su campioni freschi, tra questi uno (CB-PSMA) è risultato
specifico per tumori prostatici esprimenti l’antigene PSMA e privo di reattività con altri tipi di
tumore o cellule normali. In base a tali caratteristiche, CB-PSMA è stato scelto come
candidato per la caratterizzazione del bersaglio molecolare e per eventuali futuri impieghi
clinici.
307

Caratterizzazione della molecola riconosciuta da CB-PSMA. La molecola riconosciuta da
CB-PSMA è una glicoproteina della membrana cellulare di circa 100 kDa sia in condizioni
riducenti che non riducenti; tuttavia l’analisi elettroforetica ha evidenziato una molecola di
circa 200 kDa apprezzabile solo in condizioni non riducenti che rappresenta un dimero della
molecola. L’epitopo di legame di CB-PSMA è localizzato sulla porzione extracellulare della
molecola. L’analisi della distribuzione dell’antigene riconosciuto da CB-PSMA è stata estesa
a tessuti provenienti da campioni chirurgici di lesioni benigne e maligne della prostata e a
tessuti di controllo. L’analisi immunoistochimica su campioni fissati ed inclusi in paraffina ha
confermato che CB-PSMA riconosce una molecola selettivamente espressa da lesioni benigne
e maligne della prostata correlando in termini quantitativi con il grado di trasformazione
neoplastica.
Disegno di un modello pre-clinico. Le caratteristiche di distribuzione della molecola PSMA
suggeriscono che essa possa costituire un bersaglio per l’immunoterapia: a tal fine è stato
disegnato un modello in vivo per l’analisi della biodistribuzione dell’anticorpo CB-PSMA. Il
modello scelto è costituito da topi SCID nei quali sono state trapiantate cellule LN-CaP.
Quattro settimane dopo l’inoculo ed in presenza di una massa tumorale palpabile (» 0,8 cm),
gli animali sono stati inoculati con l’anticorpo CB-PSMA purificato e radiomarcato con 131I.
A intervalli prestabiliti (6, 48, 96 e 168 ore), la localizzazione della radioattività è stata
monitorata mediante immunoscintigrafia condotta con una gammacamera.
I risultati ottenuti hanno dimostrato che 6 ore dopo l’inoculo, 131I-CB-PSMA presenta
localizzazione diffusa con accumulo a livello della vescica. Dopo 48 ore la localizzazione
diffusa scompare ed è apprezzabile un iniziale accumulo della radioattività sulla lesione
neoplastica. A 96 ore la radioattività veicolata da CB-PSMA è selettivamente confinata alla
lesione neoplastica e la radioattività libera è captata dalla tiroide. La radioattività è stata
eliminata 168 ore dopo l’inoculo. Tali dati dimostrano che CB-PSMA ha buona
biodistribuzione ed emivita in vivo, e suggeriscono che esso possa costituire la base di
partenza per lo sviluppo di anticorpi umanizzati da impiegare come veicoli di radioisotopi,
farmaci o tossine per impieghi clinici.
PUBBLICAZIONI
1. A.L. Horenstein, F. Crivellin, A. Funaro, M. Said, F. Malavasi Design and scale-up of
downstream processing of monoclonal antibodies for cancer therapy: from research to
clinical proof of principle. Journal of Immunological Methods 275: 99-112, 2003 2)
2. A. Funaro, E. Ortolan, B. Ferranti, L. Gargiulo, R. Notaro, L. Luzzatto and F. Malavasi
CD157 an important mediator of neutrophil adhesion and migration. Blood 102: 4269-
4278, 2004
3. A.L. Horenstein, I. Durelli and F. Malavasi Purification of clinical-grade monoclonal
antibodies by chromatographic methods. In: Therapeutic Proteins: methods and protocols.
C. M. Smales and D. C. James Eds. 308: 191-208, 2005
4. S. Deaglio, T. Vaisitti, L. Bergui, L. Bonello, A. L. Horenstein, L. Tamagnone, L.
Boumsell and F. Malavasi CD38 and CD100 lead a network of surface receptors relaying
positive signals for B-CLL growth and survival. Blood 105 (8): 3042-50, 2005
308

Paola Manzini Filone tematico A1
Il donatore di sangue anti-HBc: rischio di trasmissione dell’epatite B con
la donazione.
ASO S. Giovanni Battista
Struttura Complessa Banca del Sangue e del Plasma
CONTESTO E RAZIONALE
Da molti anni è noto che è possibile trovare virus dell’epatite B circolanti nel sangue anche
molti anni dopo la guarigione da un’epatite acuta HBV correlata. Per questo motivo vengono
esclusi dalle donazioni soggetti che riferiscano di aver avuto un’epatite virale in passato.
Tuttavia circa l’80% delle epatiti da HBV decorrono in modo completamente asintomatico ed
è quindi quasi sempre occasionale l’identificazione dei soggetti che nel passato sono stati
infettati dal virus HBV (anti-HBc+). I marcatori di un pregresso contatto non vengono in
Italia indagati ed i donatori anti-HBc+ donano attualmente regolarmente. Negli ultimi anni
sono andati accumulandosi dati sulla presenza di virus circolante in differenti percentuali di
soggetti HBsAg-/anti-HBc+.
OBIETTIVO
Il nostro studio si proponeva di valutare:
1. la reale prevalenza di donatori anti-HBc+ tra i nostri nuovi donatori di sangue.
2. La prevalenza di soggetti viremici per HBV nel gruppo di donatori anti-HBc+.
3. Proporre un nuovo screening sulle unità di sangue donate che riduca il rischio di
trasmissione dell’epatite B con la trasfusione.
METODI
8 centri trasfusionali della nostra Regione sono stati invitati a partecipare allo studio e di
questi 7 hanno accettato. In questi centri a partire dal 10/3/2004 e fino al 31/10/2005 tutti i
nuovi donatori di sangue sono stati testati per anti-HBc in aggiunta ai normali tests di
screening con metodica MEIA Axsym Core (Abbott). I positivi sono poi stati
successivamente testati anche per anti-HBs con metodica MEIA Axsym AUSAB (Abbott) e
con la ricerca dell’HBV-DNA, mediante una metodica di amplificazione genica effettuata su
singola unità (COBAS Ampliscreen HBV Roche), con sensibilità dichiarata di 10 UI/ml.
RISULTATI
Dal 10/3/2004 al 31/10/2004 sono afferiti ai 7 centri aderenti allo studio complessivamente
6311 nuovi donatori. Essi erano 3677 maschi (58,26%) e 2637 femmine (41,78%), con un’età
media di 34,8 anni 26 di questi (0,41%) erano portatori di infezione da HBV in atto
(HBsAg+). Essi erano 18 maschi e 8 femmine con un’età media di 43 anni, solo due di questi
presentavano un’aumentata citolisi epatocitaria (ALT 3 e 8 volte i valori normali). 6285
donatori (3659 maschi e 2629 femmine) sono risultati HBsAg-. Tuttavia 310 di questi
(4,93%) sono invece stati sospesi, perché risultati anti-HBc+ (cioè venuti in precedenza in
309

contatto con il virus dell’epatite B). Di questi 264 erano positivi alla ricerca dell’anti-HBs
mentre 46 (16,4%) presentavano un anticorpo anti-HBc isolato. Questi 310 donatori avevano
in media 44,1 anni mentre quelli mai venuti a contatto avevano un’età media di 33,9 anni. Il
test in biologia molecolare eseguito su 286 donatori anti-HBc+ che avevano firmato il
consenso al test ha evidenziato in 20 casi (6,99%) la presenza di HBV-DNA. Di questi 19
erano anti-HBc+/anti-HBs+ e solo uno presentava un anticorpo anti-core isolato. Tutti
presentavano normali livelli di transaminasi sieriche.
La prevalenza dell’infezione in atto da HBV tra i soggetti che si presentano per la prima volta
a donare il sangue è attualmente in Piemonte dello 0,43%. Prevalenze tra loro analoghe sono
state osservate in tutti i centri meno nel numero 2 che sembrerebbe aver osservato una
prevalenza all’incirca doppia di soggetti infetti (0.61% vs 0,38%). In questo stesso Centro è
stata riscontrata una più elevata prevalenza di soggetti venuti precedentemente in contatto con
il virus dell’epatite B (7,15% vs 3,77 % di soggetti anti-HBc+). Poiché il bacino di utenza dei
due centri maggiori è lo stesso e poiché l’età media dei due gruppi è paragonabile (35 aa vs 34
aa) si può ipotizzare in prima istanza che fattori quali differenti strategie di selezione dei
nuovi donatori abbiano potuto giocare un ruolo nel selezionare una popolazione
maggiormente a rischio per il contatto con il virus HBV. Globalmente, comunque, la
prevalenza di individui venuti a contatto con HBV è attualmente, tra i nuovi donatori della
regione Piemonte, del 4,9%. Costoro sono in media più vecchi dei donatori mai venuti a
contatto con il virus (44,1 vs 33,9 anni) a conferma della netta tendenza alla riduzione
dell’epidemiologia dell’infezione da HBV nella nostra popolazione. Tra i soggetti
naturalmente immunizzatisi che attualmente donano presso i nostri centri trasfusionali, il
6,99% è risultato essere viremico. La quantificazione di questi livelli di viremia è ancora in
via di esecuzione così come l’identificazione dei genotipi virali presenti, tuttavia già in queste
circostanze possiamo dire che i donatori anti-HBc+ rappresentano il più grande fattore di
rischio residuo per la trasmissione dell’infezione da HBV con la donazione. E’ pur vero che a
meno di effettuare studi di transfezione su animali è impossibile quantificare quanti tra questi
individui sarebbero potenzialmente infettivi per un ipotetico ricevente, situazione legata anche
a numerosi altri fattori. Infatti sia la situazione immunologica specifica del ricevente
(immunizzazione naturale o da vaccinazione) sia fattori normalmente legati
all’immunocompetenza generica del ricevente oltrechè la viremia giocano un ruolo nella
possibilità di infezione. Sicuramente oggi un numero sempre maggiore di soggetti gravemente
e per lungo tempo immmunocompromessi viene trasfuso nell’ambito di cicli chemioterapici
sempre più aggressivi e sono verosimilmente questi gli individui maggiormente a rischio di
infezione. In questi individui anche viremie molto basse possono infatti rappresentare un
fattore di rischio molto importante.
CONCLUSIONI
La prevalenza di soggetti venuti in passato in contatto con il virus HBV e successivamente
guariti (anti-HBc+) rimane anche tra i nuovi donatori solo leggermente inferiore al 5%.
Poiché una percentuale, che supera quella attesa (6,99% vs 1,6-2%), dei soggetti anti-HBc+ è
risultato viremico e quindi potenzialmente infettivo almeno per pazienti
immunocompromessi, andranno variate le strategie di screening dei donatori di sangue. Una
possibile proposta vede l’introduzione dello screening per anti-HBc su tutti i donatori di
sangue e la ricerca dell’HBV-DNA almeno su quelli risultati anti-HBc+.
310

Chiara Marinacci Filone tematico A3
Epidemiologia della disoccupazione nella provincia di Torino
Asl 5 – Servizio di Epidemiologia
CONTESTO E RAZIONALE
Effetti sfavorevoli della disoccupazione sulla salute sia fisica, sia mentale sono stati
evidenziati da numerosi studi epidemiologici, anche se appare ancora controverso se ciò sia
attribuibile ad un fenomeno di selezione, dovuto al fatto che i lavoratori in peggiori condizioni
di salute abbiano una maggiore probabilità di cadere nella disoccupazione, o se l’effetto della
disoccupazione sulla salute sia di tipo causale. L’incremento della povertà e dello stress,
l’adozione di comportamenti e stili di vita pericolosi sono i principali meccanismi attraverso i
quali la disoccupazione parrebbe agire sulla salute. La provincia di Torino tra il 2001 e il 2002
presentava un considerevole tasso di disoccupazione (6%), con un totale di disoccupati che
nel 2003 ammontava a quasi 60.000 persone. Una particolare forma di protezione sociale nei
confronti della disoccupazione, di cui godono prevalentemente i lavoratori delle grandi
imprese, è l’istituto della mobilità, che prevede sia facilitazioni per il reimpiego, sia il
percepimento di un’indennità di disoccupazione per un periodo massimo di 3 anni (mobilità
corta), sia, per i lavoratori più anziani, un sostegno economico fino al pensionamento, che può
essere di durata anche superiore (mobilità lunga). Il totale dei lavoratori inscritti alle liste di
mobilità nella provincia nel 2003 era di circa 15.000, in maggioranza di bassa qualifica, dei
quali il 12% residenti a Torino.
OBIETTIVI
Obiettivi di questo studio sono stati di valutare se i disoccupati in mobilità residenti a Torino
presentavano:
a) eventuali differenze nell’incidenza di disturbi mentali e fisici nel periodo antecedente alla
mobilità, rispetto alla popolazione torinese occupata;
b) un incremento nella prevalenza di tali disturbi tra il periodo precedente e quello
successivo all’entrata in mobilità.
MATERIALI E METODI
La ricerca ha analizzato la relazione fra disoccupazione e salute in un campione composto da
1.801 soggetti (50,8% maschi), residenti a Torino, inseriti nelle liste della mobilità corta nel
periodo 2001-2003, che coincide con l’inizio della fase più recente della crisi dell’industria
manifatturiera torinese. Gli esiti di salute considerati sono stati la depressione e l’ischemia
coronarica, attribuite ai soggetti in studio per mezzo delle prescrizioni di antidepressivi e
nitroderivati come riportate nell’archivio regionale dei farmaci, e i ricoveri urgenti per
qualunque patologia, estratti dall’archivio regionale delle dimissioni ospedaliere.
Per rispondere all’obiettivo a) è stata confrontata l’incidenza nella coorte della prima
prescrizione di questi farmaci dall’1/1/1997 fino ad un anno prima dell’entrata in mobilità,
con quella della popolazione occupata torinese negli anni 1997-1999; anche per i ricoveri il
periodo di confronto è stato lo stesso, tranne che per l’esclusione del 1997, a causa della bassa
qualità dell’archivio corrispondente. L’analisi è stata condotta attraverso un modello di
regressione di Poisson controllato per età e titolo di studio e stratificato per sesso, in cui la
311

popolazione di riferimento era costituita dai soggetti torinesi che al censimento 1991 erano
impiegati con contratto di lavoro subordinato, esclusi i dirigenti.
L’obiettivo b) è stato perseguito per mezzo di un’analisi appaiata, utilizzando il test di
McNemar, in cui per ogni soggetto sono stati confrontati l’occorrenza di ricoveri e l’utilizzo
di antidepressivi e nitroderivati nell’anno successivo all’inizio della mobilità, rispetto al
periodo compreso tra 2 anni e 1 anno prima della stessa. L’anno precedente alla mobilità è
stato escluso dall’analisi, in quanto l’eventuale conoscenza della futura disoccupazione
potrebbe di per sé aver prodotto degli effetti sulla salute nei lavoratori in mobilità (effetto
annuncio).
RISULTATI
Nel periodo precedente la mobilità la popolazione in studio presentava un’incidenza di
ischemia coronarica, accertata per mezzo della prima prescrizione di nitroderivati, inferiore a
quella della popolazione di riferimento, che tra i maschi raggiungeva la significatività
statistica (maschi: RR = 0.20, 95% I.C.: 0.09-0.44; femmine: RR = 0.72, 95% I.C.: 0.38-
1.34). Anche l’incidenza di depressione era inferiore nella coorte rispetto alla popolazione
occupata, soprattutto tra le femmine, per le quali il rischio era significativamente inferiore
(maschi: RR = 0.93, 95% I.C.: 0.66-1.29; femmine: RR = 0.71, 95% I.C.: 0.53-0.96). Il
rischio di ricovero urgente per qualsiasi causa era invece significativamente in difetto tra i
maschi (RR = 0.69, 95% I.C.: 0.55-0.88) e significativamente in eccesso tra le donne (RR =
1.35, 95% I.C.: 1.17-1.57). Il confronto tra il periodo precedente e quello successivo all’inizio
della mobilità non ha mostrato differenze significative né riguardo ai ricoveri urgenti
(p=0.72), né per l’utilizzo di nitroderivati (p=0.79), anche se, per questi ultimi, il numero di
soggetti che li avevano utilizzati era molto piccolo in entrambi i periodi (n. 8 e 6,
rispettivamente). La proporzione di soggetti che avevano assunto antidepressivi era invece
aumentata nel periodo della mobilità rispetto a quello precedente, soprattutto tra le donne, per
le quali la differenza era maggiore e significativa (p=0.006).
CONCLUSIONI
La coorte in studio presentava, nel periodo precedente la mobilità, condizioni di salute
migliori della popolazione occupata, limitatamente agli esiti esaminati, eccetto che per i
ricoveri urgenti tra le donne. Ciò dimostrerebbe, almeno per gli uomini, che le peggiori
condizioni di salute riscontrate tra i disoccupati in altri studi non sarebbero attribuibili
all’espulsione di soggetti malati dal mondo del lavoro. Solo l’uso di antidepressivi è risultato
significativamente aumentato nel periodo successivo all’inizio della mobilità, rispetto a quello
precedente, mentre né i nitroderivati, né i ricoveri acuti hanno mostrato cambiamenti
sostanziali tra i 2 periodi. Questi risultati appaiono coerenti con quelli presenti in letteratura,
che dimostrano una solida associazione tra disoccupazione e occorrenza di disturbi mentali,
mentre la relazione con le patologie cardiovascolari appare ancora controversa, dal momento
che gli eccessi osservati tra i disoccupati potrebbero essere attribuibili al confondimento
causato da differenze nei fattori di rischio cardiovascolare tra questi e la popolazione di
riferimento.
312

Luca Marozio Filone tematico C2
Definizione di protocolli specifici per l'assistenza alla gravidanza in
donne extracomunitarie
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Discipline Ginecologiche e Ostretiche
CONTESTO E RAZIONALE
Negli ultimi 10 anni il numero di stranieri presenti in Italia è continuamente aumentato. Stime
della Caritas del 2005 parlano di 3 milioni di immigrati, di cui - secondo i dati ISTAT 2001-
674.195 sono donne. A Torino, in particolare, gli stranieri costituiscono il 2,5% della
popolazione residente. Le donne immigrate sono generalmente più giovani rispetto alle
italiane (in media 31,4 e 43.1 anni rispettivamente), quasi il 70% di esse è in età riproduttiva
(15-49 aa) e più della metà di esse è nubile (con tutti i problemi che questo comporta per la
gravidanza e la crescita del nascituro). La loro provenienza è molto varia, prevalentemente da
paesi ad economia meno avanzata (22,8% Europa centro-orientale, 22,7% Africa, 17,6% Sud
America e 16% Asia).
Studi condotti negli ultimi anni hanno riscontrato esiti materno-fetali complessivamente
peggiori nelle gravidanze di donne extracomunitarie rispetto alle donne italiane (maggiore
incidenza di parto pretermine, basso peso alla nascita, asfissia neonatale, natimortalità e
mortalità neonatale precoce). Altre indagini hanno inoltre evidenziato una notevole carenza di
informazioni in merito alle opportunità di assistenza sanitaria e supporto psico-sociale fornite
dalle strutture pubbliche alle gravide extracomunitarie, in particolare riguardo l’assistenza alla
gravidanza (visite mediche e corso di preparazione al parto) e la possibilità di diagnosi
prenatale e di contraccezione in puerperio. Inoltre spesso l’assistenza offerta alle gravide
extracomunitarie non è mirata ad affrontare problemi non solo sanitari, ma specificatamente
assistenziali e socio-culturali.
METODI E RISULTATI
Per questi motivi è stato istituito un ambulatorio/osservatorio dedicato al rilevamento delle
necessità peculiari delle gravide extracomunitarie e finalizzato a soddisfarne le specifiche
esigenze, con l’obiettivo finale di definire un protocollo di comportamenti e modalità di
assistenza per le gravide extracomunitarie, distinti per paese di origine ed etnia, da diffondere
a livello comunale, provinciale e regionale.
Nel corso del primo anno di studio 253 pazienti gravide extracomunitarie sono state reclutate
tra le donne afferenti all’Ambulatorio di Ostetricia della Cattedra C del Dipartimento di
Discipline Ginecologiche ed Ostetriche dell’Università di Torino e seguite longitudinalmente
per l’intera durata della gravidanza fino al parto e nelle prime settimane di puerperio, con
afferenza programmata ai servizi di “Ecografia e Diagnosi prenatale” e “Cardiotocografia e
Sorveglianza del Benessere Fetale”. Di queste, l’87% è stato seguito fino a termine di
gravidanza. Le gravide incluse nello studio sono risultate di età compresa tra 18 e 37 anni e
nel 75% erano primigravide. Ad esse sono stati somministrati i seguenti questionari che
indagavano rispettivamente:
A 20 settimane di gravidanza (253 donne) e presso il termine (220 donne):
- lo stile di vita (alimentazione, occupazione, condizioni sociali, …);
313

- la qualità dell'assistenza in gravidanza ed eventuali problemi riscontrati;
- la percezione soggettiva della gravidanza. ·
Dopo il parto (220 donne):
- la percezione soggettiva del parto;
- l'opinione sulla relativa assistenza sanitaria. ·
In puerperio (192 donne):
- il rapporto con l'allattamento;
- - l'uso di strategie anticoncezionali.
Per ogni soggetto sono stati registrati i seguenti dati: anamnesi personale ed ostetrica, epoca
gestazionale all’accesso in Ambulatorio, adesione ai protocolli di assistenza, decorso della
gravidanza, epoca gestazionale e modalità del parto, peso alla nascita, punteggio Apgar,
eventuali complicanze neonatali, modalità e durata dell’allattamento,uso di anticoncezionali
in puerperio. Le gravide incluse nel nostro studio hanno presentato la seguente distribuzione
per area di provenienza:
- Est Europa (Romania, Ungheria, Albania) = 40%
- Sud America (Perù, Ecuador) = 23%
- Centro Africa (Senegal, Nigeria) = 20%
- Nord Africa (Marocco, Tunisia) = 13%
- Asia (Cina) = 4%
Il 28% delle donne è afferito per la prima volta all’ambulatorio dopo le 12 settimane di
gestazione, il 6% di esse si è presentata solo alla prima visita e il numero medio di visite da
esse effettuato è stato di 5 (una ogni 8 settimane, in media). L’adesione ai protocolli di
screening ecografico è stata buona, anche grazie alla disponibilità di un servizio di ecografia
collegato con l’ambulatorio e a prenotazione automatica: solo il 15% delle donne non ha
effettuato tutte le ecografie previste, per lo più per assenza temporanea dal Paese. L’adesione
ai protocolli di diagnosi prenatale non è stata molto buona, pari al 95%, a causa di una
notevole difficoltà di comunicazione e di informazione corretta su obiettivi e significati della
diagnostica prenatale. Solo il 24% delle donne ha partecipato ad un corso di preparazione al
parto, che è stato proposto alla totalità delle gravide. I motivi principali per cui le donne non
hanno partecipato ai corsi sono stati la mancanza di tempo, la difficoltà organizzativa e le
barriere linguistiche.
Per quanto riguarda l’andamento della gravidanza, abbiamo rilevato una maggiore incidenza
di minacce d’aborto e di parto pretermine e un maggior numero di casi di diabete gestazionale
malcompensato. In merito agli esiti materni e perinatali, abbiamo riscontrato una maggiore
incidenza di parto pretermine, e di basso peso alla nascita. Le proporzioni di parti vaginali
spontanei, indotti e di tagli cesarei sono state sovrapponibili a quelle riscontrate nella
popolazione italiana.
Abbiamo avuto notevoli difficoltà a seguire le donne in puerperio: è infatti stato possibile
intervistare e visitare solo 192 (76%) di esse. Tra queste, abbiamo riscontrato una elevata
frequenza di blocco dell’allattamento (39%), per lo più dovuto a necessità lavorative. In
merito alla contraccezione in puerperio abbiamo riscontrato notevoli difficoltà linguistiche e
di comprensione e la percentuale di coppie che hanno utilizzato un metodo contraccettivo è
stata molto bassa, nonostante le informazioni siano state fornite a tutte le puerpere (21%).
In conclusione, per una migliore assistenza alle gravide extracomunitarie, noi è necessaria
l’istituzione di ambulatori dedicati, con disponibilità quotidiana di mediatrici culturali,
possibilità di afferenza facilitata e con prenotazione diretta agli altri servizi forniti alle gravide
(ecografia, esami di laboratorio, consulenze specialistiche, ecc), gestiti da medici esperti in
questo campo, informati sulle possibilità socio-assistenziali del territorio e in contatto con tali
servizi.
314

Aldo Martelli Filone tematico B3
Rischio biologico negli alimenti: studio e applicazione di metodi analitici
biotecnologici
Università del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”
Dipartimento di Scienze Chimiche, Alimentari, Farmaceutiche e Farmacologiche
Le problematiche relative alla Sicurezza Alimentare, recentemente stimolate dalla diffusione
di patologie trasmissibili come la BSE, e di patologie correlate allo sviluppo dei cosiddetti
"patogeni emergenti", rappresentano una priorità nella ricerca pubblica in ambito sanitario ed
alimentare.
PRIMO OBIETTIVO: progettazione e studio di test biotecnologici basati sull'uso di
Acidi Peptido Nucleici (PNA).
Si tratta di analoghi del DNA a scheletro pseudopeptidico di monomeri di 2-N-amminoetilglicina
in sostituzione dello scheletro zucchero-fosfato, legato a basi puriniche e
pirimidiniche. I PNA mimano il comportamento del DNA, si legano più stabilmente a catene
complementari formando duplex (PNA/DNA). La neutralità dei PNA (per assenza di gruppi
fosfato a carica negativa) permette di minimizzare le forze repulsive tipiche delle sonde a
DNA; i PNA risultano quindi sonde più sensibili di quelle a DNA. Finalità del progetto è stata
il design di PNA per il set-up di metodiche per il riconoscimento di carne vaccina (Bos
tauros) negli alimenti complessi e per l'identificazione di patogeni (in particolare Listeria
monocytogenes) in prodotti alimentari a rischio. Innanzitutto si è provveduto ad identificare le
sequenze di B. taurus e L. monocytogenes idonee al design di PNA specie-specifici su
Genbank: ormone della crescita bovino (NCBI accession number M57764 per la specie B.
taurus); sequenza lisA, gene per la listeriolisina, (accession number X15127 per L.
monocytogenes) e sequenza del gene iap, altamente conservata e ideale per l’identificazione
di tutte le specie di Listeria.
E’ stato quindi effettuato uno studio bio-infomatico volto alla ricerca di un frammento di
sequenza specifico per B. taurus, che presentasse le migliori caratteristiche per il design di
primer e soda, verificando l’assenza di reattività crociata con altre sequenze di mammiferi
utilizzati come ingredienti in alimenti complessi. Sono quindi state disegnate 2 coppie di
primer specifici sulle sequenze indicate; il design dei primer è stato finalizzato all’ottenimento
di ampliconi di piccole dimensioni (< 200 bp) per esigenze tecniche (metodo di rilevazione
HPLC del duplex PNA-single strand DNA). Gli ampliconi specifici sono stati quindi
sequenziati e, una volta testata la specificità mediante studi di omologia per allineamento in
banca dati, utilizzati per il design finale del PNA. La sequenza 14 mer specifica selezionata è
stata la seguente: N-CGCATCCCCAGCAT-C. I test preliminari hanno confermato la
specificità della sonda PNA sia su oligonucleotidi single-strand sia su ampliconi da PCR. Per
quanto riguarda Listeria spp. si sono individuate 2 coppie di primer specifici, una per L.
monocytogenes e l’altra, aspecifica, per Listeria spp., già descritte in letteratura. Per gli
ampliconi ottenibili da queste coppie di primer sono state sintetizzate sonde fluorescenti a
DNA per studi di pre-gel hybridization, comparandole con la sonda a PNA.
E’ stata quindi selezionata una sequenza specie-specifica (GCTTATCCAAATGTA) utilizzata
per il design di una sonda a DNA e di una sonda a PNA (15 mer), entrambe marcate con
fluoresceina alle estremità 5’ ed N terminale. Per valutare la formazione degli ibridi tra DNA
315

di Listeria e sonda fluorescente (a DNA o PNA), sono stati allestiti protocolli HPLC. Sono
state ottimizzate analisi HPLC a scambio anionico, utilizzando la sonda PNA 15 mer
fluorescente e gli oligonucleotidi sintetici complementari (senso) e non complementare (antisenso)
alla sonda. I risultati ottenuti su Listeria sono stati presentati in forma di poster al 7°
Congresso Italiano di Scienza e Tecnologia degli Alimenti (Cernobbio 19-20 settembre 2005).
SECONDO OBIETTIVO: monitoraggio microbiologico conoscitivo nell’ambito del
territorio regionale su prodotti di origine vegetale per la ricerca di patogeni emergenti.
Questa attività ha riguardato la contaminazione microbiologica di prodotti ortofrutticoli da
consumo crudo ed è stata oggetto di una campagna di analisi svolta in Piemonte effettuando
dei prelievi di campioni ortofrutticoli (totale: 16 campioni) in supermercati o mercati rionali,
nel periodo giugno 2004 – settembre 2005, scegliendo prodotti di stagione.
Sono stati analizzati campioni di verdura da consumo crudo, che comprendevano prodotti
freschi del supermercato (indivia riccia, scarola, sedano, verza), prodotti del supermercato di
IV gamma biologici e non (pan di zucchero, insalata mista, carote tagliate in vaschetta,
valeriana) e prodotti freschi acquistati al mercato (valeriana, finocchio, sedano) da produttori
locali. Su tutti i campioni è stata effettuata la ricerca di indicatori di contaminazione (carico
batterico mesofilo, coliformi totali e fecali, C. perfringens, E. coli) ed è stata analizzata la
presenza di Salmonella spp. e Listeria spp. Nessuno dei campioni analizzati è risultato
contaminato da Salmonella spp., mentre uno dei campioni di valeriana fresca prelevati al
mercato è risultato positivo a L. innocua. Gli indicatori di contaminazione non hanno
evidenziato particolari condizioni di contaminazione, fatto salvo alcuni campioni (valeriana,
scarola, finocchio, sedano), positivi per E. coli. Sui campioni conservati in frigorifero dove
sono state rinvenute le cariche più elevate degli indicatori di contaminazione è stata effettuata
anche la ricerca di Giardia, Cryptosporidium, E. coli O157:H7 e Aeromonas che in nessun
caso è risultata positiva. Sebbene non siano stati riscontrati microrganismi patogeni, la
frequenza di E. coli, anche con conteggi elevati (> di 102/g), in alcuni campioni è indice di
condizione di scarsa igiene del prodotto. Questa situazione può comportare dei rischi di
carattere igienico-sanitario derivanti dal ruolo di indicatore di contaminazione fecale di E.
coli. Bisogna considerare quindi che questi vegetali, se consumati crudi senza una adeguata
pulizia, possono rappresentare una possibile sorgente di infezione oltre che di contaminazione
crociata per gli altri alimenti.
Il naturale sviluppo del presente Progetto di Ricerca sarà il proseguimento delle attività di
ricerca (già attivate) in relazione al finanziamento, da parte della Regione Piemonte, del
progetto “Sviluppo di tecniche innovative PNA-correlate per la determinazione rapida di
contaminazioni esogene negli alimenti”, in cui si utilizzeranno le sonde a PNA specifiche per
Listeria monocytogenes, creando sistemi analitici diagnostici innovativi utilizzabili a tutela
del consumatore.
316

Maria Giovanna Martinotti Filone tematico A1
Contaminazione ambientale da Aspergillus spp. e incidenza di
aspergillosi invasiva in pazienti ematologici
Università del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”
Dipartimento di Scienze Chimiche, Alimentari, Farmaceutiche e Farmacologiche
OBIETTIVO
La valutazione della contaminazione da Aspergillus spp.in ambiente ospedaliero assume una
grande importanza come strumento di controllo e prevenzione. Scopo della presente ricerca è
stato quello di valutare l’incidenza stagionale e la distribuzione ambientale di specie fungine e
in particolare di Aspergillus spp. nell’Unità Operativa di Clinica Medica Generale
dell’Ospedale “Maggiore della Carità” di Novara e di eseguire una analisi epidemiologica
attraverso RAPD-PCR su ceppi di isolamento sia ambientale che clinico.
METODI E RISULTATI
I campionamenti sono stati effettuati in 12 siti interni al reparto costituiti da 4 stanze di
degenza ospitanti pazienti immunodepressi, prive di sistemi di conduzione e filtrazione
dell’aria, dai rispettivi bagni, da 4 punti nel corridoio della corsia posti di fronte l’ingresso
delle stanze ed in 3 postazioni all’esterno dell’edificio. I prelievi d’aria sono stati effettuati in
decuplo tramite SAS Super 180 su terreno per miceti. Per ogni sito è stata valutata la carica
fungina totale e di Aspergillus spp.
I risultati sono stati espressi come CFU/m³. L’analisi epidemiologica è stata condotta su
isolati di A. fumigatus collezionati stagionalmente in tutti i siti utilizzando il metodo RAPD-
PCR. La reazione di amplificazione è stata condotta utilizzando i primers R108 e 2
comunemente utilizzati per la caratterizzazione della specie A. fumigatus. I profili genetici
sono stati confrontati tramite software Gel Compar. Nel biennio 2004-2005 si è osservato che
la concentrazione fungina media ha sempre presentato valori più elevati all’esterno (1113.7
CFU/m³) rispetto ai siti interni (635.8 CFU/m³) dove i valori più elevati sono stati riscontrati
nel periodo estivo (1301.0 CFU/m³) e in quello autunnale (1257.2 CFU/m³). In inverno e in
primavera i valori erano rispettivamente di dieci e sei volte inferiori. Tutte le stanze di
degenza e i bagni hanno presentato concentrazioni fungine medie inferiori a quelle rilevate in
corridoio. Stanza, bagno e corridoio 3 sono risultati in media i più contaminati. La
concentrazione media totale di Aspergillus spp. negli ambienti del reparto è stata di 4.88
CFU/m³ e nei siti esterni di 4.08 CFU/m³; valori più elevati sono stati osservati in autunno
(8.04 CFU/m³) e in estate (5.93 CFU/m³) nei siti interni. Concentrazioni medie totali di
Aspergillus spp. pari a 5.84 CFU/m³ sono state rilevate nelle stanze di degenza, a 5.41
CFU/m³ nei bagni ed a 3.40 CFU/m³ in corridoio. La stanza e il bagno 3 hanno presentato in
tutte le stagioni quantità medie di conidi superiori a quelle osservate negli altri punti di
prelievo interni ed esterni. Nelle stanze 1, 2, 4 e nei bagni 1 e 4 sono state osservate
concentrazioni medie inferiori a 5 CFU/m³ e nel bagno 2 pari a 5.43 CFU/m³.
Le percentuali di specie di Aspergillus maggiormente rilevate in tutti i siti sono state: A.
fumigatus (interno 54.4% - esterno 47.6%), A. niger (interno 17.3% - esterno 25.6%) e A.
flavus (interno 9.3% - esterno 10.9%). Se confrontate con tutti i siti interni ed esterni, le
concentrazioni medie di A. fumigatus nella stanza 3 (7.80 CFU/m³) e nel bagno 3 (4.90
CFU/m³) sono risultate le più elevate. L’analisi statistica ha messo in evidenza che sia la
317

carica fungina totale che quella di Aspergillus spp. hanno un’incidenza stagionale.
Attualmente non esistono norme che stabiliscano quale sia la più alta concentrazione fungina
ammessa in reparti ospedalieri o stanze di degenza con pazienti immunodepressi. In
letteratura, tuttavia, vengono individuati valori medi di soglia di spore di Aspergillus spp.
inferiori a 5 CFU/m³ in stanze di isolamento protettivo non dotate di sistemi di filtrazione
dell’aria.
L’analisi RAPD è stata effettuata sia su isolati ambientali di A. fumigatus che su isolati clinici
ottenuti da pazienti ricoverati presso il Reparto di Pneumologia situato al 1° piano dello stesso
edificio ospitante il Reparto di Clinica Medica generale. Sono stati identificati 93 profili
distinti (ceppi) su 99 isolati fino ad ora saggiati. Di questi, 88 isolati erano di origine
ambientale e derivavano da campionamenti effettuati nel periodo compreso tra gennaio e
agosto 2005 in quattro stanze, nei relativi bagni, nel corridoio ed all’esterno dell’edificio. I
profili RAPD, ottenuti utilizzando il primer R108, hanno dimostrato da un minimo di due ad
un massimo di 12 bande distinte e sono risultati, nella maggior parte dei casi, diversi tra loro,
indicando che quasi tutti gli isolati non erano epidemiologicamente correlabili. Tuttavia, in un
campionamento effettuato nel mese di Aprile, è stata riscontrata un’elevata similarità di
profilo, tra un isolato derivato dal bagno della stanza 3 e uno derivato dalla stanza 4. I due
isolati verranno ulteriormente analizzati con i primer 2 e OPZ19 al fine di confermare o
escludere la loro correlazione genetica. Sempre durante lo stesso campionamento, due isolati
derivati dai prelievi effettuati all’esterno dell’edificio mostravano profili identici sia quando
esaminati col primer R108 che col primer 2; tali profili non erano però assimilabili a quelli
riscontrati all’interno del reparto ospedaliero.
Infine, durante il primo campionamento effettuato a luglio sono stati riscontrati due profili
identici derivati da isolati della stanza e del bagno 3 mentre, nel secondo prelievo di luglio
sono stati riscontrati tre profili identici di isolati derivati dalla stanza, dal bagno e dal
corridoio 1. Nei suddetti casi si può presumere una possibile fonte comune di contaminazione
da Aspergillus spp., da confermare con l’utilizzo di altri primers. I quattro isolati di A.
fumigatus di origine clinica sono risultati diversi tra di loro. Uno di questi, però, presentava
un profilo identico a quello di un isolato riscontrato nel corridoio 3 durante un
campionamento a luglio, sia quando caratterizzato col primer R108 che col primer 2. I due
isolati verranno ulteriormente analizzati col primer OPZ19 al fine di confermare o escludere
la loro correlazione genetica. Sono stati inoltre, analizzati un isolato clinico derivato da un
paziente deceduto durante il periodo di indagine e 5 ceppi isolati da una stanza di degenza e
dal relativo bagno, localizzati nello stesso reparto ma non presi in considerazione in questo
studio. In questo caso gli isolati non erano correlabili geneticamente.
CONCLUSIONI
In conclusione, l’analisi tramite RAPD-PCR ha indicato, nella maggior parte dei casi, la
presenza di profili geneticamente distinti, rendendo difficile l’individuazione di sorgenti
comuni. Solo in tre episodi si è osservata una correlazione genetica tra isolati derivati dagli
ambienti del reparto e, in uno, tra isolati clinici e ambientali. Tale possibile correlazione sarò
oggetto di ulteriori approfondimenti mediante l’utilizzo di altri primers.
318

Massimo Massaia Filone tematico A1
Ruolo del sistema immunitario nella prevenzione e controllo
dell'infezione da aspergillo nei pazienti oncoematologici
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale
CONTESTO E RAZIONALE
L’aspergillosi invasiva (AI), la principale causa di morte per infezione nei pazienti (pz) onco
ematologici, soprattutto dopo chemioterapia ad alte dosi seguita da autotrapianto con cellule
staminali e dopo procedure allotrapiantologiche (alloBMT), è spesso misconosciuta
nonostante i progressi nella diagnosi precoce e, malgrado i nuovi farmaci antifungini,
l’infezione accertata ha mortalità vicina al 60%. La neutropenia è usualmente considerata il
principale fattore di rischio, ma la crescente incidenza di infezioni tardive in pz allotrapiantati
non neutropenici suggerisce un ruolo determinante di altri difetti immunologici nella
suscettibilità all’AI. Studi recenti dimostrano che sia l’immunità innata sia quella adattiva
sono coinvolte nella resistenza all’infezione da Aspergillo, attribuendo particolare importanza
alle sottopopolazioni linfocitarie critiche nella generazione di una risposta immune efficace,
alla distribuzione delle cellule dendritiche (DC), distinte in 2 tipi principali, mieloidi (DC1) e
plasmacitoidi (DC2) in base a caratteristiche fenotipiche e funzionali, variabile nel decorso
dell’infezione e capace di condizionare il tipo di risposta T helper (Th) che si genera, Th1
immunoprotettiva o Th2 non immunoprotettiva. Oltre alle risposte Th, anche i linfociti T
gamma-delta (Tgd), effettori dell’immunità innata, presenti in minima percentuale nel sangue
periferico, e in particolare il subset V-g9d2, possono contribuire a generare un’immunità
protettiva nei confronti dell’AI.
OBIETTIVO
Obiettivo dello studio era valutare se i parametri immunologici sopra riportati identificassero i
pz a più alto rischio d’AI, quindi con necessità di stretto monitoraggio clinico-laboratoristico
ed eventualmente di profilassi. Inoltre, riteniamo che la conoscenza di fattori immunologici
importanti per la prevenzione e il controllo delle infezioni fungine invasive sia una premessa
fondamentale per lo sviluppo di strategie d’immunoterapia antifungina.
RISULTATI METODOLOGICI
1. Creazione di una banca di dati clinici e di campioni di 20 pz ad alto rischio di AI, trattati
con chemioterapia che causa fasi di aplasia superiori a 6 giorni. Le cellule mononucleate
del sangue periferico (PBMC) e il plasma sono prelevati alla diagnosi, pretrattamento, a
ripresa ematologica, a infezione da Aspergillo sospetta o documentata, inoltre per
alloBMT ai giorni 0, +28, +56 e a 3, 6, 12 mesi. I controlli sono donatori sani (4), 1
paziente non affetto da malattie oncoematologiche con diagnosi d’AI, donatori di cellule
staminali periferiche per alloBMT (9), raccolte aferetiche reinfuse ai pz alloBMT (7). Il
PBMC è criopreservato vitalmente in azoto liquido, se possibile, per la scarsità di
materiale e di vitalità cellulare dopo trattamenti chemioterapici.
2. Collaborazione con altri centri italiani (Roma, Montefiascone) per invio di campioni e
referti.
319

3. Validazione e standardizzazione dell’identificazione e quantificazione citofluorimetrica
dei subsets cellulari coinvolti nella resistenza all’Aspergillo su PBMC di controlli e
validazione su campioni da pz, di più complessa processazione e valutazione, con tecniche
d’immunofluorescenza diretta a 3 o 4 colori: DC1 e DC2 (cellule lin-/CD11c+/ILT3+ e
lin-/CD11c-/ILT3+, rispettivamente); linfociti T regolatori (CD4+ CD25high CD45R0+, il
subset a maggiore attività soppressoria); Tgd (naïve e memory); monociti CD16+ (espansi
in corso di sepsi. Validazione e standardizzazione di metodi per l’analisi quantitativa del
profilo di secrezione citochinica, mediante biglie marcate, sistema solido di cattura delle
CK, e anticorpo biotinilato CK-specifico, che permettono l’analisi e la quantificazione
simultanea di 10 CK di un unico campione. Messa a punto del protocollo standard di
espansione dei Tgd con specifiche concentrazioni di zoledronato (Zol) ± IL-2 a basse dosi
e valutazione dell’espansione mediante confronto del numero assoluto dei Tgd basale e al
giorno 7.
4. Messa a punto di test di citotossicità in vitro con metodi non radioattivi: il numero
assoluto dei target marcati con CFSE (linee cellulari, plasmacellule tumorali) uccisi dalle
cellule effettrici è calcolato dopo colorazione con propidio ioduro e analisi al
citofluorimetro a 24 ore, sulla base della % di cellule CFSE+ e propidio+ e della conta
cellulare totale.
RISULTATI SCIENTIFICI
1. Determinazione dei subset cellulari coinvolti nella risposta antifungina sui controlli, con
risultati concordi con la letteratura. I pz alloBMT (7 campioni) non presentano differenze
rilevanti; nei pz con graft verus host disease si osserva riduzione percentuale dei monociti
CD16+ (23% vs 33%) e di DC1 (0,02% vs 0,08%), verosimilmente causata dalla pesante
terapia immunosoppressiva
2. Dimostrazione dopo stimolazione con Zol,dell’attività anti-tumorale in vitro dei Tgd di
MM indipendente dalla capacità di proliferare dopo stimolazione con Zol e basato
sull’attivazione dei Tgd tramite presentazione di Zol da parte dei monociti e sulla
sensibilizzazione delle cellule di MM all’azione citotossica. I Tgd sono prevalentemente
memory (CD27+) nei pz con MM responders (i cui Tgd proliferano se trattati con Zol),
mentre sono prevalentemente effettori (CD27-) nei pz non-responders. I risultati sono
pubblicati su rivista peer-reviewed (Mariani et al Leukemia 2005 19, 664-670).
3. Determinazione del numero di Tgd in pz con MM trattati con Zol (8), alla diagnosi (6), o
dopo chemioterapia (13) Non sono evidenti associazioni tra responsività a ZOL e quantità
di Tgd con il numero di infusioni ev di ZOL effettuate dai pz, nè con la chemioterapia;
l’analisi dei subsets naïve e memory evidenzia però la riduzione di quest’ultimo nei pz
pluritrattati (8±4% vs 28±14%; p 0.03) · Determinazione delle concentrazioni plasmatiche
di IFNg, IL-10 e IL-12 in pz prima del alloBMT e a 2 mesi dalla procedura Nel
pretrapianto i pz non differiscono dai soggetti sani, nè dai donatori consanguinei; il
rapporto IFNg/IL-10, indicativo del bilancio Th1/Th2, misurato a 2 mesi dal trapianto
(1,28) è inferiore a quello pretrapianto (1,74; p 0.04) e ai controlli (1,85; p 0.02). La più
significativa alterazione (IFNg/IL-10 = 0,9) si è osservata in un pz in corso d’AI. Le
differenze di concentrazione plasmatica d’IL-12 non sono significative.
Dato il numero di casi e di campioni atti all’analisi, e il breve follow-up dei pz, non è stato
possibile ottenere la significatività statistica di tutti i risultati descritti, eccetto quella sopra
riportata o pubblicata. L’identificazione di gruppi di pz con diverso assetto del sistema
immunitario e di fattori immunologici di rischio infettivo, indicata da questi dati preliminari,
potranno comunque essere raggiunte con l’estensione dello studio nel tempo e a nuovi casi,
per la messa a punto di strategie diagnostiche e terapeutiche preventive.
320

Marco Massobrio Filone tematico C1
Kallikreina Umana 6 (hK6): un nuovo biomarker sierico per screening e
prognosi del cancro ovario
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Discipline Ginecologiche e Ostretiche
CONTESTO E RAZIONALE
La diffusione del carcinoma epiteliale dell'ovaio, la sua prognosi infausta oltre agli oggettivi
limiti delle attuali metodiche di "screening" (esame pelvico, ecografia transvaginale e
marcatori tumorali sierici) hanno reso indispensabile la ricerca e l'impiego di nuove
metodiche fornite di maggiore sensibilità e specificità, poco costose e ben tollerate dalle
pazienti al fine di identificare un numero maggiore di donne con malattia allo stadio iniziale.
Il marcatore tumorale ovarico più ampiamente impiegato è il CA-125 la cui valutazione
seriale è essenziale per controllare la risposta alla terapia ed è stato anche proposto come
metodica di screening. In realtà i livelli di CA-125 non sono elevati in 20-30% delle pazienti
con malattia in stadio avanzato. Sia la sensibilità che la specificità di questo marcatore sono
insufficienti per farne una metodica di screening per gli stadi precoci. Nuovi potenziali
marcatori sierici del carcinoma ovarico sono i membri della superfamiglia delle kallikreine
umane: i livelli tissutali e sierici dei prodotti di molti di questi geni sono significativamente
alterati in alcune patologie neoplastiche. La scoperta di nuovi marker biologici per una
diagnosi precoce porterebbe ad un miglioramento nella prognosi e nel trattamento delle
pazienti con neoplasia ovarica.
METODI E RISULTATI
Abbiamo in questo studio misurato la concentrazione della hK6 nel siero di 97 donne
apparentemente sane, di 141 donne con patologia ovarica benigna e di 146 donne affette da
carcinoma ovarico primitivo. Si è successivamente calcolata la sensibilità e specificità del test
e si è esaminata l’associazione tra la concentrazione sierica di hK6 con diverse variabili
clinico patologiche e con la sopravvivenza delle pazienti. Risultati: non sono state notate
differenze statisticamente significative nella concentrazione sierica di hK6 tra le pazienti sane
e quelle affette da patologia benigna. Al contrario si è riscontrato un aumento statisticamente
significativo della concentrazione sierica pre-operatoria di hK6 delle pazienti affette da
carcinoma ovarico (media = 6.8 micro g /L; P< 0.001). La concentrazione sierica di hK6
mostrava una diminuzione post-chirurgica nel 68% delle pazienti. La sensibilità della
concentrazione sierica dell’hK6 nella malattia al I-II stadio è del 21-26%. Quando si combina
al dosaggio dell’hK6 quello del Ca125 la sensibilità si attesta al 72% nella popolazione
generale e al 42% nelle pazienti con carcinoma ovarico al I-II stadio; la specificità del test che
combina i due marker è del 90%. La concentrazione sierica di hK6 correla moderatamente
con la concentrazione di Ca125 ed è più alta nelle pazienti con malattia agli stadi avanzati, di
alto grado e di istotipo sieroso. La concentrazione sierica preoperatoria di hK6 si è dimostrato
un importante fattore predittivo per quanto riguarda la sopravvivenza globale e l’intervallo
libero da malattia sia all’analisi univariata che alla multivariata.
CONCLUSIONI
La concentrazione sierica di hK6 parrebbe essere un nuovo biomarker del carcinoma ovarico
e potrebbe acquistare valore nella diagnosi e nella prognosi della malattia
321

Lina Matera Filone tematico C1
Preparazione a scopo terapeutico di vaccino cellulare semiallogenico
contro carcinoma prostatico
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina Interna
OBIETTIVI
Il progetto è stato sviluppato secondo due linee di indagine.
1. La prima riguardava la cross-presentazione di antigeni tumorali derivati da una linea
di carcinoma prostatico. La fonte di antigene è stata fornita da RNA totale della linea di
carcinoma prostatico LNCaP.
METODI
Il metodo utilizzato era la trasfezione di RNA totale di LNCaP in cellule dendritiche
immature (iDC) che sfrutta le capacità di fagocitosi e macropinocitosi della cellula in questo
stadio di differenziazione. La tecnica scelta consente di complessare l’RNA con un enhancer
ed un reagente lipidico (TransMessenger Reagent, Quiagen) permettendo la successiva
formazione di micelle che vengono catturate dalla iDC. La quota di mRNA dell’RNA totale
così inglobato viene tradotto a livello citoplasmatico. Le proteine ottenute sono processate e
presentate in membrana dalla iDC. Il fenotipo delle iDC è stato valutato al citofluorimetro
attraverso l’analisi dell’espressione di marcatori di membrana: CD14, MHCI, CD80, CD40.
L’efficienza della trasfezione è stata valutata attraverso l’espressione dell’RNA o della
proteina dell’antigene di membrana associato al carcinoma prostatico (PSMA) ed espresso
dalle LNCaP. La valutazione è stata effettuata attraverso RT-PCR e citofluorimetria con mAb
specifici (Y-PSMA-1 della Anogen; 3C6 della Northwest Bioterapeutics). La trasfezione è
stata messa a punto su iDC e su cellule di due linee di carcinoma mammario e di colon
rispettivamente (SKBR3 ed HT29), entrambe negative per l’espressione di PSMA.
RISULTATI
La linea LNCaP è risultata esprimente sia mRNA-PSMA sia la proteina. Sono stati condotti
esperimenti per la valutazione della quantità di RNA totale e del numero di cellule da
trasfettare per la standardizzazione della tecnica di trasfezione, essenziale per il suo
successivo utilizzo nella evocazione di una risposta CTL specifica. Si è stabilito di utilizzare 2
ug di RNA totale (rapporto di purezza tra 1,8 e 2) per 80000-100000 cellule.
CONCLUSIONI E SVILUPPI FUTURI
I risultati hanno permesso di stabilite le condizioni ideali per la trascrizione. Si andrà ora a
vedere se questa è seguita da presentazione di epitopi riconosciuti dai CTL.
2. La seconda linea di indagine riguardava la presentazione diretta di epitopi
dell'antigene PSMA da parte di DC.
METODI
Sono scelti due epitopi di PSMA con restrizione per HLA-A2. Uno di questi (ALFDIESKV) è
stato già sperimentato in protocolli attuati da altri centri ed è stato introdotto da noi in un
vaccino disegnato di recente e in corso di sperimentazione. L'altro (VLAGGFFLL) è stato
scelto perchè efficacemente riconosciuto in vitro dai linfociti antitumorali citotossici (CTL)
322

(Celis et al. Cancer Res 2002). CTL specifici erano generati esponendo le DC-peptide o le DC
di controllo a linfociti per tre cicli consecutivi. Bersagli dei CTL erano: i) le stesse DC
caricate con i peptidi, ii) la linea T2 deficiente della molecola di processazione dell’antigene
TAP che può legare peptidi esogeni e iii) la linea LNCaP che esprime PSMA. L’attività CTL
è stata valutata come rilascio di citochine Th1 (ELISPOT IFN-g) e la capacità citotossica
verso detti bersagli in un test del rilascio del 51Cr, in presenza della linea K562 come
bersaglio freddo bloccante l’attività NK. L’affinità dei peptidi per MHC I HLA-A2 è stata
studiata sulla base della capacità di influire sul turn-over della molecola MHC I.
RISULTATI
Si è osservato un rilascio superiore di IFN-g nei linfociti stimolati con DC-peptidi rispetto ai
linfociti stimolati con le DC di controllo. I linfociti presentavano un rilascio più alto verso la
linea T2 caricata con i peptidi rispetto alla linea T2 di controllo. I microarray funzionali di
citotossicità su piastre hanno dimostrato una più alta frequenza di pozzetti positivi nelle
colture stimolate con DC-peptide. E’ stata considerata solo l’attività citotossica verso il
bersaglio T2. Le DC presentavano infatti un rilascio spontaneo di 51Cr troppo alto. Si è notata
una significativa attività litica verso T2-peptide nelle colture stimolate con DC-peptide. La
specificità delle risposte CTL è stata valutata verso due bersagli entrambi HLA-A2+ ma
esprimenti (LNCaP) o non (Jurkat) PSMA. Si è notato un forte aumento di risposta verso
LNCaP sia nella coltura stimolata con DC-peptidi sia nella coltura non stimolata. Una risposta
trascurabile è stata notata verso le Jurkat. Il trattamento con l’anticorpo anti-MHC-I inibiva
fortemente le risposte verso LNCaP generate in entrambe le colture, dimostrando che risposta
mediata dai CTL è quindi diretta contro epitopi diversi da VLAGGFFLL e ALFDIESKV,
condivisi da DC e LNCaP, ma assenti su Jurkat. L’aumento di attività verso le Jurkat trattate
con anticorpo anti-MHC-I può essere secondario ad attività NK. I linfociti NK potrebbero
lisare Jurkat a causa del mascheramento delle molecole MHC-I riconosciute da KIR (Killer
Inhibitory Receptor) inibitorie o via citotossicità cellulare dipendente dall’anticorpo. Il
trattamento con il mAb W6/32 induceva una inibizione selettiva del rilascio di IFN-γ nei
linfociti stimolati con DC-peptidi cimentati con T2-peptidi..La presenza di linfociti NK è stata
invece confermata attraverso l’inibizione del rilascio di 51Cr in presenza del bersaglio NK
K562, usato freddo in un test di competizione. La capacità dei peptidi di legare HLA-A2 è
stata studiata direttamente con un peptide fluoresceinato (VLAGGFFLL) e indirettamente,
attraverso la stabilizzazione della molecola, conseguente all’inserimento del peptide nel
groove. L’aggiunta concomitante dei due peptidi diminuisce il turnover stabilizzando la
molecola MHC I. L’effetto ottimale è ottenuto dopo incubazione overnight a 37°C in presenza
di siero. L’analisi individuale dei due peptidi ha però dimostrato che l’effettivo positivo è
attribuibile a solo uno dei due peptidi (ALFDIESKV), essendo il peptide VLAGGFFLL
inibitente. L’aggiunta concomitante di β2-microglobulina rafforza l’effetto stabilizzante dei
peptidi.
CONCLUSIONI E SVILUPPI FUTURI
I risultati dello studio hanno dimostrato che un giudizio esatto dell’efficienza di un vaccino a
DC caricate con peptidi richiede un’accurata analisi dei parametri di affinità di questi ultimi
per la molecola MHC I. Inoltre, è stata identificata una importante componente di attività NK
nelle colture generate in presenza dei peptidi di PSMA. I risultati saranno utilizzati
nell’implementazione di futuri protocolli di terapia vaccinica antitumorale.
323

Giuseppe Matullo Filone tematico C1
Polimorfismi ed espressione dei geni della riparazione del dna in
relazione alla prognosi e alla chemiosensibilita’
Institute for Scientific Interchange Foundation
SCOPO DELLA RICERCA
Lo scopo di questo studio è di analizzare, su pazienti con diversi tipi di tumore trattati con
cisplatino e seguiti nel tempo, l’andamento della malattia in risposta al trattamento
chemioterapico ed in relazione ai polimorfismi e all’espressione dei geni della riparazione del
DNA. Gli obiettivi principali sono legati alla possibilità di identificare dei marcatori
prognostici di risposta alla chemioterapia, permettendo di identificare possibilmente dei
sottogruppi di pazienti che potrebbero meglio beneficiare del trattamento specifico con
derivati del Pt.
RACCOLTA CAMPIONI
Sono stati reclutati finora 14 pazienti con tumore al polmone, 14 con tumore testa-collo e 50
pazienti con tumore della vescica, sottoposti a trattamento chemioterapico secondo una
schedula contenente un derivato del platino, eventualmente associato ad altri chemioterapici
(gemcitabina o 5-fluorouracile) o a radioterapia. Inoltre sono stati raccolti anche 50 individui
di controllo ospedalizzati per malattie non neoplastiche.
ANALISI DEI POLIMORFISMI NEI GENI DEL RIPARO DEL DNA
Sono stati analizzati i seguenti 11 polimorfismi nei pazienti con tumore del polmone e testacollo:
ERCC2-Asp312Asn, ERCC2-Lys751Gln, PCNA-6084-3’UTR, XRCC1-Arg194Trp,
XRCC1-Arg399Gln, XRCC3-17893-IVS6, XRCC3-Thr241Met, APEX-Asp148glu, ERCC1-
Asn118Asn, MGMT-127215, XPC-PAT.
TUMORE DEL POLMONE. Polimorfismo di APEX e risposta alla terapia. L’unico
polimorfismo che ha dato un risultato significativo (P=0.032) rispetto alla risposta alla terapia
è stato APEX 1738 G/T. APEX è un gene fondamentale coinvolto nel riparo del Base
Excision Repair. Sembrerebbe che il genotipo GG possa avere una prognosi migliore rispetto
ai genotipi GT+TT. Ciò potrebbe indicare che il BER svolga un ruolo più importante di quello
che si pensa anche nel riparo dei danni da cisplatino. Secondo la nostra ipotesi di partenza che
una risposta peggiore alla terapia possa essere dovuta anche ad un aumento di
espressione/funzione di un gene coinvolto nella riparazione dei danni da cisplatino, il
genotipo GG potrebbe invece riflettere una diminuita espressione o funzionalità del gene
APEX, ma sono necessari ulteriori studi per confermare questi dati.
Polimorfismo di PCNA e grado del tumore. Una differenza borderline è stata evidenziata
confrontando la prevalenza del polimorfismo PCNA-6084 C/G nei tre gruppi di grading
(P=0.051). Sembrerebbe che il genotipo GG sia associato ad un grading maggiore, mentre gli
individui eterozigoti CG sembrerebbero correlare maggiormente con un grading minore. In
questa casistica limitata non è presente nessun individuo omozigote CC. La sigla PCNA
bisogna ricordare che significa “proliferatine cell nuclear antigen” perché questa proteina è
stata sempre utilizzata come marcatore di proliferazione cellulare. E’ una proteina
indispensabile per il funzionamento di diverse polimerasi, tra cui quelle legate alla
324

eplicazione e proliferazione cellulare, oltre che alle polimerasi coinvolte nella riparazione del
DNA. Il fatto di trovare il genotipo GG associato al grading maggiore, potrebbe essere
verosimilmente legato al fatto che lo stesso genotipo potrebbe conferire un aumento di
espressione dello stesso gene PCNA o aumentarne la funzionalità. Nell’ambito della
continuazione di questo studio è prevista l’analisi di espressione anche del gene PCNA che
potrebbe aiutare a capire se può esistere tale correlazione.
Polimorfismo di XPC-PAT e stadio del tumore. Anche se il polimorfismo XPC-PAT
sembrerebbe essere associato allo stadio del tumore (P=0.012), purtroppo i numeri sono
troppo bassi per avere un’indicazione sufficiente di cosa succede nelle categorie di stadio
rispetto ai genotipi. Aumentando in futuro la casistica, potremmo effettuare lo stesso calcolo
vedendo se i risultati sono in linea quelli ottenuti sull’associazione di XPC-PAT DD ed
aumento di espressione di ERCC1, quindi prognosi peggiore, e probabilmente anche stadio
peggiore.
TUMORE TESTA-COLLO. Non è stato ancora possibile correlare i genotipi con la risposta
alla terapia poiché si stanno raccogliendo ancora i dati di follow-up relativi a questa casistica
prospettica.
ANALISI DELL’ESPRESSIONE DEI GENI DEL RIPARO DEL DNA
L’analisi di espressione è partita dallo studio del gene ERCC1 sul quale sono stati riportati i
risultati più interessanti in letteratura in relazione alla risposta alla terapia a base di cisplatino
nel tumore del polmone. Sia per la genotipizzazione che per l'analisi di espressione è stato
utilizzato il saggio 5' nucleasico (TaqMan), su uno strumento ABI-7000 (Applera) mediante
l’utilizzo di sonde MGB.
TUMORE DEL POLMONE. L’analisi di espressione eseguita su questi pochi casi non ha
evidenziato una differenza significativamente diversa di espressione di ERCC1 né in relazione
alla risposta alla terapia né rispetto a una casistica di 14 controlli sani. E’ stata inoltre
evidenziata una differenza di espressione significativamente maggiore di ERCC1 nel genotipo
XPC-PAT del/del rispetto agli altri due genotipi. XPC è uno dei geni principali coinvolti nel
riconoscimento dei danni riparati dal Nucleotide Excision Repair, il quale è a sua volta
coinvolto anche nel riparo dei cross-links prodotti dal trattamento con cisplatino. Il
polimorfismo XPC-PAT è costituito da una delezione/inserzione di una sequenza ripetuta
(poly-AT) ed è stato visto associare in letteratura con un maggior rischio di tumore squamoso
testa-collo, ma finora non era stata ancora indagata una possibile correlazione con
l’espressione del gene ERCC1. Nel nostro studio la forma doppio deleta (D/D) sembra essere
correlata con un aumento di espressione statisticamente significativo rispetto ai genotipi (I/D
+ II) che teoricamente potrebbe essere legata ad una risposta peggiore alla terapia. Purtroppo
in questo studio molto preliminare non abbiamo evidenziato una differenza significativa tra
aumento di espressione di ERCC1 e risposta alla terapia ma ciò potrebbe essere dovuto al
numero molto limitato di campioni analizzati.
TUMORE TESTA-COLLO. Come per i genotipi, non è stato ancora possibile correlare
l’espressione di ERCC1 con la risposta alla terapia poiché si stanno raccogliendo ancora i dati
di follow-up, mentre è stata evidenziata un’espressione significativamente maggiore di
ERCC1 nei linfociti prelevati prima del trattamento chemioterapico rispetto a 14 individui di
controllo sani (P=0.009).
Nell’ambito di questo studio sono stati quindi ottenuti dei risultati e una validazione
necessaria per impostare studi collaborativi multicentrici in modo da ottenere un numero di
pazienti sufficiente per testare le ipotesi sopra descritte.
325

Margherita Meda Filone tematico A4
Naturale è sempre salutare? Curarsi da soli con le piante officinali è una
soluzione o un problema in più?
Asl 1
Dipartimento di Prevenzione S.S. - Epidemiologia Educazione Sanitaria Responsabile
Considerando che sotto il generico termine di “medicina naturale” è di uso comune
racchiudere molte pratiche, che vanno dalla omeopatia alla pranoterapia, si è scelto di
indagare questo settore che si presenta agli utenti in modo confuso e confusivo. Si è stabilito
di iniziare l’indagine a partire dalla fitoterapia poiché sono sempre più numerose le persone
che scelgono di curarsi con le piante medicinali e, malgrado non vi sia molta informazione
scientifica su di esse, questi farmaci sono molto pubblicizzati. Si ritiene, inoltre, che il
passaparola che contraddistingue l’uso di questi farmaci, cosiddetti naturali, possa in realtà
rappresentare un rischio per i pazienti che li assumono in tutta tranquillità.
Attraverso la realizzazione di questo progetto si intende informare i consumatori sulle
caratteristiche principali dei farmaci maggiormente consumati; diffondere la conoscenza delle
possibili reazioni avverse; suggerire il comportamento corretto nell’assunzione dei fitofarmaci
generando consapevolezza nel consumo. Lo svolgimento del progetto “Naturale e’ sempre
salutare?
“Curarsi da soli con le piante officinali è una soluzione o un problema in più?” ha seguito il
seguente disegno:
1^ FASE
Come prima fase di lavoro si è presa visione del panorama offerto da Internet in quanto luogo
ove più facilmente e rapidamente i consumatori possono trovare notizie sulle piante officinali.
Si è proceduto alla realizzazione di una bibliografia dalle risorse elettroniche rilevata
attraverso Google, il motore di ricerca maggiormente utilizzato dagli utenti. A termine della
prima fase di lavoro, attraverso le informazioni e i dati rilevati dalle risorse informatiche e
dalla consultazione di alcuni testi, è stata strutturata una raccolta di schede tecniche suddivisa
per tipologia di piante officinali dalla A alla Z.
2^ FASE
Sono stati predisposti i contenuti per la realizzazione di pagine Web da inserire nel sito
dell’ASL 1 e per la eventuale futura realizzazione di materiale di informazione cartaceo.
3^ FASE
L’analisi dei bisogni è riconosciuta come momento fondamentale per la realizzazione di
interventi efficaci e, come è noto, è possibile compiere un’analisi utilizzando diversi strumenti
la cui scelta è anche influenzata dal budget disponibile. Si è stabilito di iniziare l’indagine
presso alcuni punti vendita di piante officinali, farmacie – erboristerie – supermercati, ed è
stato costruito un questionario strutturato per realizzare l’indagine.
326

Adalberto Merighi Filone tematico A6
Correlazione fra condizioni di stabulazione e sviluppo postnatale del
sitema nervoso centrale in animali da esperimento
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Morfofisiologia Veterinaria
OBIETTIVI
Il progetto aveva come scopo primario la valutazione degli effetti dell’arricchimento
ambientale sullo sviluppo post-natale dell’encefalo in animali da esperimento, allo scopo di:
1. fornire basi scientifiche e razionali per poter giustificare la realizzazione di stabilimenti di
stabulazione in cui gli animali vivano in condizioni ottimali;
2. verificare l’esistenza di una correlazione fra arricchimento ambientale e miglioramento di
alcuni parametri di tipo istologico relativi alla proliferazione e morte neuronale.
Secondariamente ci si proponeva di sviluppare metodiche alternative allo studio in vivo che
consentissero di ridurre al minimo il numero di animali sperimentali.
MATERIALI E METODI
Gli esperimenti del primo anno della ricerca sono stati eseguiti presso uno stabilimento
utilizzatore di tipo tradizionale, quelli effettuati durante il secondo anno sono stati condotti
presso lo stabilimento utilizzatore del Dipartimento di Morfofisiologia Veterinaria
dell’università di Torino in cui gli animali sono stabulati in condizioni di arricchimento
ambientale (spazi più ampi di quelli minimi prescritti dalla normativa vigente, aggiunta di
ruote girevoli, gallerie, labirinto, materiale per costruzione di nidi, somministrazione di
alimenti particolarmente appetitosi). In una prima fase si è messo a punto un sistema
coltivazione in vitro di fettine di cervelletto post-natale. La procedura utilizzata comporta la
soppressione eutanasica dell’animale, l’immediata rimozione del cervelletto che viene
sezionato a circa 400 µ e quindi coltivato in condizioni statiche su inserti in plastica. Questi
ultimi sono costruiti in maniera tale per cui la fettina poggia con la faccia inferiore su una
biomembrana, mentre la faccia superiore è libera. I nutrienti contenuti nel medium di coltura
vengono quindi a contatto con il tessuto dal basso, attraverso la membrana, mentre l’ossigeno
necessario al normale metabolismo cellulare permea la faccia superiore della fettina. Il
medium di coltura utilizzato è costituito da: medium di Eagle, soluzione salina bilanciata di
Hanks, siero normale di vitello, glutamina e antibiotici. Il pH è mantenuto in atmosfera di
CO2. Con tale sistema è risultato possibile ottenere un numero variabile dalle 6 alle 15 fettine
per ogni cervelletto. Studi istologici e elettrofisiologici hanno dimostrato che le colture
mantengono la normale architettura cerebellare e le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni.
Poiché ciascuna fettina può essere sottoposta a trattamenti sperimentali differenti risulta
evidente come il numero di animali necessario alla sperimentazione possa essere
notevolmente ridotto. In questo modello è stato studiato l’effetto dell’arricchimento
ambientale sulla sopravvivenza delle colture. E’ stato possibile osservare come le colture
ottenute da animali precedentemente mantenuti in ambiente arricchito attecchissero meglio e
presentassero un’architettura della corteccia cerebellare meglio preservata. Si è quindi
proceduto alla valutazione degli effetti dell’arricchimento ambientale sull’efficienza delle
tecniche di trasferimento genico nelle colture organotipiche allestite come precedentemente
descritto. Le tecniche di trasferimento genico comportano l’introduzione di uno o più geni
327

esogeni all’interno delle cellule. In tale modo risulta possibile valutare, ad esempio, il ruolo
funzionale di una proteina aumentandone o diminuendone i livelli di espressione. Il
trasferimento genico in cellule postmitotiche, quali sono i neuroni differenziati, è
particolarmente problematico; ulteriormente complesso è il trasferimento genico in fettine di
tessuto rispetto alle cellule isolate. Per studiare il ruolo funzionale, nello sviluppo postnatale
dei neuroni della proteina BCL-2, uno dei fattori antiapoptotici meglio caratterizzati nelle
cellule di mammifero, sono stati eseguiti esperimenti di trasferimento genico utilizzando un
plasmide (transfezione) che codifica per una proteina di fusione costituita da BCL-2 e da una
molecola fluorescente (Enhanced Yellow Fluorescent Protein – EYFP). Per procedere alla
transfezione è stata utilizzata una procedura di trasferimento genico mediata da particelle, che
comporta l’introduzione del DNA esogeno (plasmide) all’interno della cellula dopo
adsorbimento su microparticelle d’oro colloidale. Queste ultime presentano una massa
sufficiente ad attraversare la membrana cellulare dopo essere state accelerate tramite un getto
di elio ad alta pressione. L’analisi quantitativa dei risultati della transfezione in colture
ottenute da animali sottoposti ad arricchimento ambientale e da animali di controllo ha
dimostrato che la densità di cellule transfettate (numero di cellule che esprimono la proteina
di fusione/area) è superiore nelle colture dopo arricchimento ambientale.
RISULTATI
I risultati indicano chiaramente che il mantenimento degli animali in condizioni di
arricchimento ambientale consente un’ottimizzazione dei risultati delle indagini sperimentali,
molto probabilmente a seguito della riduzione/scomparsa delle condizioni di stress
individuale e sociale cui gli animali sono comunque sottoposti all’interno degli ambienti di
stabulazione. Indagini tuttora in corso sono volte a stabile gli effetti della sovraespressione
della proteina BCL-2 sulla sopravvivenza neuronale nelle colture organotipiche mantenute in
condizioni di depolarizzazione (KCl 25 mM). Tutti questi esperimenti vengono ormai
routinariamente effettuati a partire da animali mantenuti in condizioni di arricchimento
ambientale. In conclusione gli esperimenti effettuati nell’ambito di questo progetto
dimostrano la possibilità di ridurre il numero di animali sperimentali tramite l’impiego di
tecniche ex vivo (colture organotipiche) che, a differenza delle colture di cellule isolate,
consentono di analizzare popolazioni cellulari miste, le quali mantengono, almeno in parte,
inalterati i rapporti spaziali e le connessioni funzionali reciproche. Essi dimostrano inoltre una
correlazione positiva fra miglioramento delle condizioni di stabulazione e la percentuale di
successo degli esperimenti.
PUBBLICAZIONI (solo articoli ISI)
LOSSI L., CANTILE C., TAMAGNO I., MERIGHI A. (2005). Apoptosis in the mammalian
CNS: Lessons from animal models. VET.J. 170, 52-66
LOSSI L., GAMBINO G., MIOLETTI S., MERIGHI A. (2004). In vivo analysis reveals
different apoptotic pathways in pre- and postmigratory cerebellar granule cells of rabbit.
J.NEUROBIOL. 60, 437-452
LOSSI L., TAMAGNO I., MERIGHI A. (2004). Molecular morphology of neuronal
apoptosis: analysis of caspase 3 activation during postnatal development of mouse cerebellar
cortex. J.MOL.HISTOL. 35, 621-629.
Prodotti della ricerca ·
- Tecniche di coltivazione su biomembrane di tessuto nervoso postnatale ·
- Tecniche di transfezione di neuroni postmitotici
328

Giuseppe Migliaretti Filone tematico D3
Asma e inquinamento nella popolazione pediatrica: riduzione dei ricoveri
legata ad una diminuzione dell’esposizione
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia
OBIETTIVO
Obiettivo dello studio era analizzare la relazione tra inquinamento urbano e ricoveri
ospedalieri per asma nella popolazione pediatrica torinese, mediante un disegno Caso-
Controllo, proponendo una stima dell’aumento del rischio di asma determinato dall’aumento
dei livelli di inquinamento.
METODI E RISULTATI
La base dati dello studio, tratta dall’archivio regionale delle schede di dimissione ospedaliera
(SDO), è costituita dai 26.583 ricoveri di pazienti residenti a Torino con età inferiore a 15
anni avvenuti nel periodo 1997-1999. Sulla base della diagnosi principale (ICD IX), sono stati
definiti come Casi i 1.060 ricoveri per Asma (ICD-IX 493) e come Controlli i 25.523 ricoveri
di pazienti con diagnosi diverse da malattie dell’apparato respiratorio (ICD-IX 460-487, 490-
492, 494-496 e 500-519) e cardiache (ICD-IX 390-405 e 410-429). Lo studio si concentra sui
pazienti in età pediatrica in quanto alcune malattie dell’apparato respiratorio, come l’asma,
presenta sindromi di diversa natura tra i bambini rispetto agli adulti o agli anziani. Le
informazioni riguardanti i livelli di inquinamento derivano dalle rilevazioni delle 10 centraline
dislocate sull’area cittadina e gestite dall’ARPA, settore Qualità dell’Aria.
Nello studio sono stati considerati come principali indicatori dell’inquinamento da traffico
urbano il Biossido di azoto (NO2) e le Polveri sospese totali (PTS). Come confermato dalla
letteratura, la media calcolata sulla base del valore rilevato nel giorno del ricovero e nei 3
giorni precedenti, è stato considerato come il miglior indicatore del livello di esposizione
attribuibile a ciascun soggetto in studio. Nello studio sono stati considerati come fattori di
confondimento la stagionalità, classificando il mese di ricovero come Estate (Aprile-
Sttembre) o Inverno (Ottobre-Marzo), la temperatura (oC), l’umidità (media giornaliera), la
irraggiamento solare (numero di ore/giorno), giorno della settimana in cui è avvenuto il
ricovero (1: Lunedì – 7: Domenica) e festività (1: Lavorativo – 2: Festivo), sesso (1: Maschi –
2: Femmine) ed età del paziente. Il rischio di ricovero per asma, aggiustato per i fattori di
confondimento considerati, è stato stimato mediante modelli di Regressione Logistica, ed
espresso in termini di incremento percentuale del rischio all’aumento di 10microg/m3 e
relativo Intervallo di Confidenza al 95%.
I Risultati mettono in evidenza un incremento medio di ricoveri per asma del 2.8% (IC95%:
0.07-4.09%) e del 1.8% (IC95%: 0.03-3.02%) determinati da un aumento di g/m3
dell’esposizione a NO2 e TSP rispettivamente. Le analisi condotte separatamente per i
pazienti di età

dell’inquinamento urbano sulla salute e proponendo inoltre una stima dell’aumento del rischio
di ricovero determinato dall’aumento dei livelli di inquinamento urbano.
PUBBLICAZIONI
Elenco delle pubblicazioni e presentazioni a Congressi relative alla presente ricerca
Migliaretti G., Cavallo F. Urban air pollution and asthma in children. Pediatr Pulmonol. 2004
Sep;38(3):198-203.
Migliaretti G., Cavallo F. Riduzione del rischio di Asma e inquinamento nella popolazione
pediatrica torinese. Siti, Genova 20-23 ottobre 2004
Migliaretti G., Cavallo F. Asma e inquinamento da traffico nella popolazione pediatrica
torinese. AIE, Torino 15-18 settembre 2004 4 Migliaretti G., Cavallo F. Traffic air pollution
and hospital admission for asthma: a case-control approach in population of Turin (Italy). [In
press on International Archives of Environmental and Occupational Health]
330

Roberto Miniero Filone tematico A4
Obesità infantile in Piemonte: informatizzazione e percorsi diagnosticoterapeutici
comuni nelle strutture ospedaliere
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche
E’ attivata in Piemonte una task-force dei pediatri universitari ed ospedalieri (Gruppo
Piemontese per lo Studio dell’Obesità Infantile –GPSOI) che operano nel settore, al fine di
avere un percorso comune per la prevenzione ed il trattamento dell’ Obesità Infantile e si è
quindi costituita una RETE REGIONALE che coinvolge tutte le pediatrie universitarie ed
ospedaliere del Piemonte per creare una base operativa su cui impostare programmi di studio
ed assistenziali comuni. I dati di questo studio confermano una capacità di arruolamento tra i
1000 e 1500 nuovi pazienti /anno. Abbiamo creato un modello di intervento diagnosticoterapeutico
per il bambino e l’adolescente affetto da obesità medio-grave, condiviso da tutte le
strutture ed applicato quindi in modo omogeneo in tutta la Regione. Abbiamo quindi
identificato dei parametri clinico-laboratoristici di primo livello, cui sottoporre tutti i pazienti
elegibili allo studio, identificare dei criteri comuni di monitoraggio e follow-up, nonché criteri
comuni di intervento terapeutico. Abbiamo identificato le indagini di secondo livello cui
sottoporre solo i casi selezionati in base ai parametri di gravità dell’obesità, e identificare per
questa categoria di pazienti modalità di approccio diagnostico e terapeutici specifiche.
Abbiamo, infine, creato una cartella clinica comune cartacea per usufruire di uno strumento
clinico condiviso per la raccolta dei dati ed abbiamo sviluppato la cartella informatizzata
mediante Access XP modulare disponibile per tutti i centri aderenti al progetto ma disponibile
per qualunque altro fosse interessato ad utilizzarla.
331

Francesco Monaco Filone tematico C2
Strumento di valutazione informatizzato delle prestazioni riabilitative
neuromotorie e muscoloscheletriche
Silenziosi Operai della Croce C.F.P.
Con questa relazione si riassumono i risultati ottenuti dall’implementazione di un software
che ha permesso di informatizzare il processo di documentazione delle terapie praticate
durante tutta la durata della degenza del paziente all’interno della Casa di Cura “Mons. L.
Novarese”.
Da un punto di vista tecnico, il suddetto programma è stato realizzato in ambiente Access e
collegato ai già esistenti programmi (“Accettazione”) con la possibilità di creare dei data base
“user friendly” utili ad un coinvolgimento in network di tutti gli operatori dell’equipe
riabilitativa. Tale programma, infatti, risulta in grado di estrapolare le generalità dei ricoverati
aggiornate dall’Accettazione ricoveri e di creare per ciascun degente una cartella
personalizzata funzionante come memoria e documentazione storica dei dati. La cartella
presenta immediatamente l’accesso al “Diario Fisiatrico” con la possibilità di documentare
anamnesi, diagnosi, valutazione fisiatrica, progetto riabilitativo e scala Barthel. Già in questa
fase si attivano i corrispondenti settori di riabilitazione interessati al caso in questione.
Pertanto, attraverso un sistema di password d’accesso, i terapisti della riabilitazione
(fisioterapisti e logopedisti) possono accedere alla loro area di interesse: “Diario
Fisioterapico” e “Intervento Logopedico”.
L’area fisioterapica prevede un elenco aggiornato di tecniche riabilitative alle quali
corrispondono i tempi fissati dalle delibere regionali. Attraverso l’automatismo del
programma, il terapista che seleziona le terapie svolte, andrà ad alimentare la compilazione
del “Diario Fisioterapico” che conterrà pertanto la data giornaliera, il tipo di terapia effettuata,
la durata della stessa e il terapista responsabile. Questo metodo permette in primo luogo di
poter accedere a tutte le aree per avere con efficienza e attendibilità le informazioni necessarie
sul percorso riabilitativo in atto, aggiornato costantemente dagli operatori. In secondo luogo
permette di snellire le procedure di comunicazione evitando l’utilizzo di moduli cartacei
circolanti per tutta la durata di degenza dell’ospite. Il programma sostituirà la versione
cartacea che comunque, in qualsiasi momento, potrà essere disponibile attraverso la stampa
dei dati inseriti. Durante i primi mesi di progettazione e utilizzo del software, si sono create
alcune esigenze che hanno portato ad un’evitabile modifica di alcuni moduli del programma.
Per motivi di priorità all’accesso dei dati, si venivano a creare dei conflitti tra l’operatore del
database dell’Accettazione ricoveri e gli operatori dei Diari Terapici (Medici Fisiatri,
Fisioterapisti e in futuro Logopedisti). Per risolvere questo problema si è ritenuto necessario
sostituire il collegamento costante esistente tra Diari Terapici e database dell’accettazione con
un collegamento limitato al tempo necessario per l’importazione dei dati dei pazienti. Il
momento dell’aggiornamento viene stabilito dall’operatore. Inoltre, per motivi logistici si è
ritenuto opportuno separare i singoli Diari contenuti nel database Diari Terapici generando i
seguenti database: Diari Fisiatrici (Medici); Diari Terapici (Fisioterapisti); Diari Logopedico
(Logopedisti). I vantaggi emersi dall’applicazione di tecnologie informatiche per aumentare la
sicurezza e l’attendibilità dei dati, sono costituiti dalla prevenzione di eventi avversi e dalla
fornitura di feed-back rapidi; si pongono in essere le c.d. “forcing functions” (azioni che
forzano il sistema) importanti per arginare fenomeni di distrazione dovuti a stress o carichi
eccessivi di lavoro. Questi sistemi forzano e guidano l’operatore ad eseguire le attività con
modalità prestabilite e non danno la possibilità di saltare passaggi chiave, evidenziando
all’occorrenza possibili errori e situazioni di rischio.
332

Pertanto possiamo così riassumere i vantaggi ottenuti:
• valutazione adeguata del carico di lavoro e assegnazione degli obiettivi specifici;
• raccolta di informazioni dettagliate riguardo alle risorse umane impiegate (es singoli
fisioterapisti operanti);
• miglioramento dei livelli di utilizzo delle attrezzature medico-sanitarie, tramite il report
della tipologia e dei tempi di utilizzo, e degli ausili dati in dotazione;
• immediatezza del monitoraggio delle prestazioni riabilitative residenziale tramite la
disponibilità di dati quali il tempo riabilitativo dedicato al singolo degente, il terapista di
riferimento per singole attività di recupero, il tempo di utilizzo delle attrezzature e degli
ausili.
Parallelamente ai Diari Terapici, si sono inoltre sviluppati alcuni moduli integrativi:
1. il database “Intervento Logopedico”;
2. il database Diari Infermieristici per la raccolta di dati relativi alla normale attività
infermieristica quotidiana (esami obiettivi, esami richiesti, terapie, consulenze, avvisi, rx
ecc…). I dati anamnestici e diagnostici sono consultabili sullo stesso programma grazie al
collegamento in rete locale al database Diari Fisiatrici;
3. un collegamento fra il database di Manutenzione delle apparecchiature e i Diari
Fisioterapici ed Infermieristici per poter sfruttare il dato relativo al tempo di utilizzo delle
attrezzature;
4. controllo della Gestione Ausili durante il periodo di ricovero con indicazione della
tipologia di ausilio attribuita e della data del prestito.
Il Programma Diari Fisiatrici si presenta a schede Scheda Anamnesi e Diagnosi del singolo
paziente che i Medici vanno a compilare all’ingresso del paziente. Scheda Barthel Index
modificata (con l’aggiunta delle tre voci finali riguardanti la Comprensione, l’Espressione e la
Deglutizione) che verrà compilata all’ingresso, durante la degenza facendo riferimento alla
previsione di miglioramento o stabilità, e alla dimissione del paziente. Scheda Programma
Riabilitativo, ancora contenuta nel Programma Diari Fisiatrici viene utilizzata per stabilire il
programma riabilitativo che viene condiviso e seguito dall’equipe riabilitativa dei
Fisioterapisti e dei Logopedisti.
Il Programma Diari Fisioterapici viene utilizzato esclusivamente dai Fisioterapisti. I record da
compilare sono relativi alla data, ora, tipo di terapia, tempo di durata della terapia e terapista
responsabile. L’automatismo permette di avere un feed-back immediato sulla durata totale
della prestazione giornaliera dedicata al paziente.
333

Guido Monga Filone tematico A2
Il ruolo dei polyomavirus umani e di SV40 nella insorgenza e nello
sviluppo dei tumori del sistema nervoso centrale
Università “A. Avogadro” del Piemonte Orientale
Dipartimento di Scienze Mediche
OBIETTIVO
L’obiettivo del presente progetto di ricerca è stato quello di valutare presenza, genotipo e
possibile ruolo etiopatogenetico dei polyomavirus umani JCV e BKV e di SV40 nelle
neoplasie cerebrali e meningee.
MATERIALI E METODI
Lo studio ha coinvolto le Divisioni di Neurochirurgia (per valutazione clinica, intervento
chirurgico e follow-up dei pazienti arruolati nello studio), di Anatomia Patologica (per
definizione istologica della patologia, raccolta e processazione dei tessuti e dei campioni
biologici, estrazione di DNA) dell’Azienda Ospedaliera Maggiore della Carità di Novara, il
Laboratorio di Virologia dell’IRCCS Don Gnocchi di Milano (indagini molecolari quali
amplificazione genomica per ricerca di DNA virale, genotipizzazione, amplificazione di RNA
messaggero virale) il laboratorio di Neurovirologia della Temple University di Philadelphia
(analisi di sequenza, interpretazione risultati). Nel corso dello studio sono stati valutati 32
pazienti con neoplasia cerebrale primitiva (24 maschi, 8 femmine, età media 56 anni
compresa tra 31 e 78 anni) e 8 con meningioma (8 femmine, età media 70 anni, compresa tra
57 e 83 anni), tutti sottoposti a resezione chirurgica a scopo diagnostico e/o terapeutico,
presso la Divisione di Neurochirurgia dell’Ospedale Maggiore della Carità di Novara.
In tutti i casi sono stati esaminati campioni tissutali neoplastici (min 4, max 8), sia dal punto
di vista istologico, sia da quello molecolare, secondo il seguente schema:
• fissazione in formalina e processazione secondo metodi routine per la diagnostica
istopatologica;
• congelamento rapido di un frammento per indagini molecolari;
• conservazione in liquido RNA later per indagini su RNA messaggero virale
E’ stato inoltre tecnicamente possibile prelevare campioni di liquido cefalo-rachidiano (in
corso di intervento chirurgico, prelevato da una cisterna cerebrale), in 25 pazienti con
neoplasia cerebrale. Sono stati inoltre prelevati 33 campioni di sangue periferico da soggetti
con neoplasia cerebrale e meningioma, così processati: -
• estrazione di DNA;
• amplificazione di DNA virale;
• genotipizzazione.
Le regioni genomiche virali studiate sono state:
• Regione codificante l’antigene tumore associato (LT)
• Regione codificante per agnoproteina (Agno)
334

• Regione regolatoria non trascrizionale (TCR)
• Regione codificante proteine capsidiche (VP1).
RISULTATI
Sulla base di criteri istologici WHO sono stati diagnosticati 21 glioblastomi (WHO grado IV),
5 astrocitomi (WHO grado II), 2 ependimomi (WHO grado II), 2 oligodendrogliomi
anaplastici (WHO grado III), 1 gangliocitoma (WHO grado I), 1 pineoblastoma (WHO grado
IV) e 8 meningiomi.
Per quanto riguarda le indagini molecolari, DNA di polyomavirus (regione LT) è stato
evidenziato nel 50% dei campioni tessutali, nel 12% dei campioni di liquor e nel 3% dei
campioni di sangue. Per la suddivisione della positività di LT rispetto all’istotipo tumorale e
la frequenza rispettiva di JCV, BKV, si guardi la TABELLA1
TABELLA 1.
Isotipo
Tessuto
tumorale
JCV LT BKV LT
335
Liquor
Sangue
periferico
Tessuto
tumorale
Astrocitoma 1/5 (20%) 1/5 (20%) 0/4 1/5 (20%)
Ependimoma 0/2 0/2 0/2 0/2
Gangliocitoma 0/1 0/1 0/1 0/1
Glioblastoma 11/21 (52.4%) 2/11 (18.2%) 1/17 (5.9%) 2/21 (9.5%)
Oligodendroglioma 1/2 (50%) 0/1 0/1 0/2
Pifleoblastoma 0/l / / 0/1
Meningioma 3/8 (40%) 0/5 1/8 3/8 (37.5%)
Totale 16/40 (400/0)
3/25 (12%)
1/33 (3%) 6/40 (15%)
Tutti i campioni risultati positivi all’amplificazione di LT (sia di JCV sia di BKV) sono stati
sottoposti ad amplificazione per VP1, TCR, Agno e mRNA di LT, per valutare
rispettivamente genotipo virale, riarrangiamenti a potenziale significato oncogeno ed
espressione di proteina tumore-associata (LT). I risultati sono espressi in TABELLA 2.
I dati ottenuti nello studio evidenziano una elevata frequenza di identificazione di genoma
virale di PV nelle neoplasie cerebrali umane; tra le neoplasie cerebrali testate, genoma virale è
stato identificato più frequentemente nei glioblastomi, e il genotipo prevalente è risultato JCV
(sottotipi 1A e 1B); raramente si sono identificate sequenze genomiche di BKV mentre DNA
di SV40 non è mai stato identificato. L’analisi di sequenza della regione TCR di JCV ha
evidenziato riarrangiamenti significativi, identificando il ceppo virale Mad 4, che studi su
animali di laboratorio hanno sicuramente indicato come oncogeno.
Di particolare rilievo è stata inoltre la valutazione della espressione di mRNA codificante la
proteina virale tumore associata (LT), risultata positiva in 5 di 8 glioblastomi testati. Poiché
tale proteina risulta direttamente coinvolta nella cancerogenesi, attraverso legami inattivanti
proteine codificate da geni oncosoppressori, quali p53 e pRB, e nella progressione
astrocitoma-glioblastoma è dimostrata una progressiva perdita di funzione di p53, la presenza
di JCV e la espressione di mRNA di LT potrebbe costituire un importante fattore o cofattore
patogenetico in questo tipo di neoplasie cerebrali.

E’ ovvio che lo studio di un numero così limitato di campioni (dovuto anche alla rarità di
questo tipo di neoplasie) non consente di trarre definitive conclusioni circa il nesso etiologico
o patogenetico tra infezione da polyomavirus, e neoplasie cerebrali; tuttavia l’osservazione
che tali virus –oncogeni in animali da laboratorio- si identifichino con diversa frequenza nei
vari tipi di neoplasie cerebrali e che alcune regioni genomiche chiave per la replicazione
virale siano mutate e che la proteina LT sia variabilmente espressa nelle varie neoplasie
suggerisce che la loro presenza nell’ambito dei alcuni tumori cerebrali non sia casuale ma
possa contribuire al loro sviluppo o progressione.
I risultati di questo studio sono stati sottoposti per la pubblicazione al Journal of Medical
Virology.
TABELLA 2
Campione
JCV BKV
Istotipo LT Agno VPl TCR
336
mRNA
LT
1 Glioblastoma + + lA Mad 4 + -
2 Glioblastoma + + lA Mad 4 + -
3 Glioblastoma + + lB - + -
4 Glioblastoma + + lB Archet + -
5 Glioblastoma + + lA - - -
6 Glioblastoma + + 2C - n.d -
7 Glioblastoma + - lA Mad 4 + -
8 Glioblastoma + + - - - -
9 Glioblastoma + n.e. - - n.e -
10 Glioblastoma + n.e n.e n.e n.e -
11 Glioblastoma + n.e. - - - -
12 Glioblastoma - n.e n.e n.e n.e. +
13 Glioblastoma - n.e. n.e. n.e. n.e +
14 Astrocitoma + - 1B - + -
15 Astrocitoma - n.e. n.e. n.e. n.e. +
16 Oligo + n.e. lA - n.e. -
17 Meningioma + - 1B - - +
18 Meningioma + + lA Mad 4 + +
19 Meningioma + n.e. - - - -
20 Meningioma - n.e. n.e. n.e. n.e. +
n.e=Non esaminato
LT

Franco Mongini Filone tematico A4
Analisi dei fattori di rischio delle cefalee e del dolore facciale in una
comunità di lavoro
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Fisiopatologia Clinica
OBIETTIVI
Considerato che le patologie caratterizzate da cefalea e dolore cranico e facciale sono
frequenti in una popolazione così detta “normale” rappresentano un problema in via di
incremento obiettivo della nostra ricerca sono stati i seguenti:
1. individuare e quantificare i più frequenti fattori predisponenti e scatenanti della cefalea e
del dolore facciale in una comunità di lavoro sufficientemente estesa;
2. elaborare adeguate strategie di prevenzione;
3. valutare i risultati raggiunti a distanza di tempo medio lunga.
MATERIALI E METODI
La comunità di lavoro oggetto della presente ricerca è stata costituita da personale
impiegatizio del Comune di Torino. Sono stati costituiti due gruppi (gruppo 1 e 2) di circa 200
soggetti per gruppo simili per età, distribuzione per sesso e caratteristiche dell'attività
lavorativa. Per tutti i soggetti sono stati raccolti mediante schede appropriate e intervista
strutturata i seguenti dati:
• presenza, intensità e durata di cefalea e/o dolore facciale e/o dolore cervicale;
• presenza e rilevanza di stressor attuali o pregressi;
• prevalenza di sintomi a carattere psicosomatico.
Sì è poi proceduto a un esame clinico dei soggetti comprendente: anamnesi, visita neurologica
e del distretto Craniofacciale. A tutti i soggetti è stato consegnato mensilmente un diario su
cui segnare su base giornaliera intensità (scala 0-5), e durata di dolore cefalico, facciale o
cervicale. Dopo due mesi al gruppo 1 sono state eseguite conferenze esplicative e sedute
dimostrative, ripetute a cadenza regolare, relative ai più frequenti fattori che possono favorire
o indurre cefalea e dolore craniofaciale e alle metodiche che il paziente può porre in atto per
ridurne l’impatto. Sì è anche proceduto alla proiezione di brevi filmati in cui venivano
dimostrati alcuni esercizi utili alla prevenzione e al trattamento delle forme più leggere. A
ogni soggetto è stata distribuita una scheda informativa con testi e disegni relativi al
programma di esercizi da eseguire. I diari relativi ai tre parametri considerati (frequenza,
intensità, durata del dolore craniofacciale e cervicale) sono stati successivamente raccolti per
ulteriori quattro mesi I dati ottenuti nei due gruppi sono stati paragonati con adeguati
strumenti statistici (t di Student, ANOVA ecc)
RISULTATI
In ambedue i gruppi la prevalenza di soggetti con dolore a capo e/o faccia e/o collo ha
superato l’85%. Nei primi due mesi in cui non sono state date istruzioni i parametri
337

considerati non presentavano differenze statisticamente significative tra il gruppo di studio e
quello di controllo. Nei quattro mesi successivi si è registrata una progressiva diminuzione dei
parametri del dolore (cranico, facciale e cervicale) del gruppo di studio (gruppo 1) mentre i
dati sono rimasti sostanzialmente invariati nel gruppo di controllo (gruppo 2). Le differenze
tra i due gruppi hanno raggiunto un grado di significatività statistica (p < 0.05, o 0.01) per
tutti e tre i parametri negli ultimi tre mesi dello studio.
CONCLUSIONE
I risultati ottenuti dimostrano che è possibile impostare nelle comunità di lavoro un’attività di
prevenzione delle patologie caratterizzate da cefalea e dolore facciale e cervicale. Tale attività
permette di ottenere risultati molto consistenti con mezzi relativamente semplici ed economici
e possiede quindi un carattere fortemente innovativo.
338

Giuseppe Montrucchio Filone tematico A2
Valutazione del ruolo della trombopoietina come fattore di rischio
nell'epatocarcinoma e nell'epatoblastoma
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Fisiopatologia Clinica
CONTESTO E RAZIONALE
Il carcinoma epatocellulare (HCC) rappresenta una delle neoplasie più frequenti e la causa di
circa 1 milione di morti per anno su scala mondiale. Il tasso di recidiva è infatti
drammaticamente alto anche in pazienti che sono stati sottoposti a terapia chirurgica o
medica. La terapia anti-angiogenetica rappresenta un potenziale nuovo approccio terapeutico.
L'HCC, in quanto tumore ipervascolarizzato, è infatti un modello ideale per lo studio di tale
terapia. Dati preliminari del nostro laboratorio dimostrano che l'abilità pro-angiogenetica in
vivo del medium condizionato di colture primarie di epatoblastoma umano e di linee
stabilizzate di HCC umano correla con la concentrazione di trombopoietina (TPO). La TPO è
un fattore di crescita di produzione epatica, originariamente identificato come linea-specifico
per la sua azione di stimolo delle megacariocitopoiesi, in grado di stimolare, attraverso il
legame con il recettore c-Mpl, la migrazione delle cellule endoteliali ed indurre una risposta
angiogenetica.
OBIETTIVO
Scopo del presente progetto di ricerca è stato pertanto quello di valutare l’espressione del
recettore per la TPO (c-Mpl) nel tessuto epatico normale, cirrotico ed in HCC.
MATERIALI E METODI
I campioni di fegato sono stati ottenuti da:
a) donatori di trapianto epatico, in cui l'esame istologico non aveva evidenziato lesioni o
alterazioni significative del parenchima e dell'architettura epatica, considerati fegati
normali (N=10);
b) pazienti sottoposti a trapianto epatico perché affetti da cirrosi (N=25) e la cui
eziopatogenesi era riconducibile ad infezione virale da virus C (HCV, N=19) o da virus B
dell’epatite (HBV, N=6);
c) pazienti sottoposti a trapianto epatico oppure a resezione chirurgica di HCC (N=10), ad
eziopatogenesi virale, ed in particolare da infezione da HCV (N=5) o da HBV (N=3), o ad
eziopatogenesi incerta (N=2).
In tutti i casi è stato eseguito esame istologico con colorazioni Ematossilina-eosina, PAS,
PAS-Diastasi e Tricromica di Masson, per verificare morfologicamente la diagnosi di
normalità, di cirrosi e di HCC ed escludere altre patologie specifiche (ad es. deficit di alfa-1antitripsina).
Le successive indagini immunoistochimiche sono state quindi eseguite sui
campioni così individuati utilizzando anticorpi monoclonali specifici per il c-Mpl e per
l'antigene endoteliale CD31, come marcatore angiogenetico.
339

La valutazione dei risultati è stata effettuata applicando uno score semiquantitativo variabile
tra 0 e 4, correlabile all’estensione della immunoreattività, ed in particolare:
a) score 0 in assenza di immunoreazione (reazione negativa);
b) score 1 per immunoreattività estesa fino al 25% del tessuto esaminato (positività focale);
c) score 2 se compresa tra >25 e 50% (positività plurifocale);
d) score 3 se compresa tra >50 e 75% (positività plurifocale/diffusa);
e) score 4 se >75% (positività estesa/totale).
Inoltre è stata valutata qualitativamente la localizzazione dell’immunoreattività del c-Mpl e
del CD31 nei tre gruppi studiati. Come riportato in tabella, è stato osservato un incremento
statisticamente significativo dell’immunoreattività sia per il c-Mpl che per il CD31 negli HCC
rispetto ai casi normali ed alla patologia cirrotica (* normali vs cirrosi o HCC P

Bruno Morra Filone tematico C2
Trattamento integrato della patologia allergica naso-sinusale
ASO S. Giovanni Battista
OBIETTIVI
Lo studio in oggetto si è proposto di sviluppare un sistema integrato di raccolta dei dati clinici
e di laboratorio concernenti pazienti affetti da poliposi nasosinusale, patologia questa che
rappresenta una condizione morbosa particolarmente complessa per la sovrapposizione – nella
sua eziologia – di più fattori (fra cui l’allergia ed i processi infettivi).
Per ottenere il risultato che ci eravamo prefissi si sono dovuti raggiungere obiettivi sia
assistenziali sia specifici: l’obiettivo assistenziale raggiunto è rappresentato dalla creazione
di un ambulatorio integrato allergologico-otorinolaringoiatrico (l’unico esistente finora in
Piemonte, a quanto ci risulti) in cui venissero visitati collegialmente pazienti affetti da
patologia nasosinusale: oltre trecento pazienti sono già stati finora indagati in modo
collegiale. Quindi ai pazienti affetti da rinosinusopatia cronica è stato garantito presso l’Az.
Osp. San Giovanni Battista di Torino un “polo di riferimento assistenziale” cui rivolgersi per:
a) valutazione diagnostica integrata (allergologica, orl e, in casi selezionati, pneumologica)
dello stato allergico; b) prescrizioni diagnostiche/terapeutiche, monitoraggio dell’andamento
dei sintomi; c) prevenzione dei fattori ambientali di scatenamento della sintomatologia
allergica; d) indicazioni all’eventuale trattamento chirurgico e valutazione postoperatoria con
modulazione del trattamento farmacologico per il controllo di eventuali recidive.
Gli obiettivi specifici del progetto che ci eravamo prefissati e che sono stati conseguiti hanno
comportato l’acquisizione e l’elaborazione dei dati relativi ai pazienti trattati attraverso la
documentazione oggettiva dei quadri patologici con tecniche endoscopiche e con
memorizzazione delle immagini e la creazione di una scheda clinica in cui integrare le
informazioni derivanti dall’esame endoscopico con quelle dell’imaging e con i dati
immunologici.
MATERIALI E METODI
Per lo sviluppo delle fasi progettuali ed il conseguimento degli obiettivi si è dovuto ricorrere
alla progettazione ex-novo di un software dedicato ed all’adattamento di una scheda video
industriale, i cui costi di sviluppo delle librerie di gestione erano decisamente inferiori a
quelle di analoghi modelli utilizzati in sistemi medicali ove la disponibilità di librerie di
gestione era inadeguata o molto costosa. Oltre a sviluppare ed adattare una scheda video
utilizzata per applicazioni industriali ai sistemi di videoendoscopia utilizzati in ambito clinico
ed a testare che la qualità delle immagini così acquisite fosse soddisfacente per l’uso clinico,
si è dovuto procedere a mettere a punto una scheda nosologica che consentisse di integrare i
dati derivanti dalle varie metodiche diagnostiche abitualmente utilizzate nello studio e
nell’inquadramento ai fini terapeutici di tali pazienti ed a creare un software dedicato
(sviluppato in ambiente Access) – in grado di funzionare su postazione singola ma con la
possibilità di venire utilizzato anche in rete – per l’acquisizione e l’archiviazione dei dati
provenienti dai controlli endoscopici.
I numerosi tests eseguiti sono, comunque, risultati pienamente positivi e negli ultimi mesi del
2005 si è finalmente potuto procedere alla fase successiva consistente nell’acquisto formale
del sistema integrato software-hardware, una volta avuto a nostra disposizione un prototipo
perfettamente funzionante. A questo punto si è proceduto alla realizzazione dei passi
341

successivi del progetto, cioè all’acquisizione ed archiviazione dei dati provenienti dai
controlli endoscopici ed all’analisi dei risultati del trattamento farmacologico proposto in
sequenza logica sui differenti aspetti della reazione immunoallergica e del trattamento
chirurgico.
RISULTATI
Gli obiettivi perseguibili con la collaborazione che si è instaurata fra più specialisti sono stati
molteplici:
• dal punto di vista economico per il paziente vi è un risparmio di tempo perché l’accesso,
con una singola prenotazione iniziale, a tutte le prestazioni specialistiche occorrenti, evita
ripetuti spostamenti da un settore all’altro dell’Ospedale, semplicizza le procedure di
prenotazione e le liste di attesa; per l’ Azienda Ospedaliera vi è un’ottimizzazione delle
risorse poiché a collaborazione coordinata tra interlocutori qualificati offre la possibilità di
evitare abituali e costose ripetizioni dello stesso esame e/o l’esecuzione di esami inutili.
• Dal punto di vista della qualità delle prestazioni erogate vi è un migliore inquadramento
diagnostico della patologia derivante dalla collaborazione di specialisti di branche affini,
con possibilità di svolgere una diagnostica strumentale di 2° livello ed eventuali visite
collegiali e la possibilità di fornire ai pazienti, attraverso la collaborazione
multidisciplinare, un corretto approccio diagnostico-terapeutico, garantito anche dalla
disponibilità, all’interno dell’Azienda Ospedaliera, di strumentazione tecnologicamente
avanzata.
A queste positive ricadute di ordine eminentemente pratico bisogna poi aggiungere le seguenti
altrettanto importanti per i Medici impegnati nel progetto:
• migliore qualità delle prestazioni conseguente all’approccio integrato alle problematiche
del paziente;
• possibilità di sviluppare programmi di controllo nel tempo (follow up);
• possibilità di confronto dei dati locali con casistiche più ampie, e successiva
partecipazione a programmi di ricerca nazionali e internazionali;
• riduzione dei costi indotti dall’organizzazione degli ambulatori dedicati e dei supporti
informatici e cartacei (sostituiti da schede di gestione elettronica dei pazienti e da
documentazione videofotografica informatizzata).
342

Maria Adele Moschella Filone tematico D3
Rapporto tra atopia e malattia manifesta tra gli alunni delle Scuole Medie
Inferiori del Verbano-Cusio-Ossola
Asl 14
CONTESTO E RAZIONALE
La patologia allergica diviene ogni giorno più frequente: le cause di questo aumento sono
probabilmente legate a fattori ambientali ed a stili di vita. L’indagine fornisce dati aggiornati
sulla presenza di atopia tra gli scolari del Verbano-Cusio-Ossola (VCO) compresi tra gli 11 e i
14 anni e sul tipo di manifestazioni cliniche(riniti, congiuntiviti, asma bronchiale, dermatiti e
orticaria) se presenti.
MATERIALI E METODI
Lo studio trasversale è stato condotto in tutte le scuole medie inferiori del VCO (26 scuole) ed
ha coinvolto 3248 alunni (1647 maschi e 1601 femmine) e le rispettive famiglie. Di tutti gli
alunni1052 erano iscritti alla classe 1a, 1011 alla 2a e 1185 alla 3a. Ogni alunno ha compilato
un questionario insieme ai genitori, per accertare la presenza di disturbi respiratori e/o
dermatologici, presenza di allergopatie e tabagismo tra i conviventi. Sono stati poi eseguiti i
Prick test a ogni alunno in classe durante l’anno scolastico 2004-2005 con i seguenti allergeni:
Graminacee Mix, Composite Mix, Parietaria Off., Ambrosia, Nocciolo, Betulla, Cipresso,
Dermatofagoides pt. e f., Alternaria, Cane e Gatto, controlli negativo e positivo (Lofarma). E’
stata considerato positivo un pomfo di almeno 3 mm di diametro. Sono stati definiti atopici i
soggetti positivi ad almeno un allergene. Ciascun alunno ha effettuato in classe una
valutazione del Picco di Flusso Espiratorio (PEF). I dati raccolti sono stati stoccati in un
database (Microsoft Excel). E’ stato utilizzato il test X quadrato per il confronto di frequenze
in due o più gruppi. Il confronto tra medie è stato effettuato con il Test di Wilcoxon (non
parametrico) previa analisi della varianza.
RISULTATI
Hanno risposto al questionario 3248 alunni su un totale di 3712 iscritti (87,5 %), mentre i
prick test sono stati effettuati su 2928 alunni (78,9 %). L’adesione alla compilazione del
questionario e alla effettuazione dei prick test è stata sovrapponibile nelle tre differenti zone
in cui si divide il VCO. Dei 2928 alunni che hanno effettuato i prick test, sono risultati
positivi 1241 (42,3%). Sono risultati sensibili ad un solo allergene il 17,2 % dei soggetti
allergici, mentre la maggior parte (82,8%) è risultata sensibile a più di un allergene. La
prevalenza dei soggetti allergici non fu differentemente significativa nel Verbano (41,9%), nel
Cusio (42,7%) e nell’Ossola (42,6%). Non è stata rilevata differenza statisticamente
significativa nella prevalenza dell’atopia all’interno delle varie fasce d’età. E’ stata rilevata,
invece, una prevalenza dell’allergia nei maschi rispetto alle femmine (49.0 % vs 35.6%),
statisticamente significativa (p < 0,00001).
Tra gli allergici sono risultati sensibili alle Graminacee 800 alunni (64,5 %), al
Dermatofagoides pt. 789 (63,6%), al Dermatofagoides f.756 (60,9 %), alla Betulla 399 (32,1
%), al Nocciolo 399 (32,1%), alle Composite 284 (22,9%), all’Ambrosia 231 (18,6%), alla
Parietaria 161 (13 %), al Cipresso 136 (10,9 %), all’Alternaria 110 (8,9%), all’epitelio di gatto
177 (14,3%), all’epitelio di cane 80 (6,4%). La sensibilizzazione all’Ambrosia è risultata
343

prevalente nell’Ossola e nel Cusio rispetto al Verbano raggiungendo la significatività
statistica (Ossola vs Verbano p=0,0001 e Cusio vs Verbano p=0,002). Tra gli alunni allergici
il 36,4% non segnala nessuna patologia tra asma, rinocongiuntivite, orticaria e dermatite nel
questionario. E’ stata segnalata una allergopatia in almeno un componente del nucleo
famigliare nel 42,1% dei soggetti non allergici e nel 58,8% degli allergici (p=0,00001). Tra gli
alunni non allergici il 44,9% ha dichiarato che almeno un convivente fuma, mentre tra i
famigliari dei soggetti allergici fuma il 40,4%. Complessivamente l’abitudine tabagica è
presente nel 43,4 % delle famiglie. Il 15,7% degli alunni ha segnalato una anamnesi positiva
per asma bronchiale, mentre i soggetti con rinite risultano essere il 21,7 % del totale degli
alunni. La frequenza dell’atopia fra coloro che riferivano asma è stata del 71,1%, mentre il
49,7% degli asmatici ha segnalato la contemporanea presenza di rinocongiuntivite. Tra i
rinitici l’atopia è stata rilevata nel 77,6%. Il 22,3 % degli alunni intervistati ha segnalato
dermatite, mentre il 17,7% ha riferito almeno un episodio di orticaria.
Il PEF medio tra i maschi fu 402 l/min a 14 anni, 352 l/min a 13 anni, 311 l/min a 12 anni; tra
le femmine a fu 348 l/min a 14 anni, 333L/min a 13 anni e 298 l/min. a 12 anni. Stratificando
poi il valore del PEF per sesso e presenzaa/assenza di anamnesi di asma all’interno di
ciascuna fascia d’età, non si sono rilevate differenze statisticamente significative tra i valori
osservati. Il confronto con altri studi epidemiologici simili condotti in Italia ha permesso di
rilevare una prevalenza di alunni allergici simile a quella riportata in uno studio condotto nella
provincia di Genova (41,4% di soggetti allergici) (Crimi P., et al. J Prev Med Hyg
2003;44/4:73), mentre si discosta da quanto rilevato in un gruppo di ragazzi della provincia di
Bolzano (22,3%).
La prevalenza dell’asma bronchiale rilevata nel VCO (15,7%) è simile a quanto riscontrato
nella Provincia di Genova (13,1%);superiore a quella riscontrata nella Provincia di Terni
(11%)(Ferranti P. et al.. Rass Pat App Resp 2002;17:173) e nel secondo studio SIDRIA
(10,4%) (Epid Prev 2005;29(2)suppl:1-96);decisamente superiore a quanto rilevato nella
provincia di Bolzano (5,1%). La diagnosi di rinite risulta essere nel nostro studio 21,7%; 28.9
% in quella di Genova e 33,6% nei ragazzi di Terni ;17% nel secondo studio SIDRIA e 11,3%
tra gli alunni di Bolzano. Il range di prevalenza è estremamente variabile ed i nostri valori si
collocano in una fascia intermedia. Preoccupa l’elevata prevalenza di tabagismo
(43,4%),presente anche tra i famigliari di soggetti allergici. E’poi più probabile essere
allergici se almeno uno dei famigliari lo è: il confronto tra la percentuale di soggetti allergici e
non allergici con e senza famigliarità per allergopatie raggiunge una significatività statistica
elevatissima. Il 17,7% degli adolescenti ha riferito almeno un episodio di orticaria: di questi il
46,5% è atopico. Tra gli alunni atopici, infine, ben 1/3 non ha segnalato alcun disturbo: una
parte sicuramente sottostima eventuali sintomi ma un'altra può effettivamente non aver
espresso clinicamente l’atopia. Non sono state rilevate differenze significative nella
determinazione del PEF in soggetti asmatici e non: tale dato era atteso in quanto la variabilità
dell’asma richiede più valutazioni della funzione respiratoria nel tempo.
344

Carmine Munizza Filone tematico C2
Reti sociali ed utilizzo dei servizi sanitari e psichiatrici.
Centro Studi e Ricerche in Psichiatria
Nella definizione di salute dell’Organizzazione Mondiale della Sanità il concetto di rete
sociale è significativamente connesso a quello di benessere. La rete sociale rappresenta
l’insieme delle relazioni grazie alle quali si riceve e si offre supporto sociale ed equivale alla
disponibilità di persone delle quali l’individuo si fida, per le quali sente di essere importante e
dalle quali si sente valorizzato come persona. Le dimensioni e la qualità della rete sociale
contribuiscono quindi al benessere dell’individuo ed influiscono in misura significativa sul
suo stato di salute e sulla frequenza ed il decorso di molte patologie. Sul piano specifico
dell’utilizzo dei servizi psichiatrici, la maggioranza degli studi finora effettuati ha mostrato
che reti sociali più povere o livelli più bassi di supporto sociale sono associate ad un aumento
dei ricoveri. Negli scorsi anni è stata condotta una ricerca su 21 delle 22 ASL piemontesi, per
valutare – con una metodologia standardizzata – l’utilizzo dei vari servizi disponibili in
ambito psichiatrico (ospedalieri, residenziali, semi-residenziali, ambulatoriali) e per
individuare la presenza di eventuali predittori delle variazioni dei tassi di utilizzo emersi.
OBIETTIVO
Con questa ricerca presentiamo una revisione della letteratura sulle metodologie di
misurazione degli aspetti quantitativi e qualitativi della rete sociale individuale e una
revisione della letteratura scientifica nazionale ed internazionale relativa agli interventi ed alle
strategie (individuali, familiari, microsociali) di sostegno o sviluppo della rete sociale
individuale (o di alcune caratteristiche essenziali).
METODI E RISULTATI
La rete è concepita e rappresentata come un sistema di nodi collegati da connessioni, come
una “rete” per l’appunto, dove elementi costitutivi sono sia l’insieme di nodi, e cioè gli attori,
siano essi individui, gruppi, organizzazioni, che le connessioni, e cioè i legami, gli insiemi di
relazioni e di scambi. Il concetto si diffonde a vari livelli. L’idea di società postmoderna e
postindustriale si associa infatti all’immagine di un attore sociale immerso in un mondo di
interdipendenze crescente e globale, nel quale, il ruolo del centro e della gerarchia risultano
fortemente ridimensionati.
Due sono i richiami teorici principali. Il primo richiamo, che ha avuto e ha notevole
influenza nell’ambito dell’intervento sociale, propone la rete come concettualizzazione della
struttura sociale nei termini di una configurazione complessa di legami interpersonali. In
particolare, rete suggerisce un’idea di complessità sociale che include sia le relazioni formali
e istituzionalizzate che le relazioni informali, meno visibili e più sfumate, come pure gli
intrecci tra di esse.
L’altro richiamo teorico è alla rete come modalità organizzativa che emerge
dall’obsolescenza delle forme e delle culture organizzative che hanno accompagnato e
sostenuto il processo di industrializzazione. Nella rete personale si possono distinguere due
tipi principali di sistemi supportivi: il sistema informale (legami con parenti, amici o persone
con cui si condivide qualche aspetto della vita) e il sistema formale (professionisti e operatori
345

che operano in contesti di cura, riabilitazione e intervento psicosociale). Questi due sistemi
sono interdipendenti.
Attualmente disponiamo di quattro indicazioni sulle vie d’azione protettive per la salute. La
prima suggerisce che i sistemi, le relazioni supportive e il sostegno hanno una connessione
stretta col benessere psicofisico, favoriscono gli aspetti evolutivi e i comportamenti volti a
tutelare la propria salute. Nella seconda via d’azione tutti gli aspetti che attengono al sostegno
sono visti in relazione alla situazione e agli eventi stressanti che sta vivendo l’individuo. La
terza via d’azione è collega alla precedente e sottolinea come la capacità di controllo sul
proprio ambiente e sulle situazioni avverse può essere favorita dal sostegno che aiuta a
mantenere una buona immagine di sé e il senso della proprio identità. La quarta via d’azione è
di tipo terapeutico e riabilitativo poiché considera gli effetti del sostegno su disturbi già insorti
e durante il processo di guarigione. La prima, la seconda e la terza via d’azione sono alla base
degli interventi di sostegno a fini preventivi.
Sostegno e nevrosi: dalle ricerche degli anni ’60 e ’70 emerge che le persone con disturbi
nevrotici tendono ad avere pochi rapporti di intimo attaccamento, una rete sociale e un
sistema di sostegno ristretti o confinati al più vicino ambito familiare (Post, 1962). Gli autori
degli studi degli anni ’70 e ‘80 suggeriscono che un supporto sociale vicino (parenti, amici
intimi, ecc.) o diffuso (gruppi secondari di lavoro, svago, ecc.) fornisce una protezione contro
gravi eventi di vita.
Sostegno e depressione: Brown (1978) sostiene che la mancanza di un rapporto intimo e
confidenziale (con il marito, il partner, un amico o un’amica, ecc.) rappresenta uno dei quattro
fattori di vulnerabilità alla depressione. Infatti, è stato notato che, in presenza di stressors
vitali e di situazioni avverse, l’assenza di una relazione confidenziale correla
significativamente agli stati depressivi.
Sostegno e schizofrenia: Tolsdorf (1976) ha svolto una ricerca sulle reti sociali, i sistemi di
sostegno e i processi di difesa di dieci pazienti schizofrenici istituzionalizzati messi a
confronto con un gruppo di controllo.
I risultati indicano che mentre i pazienti del gruppo di controllo hanno un maggior numero di
legami multiplex (più vari e forti), i pazienti schizofrenici hanno più frequentemente rapporti
uniplex (legami più rari e meno forti). La rete sociale degli schizofrenici appare dominata
dalle figure parentali. Inoltre, si è rilevato che gli schizofrenici hanno un pregiudizio sociale
negativo (affermano che non è consigliabile fidarsi degli alti) e si rappresentano la propria
rete sociale come priva di risorse utili. Quindi si può affermare che gli schizofrenici
possiedono oggettivamente meno risorse di rete poiché in situazioni avverse fanno un limitato
riferimento al sistema di sostegno. La selezione degli strumenti di misurazione che sono stati
costruiti in questo ambito di studio sono stati suddivisi in quattro capitoli a seconda del
diverso focus di analisi:
1. le misure del sostegno sociale (maggior attenzione alla qualità degli scambi relazionali);
2. le misure delle reti sociali (maggior attenzione alle caratteristiche strutturali);
3. le misure della solitudine (l’attenzione è posta sulle mancanze relazionali);
4. misure globali (reti e sostegno sono indagati all’interno di strumenti più generali che
hanno l’obiettivo di rilevare la qualità della vita e la salute nel suo complesso).
346

Roberto Mutani Filone tematico C1
Strategie integrative ed alternative nella terapia della sindrome delle
apnee ostruttive nel sonno.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Neuroscienze
Tecniche di stimolazione della muscolatura del pavimento buccale
Al fine di ottenere la contrazione dei muscoli del pavimento buccale, come di altri muscoli
striati, occorre applicare dei treni di impulsi della durata di 0.96 sec, composto da semionde
positive e negative separate le une dalle altre da una breve pausa così da neutralizzare taluni
effetti indesiderati a livello plasmatico legati principalmente a fenomeni elettrolitici. La
frequenza del treno di impulsi deve risultare compresa tra i 150 ed i 180 Hz; diversamente si
incrementerebbe in maniera significativa la temperatura locale. Ogni treno d’impulsi deve
essere poi intervallato da una pausa per rilassare il muscolo, avente durata tra variabile tra
0.96 e 1.92 secondi.
Dopo aver lasciato che il paziente si addormentasse e dopo aver osservato la costante e quasi
ritmica frequenza di apnee abbiamo azionato lo stimolatore ad ogni evento apnoico quando si
è ritenuto che la sospensione del respiro fosse la partenza di una evento apnoico, naturalmente
ciò ha comportato che per almeno 8 secondi il paziente fosse lasciato in apnea. La
registrazione polisonnografica ha avuto una durata di 95.28 minuti di cui 60 passati in sonno.
In seguito abbiamo analizzato il tracciato e dai dati ottenuti risulta che il numero delle apnee
totali è pari a 45, di cui 28 sbloccate fisiologicamente e 13 attraverso stimolazione elettrica.
Per le 4 apnee rimanenti è stato necessario applicare più di un treno d’impulsi. La durata
media delle apnee sbloccate fisiologicamente è di 14,89 secondi circa, mentre le apnee che
sono state sbloccate con stimolazione elettrica avevano una durata media di 8 secondi, per i
motivi già espressi nella sezione precedente.
Nel corso della registrazione videopolisonnografica, in assenza di stimolazione elettrica, gli
eventi apnoici presentati dal paziente esitavano nel 71 % dei casi in un arousal. Con
l’applicazione della stimolazione elettrica del miloioideo in tutte le apnee “stimolate” tale
arousal si verificava nel 100 % dei casi. Per ottenere lo sblocco dell’apnea riducendo la
probabilità dell’insorgenza di un successivo arousal è verosimile che si debba ridurre
l’ampiezza del segnale e allungare la durata dello stimolo. Non è stato possibile praticare tali
aggiustamenti a causa di problemi circuitali dello stimolatore elettrico. Un punto di
importante discussione, tutt’ora aperta, è stato quello di valutare il rapporto tra l’efficacia
della stimolazione miloioidea nel ridurre le conseguenze dell’OSAS sul piano cardiocerebrovascolare
e il rischio di provocare arousal al paziente dopo stimolazione con
conseguente frammentazione della struttura ipnica e ipersonnia diurna. Inoltre risulta
opportuno comparare la qualità del sonno che si ottiene utilizzando la ventiloterapia rispetto a
quella ottenuta con stimolazione elettrica: attraverso l’uso della CPAP si osserva, nella
stragrande maggioranza dei pazienti, una completa risoluzione dei fenomeni apnoici a
differenza del solo parziale compenso ottenuto nel nostro caso da stimolazione elettrica.
D’altra parte è necessario però considerare la scarsa compliance legata alla resistenza
psicologica che il soggetto oppone all’utilizzo della CPAP: essa potrebbe essere ovviata
dall’utilizzo della stimolazione elettrica miloioidea quale trattamento alternativo alla
ventiloterapia.
347

Nel nostro studio abbiamo voluto valutare l’effettiva efficacia associata all’utilizzo di uno
stimolatore elettrico prendendo in esame sia gli aspetti positivi sia negativi ad esso annessi. E’
stato infatti dimostrato come la stimolazione elettrica miloioidea svolga un ruolo importante
nello sblocco delle apnee ostruttive, pur essendo sempre associata alla comparsa di un arousal.
Sicuramente la prosecuzione dello studio arriverà a farci comprendere quanto la minor durata
degli eventi apnoici dopo stimolazione elettrica influisca positivamente sul versante cardiocerebrovascolare
e quanto, d’altra parte, i sicuri arousal che seguono lo stimolo elettrico,
influiscano sull’architettura del sonno, anche se, proprio per ovviare a questo pericolo, stiamo
già provvedendo ad apportare le giuste modifiche al circuito elettrico dello stimolatore.
Aumentando inoltre la casistica potremo valutare l’ effettiva compliance dei pazienti verso lo
stimolatore elettrico, mettendola a confronto con quella relativo all’utilizzo continuativo della
CPAP.
Gruppi di supporto all’utilizzo della CPAP
La finalità dei gruppi di supporto è quella di ridurre al minimo i casi di non utilizzo della
macchina attraverso informazioni corrette e complete sull’uso della CPAP e sull’OSAs,
attraverso reali e pratiche dimostrazioni di utilizzo, mediante la discussione e risoluzione dei
problemi pratici e l’elaborazione di problematiche psicologiche di accettazione al fine di
aumentare la compliance al trattamento offrendo contemporaneamente un successivo servizio
di supporto per le eventuali problematiche di carattere tecnico, medico e psicologico correlate
all’uso della ventiloterapia. A questo servizio possono afferire i pazienti affetti da sindrome
delle apnee notturne con richiesta interna a carico del centro per la diagnosi e la terapia dei
disturbi del sonno in regime di day hospital.
I gruppi sono costituiti da circa 6-8 pazienti affetti da OSAS con indicazione all’uso della
CPAP. Il lavoro è strutturato su 3 incontri nell’arco di una settimana di circa 45 minuti l’uno,
organizzati prima, durante e dopo l’inizio della ventiloterapia ed un incontro a distanza di
circa 3 mesi. E’ previsto l’uso di materiale informativo cartaceo di carattere tecnico, ma di
facile comprensione, sull’uso della CPAP e sulla sindrome delle apnee ostruttive nel sonno.
Sono inoltre utilizzate scale di valutazione per la rilevazione della qualità della vita e della
quantità/qualità soggettiva del sonno somministrate prima e dopo il trattamento.
Argomenti trattati durante gli incontri
• Principi generali sulla patologia (OSAs) e sul trattamento con CPAP ·
• Come funziona una CPAP · La negoziazione del problema OSAs e il suo impatto sulla
salute generale ·
• Predisposizione a considerare un cambiamento di comportamento (igiene del sonno,
controllo del peso, modificazione delle abitudini notturne…) ·
• Comprensione della necessità del cambiamento e inizio del trattamento ·
• Come seguire un piano di attività e trattamento con pianificazione di cambiamenti a lungo
termine
• Follow up a breve termine ·
• Follow up a lungo termine
Scale utilizzate
ESS Epworth Sleepiness
Scale NHP Nottingham health profile
QL Index Quality of life index
348

Roberto Navone Filone tematico D1
Follow-up delle diagnosi citologiche di "ascus-agus" nello screening per
il cervico-carcinoma
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Biomediche e Oncologia Umana
INTRODUZIONE
Il Sistema Bethesda 2001 prevede, per lesioni borderline, le diagnosi di ASC-US (atypical
squamous cells of undetermined significance), ASC-H (non si puo’ escludere un H-SIL) ed
AGC (atypical glandular cells); il significato, la riproducibilità e l’utilità clinica di queste
diagnosi sono tuttora dibattuti. La ricerca prevede, mediante follow-up e correlazioni citoistologiche,
di definire l’evoluzione delle diagnosi di ASC-US, ASC-H ed AGC in una
casistica di citologia cervicale seguita per almeno 3 anni.
MATERIALE E METODI
Abbiamo esaminato 90.895 esami citologici cervico-vaginali, comprendenti 1.665 casi di
ASC\AGC (1.8%), 592 (0.7%) L-SIL, 336 (0.4%) H-SIL, 44 carcinomi squamosi (0.05%) e
27 adenocarcinomi (0.03%). Tra i 1.665 casi borderline, 394 ASC e 49 AGC avevano un
follow-up considerato sufficiente, con diagnosi istologica (colposcopica), o citologica, se
almeno due esami citologici sono risultati entrambi negativi.
RISULTATI
Dei 394 casi di ASC, 291 (73.9%) sono risultati benigni, 86 (18.0%) SIL di basso grado, 28
(7.1 %) SIL di alto grado e 4 (1.0 %) carcinomi. Dei 49 casi di AGC, 31 (76.3%) sono
risultati benigni e 18 (36.7%) maligni (13 H-SIL e 5 adenocarcinomi). Inoltre, suddividendo
gli ASC nei due gruppi ASC-US e ASC-H, nel primo gruppo (di 365 casi) abbiamo osservato
281 (77.0%) diagnosi definitive di benignità, 65 (17.8%) L-SIL, 17 (4.7 %) H-SIL e 3
carcinomi (0.8%), mentre nel secondo gruppo (di 29 casi) abbiamo osservato 11 (37.9%) casi
negativi, 6 (20.7%) L-SIL, 11 (37.9 %) H-SIL e 1 (3.5%) carcinoma squamoso.
CONCLUSIONI
Dai dati esposti, si ritiene utile consentire al citologo la possibilità di formulare una diagnosi
non definitiva, da approfondire con ulteriori controlli, purchè il numero di tali diagnosi sia
contenuto nella percentuale prevista dalle linee-guida. Inoltre, appare utile, come proposto dal
Bethesda, dare ulteriori informazioni almeno per l'ASC, in quanto l’ASC-H si conferma come
lesione ad alta predittività. Infine, poiché alcuni dei nostri casi sono risultati negativi ai primi
controlli ma positivi talora a distanza di anni, parrebbe opportuno prevedere un follow-up
sufficientemente prolungato per tutte le lesioni borderline.
349

PUBBLICAZIONI
I risultati della ricerca sono stati presentati al 1° CONGRESSO NAZIONALE DI
CITOPATOLOGIA DELLA SIAPEC-IAP (Società Italiana di Anatomia patologica e
Citopatologia diagnostica - International Academy of Pathology) a Firenze (28-30 novembre
2005) e pubblicati: FOLLOW-UP E CORRELAZIONI CITO-ISTOLOGICHE DELLE
LESIONI BORDERLINE IN CITOLOGIA CERVICALE. I. Rostan, C. Magnani*, A.
Marsico, D. Antonini, R. Navone, Dipartimento di Scienze Biomediche ed Oncologia Umana
dell'Università di Torino, e *Casa di Cura S. Gaudenzio, Novara
350

Carlo Nebbia Filone tematico B1
L’approccio proteomico come metodo alternativo per evidenziare
trattamenti con anabolizzanti in bovini da carne
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Patologia Animale
MATERIALI E METODI
Nel corso del primo anno si è proceduto ad una prima caratterizzazione mediante elettroforesi
bidimensionale delle frazioni microsomiali e citosoliche epatiche di vitelli a carne bianca
sperimentalmente trattati e non con una combinazione di vari promotori di crescita illeciti
(17b-estradiolo-clenbuterolo-desametazone). L’approccio proteomico, impiegato per la prima
volta a queste tematiche concernenti la sicurezza alimentare, ha riguardato campioni di fegato
in relazione alla presenza in tale organo di recettori specifici per ciascuna delle tre molecole
impiegate. La metodica messa a punto è stata applicata a 12 campioni di frazioni microsomiali
e 12 di frazioni citosoliche (6 animali di controllo + 6 animali trattati); l'analisi dei campioni è
stata ripetuta almeno in doppio. Le relative mappe proteiche hanno permesso di paragonare
gli spot ottenuti dagli animali di controllo con quelli relativi agli animali trattati. L'analisi
qualitativa non ha fornito risultati significativi; quella quantitativa è stata effettuata su un
totale di 130 e 100 proteine per quanto riguarda rispettivamente il citosol e i microsomi: sono
state escluse sia le proteine poco espresse, in quanto non ben visualizzabili, sia quelle
maggiormente espresse, in quanto, oltre determinati valori, il legame del colorante non risulta
più essere proporzionale alla quantità di proteina presente e una minima variazione di questi
spot avrebbe notevolmente influito sull'analisi delle altre proteine.
Per quanto riguarda le frazioni microsomiali, una sola proteina è risultata essere
differentemente espressa nei due campioni: negli animali trattati la sua espressione è risultata
maggiore di più di 3 volte rispetto ai controlli. Anche nelle frazioni citosoliche sono state
dimostrate differenze statisticamente significative per una sola proteina, che tuttavia è
risultata essere maggiormente espressa nei controlli rispetto ai trattati. Dopo digestione con
tripsina, i peptidi ottenuti sono stati analizzati con spettrometro di massa MALDI-TOF e i
risultati analizzati con banche dati on line. E’ stato così possibile identificare alcune proteine
specifiche delle membrane microsomiali e altre presenti nel citosol, fra le quali l’actina, la
sieroalbumina, l’endoplasmina e la glicogeno fosforilasi e la calreticulina. Nel corso del
secondo anno si è proceduto all’identificazione degli spot che mostravano variazioni di
espressione tra i diversi campioni; la spettrometria MALDI-TOF non è risultata sufficiente
per l’identificazione ed è stato necessario utilizzare la spettrometria di massa TANDEM, che
ha permesso di individuare in ambito citosolico la adenosina cinasi (AK, 1,29 ± 0,25 nei
controlli vs. 0,51 ± 0,10 nei trattati) e in ambito microsomiale la reticulocalbina (0,74 ± 0,29
nei controlli vs. 2,49 ± 0,35 nei trattati). Pur non essendo chiari i meccanismi molecolari che
possano spiegare questi risultati, considerato il ruolo chiave dell’AK nel metabolismo
glicidico, è possibile ipotizzare un coinvolgimento dei ß-agonisti e/o dei corticosteroidi nella
modificazione dell’espressione di tale proteina.
RISULTATI
Come da programma, si è proceduto quindi alla validazione dei risultati ottenuti determinando
l’espressione dell’AK con tecniche di immunoblotting direttamente sulle frazioni citosoliche.
351

I risultati ottenuti sono stati i seguenti: CONTROLLI: 0,613 ± 0,030 TRATTATI: 0,365 ±
0,028 Mann-Whitney U-test: P = 0,0079.
I risultati del western blotting hanno quindi confermato i dati ottenuti dall'elettroforesi
bidimensionale, e la possibilità di applicare questo metodo per indagini di screening su larga
scala. Non è stato possibile effettuare lo stesso tipo di valutazione per quanto riguarda la
reticulocalbina in quanto al momento non esistono anticorpi per questa proteina. Allo scopo di
verificare se le variazioni osservate fossero imputabili all’impiego di una delle molecole
impiegate nel trattamento, il desametazone, si è valutata l'espressione dell'AK in citosol di
fegato di vitelli a carne bianca di controllo o sperimentalmente trattati con tale corticosteroide
secondo due diversi schemi di trattamento:
Trattamento A (farmacologico): 5 mg/capo i.m. (trattamento nei giorni 0 e 5)
Trattamento B (“anabolizzante”): 0,4 mg/capo/die per os (trattamento fino al giorno 20).
I risultati ottenuti indicano una diminuzione di questa proteina in entrambi i gruppi
sperimentali (intorno al 50%), più evidente nel gruppo A dopo due settimane di tratttamento.
Ulteriori e più approfondite indagini sono tuttora in corso per chiarire i meccanismi
molecolari che hanno indotto questa diminuzione e confermare l’implicazione del
desametazone nella genesi di tali risultati. Sono stati effettuati e sono tuttora in corso
campionamenti presso gli stabilimenti di macellazione di alcune località del Piemonte per
analizzare tramite western blotting l'espressione dell'AK nel fegato di vitelli a carne bianca,
deteminare le possibili variazioni della proteina in animali derivanti da allevamenti diversi e
confrontare i dati con quelli ottenuti sperimentalmente.
PUBBLICAZIONI
Parte dei dati di questo progetto di ricerca è stata resa pubblica (citando la fonte di
finanziamento) nei modi seguenti: ·
1. Comunicazione orale al Workshop "Biomarcatori di trattamenti illeciti nell'allevamento
bovino" svoltosi durante il LIX Convegno Nazionale della Società Italiana delle Scienze
Veterinarie a Viareggio (21-24 Settembre 2005); ·
2. Prossima pubblicazione su un numero speciale della rivista “Veterinary Research
Communications” di un riassunto della comunicazione presentata al workshop di cui sopra
dal titolo “Carlo Nebbia, Giulia Gardini, Andrea Urbani: The proteomic approach as a tool
to detect the illicit treatment of cattle with performance enhancing agents”; ·
3. Spedizione del manoscritto: “Giulia Gardini, Piero Del Boccio, Sebastiano Colombatto,
Giovanni Testore, Davide Corpillo, Carmine Di Ilio, Andrea Urbani, and Carlo Nebbia -
Proteomic investigation in the detection of the illicit treatment of calves with growthpromoting
agents” alla rivista Proteomics
352

Emanuela Noris Filone tematico A1
Produzione di vaccini edibili per la prevenzione delle infezioni da
Papillomavirus umano
Consiglio Nazionale delle Ricerche
Istituto Virologia Vegetale
OBIETTIVO
L’attività di ricerca finanziata da parte della Regione Piemonte ha permesso di avviare un
progetto di biotecnologie vegetali applicate alla salute umana in un particolare settore
scientifico attualmente poco esplorato. Scopo del progetto è l’ottenimento di vaccini attivi
contro Papillomavirus patogeni per l’uomo, prodotti mediante le biotecnologie vegetali.
MATERIALI E METODI
In seguito a una scelta scientifica imposta dalla notevole competizione emergente in questo
settore, in particolare nel campo dei Papillomavirus mucosali ad alto rischio (Alfa-
Papillomavirus), responsabili di gravi patologie oncologiche a carico dell’apparato genitale
femminile, si è scelto di utilizzare quale specie modello virus appartenenti al genere Beta-
Papillomavirus, anziché Alfa-Papillomavirus, in particolare papillomavirus cutanei (spesso
indicati con la sigla EV-HPV). Per avviare il progetto è stato necessario reperire cloni virali
completi di alcuni di questi papillomavirus, da cui poter isolare le sequenze nucleotidiche
deputate alla sintesi di alcune proteine virali selezionate. Come specie modello è stata scelta la
specie HPV 8, la cui sequenza genica è disponibile presso la banca dati NCBI.
Il clone virale è stato reso disponibile dal Prof. Herbert Pfister dell’Università di Colonia,
Germania. Questo clone è stato utilizzato per subclonare sequenze nucleotidiche relative alle
ORF codificanti la proteina strutturale L1 e la proteina E7. Per quanto riguarda la sequenza
codificante la proteina E7, essa è stata mutagenizzata in alcuni siti potenzialmente in grado di
interferire con alcune proteine chiave del ciclo cellulare, quali proteine appartenenti alla
classe del retinoblastoma (Rb). Malgrado una simile attività non sia stata attualmente
dimostrata per la proteina E7 di HPV8, il dominio LxCxE presente nella proteina (L27Q,
C29G, E31D) è stato mutagenizzato, in modo da annullare ogni sua possibile interazione con
Rb.
RISULTATI
La descrizione dei risultati del progetto è articolato in due parti:
1. Ottenimento di antisieri specifici per la valutazione dell’espressione di proteine virali
in pianta.
Al momento non erano disponibili antisieri specifici per la valutazione delle proteine L1 ed
E7 di HPV8. Le sequenze L1 ed E7 mutagenizzata (E7Rb-) sono state perciò clonate in
vettori di espressione per batteri, quali pET e pGEX, allo scopo di indurre l’espressione in
batteri di elevate quantità di proteine di origine virale da utilizzare per la produzione di
antisieri policlonali in coniglio. Le proteine virali sono state espresse nel sistema pGEX sotto
forma di proteine di fusione con la porzione GST posizionata all’N-terminale di L1 o E7,
separatamente. Notevoli difficoltà sono state incontrate per l’espressione della proteina di
353

fusione GST-L1 e per la sua purificazione. In particolare, il sistema di espressione in vettori
del tipo pET è stato scartato per inefficienza. In seguito all’ottimizzazione delle condizioni di
espressione e purificazione con vettori di tipo pGEX, è stato possibile purificare entrambe le
proteine da batteri allo stadio nativo, mediante l’uso di cromatografia di affinità. In seguito
alla iniezione di GST-L1 e GST-E7 in coniglio, è stata indotta la produzione di antisieri
specifici per le proteine virali. Utilizzando consuete tecniche immunologiche, è stata valutata
la reattività e la specificità degli antisieri. Gli antisieri policlonali sono stati quindi sottoposti a
purificazione mediante cromatografia di affinità per l’ottenimento di IgG specifiche delle
quali è stato valutato il titolo. Attualmente è in corso la valutazione della specificità di
reazione di queste IgGs nei confronti di proteine L1 ed E7 di altre specie di Papillomavirus
appartenenti al genere Beta-papillomavirus.
2. Espressione di proteine virali in piante modello.
In parallelo, è stata avviata la costruzione di vettori per l’espressione in pianta delle proteine
L1, E7 e di un costrutto di fusione L1-E7. Questi costrutti sono stati utilizzati per fare
esprimere transientemente in N.benthamiana le proteine di HPV8. Gli antisieri specifici
generati grazie al presente progetto sono stati utilizzati per valutare l’avvenuta espressione da
parte del tessuto vegetale e hanno permesso di evidenziare proteine di 55 kDa per il costrutto
L1 e di 12 kDa per il costrutto E7, rispettivamente. Sono stati condotti esperimenti volti a
valutare la possibilità di potenziare l’espressione di tali proteine in pianta in sistemi transienti,
mediante l’uso di soppressori di silenziamento genico. E’ noto infatti che una delle ragioni
principali responsabili di una bassa espressione di proteine eterologhe in pianta è il
silenziamento genico post-trascrizionale. Questo consiste nella degradazione degli mRNA
eterologhi in pianta e comporta una espressione ridotta e, al limite, nulla delle proteine di
interesse. Gli esperimenti sono stati condotti mediante la tecnica dell’agroinfiltrazione,
introducendo contemporaneamente in tessuto vegetale adulto di N. benthamiana costrutti in
grado di fare esprimere le proteine di HPV8 e proteine con comprovata attività inibitrice del
silenziamento genico in pianta, originate da virus vegetali, quali ad esempio la proteina p19 di
Tombusvirus. Tali esperimenti hanno mostrato un notevole potenziamento della produzione e
accumulo di E7 e hanno permesso di rilevare la presenza di discrete quantità di L1, altrimenti
poco rilevabile. Contemporaneamente è stata avviata la trasformazione mediante la tecnica
dell’agrobatterio di tessuto vegetale di N.benthamiana. Sono attualmente in fase di
rigenerazione e selezione alcuni cloni trasformati con E7 e con L1.
Nei prossimi mesi è in previsione il completamento della fase di selezione dei cloni vegetali e
la loro caratterizzazione dal punto di vista biochimico per l’espressione di proteine di origine
virale. Qualora siano disponibili risorse per la prosecuzione, si prevede di valutare il
potenziale immunologico in animali modello, quali topi, per l’individuazione di una risposta
immunitaria nei confronti delle proteine virali prodotte in tessuto vegetale.
354

Francesco Novelli Filone tematico C1
Un approccio innovativo nell'identificazione di antigeni tumorali: l'analisi
serologica del proteoma
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale
OBIETTIVI
Il progetto svolto presso il Centro Ricerche di Medicina Sperimentale dell’Ospedale San
Giovanni Battista e diretto dal Dr. Novelli e' consistito in due principali obiettivi:
1. l’identificazione di nuovi antigeni tumore associati (TAA) espressi dai tumori del
pancreas nell’uomo;
2. l’analisi della capacità delle proteine identificate di indurre un efficace risposta
immunitaria.
MATERIALI E METODI
1. Nella prima fase della ricerca, utilizzando la tecnologia dell’elettroforesi bidimensionale,
siamo riusciti a separare l’intero profilo proteico (proteoma) delle linee di adenocarcinoma
duttale del pancreas CFPAC e MIAPACA1. La risoluzione mappa proteomica delle due le
linee ha messo in evidenza oltre mille proteine evidenziabili come macchie discrete nel gel
(spots) ognuna definita da due coordinate, il punto isoelettrico ed il peso molecolare.
Successivamente, mediante il western blot è stata valutata la capacita delle immunoglobuline
di classe G (IgG) contenute nei sieri di pazienti con adenocarcinoma del pancreas o con
tumori di diverso istotipo (colon, mammella, fegato, ovaio etc) o di individui sani di reagire in
maniera specifica nei confronti dei diversi spots presenti nel proteoma delle linee di
adenocarcinoma pancreatico. Lo “screening” ha evidenziato la capacità di 24 spots proteici di
essere riconosciuti da IgG contenute nel siero pazienti con tumore del pancreas ma non da
quelle contenute nel siero di individui sani o di pazienti con tumori di diverso istotipo.
Mediante spettrometria di massa LCQ-ESI-TOF (electronspray-ionization-time of fly), dodici
di questi 24 spots sono stati identificati come diverse isoforme di tre distinte proteine, l’
enolasi-a, l’heat shock protein 60 e la ciclofillina A. Sono attualmente in corso esperimenti di
spettrometria di massa per identificare le rimanti proteine specificamente riconosciute dagli
anticorpi dei pazienti con adenocarcinoma del pancreas.
3. Nella seconda fase del progetto abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla
caratterizzazione morfologica e funzionale dell’enolasi-a, un enzima ubiquitario che
appartiene al ciclo di Krebs, ma che può anche venire esposto sulla membrana cellulare e
svolgere funzioni recettoriale legando il plasminogeneno. Innanzitutto abbiamo
confermato mediante western blot e anticorpi specifici contro l’enolasi-a che le sei
isoforme identificate dalla spettrometria di massa e riconosciute dagli sieri di pazienti con
carcinoma del pancreas corrispondono proprio all’enolasi-a. Esperimenti di biochimica
hanno accertato che gli anticorpi dei pazienti di adenocarcinoma del pancreas riconoscono
la l’enolasi esposta in membrana e sono in corso studi per valutare la loro proprietà
funzionale come ad esempio la capacità di bloccare il legame e l’attivazione del
355

plasminogeno o l'induzione dell’attivazione della citotossicità mediata a anticorpi o dal
complemento. Esperimenti di immunoistochimica sono stati condotti con anticorpi antienolasi-a
per analizzare la distribuzione di questa proteina in sezioni di pancreas normali o
di adenocarcinoma. L’espressione di enolasi-a nel pancreas normale è prevelentemente
localizzata nei piccoli dotti e nelle cellule neuroendocrine, mentre i grandi dotti risulatano
negativi. Al contrario, l’adenocarcinoma del pancreas è caratterizzato da un abbondante ed
aumentata espressione di enolasi-a nei grandi dotti, probabilmente associata ad un
aumento della capacita proliferative del tumore. Per valutare se l’enolasi-a sia in grado di
indurre una efficace risposta immunitaria anche in individui non affetti da tumore, uno
spot corrispondente e ad una isoforma di enolasi-a è stato escisso da un gel
bidimensionale generato da estratti proteici una linea di adenocarcinoma del pancreas ed
utilizzato per “pulsare” delle cellule dendritiche ottenute a partire da linfociti del sangue
periferico di individui sani stimolati per 7 giorni con interleuchina(IL)-4 e fattore per la
stimolazione delle colonie di granulociti e macrofagi (GM-CSF) e successivamente
maturate per con IL-1 e fattore di necrosi tumorale(TNF)-a per due giorni. Le cellule
dendritiche mature pulsate con un pezzettino di gel contenente o no enolasi-a sono state
poi messe coltivate per cinque giorni con linfociti T autologhi ed è stata misurata la
proliferazione mediante il test di incorporazione di timidina triziata. Abbiamo chiaramente
osservato che soltanto i linfociti T esposti alle cellule dendritche pulsate con enolasi-a
erano in grado di proliferare, indicando che l’enolasi-a, pur essendo una proteina “self”, se
opportunamente presentata ai linfociti T da cellule che presentanti l’antigene
professioniste è capace di indurre una risposta proliferativi specifica. Di conseguenza la
capacità enolasi-a di indurre una risposta anticorpale in vivo nei pazienti con
adenocarcinoma del pancreas e la risposta proliferativi dei linfociti T in soggetti sani la
rende un interessante candidato per possibili strategie terapeutiche quali vaccini e terapie
immunomodulanti. Abbiamo inoltre confermato che anche l’enolasi-a ricombinante è in
grado di stimolare la proliferazione di linfociti CD4 e CD8 da parte di vari tipi di cellule
presentanti l’antigene (macrofagi, cellule dendritiche, linfociti B).
CONCLUSIONI
Questi risultati nel loro complesso indicano:
1. che è possibile mediante la SERPA mettere in evidenza la produzione di anticorpi prodotti
ca pazienti con adenocarcinoma del pancreas;
2. che e' possibile mediante western blot vagliare la specificità degli autoanticorpi per
proteine dell'adenocarcinoma.
Tra i divesi antigeni antigeni riconosciuti dagli anticorpi, e che sono in corso di
identificazione ne abbiamo, identificato uno corrispondente alla enolasi-a, ed abbiamo
dimostrato che la sua espressione è associata all'adenocarcinoma pancreatico e che esso è in
grado di attivare risposta immunitari cellulare se propriamente presentato dalle cellule
dendritiche.
Questi risultati indicano che l'analisi serologica del proteoma e' un'utile, rapido ed innovativo
approccio per identificare antigeni tumorali.
356

Fabio Orlandi Filone tematico C1
Valutazione del marker di malignità tiroidea galectina-3 in ELISA su
eluato da citoaspirato tiroideo e su siero.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche
CONTESTO E RAZIONALE
La patologia nodulare tiroidea rappresenta un’affezione molto frequente. La biopsia con ago
sottile (FNAB) è a tutt’oggi lo strumento diagnostico preoperatorio più affidabile, sebbene
risulti poco sensibile di differenziare l’adenoma dal carcinoma follicolare. Nella ricerca di
marcatori molecolari di malignità tiroidea atti a discriminare preoperatoriamente i carcinomi
dalle neoplasie benigne un importante contributo è stato fornito dalla galectina-3 (Gal3).
L’espressione citoplasmatica di questa lectina, valutata con metodo immunocitochimico,
appare limitata ai tireociti a fenotipo maligno. Recenti studi hanno inoltre messo in evidenza
valori di Gal3 significativamente più elevati in soggetti portatori di altri tipi di neoplasia
maligna (mammaria, gastrointestinale, ovarica, ecc) con o senza metastasi rispetto ai controlli
sani.
OBIETTIVO
Scopo di questo studio prospettico è stato quello di mettere a punto un metodo di dosaggio
quantitativo immunofluorimetrico (ELISA) della Gal3, sia su siero sia su materiale citologico
da eluato tiroideo ottenuto per citoaspirazione, di soggetti sani e di pazienti portatori di
patologia nodulare tiroidea, con l’obiettivo di identificare range di valori di concentrazione
della molecola normali e patologici in grado di essere utilizzati a scopo diagnostico.
METODI E RISULTATI
Sono stati selezionati ed arruolati nel nostro ambulatorio di citoaspirazione tiroidea 80
pazienti portatori di patologia nodulare (benigna e maligna) uni e multinodulare con
indicazione all’esecuzione dell’esame citoaspirato e che non fossero affetti da patologia
tiroidea iper/ipofunzione subclinica o franca, da patologia immunoreumatologica e
neoplastica non tiroidea pregressa o attuale. Tutte le informazioni clinico-anamnestiche di
ogni singolo paziente sono state raccolte in un database informatico apposito. Un totale di 37
pazienti sono stati sottoposti all’FNAB e al prelievo citologico per la valutazione in ELISA
della Gal3 intratiroidea, previo consenso informato scritto, mentre di altri 43 pazienti si è
ottenuto un campione di sangue periferico per la valutazione in ELISA della molecola su
siero. Poiché solo la quota di Gal3 citoplasmatica delle cellule follicolari è indice di malignità,
il materiale citologico tiroideo prelevato è stato sottoposto ad un pretrattamento atto al
recupero del solo contenuto proteico citoplasmatico e non quello nucleare. Infine, è stata
messa a punto la metodica ELISA di dosaggio della Gal3 sia su siero che su eluato. Sono stati
valutati i sieri di 43 pazienti portatori di nodo tiroideo [11 carcinomi papillari (CP), uno con
estesa infiltrazione linfocitaria, e 9 carcinomi follicolari (CF), entrambi con T>2, N0, M0, 12
adenomi follicolari (AF), 10 strumi macrofollicolari (ST), 1 tiroidite cronica
linfocitaria(TIR)]. Sono stati inoltre studiati come controlli 10 soggetti sani non fumatori.
357

I risultati hanno evidenziato una concentrazione media di Gal3 di 43,95 ng/ml (range: 3,67-
82,91) nei CP, di 79,33 ng/ml (range: 13,58-218,27) nei CF, di 59,52 ng/ml (range: 11,93-
108,49) negli AF, di 75,62 ng/ml (range: 43,29-103,54) negli st, di 44,94 ng/ml nelle TIR, di
25,13 ng/ml (range: 13,58-44,94) nei sani ed infine di 77,96 ng/ml nel caso di CP con TIR.
Sebbene nessuna differenza statisticamente significativa sia emersa dal confronto tra i gruppi
di pazienti studiati (p>0,05), i carcinomi (4 casi) che istologicamente presentavano massiva
angioinvasività avevano valori di concentrazione sierica di Gal3 significativamente più elevati
(media: 210,95 ng/ml) rispetto a quelli senza o con minima infiltrazione vascolare.
Per quanto riguarda la valutazione quantitativa della Gal3 citoplasmatica da cellule tiroidee
ottenute da eluato tiroideo (37 casi) sono stati invece identificati valori di concentrazione
media di Gal3 significativamente più alti (p

Maria Orlando Filone tematico A5
Ricerca sull’incidenza della guarigione dei minori sintomatici correlata al
miglioramento della funzione genitoriale
Asl 5 – U.O.S. di Psicologia
CONTESTO E RAZIONALE
Questa ricerca si pone come obiettivo la valutazione degli effetti della terapia familiare in
situazioni di abuso, maltrattamento fisico e psicologico, attraverso la tecnica del test – retest a
distanza di un anno di psicoterapia. L’assunto di base considera il maltrattamento psicologico
infantile come risultato del funzionamento di un sistema relazionale familiare che provoca
sofferenza per tutti i membri. Si ritiene il semplice intervento di cura individuale sul minore
non sufficiente a modificare gli schemi familiari disfunzionali, in quanto ogni membro gioca
un ruolo interconnesso a quello degli altri.
CAMPIONE
Sono stati stabiliti dei criteri di definizione del campione che hanno portato alla selezione di 5
famiglie per un totale di 9 bambini. In tutti i nuclei vi sono figli con diagnosi di sindrome da
stress post-traumatica o grave quadro psicopatologico. Le famiglie sono caratterizzate come
segue: Fam1: genitori conviventi, 6 figli di cui solo i primi 4 presi in carico dai servizi,
attualmente in comunità (presunto abuso). Fam2: genitori separati, 2 figli, di cui solo il
minore in carico, entrambi affidati a madre (padre tossicodipendente). Fam3: genitori separati,
2 figli, entrambi in carico e in comunità con la madre (padre presunto abusante). Fam4:
genitori separati, 2 figli, di cui solo il minore in carico, entrambi affidati a madre (padre
presunto abusante). Fam5: genitori separati, 1 figlio in carico (affidamento congiunto).
STRUMENTI
Per valutare l’eventuale cambiamento in seguito alla terapia sono stati utilizzati i seguenti
strumenti: CBCL, Child Behavior Checklist (per età 4-18, Achenbach, 2001). E’ un
questionario auto-somministrato ai genitori che esplora competenze sociali, relazionali,
problemi emotivi e comportamentali dei figli. È stato utilizzato per l’analisi del campione
senza retest. FRT, Family Relations Test (Bene e Anthony, 1985): fornisce un quadro
integrato dei sentimenti che il paziente e gli altri membri della famiglia nutrono l’uno verso
l’altro (somministrato ai bambini e ai genitori). TEC, Test of Emotion Comprehension (per
età 3-11, Pons e Harris, 2000): permette di valutare gli aspetti principali che concorrono alla
comprensione delle emozioni. Consente di confrontare il profilo dei bambini rispetto alla
competenza attesa per l’età e di registrare i cambiamenti che si verificano nella comprensione
dei vissuti emotivi dopo la terapia.
OBSERVER (software per analisi osservative mediante schema di codifica). Ha permesso di
valutare il cambiamento tra la seduta iniziale e finale della terapia.
ANALISI DEI DATI CBCL
Il manuale del test fornisce i valori borderline (B) e clinici (C) per le singole scale di seguito
evidenziate. Fam1: ansia, difficoltà attentive, aggressività (B) in F1; in F2 difficoltà attentive
e aggressività (C); ansia, problemi sociali, comportamento senza regole (B) e aggressività (C)
in F3 Fam2: ansia (B) e aggressività (C) in F2 Fam3: problemi attentivi e aggressività (C) in
F1 Fam4: nella norma (somministrato solo alla madre protettiva già in trattamento da due
anni). Fam5: ansia (B) e depressione (C) in F1 (1^oss), nella norma (2^oss). Solo in questo
359

caso, in via sperimentale, abbiamo raccolto il confronto inizio-fine trattamento: è significativo
il passaggio da valori clinici a valori normativi. FRT Evidenziamo i cambiamenti verificatisi
in seguito all’intervento terapeutico indicando sia quelli statisticamente significativi

Giancarlo Orofino Filone tematico A4
Inserimento della prevenzione HIV nella cura di persone HIV positive:
applicazione di linee guida internazionali
Asl 3
OBIETTIVI
Gli obiettivi iniziali del progetto consistevano in:
• valutare l’applicabilità delle raccomandazioni degli esperti, contenute anche nelle linee
guida internazionali americane sulla terapia antiretrovirale, in materia di prevenzione della
diffusione di HIV sulla e nella popolazione HIV infetta afferente ad un cento italiano;
• organizzare una equipe che sappia rilevare pratiche e comportamenti a rischio e favorire il
cambiamento di tali atteggiamenti attraverso un modello operativo, di indagine ed
intervento, che sia riproducibile anche in altri centri;
• valutare l’accettazione da parte dei pazienti di tale modello operativo.
MATERIALI E METODI
E’ stato costituito un gruppo di lavoro formato dal medico infettivologo, dallo psicologo,
dell’educatore (2 unità), del medico sessuologo; sono state svolte riunioni di tipo formativo
finalizzate a:
a) aumentare il grado di conoscenza su HIV/AIDS, soprattutto sul campo preventivo e
curativo,
b) aumentare il grado di conoscenza delle principali disfunzioni sessuali e loro approcci
diagnostici,
c) acquisire nozioni di psicologia clinica, inerenti in particolare alla infezione da HIV-AIDS,
d) elaborazione e stesura di un questionario da utilizzare con i pazienti.
Si sono utilizzati i seguenti strumenti:
1. questionario (30 items a risposta SI/NO) sul grado di conoscenza della malattia da
HIV/AIDS (rielaborazione parziale di un questionario gentilmente concesso dalla dr.ssa
Luzi dell’ ISS-Telefono Verde AIDS)
2. questionario (non autosomministrato ma configurato come una griglia per una intervista
semistrutturata da parte dell’educatore), di cui al punto d) e che esplorava 6 aree (aspetti
sociodemografici e qualità della salute, contagio, sessualità, affettività, aderenza alla
terapia antiretrovirale, prevenzione)
3. un documento scritto riportante le risposte esatte e i commenti alle domande del
questionario di cui al punto 1.
Metodologia: ai pazienti HIV positivi afferenti all’ambulatorio della Div A di Malattie
Infettive dell’Ospedale è stato chiesto di entrare in questo progetto; a coloro che accettavano,
è stato chiesto di compilare il questionario conoscitivo (vedi punto 1); veniva di seguito
consegnato il documento di verifica e commento delle domande e affermazioni; a coloro che
dichiaravano (rispondendo a domanda esplicita posta dall’infettivologo se negli ultimi 6 mesi
avessero avuto dei comportamenti a rischio, in particolare sesso non protetto) di non rispettare
le norme di prevenzione secondaria oppure lo richiedevano esplicitamente, è stato proposto un
colloquio con l’ educatore e, in casi selezionati, un appoggio di tipo psicosessuologico.
361

Casistica: sono stati contattati 180 soggetti; di questi, 170 (94%) hanno dato la disponibilità
ad entrare nel progetto e hanno compilato il questionario (134 M/ 36 F); di 149 che hanno
risposto anche alla domanda sui comportamenti personali, 29 (20%) hanno ammesso di aver
corso dei rischi 25 su 29 di questi hanno accettato l’intervista semistrutturata con l’educatore;
ad essi si sono aggiunte 20 persone (per un totale di 49 persone) che l’infettivologo ha
ritenuto opportuno appoggiare all’educatore (tra di essi anche alcuni stranieri). 6 persone sono
state inviate a consulenza psicosessuologica.
RISULTATI
Le risposte al questionario maggiormente sbagliate riguardano (tra parentesi la % di errore): il
numero di soggetti HIV positivi in Italia (61%), il rischio collegato al rapporto anale tra
persone sieronegative (48%), se sia sufficiente il test dopo 6 mesi dall’ultimo rapporto a
rischio (39%), la percentuale di passaggio della infezione dalla madre con infezione da HIV al
figlio durante la gravidanza (32%); per quel che riguarda le pratiche a rischio, il 19 % ritiene
che i rapporti orogenitali non siano a rischio mentre il 25 % ritiene che la masturbazione con
una persona HIV positiva sia a rischio e il 31% che il rapporto di penetrazione senza
eiaculazione non sia a rischio. Delle 6 persone (5 M / 1F) avviate a consulenza sessuologia, 5
presentavano deficit erettile e in 1 caso era presente deficit del desiderio.
Un paziente donna (in coppia eterosessuale stabile) ha seguito terapia sessuologica per circa 1
anno con buon recupero del tono dell'umore e miglioramento del sintomo sessuale. Un
paziente omosessuale (in coppia stabile) ha completato terapia sessuologica in 6 mesi, con
completa risoluzione del sintomo. Negli altri casi è stato mediamente sufficiente 1 colloquio
al fine di fare ulteriore chiarezza sulla motivazione dei sintomi sessuali.
COMMENTI
L’ambulatorio infettivologico di riferimento per le persone con infezione da HIV si configura
come un luogo naturale ed adeguato per affrontare tematiche di prevenzione se viene
rispettato il criterio organizzativo di multidisciplinarietà; l’infettivologo può essere colui che
propone e dà l’avvio all’iniziativa, partendo anche da problematiche cliniche di grande rilievo
(diffusione di ceppi virali resistenti, possibile sovrainfezione con ceppi più aggressivi di HIV
e acquisizione di altre malattie a trasmissione sessuale da parte dei pazienti HIV positivi, etc.)
ma si è rivelato fondamentale l’inserimento di altre figure professionali, verso le quali il
paziente si sente più libero di esprimersi; questa realtà può in parte spiegare l’alta accettabilità
da parte dei pazienti, sia per quel che riguarda la figura dell’educatore che del sessuologo.
Tutti i pazienti si sono mostrati estremamente contenti di poter confrontarsi rispetto alle
proprie eventuali "condotte a rischio" e alle problematiche sessuali. Gli strumenti utilizzati
sono risultati congrui con le finalità del progetto.
E’ emersa l’indicazione di rivedere alcune domande del questionario e di elaborare un
vademecum semplice (in corso di progettazione e da redigere anche in altre lingue, per avere
dati anche sulla popolazione straniera, che ormai rappresenta il 15 – 18 % della casistica
ambulatoriale) che affronti in maniera semplice le principali questioni di prevenzione (sesso
protetto, pratiche a rischio). Si è evidenziato un quadro di diffusa ignoranza sulla malattia da
HIV da parte dei pazienti, che solo in parte può dipendere dalla difficoltà alla comprensione
di alcune domande poste in negativo, ma in larga parte può ricollegarsi con vera scarsa
conoscenza e che deve fare rivedere l’idea presupposta che i pazienti siano istruiti sulla
malattia; tale dato, tuttavia, deve essere interpretato con cautela, nel senso che l’avere una
concezione sbagliata riguardo ad un comportamento a rischio non vuol dire metterlo in
pratica, ma certo è un messaggio importante che spinge a dedicare più tempo e risorse alla
educazione ed informazione dei pazienti.
362

Piero Paccotti Filone tematico C1
Approccio integrato allo studio della struttura e funzione muscolare:
rilievi genetici, biochimici ed elettromiografici
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche
METODI E RISULTATI
Tutti i soggetti sono stati sottoposti al seguente protocollo di studio:
• riscaldamento su cicloergometro e stretching dei gruppi muscolari successivamente
coinvolti nell’esercizio (arti inferiori e muscolatura glutea);
• esecuzione di 3 contrazioni isometriche volontarie massimali della muscolatura degli arti
inferiori su dinamometro isometrico dedicato (durata di 5 secondi su pressa orizzontale,
con angolo femoro-tibiale di 110°);
• esecuzione di test isometrico protratto con mantenimento per 30 secondi di un carico pari
al 90% del massimale pre-determinato;
• esecuzione di 8 serie da 20 contrazioni isometriche intermittenti (3 secondi di contrazione,
con mantenimento di un carico pari al 90% del massimale, e 1 secondo di recupero), con
recupero di 2 minuti tra ogni serie.
Tutti i soggetti sono stati sottoposti prelievi di materiale ematico e salivare, ai seguenti tempi:
• sangue venoso: pre-esercizio, dopo 5, 15, 30, 60, 90 e 120 minuti dal termine;
• sangue capillare: pre-esercizio, durante l’esercizio (dopo la quarta serie di contrazione
intermittente), dopo 5, 30, 60 minuti dal termine;
• prelievi salivari: agli stessi tempi del campionamento di sangue venoso.
E’ stata fatta una iniziale elaborazione dei test di funzione muscolare meccanica e del
materiale ematico prelevato, i cui risultati possono così essere preliminarmente elencati:
• i soggetti dediti a specialità di potenza hanno presentato maggiori valori di forza
isometrica massimale degli arti inferiori rispetto ai soggetti di resistenza;
• le tre prove di determinazione della massima contrazione isometrica volontaria hanno
dimostrato una elevata ripetibilità del test (elevato coefficiente di correlazione intraindividuale);
• la performance al test isometrico protratto per 30 secondi ha documentato significative
differenze tra i soggetti dei due gruppi: l’entità di decremento della forza espressa durante
i 30 secondi di contrazione è risultata minore nei soggetti di resistenza rispetto a quelli di
potenza;
• la risposta lattacidemica al test intermittente è risultata maggiore nei potenti rispetto ai
resistenti, sia in termini di picco dei livelli ematici che in termini di area sotto la curva
della risposta;
• si è osservata una significativa risposta citochinica sierica all’esercizio isometrico, con
rilievo di importante variabilità inter-individuale: i livelli sierici di picco di interleuchina-6
(IL-6) sono risultati compresi tra 3 e 10 pg/ml in un sottogruppo di 8 atleti, mentre nei
363

estanti 27 soggetti la risposta di IL-6, per quanto significativa, ha prodotto livelli di picco
inferiori a 3 pg/ml.
La prosecuzione delle elaborazioni sarà principalmente volta a:
• caratterizzare le manifestazioni mioelettriche di fatica in ogni soggetto, sia quelle relative
al test isometrico protratto per 30 secondi, sia quelle associate al test intermittente; -
definire gli effetti della composizione muscolare (indirettamente valutata nei termini di
anamnesi sportiva e prestazione funzionale meccanica di ogni soggetto) sulle
manifestazioni mioelettriche di fatica;
• quantificare il peso del recupero tra le ripetizioni nel determinismo della fatica
mioelettrica (attraverso il confronto tra i 30 secondi di esercizio isometrico protratto e le
prime 10 ripetizioni dell’esercizio intermittente);
• stabilire l’esistenza di correlazioni tra il fenotipo muscolare (determinato in base alle
performance meccanica e elettromiografica) e la risposta ormonale e citochinica (IL-6)
all’esercizio;
• approfondire il problema dei rapporti tra la produzione sistemica (muscolare) e quella
locale (ghiandole salivari) di IL-6: un precedente lavoro del nostro gruppo non ha
documentato l’esistenza di correlazioni tra gli incrementi salivari e quelli sierici in
risposta all’esercizio isocinetico.
364

Gian Franco Pagano Filone tematico B3
La razionalizzazione della dieta da sola puo’ controllare la sindrome
metabolica e il rischio cardiovascolare connesso?
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina Interna
OBIETTIVO
Scopo di questo studio è stato valutare l’efficacia di un programma di counseling intensivo
rispetto ad uno tradizionale nel modificare l’alimentazione e lo stile di vita dei pazienti con
più elementi della sindrome metabolica (definita secondo i criteri ATPIII del 2001).
MATERIALI E METODI
Si tratta di uno studio prospettico randomizzato, innestato in una indagine conoscitiva su un
campione della popolazione generale di Asti, con l’obiettivo primario di confrontare la
proporzione di soggetti nei due bracci in studio che a 12 mesi dall’inizio dell’intervento
abbiano mostrato una regressione di parte o di tutti gli elementi che definiscono la sindrome e
che quindi non rientrino più nella categoria a rischio. E’ stata eseguita la randomizzazione in
due gruppi, dopo stratificazione per: fascia di età (3 livelli), medico di famiglia (2 per ciascun
distretto), sesso, n° di componenti della SM (due livelli: 3 o >3). Sono stati così randomizzati
188 soggetti a ricevere il counseling “convenzionale” (convocati dal medico di famiglia per
una informazione sul rischio metabolico e vascolare, con raccomandazioni sullo stile di vita e
sulla corretta alimentazione) e 187 individui a ricevere l’intervento sperimentale “intensivo”.
Tale intervento è stato così articolato: prima visita individuale, visita 2 collettiva = dopo 1
mese; visita 3 collettiva = dopo 3 mesi; visita 4, individuale con prelievo ematico e
misurazioni antropometriche = dopo 6 mesi; visita 5, collettiva = dopo 9 mesi; visita 6
individuale con prelievo ematico e misurazioni antropometriche = dopo 12 mesi.
I pazienti sono stati istruiti e motivati da personale dedicato (medico + nutrizionista), sono
state fornite dettagliate informazioni sulla composizione degli alimenti, sulla opportunità di
scelte motivate, sono stati forniti schemi di alimentazione personalizzati e indicazioni volte a
correggere abitudini e stili di vita noti per essere importanti fattori di rischio. Con l’ausilio di
materiale cartaceo e proiettato i pazienti sono stati stimolati ad una costante e almeno
moderata attività fisica. Le visite collettive sono state organizzate in piccolo gruppi di lavoro,
con largo spazio interattivo e di coinvolgimento partecipativo dei soggetti.
RISULTATI
E’ in corso la rivalutazione dei dati antropometrici e laboratoristici dei partecipanti, al fine di
valutare:
1. la proporzione di pazienti che dopo l’intervento presentano

3. la proporzione di pazienti che hanno presentato una normalizzazione per singolo
componente della SM.
PUBBLICAZIONI
1. BO S, GAMBINO R, DURAZZO M, GUIDI S, TIOZZO E, GHIONE F, GENTILE L,
CASSADER M, PAGANO G. -glutamil transferase, metabolic abnormalities and
Associations between inflammation in healthy subjects from a population-based cohort: a
possibile implication for oxidative stress. World J Gastroenterol 11:7109-7117,2005 IF=
3.318
2. BO S, CICCONE G, ROSATO R, GANCIA R, GRASSI G, MERLETTI F, PAGANO G.
Renal damage in patients with type 2 diabetes: a strong predictor of mortality. Diabetic
Medicine 22:258-265,2005. IF= 2.235
3. BO S, GAMBINO R, PAGANI A, GUIDI S, GENTILE L, CASSADER M, PAGANO G.
Relationships between human serum resistin, inflammatory markers and insulin
resistance. Int J Obes Relat Disord 2005
4. BO S, GAMBINO R, UBERTI B, MANGIAMELI MP, COLOSSO G, REPETTI E,
GENTILE L, CASSADER M. PAGANO G. Does C-reactive protein identify a subclinical
metabolic disease in healthy subjects? Eur J Clin Invest 35:265-270,2005 IF= 2.346
5. BO S, GAMBINO R, GUIDI S, SILLI B, GENTILE L, CASSADER M, PAGANO G.
Plasma nitrotyrosine levels, antioxidant vitamins and hyperpgycaemia. Diabet Med
22:1185-9,2005 IF= 2.235
6. BO S, GENTILE L, CICCONE G, BALDI C, BENINI L, DUSIO F, LUCIA C,
FORASTIERE G, NUTI C, CASSADER M, PAGANO G. The metabolic syndrome and
high C-reactive protein: prevalence and differences by sex in a southern-European
population-based cohort. Diabetes Metab Res Rev 21:515-524,2005 IF=3.133
7. BO S, LEZO A, MENATO G, GALLO ML, BARDELLI C, SIGNORILE A, BERUTTI
C, MASSOBRIO M, PAGANO G. Gestational hyperglycemia, zinc, selenium, and
antoxidant vitamins. Nutrition 21:186-191,2005. IF= 2.324
8. BO S, SIGNORILE A, MENATO G, GAMBINO R, BARDELLI C, GALLO ML,
CASSADER M, MASSOBRIO M, PAGANO G. C-reactive protein and in gestational
hyperglycemia. J Endocrinol Invest tumor necrosis factor- 28:779-786,2005 IF= 1.621
366

Augusta Palmo Filone tematico B3
Studio prospettico su supplementazione in antiossidanti nei soggetti in
nutrizione parenterale domiciliare long-term
ASO S. Giovanni Battista – Struttura Complessa
CONTESTO E RAZIONALE
Nostri precedenti studi hanno dimostrato la presenza di uno stress ossidativo in pazienti con
Insufficienza Intestinale Cronica Benigna (IICB) in nutrizione parenterale di lunga durata.
Infatti in questi pazienti vi era un aumento dei livelli plasmati ci di MDA (Malondialdeide) e
HNE (4 Idrossinonenale), aldeidi terminali del!a perossidazione lipidica; è stata evidenziata
una relazione significativa fra questi e l'apporto ev di selenio e livello ematico di vit E.
Sulla base di tali risultati si è progettato uno studio prospettico di intervento nutrizionale per
valutare l'eventuale efficacia sullo stato ossidativo (valutato con gli stessi indici) di ulteriori
supplementazioni dei due micronutrienti in precedenza risultati insufficienti.
Scopo del nostro lavoro è stato quello di verificare l'ipotesi per cui la perossidazione lipidica
possa essere controbilanciata da un apporto di antiossidanti più elevato rispetto ai normali
fabbisogni.
MATERIALI E METODI
Sono stati inclusi nello studio 18 pazienti con IICB in trattamento NPD da almeno 6 mesi.
Sono stati esclusi i pazienti con:
• clearance creatininica < 40 ml/die per almeno 2 determinazioni consecutive;
• situazione infiammatoria acuta all'inizio dello studio e durante il follow up.
Il programma nutrizionale ev è stato stabile per tutta la durata dello studio con i seguenti
apporti medi: aminoacidi: 50.6 ± 24.1 g/d; lipidi: 786 ± 450 ml/sett; acidi grassi poliinsaturi
(PUFA): 39 ± 28 g/sett; carboidrati: 136 ± 77 g/d; volume infuso: 1916 ± 634 ml/d; n
infusioni/sett: 5.4 ± 1.5.
Gli apporti di micronutri enti all'inizio dello studio erano stabiliti sulla fase delle dosi
giornaliere raccomandate per la nutrizione parenterale e valutati periodicamente con gli indici
nutrizionali individuati a livello internazionale per ogni micronutriente.
Fasi dello studio:
• Valutazione come stato ossidativo al tempo basale (Se t O)
• Supplementazione ulteriore ev di Selenio per 60 giorni: raddoppiata la quota di Se
normalmente infusa ai pazienti con P-Se < 80 µ/l (valore centrale del range di
riferimento). La popolazione è stata suddivisa in due gruppi: A (n=12), ulteriormente
supplementato e B non liÌteriormente supplementato
• Se t 1: come Se t 0, dopo 60 giorni
• A 60 giorni dalla sospensione della supplementazione ricontrollo per gli stessi indici (120
giorni dall’inizio dello studio: Se t 2).
• Dopo un periodo di wash out di 4 mesi si è provveduto alla supplementazione per os con
367

vit E (2100 mg/sett), con le stesse modalità: E t 0, E t 1, E t 2.
Il protocollo dello studio prevedeva la valutazione dei seguenti parametri:VES, PCR, AST,
ALT, γGT, clearance della creatinina, P-Se, RBC-GSHPxSe, P-ac. Ascorbico e
deidroascorbico, P-retinolo, P-tocoferolo, RBC-GSH/GSSG, P-MDA e P-HNE.
RISULTATI:
I risultati sono esposti nelle seguenti tabelle
1. Supplementazione con selenio. Le variazioni significative (test t di student) sono state a
carico di: P-Se da 61,08 ± 18.7 ug/l (basale) a 88 ± 17.8 ug/l (t1), a 71.6 ± 16.9 ug/l (t2); P-
DHAA da 0.0 ± 0.1 mg/L a 0.2 ±0.3 mg/L(t 1), a 0.0 ± 0.0 mg/L(t2); RBC-GSSG da 0,8 ±
0,3 uMol/g HB a 1,2 ± 0,4 uMol/g HB(t1), a 1,0 ± 0,3 uMol/g HB. Gli indici di
perossidazione non hanno dato variazioni significative.
2. Supplementazione con vitamina E. Le variazioni significative (test t di student) sono state a
carico di: P-AA: da 8,6 ± 4,0 a 6,4 ± 2,2 (t1), a 9,9 ± 3,6 mg/L(t2); RBC-GSH:da 4,8 ± 1,3
uMol/g HB a 3,5 ± 1,2 (t1), a 3,5 ±1,2 (t2); RBC-GSSG: da 1,2 ± 0,3 a 0,8 ± 0,3 (t1),a 1,0 ±
0,5 (t2); RBC-GSH tot da 2391 ± 514 uMol/L a 1681 ± 492 (t1), a 1828 ± 659 (t2); MDA: da
4,9 ± 1,1 a 4,1 ± 0,6 uMol/L (t1), 5,4 ±1,2 (t2).
CONCLUSIONI
La supplementazione ulteriore con selenio ha dato:
• Un aumento (non significativo) dell'attività della glutatione per ossidasi.
• Una situazione borderline dello stato infiammatorio (v. VES) già dal basale e non
modificato.
• GGT già mossa a partire dal t. basale.
• Lieve risparmio di vitamina C.
• Nessun effetto su vitamine A, E. f
• Aumento della quota ossidata del glutatione e del GSH totale.
• Nessuna variazione nei livelli plasmatici delle aldeidi
La supplementazione ulteriore con vitamina E ha dato:
• Una importante riduzione di glutatione perossidasi, GSH e GSSG
• Una situazione borderline dello stato infiammatorio (v. VES) già dal basale e non
modificato
• Una riduzione del livello medio plasmatici di acido ascorbico
• Il dosaggio del tocoferolo plasmatico non ha rilevato il diverso apporto di vit E
• Una riduzione dei livelli delle aldeidi plasmatiche
Sono necessarie ulteriori indagini per valutare la durata efficace della supplementazione di
selenio, l'eventualeutilità della determinazione intracellulare del tocoferolo e la
supplementazione contemporanea di Se e vit E.
368

Pierino Panarisi Filone tematico C1
La famiglia in un sistema aziendale: il caregiver come risorsa nelle cura
al paziente con problemi cronici invalidanti
ASO S. Giovanni Battista
CONTESTO E RAZIONALE
Le trasformazioni demografiche e socio-economiche dello scenario italiano hanno influenzato
nell’ultimo decennio l’orientamento delle scelte normative ed organizzative che
necessariamente debbono razionalizzare la spesa derivata dalla domanda sempre più
crescente. L’attenzione alla riduzione delle giornate di degenza derivata da questo processo,
ha condotto necessariamente alla contrazione del tempo di ricovero. Al paziente, conclusa la
fase acuta della malattia, sono proposte le dimissioni. Ciò è sicuramente funzionale per
persone che, superato l’empasse della malattia, riacquistano completamente le proprie
funzioni o necessitano di cure ambulatoriali semplici, ma per le persone che hanno bisogno di
assistenza continua o di cure complesse la dimissione può diventare un problema dovuto alla
fragilità della persona anziana e l’assenza di una rete di tutela. I pazienti con patologie
croniche degenerative o invalidanti, sono inseriti in un sistema di cure dove, nonostante gli
intenti, la distribuzione del lavoro, delle attività e delle responsabilità continua ad essere
organizzata in sottosistemi omogenei non sempre fra loro interagenti (cure ospedaliere, cure
domiciliari, cure residenziali, assistenza sociale), il paziente nel suo percorso può passare da
uno all’altro rischiando di perdere i propri riferimenti terapeutici ed assistenziali. Di
conseguenza il disorientamento prodotto da questo tipo di organizzazione può portare alla
richiesta di ricoveri inappropriati, al rifiuto delle dimissioni.
OBIETTIVI
Sono queste le principali motivazioni che hanno portato a iniziare un percorso che ha come
obiettivo quello di individuare le modalità di integrazione nel processo di cura della famiglia
dei pazienti dimissibili a domicilio sviluppando un modello strutturato di riferimento che
riconosca le potenzialità del caregiver e lo inserisca stabilmente nel processo assistenziale.
Attraverso uno studio pilota svolto in quattro reparti di degenza (oncologia geriatria) dove
sono principalmente ricoverate persone con problemi di salute di tipo cronico-invalidante è
stato ridefinito il processo assistenziale inserendovi il caregiver, ciò ha comportato la
necessità di identificare:
1. gli strumenti utili a valutare la complessità assistenziale per individuare correttamente i
pazienti da inserire nel percorso;
2. stabilire le modalità per identificare i caregiver,
3. definire le tecniche per l’assistenza utili al caregiver affinché possa “sapere” e “saper”
fare.
MATERIALI E METODI
Lo studio ha considerato i pazienti che necessitano di un supporto assistenziale a domicilio
escludendo quindi i ricoverati gravi. Per misurare la complessità assistenziale e progettare la
fattibilità dell’inserimento del caregiver già nella fase di accettazione del paziente, si sono
scelte le scale di valutazione proposte dalla Regione Piemonte per le cure
domiciliari.(IADL;ADL; CIRS; DISCO). Il caregiver da inserire nel percorso assistenziale è
stato individuato sulla base della sua disponibilità e delle preferenze del paziente. Per poter
369

meglio comprendere durante il colloquio iniziale l’esistenza di problematiche familiari in
grado di impedire l’attivazione del processo di training,, le cause di ostacolo alla dimissione
sono inserite nella raccolta dati volta all’identificazione del caregiver. Al fine di comprendere
ciò che il caregiver deve “sapere” e “saper fare” per potersi occupare del paziente alla sua
dimissione, e nel contempo riconoscere le effettive difficoltà di queste persone si è proceduto
su piani contemporanei:
• Interviste ai caregiver. ·
• Interviste agli operatori territoriali che operano con i caregiver.
• Analisi del processo assistenziale.
RISULTATI
L’analisi della situazione esistente, e le informazioni scaturite dal confronto tra i componenti
del gruppo di lavoro, i risultati delle interviste e la letteratura hanno comportato le definizione
del nuovo processo assistenziale di riferimento, e degli strumenti applicativi per la sua
realizzazione. Le principali fasi del nuove segmento organizzativo prevedono:
1. la valutazione della complessità assistenziale
2. la raccolta dati sul caregiver
3. l’identificazione di un potenziale caregiver
4. il controllo del training
5. la valutazione dei risultati del training prima della dimissione.
Per l’attuazione del nuovo modello sono stati prodotti i seguenti strumenti operativi:
Libretto informativo per il caregiver, una raccolta delle informazioni tecniche utilizzate nel
training
Guida all’inserimento del caregiver nel processo assistenziale.
Una raccolta delle schede operative utili agli operatori per controllare il nuovo processo,
identificare le problematiche e porvi le eventuali correzioni.
CONCLUSIONI
Lo studio vuole contribuire a migliorare il processo di integrazione fra ospedale e territorio,
sostenendo le famiglie sempre più coinvolte nel processo di cura, ed è in linea con i dettami
del Piano Sanitario Nazionale che stabilisce: “l’obiettivo prioritario è la realizzazione di un
processo di riordino che garantisca un elevato livello di integrazione tra i diversi servizi
sanitari e sociali…” L’impatto positivo di questo modello, e la sua diffusione nelle Strutture
Complesse Aziendali potrà ridurre le giornate di degenza per i pazienti che necessitano di
assistenza a domicilio. Questa proposta si può rivelare efficace solo qualora il rifiuto delle
dimissioni sia condizionato da problemi risolvibili attraverso il training di addestramento.
Anche se siamo lontano dal risolvere il problema delle protrarsi delle giornate di degenza, la
diffusione di questo modello consente di agire sul 47% dei pazienti ricoverati in attesa di
essere trasferiti presso altre strutture a bassa o media complessità. Ma, al di là, delle ragioni
organizzative, questo studio ha permesso anche di riflettere su come il concetto di accoglienza
debba superare la forma, per concretizzarsi nel prendersi cura della persona ricoverata.
L’organizzazione ospedaliera troppe volte crea un muro fra se e la famiglia dei pazienti, una
barriera fatta di regole, di orari, di silenzi, l’ambizione di questo lavoro è quindi anche quella
di rivedere l’attuale modello organizzativo, lasciando maggior spazio ad un approccio alla
persona, dove senza limitare le cure ci sia spazio anche per il “care”. Il responsabile delle
ricerca Dott. Pierino Panarisi.
370

Massimiliano Panella Filone tematico C1
Sperimentazione di un modello di gestione integrata del paziente
schizofrenico
Asl 13
CONTESTO E RAZIONALE
La schizofrenia è una grave patologia psichiatrica con caratteristiche di cronicità che colpisce
il funzionamento globale dell’individuo, nel senso della sua individualità. Si manifesta, in
generale, con alterazioni delle percezioni, del pensiero, dell’affettività e quindi, del
comportamento della persona. Nello specifico della schizofrenia sono attualmente reperibili in
letteratura poche esperienze relative a programmi di Disease Management (DM), tuttavia, i
dati presenti sull’efficacia non sono univoci. L’obiettivo della ricerca consiste nella
valutazione di efficacia degli effetti derivanti dall’implementazione di un programma di DM
per i pazienti schizofrenici presso il DSM Nord dell’ASL 13 di Novara.
MATERIALI E METODI
Il disegno dello studio si identifica in un Concurrent Control Trial, applicato per confrontare i
risultati di un gruppo di intervento con quelli di un gruppo di controllo, appaiato per
caratteristiche. Nella ricerca, il gruppo di intervento è rappresentato dai soggetti affetti da
schizofrenia afferenti al DSM Nord, presso cui è stato implemento il programma di DM,
mentre il gruppo di controllo è rappresentato dalle strutture del DSM dell’ASL 11 di Vercelli
(Centro di Salute Mentale-CSM- di Borgosesia e il Servizio Psichiatrico di Diagnosi e Cure -
SPDC- di Vercelli e i Centri Diurni di Borgosesia e Gattinara).
Per la valutazione dell’efficacia del programma di DM è stato definito un apposito set di
indicatori di processo tratti dalla letteratura internazionale (tra cui: compilazione della
documentazione clinica, valutazione testistica, definizione di piano terapeutico, applicazione
VGF, condivisione del progetto terapeutico, somministrazione di farmaci, applicazione di
procedura di contenzione e TSO). Al fine di testare e rendere operativi gli strumenti
approntati per la ricerca, è stato condotto uno studio pilota che ha consentito di valutare la
reale applicabilità degli indicatori. La ricerca ha una durata complessiva di 24 mesi (di cui 12
finanziati con i fondi regionali), con un primo momento di monitoraggio
dell’implementazione del profilo a tre mesi dall’inizio della sperimentazione.
RISULTATI
Il campione, diviso tra Servizio Psichiatrico di Diagnosi e Cura (SPDC), Centro di Salute
Mentale (CSM) e Centro Diurno (CD), consta rispettivamente di 89 soggetti, di cui 18
reclutati in SPDC, 26 al CSM e 45 al CD dell’ASL 13 di Novara, mentre per i controlli i
soggetti sono complessivamente 29 (13 per l’SPDC, 5 al CSM e 11 al CD). La numerosità dei
soggetti selezionati è proporzionale al bacino di utenza delle due ASL. Dallo studio sono
emerse differenze tra i due gruppi, alcune di queste statisticamente significative. Per quanto
riguarda i soggetti reclutati in SPDC dell’ASL 13, il 38,89% del campione era composto da
femmine e il 61,11% maschi, mentre presso l’SPDC di Vercelli il 15,38% dei reclutati erano
donne e 84,62% uomini. Entrambi i gruppi compilano in modo metodico l’esame obiettivo
psichico e quello generale, mentre, solo presso i casi si tiene una riunione settimanale con
l’équipe del territorio per pianificare il progetto terapeutico del paziente. Un’altra differenza
371

iguarda il piano terapeutico che consta di precise operazioni che il medico è tenuto a
svolgere. Queste operazioni sono effettuate da entrambi i gruppi, ma i casi, compilando una
apposita scheda, segnalano in modo più dettagliato quanto fatto e quali attività non è
necessario effettuare. Differenze significative si ritrovano inoltre nella contenzione e nel
ricovero di pazienti in regime di trattamento sanitario obbligatorio (TSO). La contenzione, per
quanto riguarda i casi, non è stata mai attivata mentre è stata applicata nel 38,46% dei
controlli (p

Marzio Panichi Filone tematico A3
Studio epidemiologico delle morsicature canine e identificazione di
nuove strategie di prevenzione in Piemonte
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Patologia Animale
OBIETTIVO
Le Ordinanze Min.Sal. del 2003, 2004 e 2005 (GU n° 281/05) hanno cercato di tutelare
meglio l’incolumità dei cittadini ma le morsicature canine sono ancora oggi un problema
sanitario ed un costo sociale. Questa ricerca si è compiuta sui danni causati dalle morsicature
dei cani alle persone con un’indagine epidemiologica condotta nell’ASL N.8 della Regione
Piemonte negli anni dal 1999 al 2004 per identificare nuove strategie di prevenzione.
MATERIALI E METODI
Sono state esaminati 780 casi di aggressioni di cani e le conseguenti lesioni riportate da adulti,
bambini ed anziani in un territorio che raggruppa 40 Comuni su una superficie di 795 Kmq.
con circa 285.000 residenti e 45.100 cani censiti. I dati sono stati raccolti attraverso le
“Schede di osservazione dei cani morsicatori” del Serv. Vet. ASL ed i “Rapporti di lesione”
compilati dai Pronto Soccorso dei diversi Ospedali del territorio. I risultati relativi ai vari
aspetti presi in considerazione sono i seguenti:
Anno dell’aggressione: 218 aggressioni nel 1999, 152 nel 2000, 122 nel 2001, 82 nel 2002,
99 nel 2003, 107 nel 2004.
Mese dell’aggressione: Aprile 75 aggressioni, Maggio 91, Giugno 103, Luglio 65, Agosto
87, Settembre 66, fino al totale di 780.
Giorno dell’aggressione: Lunedì 40, Martedì 48, Mercoledì 38, Giovedì 50, Venerdì 96,
Sabato 290, Domenica 218.
Ora dell’aggressione: ore serali (18-24) 198 aggressioni, pomeridiane (12-18) 130, il restante
numero nelle altre ore.
Sesso del morsicato: maschi 465, femmine 315.
Età del morsicato: dai 50 ai 60 anni 143, dai 20 ai 30 anni 100, dai 30 ai 40 anni 100, dai 40
ai 50 anni 90, dai 5 ai 10 anni 61, il restante numero fino a 780 nelle altre diverse fasce di età.
Tipo di lesioni riportate: ferite lacero contuse (FLC) 387, FLC multiple 126, escoriazioni
194, contusioni 30, fratture 2, amputazioni falangi 6, lussazioni 1, il restante numero è rimasto
sconosciuto.
Sede delle lesioni: mani 222, gambe 146, avambracci 95, volto 70, braccia 73, il restante
numero fino a 835 (più morsi sulla stessa persona) a carico di molti altri distretti corporei.
Prestazioni mediche effettuate: medicazioni 671, suture 113, trattamenti immunizzanti
(tetano, rabbia) fino a 1190 (più prestazioni ad uno stesso paziente) senza tener conto delle
terapie antibiotiche.
Ospedali: Chieri 303 prestazioni di P.S.,Moncalieri 120, Carmagnola 103, Altri Ospedali 111
373

Giorni di prognosi: da 0 a 10 gg. 644 casi, da 10 a 20 gg. 35 casi, > 20gg. 6 casi di cui 2 con
prognosi di 40gg.
Taglia del cane morsicatore: piccola 142, media 224, grande 406, il restante numero fino a
780 è rimasto imprecisato.
Sesso del cane morsicatore: femmine 140, maschi 498, il numero restante è rimasto
sconosciuto.
Età del cane morsicatore: 214 casi > 7 anni, da 3 a 7 anni 253 casi, da 1 anno e mezzo a tre
59 casi, da 4 a 10 mesi 31 casi, 5 casi per cani < a tre mesi.
Razza del cane morsicatore: Incrocio 302, Pastore tedesco 186, Pastore maremmano 38,
Rottweiler 33, Boxer 22, Dobermann 15, Siberian Husky 14, Pit bull 13, Pastore belga 12,
Dalmata e bassotto nano 11, ecc.
Stato del cane morsicatore: randagi 9, di proprietà 771.
Identificazione dei cani: 562 Sì, 122 No.
Numero di morsicature per cane: 738 cani hanno morsicato una volta, due volte in 37 casi e
3 volte in cinque casi.
Cani che hanno morsicato il proprietario: 185 su 780.
L’identikit del cane morsicatore nell’ASL N. 8 della Regione Piemonte risulta essere il
seguente: si tratta di un cane meticcio, maschio, adulto (>7 anni) di proprietà, di grossa mole,
iscritto all’anagrafe canina, più mordace nei confronti delle persone di sesso maschile e che
risulta più aggressivo nei confronti di persone adulte (50-60 anni) spesso anche verso il
legittimo proprietario (185 casi) e talvolta anche recidivo (40 volte). La stima sui costi
presunti di una aggressione canina che abbia comportato una prognosi di soli 5 giorni, senza
ricovero ospedaliero, senza trasporto in ambulanza, senza invalidità permanente ammonta a
circa 820.00 €, più il costo di due visite veterinarie domiciliari, più gli oneri amministrativi
dei Servizi di Igiene pubblica per un importo complessivo di circa 150.00 € ad evento. Questi
costi medi di una aggressione canina non grave possono fornire un’idea approssimata dei
danni subiti dalla società per colpa dei cani mordaci.
STRATEGIE DI PREVENZIONE IN PIEMONTE
L’incolumità pubblica potrebbe essere tutelata meglio attraverso l’adozione di
Azioni di prevenzione:
• campagne di informazione ai cinofili per una maggiore consapevolezza delle proprie
responsabilità
• percorsi educativi nelle scuole di ogni grado sul corretto approccio alla relazione animaliuomo
• completamento dell’Anagrafe canina regionale (ex L. R. 18/04)
• formazione di Medici Veterinari “comportamentalisti” nell’ambito dei Servizi veterinari
delle ASL
• istituzione di un Osservatorio Regionale dei cani morsicatori
• creazione di una Banca Dati nazionale per i cani dichiarati “pericolosi”
• corsi professionalizzanti per commercianti ed allevatori di cani bbligo di iscrizione degli
addestratori all’Albo nazionale (D.M 8/3/2005 M.P.A.F.)
374

Azioni restrittive ·
• ordinanza sindacale o dell’ASL di osservazione coatta per i cani morsicatori appartenenti
a persone non consenzienti e denuncia all’A. G. in caso di inottemperanza
• obbligo di visita comportamentale per cani che arrecano lesioni con prognosi > di 20
giorni
• obbligo per il proprietario di trasmettere all’ASL la conseguente valutazione veterinaria in
30 gg
• obbligo per il Medico Veterinario specializzato di trasmettere all’ASL l’esito della
valutazione
• proibizione a detenere cani per i proprietari non in grado di saper controllare l’aggressività
del proprio cane e conseguente eventuale sequestro da parte dell’A. G. ·
• ordinanza Sindacale o Prefettizia di soppressione eutanasica per i cani mordaci dichiarati
irrecuperabili perché comprovatamene pericolosi (Art. 2 Comma. 6 L.281/91) ·
• obbligo di guinzaglio e museruola in luogo pubblico fino a valutazione comportamentale
eseguita per i cani che hanno arrecato lesioni con prognosi > di 20 gg. ·
• obbligo di museruola o guinzaglio nei luoghi pubblici per tutti i cani di taglia media e
grande
• istituzione del brevetto “cane buon cittadino” a livello dei Comuni capoluoghi di
Provincia controllo e verifica degli Addestratori che producono cani iperattivi o che ne
esaltano le doti aggressive ·
• indicazione di presenza di “cani potenzialmente pericolosi” anche nei luoghi non aperti al
pubblico
CONCLUSIONI
Le azioni preventive e restrittive succitate possono offrire spunti al legislatore regionale e
nazionale per promulgare disposizioni di legge più idonee per tutelare l’incolumità pubblica.
375

Maurizio Parola Filone tematico A4
Terapia antifibrotica sperimentale cellulo-mirata nella prevenzione delle
epatopatie croniche
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale
OBIETTIVO
L’obiettivo del progetto di ricerca era quello di valutare sperimentalmente la possibilità di
indurre in modo mirato e cellulo-specifico apoptosi classica o altra forma di morte cellulare in
cellule stellate epatiche umane attivate a fenotipo miofibroblastico o HSC/MF (cellule profibrogeniche)
come base di una seria elaborazione di strategie terapeutiche capaci di ridurre
e/o rallentare l’evoluzione fibrotica delle epatopatie croniche.
METODI E RISULTATI
Le cellule HSC/MFs umane risultano resistenti alla induzione di apoptosi e altre forme di
morte cellulare E’ stata valutata la sensibilità delle HSC/MF umane (isolate da fegati umani
non utilizzabili per trapianto) all’induzione di apoptosi da parte di una serie di stimoli e
condizioni pro-apoptotiche standard o capaci di indurre apoptosi in HSC/MF di origine
murina. Le HSC/MFs umane, utilizzate a fenotipo simil-miofibroblastico attivato (passaggi da
4° a 7° in coltura) sono risultate insensibili ai seguenti stimoli pro-apoptotici (in parentesi
tempi o intervalli di concentrazione):
1. assenza di siero fetale sino a 72-96 ore;
2. TNF (10 - 100 ng / ml);
3. NGF (100 - 500 ng / ml);
4. ligando di Fas o FasL, 50 - 200 ng / ml);
5. doxorubicina (10 - 200 nM);
6. etoposide (1 - 25 mM);
7. cicloesimide (CHX, 20 - 200 mg/ml);
8. actinomicina D (ActD, 0,1 - 1 mg/ml);
9. associazione TNF (20 ng/ml) + CHX (50 mg/ml);
10. associazione FasL (50 ng/ml) + CHX (20 mg/ml);
11. gliotossina (GT, 0,1 - 1,0 mM);
12. produzione di anione superossido (sistema ipoxantina – xantina ossidasi);
13. 4-idrossi-nonenale (HNE, 0,1 – 10 mM);
14. perossido di idrogeno (H2O2 0,1 – 100 mM).
L’induzione di apoptosi caspasi dipendente era ottenuta solo in presenza di CHX (inibitore
della sintesi proteica), ActD (inibitore della trascrizione) o di trattamenti contemporanei
TNF/CHX e FasL/CHX, adottando concentrazioni di TNF e FasL minime e concentrazioni di
CHX di per sè inefficaci. La gliotossina o GT è stata l’unica molecola risultata capace di
376

determinare morte cellulare nelle HSC/MFs umane. La GT, usata a concentrazioni minime
(0,1 e 1,0 mM) induce in tempi rapidissimi (entro 2-4 ore) condensazione nucleare e distacco
delle cellule dal substrato di coltura. Un’analisi approfondita dei vari parametri di apoptosi ha
rivelato come la GT non induca apoptosi classica o caspasi-dipendente ma piuttosto una morte
programmata di tipo simil-apoptotico. Le cellule HSC/MFs umane sono risultate anche
estremamente resistenti alla induzione di morte di tipo necrotico: tale evento è stato ottenuto
solo in presenza di concentrazioni molto elevate di H2O2 (1 mM), HNE (25 e 50 mM), CHX
(200 mg/ml) ed etoposide (50 mM). Meccanismi alla base della sopravvivenza delle
HSC/MFs umane Le HSC/MFs umane, che possiedono recettori specifici per stimoli quali
TNF, FasL e NGF nonché un corredo completo di componenti chiave dell' apparato
apoptotico, paiono capaci di sopravvivere ai più comuni stimoli pro-apoptotici in quanto nel
corso del cosiddetto processo di attivazione acquisiscono peculiari caratteristiche antiapoptotiche.
I dati ottenuti indicano che le cellule umane, passando dal fenotipo quiescente
(cellule appena isolate) a quello miofibroblastico (cellule a passaggio 4 – 7 in coltura)
perdono la capacità di sintetizzare Bax ed iper-esprimono, per contro, Bcl-2.
L’iper-espressione di Bcl-2 è stata osservata anche “in vivo” (analisi immunoistochimica) in
biopsie umane ottenute da pazienti cirrotici (Score Metavir F4, con eziologia da infezione
cronica con HCV; biopsie usate in accordo alle linee guida di comportamento etico vigenti).
Nei fegati umani cirrotici, in cui gli epatociti sono negativi per Bcl-2, la positività per questa
proteina anti-apoptotica è stata rintracciata, oltre che in cellule mononucleate (linfociti e
macrofagi) ed in alcune cellule dell’epitelio biliare, solo in cellule a localizzazione
sinusoidale/perisinusoidale caratterizzate da tipico aspetto miofibroblastico corrispondente a
quello delle cellule a-SMA positive. Questi aspetti di immunopositività per Bcl-2 sono stati
osservati soprattutto nelle cosiddette aree di interfaccia tra i setti fibrotici ed il parenchima ed
in tutte le biopsie ottenute da fegati cirrotici umani analizzate.
A riprova del ruolo cruciale svolto “in vitro” e, presumibilmente, “in vivo”,
dall’iperespressione di Bcl-2 nelle HSC/MFs sono stati ottenute le seguenti evidenze
sperimentali: a) le cellule HSC/MFs senescenti (passaggi in coltura tardivi e cellule positive
per X-Gal) che mostrano la scomparsa dei livelli proteici di Bcl-2, diventano sensibili
all’induzione di apoptosi caspasi-dipendente da parte di solo TNF; b) ricorrendo alla strategia
di RNA interference ed utilizzando specifici siRNA, capaci di abrogare completamente
l’espressione di RNAm per Bcl-2 umano in cellule HSC/MFs a passaggio da 4 a 7 in coltura,
le cellule così “silenziate” sono diventate anch’esse sensibili all’induzione di apoptosi da solo
TNF (condizioni che non si verifica né nelle cellule di controllo non trasfettate che nelle
cellule transfettate con un “non-silencing” siRNA).
Potenziale significato traslazionale dei dati ottenuti
Le cellule HSC/MFs umane, cellule che svolgono un ruolo primario nella evoluzione
fibrosclerotica delle epatopatie croniche di interesse clinico, presentano una peculiare
attitudine alla sopravvivenza a vari stimoli e condizioni pro-apoptotiche acquisita nel corso
del processo di attivazione. A differenza di quanto descritto in modelli sperimentali animali e
per le HSC/MFs murine, (ove è descritto un parallelismo tra cessazione dell’esposizione allo
stimolo fibrogenico, reversione istologica dell’epatopatia cronica ed apoptosi delle
HSC/MFs), nelle cellule HSC/MFs umane il processo di attivazione induce una attitudine alla
sopravvivenza che è potenzialmente capace di favorire la progressione fibrosclerotica verso lo
stadio di cirrosi e di limitare la reale reversione istopatologica nelle epatopatie croniche
umane.
377

PUBBLICAZIONI
I risultati ottenuti sono oggetto delle seguenti pubblicazioni:
1. Zamara E et al. 4-Hydroxynonenal as a selective pro-fibrogenic stimulus for activated
human hepatic stellate cells. J. Hepatol. (2004) 40, 60-68.
2. Novo E et al. Dose-dependent and divergent effects of superoxide anion on cell death,
proliferation and migration of activated human hepatic stellate cells. Gut (2005) accepted
on July 16th 2005, Gut Published Online First: 24 July 2005.
doi:10.1136/gut.2005.069633
3. Novo E et al. Overexpression of Bcl-2 by activated human hepatic stellate cells: resistance
to apoptosis as mechanism of progressive hepatic fibrogenesis. Gut (2005), revision
submitted for publication on November 17th 2005.
378

Adele Parziale Filone tematico A2
Ruolo dei polimorfismi del recettore 1 per la melanocortina e del
recettore della vitamina D nel rischio di melanoma
Presido Sanitario Gradenigo
CONTESTO E RAZIONALE
Il Melanoma maligno (MM) rappresenta la più grave delle neoplasie cutanee e la prognosi per
taluni MM è estremamente infausta. Il MM rappresenta una malattia dei soggetti di pelle
chiara e l’esposizione alla luce ultravioletta appare un elemento cruciale, sebbene la relazione
fra esposizione e rischio non risulta ben definita. Altri importanti elementi di rischio sono la
presenza di un elevato numero di nevi o di nevi atipici, i capelli rossi e gli occhi azzurri o
verdi. Si conosce relativamente poco sui fattori genetici che modulano la suscettibilità al MM
e la sua evolutività. Il gene che codifica per il recettore della Vitamina D (VDR) potrebbe
influenzare la suscettibilità al MM. A supporto di questa ipotesi i dati che dimostrano che l’
1,25 (OH)2D3 (il derivato ormonale della Vitamina D3 e ligando del VDR) ha effetti
antiproliferativi e pro-differenziatori in cellule che esprimono il VDR. Non solo ma sono state
identificate associazioni fra 1,25 (OH)2D3 e la suscettibilità a neoplasie come il tumore della
mammella, della prostata e del colon, tanto in relazione ai livelli sierici dell’1,25 (OH)2D3,
che ai polimorfismi del gene VDR. Melanociti e cellule di melanoma esprimono il VDR e in
vitro l’1,25 (OH)2D3 ha proprietà antiproliferative. In vivo esiste attualmente scarsa evidenza
di coinvolgimento della Vitamina D3 nella genesi del MM, sebbene bassi livelli circolanti di
1,25 ((OH)2D3 siano stati riportati in soggetti affetti da MM. Cinque siti polimorfici (BsmI,
ApaI, FokI, TaqI, Tru9) sono stati identificati nel gene che codifica per il VDR ed esiste
evidenza che tali polimorfismi abbiano effetti funzionali.
OBIETTIVO
Valutare le relazioni fra polimorfismi del VDR e suscettibilità al melanoma cutaneo.
MATERIALI E METODI
Pazienti: in accordo con il protocollo, ma in proporzione alla quota di finanziamento, sono
stati arruolati consecutivamente 100 pazienti con diagnosi istologica di MM in situ o invasivo,
25 pazienti affetti da carcinoma basocellulare e 8 pazienti affetti da carcinoma spinocellulare;
i pazienti con patologie maligne concomitanti sono stati esclusi. I soggetti di controllo, in
numero di 100, bilanciati per età e sesso, sono stati selezionati fra soggetti privi di storia di
malattie infiammatorie o neoplastiche.
Metodi: il DNA è stato estratto da sangue periferico con metodiche commerciali,
l’amplificazione dei loci polimorfici è stata effettuata impiegando primer specifici, la
determinazione dei polimorfismi genici è stata valutata attraverso RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism) e successiva corsa dei prodotti di digestione del DNA su gel
di agarosio al 2% colorato con etidio bromuro (i dettagli relativi a primer ed enzimi di
restrizione sono forniti nella versione in estenso del progetto). In relazione all’entità del
finanziamento non si è potuto procedere alla valutazioni dei polimorfismi del Melanocortin-1
receptor.
379

RISULTATI
Cento pazienti con MM (età media ± SD 54,4 ± 15,4 anni, femmine 62%) e 100 controlli (età
media ± SD 53,9 ± 14,7 anni, femmine 62%) sono stati arruolati nello studio.
Distribuzione dei genotipi
Bsm I
MM: C/C 14%, C/T 69%, T/T 17%
Controlli: C/C 8%, C/T 72%, T/T 20% (p = n.s.)
Apa I
MM: G/G 15%, G/A 25%, A/A 60%
Controlli: G/G 7%, G/A 23%, A/A 70% (p = n.s.)
Tru9
MM: G/G 2%, G/A25%, A/A 73%
Controlli: G/G 1%, G/A 16%, A/A 83% (p = n.s.)
TaqI
MM: T/T40%, C/T 45%, C/C 15 %
Controlli: T/T 35%, C/T 50%, C/C15 % (p = ns)
FokI
MM: C/C 34%, C/T 47%, T/T 19%
Controlli: C/C 51%, C/T 36%, T/T 13% (p < 0,05)
Si è osservata una ridotta proporzione di soggetti affetti da MM con il genotipo FokI C/C, OR
per MM 0.66 (p < 0.05). Non si sono osservate associazioni significative fra frequenze
genotipiche e sede del tumore, tipo di pelle o colore degli occhi. Ugualmente non significativa
la distribuzione dei polimorfismi nei 25 carcinomi basocellulari e negli 8 carcinomi
spinocellulari.
CONCLUSIONI
Lo studio ha evidenziato che omozigosità per l’allele selvaggio (C) al sito di restrizione FokI
si associa ad un rischio ridotto di MM, con una riduzione del rischio attribuibile al genotipo
C/C stimata al 21%. Il polimorfismo FokI T/T può funzionalmente tradursi in un deficit
dell’attività dell’1,25 (OH)2D3 a livello cellulare con un vantaggio di crescita dei melanociti.
E’ dunque verosimile che il polimorfismo al sito di restrizione FokI possa essere implicato
non solo nel modulare la suscettibilità all’MM, ma anche il suo successivo atteggiamento di
crescita. Sebbene statisticamente significativi i risultati da noi ottenuti sono lontani dalla
significatività clinica; la riduzione del rischio di circa il 20% indotto dal genotipo FokI C/C è
infatti troppo debole – e troppo costosa da applicare - per trovare una indicazione nella
preselezione dei pazienti per i programmi di prevenzione del MM.
E’ verosimile inoltre che la piena espressione funzionale di un polimorfismo genico si realizzi
raramente, per la presenza di genotipi antagonisti o agonisti di tale funzione. E’ dunque
verosimile che solo la valutazione di genotipi complessi (aplotipi) possa darci una reale stima
del rischio o della protezione nei confronti di una determinata patologia.
380

Barbara Pasini Filone tematico A2
Studio dei fattori genetici di rischio nell'adenocarcinoma gastrico
famigliare: una malattia ereditaria multifattoriale?
Università degli Studi di Torino,
Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica
CONTESTO E RAZIONALE
Il progetto è nato dall’osservazione di 4 nuclei famigliari con forte ricorrenza di tumori
gastrici (GC). Nella famiglia 1 (prov. di Cuneo) erano stati inizialmente riferiti 13 casi di GC
in 2 generazioni. La successiva acquisizione della documentazione clinica di diversi membri
affetti della famiglia ha permesso di confermare la diagnosi in 10 casi e di dimostrare la
presenza di 2 casi di npl del colon-retto, 2 casi di epatoca, 1 caso di npl del pancreas e 1 caso
di npl dell’esofago. La famiglia 2 (prov. di Treviso) presenta 6 casi di GC in 2 generazioni (1
dei 6 con istotipo neuro-endocrino) più un caso con diagnosi incerta di cui non è stato
possibile acquisire la relativa documentazione clinica. Altri membri della famiglia presentano
una storia clinica di ulcera duodenale ed esofago di Barrett. Nella famiglia 3 (prov. di
Caltanisetta) sono riferiti 6 casi di GC in tre generazioni di cui 3 documentati. La famiglia 4
(prov. di Torino) presenta 4 casi documentati di GC in un’unica generazione. Le famiglie
suddette sono risultate suggestive di una forte componente di rischio genetico ai limiti con
l’ereditarietà autosomica dominante a penetranza incompleta.
OBIETTIVO
Dal momento che nessuna forma di predisposizione allo sviluppo di tumori sembra coerente
con il fenotipo osservato nei 4 nuclei famigliari di cui sopra il progetto si è proposto di:
1. ampliare la casistica di GC famigliari,
2. escludere la presenza dell’HNPCC,
3. valutare lo stato (favorevole/sfavorevole) dei polimorfismi noti nei geni legati alla risposta
infiammatoria,
4. condurre uno studio di fattibilità per un’eventuale analisi di linkage volta alla ricerca di
geni di suscettibilità.
METODIE E RISULTATI
1) L’analisi del database in Progeny del progetto Rigenio comprendente 295 nuclei famigliari
inviati in consulenza genetica per npl del tratto gastro-enterico famigliari, e/o multiple e/o
giovanili nei 3 centri di riferimento per la genetica oncologica della Regione Piemonte ha
permesso di identificare 6 nuove famiglie con ricorrenza di GC e un caso di tumore giovanile
(GC a 31 anni). Nelle 6 nuove famiglie, il numero di casi di GC varia tra i 2 e i 6 parenti
affetti con 1-4 generazioni interessate. Nella casistica del progetto Rigenio, tra i casi di
neoplasie del colon inviati in consulenza genetica per una diagnosi di conferma o di
esclusione dell’HNPCC (180 casi) la percentuale di nuclei famigliari con presenza di GC in
associazione alle neoplasie del colon si è rivelata quasi costante in tutte le categorie (19.2%
delle famiglie HNPCC, 15.8% delle famiglie HNPCC-like, 18.8% delle famiglie classificate a
medio o basso rischio genetico). Questo dato, oltre a confermare che il GC è parte integrante
dello spettro fenotipico dell’HNPCC, suggerisce che in una quota di nuclei famigliari senza
381

mutazioni responsabili dell’HNPCC, la contemporanea presenza di npl del colon e dello
stomaco possa essere imputata a fattori di rischio comuni per entrambe le neoplasie anche se
non si può escludere l’associazione casuale.
2) Poiché come detto il GC è parte integrante del fenotipo del carcinoma famigliare del colon
non poliposico o HNPCC, si è provveduto all’indagine di questa malattia nelle 8 famiglie su
10 per le quali erano disponibili campioni biologici di sangue e/o di tessuto tumorale nonché
nel caso di GC giovanile. Nelle famiglie 2, 3, 4, 5, 6 e 9 l’analisi di 1-3 campioni di GC per
famiglia ha rivelato la presenza di microsatelliti stabili (BAT25, BAT26 + BAT40 o 3
marcatori di-nucleotidici del pannello di Bethesda) con proteine MLH1, MSH2 e MSH6
normalmente espresse nel tessuto tumorale. Lo stesso dicasi per il caso di GC giovanile. Nelle
famiglie 2, 3 e 7 la ricerca di mutazioni germinali puntiformi e delezioni nei geni MLH1 e
MSH2 si è rivelata negativa. Nella famiglia 1, l’analisi dei tessuti tumorali ha dato risultati
discordanti (microsatelliti instabili in un ca. gastrico e del retto, microsatelliti stabili in un ca.
gastrico e del pancreas) ma la ricerca di mutazioni germinali puntiformi e delezioni nei geni
MLH1 e MSH2 in un membro affetto della famiglia si è di nuovo rivelata negativa. In base a
questi dati, l’HNPCC può essere escluso come fattore di rischio di tipo genetico nei nuclei
famigliari con ricorrenza del GC da noi selezionati.
3) Si è quindi cercato di mettere a punto le condizioni sperimentali per la valutazione di
polimorfismi in geni legati al controllo della risposta infiammatoria con l’intento di eseguire
la suddetta analisi anche nei casi di cui era disponibile solo materiale biologico incluso in
paraffina. Sono stati selezionati i geni codificanti l’Interleuchina-1b (IL-1b: polimorfismi –31
T/C e –511 C/T), il fattore di necrosi tumorale alfa (TNFa: polimorfismo –308 G/A),
l’Interleuchina-10 (IL-10: polimorfismi –592 C/A, -819 C/T e –1082 G/A) e l’antagonista
endogeno dell’IL-1 (IL-1RN: VNTR nell’introne 2). Solo per l’ultimo marcatore non si sono
ancora ottenute condizioni sperimentali soddisfacenti per l’analisi di DNA estratto da tessuto
paraffinato. La ricerca degli alleli sfavorevoli associati allo sviluppo del GC eseguita in prima
istanza in membri affetti delle famiglie 1, 2, 3, 4 e 5 ha dato risultati preliminari interessanti.
Nei nuclei famigliari con ricorrenza del GC e associazione di altre neoplasie si è osservata la
presenza di alleli sfavorevoli ad uno, due o tutti e tre i loci analizzati. Al contrario, nel nucleo
famigliare 3 caratterizzato dalla presenza di 6 casi di GC di cui 3 documentati di istotipo
tubulare e assenza di altre neoplasie, la presenza di alleli sfavorevoli non segregava con la
malattia.
CONCLUSIONI
I dati ottenuti durante lo svolgimento di questo progetto consentono di trarre alcune
conclusioni:
• il GC è una malattia multifattoriale alla cui insorgenza partecipano diversi fattori di
rischio sia di tipo ambientale che genetico;
• più del 15% dei nuclei famigliari con HNPCC presentano famigliari affetti da GC (da 1 a
3 per famiglia) e pertanto mutazioni germinali nei geni del mismatch repair possono
rappresentare una rara causa di questa malattia;
• sono stati raccolti 22 nuclei famigliari con contemporanea presenza di neoplasie del colon
e GC non riconducibili ad HNPCC nelle quali andranno indagati ulteriori fattori di rischio
di tipo genetico o ambientale;
• tra le famiglie con prevalente ricorrenza del GC una percentuale di casi potrebbe essere
riconducibile alla presenza di alleli sfavorevoli multipli nei geni che controllano la
risposta infiammatoria;
• un numero estremamente limitato di nuclei famigliari con GC potrebbe essere
riconducibile a fattori di rischio genetici diversi da quelli testati. Su questi dovrà
concentrarsi l’eventuale ricerca di nuovi geni di suscettibilità allo sviluppo del GC.
382

Guido Pastore Filone tematico D1
Matrimoni e prole nelle persone, residenti in Piemonte, guarite da un
tumore maligno insorto in eta’ pediatrica
Asl 11
Nel corso dei 2 anni utilizzati per realizzare il progetto di ricerca sono stati raggiunti gli
obiettivi individuati in fase di presentazione dello studio: stimare la frequenza e la durata dei
matrimoni, la fertilità, il numero dei figli e la loro distribuzione per sesso tra gli individui
guariti da un tumore maligno diagnosticato in età pediatrica, iscritti nel ROT e residenti in
Piemonte.
FASI DELLA RICERCA
1. individuazione dei bambini iscritti nel ROT e residenti in Piemonte con più di 18 anni di
età al 31.12.2003;
2. individuazione dei bambini piemontesi con più di 18 anni di età al 31.12.2003 e non
iscritti nel ROT, ma iscritti nel RTIP;
3. accertamento di esistenza in vita, stato civile e composizione del nucleo familiare presso
gli Uffici Anagrafici dei comuni di residenza;
4. messa a punto dei metodi statistici e implementazione dei programmi necessari per il
calcolo della probabilità di contrarre matrimonio e di avere un figlio;
5. realizzazione delle analisi per i casi individuati ai punti 1. e 2.
METODI E RISULTATI (1.-4.)
Il database utilizzato nello studio include 1237 individui con diagnosi di tumore infantile (0-
14 anni) avvenuta nel 1967-2000, residenti in Piemonte al momento della diagnosi, con età
superiore a 18 anni al 31.12.2003. E’ stata accertata l’esistenza in vita, lo stato civile e la
composizione del nucleo familiare attraverso richieste agli Uffici Anagrafici dei comuni di
residenza. Alla fine del follow-up 1147 (92.7%) soggetti sono risultati vivi, 77 (6.2%)
deceduti, e 13 (1.1%) persi al follow-up; l’età media alla fine del follow-up è stata di 28.5
anni. I casi sono stati classificati in nubili/celibi, coniugati/conviventi, separati o divorziati e
vedovi. Come data di inizio della convivenza è stata riportata la data di emissione del
certificato anagrafico. Ciascun individuo è stato considerato coniugato o convivente fino al
momento in cui il suo stato civile è risultato essere ‘già coniugato’ o fino al momento in cui
ha iniziato una convivenza con individuo diverso dal precedente coniuge/convivente. Sono
state confrontate le distribuzioni dello stato civile per genere, età alla diagnosi, periodo di
diagnosi e per i principali tipi di tumore maligno. E’ stata stimata l’età media al primo
matrimonio per ciascun tipo tumorale, testando la significatività delle differenze tra i gruppi
attraverso l’analisi della varianza. La probabilità di matrimonio è stata stimata con il metodo
di Kaplan-Meier (tempo all’evento: età dell’individuo). Il rischio relativo di matrimonio dei
soggetti per tipo tumorale è stato stimato con il modello di Cox, aggiustando per età alla
diagnosi, periodo di diagnosi e stato in vita alla fine del follow-up. E’ stata stimata la durata
media del matrimonio testando la significatività delle differenze tra i gruppi tumorali.
383

Tutte le analisi sono state condotte stratificando per genere. L’analisi della fertilità è stata
condotta con metodologia analoga a quella applicata per l’analisi della probabilità di
matrimonio, stimando l’età media alla nascita del primo figlio, la probabilità di avere un figlio
e il rischio relativo di gravidanza. Sono stati inoltre stimati il numero di figli per ciascun
individuo e il rapporto M/F nel sesso dei figli. Le analisi sono state condotte utilizzando i
software SAS (Versione 8.2) e STATA (Versione 7.0) implementando particolari codici per le
specifiche esigenze.
METODI E RISULTATI (5.)
Dei 1273 individui inclusi nello studio, alla fine del follow-up 919 (74.3%) non sono mai stati
sposati o non hanno mai avuto una convivenza, 302 (24.4%) sono sposati o hanno una
convivenza in corso, 14 (1.1%) sono divorziati/separati o hanno terminato una convivenza e 2
(0.2%) sono vedovi. L’età media al matrimonio è stata di 26.1 anni (range: 18.0-42.4).
L’8.5% dei soggetti si è sposato o ha iniziato una convivenza nel periodo 1973-1983, il 30.2%
nel periodo 1984-1993 e il 61.3% nel periodo 1994-2003. Dalle analisi sulla probabilità di
matrimonio sono stati esclusi 13 individui persi al folow-up, poiché per tali soggetti le
informazioni sullo stato civile o non sono note o hanno data di aggiornamento precedente a
quella dei certificati dei soggetti rintracciati all’Ufficio Anagrafico. Le donne hanno una
probabilità di matrimonio significativamente più alta degli uomini (Log-rank test: p

Alberto Paudice Filone tematico A5
Studio pilota per il follow-up degli esiti a lungo termine di un gruppo di
pazienti psichiatrici.
Il Porto Onlus
Istituto per la Ricerca ed il Trattamento del Disagio Esistenziale Giovanile
OBIETTIVO
La Comunità Terapeutica Il Porto Onlus dal 1983 si occupa del trattamento residenziale della
tossicodipendenza e della patologia psichiatrica. L’obiettivo del presente studio è la
costituzione di una fase pilota di uno studio adeguato a raggiungere degli obiettivi di
valutazione.
MATERIALI E METODI
Dal punto di vista del metodo il progetto è articolato in cinque fasi: campionamento dei casi
(120 casi estratti su un totale di 387 nel periodo 1993-2002), documentazione del trattamento
residenziale, definizione della tipologia degli eventi ed esiti indagati, modalità operative del
follow-up, analisi dei dati e conclusioni circa la fattibilità. In questa prima parte del lavoro
l’attenzione è stata focalizzata sulla documentazione del trattamento residenziale.Per ogni
residente è disponibile una cartella clinica; non ci sono mai stati criteri unitari nella
compilazione. E’ stata definita una scheda griglia di criteri demografici, amministrativi,
diagnostici e terapeutici sintetici entro la quale riversare il contenuto complessivo della
cartella originale.La verifica sul campo ci ha permesso di scoprire un livello di disorganicità e
di incompletezza delle cartelle cliniche elevato e superiore alle nostre aspettative. Il livello di
disorganicità e la scarsa funzionalità nel reperimento delle informazioni ci ha indotti a
decidere di compilare la scheda griglia per tutte le 387 cartelle cliniche del periodo in esame
(non solo per quelle relative ai casi campionati presi in considerazione dallo studio) e per le
restanti 295 relative al periodo 1983-1992; questa diversione, non pertinente allo studio e che
ha comportato un significativo aggravio di lavoro, ha però rappresentato per Il Porto
un’occasione per avere finalmente un archivio di dati di facile consultazione.
ANALISI DEI DATI
L’archivio è costituito dagli utenti inseriti in comunità nel periodo 1983-2002 (682
soggetti).Per un’osservazione più dettagliata si è stratificata la popolazione in quinquenni.
Dati demografici
Sesso: i soggetti sono in maggiore misura maschi (con un’oscillazione tra i periodi che varia
tra il 64% ed il 71%).L’età di ingresso è distribuita prevalentemente nella fascia d’età che va
dai 18 ai 45 anni. Nel primo periodo vi è una prevalenza della fascia 18-25 anni (48% degli
ingressi) che progressivamente si riduce nei quinquenni successivi fino al 29%. La
popolazione che accede alla comunità è progressivamente più vecchia: la fascia d’età 36-
45 anni passa dal 2 al 18%.
Stato civile:questo dato non è utilizzabile in quanto risulta ampiamente mancante nelle
cartelle.
Titolo di studio: situazione simile alla precedente si pone anche per questa variabile.
385

Dati relativi alla terapia comunitaria
Giorni totali di residenzialità: almeno il 30% degli utenti di ogni quinquennio risiede in
comunità per più di un anno. Con il passare dei quinquenni si è ridotta la permanenza per
brevi periodi mentre è aumentata la permanenza per periodi più lunghi (oltre 181 gg.).Tra gli
utenti con più di un anno di permanenza almeno il 65% è stato residente tra un anno e due
anni e mezzo. Il numero di ingressi per utente è progressivamente diminuito nel tempo (dal
54% all’85% di utenti con un solo ingresso).E’ quindi diminuita la possibilità di un revolvingdoor
dello stesso utente nell’istituzione. Le spiegazioni di questo dato sono molteplici: alcune
riguardano il cambiamento della tipologia di pazienti, altre mutamenti culturali (teorici e
tecnici) con conseguenti modalità operative differenti nell’accoglienza e nella gestione dei
falliti inserimenti.
Ricoveri: il dato relativo ai ricoveri avvenuti durante la permanenza in comunità sarebbe
importante sia in termini di osservazione ‘’storica’’, sia in relazione all’efficacia della terapia
comunitaria (i ricoveri sono uno dei criteri più importanti utilizzati dalla ricerca in psichiatria
per valutare l’efficacia di una terapia). Purtroppo le cartelle sono risultate inaffidabili ed
incomplete.
Diagnosi: per ben il 13% nel primo quinquiennio, il 6% nel secondo, il 33% nel terzo ed il
19% nel quarto non è stato possibile risalire a una diagnosi.Le diagnosi di sola
tossicodipendenza diminuiscono progressivamente e nettamente nel tempo (dal 52% al 6%);
aumentano proporzionalmente i casi che, in associazione alla diagnosi di
tossicodipendenza,ricevono anche una diagnosi psichiatrica (psicosi ma soprattutto disturbo di
personalità).Questo dato richiede molteplici valutazioni e apre numerosi interrogativi:
l’istituzione è cambiata nel tempo rivolgendo la sua attenzione a una popolazione diversa?
Sono state diagnosticate diversamente alcune caratteristiche proprie dell’abusatore di sostanze
stupefacenti che precedentemente venivano misconosciute? L’invio progressivamente più
frequente (fino alla quasi totalità degli utenti dell’ultimo quinquennio) da parte del servizio
pubblico invece che dall’ambito privato ha favorito l’ingresso di persone tossicodipendenti
che per problematiche psichiatriche non vengono tollerate nelle tradizionali comunità per
tossicodipendenti ad impronta “ lavorativa”? Da segnalare il netto aumento negli ultimi dieci
anni di inserimenti di utenti con diagnosi di psicosi.
Trattamento farmacologico: anche i dati riguardanti il trattamento farmacologico sono
indicativi dell’incompletezza delle cartelle cliniche ma i casi con assenza di riferimenti alle
terapie farmacologiche, senza alcuna possibilità di determinare con certezza la reale assenza
di trattamento, sono passati dall’86% del primo periodo al 17% dell’ultimo.
CONCLUSIONI
Il livello di disorganicità e soprattutto di incompletezza delle cartelle cliniche ci impone una
serie di considerazioni e di scelte.Un’analisi delle risorse disponibili, della qualità del
materiale in nostro possesso e delle priorità ci porta a ritenere più opportuno mutare gli
obiettivi dello studio e destinare le risorse restanti nel mettere a punto nei tempi più brevi
possibili dei sistemi adeguati di raccolta di dati demografici, amministrativi e clinici; questi
dovrebbero permettere la raccolta, attraverso modalità di compilazione semplici, di una serie
di variabili (assumendo come base ad es. la scheda griglia) e prevedere uno spazio per la
valutazione di alcuni esiti (ad es. quelli individuati per il progetto di follow-up).In sostanza,
prendendo atto della scadente qualità del materiale in nostro possesso, è probabilmente più
opportuno abbandonare la progettazione di uno studio retrospettivo problematico e oneroso e
fin da ora concentrare le risorse per dotarci in tempi brevi degli strumenti necessari per uno
studio prospettico routinario.
386

Angelo Penna Filone tematico C2
Costruzione e applicazione di un percorso integrato tra ospedale e
territorio nella gestione dello scompenso cardiaco
Asl 12
OBIETTIVI
Obiettivi principali del progetto regionale erano quelli di:
1. migliorare l’assistenza del paziente affetto da scompenso cardiaco nell’Azienda Sanitaria
Locale di Biella, attraverso la promozione di interventi di documentata efficacia e
appropriatezza in campo diagnostico e terapeutico;
2. promuovere l’informazione dei pazienti e dei familiari e la comunicazione tra operatori.
Nello specifico il progetto intendeva:
a) assicurare gli accertamenti diagnostici utili ed evitarne un uso improprio sia in ospedale
sia sul territorio;
b) promuovere l’uso di terapie efficaci e disincentivare quelle inefficaci;
c) ridurre i ricoveri ripetuti;
d) ricercare a livello territoriale le soluzione più idonee di presa in carico dei pazienti dimessi
dall’ospedale;
e) coinvolgere il paziente e i familiari nel progetto terapeutico.
METODI E RISULTATI
Nell’ambito del progetto sono stati realizzati:
a) la costituzione di una equipe multidisciplinare aziendale (circa 15 Operatori)
rappresentativa delle diverse professionalità mediche e infermieristiche delle seguenti
strutture: Cardiologia, Medicina, Geriatria, Radiologia, Laboratorio, Direzione Sanitaria,
Distretti e SAST oltre ai rappresentanti delle equipe dei Medici di Famiglia;
b) riunioni del gruppo di lavoro multidisciplinare che ha discusso le evidenze sintetizzate da
Clinical Evidence e linee-guida internazionali allo scopo di: ottimizzarne l’applicazione
nel contesto locale, redigere un documento tecnico di adattamento aziendale sullo
scompenso cardiaco;
c) un documento dal titolo “Insufficienza cardiaca”, linee-guida da diffondere tra i Medici
Ospedalieri e Territoriali dell’Azienda Sanitaria Locale di Biella (circa 600 copie anche
disponibili sul sito www.asl12.piemonte.it);
d) un opuscolo informativo ad uso dei pazienti e dei loro familiari con informazioni relative
agli stili di vita, alla gestione dei farmaci ecc. (10.000 copie anche disponibili sul sito
www.asl12.piemonte.it);
e) la costruzione di percorsi di dimissione differenziati, in base alla gravità dei pazienti, che
prevedono una diversa intensità di intervento da parte servizi territoriali: contatto
telefonico infermieristico programmato, visita infermieristica domiciliare programmata,
accesso programmato all’ambulatorio cardiologico territoriale, visita medica e
infermieristica domiciliare programmata.
387

E' stata quindi messo a punto un protocollo, una scheda raccolta dati ed un data base per la
valutazione d'impatto del progetto in termini di aderenza del percorso clinico assistenziale del
paziente a quanto definito dalle linee-guida e dal protocollo di dimissione.
In particolare il protocollo prevedeva il confronto tra serie consecutive di pazienti ricoverati in
regime ordinario con diagnosi di scompenso cardiaco (codici ICD9-CM: 428.0, 428.1, 402.01,
402.11, 402.91 e DRG medico 127) ricoverati nell’Ospedale di Biella in due periodi, di cui
uno precedente e uno successivo all’implementazione della LG (2004). In particolare nel
periodo precedente erano incluse le dimissioni comprese tra il 1 aprile e il 31 agosto 2003,
mentre nel periodo successivo quelle comprese tra il 1 aprile e il 31 agosto 2005. Il numero
complessivo stimato di pazienti da includere nello studio era di 340 pazienti. Attualmente
sono stati inseriti nel data base 181 pazienti, il completamento dell'inserimento è previsto per i
prossimi mesi. A livello territoriale è poi in corso il monitoraggio della presa in carico dei
pazienti da parte dei servizi di assistenza integrata e di assistenza infermieristica con il
monitoraggio degli interventi domiciliari e telefonici.
PUBBLICAZIONI
I risultati preliminari del progetto sono stati presentati a due recenti convegni e pubblicati sui
relativi atti.
1. C. Prastaro, G. Corgnati, G. Fonte, S. Anchisi, A.Penna. Insufficienza cardiaca:
dimissione ospedaliera e follow-up territoriale secondo linee-guida aziendali. Atti del
Convegno Regionale HPH. Ospedale e Territorio: Esperienze per l'integrazione e la
continuità assitenziale. Biella, 23 giugno 2005.
2. Penna,V. Marinoni, P. Carpano Maglioli, G. Lanza, C. Prastaro, S. Anchisi, M.
Marcolongo, L. Savoia. Insufficienza cardiaca: linee-guida e percorsi aziendali per
promuovere comunicazione ed integrazione. Atti della 9 Conferenza Nazionale HPH.
Comunicare la salute: il ruolo dell'Ospedale e del Distretto. Courmayeur, 29-30 settembre
2005.
388

Alberto Piazza Filone tematico A2
Fattori di rischio genetici associati all'aterosclerosi coronarica e alla
restenosi
Università degli Studi di Torino,
Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica
L’attività svolta nell’ambito del progetto ha portato ai seguenti risultati sottoposti per la
pubblicazione a due riviste scientifiche internazionali peer reviewed:
1. I polimorfismi del sistema Renina-angiotensina-aldosterone nell’insorgenza e nella
prognosi a lungo temine di infarto miocardico acuto giovanile
Scopo del lavoro:è stato valutare l’influenza di polimorfismi del sistema renina-angiotensinaaldosterone
(SRAA) sul rischio di infarto miocardico acuto (IMA) in una popolazione italiana
con età giovanile e sulla progressione della malattia.
Metodi: 201 pazienti e 201 controlli sono stati appaiati per età e sesso (età media 40 ± 4 anni;
90.5% maschi). I fattori di rischio convenzionali più frequenti sono fumo, storia familiare di
malattia coronaria, ipercolesterolemia e ipertensione. Sono stati analizzati i seguenti
polimorfismi genetici: I/D dell’enzima di conversione dell’angiotensina I (ACE I/D), A1166C
nel recettore tipo 1 dell’angiotensina II (AGTR1) e C-344T nel gene dell’aldosterone sintetasi
(CYP11B2). Considerando un follow-up a lungo termine (9 ± 4 anni) abbiamo confrontato la
prevalenza dei polimorfismi genetici in pazienti con e senza eventi successivi (morti per
arresto cardiaco, infarti del miocardio, procedure di rivascolarizzazione).
Risultati: abbiamo evidenziato un’associazione statisticamente significativa tra IMA e
polimorfismo ACE D/I (genotipo DD, 42% nei casi vs 31% nei controlli; p=0.05). Tale
associazione rimane statisticamente significativa anche dopo aggiustamento per le possibili
variabili cliniche confondenti. Per quanto riguarda lo studio di follow-up, durante i 9 anni in
cui i pazienti (65 nuovi eventi, compreso 13 morti) sono stati seguiti abbiamo riscontrato che
gli individui eterozigoti AC per il polimorfismo AGTR1 erano significativamente più
frequenti nel gruppo degli eventi (p=0.016).
Conclusioni: polimorfimi nei geni ACE e AGTR1 potrebbero avere un ruolo importante
nell’insorgenza e nella progressione dell’IMA in età giovanile. Sono comunque necessari
studi collaborativi con un maggior numero di pazienti per confermare i nostri risultati.
2. Associazione tra polimorfismi/aplotipi nel gene TGF-β1 e infarto miocardico acuto in
pazienti italiani di giovane età
Scopo del lavoro: il fattore di crescita trasformante β1 (TGF-β1) sembrerebbe assumere un
ruolo importante nell’infarto miocardio acuto (IMA), ma a tuttoggi non esistono studi che
abbiano indagato il suo possibile ruolo nell’IMA giovanile. In questo studio abbiamo valutato
l’influenza di polimorfismi/aplotipi nel gene TGF-β1 sull’insorgenza e la progressione
dell’IMA in un campione italiano di giovani infartuati.
389

Metodi: sono stati tipizzati 201 casi e 201 controlli per tre polimorfismi nel gene TGF-β1 (G-
800A, C-509T and Leu10Pro). I principali eventi valutati durante il follow-up (media 107 ±
49 mesi) sono stati morte, infarto miocardico o procedure di rivascolarizzazione.
Risultati: fattori di rischio tradizionali risultati significativi in questo studio sono fumo (p

Pavilio Piccioni Filone tematico D1
Utilizzo di varie fonti informative nello studio della prevalenza di ASMA e
BPCO nella città di Torino
Asl 4
CONTESTO E RAZIONALE
L’asma bronchiale e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) sono patologie
respiratorie croniche largamente rappresentate nella popolazione. Nonostante le
classificazioni proposte dalle linee guida, nella pratica è spesso arduo distinguere tra forme
gravi di asma e di BPCO, anche a causa della loro possibile coesistenza nello stesso
individuo. Obiettivo primario di questo progetto è la stima della prevalenza di asma e BPCO
con l’utilizzo di diverse fonti informative.
MATERIALI E METODI
Relativamente agli anni 2000-2003 sono stati utilizzati:
• i dati relativi ai registri di mortalità per i seguenti codici ICD 9: 491 (bronchite cronica),
492 (enfisema), 493 (asma) e 518.81 (insufficienza respiratoria acuta);
• le schede di dimissione ospedaliera (SDO);
• i registri di esenzione ticket per asma (codice 007) e insufficienza respiratoria (IR, cod.
024);
• l’archivio delle prescrizioni farmaceutiche;
• limitatamente all’ASL4, gli accessi alle strutture di pronto soccorso (Ospedale Giovanni
Bosco) e le visite ambulatoriali effettuate presso l’ex-CPA.
RISULTATI
Per ognuna delle fonti informative, vengono riportate le prevalenze di asma, BPCO e IR,
stratificate per sesso, età e ASL di residenza. La popolazione di Torino del 2002, utilizzata per
il calcolo dei tassi di prevalenza, è quella riportata nella banca dati demografici (BDDE)
disponibile nel sito internet della Regione Piemonte.
Registro di mortalità
In totale si sono verificati 1181 decessi per le cause sopra riportate (1081 per BPCO, 50 per
enfisema, 66 per asma e 24 per IR). Il numero di decessi per BPCO e enfisema è maggiore nei
maschi (60,7% vs 39,3% e 62,0% vs 38,0% rispettivamente), mentre la prevalenza di decessi
per asma è maggiore nelle femmine (59,0% vs 41,0%). Il maggior numero di decessi si è
verificato nelle fasce di età 60-79 anni e maggiore di 80 anni; il 9% dei decessi per asma
riguarda soggetti di età inferiore a 60 anni. Il tasso di mortalità a Torino per l’ insieme delle
patologie respiratorie considerate è risultato essere del 3,2 per 10.000 residenti (0,2*10.000
per asma e 2,7*10.000 per BPCO).
Schede di Dimissione Ospedaliera (SDO)
Si sono registrati 25330 ricoveri per patologie respiratorie croniche; il numero di pazienti
ricoverati è 14996 di cui 10824 (74,7%) hanno avuto un solo ricovero e i restanti 4172 due o
391

più ricoveri. Per 10750 pazienti (il 71,7% del totale) è stata posta diagnosi di BPCO o di
enfisema, per 3904 (26,0%) diagnosi di IR e per 2601 (17,3%) diagnosi di asma.
E’ risultato che i maschi sono maggiormente ricoverati per BPCO (61,8% vs 38,2%), mentre
la % di ricoveri per asma è sovrapponibile nei due gruppi. Il maggior tasso di ricoveri per
BPCO viene registrato in pazienti con età superiore a 50 anni (circa il 96%), mentre almeno il
60% dei ricoveri per asma è rappresentato in pazienti con meno di 40 anni (il 35% in bambini
di età inferiore a 4 anni). Analizzando la sovrapposizione di diagnosi, si nota che per il 45%
dei pazienti con IR è riportata anche la BPCO, mentre la contemporanea diagnosi di asma e
BPCO è presente per solo l’1,7% dei ricoverati. Il tasso di prevalenza di ricoveri per BPCO
nel periodo in studio è dell’1,2% (1,6% nei maschi e 0,9% nelle femmine). Analizzando per
fasce di età risulta che la prevalenza di BPCO nella popolazione con età superiore a 60 anni è
del 3%. Per quanto riguarda l’asma la prevalenza di ricoveri è dello 0,3% con tassi di ricovero
maggiori nelle fasce di età più basse (2,7% in bambini con meno di 4 anni).
Registro di esenzione per patologia
Sono state registrate 8604 esenzioni per patologie quali asma e IR (4751 soggetti hanno
ricevuto esenzione per asma, 3692 per IR e 161 per entrambe le patologie). La maggior parte
dei soggetti con esenzione per IR sono maschi di età superiore a 60 anni (più dell’80%); tra i
soggetti con l’esenzione per asma non ci sono differenze significative per sesso, mentre più
del 50% degli esenti ha età inferiore a 40 anni. Il tasso di prevalenza delle esenzioni per tali
patologie nel 2002 risulta essere dello 0,6% per asma e dello 0.5% per IR.
Dall’incrocio delle diverse fonti risulta una prevalenza complessiva di malattie ostruttive delle
vie aeree del 2,5%: 0,8% per l’asma (1,2% nella fascia di età sotto i 40 anni), 1,3% per la
BPCO (1.7% nei maschi, 3.1% nelle categorie di età oltre i 60 anni) e 0,8% per la IR (da
0,2% a 1,8%, rispettivamente al di sotto e al di sopra dei 60 anni). L’11,6% del totale dei casi
prevalenti è rappresentato nelle due fonti informative (SDO e esenzioni): il 58,8% solo nelle
SDO e il 28,8% solo nel registro delle esenzioni. Il registro di mortalità ha contribuito a
individuare altri 179 casi (0,8%) morti nel corso del 2003.
Visite al CPA e accessi al PS dell’Ospedale Giovanni Bosco (ASL4)
La presenza di una delle patologie di interesse è stata riportata per 11747 soggetti visitati
presso il CPA: di questi 6478 hanno ricevuto diagnosi di asma, 4795 di BPCO e 850 di IR.;
199 soggetti riportano diagnosi di asma e BPCO contemporaneamente e 165 presentano
BPCO in IR. Dai dati relativi agli accessi al Pronto Soccorso del Giovanni Bosco risultano
5030 accessi al PS per BPCO, enfisema, asma o IR tra il 2002 e il 2003, relativi a 3617
pazienti, 2861 dei quali con un unico accesso e 756 con due o più passaggi al PS. Per 2874
soggetti (circa l’80%) è stata posta diagnosi di BPCO o bronchite cronica o acuta o di
enfisema; per 1125 (31,1%) è stata diagnosticata asma e per 320 (8,9%) IR.
Utilizzando tutte le fonti disponibili per l’ASL4, i tassi di prevalenza sono rispettivamente del
4,2% (12,4% nella popolazione al di sopra di 60 anni) per la BPCO, del 4,1% per l’ asma (6%
nella popolazione al di sotto di 20 anni) e dello 0,9% per IR.
CONCLUSIONI
L’ insieme di questi dati conferma che le patologie ostruttive delle vie aeree rappresentano
una importante causa di morte e di ricovero. Resta spesso complesso, utilizzando dati
routinari, distinguere le diverse patologie. L’incrocio di fonti diverse ha dimostrato di essere
un interessante metodo per meglio stimare l’impatto complessivo di queste patologie che,
oltre ad essere largamente diffuse, sono caratterizzate da diversi gradi di severità.
392

Antonio Piga Filone tematico D4
Validazione di uno strumento EBM per l'utilizzo ottimale delle risorse
Internet dedicate alla prevenzione
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze pediatriche e dell’Adolescenza
METODI E RISULTATI
Il 31 gennaio 2005 si sono conclusi i lavori e ha avuto termine la borsa di studio assegnata a
partire dal 1 aprile 2004. E’ stato realizzato uno strumento EBM per la valutazione delle
risorse Internet in campo biomedico e lo si è sottoposto a una prova di valutazione da parte di
un gruppo di medici non coinvolti nell’elaborazione dello strumento. I risultati del test sono
stati sottoposti ad analisi della varianza ed hanno dato buoni risultati in termini di
concordanza intervalutatore. Parallelamente al lavoro di sviluppo e test dello strumento, la
ricerca ha consentito l’inserimento di 29 risorse sulla talassemia sul catalogo online Elisir,
reperibile all’indirizzo: da parte di un documentalista esperto nella catalogazione delle risorse
Internet. Il gruppo risultava formato da 1 clinico esperto di talassemie (responsabile della
ricerca), 4 bibliotecari biomedici, 7 clinici di cui 3 esperti di talassemie che hanno svolto il
ruolo di tester.
Metodi di ricerca delle griglie di valutazione esistenti
Ad agosto 2004 è stata eseguita una ricerca sistematica della letteratura con l’obiettivo di
reperire il maggior numero possibile di griglie per la valutazione dell’informazione biomedica
disponibile in Internet. Allo scopo sono stati utilizzati database bibliografici (Pubmed,
EMBASE, CINAHL), motori di ricerca (Google, Yahoo) e altre fonti (AMIA Annual
Symposium Proceedings 2002 e 2003). Sono stati inclusi soltanto studi o siti web che
presentassero esplicitamente una griglia di valutazione per risorse relative alla salute, oppure
griglie di valutazione che, pur pensate per un utilizzo generale, potessero adattarsi pienamente
alla valutazione di risorse sulla salute. Sono state in tal modo reperite 325 risorse. E’ stata
fatta una revisione sistematica di tutti i criteri di valutazione dei siti utilizzati. Sono stati così
identificati 254 singoli criteri che presentavano una differenza significativa, ancorché in molti
casi minima.
Rielaborazione dei criteri e creazione della griglia di valutazione
Un successivo lavoro di analisi e discussione tra i 4 bibliotecari ha permesso di ridurre i criteri
a 22, eliminando i criteri che presentassero sovrapposizioni ritenute non significative. Questi
criteri sono stati assemblati in un prototipo di griglia, che è stato rivisto criticamente insieme
ai testers ed al clinico esperto, che ha portato alla riformulazione di alcuni, all’ordinamento
razionale all’interno della griglia. Di ciascun criterio sono stati formulati definizione, limiti e
modalità di applicazione. Di seguito la lista dei 22 criteri:
A. Valutazione della risorsa
1. L'autore della risorsa è chiaramente indicato?
2. E' chiaro l'obiettivo della risorsa?.
3. La risorsa è appropriata al proprio target di utenza?
4. La risorsa è priva di distorsioni sistematiche (bias)?
393

5. Lingua - L'informazione è disponibile anche in inglese?
6. La risorsa è accessibile in modo soddisfacente?
7. La risorsa è disponibile gratuitamente?
8. La risorsa è organizzata in modo soddisfacente?
9. La risorsa è libera da barriere di utilizzo?
10. La risorsa è graficamente efficace e questo ne favorisce la fruibilità?
11. La risorsa ha un buon grado di interattività?
12. E' garantita la tutela dei dati personali?
13. I collegamenti esterni (link) proposti dal sito sono di qualità?
14. La risorsa viene aggiornata regolarmente?
B. Valutazione dell’informazione
15. L'informazione proposta è rilevante?
16. L'informazione proposta è originale?
17. L'informazione proposta è esaustiva?
18. Viene presentato più di un punto di vista sull'argomento?
19. L'informazione presentata è evidence-based?
20. Sono citate le fonti sulle quali si basa l'informazione?
21. Esistono processi di selezione e/o revisione dell'informazione presentata?
22. La risorsa rispetta i principi deontologici e di etica delle professioni mediche?
Selezione siti e applicazione della griglia
La griglia è stata quindi testata su un argomento medico. E’ stata scelta la talassemia per il
grado di esperienza dei valutatori e del referente, e per la pertinenza rispetto ai temi di salute
con importanti aspetti di prevenzione. Sull’argomento è stata effettuata una ricerca utilizzando
due dei principali motori della rete, Google e Yahoo. Tra i primi 200 siti sono stati selezionati
secondo un criterio di pertinenza 40 siti. Da questo elenco sono state scelte in modo random le
5 risorse che sono state oggette di test. Dopo una riunione congiunta di discussione sui metodi
di applicazione dei criteri, ognuno dei 7 clinici coinvolti ha operato indipendentemente e
applicato la griglia alle 5 risorse. Il punteggio totale attribuibile a ciascun sito era dato dalla
somma dei punteggi parziali delle due componenti qualitative della griglia:
A Valutazione della risorsa,
B Valutazione dell’informazione, con un peso relativo rispettivamente del 42% e del 58%.
Valutazione statistica
L’analisi della varianza ha mostrato differenze significative tra le cinque risorse e una buona
concordanza generale tra osservatori. La concordanza di giudizio è stata massima per i criteri
più facilmente oggettivabili e descrittivi, e minore per i criteri di formato e organizzazione
della risorsa. I criteri più importanti, riguardanti la rilevanza, l’obiettività ed il grado di
evidenza del contenuto hanno avuto una bassa variabilità. Catalogazione di risorse sulle
talassemie all’interno del motore ELISIR Utilizzando la griglia elaborata, sono state inserite
nel catalogo online Elisir 29 risorse, il cui elenco è reperibile all’indirizzo:
http://www.lib.unito.it/database/uri.php?id_mesh=171.
394

CONCLUSIONI
La ricerca ha permesso di costruire e validare uno strumento potenzialmente utile per la
valutazione di risorse della rete di argomento sanitario, di catalogare secondo criteri EBM
quelle sulla talassemia e di renderle liberamente disponibili in un sito di pubblica utilità.
Gli sviluppi ulteriori saranno:
• applicazione sistematica della griglia ad altri argomenti medici ed infermieristici con
relativa catalogazione;
• utilizzo della griglia a scopo didattico nei corsi tenuti dal Dipartimento;
• utilizzo della griglia nelle ricerche di tipo bibliotecario;
• traduzione della griglia in inglese e sua proposta su una rivista di metodologia applicata.
395

Lorenzo Pinessi Filone tematico A4
Cefalea a grappolo e stili di vita: indagine sui fattori di rischio ambientali
e genetici.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Neuroscienze
OBIETTIVI
1. Ricercare eventuali fattori di rischio correlati allo stile di vita (attività lavorativa, fumo,
consumo di alcol, esposizione a tossici ambientali, ipertensione, uso di farmaci analgesici,
etc.) correlabili alla comparsa di cefalea a grappolo.
2. Valutare se polimorfismi dei geni che codificano per il sistema ipocretina/oressina siano
associati alla cefalea a grappolo e/o ne possano modificare la storia naturale.
MATERIALI E METODI
Secondo i criteri internazionali (ICHD-II), sono stati selezionati dagli archivi della SC-DU
Neurologia III- Centro Cefalee dell’Università degli Studi di Torino – Ospedale Molinette:
A. 120 pazienti affetti da cefalea a grappolo
B. 240 soggetti sani, age and sex-matched.
Tutti i pazienti selezionati sono stati sottoposti ad visita neurologica e ad una serie di
accertamenti comprendenti: ematochimici di ruotine, screening laboratoristico per le sindromi
cefalalgiche e, ove necessario, TAC cranio e tests neuropsicologici. E’ stata compilata una
apposita cartella clinica per valutare l’eventuale esposizione a presunti fattori di rischio. In
particolare sono stati considerati potenziali fattori di rischio: età, sesso, familiarità per cefalea,
istruzione, attività lavorativa, esposizione a tossici ambientali, uso e/o abuso di analgesici,
ipertensione, diabete, dislipidemia.
Dopo estrazione del DNA dal sangue, sono stati esaminati, in accordo con le correnti
metodiche di biologia molecolare, i seguenti polimorfismi:
• HCRT gene: –3250C>T (SNP # 4796717) e –1717C>T (SNP # 8072081). ·
• HCRTR1 gene: 264C>T (R37R) (SNP # 1056526) e 1375C>T (I408V) (SNP # 2271933)
• HCRTR2 gene: 1246G>A (V308I) (SNP # 2653349) e IVS4-492A>C (SNP # 1027650)
L’analisi statistica è stata effettuata utilizzando i programmi SigmaStat – version 1.0 (Jandel
Corp. 1994) e Epi Info software, version 6.04 (CDC Centers, Atlanta, USA, and WHO,
Geneva, Switzerland).
RISULTATI E RICADUTE PER IL SERVIZIO SANITARIO REGIONALE
C. I fattori di rischio esaminati (familiarità per cefalea, educazione, attività lavorativa,
esposizione a tossici ambientali, ipertensione, dislipidemia) non sono risultati
statisticamente differenti tra i pazienti con cefalea a grappolo ed i soggetti di controllo.
Questo può essere motivato da una numerosità ancora bassa del campioni di affetti. E’ in
corso l’ampliamento della casistica.
396

D. L’analisi dei polimorfismi dei geni del sistema ipocretina/oressina ha dimostrato che i
pazienti con cefalea a grappolo presentano un aumento significativo del genotipo G/G del
polimorfismo 1246 G< A del gene HCRTR2. Questo effetto è stato dimostrativo sia nei
pazienti maschi, sia nelle femmine. Non è stato dimostrato un effetto significativo di tale
polimorfismo sulla storia clinica di tale malattia.
Il nostro studio dimostra, per la prima volta, che un polimorfismo del HCRTR2 è associato
alla cefalea a grappolo. Ad oggi, nessuno studio di genetica molecolare ha presentato alcuna
associazione significativa tra polimorfismi di diversi geni e la malattia.
Vista l’importanza scientifica dello studio è stato preparato un manoscritto che è stato
pubblicato sulla rivista Neurology come Expedited Publication (Neurology 2004;63:1286-
1288).
397

Enrico Pira Filone tematico A3
Modelli per lo studio del comportamento fisiopatologico della cute, a
contatto con materiali tessili utilizzati come DPI
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Traumatologia, Ortopedia e Medicina del Lavoro
METODI E RISULTATI
Nell’ambito del Progetto è stato preliminarmente effettuato un lavoro di ricerca bibliografica
a livello internazionale sul comfort in relazione all’utilizzo di prodotti tessili, aggiornamento
che ha portato alla redazione di un Documento di sintesi.
Si è provveduto inoltre alla elaborazione di Linee Guida per l’individuazione di un campione
umano significativo da utilizzare per le rilevazione nella camera climatica. Infatti, per poter
arrivare a risultati affidabili nell’analisi del comfort, occorre innanzitutto che il campione sia
selezionato in modo da rappresentare la popolazione a cui i risultati debbono essere riferiti,
soprattutto in considerazione del fatto che lo stesso gruppo di persone viene sottoposto al test
in diverse condizioni (a riposo, durante attività fisica moderata ed elevata; a diverse
temperature e livelli di umidità; senza e con sistema abito). Si è reso così necessario precisare
il numero complessivo di test che verranno effettuati sul singolo gruppo di soggetti (come
combinazione delle diverse condizioni sopra elencate), per poter determinare correttamente il
livello di significatività da considerare nel dimensionamento del campione.
Successivamente alla raccolta dei dati, si procederà all’analisi statistico-epidemiologica
affidata all’Istituto Superiore di Sanità, che si è assunto il compito di
1. descrivere il campione considerato, relativamente alle variabili biologiche e demografiche
che si ritiene possano avere una influenza sulle variabili risposta considerate per la
valutazione del comfort.
2. sintetizzare ogni variabile risposta nel campione e nella condizione considerata,
utilizzando gli appropriati indici di tendenza centrale e variazione, costruendo ove
possibile gli intervalli di confidenza.
La definizione dei diversi modelli previsti dal progetto potrà essere utilmente completata dalla
raccolta dei dati sperimentali sul campo, al fine di valutare le relazioni tra le variabili di
interesse, secondo quanto previsto al Livello 3 del modello di Umbach (riportato,
schematicamente, in Fig. 1)
A tale proposito saranno arruolati volontari – secondo i criteri biostatistici definiti nelle Linee
Guida sopra riportate – e le misure derivate dalle diverse condizioni di esposizione in camera
climatica consentiranno di confermare la validità dei modelli teorici approntati in questo
studio secondo quanto elaborato dal Gruppo di lavoro Interdisciplinare.
398

Modello di
comfort:
previsione della
risposta
termofisiologic
Figura 1 – Modello di Umbach
Livello 5:
test di mercato
Livello 4:
prove specifiche
Livello 3:
controllo dei risultati con soggetti umani
per mezzo di test in camera climatica
⇒ funzioni fisiologiche caratteristiche
del corpo
Livello 2:
analisi biofisiche sul sistema “indumento”
⇒ misure su Manichino Termico
Livello 1:
analisi biofisiche sul campione tessile
⇒ misure su Skin Model
Questa fase prevede le seguenti condizioni sperimentali
• Una persona a riposo con condizioni microclimatiche standard
- standardizzazione del periodo della giornata nel quale effettuare le prove
- definizioni dei tempi di misurazioni dei parametri fisiologici della pelle;
- standardizzazione di alcuni parametri fisiologici del corpo (frequenza cardiaca e
della gettata cardiaca) e correlazione con la sensazione soggettiva di comfort;
- produzione di dati delle variabili fisiologiche della pelle nei vari punti individuati:
microcircolo, temperatura, idratazione, elasticità, pH, levigatezza, morfologia
cellulare degli strati superficiali cutanei (strato corneo e malpighiano)
- valutazione della correlazione dei dati fisiologici della pelle e del corpo con la
sensazione di comfort.
• Una persona riposo con variazioni delle condizioni microclimatiche ( valutazione del Cns
– comfort a riposo)
- misurazioni ripetibili delle variabili fisiologiche del corpo e della pelle nei punti
individuati, all’interno della camera, al variare della temperatura con umidità e
ventilazione costante, con misurazione delle sensazioni soggettive ed oggettive di
comfort;
- misurazioni ripetibili delle variabili fisiologiche del corpo e della pelle nei punti
individuati, all’interno della camera, al variare della umidità con temperatura e
ventilazione costante, con misurazione delle sensazioni soggettive;
399
Modello di
comfort:
previsione della
risposta
termofisiologica

- misurazioni ripetibili delle variabili fisiologiche del corpo e della pelle nei punti
individuati, all’interno della camera, al variare della ventilazione con temperatura e
umidità costante, con misurazione delle sensazioni soggettive;
- valutazione sulla correlazione dei dati fisiologici della pelle e del corpo con la
sensazione di comfort.
• Una Persona in attività fisica moderata ed elevata con condizioni microclimatiche
standard (valutazione del comfort con leggera e forte sudorazione)
- standardizzazione del range di attività fisica;
- Misurazioni ripetibili e riproducibili delle variabili fisiologiche della pelle in un
punto, all’interno della camera con condizioni microclimatiche standard;
- Misurazioni ripetibili e riproducibili delle variabili fisiologiche della pelle in tutti i
punti e del corpo, indicati dal dermatologo, all’interno della camera con condizioni
microclimatiche standard;
- valutazione sulla correlazione dei dati fisiologici della pelle e del corpo con la
sensazione di comfort.
• Una Persona in attività fisica moderata e ed elevata con variazioni delle condizioni
microclimatiche
- misurazioni ripetibili e riproducibili delle variabili fisiologiche della pelle in un
punto e successivamente su tutti i punti, all’interno della camera al variare della
temperatura con umidità e ventilazione costante, con misurazione delle sensazioni
soggettive
- misurazioni ripetibili e riproducibili delle variabili fisiologiche della pelle in un
punto e successivamente su tutti i punti, all’interno della camera, al variare della
umidità con temperatura e ventilazione costante, con misurazione delle sensazioni
soggettive.
- misurazioni ripetibili riproducibili delle variabili fisiologiche della pelle in un
punto e successivamente su tutti i punti, all’interno della camera al variare della
ventilazione con temperatura e umidità costante, con misurazione delle sensazioni
soggettive.
• Ripetizione delle diverse condizioni sperimentali con una persona a riposo e con
attività fisica moderata ed elevata con sistema abito
- utilizzo di materiali tessili testati e valutati in termini di resistenza del tessile al
passaggio del calore secco e dell’umidità con lo Skin Model
- misurazioni delle variabili del corpo e della pelle e delle sensazioni soggettive
di comfort
- Taratura del sistema di valutazione del comfort con parametri fisiologici ed
ingegneristici
• Ripetizione delle diverse condizioni sperimentali in un gruppo significativo in eta’
lavorativa e di sesso diverso, costituito da persone sane.
La definizione di queste diverse condizioni sperimentali e la elaborazione dei protocolli per la
verifica dei diversi modelli completa il programma di ricerca e consente l’avvio della fase
operativa nella camera climatica installata presso il LABORATORIO DI ALTA
TECNOLOGIA TESSILE di Città degli Studi di Biella, operativa dal giugno 2006, dopo una
lunga fase di messa a punto tecnica, anche sulla scorta dell’attività scientifica e dei
suggerimenti forniti da questo gruppo di lavoro.
400

Mario Pirisi Filone tematico A2
Ferro, determinanti genetici e progressione fibrotica nell’epatite cronica C
Università “A. Avogadro” del Piemonte Orientale
Dipartimento di Scienze Mediche
MATERIALI E METODI
Come previsto dal progetto di ricerca, abbiamo esaminato materiale da 100 pazienti
consecutivi, non selezionati, tutti affetti da epatite cronica C istologicamente documentata (54
maschi, 46 femmine, di età media 52 anni). Tutti, come da criteri di selezione, erano negativi
alla ricerca nel siero di HBsAg ed anticorpi anti-HIV. Il materiale da biopsia epatica è stato
valutato da due patologi in modo indipendente, così da stimare su di essi l’entità di fibrosi
utilizzando il metodo di Ishak.
In relazione al punteggio di fibrosi stilato dall’anatomo-patologo, abbiamo analizzato,
utilizzando un completo data base clinico:
1. caratteristiche demografiche e cliniche, quali età, età al momento dell’infezione, durata
stimata dell’infezione, presumibile via di trasmissione, entità di consumo alcolico,
genotipo virale;
2. parametri relativi al metabolismo del ferro (sideremia, indice di saturazione della
transferrina, ferritina, concentrazione intraepatica di ferro, distribuzione intraepatica del
ferro secondo il metodo di Searle);
3. la presenza di mutazioni HFE e del gene per il recettore della ferritina e di mutazioni
del gene della beta globina. A quest’ultimo fine, come da indicazioni del produttore
(Nuclear Laser Medicine, Milano) abbiamo utilizzato amplificati provenienti da DNA
estratto da campioni di sangue intero, utilizzando tests basati sul principio della
ibridazione inversa, che prevedono tre fasi successive:
• isolamento del DNA da sangue non coagulato utilizzando reattivi commercialmente
disponibili (QIAamp minikit, Qiagen);
• amplificazione simultanea (multiplex PCR) di sequenze genomiche di HFE e beta-globina
utilizzando oligonucleotidi specifici 5’-biotenilati;
• ibridazione su strip dei frammenti amplificati biotenilati con sonde oligonucleotidiche
allele-specifiche. Gli ibridati biotenilati sono stati successivamente rivelati utilizzando la
strepatvidina coniugata con fosfatasi alcalina ed un appropriato substrato colorato.
RISULTATI
Tra i 100 pazienti esaminati, abbiamo identificato 12 eterozigoti per una delle mutazioni del
gene della beta-globina (interessanti il codone 39 in sette casi, il codone IVS 1 in tre casi, il
codone 22 in un caso, ed il codone IVS 16 in un caso) e 29 eterozigoti di mutazioni HFE
(eterozigoti C282 in tre casi, omozigoti H63 in tre casi, eterozigoti H63 in 22 casi and 65c
eterozigoti in un caso).
Un ulteriore paziente è risultato portatore simultaneamente di mutazioni in forma eterozigote
sia per HFE che per beta globina (rispettivamente, H63 e codone 39). I soggetti wild-type per
entrambi i geni erano dunque 58/100. All’analisi univariata, l’età del paziente alla biopsia (P
401

0.001), l’età del paziente all’atto dell’infezione (P = 0.01), la presenza di una mutazione per
il gene della beta globina (P = 0.01), l’indice di saturazione della transferrina (P = 0.02) e la
misura semiquantitativa di colorazione per ferro intraepatico (P = 0.03) sono risultati avere
una correlazione con il punteggio di staging dei preparati bioptici. Alla analisi multivariata,
solamente età alla biopsia (P < 0.001) e presenza di una mutazione del gene della beta globina
(P = 0.01) avevano significato indipendente dagli altri parametri. Una fibrosi di grado marcato
(staging uguale o superiore a 3) era correttamente predetta in un modello logistico includente
l’età alla biopsia (O.R. 1.05, 95% C.I. 1.02-1.09), il consumo di alcool (O.R. 11.3, 95% C.I.
1.2-103.5) e la presenza di mutazioni del gene della beta globina (O.R. 5.0, 95% C.I. 1.2-
20.3).
PUBBLICAZIONI
I suddetti dati sono stati accettati come comunicazione al 55th Annual Meeting della
American Association for the Study of Liver Diseases, tenutosi a Boston tra il 29/10 ed il
02/11 p.v., e come tali pubblicati in forma di abstract sulla rivista Hepatology (Sartori M,
Adorno S, Rigamonti C, Capelli F, Bozzola C, Pergolini P, Rolla R, Boldorini R, Bellomo G,
Pirisi M. Heterozygous beta globin gene mutations are associated with more severe liver
fibrosis in patients with chronic hepatitis C. Hepatology 2004;40:684A).
Un articolo in extenso, contenente l’elaborazione finale dei dati e la presentazione di risultati
e conclusioni dello studio, è attualmente in fase di preparazione.
402

Valerio Podio Filone tematico C1
Miglioramento dell’attivita’ antalgica della terapia radiometabolica in
pazienti con metastasi ossee
Azienda Ospedaliera San Luigi di Orbassano
OBIETTIVO
L'obiettivo dello studio è la valutazione della riduzione della sintomatologia dolorosa ossea
mediante terapia radiometabolica (sia con Sm-[153]EDTMP, sia con Sr-89++), con particolare
riguardo per il possibile effetto sinergico e non semplicemente additivo con la terapia
antalgica tradizionale.
MATERIALI E METODI
A tale scopo abbiamo seguito 13 pazienti, che risultavano affetti da patologia neoplastica a
carico della mammella (3 soggetti), a carico della prostata (6 pazienti) o a carico del polmone
(i restanti 4). Tutti i soggetti sono stati arruolati in seguito all'esecuzione di scintigrafia ossea
total body che dimostrava la presenza di multiple lesioni scheletriche captanti il radiofarmaco
utilizzato per l’esame (in conformità al dettato normativo). Ai soggetti, informati su scopi e
modalità della terapia radiometabolica, nonché sulle precauzioni da adottare, dopo adeguata
sospensione dell’eventuale terapia con difosfonati (come da letteratura scientifica e
conformemente alle norme d’uso approvate), è stata somministrata la dose terapeutica di Sm-
[153]EDTMP (12 casi) o Sr-89++ (un solo caso) in un periodo di tempo compreso tra 1 e 2
settimane dall'esecuzione della scintigrafia. Nelle prime 6 settimane dalla somministrazione
del radiofarmaco sono stati strettamente monitorati i "marker" tumorali (PSA per il tumore
prostatico e Ca 19.9 per il tumore mammario) e la funzione emocateretica; è stato inoltre
chiesto ai pazienti di riferire l'evoluzione della sintomatologia dolorosa e le eventuali
variazioni della terapia antalgica (in base ad apposito diario tenuto dai pazienti). I soggetti
hanno ripreso la terapia con difosfonati o continuato le altre eventuali terapie antineoplastiche
e/o antalgiche; a scadenze prefissate (3, 6 e 9 mesi) sono stati eseguiti la scintigrafia
scheletrica, il dosaggio dei "marker" e l'esame emocromocitometrico ed è stata, inoltre,
indagata in modo approfondito la qualità di vita e la sintomatologia dolorosa.
Abbiamo quindi suddiviso i soggetti in base alle variazioni della terapia antalgica: è stata
considerata come risposta completa alla terapia radiometabolica la totale sospensione della
terapia antalgica precedentemente assunta dal soggetto, come risposta parziale la riduzione
della posologia degli analgesici, ma senza sospensione degli stessi, e come mancata risposta il
proseguimento senza variazioni della terapia.
RISULTATI
I risultati ottenuti indicano buona risposta della sintomatologia dolorosa al trattamento
radiometabolico (risposta completa in 3 pazienti, risposta parziale in 8, nessuna risposta in 2).
Per quanto riguarda gli altri parametri (funzione emocateretica, marker sierologici, ….), non
sono state eseguite valutazioni approfondite, che verranno eventualmente svolte in seguito,
con l’ampliarsi della casistica a disposizione. I dati sono stati comunque considerati nel loro
complesso, e quindi verranno di seguito riportate alcune considerazioni generali. La tossicità
midollare è risultata modesta in tutti i pazienti, con nadir dei leucociti e delle piastrine intorno
alla 4a settimana e risoluzione spontanea in breve tempo (nessuna trasfusione si è resa
403

necessaria). La risposta dei "marker" tumorali risulta di valutazione ancor più incerta (stante il
basso numero di valori disponibili in questa fase), ma pare meno omogenea. Sempre con le
stesse limitazioni, la scintigrafia ossea evidenzia patologia ripetitiva scheletrica
sostanzialmente stabile, sia per quanto riguarda l’estensione, sia per quanto concerne
l’intensità dell’accumulo osseo.
Di rilievo è il riscontro, in alcuni soggetti (in particolare in coloro che hanno avuto una
diminuzione consistente del dolore e/o una riduzione dei marker) della riduzione del numero e
dell'intensità delle lesioni. I dati indicano, quindi, una buona risposta antalgica al trattamento
stesso, con lievi o modesti effetti collaterali (in particolare riguardanti la funzione midollare):
tale dato, pur se riferito ad una piccola popolazione, risulta congruente con i dati riportati dalla
letteratura. Si è verificato inoltre come vi sia una risposta, almeno parziale, anche a livello dei
marker sierologici (PSA e Ca19.9). Il dato interessante che emerge (anche se per ora, data
l'esiguità della popolazione studiata, non assume ancora rilevanza statistica) è il fatto che
l'associazione tra terapia radiometabolica e terapia antalgica tradizionale presenta effetto
sinergico piuttosto che cumulativo: gli effetti antalgici appaiono infatti più prolungati e
maggiormente efficaci nei due pazienti che assumono, assieme alla radioterapia metabolica,
basse dosi di analgesici rispetto ai pazienti sottoposti alla sola terapia antalgica od alla sola
radioterapia metabolica.
Vi è inoltre evidenza che la somministrazione in fase precoce (soggetto con dolore osseo
modesto/moderato e lesioni ossee in numero ridotto) sia mediamente più efficace rispetto alla
somministrazione in fase metastatica avanzata.
404

Giuseppe Poli Filone tematico A2
Colesterolo ossidato e marcatori di risposta infiammatoria nei pazienti a
rischio vascolare
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche
MATERIALI E METODI
Nel corso del progetto sono stati eseguiti sia esperimenti in vitro su cellule in coltura sia
analisi di biologia molecolare su campioni di sangue periferico di pazienti a rischio vascolare,
con diabete di tipo II o con coronaropatia ed angina stabile o instabile. Per quanto riguarda gli
studi in vitro, sono state eseguite analisi di gene array a bassa densità su cellule della linea
macrofagica trattate con LDL minimamente ossidate o con prodotti di ossidazione lipidica in
essi contenuti, quali ossisteroli e idrossialchenali. E’ stata osservata una costante
ipermodulazione di alcuni geni, in particolare quelli che codificano per la chemochina MCP-1
e l’integrina beta1, come confermato da analisi RT-PCR (Poli G et al., 2004).
L’approfondimento analitico delle vie di trasduzione di segnali cellulari risultate attivate in
cellule macrofagiche trattate con ossisteroli ha permesso di identificare le vie biochimiche
essenziali tramite le quali i prodotti di ossidazione del colesterolo sono in grado di indurre la
cellula macrofagica ad esprimere e produrre concentrazioni di MCP-1 e beta 1 integrina 3-4
volte superiori a quelle riscontrabili in macrofagi di controllo. Precisamente, in seguito
all’interazione con i recettori CD36 dei macrofagi con miscele di ossisteroli si ha,
probabilmente tramite un significativo incremento di Ca2+ citosolico, l’attivazione a cascata
di protein cinasi C e di ERK1,2 cinasi, senza apparente coinvolgimento delle cinasi JNK e
p38. Si è poi ottenuto un risultato di particolare interesse applicativo, e cioè l’inibizione totale
dell’incremento della sintesi di MCP-1 da parte di macrofagi stimolati da ossisteroli, quando
alla miscela di reazione veniva aggiunto un inibitore delle cinasi ERK1,2 (Leonarduzzi G et
al. 2005). Con riferimento alla valutazione di colesterolo ossidato nel sangue periferico di
pazienti a rischio vascolare, sono stati presi in considerazione due tipi di patologie diverse, il
diabete di tipo II e l’angina stabile o instabile. In un primo tempo sono stati reclutati 35
pazienti con diabete mellito non insulino dipendente, di cui 7 casi con ipercolesterolemia ed i
restanti 28 casi con normocolesterolemia. Il livello di ossisteroli plasmatici nei pazienti
ipercolesterolemici è risultato due-tre volte superiore a quello di individui sani di pari età (16
casi). Al contrario, nei pazienti diabetici con normocolesterolemia, non si è riscontrato
aumento significativo degli ossisteroli plasmatici rispetto ai controlli.
E’ poi iniziato il reclutamento di pazienti con angina stabile (n°20) e pazienti con angina
instabile (n°28) ed in essi si sono valutati alcuni indici ematici di ossidazione lipidica e di
infiammazione. Rispetto ai valori riscontrati in un gruppo di individui adulti sani, presi come
controllo (n°15), il livello di ossisteroli plasmatici è risultato significativamente aumentato sia
nei pazienti con angina stabile che in quelli con angina instabile, senza peraltro evidenti
differenze tra i due tipi di pazienti. Tra gli ossisteroli analizzati, il colesterolo alfa-epossido è
quello che ha dimostrato l’incremento più significativo. Con riferimento alla determinazione
dello stato infiammatorio, la misura del livello plasmatico di proteina C (metodo quantitativo)
è quella che ha dimostrato maggior interesse ed affidabilità, in quanto la PCR è risultata in
tutti i pazienti con angina significativamente più alta rispetto ai valori ottenuti negli individui
di controllo, ma con un aumento statisticamente più sostenuto nei casi di angina instabile
rispetto a quelli con angina stabile.
405

Sono stati inoltri valutati per il loro potenziale ruolo di markers di progressione della lesione
aterosclerotica diversi altri indici di infiammazione, tra cui molecole di adesione, citochine
infiammatorie e chemochine. Ciò è stato reso possibile dall’impiego di una metodica prototipo
di protein array, cioè analisi immunochimica contemporanea di un insieme di molecole
proteiche presenti nel plasma, nel nostro caso proteine infiammatorie.
RISULTATI
I risultati ottenuti, per quanto bisognosi di essere confermati in una casistica molto più ampia,
hanno indicato come la citochina MCP-1 e probabilmente anche la molecola di adesione
ICAM-1 sembrino essere buoni candidati a fungere da indicatori di avanzamento della
malattia aterosclerotica, purchè non considerati come singoli parametri di analisi bensì inseriti
in un panel di indicatori di infiammazione, di cui ovviamente faccia parte la proteina C
reattiva.
PUBBLICAZIONI
1. Poli G, Leonarduzzi G., Biasi F, Chiarpotto E. Oxidative stress and cell signalling. Curr.
Med. Chem. 11, 1163-1182, 2004.
2. Leonarduzzi G, Gamba P, Sottero B, Kadl A, Robbesyn F, Calogero RA, Biasi F,
Chiarpotto E, Leitinger N, Sevanian A, Poli G. Oxysterol-induced up-regulation of MCP-1
expression and synthesis in macrophage cells. Free Radic. Biol. Med. 39; 1152-1161,
2005.
406

Antonio Ponzetto Filone tematico A2
Il carcinoma epatocellulare e infezione da virus dell'epatite C.
Identificazione di fattori di rischio associati.
Fondazione per la Ricerca Biomedica – Onlus
La mortalità per patologie epatiche terminali è un grave problema di interesse mondiale. In
Italia, la mortalità per cirrosi nel sesso maschile è tripla rispetto a quella del carcinoma del
colon-retto. La cirrosi epatica è la prima causa di morte nella fascia di età 25-44 anni in Italia
(dati ISTAT). Al secondo posto si colloca la morte per cause cardiocircolatorie, ed al terzo
posto il diabete. Per ogni singolo paziente diabetico deceduto nella fascia di età dei giovani
adulti sopracitata muoiono 5 persone per cirrosi epatica, ogni anno. La coscienza nazionale è
molto attenta al problema diabete, grazie a molte rigorose campagne di sensibilizzazione. I
problemi inerenti il cuore e la circolazione occupano giustamente un posto preminente
dell’attenzione pubblica, dei Programmi Nazionali, dei mass-media. Purtroppo non si pone
altrettanta attenzione alla prima causa di morte degli Italiani in età lavorativa. Una
conseguenza a lungo termine della cirrosi epatica è il carcinoma primitivo epatocellulare
(HCC), causa di morte di oltre 9000 Italiani ogni anno. La maggioranza assoluta dei
connazionali con cirrosi del fegato e con HCC sono cronicamente infetti dal virus dell’epatite
C (HCV). Attualmente, non esiste una terapia efficace per queste epatopatie, eccetto il
trapianto del fegato che ha costi elevati e non è disponibile per tutti i pazienti terminali.
407

Carola Ponzetto Filone tematico C1
I sarcomi a piccole cellule: nuove prospettive diagnostiche e
terapeutiche
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Anatomia, Farmacologia e Medicina Legale
La prima parte del progetto prevedeva di validare Met come target terapeutico nei
rabdomiosarcomi.
Nella maggioranza dei rabdomiosarcomi alveolari la lesione causale è il riarrangiamento Pax-
3/7-FKHR. In uno studio collaborativo, basato sulla costruzione di un topo knock-in che
esprime Pax3-FKHR nel locus di Pax3, abbiamo mostrato che Pax3-FKHR incrementa
l’espressione di Met nel dermomiotomo e l’iperattivazione di Met conduce all’inappropriata
delaminazione delle cellule dai somiti. Quindi Met è un bersaglio diretto di Pax3 nei
precursori miogenici in vivo. Nei casi di rabdomiosarcoma embrionale e di un piccolo numero
di casi di rabdomiosarcoma alveolare, negativi per il riarrangiamento Pax-3/FKHR, non è
chiaro quale sia la lesione genetica “trainante”. Abbiamo ipotizzato che in questo caso ci
possa essere una mutazione attivante di Met e abbiamo iniziato un’analisi mutazionale per
sequenza del gene c-Met. Abbiamo messo a punto il sequenziamento su cDNA retrotrascritto
da mRNA degli esoni che codificano per il dominio tirosina-cinasico e carbossiterminale di
Met nelle linee cellulari di rabdomiosarcoma RH4, RH30 e RD18. Abbiamo reperito il cDNA
da una ventina di casi di rabdomiosarcoma embrionale e di un piccolo numero di casi di
rabdomiosarcoma alveolare, negativi per il riarrangiamento Pax-3/FKHR (Dr B. Schafer,
University Children’s Hospital, Zurich), sui quali abbiamo iniziato l’analisi mutazionale.
Per verificare se Met gioca un ruolo importante nell’insorgenza e nel mantenimento del
rabdomiosarcoma, abbiamo adottato due diverse strategie.
1. Abbiamo testato la capacità di Pax-3/FKHR di trasformare fibroblasti derivati da un topo
geneticamente modificato (MetD) equivalente a un knock-out di Met, che esprimono una
forma inattiva di Met. La loro eventuale resistenza alla trasformazione Pax-3/FKHR
mediata avrebbe dovuto confermare che Met ne è un effettore necessario. In maniera
inaspettata, alcuni dei fibroblasti di controllo trasfettati con il cDNA di Pax-3/FKHR sono
andati incontro a una differenziazione muscolare terminale, sviluppando dei miotubi che si
contraggono. Anche se è già stato descritto che Pax-3/FKHR è capace di attivare il
programma miogenico nei fibroblasti, una completa differenziazione non è stata ancora
descritta. Per quanto riguarda la trasformazione, non siamo riusciti ad ottenere la
formazione di foci nei fibroblasti usando il cDNA di Pax-3/FKHR. Questo risultato è
probabilmente dovuto al fatto - recentemente descritto da altri autori- che solo bassi livelli
di Pax-3/FKHR sono in grado di promuovere la crescita cellulare, mentre alti livelli
sembrano essere pro-apoptotici per le cellule. Per facilitare l’attività trasformante di Pax-
3/FKHR e quindi rendere possibile l’analisi del ruolo di Met nella trasformazione Pax-
3/FKHR–mediata, stabilizzeremo delle nuove linee di fibroblasti di controllo e MetD da
topi in un contesto genetico Ink4a-/-, che consente la resistenza all’apoptosi.
2. Abbiamo cercato di sopprimere l’espressione di Met in linee di rabdomiosarcoma umane e
murine mediante interferenza a RNA per verificare se la loro tumorigenicità dipende da
Met. Abbiamo clonato in un vettore per la produzione di shRNA (pSUPER) una sequenza
408

oligonucleotidica specifica per Met murino e umano e in esperimenti di co-trasfezione
abbiamo verificato che è in grado di abbattere l’espressione del recettore Met. Abbiamo
sub-clonato questa sequenza in un vettore lentivirale ottimizzato per shRNA per produrre
un virus capace di infettare le cellule con un’alta efficienza e di trasdurre alti livelli di
espressione dell’shRNA. Per ora abbiamo infettato la linea di rabdomiosarcoma
embrionale RD18 e verificato che la soppressione di Met correla con un arresto della
crescita cellulare.
409

Maria Prat Filone tematico B3
Anticorpi monoclonali contro il recettore Met nella prevenzione e terapia
di infezioni da Listeria monocytogenes
Università “A. Avogadro” del Piemonte Orientale
Dipartimento di Scienze Mediche
CONTESTO E RAZIONALE
La Listeria monocytogenes (L.M.) è un batterio intracellulare facoltativo Gram-positivo,
presente nella normale flora batterica dell’intestino di numerose specie animali. Esso causa
malattia negli animali e nell’uomo, soprattutto in individui immunosoppressi, donne gravide e
neonati, a livello di tre sistemi/apparati: nervoso, viscerale e riproduttivo, provocando
meningiti, meningo-encefaliti, gastro-enteriti e aborti con un tasso di mortalità del 30%. Esso
viene internalizzato, oltre che da cellule fagocitiche, anche da cellule non fagocitiche, quali
quelle epiteliali ed endoteliali. L’internalizzazione di L.M. dà loro accesso a una nicchia
permissiva per la crescita e li sottrae al sistema di difesa dell’organismo. La penetrazione del
batterio nella cellula ospite avviene con strategie evolutesi nel tempo e utilizzate da più batteri
patogeni. La L.M. utilizza proteine della sua superficie che legano recettori della superficie
della cellula bersaglio, attivando segnali per l’internalizzazione, che portano a riarrangiamenti
del citoscheletro ed esitano nell’internalizzazione del batterio. Due proteine batteriche note
come Internalina A (InlA) e InternalinaB (InlB) sono risultate responsabili
dell’internalizzazione di LM. InlB è coinvolta nell’internalizzazione in epatociti, cellule
endoteliali e fibroblasti. Recentemente è stato riportato che L.M. viene internalizzata in cellule
di mammifero a seguito dell’interazione tra InlB e il recettore tirosina chinasi Met,
precedentemente caratterizzato per essere il recettore del fattore di crescita epatocitario HGF.
Il trattamento di cellule di mammifero con L.M. o InlB induce lo stesso effetto biologico di
motilità “scatter” indotto dal trattamento con HGF e attiva parecchie delle vie di traduzione
del segnale attivate da questo fattore di crescita. Nell’ottica di una prevenzione o terapia
contro la diffusione dell’infezione, i recettori presenti sulla superficie delle cellule eucariote
possono rappresentare validi bersagli. In effetti, se da un lato questi recettori sono le “porte”
attraverso cui la L.M. può penetrare, dall’altro lato, qualora si interferisca con la loro specifica
funzione di recettori per la L.M., possono diventare dei bersagli terapeutici.
OBIETTIVO
Obiettivo di questo progetto di ricerca era lo sviluppo di un reagente con potenzialità
terapeutiche, in grado di interferire in vitro con l’infezione di L.M. in cellule di mammifero e
di proteggere in vivo topi da un inoculo mortale di L.M. Ci si proponeva di utilizzare un
anticorpo monoclonale (Mab DO-24) diretto contro il dominio extracellulare del recettore
Met, che era stato sviluppato nel laboratorio della proponente e che era risultato in grado di
bloccare l’internalizzazionedi L.M. in cellule di mammifer.
RISULTATI
a) Sono state approntate le cinetiche di crescita di due ceppi batterici: BUG 600 e BUG 947,
rispettivamente ceppo selvatico e ceppo mutante che esprime soltanto l’Inl B.
410

) Sono stati messi a punto esperimenti di infezione su varie linee cellulari di istotipo e
specie diverse: In particolare sono state usate le seguenti linee cellulari umane: ECV
(endotelio), GTL-16 (carcinoma gastrico), Hep G2 (epatocarcinoma), HT29
(coloncarcinoma); la linea di epatociti murini immortalizzati MLP-29 e la linea di epitelio
renale di scimmmia VERO. È stato osservato che alcune linee erano infettate dai due ceppi
batterici con la stessa efficienza (cellule ECV, VERO, MLP-29), mentre altre erane
infettate con maggiore efficienza dal ceppo selvatico, che esprimeva entrambe le
internaline (cellule GTL-16, HT29, HepG2). L’internalina B è considerata il determinante
d’internalizzazione di maggiore importanza, essendo in grado di indurre fagocitosi nella
cellula bersaglio anche in assenza di cooperazione da parte di altre internaline (Bergam et
al., Mol Microbiol. 43:557-570,2002); ciò sarebbe in accordo con quanto osservato
riguardo l’internalizzazione di L. M. nelle linee cellulari ECV, Vero, MLP-29. Per contro,
i risultati ottenuti riguardo alle linee cellulari GTL-16, HT29, HepG2 evidenziano come
entrambe le internaline svolgono un ruolo importante nell’internalizzazione del patogeno.
c) Sono stati condotti esperimenti utilizzando l’anticorpo monoclonale purificato DO-24, che
riconosce l’epitopo del recettore Met su cui si lega Inl B, per bloccare l’infezione del
batterio. In accordo con quanto osservato in letteratura, i risultati ottenuti hanno
dimostrato che l’anticorpo era in grado di inibire l’internalizzazione dei batteri in modo
dose-dipendente (a dosi nM).
d) A partire dall’anticorpo monoclonale DO-24, sono stati preparati e purificati frammenti
Fab monovalenti a seguito di digestione con papaina e selezione negativa per
cromotografia di affinità su colonna Sepharose-Proteina A. l’anticorpo è stato saggiato
sulle differenti linee cellulari per verificare la capacità di interferire nell’internalizzazione
di L.M. In accordo con quanto osservato per il DO24, anche il Fab era in grado di bloccare
l’internalizzazione di L.M. sulle linee cellulari saggiate.
e) Sulla base di questi risultati, si è deciso di produrre la forma ricombinante scFv, che è la
porzione minima dell’anticorpo monoclonale che mantiene ancora attività anticorpale e
che può essere prodotta in sistemi di espressione batterici ad alta resa. I geni delle porzioni
variabili della catena leggera e della catena pesante sono stati clonati a partire dall’mRNA
isolato dall’ibridoma producente il monoclonale DO-24. Il prodotto inizialmente ottenuto
si è però dimostrato non utilizzabile in quanto insolubile.
f) L’anticorpo ricombinante è stato ridisegnato, inserito in un altro vettore in cui era stata
aggiunta un’ulteriore sequenza al C-terminale. Il prodotto ottenuto, si è dimostrato solubile
e funzionale, in quanto in grado di immunoprecipitare il recettore Met e di bloccare in
vitro l’internalizzazione di L.M nelle cellule. In conclusione, si è dimostrato è possibile
interferire con l’internalizzazione di L.M. in vitro con forme ricombinanti l’anticorpo
monoclonale DO-24, prodotte nel laboratorio. Su questa base queste molecole potrebbero
trovare applicazione nella prevenzione e nella terapia da infezioni di L.M.. Il fatto che il
progetto, che originariamente prevedeva anche esperimenti di protezione in vivo in
animali inoculati con dosi letali di L.M., sia stato finanziato solo parzialmente ne ha
impedito per ora lo sviluppo in questa direzione.
411

Michele Presutti Filone tematico C2
Costruzione e applicazione di un sistema di indicatori per la misurazione
della qualita’ dell’assistenza domiciliare
Asl 10
CONTESTO E RAZIONALE
La recente letteratura internazionale (Patmore, 2004) riferisce che si è assistito ad un crescente
interesse per l’individuazione di indicatori sulla qualità ai fini di monitorare i cambiamenti
interni all’organizzazione e confrontare la propria organizzazione con le altre (benchmarking)
per individuare nuove domande e promuovere il cambiamento. Secondo quanto ha
recentemente sottolineato Olsson (2004), l’incontro tra l’operatore e il paziente è destinato a
divenire una relazione molto stretta, intima. L’autore descrive tale relazione in funzione di una
serie di dimensioni che possono essere immaginate lungo un continuum che comprende, ad un
estremo, il rapporto tra il care giver e il paziente (e i suoi familiari) e all’altro, gli aspetti più
razionali e logistici (numero di visite, prescrizioni, etc.). In particolare, sono individuati tre
processi: le condizioni organizzative dei servizi di cura domiciliare (riunioni, supervisione,
ogni forma di delega di responsabilità all’interno dell’organizzazione e del nucleo familiare
dell’assistito), le aspettative che le diverse parti dell’organizzazione hanno rispetto al lavoro e
agli altri attori, e infine, lo scambio tra gli attori durante l’attività lavorativa che può essere
tradotto in clima emotivo che si genera e si alimenta nella cura quotidiana. In modo analogo
Donabedian (Cfr Kane, 1994) ha suggerito di esaminare la cura domiciliare attraverso tre tipi
di criteri: la struttura organizzativa, il processo e i risultati. I criteri strutturali si riferiscono a:
competenza dello staff, livelli organizzativi, pratiche di supervisione, registrazione dei dati,
attrezzature e politiche della direzione. I criteri di processo riguardano l’introduzione di
pratiche per il mantenimento di un buon standard di vita (prevenzione). I criteri per la
valutazione dei risultati richiedono delle valutazioni pre-post, al fine di individuare una base
line con cui confrontare i risultati. Oltre tali criteri Kane (1994) ne suggerisce un quarto
“abilitante”, che comprende aspetti relazionali: cortesia, puntualità, affidabilità e onestà.
OBIETTIVO
Obiettivo della presente indagine è approfondire le dimensioni di tali esperienze soggettive
per individuare anche delle implicazioni empiriche verso cui orientare il miglioramento della
qualità dell’assistenza domiciliare.
MATERIALI E METODI
Il metodo qualitativo è oggi riconosciuto come metodo specifico particolarmente adatto a
cogliere il punto di vista dell’utenza. Il campione dei pazienti – utenti è rappresentativo delle
tipologie prese in carico dal servizio. Il campione dei caregivers è costituito da 15 soggetti
che, in posizioni organizzative e operative sul territorio abbiano contribuito alla realizzazione
della rete di servizi e siano in grado di valutarne l’impatto attuale.
RISULTATI
412

Gli utenti. Il servizio a domicilio viene rappresentato come qualcosa di speciale, di
straordinario nel senso di qualcosa che viene realizzato ad hoc per ogni specifica situazione e
porta inevitabilmente con sé un disagio e un certo grado di disorganizzazione per entrambe le
parti: il cliente e l’erogatore del servizio medesimo. Nelle cure a domicilio è evidente il ruolo
attivo del cliente nel costruire insieme all’erogatore il servizio stesso. Non è un prodotto finito
che il cliente acquista, ma un incontro in cui il professionista e il cliente mettono in gioco il
loro sapere e le loro tecniche. La relazione diviene il servizio stesso nella misura in cui sembra
emergere una preminenza del dato relazionale, dialogico e umano su quello tecnico. Il
domicilio è il contenitore di una fitta trama di relazioni e rapporti che hanno per protagonista
il malato. L’identificazione dei familiari con il ruolo degli operatori, in quanto sono loro stessi
a farne le veci quando questi ultimi sono assenti, è da considerarsi un aspetto della dimensione
affettiva che caratterizza la relazione tra i familiari e gli operatori.
I caregivers. I temi risultati particolarmente salienti sono stati quelli dell’ambiguità o meglio
del bisogno di chiarezza rispetto ai confini di ruolo dei singoli operatori che insistono sul
territorio, della comunicazione snella ed efficace e della conoscenza approfondita di tutte le
risorse organizzative disponibili all’interno dell’Asl 10 e offribili al paziente. Emerge con
forza la necessità del coordinamento, della conoscenza reciproca, personale degli operatori.
Un’intervistata delinea le criticità dei servizi territoriali antecedenti gli sforzi di
coordinamento, integrazione, reticolazione. Le aspettative che i soggetti hanno, a differenti
livelli nell’organizzazione, rispetto al lavoro e agli altri attori coinvolti, sono uno dei fattori
che sembra avere maggiore influenza sulla qualità della cura domiciliare. Il rispetto e la
concretizzazione di tali aspettative hanno ricadute rilevanti sulla soddisfazione lavorativa e
sullo stress degli operatori derivante dalla discrepanza fra le risorse disponibili (pratiche -
mezzi tecnici, coperture di orario e di territorio- e relazionali -coordinamento, supporto sociale
ed emotivo, condivisione della sofferenza e del carico emotivo della cura) e quelle auspicate
per la realizzazione di un buon servizio domiciliare.
CONCLUSIONI
I risultati dell’analisi hanno consentito di individuare degli indicatori riferiti ad entrambi gli
attori della relazione. Di seguito un elenco degli indicatori relativi alla qualità del servizio,
individuati da declinare in funzione degli attori gli operatori e gli utenti (per esempio, il carico
di lavoro come è raccontato dagli operatori che lo vivono, e come viene percepito dagli utenti
che per così dire, lo “subiscono”): Continuità di lavoro percepito (carico di lavoro, elevato
conflitto, limitata distanza dal paziente), Continuità della cura, Comunicazione,
Conflitto/coesione nel gruppo di lavoro, Stabilità del gruppo di lavoro, Stabilità della
relazione, Processo di decisione, Condizioni di cura, Relazione di fiducia, Rapporto
(percepito) tra i membri dell’équipe, Isolamento sociale, Umore/emotività associata al
processo di cura/presa in carico.
I risultati ancorché parziali, dati i limiti che presentano, offrono degli spunti interessanti
soprattutto verso l’area della formazione professionale degli operatori. In particolare, pur
essendo importante prendere in esame le specificità delle diverse forme di cura e dei diversi
tipi di utenti-pazienti, risultano essenziali tre aree: l’area relativa al piccolo gruppo – coesione,
conflitto, leadership, processi decisionali – ; la comunicazione – rafforzamento della rete
integrata,sviluppo della capacità di comprensione ed ascolto; gli aspetti relazionali:
rafforzamento delle capacità di fiducia ed empatia.
413

Giulio Preti Filone tematico C1
Studio dei fattori che regolano interfaccia tessuti-impianti per terapia di
supporto in pazienti con traumi o neoplasie
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale
OBIETTIVI
Nella presentazione del progetto sono stati posti 2 obiettivi:
a) analizzare ed identificare, in vivo, i fattori biologici, che favoriscono o impediscono il
processo infiammatorio, presenti nell’interfaccia impianto e tessuto periimplantare in
pazienti che hanno subito exeresi chirurgiche dei tessuti orali ed extraorali per traumi o
neoplasie;
b) partendo dai fattori biologici identificati, trovare farmaci idonei per impedire il processo
infiammatorio e l’eccessiva proliferazione della cute.
Tali obiettivi derivano dalla considerazione che il successo dell’implantologia dipende da
diversi fattori: il tipo di impianto, lo sviluppo di un processo infiammatorio, il tempo di
guarigione e le condizioni generali del paziente. E’ pertanto di fondamentale importanza
capire quali siano i fattori ed i meccanismi coinvolti nella guarigione, nell’integrazione
dell’impianto con l’osso e in quale modo siano coinvolti il tessuto periimplantare e
periprotesico.
METODI E RISULTATI
Per raggiungere gli obiettivi è stato preso in considerazione il tessuto cutaneo perimplantare e
periprotesico sia nel caso degli impianti extraorali che intraorali, in quanto anche in questi
ultimi la chirurgia ricostruttiva utilizza inserti di tessuto cutaneo. I pazienti analizzati sono
stati 5:
1) perdita di orecchio per incidente,
2) carcinoma squamoso della regione nasale,
3) 4) e 5) carcinoma del pavimento buccale.
Tutti questi pazienti sono stati sottoposti a trapianto di cute e successivamente a
posizionamento di impianti e protesi per chiudere il difetto anatomico causato o dal trauma o
dall’asportazione del tumore. Sulle biopsie di tessuto cutaneo effettuate a diversi tempi
durante il posizionamento degli impianti (first and second samples) e della protesi (third
sample) è stata valutata l’espressione di alcune citochine pro-infiammatorie mediante l’analisi,
in real time –PCR del contenuto dell’RNAm. Le citochine pro-infiammatorie:TNFα, IL-1β e
IL-6 e IL-8 aumentano soprattutto in due pazienti (3 e 5), nei quali si è avuto il rigetto di
almeno un impianto, mentre la citochina anti-infiammatoria IL-10 aumenta solo nei pazienti,
in cui non si è avuto processo infiammatorio e quindi nessun rigetto. Da questi dati si può
affermare che il dato biologico coincide con quello clinico. Inoltre l’esame istologico sulle
biopsie, su cui sono state determinate le citochine, conferma il dato molecolare. Nel prossimo
futuro si cercherà di atttuare terapie adeguate per evitare il rigetto.
414

Vito Marco Ranieri Filone tematico D4
Ventilazione non invasiva (CPAP) per prevenire l’insufficienza
respiratoria acuta nel paziente chirurgico: studio randomizzato
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Discipline Medico-Chirurgiche
La prima fase dello studio è consistita nella realizzazione di uno studio randomizzato e
controllato mirante a verificare se il trattamento precoce della ipossiemia severa nel paziente
post-chirurgico potesse prevenire complicanze gravi quali la insufficienza respiratoria acuta
richiedente ventilazione meccanica. 200 pazienti con ipossiemia grave sviluppatasi
immediatamente dopo il termine dell’intervento chirurgico di chirurgia addominale maggiore
sono stati randomizzati per essere trattati con trattamento convenzionale o applicazione di
ossigeno attraverso un circuito pressurizzato per la ventilazione non invasiva (CPAP). Il
sistema utilizzato per erogare la ventilazione non invasiva è stato realizzato e testato nel
nostro laboratorio e si tratta di un elmetto di materiale plastico che circonda completamente la
testa del paziente e consente la erogazione della CPAP riducendo gli effetti indesiderati e
collaterali della ventilazione non invasiva erogata attraverso maschere facciali convenzionali.
Dalla analisi dei dati sono state ottenute le seguenti informazioni:
1. L'applicazione precoce della CPAP consente di ridurre l'incidenza dell'intubazione
endotracheale e della ventilazione meccanica dal 10 all’1 %.
2. L'applicazione precoce della CPAP ha significativamente ridotto l’incidenza di polmoniti,
infezioni e sepsi ed ha inoltre ridotto la durata della degenza in terapia intensiva e in
ospedale. La mortalità nel gruppo trattato con trattamento convenzionale era del 4% e si
riduceva all’1% nel gruppo trattato con CPAP.
La rilevanza delle osservazioni ha determinato la pubblicazione dei risultati dello studio su
JAMA, una delle più prestigiose riviste di medicina al modo.
Nella fase successiva, abbiamo sviluppato un modello sperimentale di ipossiemia severa postoperatoria
per elucidare il meccanismo bio-molecolare sottostante al risultato della riduzione
di infezioni e sepsi osservati nei pazienti trattati con CPAP. L’ipotesi che è stata verificata è se
la riapertura delle atelettasie polmonari tipiche della fase post-operatoria e realizzatasi
attraverso CPAP possa attenuare fattori pro-infiammatori a livello polmonare e sistemico e
favorire i processi di riparazione cicatriziale al livello della sutura chirurgica. Tale ipotesi è
stata generata sulla base delle seguenti considerazioni:
a) dati sperimentali hanno dimostrato che il polmone atelettasico di pazienti e di animali
genera mediatori pro-infiammatori che si diffondono in periferia e che inducono la
insufficienza degli organi periferici (rene, intestino) attraverso un processo apoptosimediato;
b) lo studio clinico ha dimostrato che il livello di ossigenazione del sangue arterioso e di
pressione arteriosa media era identico nei due gruppi e che quindi fattori diversi
dall’incremento della ossigenazione poteva spiegare la riduzione di infezioni e sepsi
osservato nei pazienti trattati con CPAP.
Il modello realizzato è un coniglio che, durante anestesia generale, subisce una laparotomia ed
una resezione colica. Al risveglio l’animale viene trattato per 6 ore con ossigeno in aria
415

ambiente o con CPAP. Gli animali sono quindi sacrificati a 6-12-24-48 72 ed una settimana.
Si misurerà la concentrazione dei mediatori della infiammazione e la espressione delle
proteine pro.infiammatorie nei tessuti polmonari, nel rene e nell’intestino.
CONCLUSIONI
L'evoluzione di questo studio e le eventuali ricadute per il sistema sanitario regionale
prevedono:
1. La riduzione dei costi legati alla diminuzione della degenza in terapia intensiva e della
incidenza di sepsi, che può essere stimata tra i 3000 ed i 15000 Euro per paziente.
2. Ogni anno vengono sottoposti ad interventi di chirurgia addominale circa 100.000 pazienti
all’anno. L'incidenza di sepsi e ventilazione meccanica (condizioni ad alto costo ed alta
mortalità) è del 10%. E’ come se ogni anno, all’aereoporto di Caselle, 4 aerei della tratta
Torino-Roma abbiano gravi incidenti. L’uso di un sistema semplice ed a basso costo come
la CPAP può ridurre drammaticamente le dimensioni di tale fenomeno.
3. La comprensione dei meccanismi biologici sottostanti questo risultato potrà indurre lo
sviluppo di ipotesi farmacologiche di trattamento che, modulando la risposta
infiammatoria e riducendo la apoptosi degli organi periferici, possa agire in modo
sinergico con la CPAP.
L’ottenimento di tali risultati e lo sviluppo delle ipotesi sperimentali ha comportato:
• acquisto di un fabbricatore di ghiaccio granulare;
• acquisto di reagenti in grado di quantificare la risposta infiammatoria e la apoptosi/necrosi
nei tessuti di animali sottoposti a chirurgia addominale maggiore;
• acquisto di un lettore in assorbanza a 96 pozzetti.
PUBBLICAZIONI
1. Racca F, Appendini L, Gregoretti C, Stra E, Patessio A, Donner CF, Ranieri VM.
Effectiveness of mask and helmet interfaces to deliver noninvasive ventilation in a human
model of resistive breathing. J Appl Physiol. 2005 Oct;99(4):1262-71.
2. Squadrone V, Coha M, Cerutti E, Schellino MM, Biolino P, Occella P, Belloni G, Vilianis
G, Fiore G, Cavallo F, Ranieri VM; Piedmont Intensive Care Units Network (PICUN).
Continuous positive airway pressure for treatment of postoperative hypoxemia: a
randomized controlled trial. JAMA. 2005 Feb 2;293(5):589-95.
3. Fanelli V, Ranieri VM. Role of apoptosis in the post-operative sepsis. Intensive Care
Medicine 2005; 31: S987
416

Daniele Regge Filone tematico C1
Ruolo della colonscopia virtuale nell’identificare lesioni neoplastiche in
soggetti con rischio familiare o personale
A. S. O. Ordine Mauriziano di Torino
OBIETTIVO
Lo scopo del progetto è di valutare l’attendibilità della TC-colografia come test di screening
per il carcinoma colorettale. Per ottenere dati sufficientemente attendibili un tale studio deve
reclutare un numero elevato di soggetti sani. Si è pertanto deciso di condurre uno studio di
tipo multicentrico coinvolgendo diversi centri italiani ed europei. End point secondario dello
studio è la messa a punto di un programma informatico di riconoscimento automatico dei
polipi che possa consentire una lettura in automatico degli esami di TC-colografia, procedura
che ridurrebbe i tempi di refertazione e quindi il costo complessivo dell’esame.
METODI E RISULTATI
a) Richiesto parere sperimentazione clinica: lo studio, già approvato dal comitato etico
della Fondazione Piemontese per la Ricerca sul Cancro-Onlus e dal Comitato Etico
Regionale, è stato riconosciuto come progetto nell’ambito della Società Italiana di
Radiologia Medica (SIRM) e della Società Italiana di Gastroenterologia ed Endoscopia
(SIGE). In itinere il progetto è stato emendato in modo da includere anche soggetti con
test del sangue occulto fecale positivo (FOBT) eseguito nell’ambito del Programma di
Screening Regionale.
b) Data base per la raccolta dati: il data base per la raccolta dati è stato creato dal Dott.
Luca Boni dell’Unità di Epidemiologia Clinica dell’Istituto Nazionale per la Ricerca sul
Cancro di Genova. Le schede, accessibili in rete Internet, sono state completate con l’aiuto
della Dott.ssa Cristiana Laudi dell’Unità Operativa di Gastroenterologia dell’IRCC di
Candiolo in una serie di incontri svoltisi a Genova. I Centri partecipanti al progetto
possono accedere al data base centralizzato e compilare le apposite schede previa
comunicazione di apposita propria login e password.
c) Inserimento del progetto nell’ambito del programma di screening regionale: a partire
dal mese di ottobre sono stati inseriti nello studio anche i pazienti nei quali venga
riscontrata una positività del sangue occulto fecale (FOBT) nell’ambito del Programma di
Screening Regionale per la prevenzione dei tumori colorettali. Il piano regionale prevede il
ritiro del test per il FOBT presso le farmacie e quindi l’invio del test al laboratorio analisi.
I pazienti risultati positivi, per i quali vi è pertanto indicazione all’esecuzione della
colonscopia, sono randomizzati ad eseguire o meno la TC-colografia prima della
colonscopia al mattino stesso dell’esame. Una Segreteria allestita a tale scopo presso il
CPO contattata i pazienti randomizzati ad eseguire entrambi gli esami, spiega loro le
finalità del progetto e raccoglie la loro eventuale adesione. I soggetti che accettano di
partecipare allo studio si recano presso l’IRCC di Candiolo o presso l’Ospedale Molinette
di Torino ove ottengono ulteriori informazioni da parte della dott.ssa Cristiana Laudi (per
l’IRCC) o della dott.ssa Barbon (per l’ Ospedale Molinette) che consegnano loro il
modulo di consenso informato e prenota la data in cui verranno effettuati entrambi gli
esami. Ad oggi sono stati reclutati 38 soggetti FOBT positivi e di questi 30 sono già stati
sottoposti ai due tests.
417

d) Centri attivati e pazienti reclutati: è stato calcolato che per raggiungere un
significatività statistica è necessario reclutare un minimo di 400 soggetti. Sono stati
contattati 30 centri Italiani ed Europei. I Centri Italiani hanno partecipato ad un
Investigator Meeting che si è tenuto in Gennaio a Torino durante il quale il è stato
presentato lo studio. Al momento altri 17 Centri Italiani e 1 Centro Estero (University
Hospital Gasthuisberg di Leuven in Belgio) oltre il nostro, dopo le adeguate procedure di
registrazione del Centro, sono stati attivati, dispongono di propria login e password per
l’inserimento dei dati e hanno già iniziato le procedure di reclutamento dei pazienti a
partire da gennaio. Per ciascun Centro sono state effettuate visite di start-up da parte dei
responsabili dello studio per verificare l’idoneità del Centro e per istruire riguardo alle
modalità di inserimento dei dati nel data-base. Riguardo al reclutamento dei pazienti fino
ad oggi sono stati reclutati 250 soggetti dei quali 230 sono già stati sottoposti ai due tests.
Il tasso totale di reclutamento è stato di circa 20 pazienti al mese. Si prevede che il
reclutamento terminerà entro la fine del 2006.
e) Data base per la raccolta degli esami: è stato acquistato un server che consentirà la
raccolta di tutti gli esami di TC-colografia eseguiti nel corso dello studio. I dati raccolti
verranno testati con programma di riconoscimento automatico dei polipi, in via di sviluppo
presso l’Istituto di Interscambio scientifico di Torino. I dati preliminari effettuati
analizzando gli esami condotti su 25 pazienti sono stati presentati all’ultimo Congresso
della Società Americana di Radiologia.
418

Corrado Rendo Filone tematico C2
Continuità assistenziale in gravidanza, parto e puerperio e individuazione
di percorsi differenziati e flessibili
Asl 16
CONTESTO E RAZIONALE
Nella premessa dello studio è stato evidenziato che con il d.lgs. 229/99 è stata confermata la
regionalizzazione del SSN e l'aziendalizzazione delle USL, imponendo una rimodulazione
dell'offerta sanitaria che, in un quadro di assegnazione locale di risorse limitate, pur tenendo
conto dell’evoluzione della scienza medica e del soddisfacimento dei bisogni di salute,
persegua lo sviluppo di modelli organizzativi efficienti. Il sistema normativo nazionale si è
occupato (sia nell'ambito dei successivi PSN sia più specificamente con il DPR 14.01.97 e con
il progetto-obiettivo materno infantile nazionale) di tutelare il processo riproduttivo delle
donne principalmente individuando competenze e requisiti affinchè l'assistenza alle gravide e
al feto sia la più adeguata possibile dal punto di vista della sicurezza. La stessa normativa
appare invece più carente nell’affrontare gli aspetti più specificamente legati alla continuità
dell’assistenza nel processo riproduttivo e all’individuazione dei luoghi più idonei al parto.
L’attuale situazione (nazionale e regionale) dell’evento nascita e dell’assistenza alle donne
gravide appare oggi caratterizzata da luci e ombre. Accanto a livelli di natalità e fecondità i
più bassi del mondo e al permanere di alcuni aspetti critici, i principali indicatori
epidemiologici si sono modificati positivamente negli ultimi anni. Se ci discostiamo però dai
classici indicatori epidemiologici lo scenario dell’offerta appare connotato da alcuni
importanti elementi di criticità quali ad es. l’eccessivo utilizzo di procedure diagnostiche e
terapeutiche complesse e invasive anche nelle gravidanze fisiologiche, la parcellizzazione dei
punti-nascita con casistiche inferiori ai 500-600 parti/anno, la gestione inadeguata delle
gravidanze ad alto rischio.
La situazione organizzativa appare contraddistinta da due elementi negativi principali:
1. la discontinuità dell’assistenza al processo riproduttivo;
2. la mancanza di chiare distinzioni tra i percorsi assistenziali delle gravidanze a basso e
quelle ad alto rischio.
Diversi modelli di assistenza alle gravidanze fisiologiche sono stati studiati e proposti nella
letteratura internazionale: da essi emerge con evidenza che il perseguimento di modelli
organizzativi con forte continuità assistenziale nonchè l'individuazione di percorsi
assistenziali distinti può assicurare risultati di maggiore appropriatezza, umanizzazione,
sicurezza, gradimento degli utenti ed economicità.
OBIETTIVO
L’obiettivo della ricerca è quello di elaborare (attraverso l'analisi di elementi informativi della
realtà locale- l’ASL 16 Mondovì-Ceva - e l'analisi della letteratura) un modello di assistenza
al processo riproduttivo che garantisca (con razionalizzazione della tecnologia e della spesa)
un’efficiente continuità delle cure e l'individuazione di percorsi differenziati per promuovere
sia l'umanizzazione delle gravidanze a basso rischio sia la migliore tutela delle gravidanze ad
alto rischio.
419

METODI E RISULTATI
Sui modelli realizzati in altre realtà europee è stata effettuata una rassegna attraverso la
consultazione delle principali banche-dati, e un viaggio-studio ha permesso di conoscere la
realtà sanitaria francese. La situazione locale è stata esaminata attraverso l'analisi dei dati
socio-demografici della popolazione femminile, lo studio del sistema di offerta dell’ASL 16,
la raccolta delle principali informazioni di tipo clinico relative alle gravidanze e ai parti (in
particolare tutti i parti di residenti avvenuti nel periodo 01.02-12.03), il grado di continuità
delle cure e infine il grado di soddisfazione delle utenti intervistando un campione
significativo di gravide che avevano partorito nei due ospedali dell’ASL. Dall’analisi
acccurata di quanto acquisito è emerso che l'attuale offerta assistenziale dell’ASL 16 appare
sinteticamente caratterizzata da:
1. presenza di due ospedali, dislocati a breve distanza l'uno dall'altro (Mondovì e Ceva),
ognuno dotato di un punto nascita ma solo uno (Mondovì) supportato dal DEA e da
rianimazione;
2. espletamento nel 2003 di 352 parti a Mondovì e 255 a Ceva (meno dell’1% a domicilio),
presenza di rilevante mobilità passiva;
3. gravide con caratteristiche socio-demografiche associate a difficoltà di accesso ai servizi
nella misura del 23% a Mondovì e del 15% a Ceva;
4. percentuale del 25% di gravidanze a rischio;
5. assistenza in gravidanza prestata prevalentemente da medici pubblici, di cui i 2/3 del totale
in regime libero-professionale e 1/3 erogata presso i consultori e gli ambulatori
ospedalieri;
6. percentuale significativa di gravide con assistenza prenatale inadeguata e che non accede
agli screening prenatali;
7. 40% di parti cesarei, 4,7% di nati pretermine a Mondovì e 3% a Ceva, nati sottopeso 3%;
8. maggiore discontinuità assistenziale durante il puerperio.
Alla luce di quanto analizzato la proposta che si può suggerire quale modello alternativo di
assistenza è la seguente:
1. la presenza di due ospedali con due distinti punti nascita (entrambi con un numero di parti
al di sotto della soglia raccomandata, e con uno dei due privo del supporto del DEA)è in
contrasto con le raccomandazioni delle Autorità sanitarie e della letteratura. Si può
ipotizzare un modello locale integrato e coordinato all'interno del quale indirizzare una
delle due strutture al monitoraggio della gravidanza e del parto a basso rischio (modello
'Casa di maternità' dove la figura professionale di riferimento è l'ostetrica), concentrando
nell'altra le risorse necessarie per garantire l'assistenza più adeguata alle gravidanze a
rischio aumentato.
2. Il miglioramento del modello della continuità assistenziale appare perseguibile attraverso
un maggiore impegno e potenziamento dei servizi consultoriali, nonchè atrraverso una più
efficace integrazione fra servizi territoriali e ospedalieri.
Si può suggerire: l'attivazione di una offerta di assistenza ostetrica e pediatrica a domicilio
nella prima settimana di vita del neonato; azioni di miglioramento organizzativo delle
procedure riguardanti il travaglio di parto (modificazione attività e ritmi di lavoro delle
ostetriche, formazione continua, criteri di flessibilità nella presenza del personale);
qualificazione delle prestazioni ambulatoriali per correggere alcune evidenti anomalie
(eccessivo ricorso all'assistenza libero-professionale, procedure cliniche non in linea con la
moderna assistenza ostetrica).
420

Gabriella Restagno Filone tematico C1
Ottimizzazione della diagnosi molecolare di mutazioni causa di sordità
congenita mediante tecnologie miniaturizzate
ASO O.I.R.M. Sant’Anna
Dipartimento di Patologia Clinica
CONTESTO E RAZIONALE
La sordità congenita bilaterale grave è una delle più frequenti malattie genetiche, (1 su 1000
nati). Il 70% sono forme non-sindromiche ed il 50% di queste è dovuto a mutazioni
autosomiche recessive nel gene GJB2 che codifica la proteina CX26. Tali mutazioni causano
una forma di sordità congenita bilaterale grave (>40Db), che se diagnosticata precocemente ha
comunque la possibilità di interventi riabilitativi precoci. Gli obiettivi del progetto di ricerca
erano: 1- messa a punto di un sistema ottimale, confrontando le due tecnologie miniaturizzate
del Pyrosequencing e dei microarray, per l’identificazione delle mutazioni più frequenti nel
gene GJB2 e per la ricerca della mutazione mitocondriale A1555G. 2- validazione nella
clinica delle due nuove tecnologie con verifica dei tempi di attesa e dei costi, paragonati ai
costi attuali.
METODI E RISULTATI
Negli anni 2000-2004 sono stati diagnosticati presso l’Istituto di Audiologia delle Molinette
79 casi di bambini con sordità grave, sottoposti all’analisi molecolare per la CX26 con
metodiche di sequenziamento diretto. 36 bambini (45,6%) sono risultati portatori di mutazioni
nel gene GJB2. Nel 64% dei cromosomi-sordità è presente la mutazione 35delG, negli altri
casi le mutazioni risultano altamente eterogenee (509insA, L90P, V94M, G12D, W24X,
R127H, F83L, S139N, E129K, V153I, W44X, W44C, M34T, 393 –2A, Q80P, E47X,
119delE, M162V, 290-291insA, K224Q, G160S, R75W, T189I). La mutazione A1555G è
stata evidenziata in cinque bambini. Per l'analisi su PSQ96MA (Pyrosequencing) uno dei due
primer di ogni reazione è stato sintetizzato con biotina al 5', per facilitare l'isolamento del
templato a singola elica. Le reazioni di pyrosequencing sono state eseguite su un apparecchio
PSQ96 a 28°C. Il test consiste in un allungamento della catena del primer ibridizzato alla
sequenza omologa del DNA a singola elica da analizzare, con l'aggiunta di uno o più
nucleotidi dopo l'aggiunta sequenziale dei desossinucleotidi trifosfati, seguito dalla
degradazione dei nucleosidi trifosfati in eccesso da parte della apirasi. L'aggiunta sequenziale
dei differenti deossinucleotidi trifosfati segue un ordine di dispensazione programmato dal
software SNP Entry (Pyrosequencing AB, Uppsala, Svezia). La sequenza a ogni passaggio di
allungamento è registrata dalla misurazione dell'emissione di luce come indicatore
dell'incorporazione del nucleotide aggiunto, e le sequenze risultanti sono analizzate
automaticamente dal software SNP evaluation. Per i microarray abbiamo valutato la metodica
che attualmente meglio si adatta all'identificazione di SNPs e mutazioni per la sua sensibilità e
versatilità: la NMW 1000 NanoChipTM Molecular Biology Workstation (Nanogen, San
Diego, CA). Questa tecnologia prevede l'uso di un particolare supporto semiconduttore, che
rende possibile il movimento attivo e la concentrazione di molecole cariche su siti specifici di
analisi (pads) attraverso la manipolazione elettronica di un campo elettrico. In particolare un
processo di elettroforesi microelettronica indirizza il prodotto di PCR biotinilato su “pads”
selezionati caricati positivamente. Gli amplificati sono quindi immobilizzati grazie
all'interazione con la streptavidina contenuta nello strato di agarosio che ricopre la superficie
421

del supporto microelettronico. Il DNA fissato sul chip è successivamente ibridato con una
miscela di oligonucleotidi complementare alle sequenze normali e mutate, marcati con i
fluorofori Cy5 e Cy3. L'applicazione al chip di un gradiente di temperatura crescente
determina la denaturazione e quindi la rimozione preferenziale delle sonde non perfettamente
appaiate.
Dopo tale passaggio ad elevata stringenza termica, il chip è analizzato e la fluorescenza
quantificata. Abbiamo analizzato in cieco i 36 pazienti con le mutazioni e altri 40 pazienti in
cui con il sequenziamento non erano state evidenziate varianti di sequenza. Il pannello che
abbiamo predisposto con le metodiche di Pyrosequencing riguarda le mutazioni più frequenti:
35delG (64% dei nostri casi), F83L, M34T, Q80P e L90P, V94M, R127H, E129K, W44X (un
aggiuntivo 16%). Lo stesso pannello è stato ottimizzato su sistema Nanogen. Con la metodica
Pyrosequencing tutte le mutazioni analizzate sono risultate corrispondenti alle mutazioni già
evidenziate con la metodica tradizionale su 3100 ABIPrism Genetic Analyzer. I DNA
analizzati con il sistema Nanogen hanno evidenziato una discrepanza tra i risultati della
sequenza “classica” (confermati in Pyroseqeuncing) per la non possibilità del sistema
Nanogen di discriminare tra la mutazione W44X e la mutazione W44C. Rianalizzando il
flusso di lavoro, dall’arrivo del campione di sangue alla refertazione, per entrambi i sistemi i
tempi di esecuzione dell’intero esame sono brevi, di circa quattro giorni. I tempi per il
sequenziamento dell’intero gene sono invece di circa 7 giorni. I costi sono decisamente
contenuti per quanto riguarda il Pyrosequencig, di circa 5 euro a mutazione, mentre per il
sistema Nanogen, dato l’elevato costo iniziale della strumentazione, ci si aggira intorno a 14
euro per mutazione. Il sequenziamento dell’intero gene ha un costo di circa 150 euro.
CONCLUSIONI
E’ ovvio che i vantaggi delle due tecniche nuove sono la rapidità di risposta e i costi contenuti
quando ci si trovi ad analizzare mutazioni ad elevata frequenza nella popolazione considerata.
Il maggior svantaggio è che sia il Pyrosequencing sia gli array permettono unicamente la
diagnosi di quelle particolari mutazioni presenti nel pannello specifico. In conclusione, data la
frequenza variable delle diverse mutazioni nel gene GJB2, l’approccio più razionale sarebbe
di adottare una strategia diagnostica a due passaggi: nel primo, utilizzare la metodica del
Pyrosequencing, che nella nostra esperienza si è rivelata la più affidabile ed economica, per
evidenziare la mutazione 35delG (presente nel 64% della nostra popolazione), e di passare al
sequenziamento diretto nel restante 36% dei casi in cui sono presenti mutazioni più rare, che
sono rappresentate singolarmente in meno del 2% dei pazienti. Tra le due micrometodiche la
tecnologia di Pyrosequencing si è dimostrata una piattaforma veloce ed accurata per la
genotipizzazione di SNP e mutazioni.
L’analisi con tale tecnologia della mutazione più frequente, 35delG, dimostra una tipizzazione
certa degli omozigoti e degli eterozigoti, e permette l’estensione dell’analisi rapida ai parenti
degli affetti per la ricerca degli eterozigoti (“portatori sani”), con possibilità di offrire una
consulenza genetica mirata. (“portatori sani”), con possibilità di offrire una consulenza
genetica mirata.
422

Umberto Ricardi Filone tematico C1
Radioterapia stereotassica ipofrazionata del carcinoma broncogeno non
a piccole cellule in stadio I
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Discipline Medico-Chirurgiche
CONTESTO E RAZIONALE
La radioterapia stereotassica ipofrazionata è una moderna tecnica radioterapia ad alta
precisione in grado di consentire la somministrazione di una dose biologicamente più efficace,
rispetto ai trattamenti convenzionali, in pazienti affetti da tumore del polmone non a piccole
cellule (NSCLC) in stadio iniziale (T1N0M0 stadio IA; T2N0M0 stadio IB) e giudicati non
eleggibili ad intervento chirugico per motivi medico-internistici.
MATERIALI E METODI
Nell’ambito del progetto di ricerca, dal Dicembre 2003 all’Agosto 2005 sono stati sottoposti a
ESRT 31 pazienti affetti da NSCLC in Stadio I (28 maschi e 3 femmine; età media 72.5 anni;
diametro medio delle lesioni 2.81 cm con range 1.5-4.5 cm). Dopo confezionamento di
apposito cuscino a vuoto come parte integrante del sistema di localizzazione (Stereotactic
Body Frame-Elekta Oncology System) e previo utilizzo di apposito compressore
diaframmatico per la riduzione della mobilità respiratoria ove necessario (escursione
respiratoria delle lesioni superiore a 1 cm), i pazienti sono stati sottoposti a studio TC nella
posizione di trattamento, con acquisizione di immagini assiali, con spessore di 2.5 mm e
ricostruite con un intervallo di 2.5 mm. Sulle immagini TC di centratura, utilizzando la
finestra per il parenchima polmonare, sono stati definiti i volumi di interesse radioterapico. Il
volume tumorale microscopico (CTV) è stato considerato equivalente al volume tumorale
macroscopico (GTV). Sono stati quindi aggiunti, per la definizione del PTV, margini assiali di
5 mm e longitudinali di 10 mm. Per il calcolo della dose sono stati utilizzati gli algoritmi
matematici più complessi di tipo convolutivo al fine di una più corretta valutazione della
diffusione laterale degli elettroni nel parenchima polmonare. Il programma di trattamento è
consistito nella somministrazione di 45 Gy in 3 frazioni di 15 Gy ciascuna, in 5 giorni totali.
L’isocentro stabilito dalle coordinate stereotassiche del localizzatore corporeo, è stato
verificato mediante esecuzione di immagini portali ortogonali confrontate con le corrispettive
DRR.
RISULTATI
Non si sono verificate tossicità maggiori (≥2). 29 di 33 pazienti risultano valutabili (1 paziente
perso al follow-up e i restanti 3 presentano follow-up limitato). Il follow-up medio è stato di
10 mesi (range 1.5- 21). Il controllo locale è risultato pari al 100% (12/29 risposte complete,
11/29 risposte parziali, 6/29 stabilità di malattia).
CONCLUSIONI
In conclusione, nella nostra attuale esperienza, la radioterapia stereotassica ipofrazionata pare
rappresentare una valida alternativa terapeutica, estremamente sicura ed efficace, nel
423

trattamento degli stadi iniziali di tumore del polmone non eleggibili a chirurgia per motivi
medici-internistici, costituendo quindi in questa popolazione di pazienti una modalità di
trattamento realmente paritetica alla chirurgia. Questa preliminare esperienza potrebbe
pertanto avere delle immediate ripercussioni nella ottimizzazione del trattamento radioterapico
di pazienti affetti da carcinoma broncogeno non a piccole cellule in stadio iniziale e non
candidabili ad intervento chirurgico per problemi internistici, sia per i brillanti risultati clinici
ottenuti che per la compliance dei pazienti ad un trattamento concentrato in tre sedute in una
settimana rispetto ad un trattamento quotidiano della durata di 6-7 settimane.
424

Lorenzo Richiardi Filone tematico D1
Incidenza del tumore del testicolo in Piemonte e aree del Sud Europa:
trend temporali e differenze geografiche.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Biomediche e Oncologia Umana
OBIETTIVI
Lo studio si propone di utilizzare i dati di diversi Registri Tumori europei per analizzare
l’incidenza di tumore del testicolo, stimando trend temporali, variazioni geografiche, ed
effetto dell’età, periodo di diagnosi e coorte di nascita. In particolare si vuole paragonare il
Sud Europa (e in primo luogo l’Italia) con gli altri paesi europei, in cui sono stati condotti
precedenti studi che hanno mostrato un forte aumento di incidenza del tumore del testicolo nel
tempo ed importanti differenze geografiche.
METODI E RISULTATI
Sono stati valutati i trend temporali sia per quanto riguarda tutti i tumore del testicolo, sia
separatamente per sottotipo istologico, seminomi e non seminomi.
TUTTI I TUMORI.
L’incidenza è andata aumentando in tutte le 12 popolazione per cui erano disponibili i dati
(Paesi scandinavi, UK, Repubblica Ceca e Slovacchia, Spagna, Slovenia, Francia, Svizzera ed
Italia). L’aumento annuale medio nel periodo 1993-1999 è stato tra l’1% ed il 6% a seconda
del paese (in Italia dell’ 1.2%, intervallo di confidenza al 95%: -0.5 - 3.0). Le variazioni in
incidenza tra i diversi paesi erano dell’ordine di 5-volte. L’incidenza, standardizzata e troncata
per la classe di età 15-54 anni, più elevata è stata trovata in Danimarca (16.7 per 100,000
abitanti-anno) mentre la Finlandia aveva l’incidenza meno elevata (4.2 per 100,000 abitantianno).
E’ stata notata una differenza nel trend temporale in base all’incidenza: nei paesi ad
incidenza più elevata si è verificato negli ultimi anni un’attenuazione della cosiddetta
epidemia di tumore del testicolo, mentre nei paesi a bassa incidenza l’epidemia continua ad
aumentare. L’andamento di mortalità è stato studiato in 22 paesi europei. Nell’ultimo
ventennio la mortalità è diminuita in tutti i paesi con stime dell’aumento medio annuale
comprese tra –0.1% (Romania e Bulgaria) e – 6.2% (Germania). Vi sono però due importanti
eccezioni: il Portogallo (+2.0%) e la Croazia (+4.4%). Le ragioni dell’aumento di mortalità in
questi due paesi dovranno essere studiate ad-hoc, in quanto la mortalità potrebbe essere un
indicatore di problemi di adeguatezza dell’assistenza. In Italia il tasso di mortalità per il
periodo 1993-98 era di 0.4 per 100,000 abitanti-anno, con una diminuzione nell’ultimo
ventennio di – 4.0 (intervallo di confidenza al 95%: -5.3 a –2.6). I tassi di mortalità sono più
alti nei paesi dell’Est Europa, dove vi è stato probabilmente un ritardo nell’introduzione del
corretto regime chemioterapico a base di cispaltino. In particolare, in Bulgaria, Polonia,
Repubblica ceca, Romania ed Ungheria la mortalità per il periodo 1993-98 era superiore ad 1
per 100,000 abitanti anno.
425

SEMINOMI E NON SEMINOMI
Le analisi per sottogruppo istologico sono state condotte nei paesi in cui si è verificato un
numero sufficiente di seminomi e non seminomi (almeno 5 casi all’anno in media per ogni
classe di età tra 15 e 54 anni). Tali paesi sono: Italia, Francia, Svizzera, Repubblica Ceca,
Danimarca, Norvegia, Svezia e Gran Bretagna. Il risultato principale è che l’incidenze di
seminoma e non seminoma hanno andamenti temporali simili, soprattutto quando si considera
la coorte di nascita. I paesi con una più alta incidenza di seminoma hanno anche un’alta
incidenza di non-seminoma. In alcuni paesi, come Danimarca e Svizzera, si è assistito ad un
appiattimento dell’aumento di incidenza negli anni novanta solo per quanto riguarda il nonseminoma.
Tale differenza, rilevabile nelle analisi per periodo di calendario, non è però
evidente quando si conducono analisi per coorte di nascita, in quanto il nonseminoma si
verifica ad un’età più giovane e quasi tutti i casi nati negli anni ’80 hanno un nonseminoma.
Questo tipo istologico di tumore al testicolo è quindi più suscettibile ai cambiamenti recenti.
In alcuni paesi era evidente una diminuzione nell’incremento di incidenza durante la Seconda
Guerra Mondiale (noto come “II World War Effect”), sia per i seminomi che per i
nonseminomi; risultato, questo, consistente con un eziologia simile tra i due tipi istologici. In
Italia, nel periodo 1992-1997, l’incidenza standardizzata di seminoma era di 3.9 casi per
100,000 abitanti-anno, mentre l’incidenza di non-seminoma era di 2.4 per 100,000.
PUBLICAZIONI
Sono previste due pubblicazioni su riviste internazionale.
426

Franco Ripa Filone tematico C2
Lo sviluppo degli indicatori professionali per il miglioramento della
performance clinica e della qualità
ASO S. Giovanni Battista
CONTESTO E RAZIONALE
Una delle principali risposte elaborate dalle scienze amministrative alla necessità di
individuare strumenti coerenti di misurazione e valutazione è la cosiddetta Balanced
Scorecard (BSC). È questo un sistema di riferimento in grado di tradurre gli obiettivi
strategici, raggiungibili, misurabili in un insieme “multidimensionale” coerente di misure di
performance bilanciate e tendenti a proiettare l’Azienda sulla prospettiva futura. La necessità
della BSC deriva, in sintesi, dalla difficoltà che si riscontra in particolare nelle Aziende
Sanitarie a misurare le performance aziendali di lungo periodo, non direttamente riconducibili
agli aspetti finanziari.
OBIETTIVO
Sulla scorta delle considerazioni in precedenza espresse, il lavoro maturato nell’ASL di Ivrea
nel corso del 2005 e 2006 nell’ambito del Progetto di Ricerca Sanitaria della Regione
Piemonte si è proposto alcuni obiettivi generali:
a) sperimentare un modello di controllo di gestione, con particolare riferimento
all’applicazione e allo sviluppo del sistema di BSC;
b) analizzare l’organizzazione sulla base del modello sviluppato per individuare i punti critici
e, se necessario, porre in atto gli interventi di miglioramento;
c) produrre un Manuale per la formazione degli operatori sullo sviluppo della BSC.
L’ASL di Ivrea è una delle Aziende Sanitarie della Regione Piemonte, con circa 185.000
abitanti, due Distretti Sanitari (Ivrea e Cuorgnè) e tre Presidi Ospedalieri (Ivrea, Cuorgnè e
Castellamonte). Il ricorso alla BSC ha rappresentato un tentativo di realizzare pertanto un
controllo di gestione “multidimensionale” di seconda generazione, in grado di monitorare le
diverse linee organizzative in modo dinamico e proiettato al futuro, ma soprattutto coerente
con i bisogni degli attori in campo.
MATERIALI E METODI
Nell’ASL di Ivrea il Progetto di sviluppo della BSC è stato avviato dai primi mesi del 2005,
contestualmente con la formulazione del nuovo “Atto aziendale”, che ha ridisegnato
l’Azienda nelle sue articolazioni strategiche ed operative. L’impostazione della BSC è stata
considerata alla luce del ciclo Plan, Do, Check, Act.
In senso più specifico la costruzione della BSC si è articolata in specifiche fasi
conseguenziali: analisi organizzativa, definizione della mappa strategica, individuazione di
KPA e KPI, utilizzo della BSC come sistema di misurazione, integrazione e messa a regime
dei sistemi formativo, formativo e premiante. La fase di analisi organizzativa è stata
indispensabile per chiarire le caratteristiche aziendali. L’Atto aziendale è diventato
propedeutico per l’individuazione degli obiettivi strategici, da trasformare in obiettivi di
gestione quotidiana e in tal senso è stata necessaria individuare una coerenza logica
427

nell’organizzazione. Tale approccio si è concretizzato nella definizione della mappa
strategica, uno dei punti di riferimento fondamentali della BSC. L’ipotesi strategica
rappresentata attraverso la mappa strategica è servita a guidare verso una corretta
strutturazione delle aree di interesse su cui l’organizzazione non può fallire (key performance
area - KPA), nonché su di una specifica ponderazione delle grandezze utilizzate per misurare
le performance nelle diverse aree (key performance indicator- KPI). Definiti KPA e KPI, il
passo successivo si è concretizzato nella definizione della “Scheda di valutazione bilanciata”,
specifica per i livello organizzativo in analisi (Azienda, Presidi Ospedalieri, Distretti,
Dipartimento di Prevenzione). Bilanciata per l’appunto tra misure di performance di natura
puramente finanziaria (lagging indicators) e misure di performance di natura non finanziaria
(leading indicators), tra misure di risultato e misure che indirizzano le performance future. La
scheda di valutazione bilanciata utilizzata nell’ASL di Ivrea riporta le seguenti voci di
riferimento: codice, KPI, valori anno 2001 2002 2003 2004, target, andamento, valori anno
2005 2006 2007, azioni da mettere in atto. In tal modo la Scheda può essere utilizzata come
strumento di analisi e lettura dell’organizzazione verso il passato, ma anche come modello di
proiezione verso il futuro in senso progettuale.
RISULTATI
L’esperienza dell’ASL di Ivrea ha messo in evidenza come la BSC possa essere utilizzata in
primo luogo come sistema di valutazione. Attraverso quindi la raccolta ragionata dei dati tra il
2001 e il 2005 è stato possibile ripercorrere la “storia aziendale” e mettere in luce punti di
forza e punti deboli. Altresì la BSC è stata utilizzata come strumento di integrazione
aziendale, per lo sviluppo del sistema formativo, del sistema informativo e del sistema
premiante a livelli sempre maggiori di integrazione. Per quanto riguarda il sistema formativo,
a partire dal 2005 è stata ulteriormente implementata la formazione manageriale ad ampio
raggio sulla valutazione di attività, costi e qualità. Per quanto concerne invece il sistema
informativo; nell’ASL 9 è stata effettuata la scelta di utilizzare a livello di sistemi informativi
strumenti omogenei e trasversali: questa scelta ha portato all’introduzione di due sistemi
automatizzati, uno in ambito amministrativo-contabile ed uno in ambito sanitario nell’area
ospedaliera e nell’area territoriale, che sono stati comunque consolidati in chiave di BSC. Per
quanto riguarda il sistema premiante, la formulazione del piano di obiettivi di budget relativo
alla mappa strategica ha assimilato per gli anni 2005 e 2006 le specifiche della BSC e le sue
quattro aree di riferimento.
E’ stato anche prodotto uno specifico Manuale di riferimento per lo sviluppo della BSC
nell’ASL di Ivrea “La valutazione e il miglioramento delle performance nelle Aziende
Sanitarie: la BSC tra controllo di gestione e qualità”, utile come strumento di formazione
degli operatori e, come tale, trasmesso anche alle altre Aziende della Regione Piemonte,
secondo le finalità del Progetto.
CONCLUSIONI
In sintesi l’introduzione dei principi connessi alla BSC nell’ASL di Ivrea ha rappresentato
sicuramente una crescita del sistema verso forme più evolute di controllo di gestione. La BSC
non è comunque uno strumento per superare i limiti di imposti dalle regole finanziarie, ma un
mezzo per governare più variabili, in uno scenario omnicomprensivo in cui gli aspetti
economici rappresentano alternativamente crisi od opportunità in rapporto ad altri parametri
organizzativi e sociali. Il lavoro presentato ha pertanto mostrato molti contenuti positivi per i
diversi livelli di management, soprattutto per quanto riguarda la maggiore integrazione
dell’organizzazione e dei suoi meccanismi operativi, nella logica del governo clinico.
428

Menico Rizzi Filone tematico A1
Studi strutturali e funzionali di NadN di Haemophilus influenzae: un
potenziale candidato per lo sviluppo di un vaccino
Università del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”
Dipartimento di Scienze Chimiche, Alimentari, Farmaceutiche e Farmacologiche
In tempi recenti lo studio dei fenomeni di regolazione che governano l'omeostasi del NAD+,
cofattore enzimatico vitale ed ubiquitario in natura, è stato oggetto di un'intensa attività di
ricerca. I percorsi biochimici che sovrintendono alla sintesi di NAD ed al traffico dei suoi
precursori metabolici sono distinti, e differentemente regolati, nei batteri e negli eucarioti
superiori. Con il presente progetto ci siamo proposti di caratterizzare strutturalmente e
funzionalmente la proteina NadN di H. influenzae, agente eziologico, nell'uomo, di comuni
patologie a carico dell'occhio, dell'orecchio e delle vie respiratorie. L'enzima NadN è una 5'nucleotidasi
che interviene nei meccanismi essenziali di processamento e trasporto di
precursori biosintetici del NAD attraverso la membrana del batterio, agendo in concerto con
la proteina e(P4) ed una porina non ancora caratterizzata. L'enzima, inoltre, dimostra un
elevato grado d'immunogenicità che suscita, nell'ospite, una potente risposta battericida nei
confronti di numerosi ceppi ed isolati del patogeno. Inoltre, in una seconda fase ci siamo
occupati di caratterizzare un’ enzima di Anopheles gambiae, il vettore per il Plasmodium
falciparum, la causa della forma più pericolosa della malaria. Tale enzima, la 3idrossichiunurenina
transaminasi, è ritenuta un bersaglio molto promettente per nuovi agenti
antimalarici.
RISULTATI
Mediante PCR effettuata sul DNA genomico del ceppo Rd di H. influenzae (ATCC #51907D)
abbiamo selettivamente amplificato il gene che codifica l'enzima NadN. Utilizzando tecniche
classiche di sottoclonaggio, l'amplimero è stato inserito nel vettore d'espressione procariotico
pET25b (Novagen). Il costrutto risultante (pET25-hiNadN) dirige, nel ceppo BL21(DE3) di
E. coli, la sovra-espressione inducibile, T7-dipendente, di una versione ricombinante della
proteina, in grado di essere esportata nel periplasma, creando una situazione artificiale che
ricalca i meccanismi naturali di processamento dell’enzima in Haemophilus. A seguito di una
sottile messa a punto dei parametri di crescita e d'induzione del clone ricombinante
BL21(DE3)-hiNadN, abbiamo ottenuto un sistema in vitro che sostiene una vigorosa
espressione di NadN (il 70% delle proteine totali nella frazione solubile del lisato batterico è
costituito dall'enzima ricombinante). Abbiamo successivamente ottimizzato un protocollo di
purificazione dell'enzima su larga scala, basato sulla metodologia FPLC; tale protocollo,
prevedendo solo due passaggi cromatografici garantisce una resa eccellente in proteina pura al
99% ed una totale riproducibilità. Abbiamo, inoltre, messo a punto un semplice saggio
colorimetrico che misura l'attività catalitica della NadN in funzione del rilascio di fosfato
inorganico che accompagna l'idrolisi del substrato. Ciò ha permesso un'esaustiva
caratterizzazione funzionale dell'enzima ricombinante e la descrizione dei parametri cinetici
relativi all'idrolisi del substrato specifico NAD e di suoi analoghi. Inoltre, grazie all'elevato
grado d'omogeneità del materiale purificato, sono stati ottenuti cristalli della proteina NadN in
diverse forme cristalline, creando una situazione ideale per la determinazione della struttura
tridimensionale. Le condizioni ottimali per la crescita di cristalli della proteine NadN adatti ad
indagini strutturali attraverso cristallografia a raggi-X sonoi le seguenti:
429

• tecnica della diffusione di vapore in goccia pendente;
• soluzione precipitante contenete 30% PEG 1500, 0.1 M NaAcetato pH 5.0;
• concentrazione della proteina pari a 6.5 mg/ml;
• temperatura di 20 °C.
I cristalli cosi ottenuti sono stati caratterizzati in via preliminare utilizzando luce di
sincrotrone presso la stazione ESRF, Grenoble Francia. I cristalli appartengono al gruppo
spaziale C2221 con le seguenti costanti reticolari a= 52.8 Å, b=125.6 Å, c=198.5 Å e
diffrangono ad una risoluzione di 1.3 Å. La determinazione della struttura tridimensionale è
attualmente in corso sulla base di diversi data set sempre ottenuti attraverso l’uso di luce di
sincrotrone. Nel caso dell’enzima 3-idrossichinureina transaminasi di A. gambiae, il cDNA
del gene relativo è stato isolato a partire da una banca di mRNA di ghiandole salivari di
zanzara adulta. Il cDNA è stato quindi inserito in un opportuno vettore per la sovraespressione
in E. coli (pET-16b) e la proteina ricombinante purificata all’omogeneità e caratterizzata dal
punto di vista enzimatico. I risultati sono apparsi su una rivista internazionale (Rossi et al.
2005) in cui è stato specificamente menzionata la Regione Piemonte come finanziatrice del
progetto. Inoltre anche in questo caso la struttura tridimensionale è in via di definizione. Per
entrambe le proteine studiate, le informazione strutturale, chiarendo a livello atomico i
meccanismi della catalisi potranno essere utilizzate per il rational design di potenziali nuovi
agenti antibiotici o antimalarici, a funzione inibitoria specifica. Inoltre, nel caso di H.
influenzae NadN, sarà possibile proporre, come potenziali candidati vaccino, forme
ricombinanti dell'antigene, in cui vengano introdotte mutazioni puntiformi a carico delle
regioni coinvolte nell'induzione della risposta immune, per potenziare le proprietà
immunogeniche dell'enzima senza causarne alterazioni strutturali.
PRODOTTI DELLA RICERCA
• costrutto pET25-hiNadN per la produzione ad alte rese di NadN ricombinante; protocollo
per la sovra-espressione di NadN in Escherichia coli;
• protocollo per la purificazione all’omogeneità di NadN attraverso cromatografia;
• protocollo per la preparazione di cristalli di NadN adatti ad indagine strutturale;
• costrutto pET16-Ag-hkt per la produzione ad alte rese di A. gambiae 3-HKT
ricombinante;
• protocollo per la sovra-espressione di A. gambiae 3-HKT in Escherichia coli;
• protocollo per la purificazione all’omogeneità di di A. gambiae 3-HKT attraverso
cromatografia;
• protocollo per la preparazione di cristalli di di A. gambiae 3-HKT adatti ad indagine
strutturale;
PUBBLICAZIONI
Articoli su riviste internazionali (in cui stata specificamente indicata la Regione Piemonte
come finanziatrice della ricerca):
1. Cassani, C., Rossi, F., Garavaglia, S., Rizzi, M. (2005). Expression, purification and
preliminary crystallographic analysis of Haemophilus influenzae NadN. Acta Cryst.
Section D. Under revision.
2. Rossi F., Lombardo F., Paglino A., Cassani C., Arcà B., Rizzi M. (2005). Identification
and biochemical characterization of Anopheles gambiae 3-hydroxykynurenine
transaminase. FEBS Journal, 272, 5653-5662.
430

Patrizia Robino Filone tematico D2
Identificazione di Helicobacter enterici in specie aviari e nell'uomo con
metodi tradizionali e biomolecolari
Università degli Studi di Torino
Dipartimento diProduzioni Animali, Epidemiologia ed Ecologia
AREE DI LAVORO
1. Settore Malattie Infettive - Dipartimento di Produzioni animali, Epidemiologia ed
Ecologia - FMV, Università di Torino
2. Unità Operativa Gastroenterologia ed Endoscopia Digestiva - Ospedale Asti; Laboratori
diagnostici - Ospedale di Nizza Monferrato (ASL19).
PRIMA PARTE SVOLTA PRESSO IL SETTORE DI MALATTIE INFETTIVE
Campionamento
Volatili da reddito: sono stati prelevati campioni da 132 volatili da reddito: 36 faraone, 15
galletti livornesi, 15 ovaiole, 15 galli Highline, 20 broilers e da volatili provenienti da
allevamenti privati: 19 broilers, 10 ovaiole, 2 struzzi.
Volatili da affezione e ornamentali: sono stati prelevati campioni autoptici da 33 pappagalli
e 15 uccelli ornamentali (pavoni, micterie, struzzi e un casuario) provenienti da diversi
allevamenti privati piemontesi.
Metodi di laboratorio
Dall'intestino cieco e dal contenuto cecale venivano prelevati campioni per l'estrazione del
DNA. Negli psittacidi, poichè hanno i ciechi pseudoatrofici, veniva prelevata una porzione di
duodeno. La presenza del DNA estratto veniva controllata con PCR con primers universali
per il gene 16S rRNA. I campioni di DNA risultati positivi sono stati sottoposti a una PCR per
Helicobacter genus. Parte dei campioni positivi alla PCR-H. genus venivano sequenziati per
identificare la specie di appartenenza. Su tutti i campioni è stata eseguita una PCR per H.
pullorum e su alcuni di quelli risultati positivi si è proceduto a un'ulteriore tipizzazione per
discriminare eventuali ceppi di H. canadensis. Le sequenze riconosciute mediante
sequenziamento come appartenenti alla specie H. pylori sono state riconfermate mediante
PCR. Infine su un campione di feci provenienti da volatili positivi alla PCR per H. pullorum
sono stati eseguiti esami colturali per la ricerca di helicobacter.
Risultati
Su 132 volatili da reddito 100 sono risultati positivi alla PCR-H. genus (75.7%), mentre i
volatili da affezione e ornamentali sono risultati negativi. La PCR per H. pullorum ha
evidenziato 93 campioni positivi. Una parte di questi campioni è stata sequenziata
confermando la positività per H. pullorum. Il sequenziamento di 7 prodotti di PCR positivi
alla ricerca di H. genus ma negativi alla ricerca di H. pullorum ha permesso di identificare 3
campioni come H. pylori, 3 come H. hamster e 1 come H. pullorum. La successiva ricerca del
sito di taglio per l'enzima Apa LI su 10 campioni positivi alla ricerca di H. pullorum, ha
evidenziato la presenza di 1 ceppo appartenente alla specie canadensis nel gruppo delle
faraone francesi. L'esame colturale ha evidenziato solo ceppi di Campylobacter jejuni e C.
coli confermati con PCR.
431

SECONDA PARTE SVOLTA PRESSO LA ASL 19
E' stata preparata una scheda informativa più un questionario da sottoporre ai pazienti in visita
presso il reparto di gastroenterologia dell'Ospedale di Asti.
Campionamento
Durante le visite endoscopiche sono stati prelevati campioni di succo gastrico da 50 persone
con problemi digestivi. Da 3 pazienti è stato possibile ottenere anche un campione di feci
Metodi di laboratorio
Su frammenti di mucosa gastrica veniva eseguito il Campylobacter Pylori test. Sulle stesse
porzioni veniva effettuata l'estrazione del DNA. I campioni di DNA pervenivano presso il
settore di Malattie Infettive del Dip. di Produzioni animali, per essere ulteriormente processati
(vedi "metodi di laboratorio" nella parte 1). Solo in 3 casi è stato estratto DNA anche dalle
feci dei pazienti.
Risultati
Sul totale di 50 campioni di succo gastrico analizzati con PCR-H. pylori 33 sono risultati
positivi. Sui 3 campioni di feci, in due casi si è avuto esito positivo alla PCR, confermando il
risultato ottenuto dal succo gastrico, mentre un terzo ha dato esito negativo, nonostante il
succo gastrico fosse positivo. Su 17 campioni positivi al CP test 16 sono stati confermati
mediante PCR. In un caso il CP test ha dato esito positivo con PCR negativa. Su 33 campioni
negativi al CP test 16 sono risultati positivi alla PCR evidenziando un valore di concordanza
molto basso (=0.34). La ricerca di H. pullorum ha dato esito negativo su tutti i campioni.
CONCLUSIONI
I nostri dati confermano una elevata presenza di H. pullorum nelle specie aviari da reddito
evidenziando una percentuale (70.4%) maggiore rispetto a quelle riscontrate finora con
metodi tradizionali. Questi risultati confermano la notevole diffusione di questi microrganismi
nei volatili da reddito e pongono interrogativi sulle modalità di diffusione di germi che
possono colpire anche l'uomo, in quanto potrebbero rappresentare una potenziale fonte di
contaminazione delle carcasse durante la macellazione. Non è possibile al momento trarre
delle conclusioni sulla presenza di H. canadensis nei nostri volatili, dato il campione non
rappresentativo. Comunque questo batterio (identificato come nuova specie nel 2000 da Fox e
coll.) è stato isolato finora in oche selvatiche e in casi di diarrea nell'uomo. Un risultato di
particolare rilevanza ottenuto nella nostra indagine è stato l'identificazione di H. pylori
nell'intestino cieco di volatili. Questo dato se confermato con adeguata casistica potrebbe
indicare gli uccelli come potenziali reservoir. Non abbiamo rilevato presenza di Helicobacter
nei volatili da affezione ed esotici esaminati, questo ci fa ipotizzare che siano proprio le
condizioni di allevamento a permettere la diffusione del microrganismo, ma al momento non
possiamo escludere anche una differente sensibilità all'infezione. Per quanto riguarda la parte
dedicata allo studio su pazienti umani il nostro intento è stato di confrontare un test
biomolecolare, ancora poco utilizzato, con un test comunemente usato in ambito ospedaliero.
La valutazione della concordanza fra le due metodiche ha rilevato una scarsa correlazione,
con una apparente maggiore sensibilità del test biomolecolare rispetto a quello tradizionale.
Entrambi i protocolli sono comunque metodi invasivi per cui abbiamo voluto valutare la
possibilità di eseguire la PCR a partire da feci. I primi risultati sono stati interessanti ma
andranno proseguiti su un campione adeguato. Concludendo, i risultati da noi ottenuti in
campo veterinario dimostrano che specie appartenenti al genere Helicobacter sono ben
radicati nel patrimonio aviare e che in questo ambito possono essere mantenuti batteri
patogeni per l'uomo come H. pylori o potenzialmente tali (H. pullorum, H. canadensis).
432

Rodolfo Rocca Filone tematico C1
Neurolisi plesso celiaco nella palliazione del dolore neoplastico:
confronto della tecnica radiologica e ecoendoscopica
A. S. O. Ordine Mauriziano di Torino
CONTESTO E RAZIONALE
Gli studi preliminari che hanno utilizzato l’approccio ecoendoscopico-guidato nella
esecuzione dalla neurolisi del plesso celiaco sembrano evidenziare una minore probabilità di
causare effetti avversi rispetto alle tecniche percutanee assistite radiologicamente o
ecograficamente. In particolare, benché il plesso celiaco in se non sia una struttura
identificabile dalla ecoendoscopia, è possibile una precisa localizzazione della regione celiaca
dove esso si trova. Pertanto l’avanzamento dell’ago per effettuare la ablazione delle fibre
nervose in questa regione attraverso la parete gastrica posteriore è maggiormente accurato e
dovrebbe ridursi la possibilità di complicanze neurologiche (soprattutto motorie e sensitive
agi arti inferiori) od emorragiche che sono proprie della procedura.Inoltre la tecnica
endoscopica ha lo svantaggio di richiedere l’esecuzione di una endoscopia con una blanda
sedazione. Non esiste tuttavia attualmente alcuno studio che confronti in modo randomizzato
l'efficacia, gli effetti collaterali, il gradimento e i risultati a distanza tra le due tecniche per
ottenere la neurolisi del plesso celiaco. Il vantaggio atteso per il sistema sanitario regionale e
nazionale è una risposta sul migliore metodo per procedere al trattamento del dolore
neoplastico refrattario tra le due metodiche attualmente disponibili, in termini di efficacia,
semplicità, costo e sicurezza.
OBIETTIVI
Studio randomizzato controllato in cieco in collaborazione tra l’UOA di Gastroenterologia
dell’Ospedale Mauriziano di Torino e il Servizio di Anestesia, Rianimazione e Terapia
Antalgica dell’IRCC di Candiolo per valutare l'efficacia e la sicurezza della neurolisi del
plesso celiaco guidata ecoendoscopicamente vs la neurolisi TAC-guidata in 38 pazienti
consecutivi randomizzati 1:1 con dolore da neoplasie del pancreas, stomaco e vie biliari non
operabili e che richiede terapia antalgica (FANS e/o oppioidi). Sono esclusi dallo studio i
pazienti con metastasi ossee e ai tessuti molli. L’obiettivo primario è confrontare in termini di
efficacia, sicurezza e tollerabilità le due tecniche con cui si può eseguire la neurolisi del
plesso celiaco, endoscopica o percutanea, in una serie di pazienti affetti da tumori
gastroenterici avanzati con dolore addominale cronico refrattario ed impegno del plesso
celiaco.
METODI E RISULTATI
Il progetto è stato sottoposto al parere del Comitato Etico della Regione Piemonte; dopo un
lungo iter di valutazione lo studio ha ottenuto il parere favorevole del Comitato, per cui è stato
possibile iniziare l’arruolamento dei pazienti (approvazione a fine 2004). A seguito
dell’approvazione è stato possibile procedere con l’organizzazione pratica dello studio, sono
stati valutati 12 pazienti, 3 dei quali sono stati sottoposti ai trattamenti in studio; tra gli altri, 4
sono deceduti prima della randomizzazione, 3 sono stati scartati per l’assenza dell’indicazione
o per il miglioramento delle condizioni cliniche, ed i restanti 5 hanno rifiutato il loro consenso
alla partecipazione allo studio.
433

Criticità evidenziate. Per la ricerca dei pazienti candidabili al trattamento la Gastroenterologia
dell’ospedale Mauriziano si è integrata con il Servizio Cure Palliative del presidio Umberto I
di Torino, d’altro canto l’analogo tentativo di integrazione con il Centro dell’IRCC di
Candiolo, che è stato coinvolto sin dall’inizio del progetto, non ha fornito alcun candidato al
trattamento (per scarso interesse al protocollo o per mancanza di pazienti neoplastici avanzati
candidabili). Da ultimo l’adesione dei pazienti allo studio è risultata inferiore all’atteso e data
la delicatezza della situazione (palliazione del dolore neoplastico avanzato), non si è ravvisata
l’opportunità di una eccessiva insistenza nei confronti dei pazienti, nel rispetto delle normali
norme etiche e di ‘good clinical practice’. Per il futuro, data la persistente attualità dei quesiti
che questo progetto mirava a chiarire, si tenterà l’ampliamento della popolazione
coinvolgibile attraverso l’interessamento di ulteriori centri per il trattamento del dolore
neoplastico (con affluenza di più ampie casistiche di carcinomi pancreatici avanzati) in modo
da poter raggiungere la numerosità campionaria necessaria a verificare gli obiettivi dello
studio. Peraltro con il materiale di cui ci si è dotati, si conta di poter raggiungere una
numerosità di casi sufficentemente elevata da poter eseguire un'analisi ad interim adeguata
434

Giovanni Rolla Filone tematico C1
Valore predittivo di asma della misura di NO nell’aria espirata nei pazienti
rinitici con sintomi simil-asmatici.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Oncologiche
La frazione di ossido di azoto presente nell’aria espirata (FENO) è considerata un indicatore
di flogosi delle vie aeree. Numerosi studi dimostrano che i soggetti asmatici presentano una
quota di FENO notevolmente maggiore rispetto ai soggetti sani, e che anche nei pazienti
rinitici i valori di FENO sono più elevati rispetto ai valori osservati nella popolazione
generale. La presenza di rinite nei soggetti asmatici è stata dimostrata da numerosi studi
epidemiologici con una frequenza variabile tra il 75 e l’80%.
OBIETTIVO
Scopo della ricerca è stato quello di studiare se elevati valori di FENO potessero essere
indicativi di asma nei pazienti affetti da rinite e sintomi asthma-like (tosse stizzosa, dispnea,
sensazione di costrizione toracica, sibili respiratori), ma senza ancora una diagnosi certa di
asma.
MATERIALI E METODI
Pazienti. Abbiamo selezionato 40 pazienti (età media: 38,73 +/- 17,02 anni – rapporto M/F=
0,86) giunti al nostro Ambulatorio di Allergologia lamentando sintomatologia oculorinitica
persistente (ostruzione nasale, rinorrea anteriore, starnuti, prurito nasale e sintomi oculari) e
sintomi asthma-like, 40 pazienti affetti da rinite persistente senza sintomatologia asmatiforme
associata (età media: 32,35 +/- 14,60 anni – rapporto M/F= 0,86), 15 pazienti affetti da asma
non associata a rinite e 30 controlli sani (età media: 35,06 +/- 16,25 – rapporto M/F= 0,89).
Tutti i soggetti erano non fumatori e non avevano assunto, nei sette giorni precedenti,
antistaminici, cortisonici topici e/o sistemici, inibitori della degranulazione mastocitaria,
antileucotrieni, né broncodilatatori.
Valutazione clinica e misurazione del FENO: a tutti i soggetti selezionati abbiamo
somministrato un questionario per la valutazione della gravità dei sintomi nasali ed un
questionario relativo alla sintomatologia asmatiforme (questionario ECRHS); abbiamo quindi
praticato la misurazione del FENO tenendo conto delle raccomandazioni tecniche fornite
dall’ATS, mediante un analizzatore di NO a chemiluminescenza a rapida risposta (NIOX,
Aerocrine, Solna, Svezia).
Test di funzionalità respiratoria: i test di funzionalità respiratoria sono stati effettuati
mediante uno spirometro computerizzato in accordo con le procedure standard ATS e, nei soli
pazienti con sintomi asthma-like, venivano effettuati o il Test di broncodilatazione o il Test di
provocazione bronchiale con metacolina.
Prove allergometriche cutanee: in tutti i pazienti affetti da rinite (con o senza sintomi
asmatiformi) ed in quelli asmatici ma non rinitici, sono stati inoltre praticati test
allergometrici secondo la tecnica dello Skin Prick Test per i comuni allergeni inalanti.
435

RISULTATI
Il 77,5% (n=62) dei soggetti affetti da oculorinite avevano almeno una positività allo Skin
Prick Test, senza significativa differenza tra i due gruppi (paziente che riferivano o no sintomi
asmatiformi). Le sensibilizzazioni più frequentemente riscontrate nei due gruppi di pazienti
sono state: pollini di graminacee (14,84% dei pazienti), Dermatophagoides Farinae e
Dermatophagoides Pterossinus (10,44%), epitelio di gatto (7,69%), epitelio di cane (7,69%),
pollini di olivacee (7,69%). I tre gruppi di soggetti considerati non differivano statisticamente
nè per età, né per rapporto M/F e neppure per i risultati dei test di funzionalità respiratoria. A
12 (30%) dei 40 pazienti con sintomatologia asmatiforme è stata posta diagnosi di asma sulla
base della positività al TPB alla metacolina o al Test di broncodilatazione con salbutamolo. In
entrambi i gruppi di pazienti affetti da rinite (con o senza sintomatologia asmatiforme)
abbiamo riscontrato valori di FENO significativamente più elevati rispetto al gruppo di
controllo (37,25 ppb +/- 28,91 vs 13,08 ppb +/- 5,73, p=0,000007). I pazienti con rinite
associata a sintomi asmatiformi avevano valori medi di FENO significativamente più elevati
rispetto ai pazienti affetti da sola rinite (42,92 ppb +/- 28,48 vs 23,90 ppb +/- 15,17,
p

Sergio Rosati Filone tematico D2
Sviluppo di nuovi test sierologici gE-ELISA per il controllo della
Rinotracheite Infettiva del Bovino (IBR)
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Produzioni Animali, Epidemiologia ed Ecologia
CONTESTO E RAZIONALE
L'IBR è una malattia ampiamente diffusa in tutto il mondo con livelli di sieroprevalenza
elevati: attualmente le forme cliniche della malattia sono controllate perché negli ultimi venti
anni si è fatto ampio uso della vaccinazione. Ciò nonostante il BHV-1 è ancora oggi da
annoverare tra le maggiori cause di perdite economiche a livello di allevamento: inoltre, le più
recenti normative relative al commercio dei bovini pongono serie limitazioni al trasporto di
animali sieropositivi contro BHV-1 facendo presupporre che nei prossimi anni l'IBR
rappresenterà un problema dal punto di vista socio-economico. In Italia non c'è un
atteggiamento uniforme a riguardo: la provincia di Bolzano, unica in Italia, ha eradicato l’
infezione e il suo territorio è stato dichiarato ufficialmente indenne; regioni come Lombardia,
Piemonte e Valle D'Aosta hanno in corso dei piani di controllo per l'IBR. Nell'ambito di un
piano di eradicazione è fondamentale avere a disposizione un apparato diagnostico valido per
poter individuare con alto livello di sensibilità i soggetti positivi e poter così gradualmente
eliminare l'agente patogeno coinvolto.
La Regione Piemonte dal 2000 ha intrapreso un piano di controllo per l’ IBR, basato sulla
adesione volontaria da parte degli allevatori. Tale piano contempla l'utilizzo di vaccini marker
gE-. In passato però si è fatto largo uso di vaccini a virus vivo ed inattivato che hanno
sicuramente contribuito a limitare la malattia, ma hanno anche causato un aumento della
prevalenza sierologica per cui animali mai venuti a contatto con il virus wild type risultano
sieropositivi per la presenza di anticorpi vaccinali. Risulta quindi particolarmente utile
disporre di un metodo di screening economico ed applicabile su larga scala da affiancare ai
test ufficiali per riconoscere gli animali infetti (gE +) dagli animali vaccinati con vaccino
deleto (gE) in stalle che aderiscono al piano di eradicazione. Sono disponibili in commercio
test diagnostici di tipo competitivo che si basano sulla reattività verso un epitopo
immunodominante della gE. Tali test sono costosi ed incidono notevolmente sul budget a
disposizione delle autorità sanitarie regionali. Inoltre, si registrano false positività dovute al
fenomeno dell'impedimento sterico, allorquando un animale ripetutamente vaccinato con
marker gE- produce anticorpi diretti verso glicoproteine virali (es. gB) che, legandosi
all'antigene presente nel pozzetto, impediscono il legame fra monoclonale e gE.
Per le ragioni esposte risulta quindi particolarmente utile disporre della gE in forma purificata.
Infatti, l'assenza di altre proteine virali risolve l'eventuale fenomeno di impedimento sterico.
Inoltre, la gE in forma pura consentirebbe di sviluppare un test di tipo indiretto in cui altri
epitopi della gE potrebbero essere accessibili, aumentando la sensibilità del test.
OBIETTIVO
Queste considerazioni ci hanno indotto ad esplorare la possibilità di ottenere la gE in forma
ricombinante. Trattandosi di una glicoproteina dell'envelope virale, si è deciso di optare per
un sistema eucariota che garantisse una corretta modificazione post-traduzionale della
proteina (prevalentemente glicosilazione e trasporto).
437

METODI E RISULTATI
Il gene gE è quindi stato amplificato mediante PCR e clonato in un vettore di trasferimento
per baculovirus. Successivamente si sono generati baculovirus ricombinanti mediante
transfezione di cellule di insetto. Infine sono state valutate le caratteristiche antigeniche dei
prodotti con le usuali tecniche immunologiche.
I risultati indicano che la gE è stata espressa in forma glicosilata ed è localizzata a livello della
membrana delle cellule di insetto. Inoltre la reattività di due epitopi conformazionali ed un
epitopo lineare evidenziata con 3 anticorpi monoclonali anti-gE dimostra che l'espressione in
baculovirus preserva l'antigenicità e l'attività immunobiologica tipica della proteina nativa.
Sono stati utilizzati due vettori di trasferimento in grado di esprimere la proteina d’interesse in
forma secreta ed in forma cellulo-associata. Nel primo caso abbiamo valutato la possibilità di
utilizzare la gE ricombinante in un ELISA indiretto utilizzando sieri bovini caratterizzati in
precedenza mediante sieroneutralizzazione ed ELISA gE competitivo.
I risultati, pur incoraggianti evidenziano un limitato livello di espressione della gE in forma
secreta, probabilmente dovuta ad una rapida degradazione ad opera di proteasi cellulari in
ambiente "protein free". Più incoraggianti sono risultati i livelli di espressione della gE
associata alle cellule. Il test di western blot ha messo in evidenza una cospicua banda di peso
lievemente inferiore alle gE nativa, indicando un buon livello di espressione. Va considerato
che il background di sieri bovini verso proteine cellulari di insetto è piuttosto modesto e
l'utilizzo di un estratto cellulare infetto può essere utilizzato tal quale nella sensibilizzazione
di piastre ELISA, eventualmente predisponendo un controllo antigene rappresentato da un
estratto di cellule non infetto. Nella seconda fase del progetto, di ottimizzazione del test
ELISA indiretto, si è cercato di migliorare la sensibilita del test mediante la messa appunto di
un ELISA trapping, immuno-catturando la gE con l’anticorpo in grado di riconoscere
l’epitopo lineare. Questo ha permesso di migliorare il test ELISA, senza però ottenere i
risultati sperati e riportati da un altro gruppo che ha utilizzato lo stesso sistema di espressione
per produrre la glicoproteina ricombinante (Borrè et al., SIDILV 10-12 Novembre 2004).
Una valutazione più accurata di tale test e del sistema di espressione sarà oggetto di ulteriori
approfondimenti in un prossimo futuro prendendo in considerazione la possibilità di produrre
la glicoproteina E in un sistema di espressione che utilizza le cellule di mammifero. Questo
sistema dovrebbe permettere di produrre la gE ricombinante con la stessa conformazione della
glicoproteina E nativa. In conclusione, è stata ottenuta l’espressione della glicoproteina E di
BHV-1 in forma ricombinante con caratteristiche simili alla proteina nativa, ma non
sufficiente per la realizzazione di un test ELISA sensibile e specifico: in prospettiva futura, si
può ipotizzare l’utilizzazione di cellule di mammifero come sistema di espressione per la
produzione della gE con caratteristiche adatte all’impiego nell'ambito della diagnostica
dell’IBR, per l'identificazione di bovini immunizzati con vaccino a marker immunologico
negativo.
438

Floriano Rosina Filone tematico A2
Ruolo dei polimorfismi dei geni immunoregolatori nella risposta alla
terapia antivirale nell’epatite cronica C
Presido Sanitario Gradenigo
U.O.A. Gastroenterologia e Epatologia
CONTESTO E RAZIONALE
Il virus dell’epatite C (HCV)determina un ampio spettro di malattie epatiche che spazia
dall’epatite acuta e cronica, alla cirrosi e all’epatocarcinoma. Nondimeno l’infezione da HCV
può essere eradicata attraverso l’impiego dell’interferone α ricombinante o dell’interferone α
ricombinante peghilato da solo o in combinazione con la Ribavirina. Il ruolo dei genotipi
virali nel modulare le possibilità di risposta alla terapia risulta essere sufficientemente
determinato con i genotipi 2 e 3 che si associano ad una risposta sostenuta nel tempo nel 75-
85% dei casi trattati ed i genotipi 1 e 4 che si associano ad una risposta inferiore nell’ordine
del 35-45%. Meno chiaro a tutt’oggi il ruolo dell’ospite nel condizionare le possibilità di
risposta alla terapia: se è evidente che gli individui immunosoppressi dal virus
dell’immunodeficienza acquisita (HIV) o farmacologicamente (soggetti sottoposti a trapianto
di organi) rispondono in modo inferiore alla terapia, più nebuloso è il ruolo dei polimorfismi
dei geni che codificano per molecole immunomodulatrici nel condizionare le possibilità di
risposta alla terapia
OBIETTIVO
Valutare il ruolo dei polimorfismi dei geni che codificano per molecole immunomodulatrici
selezionate nel modulare le possibilità di risposta alla terapia nei diversi genotipi virali.
MATERIALI E METODI
Pazienti: in accordo con il protocollo, ma in proporzione alla quota di finanziamento, sono
stati selezionati a posteriori, classificandoli in base alla risposta alla terapia (Risposta
virologica sostenuta (SVR) e Non Risposta (NR)) e bilanciandoli per età, sesso e genotipo
o 40 pazienti trattati con Interferone α-2a o α-2b in monoterapia alla dose di 5 MU tre volte
alla settimana per 12 mesi
• o SVR: 20 pazienti (Maschi/Femmine 14/6, età media 48,2±9,1 anni, Genotipo 1: 14 pz –
Genotipo 2-3: 6 pz)
• o NR: 20 pazienti (Maschi/Femmine 14/6, età media 47,1±8,1 anni, Genotipo 1: 14 pz –
Genotipo 2-3: 6 pz)
o 40 pazienti trattati con Interferone α-2a o α-2b 5 MU tre volte alla settimana in
combinazione con Ribavirina 800-1200 mg in relazione al peso corporeo somministrati per 6
mesi nei pazienti con genotipo 2 e 3 e per 12 mesi nei pazienti con genotipo 1 e 4;
• o SVR: 20 pazienti (Maschi/Femmine 13/7, età media 50,0±9,3 anni, Genotipo 1: 15 -
Genotipo 2-3: 5 pz)
• o NR: 20 pazienti (Maschi/Femmine 13/7, età media 49,1±6,1 anni, Genotipo 1: 15 pz –
Genotipo 2-3: 5 pz)
439

o 40 pazienti trattati con Interferone Peghilato α-2a (180 ug 1 volta/settimana) o α-2b (1,5
ug/Kg 1 volta/settimana) in combinazione con Ribavirina 800-1200 mg in relazione al peso
corporeo somministrati per 6 mesi nei pazienti con genotipo 2 e 3 e per 12 mesi nei pazienti
con genotipo 1 e 4.
• o SVR: 20 pazienti (Maschi/Femmine 13/7, età media 51,4±9,1 anni, Genotipo 1: 14 -
Genotipo 2-3: 6 pz)
• o NR: 20 pazienti (Maschi/Femmine 13/7, età media 52,1±6,8 anni, Genotipo 1: 14 pz –
Genotipo 2-3: 6 pz)
Al fine di abbattere il ruolo delle modificazioni terapeutiche legate agli effetti collaterali dei
farmaci o alla non compliance dei pazienti sono stati arruolati solo quei soggetti che hanno
portato a termine l’intero ciclo di terapia. La risposta virologica sostenuta (SVR) è stata
definita come la persistente negatività del genoma del virus C in circolo (HCV-RNA) a
distanza di sei mesi dalla sospensione della terapia. La non riposta (NR) è stata definita come
la mancata negatività dell’HCV-RNA circolante a distanza di 6 mesi dall’inizio della terapia.
Al fine di estremizzare i fenotipi di risposta non sono stati inseriti pazienti relapser (pazienti
che dopo una risposta durante la terapia recidivano alla sospensione)
Metodi: il DNA è stato estratto da sangue periferico con metodiche commerciali,
l’amplificazione dei loci polimorfici è stata effettuata impiegando primer specifici, la
determinazione dei polimorfismi genici è stata valutata attraverso RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism) e successiva corsa dei prodotti di digestione del DNA su gel
di agarosio al 2% colorato con etidio bromuro.
RISULTATI
Nessuna delle differenze è risultata statisticamente significativa quando complessivamente la
coorte di SVR è sta confrontata con quella dei NR per ogni singolo polimorfismo. Nondimeno
quando i risultati sono stati analizzati in relazione alle singole modalità di trattamento si è
osservato nel gruppo di soggetti trattati con Interferone in monoterapia un trend alla
segregazione dei pazienti con SVR fra i soggetti con il genotipo TGF – 10 C/C (SVR C/C
9/20 (45%), NR C/C 4/20 (20%) (P = 0,07), tutti i questi soggetti erano portatori di genotipo
1. CONCLUSIONI: Nessuno dei genotipi polimorfici studiati ha dimostrato una significativa
associazione con le modalità di risposta alla terapia, quando i soggetti SVR e NR sono stati
valutati globalmente ed indipendentemente dalle modalità di terapia. Quando SVR e NR sono
stati analizzati per sottogruppi in relazione alla modalità terapeutica si è osservato un trend
all’associazione fra genotipo C/C TGF – 10 e la SVR.
Una maggiore numerosità del campione potrebbe chiarire se l’associazione è casuale o reale,
ma tale approccio avrebbe un valore speculativo dal momento che la monoterapia con
Interferone è stata pressoché completamente abbandonata o limitata a pazienti intolleranti o
con controindicazioni alla Ribavirina. L’assenza di un trend simile fra i soggetti trattati con
protocolli terapeutici combinati e maggiormente efficaci potrebbe nuovamente riflettere a) la
presenza di un errore Beta o b) la capacità di tali trattamenti di by-passare il ruolo favorente o
deterrente di determinati polimorfismi nel condizionare la risposta terapeutica.
440

Daniela Rossi Filone tematico C1
Integrazione della “memoria artificiale” nella cartella clinica per studio,
diagnosi e terapia delle malattie rare.
Asl 4
Sono stati raggiunti i seguenti obiettivi:
• Reperimento dei criteri diagnostici e dei protocolli terapeutici per le Malattie Rare
previste nel D.M. 279/2001 All.1 - Gruppo V - Malattie del sistema circolatorio: in
seguito ad un'ampia ed accurata analisi della letteratura scientifica condotta sulle
principali banche dati biomediche disponibili online (OVID, Pubmed, Cochrane Central) e
delle linee guida pubblicate (ricavate soprattutto dalla "National Guideline
Clearinghouse"). L'analisi di tali fonti ha permesso di realizzare dei criteri diagnostici
univoci per le patologie del gruppo V prese in esame (endocardite reumatica, poliangioite
microscopica, poliarterite nodosa, sindome di Kawasaki, Churg-Strauss, sindrome di
Goodpasture, granulomatosi di Wegener, arterite a cellule giganti, micripoliangiopatie
trombotiche e malattia di Takayasu). Per quanto riguarda invece gli approcci terapeutici e
i parametri da valutare nel follow up, sono state riscontrate delle differenze fra i diversi
protocolli proposti; si è quindi di classificare i diversi schemi terapeutici in base ad un
sistema di "grading" delle indicazioni basato sulle raccomandazioni del Manuale
Metodologico del Piano Nazionale Linee Guida. I protocolli di follow up dei pazienti sono
stati invece basati sul monitoraggio di indicatori generici di infiammazione, degli
indicatori di danno relativi agli organi principalmente colpiti dalle diverse patologie, e dei
marker relativi ai possibili effetti collaterali delle terapie (es. danno retinico nel caso
dell'uso di antimalarici di sintesi, marker di neoplasia nel caso dell'uso di
immunosoppressori).
• Realizzazione di tabelle costituenti la "memoria artificiale": i dati ottenuti dall'analisi della
letteratura sono stati inseriti all'interno di tabelle correlate fra loro realizzate mediante
l'uso del "DataBase Management System" (DBMS) MySQL. La scelta di questo software
è stata dettata dalla necessità di utilizzare un DBMS stabile, ampiamente diffuso e che
presentasse dei costi di acquisizione e di gestione ridotti. Le tabelle realizzate sono state
opportunamente "linkate" fra di loro al fine di permettere la migliore fruibilità delle
informazioni presenti nella memoria artificiale. L'accesso ai dati presenti è inoltre già oggi
possibile da differenti postazioni di lavoro grazie ad un'interfaccia web.
• E' attualmente in fase di ultimazione il porting delle tabelle attualmente realizzate
all'interno di un applicativo di gestione ospedaliera informatizzata open source (Care
2002) al fine di permettere l'utilizzo della "memoria artificiale" creata nell'ambito
dell'attività clinica quotidiana. Tale fase ha richiesto per essere realizzata un tempo
superiore al previsto in quanto si è ritenuto utile utilizzare un sistema di gestione della
cartella clinica a "sorgente aperto" al fine di facilitare l'adozione della stessa anche da
parte di altre realtà Regionali interessate. Inoltre una scelta di questo tipo favorirà il
trasferimento dei dati a livello centrale e la successiva analisi statistica.
• Sono stati realizzati mediante l'utilizzo del software per l'analisi epidemiologica Epiinfo
appositi moduli che permetteranno l'importazione dei dati grezzi provenienti dalle cartelle
cliniche elettroniche relative alle patologie rare prese in considerazione e l'analisi statistica
volta all'identificazione di particolari indici prognostici utili nel follow-up delle patologie
stesse e alla determinazione dell'outcome terapeutico.
441

Ferdinando Rossi Filone tematico A2
Protezione e riparazione di circuiti nervosi mediante trapianti cellulari in
modelli di patologie neurodegenerative
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Neuroscienze
CONTESTO E RAZIONALE
Il progetto di ricerca si inserisce in una serie di studi concernenti l’analisi delle capacità del
sistema nervoso centrale (SNC) adulto affetto da lesione o neurodegenerazione di sostituire
gli elementi cellulari danneggiati riattivando segnali neurogenici capaci di guidare la
riparazione del danno attraverso la differenziazione di cellule progenitrici multipotenti.
METODI E RISULTATI
E’ stato utilizzato come modello di studio il cervelletto di topi mutanti pcd (Purkinje cell
degeneration) poiché offrono un esempio particolarmente adatto di neurodegenerazione in cui
viene a mancare selettivamente uno specifico tipo cellulare mentre rimangono preservati tutti
gli altri elementi che costituiscono il circuito cerebellare. In questi animali mutanti tutte le
cellule di Purkinje muoiono dopo la fine dello sviluppo. Al fine di studiare se l’ambiente
tessutale del cervelletto affetto da degenerazione fenotipo-specifica sia in grado di fornire i
segnali necessari per promuovere la sostituzione dei neuroni mancanti, abbiamo trapiantato
nel cervelletto di topi mutanti pcd e di topi wild-type (come controllo), una sospensione di
cellule progenitrici multipotenti di tipo cerebellare embrionale che sono in grado di dare
origine a tutti i fenotipi cellulari cerebellari. Queste cellule multipotenti sono state ottenute da
topi transgenici che sovraesprimono la green fluorescent protein (GFP) sotto il promotore
della beta-actina, consentendo l’identificazione delle cellule trapiantate e della loro progenie
nel tessuto ospite grazie alla fluorescenza verde.
La popolazione di progenitori è stata iniettata nel parenchima cerebellare sotto forma di
sospensione cellulare, anziché di frammento di tessuto, affinché ciascuna cellula progenitrice
fosse individualmente esposta ai segnali presenti nell’ambiente tessutale ricevente. Gli
animali riceventi sono stati sacrificati da 3 a 6 settimane dopo il trapianto, un tempo
sufficiente perché le cellule progenitrici trapiantate potessero terminare il loro
differenziamento nei diversi fenotipi cellulari che sono stati identificati mediante criteri
morfologici e per l’immunoreattività per marcatori molecolari specifici. Abbiamo osservato
che il tessuto cerebellare adulto, sia wild-type che mutante, è permissivo per lo sviluppo dei
progenitori cerebellari embrionali e fornisce i segnali necessari per la generazione dell’intero
repertorio di fenotipi cerebellari. Tuttavia, a differenza di quanto precedentemente osservato
in analoghi trapianti di progenitori cerebellari in animali riceventi in età embrionale, nel
tessuto ricevente adulto non si ottiene la corretta integrazione citoarchitettonica dei diversi
fenotipi neuronali. Inoltre, analizzando la distribuzione dei differenti fenotipi nel tessuto
ospite, abbiamo osservato che ogni tipo neuronale derivato dalle cellule progenitrici
trapiantate manifesta una specifica localizzazione nella corteccia cerebellare dell’animale
ricevente e che tale localizzazione è identica sia nel mutante che nel wild-type suggerendo la
presenza di segnali ambientali capaci di influenzare la migrazione dei diversi tipi di neuroni
generati.
442

Abbiamo quindi valutato le eventuali differenze quantitative nel repertorio di fenotipi
generato nei cervelletti mutanti e wild-type e in questo caso i risultati hanno evidenziato una
marcata differenza indicando che i segnali ambientali presenti nel cervelletto adulto possono
essere modulati in seguito a degenerazione di una specifica popolazione neuronale. Nei topi
pcd la perdita delle cellule di Purkinje induce, con un apparente fenomeno di compensazione,
un cambiamento nel rapporto tra i diversi fenotipi generati in favore del tipo cellulare
mancante. La percentuale di cellule di Purkinje originate dal trapianto nel pcd è dell’84%
contro un 56% nel controllo e tale aumento si verifica a scapito degli altri fenotipi che nel pcd
subiscono una diminuzione significativa. Abbiamo cercato dunque di indagare la natura di
tale fenomeno per capire se l’incremento nella percentuale di Purkinje dipendesse da
meccanismi induttivi capaci di promuovere la generazione di uno specifico tipo cellulare,
oppure da meccanismi selettivi in cui prevalesse la sopravvivenza e l’integrazione del
fenotipo mancante. Nella prima ipotesi si dovrebbe assumere un incremento della
proliferazione, poiché è noto che la determinazione del fenotipo adulto si verifica durante la
fase “S” dell’ultima divisione mitotica, mentre cellule postmitotiche sono ormai già
specificate. A tal fine utilizzando la marcatura con bromodesossiuridina (BrdU) abbiamo
determinato la frazione proliferante nella popolazione di cellule donatrici, sia prima che dopo
il trapianto ad un mese di distanza da questo. In primo luogo abbiamo misurato il potenziale
proliferativo dei progenitori cerebellari embrionali in situ somministrando Brdu nelle madri
36 ore prima del trapianto e ad 1 mese di distanza da questo abbiamo osservato che il 29,8%
delle cellule trapiantate erano positive per la Brdu. Successivamente per valutare la
percentuale di proliferazione nel tessuto ricevente, in un diverso gruppo di animali abbiamo
somministrato Brdu 36 ore dopo il trapianto. In questo caso ad 1 mese dall’iniezione sia negli
animali di controllo che nei mutanti la percentuale di cellule trapiantate proliferanti diminuiva
drasticamente fino al 5-7%. Al fine dunque di escludere una diluizione della BrdU dovuta ad
eccessiva proliferazione abbiamo ripetuto l’esperimento uccidendo gli animali a tempi brevi
(36 ore dopo il trapianto) ed i dati hanno confermato i risultati ottenuti ad un mese
dimostrando una forte riduzione della proliferazione in seguito a trapianto.
In ultima analisi per poter attribuire tale fenomeno all’esposizione verso i segnali
dell’ambiente ricevente e non ad un eventuale blocco della proliferazione dovuto alla
metodica con cui le cellule sono state dissociate abbiamo messo in coltura le cellule dissociate
ed esposte per 2 ore al trattamento con BrdU. In queste condizioni il 27% delle cellule erano
positive per la BrdU. Queste analisi indicano definitivamente che la dissociazione non ha
effetto inibitorio sull’attività mitotica e che la forte riduzione della proliferazione osservata
dopo trapianto è il risultato delle interazioni che si stabiliscono precocemente tra le cellule
trapiantate e l’ambiente ospite. In conclusione i nostri risultati non confermano nel cervelletto
adulto una riattivazione di segnali induttivi capaci di promuovere la proliferazione del tipo
cellulare mancante ma evidenziano piuttosto la presenza di meccanismi selettivi capaci di
favorire la sopravvivenza di quest’ultimo.
443

Filiberto Rossi Filone tematico A4
I Giovani contro il doping
UISP Comitato Regionale Piemonte
Il Questionario: è stato realizzato in collaborazione con il Dipartimento di Scienze Sociali
dell’Università di Torino, si poneva l’obbiettivo di evidenziare gli interessi di un campione di
studenti di Scuole Medie Superiori in Piemonte e in particolare in ambito sportivo, di
conoscere le scelte e le opinioni di questi nei confronti del doping. La struttura del
questionario prevede quattro sezioni che dovevano essere riempite secondo un criterio
preciso: la prima e l’ultima sezione erano compilabili da tutti, mentre la seconda e la terza
erano state concepite in modo da distinguere gli sportivi che fanno uso di sostanze
farmaceutiche da quelli che non ne fanno uso. Si è inoltre verificata la frequenza dell’uso e
non uso in rapporto al carattere amatoriale o agonistico dello sport praticato.
Il Campione in Esame: gli studenti costituenti il campione scelto per questa inchiesta
frequentano tre Istituti già coinvolti nella prima fase del progetto: I.T.I.S. “Volta” di
Alessandria, I.T.I.S. “Pininfarina” di Moncalieri, Liceo Scientifico “Gramsci” di Ivrea. Sono
studenti di età compresa fra i 15 e i 19 anni di ambedue i sessi. Sono stati compilati 200
questionari, di cui 62 dell’ I.T.I.S. “Volta”, 101 del Liceo “Gramsci” e 37 dell’ I.T.I.S.
“Pininfarina”.
Riguardo ai 62 questionari del “Volta” è emerso che la maggioranza è di sesso maschile, è
intorno ai 17 anni ed è originaria delle province di Alessandria ed Asti. Hanno genitori che
svolgono prevalentemente professioni come: impiegato amministrativo, di servizio, quadri
intermedi o tecnici, imprenditori, artigiani o commercianti. L’estrazione sociale è medio-alta.
Dei 37 studenti del “Pininfarina” emerge che la maggioranza, anche in questo caso di sesso
maschile, ha un’età che va dai 18-19 anni in su ed è originaria esclusivamente della provincia
di Torino. L’estrazione sociale è di livello relativamente più basso, poiché il 34,3% sul totale
ha indicato come professione l’operaio, seguita dal 22,9% impiegato amministrativo e dal
14,3% impiegato di servizio o tecnico.
Fra i tre Istituti indagati, il liceo “Gramsci” è quello che presenta le caratteristiche più
differenti. Dai 101 studenti risulta, infatti, che: la prevalenza è di sesso femminile, in età tra i
16 e i 17 anni, originaria soprattutto della provincia di Torino, cioè Ivrea e limitrofi e
dell’estero europeo ed extraeuropeo. L’estrazione sociale è decisamente alta, infatti le
professioni prevalenti fra i genitori risultano essere: dirigenti e quadri, liberi professionisti,
seguiti da imprenditori, artigiani e commercianti e,infine,da impiegati amministrativi.
Gli Interessi degli Intervistati: gli studenti del liceo “Gramsci” sono quelli che fra i tre
istituti mostrano una maggiore varietà di scelta delle attività extrascolastiche. Molti ,infatti,
forse proprio perché in maggioranza di sesso femminile, hanno segnalato il “ballare e la
discoteca” come interesse principale. Dal momento che, era una risposta multipla, si sono
aggiunte altre attività come “il seguire spettacoli di vario genere” e la lettura, sicuramente
indotta dallo stesso contesto scolastico. Lo sport qui si colloca in quarta posizione con un
30,3% sul totale delle risposte del Gramsci. Al “Volta” e al “Pininfarina” vi è un’incidenza di
interessi prevalentemente sportivi, seguito dall’andare in discoteca. Mentre tale interesse al
Gramsci occupava la prima posizione, qui passa in secondo piano, seguito dalla lettura e lo
spettacolo. E’ importante notare che in tutte e tre le scuole gli sport in assoluto più praticati
444

sono: Calcio, Pallavolo, Nuoto. Gli studenti che non praticano sport sono 93, pari a circa il
48% del campione.
L’Uso di Sostanze nello Sport Agonistico e in quello Amatoriale: dalle analisi statistiche il
totale degli studenti fra le tre scuole che fanno uso di sostanze farmaceutiche (in prevalenza
integratori) è di 21, cioè il 21,2% di coloro che fanno sport. Per ogni singola scuola i risultati
sono:
• 10 studenti per l’ I.T.I.S. “Volta”,
• 8 studenti per l’ I.T.I.S. “Pininfarina”,
• 3 studenti per il Liceo Scientifico “Gramsci”.
sul totale di coloro che praticano sport (99 studenti su 192 che hanno risposto alla domanda
sugli interessi). A prescindere dalla scuola deduciamo che 13 studenti sui 21 fa uso di
sostanze in uno sport agonistico, il 61,9% mentre 8 studenti ne fanno uso in uno attività
amatoriale, il 38,1%, al fine di avere esaurienti prestazioni sportive, per potenziare il fisico e
sentire meno la fatica. Positivamente accogliamo il numero di coloro che danno allo sport un
significato anticompetitivo, di divertimento e di soddisfazione personale senza inganni. Tra
gli sportivi amatoriali abbiamo il 31,3% c.a, mentre il 47,4% c.a svolge un’attività agonistica.
Ancora un’osservazione è degna di essere messa in evidenza: il sesso di coloro che fanno uso
facendo sport vede una prevalenza maschile ,18 studenti sui 192, quindi il 20,7%. Le femmine
sono soltanto 2, cioè l’1,9%.
Le Opinioni degli Intervistati: abbiamo chiesto ai giovani intervistati di proporre un
massimo di cinque iniziative che secondo loro potrebbero essere efficaci contro il doping,
anche alla luce di tutto ciò che hanno imparato durante la prima fase del progetto o che gli è
stato trasmesso da coetanei o, che hanno appreso dalle conferenze e dagli incontri che si sono
svolti nelle tre scuole, in coda alla realizzazione dei loro elaborati. L’indicazione che è
prevalsa maggiormente sulle altre è quella dell’informazione come il mezzo migliore e più
efficace nella lotta contro il doping. In tale contesto la pubblicità televisiva e radiofonica sono
le più citate. Inoltre, gli studenti hanno suggerito anche la creazione di slogan e filmati incisivi
che coinvolgano atleti famosi che nella loro carriera agonistica, hanno fatto uso di sostanze
ma che ne illustrano gli effetti negativi. La suddetta indicazione è accompagnata da una
richiesta di più controlli sia sugli atleti che nei confronti dei medici e dei trainer che li
sostengono e li allenano. E’ stata, poi, giudicata anche valida la proposta di maggiori e più
drastiche sanzioni nei confronti dei trasgressori o divieti della vendita o dell’esportazione dei
prodotti.
L’insegnamento di una cultura anticompetitiva già a una età pre-adolescenziale è stato
soprattutto messo in evidenza dagli allievi del liceo “Gramsci”e Pininfarina”. Gli studenti del
“Volta” hanno voluto anche proporre un maggior dialogo o scambio diretto di informazioni
tra l’atleta e l’allenatore o tra l’atleta e chi ha fatto uso di sostanze dopanti.
445

Stefano Rosso Filone tematico A2
Prevenzione dei tumori cutanei: sviluppo di un test biochimico per
l'individuazione di gruppi ad alto rischio
ASO S. Giovanni Battista
OBIETTIVO
Lo scopo di questo progetto è proprio quello di individuare i metaboliti estratti, e quindi i
metodi di estrazione ed analisi, più idonei per svolgere la funzione di efficiente indicatore di
rischio per i tumori cutanei.
MATERIALI E METODI
Popolazione di riferimento. La presente analisi prende origine da un più ampio studio
internazionale caso-controllo sui tumori cutanei, che ha visto partecipare 14 centri in Europa
ed America Latina (Argentina). L’alto numero di centri si è reso necessario per assicurare un
maggiore varietà fenotipica. Il reclutamento dei casi e dei controlli è stato limitato ai soli
soggetti di sesso maschile (età: 20-75 anni) poiché in un precedente studio pilota vi era una
proporzione di donne con i capelli colorati artificialmente: i processi di colorazione alterano
irrimediabilmente la struttura del pigmento originando risultati analitici spuri. Misura
dell’esposizione e fattori di rischio. Il questionario somministrato ad ogni soggetto intervistato
comprendeva varie sezioni. Il fenotipo è stato determinato con vari indicatori: colore dei
capelli misurato dall’intervistatore confrontando con luce naturale il colore dei capelli del
soggetto rispetto ad un campionario di 11 colori naturali; colore degli occhi misurato
confrontando con luce naturale il loro colore con 10 fotografie di iridi standard; reazione della
cute al sole misurata dividendo in due la tradizionale scala Fitzpatrick. La storia d’esposizione
solare è stata ottenuta investigando l’esperienza passata dei soggetti per attività lavorative e
ricreative. Si sono fatto domande sul tipo d’attività, periodo dell’anno, durata nel corso della
vita ed andamenti stagionali; ed inoltre le abitudini vestiarie durante l’attività. Gli
intervistatori, inoltre, hanno misurato il numero di nei e di quelli di una certa dimensione (>10
mm) presenti su entrambi gli avambracci. Per quanto riguarda invece il conteggio totale sul
corpo e le lentiggini si sono utilizzate delle figure graduate di riferimento fra cui il soggetto
intervistato doveva scegliere. Determinazione biochimica della quantità di melanina. Ogni
campione di capelli è stato esaminato accuratamente su campo opaco scuro e mondato dai
capelli non sufficientemente pigmentati. Le tecniche qui considerate sono la cromatografia
liquida ad alta pressione (HPLC), l’analisi spettrofotometrica nel campo dell’UV e nel campo
vicino all’infrarosso (Near InfraRed – NIR). Per l’analisi HPLC sono stati presi due
sottocampioni che hanno subito due processi di preparazioni indipendenti, in modo da poter
controllare la riproducibilità del metodo in fasi differenti. I campioni di capelli sono stati
sospesi in NaOH 1N (1,5 ml) con H2O2 (30% 0.1 ml) 2°C. Il residuo H2O2 è stato
decomposto conin provetta per 24 ore a 20 l’aggiunta di 0.2 ml di of Na2S2O5 al 5% e poi
la soluzione acidificata a pH 4 con 6M di H3PO4 centrifugata a 12,000 giri/min per 15min. Il
supernatante è stato filtrato e poi iniettato nella colonna HPLC. Con questa procedura di
ossidazione con H2O2 in ambiente alcalino [Napolitano, 1995] si ottiene in maniera più
efficiente il metabolita d’interesse che è l’acido 2.3.5 pirrol-carbossilico (PTCA) rispetto alla
procedura con permanganato di potassio [Ito, 1985]. Per quanto riguarda invece l’analisi
spettrofotometrica ad UV, i capelli sono stai solubilizzati in una soluzione di 1ml di Soluene-
350 in acqua (9:1), mantenuta per 3 ore in provetta ed agitato alla temperatura di 80° C. Lo
spettro d’assorbimento del supernantante con luce UV è stato valutato a 500 nm (A500) per
446

misurare la quantità totale di melanine, ed a 650nm (A650) per valutare la quantità della sola
eumelanina. Il rapporto A650/A500 può quindi rappresentare una misura indiretta della
quantità di pigmento non eumelanico. La procedura per effettuare la spettroscopia
all’infrarosso (NIR) è invece più veloce e non comporta la degradazione distruttiva del
materiale, tuttavia essa è una misura indiretta che necessità di un procedimento di calibrazione
contro uno standard sicuro. Tale calibrazione è stata realizzata in precedenza dallo stesso
gruppo di ricerca [Zoccola, 2004] ed ha fornito buoni risultati. Si tratta quindi, in questo
studio, di verificarne la potenzialità come indicatore di rischio rispetto al PTCA.
RISULTATI
Sono risultati disponibili per l’analisi 98 coppie di casi e controlli poiché per 2 casi ed 1
controllo non si disponeva di una sufficiente quantità di capelli pigmentati. La riproducibilità
delle determinazione PTCA-HPLC era molto elevata con un coefficiente di correlazione
intraclasse di 0.99 fra le due preparazioni indipendenti e di 0.98 fra le iniezioni in colonne
separate. L’effetto più elevato è stato osservato per valori di PTCA fra 50 e 100 ng/mg, con
limiti di credibilità più ristretti per i valori fra 75 e 100 ng/mg. L’effetto del controllo per le
altre variabili di fenotipo è importante e riduce l’associazione di circa la metà (OR
standardizzato: 3.2 – CI95% 1.44-13.20). Al valore soglia di 85 ng/mg l’associazione di
PTCA e rischio raggiunge il valore massimo, mantenendo ancora un effetto separato ed
indipendente dal colore dei capelli rilevato dagli intervistatori (OR standardizzato: 4.4 –
CI95% 1.52-15.54). I valori di assorbimento A650/A500, che rappresentano la quantità
relativa di eumelanina sul totale, sono state sottoposte ad analoga analisi (Tabella 5). La
soglia di massimizzazione del rischio è stata individuata per valori inferiori di 0.35, tuttavia
non statisticamente significativa. La spettroscopia NIR, considerato un metodo meno preciso
ma più rapido ed economico per la determinazione della melanina, è stata valutata al
medesimo valore di soglia di 85 ng/mg. Dopo correzione per la misclassificazione l’OR
grezzo è aumentato a 3.4, mentre quello controllato per gli altri fattori di rischio è risultato di
2.5 con intervallo di credibilità al 95% da 1.36 a 4.22.
CONCLUSIONI
1. L’effetto indipendente del metabolica PTCA misurato con metodica HPLC rispetto alle
altre variabili misurate con metodiche epidemiologiche tradizionali (questionario,
intervista, rilevazione oggettiva);
2. la soglia di massimizzazione di tale effetto (85 ng/mg) che ha portato ad un aumento di 4
volte rispetto al rischio di base, anche dopo correzione per variabili di confondimento;
3. la sostanziale irrilevanza del metodo di determinazione spettrofotometrica ad UV per la
determinazione di altri metabolici feo-melanici;
4. la possibilità di utilizzare la spettroscopia NIR con alta (anche se non perfetta)
concordanza di risultati;
5. la possibilità di utilizzo in campo di ricerca per studi con larga base di popolazione;
6. la possibilità di utilizzo per l’individuazione di soggetti ad elevato rischio su cui
indirizzare iniziative di prevenzione primaria e diagnosi precoce.
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Giuseppe Ru Filone tematico D1
Stima di denominatori della popolazione canina su un area pilota:
aggiustamento dei dati di anagrafe a fini sanitari
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta
CONTESTO E RAZIONALE
L’applicazione di metodi epidemiologici in campo animale si scontra con la difficoltà di
disporre dei necessari denominatori. Con l’avvio di un Registro Tumori del Cane in Piemonte
nel 2001, furono messe in evidenza le carenze del sistema di identificazione canino: i cani
tatuati risultavano pari al 79,3% e tra quelli iscritti solo il 44,4% risultava essere ancora in
vita. Con il presente studio si intendeva definire una metodologia per la stima di denominatori
relativi alla popolazione canina. In particolare, si voleva validare le stime campionarie relative
alla popolazione canina di un’area del torinese ottenute grazie ad un precedente progetto
regionale.
MATERIALI E METODI
La verifica dei denominatori.
Sulla scorta dell’entrata in vigore della legge regionale 18/2004, è stato deciso di condurre un
censimento capillare della popolazione canina. Grazie ad una lettera indirizzata ai sindaci,
sono stati coinvolti tutti i 108 comuni dell’ASL 9. Nella lettera si invitava a predisporre un
censimento straordinario dei cani attraverso l’utilizzo di un questionario prodotto e messo a
disposizione dagli autori del presente studio. Il questionario richiedeva informazioni relative
a: possesso di cani, codice fiscale del proprietario, nome dei cani, sesso, razza, anno di
nascita, numero tatuaggio, sua leggibilità. Nei comuni disponibili a collaborare, una copia del
questionario è stata inviata a ciascun capo famiglia residente. E’ stata quindi avviata una
campagna di sensibilizzazione della popolazione attraverso un comunicato stampa. Sono stati
organizzati due incontri (20 e 21 ottobre 2004) con i messi comunali durante i quali sono stati
presentati le novità riguardo all’anagrafe canina e il questionario per il censimento. Un
incontro con finalità analoghe era stato organizzato con i veterinari liberi professionisti (LP)
operanti sul territorio (15 ottobre 2004). In tutti gli incontri è stata ricordata l’importanza
sanitaria dell’anagrafe canina portando l’esempio del Registro Tumori del Cane. La
restituzione dei dati aggregati da parte dei comuni è stata sollecitata attraverso ripetuti contatti
telefonici con i funzionari direttamente coinvolti. I comuni sono stati invitati a conservare
copia cartacea dei questionari per una successiva determinazione della struttura della
popolazione censita. Inoltre, la maggior parte dei comuni coinvolti è stata messa nella
condizione di disporre dell’elenco dei non rispondenti per consentire successivi accertamenti
mirati. Il dato censuale ottenuto è stato confrontato con quello ottenuto con metodo di cattura-
ricattura nell’ambito del precedente progetto regionale. In esso erano state eseguite due
indagini campionarie: la prima per verificare la proporzione di capi iscritti in anagrafe e che
risultavano ancora in vita, la seconda per stimare la proporzione di cani tatuati e quella di cani
sotto assistenza veterinaria. Anche per i comuni non partecipanti al censimento con
questionario, si è operata una stima della popolazione canina sulla base del metodo di catturaricattura.
Registrazione tumorale.
448

Per individuare tutti i casi di tumore diagnosticati è stata proseguita l’attività di registrazione
avviata fin dal 2001 e già descritta nelle relazioni relative al precedente progetto regionale. In
breve, presso la sede ASR 9 di Ivrea è stato istituito un punto di raccolta dei casi sospetti
prelevati dai LP. Dopo l’opportuna preparazione dei campioni da parte dell’IZS di Torino, per
la diagnosi istologica fornita gratuitamente ci si è avvalsi dell’Università Veterinaria di
Milano. Tutte le neoplasie registrate dispongono di diagnosi istologica (classificazione
WHO). Per gli eventuali tumori diagnosticati al di fuori del registro, è stata richiesta la loro
segnalazione da parte dei LP e sono stati consultati gli archivi dei laboratori diagnostici
operanti sul territorio. I dati ottenuti sono serviti al calcolo dei tassi di incidenza riferiti al
periodo dal 01/07/2001 e fino al 31/05/05 (47 mesi di osservazione).
RISULTATI
Relativamente al censimento, 78 (72,2%) dei 108 comuni dell’ASL 9 hanno utilizzato il
questionario proposto inviandone 50’664 copie e ottenendone indietro 34’421 (67,9%). Dei
46 comuni che costituiscono l’area coperta dal registro, 44 (95,7%) hanno aderito, e dei
28’068 questionari inviati ne sono stati ottenuti indietro 17’833 (63,5%). Al rilevamento
censuale non hanno aderito la città di Ivrea e il comune di Ribordone, piccolo comune con
soli 84 abitanti residenti. I dati in possesso del comune di Ivrea non sono stati utilizzati perchè
poco plausibili. Infatti grazie ad una precedente attività di registrazione (1998-2004) mai
validata, risulterebbero presenti attualmente 1048 soggetti e di questi solo 26 sarebbero morti
o trasferiti lungo il periodo. A fronte di ciò, dopo l’approvazione della legge, il microchip
identificativo è stato inserito a 886 soggetti. Nei 44 comuni partecipanti sono risultati presenti
al censimento complessivamente 9’987 cani. La stima della popolazione canina sugli stessi
comuni ottenuta con metodo di cattura-ricattura è pari a 9’027 unità (intervallo di confidenza
(IC) al 95%: 8’671-9’382). Assumendo che la quota dei non rispondenti al censimento
corrisponda alle famiglie che effettivamente non posseggono cani, lo scarto derivante dal
metodo campionario rispetto al dato censuale sarebbe pari a -9,6% (-6,1% tenendo conto del
limite superiore dell’IC95%). La popolazione canina stimata con il metodo di cattura-ricattura
di Ivrea ammonterebbe invece a 1’502 unità (IC95% 1’374-1’630). In questo caso l’eventuale
scarto non è determinabile. Dato il moderato scarto tra le stime, per il calcolo del tasso di
incidenza ci si è basati su: 1) somma (11’489) tra la popolazione censuale dei 44 comuni e la
stima campionaria relativa ad Ivrea, ridotta poi a 10’450, per tener conto dei cani osservabili
dai veterinari (91%); 2) periodo di osservazione (47 mesi). Il tasso grezzo dei tumori maligni
è risultato pari a 686.6 per 100’000 anni-cane, molto più elevato nelle femmine rispetto ai
maschi (946,4 vs. 445,7) e nei cani di razza rispetto agli incroci (997,3 vs. 780,1).
CONCLUSIONI
Con questo studio è stata censita la popolazione canina di un’area definita. Tale risultato è
servito a valutare l’efficacia di una stima precedentemente ottenuta su base campionaria.
Inoltre è stato possibile ottenere stime di incidenza tumorale per una popolazione canina
definita. Nonostante l’entità dello scarto tra le stime di popolazione ottenute e i potenziali
errori sistematici, i risultati raggiunti ribadiscono l’opportunità di utilizzo, la maggior
efficienza in termini di risorse e l’applicabilità sul campo dei metodi epidemiologico-statistici
in ambito di sanità pubblica e animale.
449

Roberto Russo Filone tematico C2
Criteri di appropriatezza di prestazioni ambulatoriali utili a definire
contratti tra ASL e strutture accreditate
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica
OBIETTIVO
Definire una metodologia di costruzione di criteri di appropriatezza per alcune prestazioni
ambulatoriali erogate dall' Asl 1di Torino.
METODOLOGIA
La base dati è costituita dalla mobilità passiva delle prestazioni ASL 1 di Torino - anno 2003.
L'analisi è stata effettuata con il software di analisi statistica SAS System per individuare sia
le branche specialistiche di interesse sia le relative singole prestazioni o gruppi di prestazioni
in base a criteri di frequenza e costo, escludendo i codici branca 98 laboratorio e 99 altre
prestazioni in quanto comprendono una miscellanea di prestazioni non pertinenti con
l'obiettivo. Più precisamente si sono scelte le prime 5 branche per ogni criterio e per ognuna si
è ricercata la distribuzione della tipologia delle prestazioni sempre secondo i criteri di
ftequenza e costo. Quindi si è proceduto con la selezione delle prime tre prestazioni sempre
secondo i criteri. Si sono costituiti dei gruppi di lavoro per ogni branca specialistica sulla base
delle risorse presenti nell'Azienda.
RISULTATI
Dall'analisi della base dati è risultato un n. totale prestazioni di 585.637 pari al 21,89% del
totale delle prestazioni effettuate. L'importo totale del costo delle prestazioni erogate è stato di
euro 23.179.685,58. In Tabella 1 si riportano le branche selezionate, precisando che si sono
escluse la 70 radioterapia in quanto in Asl non sono disponibili dei medici specialisti in
radioterapia e la 29 nefrologia poiché appare difficile indagare la relativa prestazione. La
Tabella 2 mostra le prestazioni di cardiologia, oculistica e radiologia oggetto di analisi dai
gruppi di lavoro aziendali. Essi non hanno ritenuto di potersi esprimere in maniera univoca
circa la definzione di criteri per l'appropriatezza delle prestazioni ambulatoriali discusse,
suggerendo solamente la possibilità di definire un tetto massimo annuo di prestazioni da
erogare per ciascuna struttura accreditata.
Tabella 1: selezione dei codici branca in base frequenza e costo- anno 2003
Codice branca N % sul totale delle
prestazioni
costo in euro
69 diagnostica per
immagini radiologia
diagnostica
130.947 22.36 7.335.453
08 cardiologia 28.059 4.79 917.508,7
34 oculistica 23.213 3.96
450

Tabella 2: selezione delle prestazioni per branca su cui indagare i criteri di appropriatezza.
BRANCA
08-
CARDIOLOGIA
34 -
OCULISTICA
69 -
RADIOLOGIA
CODICE
prestazione
88.72.3
NOME prestazione N
ecocolordopplergrafia
cardiaca
451
PERCENTUALE
sul totale branca
COSTO
in euro
4.841 17,25 330.430,6
88.72.1 ecocardiografia 2.932 10,45 151.437,8
95.02
Esame complessivo
dell' occhio-visita oculistica,
esame dell'occhio
comprendente tutti gli aspetti
del sistema visivo.
12.588 54,23 235.631,9
88.76.1 Ecografia addome completo 10.659 8,14 650.108,2
87.24
Radiografia della colonna
lombo-sacrale
6.037 4.61 107.104,3

Giuseppe Saglio Filone tematico C1
Ricerca di marcatore molecolare per l’identificazione di pazienti affetti da
Policitemia Vera e Trombocitemia Essenziale.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche
La policitemia vera (PV) e la trombocitemia essenziale (TE) sono disordini mieloproliferativi
cronici che si presentano rispettivamente con un valore elevato di ematocrito e emoglobina o
di piastrine. Tale forme sono spesso difficilmente distinguibili dalle poliglobulie e piastrinosi
secondarie. Diversi dati della letteratura riportano l’iperespressione di PRV-1(Polycythemia
Vera Rubra 1 gene) nei granulociti di pazienti affetti da policitemia vera rispetto ai pazienti
con poliglobulia secondaria. L’espressione di PRV-1 sembrerebbe pertanto in grado di
distinguere le forme di poliglobulia secondaria dalle forme mieloproliferative quali
policitemia vera. (PV). Tuttavia l’esatta percentuale di pazienti che si presentano con
l’iperespressione di PRV-1 non è attualmente ben definita e i dati della letteratura su questo
punto sono discordanti. Inoltre non è ancora dimostrato se il gene PRV-1 è iperespresso nelle
trombocitemie essenziali.
METODI E RISULTATI
Per stabilire il ruolo dell’espressione di PRV-1 quale marcatore molecolare in grado di
differenziare le forme primitive di pocilitemia e trombocitemia dalle forme reattive abbiamo
valutato quantitativamente l’espressione del gene PRV-1 in 119 campioni di sangue
periferico separati mediante gradiente di ficoll [34 PV, 12 eritrocitosi secondaria (ES), 32 TE
e 16 trombocitosi secondaria (TS)].
Inoltre abbiamo testato l’espressione di PRV-1 in 25 campioni di sangue periferico ottenuti
da volontari sani. I valori di espressione di PRV-1 sono stati stabiliti utilizzando la tecnica di
Real Time PCR quantitativa utilizzando un set di primers e probe specifici (Assays-on-
Demand, Gene Expression Products , Applied Byosystems, Forster City, CA, USA). I valori
ottenuti sono stati normalizzati utilizzando ABL come gene di controllo. I campioni normali
esprimono una quantità di trascritto quasi costante (valore medio di 2 delta delta ct = 13,8). I
livelli di trascritto di PRV-1 nei pazienti con policitemie e trombocitemie secondarie non
sono significativamente diversi rispetto a quelli di soggetti sani. Il valore medio di 2 delta
deltact è 15 nelle ES e 12,7 nelle TS mentre nei pazienti normali è 13,8 (p=0,4 e p=0,45). Al
contrario nei campioni di pazienti affetti da PV i livelli di trascritto di PRV-1 sono elevati
(valore medio di 2 delta delta è 5727 range: 184-40342). La differenza è molto significativa
rispetto ai controlli normali (p=0,005) e alle eritrocitosi secondarie (p=0,006). Risultati simili
sono stati ottenuti analizzando i campioni dei pazienti con TE: il valore medio di 2 delta delta
ct è 2680 (range: 512-7761). Anche per i pazienti con TE la differenza di espressione è molto
significativa rispetto ai controlli normali (p=4-7)e alle ST(p=5,2–7).
Questi dati dimostrano chiaramente che PRV-1 è un utile marcatore per differenziare le forme
primitive clonali di policitemia e trombocitosi dalle forme secondarie. Inoltre, i dati presenti
in letteratura derivano dall’analisi eseguita su granulociti separati mediante sorting. I nostri
dati permettono di stabilire che è possibile eseguire l’analisi su campioni di sangue periferico
in toto e pertanto d semplificare l’analisi riducendo i costi e il tempo necessario senza perdere
la significatività dell’analisi stessa.
452

PUBBLICAZIONI
Cilloni D, Carturan s, Gottardi , Messa F, Fava M, Defilippi I, Arruga F, Saglio G.
Usefulness of the quantitative assessment of PRV-1 gene expression for the diagnosis of
polycythemia vera and essential thrombocythemia patients. Blood: 2004; 103-2028-2429.
453

Mauro Salizzoni Filone tematico C1
Valutazione del reflusso gastroesofageo non acido mediante
impedenziometria intraluminale esofago-gastrica
ASO S. Giovanni Battista – Struttura Complessa Chirurgia Generale 8
Centro Trapianto di Fegato
Sono stati finora arruolati nello studio 6 pazienti (considerata l'acquisizione completa
dell'apparecchiatura nel mese di agosto/settembre 2005). Si trattava in tutti i casi di pazienti
con sintomi tipici di malattia da reflusso gastro-esofageo. In 1 caso si associavano anche crisi
di dolore toracico ed in 1 altro caso sintomi della sfera ORL. In tutti i casi gli studi
endoscopico, manometrico e pH-metrico classico non avevano permesso di stabilire con
certezza la presenza o meno di una malattia da reflusso gastro-esofageo. Lo studio esofageo
delle 24 ore con pH-impedenziometro Sleuth ha consentito di definire la diagnosi di malattia
del reflusso gastro-esofageo e di stabilire una correlazione con i sintomi in 2 casi, mentre ha
permesso di escludere la patologia negli altri 4 casi. In particolare, per i 2 casi con diagnosi
positiva un paziente è ora in lista d'attesa per intervento chirurgico di plastica anti-reflusso,
mentre l'altro paziente in cui concomita una patologia cardiaca coronarica prosegue con la
terapia medica.Per i 4 casi con diagnosi negativa, tre pazienti sono stati del tutto rassicurati
sulla origine non esofagea dei loro sintomi, mentre un paziente con pH-metria ai limiti di
norma prosegue con cicli di terapia antiacida.
I risultati finora ottenuti sono, a nostro avviso, assai incoraggianti.La pH-impedenziometria
esofagea delle 24 ore si dimostra essere realmente uno strumento diagnostico prezioso, capace
di aiutare nella definizione della diagnosi da reflusso gastro-esofageo nei casi più complessi.
454

Bruna Santini Filone tematico B3
Gli acidi grassi strutturali nella dieta dei bambini in età scolare:
valutazione qualitativa e quantitativa dell’apporto
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze pediatriche e dell’Adolescenza
OBIETTIVI
I fondi asseganti sono stati utilizzati per:
1. Il prelievo dei campioni presso i centri di cottura e la loro preparazione per le successive
analisi (congelamento, liofilizzazione e determinazione della sostanza secca). ·
2. La determinazione della composizione chimica centesimale e del profilo acidico di tutti
gli alimenti di origine animale inseriti nella refezione scolastica primaverile ed invernale. ·
3. La preparazione di questionari alimentari "ad hoc" elaborati sulla base di un questionario
valicato.
4. La distribuzione ed illustrazione dei questionari alle classi elementari e medie scelte a
campione nella città di Torino come specificato dal progetto di ricerca. ·
5. La messa a punto del software per analizzare i dati ottenuti dai questionari e formulare la
composizione in macro e micronutrienti delle diete degli studenti torinesi. ·
6. Il confronto di tali apporti con i fabbisogni stabiliti dai livelli di assunzione raccomandata
dei nutrienti (LARN).
RISULTATI
Al momento sono stati raccolti 450 questionari di cui 386 sono risultati correttamente
compilati, mentre il numero minimo utile per ottenere dati attendibili dal punto di vista
statistico è di 600 questionari come è stato ampiamente specificato nel progetto iniziale.
Dall'analisi dei questionari raccolti si possono trarre le seguenti considerazioni:
• Sono stati raccolti 386 questionari validi di cui 181 dai bambini delle scuole elementari
(89M/92F) e 205 dai bambini delle scuole medie (102M/103F).
• L'apporto calorico complessivo risulta essere di 1808 kcal per i bambini delle scole
elementari e di 2079 per quelli della scuola media, entrambi entro i limiti di riferimento
indicati dai LARN; la quota proteica e di 1,78 g/kg (15% delle kcal totali) e di 1.94 g/kg
(16% delle kcal totali) mentre l’apporto di fibra risulta essere di 12.3 e 15.2 g al giorno
rispettivamente per i bambini della scuola elementare e media. Tutti i valori sopra riportati
così come la quota di carboidrati risultano adeguati per l’età.
• L’apporto lipidico complessivo (circa 30% delle kcal totali) risulta corretto con una quota
di acidi grassi saturi di 9.95% e di 10.4% delle kcal totali, rispettivamente per i bambini
della scuola elementare e media, adeguata in tutte le fasce di età; l’apporto di acidi grassi
polinsaturi rappresenta il 6% delle kcal totali sia per la scuola media che per la scuola
elementare. Considerando che il livello raccomandato di assunzione giornaliera per il
colesterolo è di 100 mg/1000 kcal, i valori del nostro campione risultano lievemente
superiori ai fabbisogni, soprattutto nei ragazzi della scuola media.
455

• L’apporto di calcio e di ferro è invece largamente insufficiente; per il calcio questo
corrisponde mediamente a 736 mg/die contro i 1200 mg/die indicati dai LARN. L’apporto
medio di ferro secondo i LARN deve essere di 12 mg/die per gli adolescenti e di 18
mg/die per le adolescenti in età fertile, mentre l’apporto da noi valutato è intorno ai 7.9
mg/die. In merito allo scarso apporto di calcio e ferro a fronte di un corrto apporto di acidi
grassi saturi, si può dedurre che questi ultimi non derivano integralmente da alimenti di
origine animale ma soprattutto da prodotti di pasticeria e snack, abitudine questa molto
diffusa tra i ragazzi delle fasce di età studiate.
I prodotti di origine animale che vengono impiegati nella refezione scolastica invernale e
primaverile hanno presentato dei profili acidici che rientrano ampiamente nei range riportati
dalla bibliografia scientifica, ma risultano estremamente variabili in funzione del tipo di
prodotto analizzato (uova, pesci, carni bianche e rosse, latticini, ecc.) e, nell’ambito dello
stesso prodotto, in funzione dell’epoca di produzione con differenze anche sensibili tra menu
invernale e primaverile. Per quanto riguarda gli acidi grassi strutturali (CLA, EPA, DHA, altri
PUFA), è emerso dall’esame dei 34 profili acidici del menù primaverile e dei 70 del menù
invernale, che alcuni prodotti (pesci, uova, carni di pollo) sono risultati completamente privi
di acido linoleico coniugato (CLA), mentre i più ricchi di CLA sono risultati alcuni formaggi
e le carni di bovino, solitamente demonizzati per il loro contenuto lipidico; inferiore è risultata
la presenza di CLA nella carne di tacchino. Tra i pesci esaminati sono risultati particolarmente
ricchi di EPA e DHA il merluzzo e la platessa, quest’ultima ha peraltro presentato un profilo
acidico differente nei due menù a causa di ben note variazioni stagionali di alcuni prodotti
della pesca. Tra gli acidi grassi essenziali il linoleico e il linolenico sono risultati presenti in
proporzioni estremamente variabili nei vari alimenti analizzati. L’acido linoleico è risultato
presente in maggior percentuale nei prodotti avicoli (pollo e tacchino), mentre entrambi gli
acidi sono risultati abbondanti, per la probabile aggiunta di oli vegetali, in alcuni semilavorati
(medaglione, carne tritata).
Qualora questi dati fossero confermati dalle più costose analisi quantitative, porterebbero a
proporre un incremento ad esempio delle porzioni di formaggio e di pesce nei menu scolastici,
al fine di garantire la copertura del fabbisogno medio giornaliero di questi acid grassi
strutturali nei ragazzi in età scolare anche in presenza di un introito insufficiente derivante
dall’alimentazione extrascolastica. Disporre di tali dati permetterà di valutare, anche con
l'ausilio dei dati nutrizionali ottenuti dai questionari alimentari, il grado di protezione
assicurato da un alimentazione corretta ai nostri ragazzi ed eventualmente di poter suggerire
alternative utili in questo senso.
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Claudio Santoro Filone tematico A2
Identificazione e clonaggio di nuovi auto-antigeni associati al diabete
mellito di tipo1 (T1DM)
Università “A. Avogadro” del Piemonte Orientale
Dipartimento di Scienze Mediche
CONTESTO E RAZIONALE
Il diabete di tipo 1 (T1DM) è una malattia auto-immune degenerativa organo-specifica
caratterizzata dalla progressiva distruzione delle cellule pancreatiche ß delle isole di
Langherans ad opera di linfociti T citotossici (CTL) CD4+ e/o CD8+. Inoltre, la maggior
parte dei pazienti T1DM hanno auto-anticorpi circolanti diretti contro antigeni quali insulina
(I), glutammico-decarbossilasi acida (GAD) e tiroxina-fosfatasi (IA-2), il cui coinvolgimento
nell’insorgenza e/o mantenimento della malattia è ancora dibattuto. Diversi studi dimostrano
che la comparsa di picchi di auto-anticorpi all’età di 2-5 anni in soggetti pre-diabetici, è
significativamente associata ad una rapida progressione della malattia. Tuttavia, la maggior
parte dei soggetti a rischio di T1DM non mostra picchi di auto-anticorpi nel periodo prediabetico
e, inoltre, un significativo numero di individui con auto-anticorpi non sviluppa
T1DM. Questa variabilità sierologica suggerisce che, almeno in una parte di questi individui,
la risposta auto-immunitaria possa essere diretta contro antigeni ancora ignoti e che la loro
identificazione possa largamente dipendere dalla strategia con cui vengono ricercati. Inoltre,
numerose indagini suggeriscono che le cellule apoptotiche rappresentano una importante
fonte di autoantigeni la cui insufficiente clearance può contribuire allo sviluppo di reazioni
autoimmunitarie. Poiché la ricerca di auto-anticorpi è uno dei criteri per diagnosticare il
T1DM e per identificare i soggetti a rischio, l’identificazione di altri antigeni associati al
T1DM consentirebbe di seguire la progressione della risposta auto-immune in soggetti a
rischio di T1DM e di configurare strategie terapeutiche basate sull’induzione della tolleranza
verso quegli antigeni che iniziano e/o perpetuano la risposta autoimmune.
METODI E RISULTATI
Le due strategie che noi abbiamo seguito in questa direzione consistono:
• nel clonaggio dei repertori anticorpali di individui affetti da T1DM mediante la tecnologia
del “phage antibody dispaly”;
• nella costruzione di un nuovo sistema di espressione che consente il clonaggio di antigeni
(”phage antigen display”).
Mediante il “phage antibody display” abbiamo costruito delle genoteche anticorpali da
pazienti T1DM di nuova diagnosi e dai loro genitori. L’analisi di queste genoteche ha
consentito di clonare scFv diretti contro gli auto-antigeni insulari I, GAD e IA2. Alcuni di
queste specificità anticorpali sono state testate per il loro utilizzo nella diagnosi
immunoistochimica di T1DM in collaborazione con l’Unità di Anatomia Patologica
dell’Ospedale Maggiore di Novara Stiamo valutando la possibilità di brevettare questi nuovi
reagenti diagnostici. A questo scopo, abbiamo messo a punto dei test in vitro (dot blots) per
verificare l’utilizzo dei scFvs clonati come anticorpi specifici.
457

Inoltre, in virtù delle recenti indicazioni di associazione tra antigeni esposti da cellule
apoptotiche e malattie auto-immuni, abbiamo analizzato le nostre genoteche con una serie di
antigeni fosfolipidici e abbiamo clonato scFv diretti contro la cardiolipina ossidata, un
antigene criptico esposto da cellule apoptotiche.
PUBBLICAZIONI
1. Secco P, Ferretti M, Gioia D, Cesaro P, Bozzo C, Marks JD, Santoro C. Characterization
of a single-chain intrabody directed against the human receptor tyrosine kinase Ron.. J
Immunol Methods. 2004 Feb;285(1):99-109.
2. Secco P, Cotella D, Santoro C. Selection of peptides with affinity for the N-terminal
domain of GATA-1: Identification of a potential interacting protein. Biochem Biophys
Res Commun. 2003 Jun 13;305(4):1061-6.
3. Zacchi, P., D. Sblattero, F. Florian, R. Marzari, and A. R. Bradbury.. Selecting open
reading frames from DNA. Genome Res 200313:980.
4. Sblattero, D., F. Florian, T. Not, A. Ventura, R. Troncone, S. Auricchio, and R. Marzari. .
The gut as site of production of autoimmune antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004
39 Suppl 3:S730.
5. Pavlik, P., R. W. Siegel, R. Marzari, D. Sblattero, V. Verzillo, C. Collins, J. D. Marks,
and A. Bradbury.. Predicting antigenic peptides suitable for the selection of phage
antibodies. Hum Antibodies 200312:99.
458

Alberto Sartoris Filone tematico A2
Infezione e stati carenziali quali fattori predisponenti l'insorgenza della
malattia degenerativa e neoplastica ORL
ASO S. Giovanni Battista
MATERIALI E METODI
Lo studio è partito dall’evidenza crescente che infezioni sia batteriche sia virali costituiscono
un fattore predisponente all’insorgenza della patologia ischemica e degenerativa. Numerose
segnalazioni bibliografiche concordano nell’affermare che i fattori patogenetici coinvolti sono
l’aumento dell’aggregazione piastrinica, l’aumentata espressione della selectina e delle
molecole di adesione delle cellule endoteliali con diapedesi dei neurtofili attivati e contestuale
innalzamento dei valori del fibrinogeno e delle citochine pro – infiammatorie. Tali fattori
alterano il microcircolo favorendo il danno ischemico e agevolando la crescita delle cellule
tumorali dotate di metabolismo anaerobio. Sono stati, pertanto, indagati parametri
ematochimici e sierologici di pazienti affetti da ipoacusia improvvisa, poliposi nasale,
neoplasie maligne ed in particolare gli indici di flogosi specifici, aspecifici, i parametri
coagulativi, gli indici del metabolismo dei glicidi, dei lipidi e del calcio ed infine della
funzionalità renale, tiroidea ed epatica. Sono stati valutati inoltre i test per la ricerca di
anticorpi anti CMV, HSV – 1, HSV- 2, HSV – 6, HP, Clamidia e HB.
RISULTATI
Carcinoma della laringe. Sono stati esaminati 33 pazienti con Ca della laringe. Il 73% sono
risultati positivi al test per la infezione da H pylori, contro il 50% dei controlli della stessa età
(p significativo 0.01). In particolare ben il 50% aveva una infezione da ceppi citotossici Cag-
A positivi, mentre solo il 17% dei controlli presenta una infezione da parte di questo ceppo
patogeno, fortemente pro - infiammatorio (p 0.0001). I ceppi patogeni Cag-A positivi
producono una citotossina, una proteina che viene secreta e può raggiungere anche organi
lontano dal sito di produzione della tossina stessa.
La citossina Cag-A viene introdotta all’interno delle cellule epiteliali da una pompa
molecolare codificata dai geni dell’isola di patogenicità del batterio. La Cag-A induce
secrezione di interleuchina 8, la quale è fortemente pro - angiogenica; attiva il proto-oncogene
Met, il recettore di membrana per l’Hepatocyte Growth Factor; incrementa fortemente
l‘enzima cicloossigenasi2 (COX2) fortemente coinvolto nella proliferazione cellulare. Tali
dati fanno ritenere che la infezione cronica con un ceppo patogeno di H. Pylori possa
contribuire alla patogenesi del carcinoma della laringe, come già dimostrato nel carcinoma
gastrico e pancreatico.
Sono stati esaminati pazienti con ischemia cerebrale (ictus ischemico). L’ictus ischemico
non cardioembolico (LINCE) è ascrivibile ai "classici" fattori di rischio solo in parte. Nella
patogenesi delle patologie vascolari ischemiche è oggi ritenuta importante l’infiammazione
cronica, spesso causata da infezioni croniche, fra queste anche quella da Helicobacter pylori
(H. pylori). In particolare lo scopo dello studio è stato valutare la prevalenza di infezione da
H. pylori in 147 pazienti con LINCE (104 maschi), età media 59 anni in confronto a 320
donatori di sangue e 52 pazienti con malattia neurologica non vascolare (depressione).
La sieroprevalenza dell’infezione è stata ricercata per mezzo delle IgG specifiche anti -
H. pylori. La prevalenza è risultata più elevata nei pazienti affetti da LINCE (76,87%,
113/147) rispetto ai controlli (59,37%, 190/320, nei donatori e 50%, 26/52, nei depressi). Il
459

valore è statisticamente significativo (OR: 2.27, IC 95%: 1,43- 3.63, con p

Luca Scaglione Filone tematico C2
Valutazione dell'uso della profilassi antitrombotica nei pazienti con
fibrillazione atriale non-valvolare
ASO S. Giovanni Battista – U.O.A Medicina Generale 9
CONTESTO E RAZIONALE
La fibrillazione atriale non valvolare (FANV) è un’aritmia comune, più frequente
nell’anziano, e rappresenta un rilevante fattore di rischio per tromboembolie arteriose, in
particolare cerebrali. Nonostante le evidenze scientifiche dimostrino chiaramente il beneficio
della terapia antitrombotica al fine di prevenire gli eventi cardioembolici nei pazienti con
fibrillazione atriale e numerose Linee Guida internazionali ne raccomandino l’utilizzo, nella
pratica clinica la terapia antitrombotica, ed in particolare la TAO (terapia anticoagulante
orale), è spesso sottoutilizzata.
METODI E RISULTATI
Nella nostra Azienda Ospedaliera la situazione non è diversa, come dimostra un’indagine
condotta nel primo semestre 2000 tra i dimessi da reparti non chirurgici dell’ASO S. Giovanni
Battista di Torino con diagnosi di fibrillazione atriale. Questi dati sottolineano l’attuale
scostamento della pratica clinica ospedaliera e sul territorio dalle evidenze scientifiche in
merito all’uso della terapia antitrombotica nella FANV, sia nei termini di un mancato utilizzo,
in presenza di chiara indicazione, che di un utilizzo improprio, in presenza di
controindicazioni o efficacia non documentata. Nella seconda metà del 2002, il gruppo EBM
dell’ASO S. Giovanni Battista, in collaborazione con la direzione dell’azienda, ha istituito un
gruppo di lavoro multidisciplinare per produrre una linea guida sulla terapia antitrombotica
nei pazienti con FANV. Tale gruppo, composto da internisti, cardiologi, medici di famiglia,
ematologi ed epidemiologi, ha prodotto un documento che, dopo un’accurata revisione, è stato
presentato al personale sanitario dell’Azienda (giugno 2003) (il documento è disponibile sul
sito www.CPO.it). Le raccomandazioni di questo documento sono state quindi implementate
utilizzando diverse strategie (presentazione e distribuzione della linea guida, riunioni
finalizzate nei singoli reparti dell’ospedale e distribuzione di reminders per i singoli medici).
Una fase di implementazione è stata anche prevista per i medici di medicina generale sul
territorio.
Per valutare l’impatto della linea guida sull’appropriatezza della tromboprofilassi nei pazienti
ricoverati con FANV è stato eseguito uno studio con disegno “prima-dopo” confrontando i
dati di tutti i pazienti dimessi con questa diagnosi nel primo semestre 2000 (313 pazienti) con
quelli dimessi nel primo semestre 2004 (388 pazienti). Confrontando i due gruppi emerge che
nel I° semestre 2004 è aumentata la percentuale di pazienti anziani, con scompenso cardiaco e
ipertensione arteriosa, mentre si sono ridotti i pazienti con TIA o ictus in anamnesi.
L’appropriatezza della tromboprofilassi è stata valutata in base al rischio di ictus dei pazienti
con FANV:
• rischio molto alto = pazienti con anamnesi di TIA/Ictus/embolia sistemica ·
• rischio alto = età >65 anni e almeno un fattore di rischio (ipertensione, diabete, scompenso
cardiaco) ·
461

• moderato e basso = età >65 anni senza fattori di rischio, età

Giorgio Vittorio Scagliotti Filone tematico C1
Farmacogenetica della risposta ai derivati del platino in pazienti affetti da
carcinoma polmonare
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche
CONTESTO E RAZIONALE
Il meccanismo di azione del cisplatino e dei suoi analoghi e’ legato alla formazione di addotti
e di legami covalenti di cross-link tra le basi nel DNA nelle cellule. Questi danni, da cui
dipendono direttamente sia l’efficacia che la tossicita’ del trattamento, sono rilevati e riparati
dal sistema di riparazione NER (Nucleotide Excision Repair) associato alla trascrizione.
Alcuni studi clinici hanno messo in relazione l’efficacia dei derivati del platino con l’attività
del sistema NER nel tessuto tumorale, e in particolare dei suoi fattori XPD e ERCC1. Oltre ai
livelli di espressione, in alcuni studi clinici anche i polimorfismi del gene XPD, il cui
genotipo è facilmente determinabile sul DNA estratto dal sangue, sono risultati associati con
la sensibilità a derivati del platino sia in pazienti affetti da tumori del colon che del polmone.
Due polimorfismi del gene XPD, con le sostituzioni di aminoacidi Asp/Asn in posizione 312
e Lys/Gln in posizione 751, determinano una attività ridotta del 30%, e possono influenzare la
funzionalità dell’intero sistema NER e la risposta ai farmaci.
OBIETTIVO
E’ stato condotto uno studio prospettico su una serie consecutiva di pazienti afferenti nel
corso di un anno al reparto di Oncologia Polmonare dell’Ospedale San Luigi di Orbassano,
con lo scopo di convalidare l’importanza del genotipo dei pazienti per i polimorfismi XPD
come criterio per la scelta del trattamento chemioterapico.
MATERIALI E METODI
E’ stata preliminarmente analizzata la distribuzione di frequenza del polimorfismo di XPD
Lys751Gln in un campione di soggetti sani di controllo. Successivamente si è valutata la
frequenza dei polimorfismi di XPDLys751Gln e di ERCC1 in un campione di 251 pazienti
consecutivi con diagnosi di carcinoma polmonare con stadio avanzato di malattia candidati al
trattamento chemioterapico. La valutazione della risposta alla chemioterapia è avveuta
mediante controlli radiologici (TC Total Body) ed ematochimici trimestrali fino a
progressione della malattia, sia la valutazione del profilo di tossicita’ con visite ed esami
ematochimici appropriati a scadenze settimanali durante la somministrazione di terapia, e
quindi trimestrali nei controlli di follow up. Le relazioni tra diverse variabii cliniche ed i
genotipi XPD e XRCC1 sono state analizzate mediante analisi logistica uni- e multivariata.
RISULTATI
Iniziali dati sono stati oggetto di una comunicazione orale al meeting dell’American Society
of Clinical Oncology del giugno 2004 (U. Ricardi, S. Regazzoni, P. Ghio, D. Giachino, M. De
Marchi, S. Novello, G. Selvaggi, G. V. Scagliotti - The K751Q polymorphism of XPD gene
in lung cancer patients receiving platinum-based chemotherapyJournal of Clinical Oncology,
463

2004 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition). Vol 22, No 14S (July 15
Supplement), 2004: 2500) Il secondo anno è stato impiegato per il completamento del follow
up, l’analisi genomica di altri polimorfismi (XRCC1 e TS – non oggetto del presente
finanziamento) e l’analisi statistica.
Complessivamente sono stati inclusi 207 pazienti con diagnosi di carcinoma polmonare non a
piccole cellule (stadio III =79, stadio IV = 126) e 44 di carcinoma polmonare a piccole cellule
con l’età media di 61. 5 anni. L’80% dei pazienti è di sesso maschile, fumatori correnti 57%,
ex fumatori 31%, non fumatori 12%. La valutazione della risposta terapeutica è disponibile
per 234 pazienti, la recidiva è attualmente stata documentata nel 34% dei pazienti. Il
trattamento con platino è stato effettuato nel 93% dei pazienti considerati. All’analisi
univariata performance status, stadio della malattia, la presenza di metastasi si sono dimostrati
fattori indicanti la prognosi.
La frequenza dei polimorfismi è risultata essere equamente distribuita fra controlli sani
(n=220) e pazienti. Frequenza del polimorfismi di XPD nei pazienti con carcinoma
polmonare: AA 43% - AC 43% - CC 14%; polimorfismo di XRCC1: AA 13% - AG 39% -
GG 48%. All’analisi univariata entrambi i polimorfismi non sono risultati essere associati ne
con la risposta, ne con la probabilità di recidiva e/o di sopravvivenza complessiva. Il dato
consolidato sull’intero campione di pazienti è in contraddizione con le iniziali segnalazioni
riportate in un campione più limitato di 50 pazienti.
Nel modello di interazione fra fattori clinici più interazione del polimorfismo con la terapia a
base di platino tutti gli hazard ratios considerati sono risultati essere non statisticamente
significativi
CONCLUSIONI
Questo studio prospettico consente di escludere l’analisi dei polimorfismi di XPD e di
XRCC1 dai marcatori genomici che possano predirre un differente profilo di attività del
cisplatino nei pazienti sottoposti a trattamento chemioterapico
464

Maria Pia Schieroni Filone tematico C1
Progetto per la mobilizzazione pazienti degenti per il miglioramento
dell’outcome e il contenimento della spesa sanitari
ASO S. Giovanni Battista –S.C.D.O. Recupero e Rieducazione Funzionale
Dipartimento Medicina Riabilitativa e Domiciliare
OBIETTIVO
Obiettivo del progetto è stato quello di favorire la mobilizzazione dei pazienti degenti,
attraverso la formazione del personale e l’acquisizione di ausilii, al fine di ridurre l’incidenza
delle complicanze cliniche legate all’allettamento, migliorare gli outcome e favorire la
guarigione e la dimissione precoce dei pazienti. Tali obiettivi sono stati perseguiti attraverso
le seguenti modalità:
1. analisi e valutazione dei bisogni clinici, strutturali e formativi;
2. piano operativo con attivazione di percorsi specifici, acquisizione degli ausilii e
sperimentazione in quattro Reparti Pilota dell’Azienda;
3. valutazione dei risultati della sperimentazione.
METODI E RISULTATI
Nell’ambito delle suddette fasi sono state svolte le seguenti attività:
• Istituzione di una Commissione Multidisciplinare coordinata dalla Direzione Sanitaria e
composta da: Responsabile Scientifico del Progetto, Vice Responsabile, Ufficio Controllo
Qualità Progetti, fisiatra, fisioterapista. Nel corso del lavoro, in risposta a problematiche
intercorrenti di carattere organizzativo, gestionale, clinico, sono state coinvolte diverse
figure professionali Aziendali (Clinici, Dirigenti Infermieristici, personale dell’Area
Formazione, del Provveditorato, del Servizio di Prevenzione e Protezione, dell’Ufficio
Relazioni con il Pubblico, dell’Ufficio Tecnico Progettazione e Manutenzione, …) al fine
di favorire il raggiungimento degli obiettivi.
• Individuazione di quattro Reparti Pilota, ritenuti idonei per la fase sperimentale del
Progetto, e delle professionalità da coinvolgere nella sperimentazione (Direttore della
Struttura Complessa, Medico referente di reparto, Capo Sala, Medico Fisiatra e Terapista
referenti di reparto per il Progetto). La fase sperimentale ha previsto l’interfacciamento e
l’azione congiunta di tali figure professionali al fine di promuovere al massimo e in modo
ottimale la mobilizzazione di ciascun paziente ricoverato, mediante la formulazione di un
Piano di Mobilizzazione personalizzato, affiancato al bisogno dal Progetto di
Riabilitazione.
• Con il finanziamento (€ 8000) è stata acquisita la dotazione degli ausili indispensabili al
programma di mobilizzazione dei pazienti ricoverati nei Reparti Pilota, e stipulato un
contratto di prestazione occasionale per la raccolta e l’elaborazione dei dati.
• Promozione ed attuazione, con l’Area Formazione, di un piano formativo e di
addestramento alla mobilizzazione dei pazienti (accreditato ECM), articolato in una parte
teorica rivolta a personale medico, infermieristico, tecnico e di assistenza dei Reparti
465

Pilota, e in una parte pratica, effettuata nei reparti di degenza, rivolta a personale
infermieristico, tecnico e di assistenza.
• Elaborazione e applicazione di tre schede di valutazione (scheda fisiatrica, scheda
fisioterapistica, scheda infermieristica) dei pazienti degenti per la gestione integrata del
piano di mobilizzazione.
• Verifica e censimento, in collaborazione con le Capo Sala, degli ausilii in dotazione e dei
reali bisogni di ausili per la mobilizzazione dei pazienti in ogni Reparto di Degenza
dell’ASO a seconda della tipologia, tenendo conto anche di quelli previsti per i lavoratori
dalla L. 626-94 sul Rischio da Movimentazione dei carichi.
• Revisione ed ottimizzazione dei percorsi Aziendali di Manutenzione degli Ausilii in
dotazione a tutti i reparti. 8.Supporto agli operatori da parte del personale della
Riabilitazione nella definizione del Piano di Mobilizzazione personalizzato in relazione
alle problematiche clinico-assistenziali e nelle modalità di utilizzo di ausilii specifici.
La fase sperimentale operativa del progetto è stata effettuata nei Reparti Pilota dal mese di
maggio al mese di novembre 2005, con il fine di valutare la ricaduta dell’attività di
formazione specifica inerente il Piano di Mobilizzazione, l’attuazione di tale Piano
nell’attività assistenziale quotidiana, e quanto tale sensibilizzazione interferisse sui pazienti
sia in termini di qualità assistenziale percepita che di miglioramento della disabilità (grazie
anche ad un incremento dell’utilizzo di ausilii e alle nuove tipologie di ausilii introdotte). A
tal fine si è proceduto ad identificare due gruppi omogenei di pazienti (Gruppo 1-Controlli: 39
pazienti, età media 60,6 anni; Gruppo 2-Casi: 40 pazienti, età media 64,3 anni) nell’ambito
dei Reparti Pilota. Con il supporto delle schede di valutazione standardizzate (fisiatrica,
fisioterapistica ed infermieristica) appositamente elaborate, i pazienti sono stati sottoposti a:
• visita fisiatrica iniziale e predimissione, con valutazione di specifici parametri clinicofunzionali
e del grado di autonomia dei pazienti;
• trattamento rieducativo;
• piano di mobilizzazione infermieristico, attuato soltanto per i pazienti del Gruppo 2.
Dall’analisi dei dati è emerso che i pazienti inseriti nello studio sono stati ricoverati per
patologie ad alta complessità e spesso gravemente disabilitanti (Gruppo 1: 25 pz con patologie
neurologiche gravi e 7 pazienti con patologie neoplastiche; Gruppo 2: 24 pz con patologie
neurologiche gravi e 10 pazienti con patologie neoplastiche), frequentemente associate a
comorbilità a loro volta interferenti con l’autonomia dei pazienti già prima del ricovero (più
del 50% dei pazienti in entrambi i gruppi). Tale riscontro ha reso particolarmente evidente la
necessità di personale assistenziale sensibilizzato al problema della mobilizzazione.
Gli outcome presi in esame sono stati numerosi; in particolare si segnalano:
1. miglioramento della disabilità alla dimissione rispetto al momento della presa in carico in
entrambi i gruppi ma in misura maggiore e in un numero superiore di pazienti nel Gruppo
2 (19 pz-Gruppo 1 vs 22 pz-Gruppo 2 migliorati);
2. riduzione del numero di lesioni da decubito nei pazienti del Gruppo 2 (5 pz-Gruppo 1 vs 1
pz-Gruppo 2);
3. riduzione del numero di cadute nei pazienti del Gruppo 2 (1 pz-Gruppo 1 vs 0 pz-Gruppo
2);
4. incremento dell’utilizzo di ausilii per i pazienti del Gruppo 2 (9 pz-Gruppo 1 vs 17 pz-
Gruppo 2).
CONCLUSIONI
466

In conclusione, da questi dati preliminari, possiamo affermare, grazie al coinvolgimento e alla
grande collaborazione del personale medico e infermieristico, sia nella fase formativa che in
quella operativa-sperimentale del Progetto che importante è stata la ricaduta sul decorso
clinico e sull’outcome; è comunque emersa nel contempo la necessità di estendere ed
incrementare la cultura della mobilizzazione, integrata dall’acquisto di ulteriori ausilii per
ottimizzare l’assistenza.
467

Giuseppe Scielzo Filone tematico A3
Determinazione delle dosi assunte da operatori, pazienti famigliari e
popolazione nell'impiego terapeutico di iodio 131
A. S. O. Ordine Mauriziano di Torino
Ospedale Umberto I
CONTESTO E RAZIONALE
Presso l’U.O.A. di Medicina Nucleare dell’Ospedale ‘Umberto I’ di Torino è operativa
un’unità composta da 5 posti letto per il trattamento con Iodio (I-131) del tumore tiroideo.
L’obiettivo del progetto è la determinazione delle dosi somministrate ai pazienti trattati, la
loro modellizzazione e il confronto con analoghe operatività. Uno studio retrospettivo ha
permesso di valutare le dosi somministrate ai pazienti e quelle ricevute da operatori,
famigliari e popolazione venuti a contatto con essi. I risultati ottenuti hanno permesso di
ottimizzare i protocolli operativi al fine di ridurre le dosi, ai sensi del Dlg 187/00.
MATERIALI E METODI
Lo I-131 (emivita fisica di 8,02 giorni, emissione beta di energia media 191 keV e gamma di
364 keV) è utilizzato per la terapia del ca differenziato della tiroide somministrando alte
attività (1110 – 7400 MBq) poiché permette di indirizzare quasi unicamente sul tessuto
tiroideo il danno radioindotto, risparmiando i tessuti sani circostanti. Alcuni organi extratiroidei
ricevono una dose dalla componente gamma che diventa sorgente di irradiazione
anche per gli individui che si trovano nelle vicinanze del paziente. Gli aspetti legislativi e di
radioprotezione della terapia con I-131 sono in gran parte contenuti nei Dlgs 241/00 e 187/00.
La terapia con I-131 avviene in ricovero di degenza protetta in cui i pazienti non possono
uscire dall’area sorvegliata. Al fine di monitorare l’attività del paziente è stata predisposta
un’apposita strumentazione che ne misura periodicamente la presenza nel corpo traducendola
in conteggi. L’analisi delle curve di dismissione dell’attività così ottenute ha permesso lo
studio dei tempi di dimissione e un stima precisa delle dosi.
RISULTATI
E’ stato studiato un gruppo di 1145 pazienti (63,3 % femmine, 36,7 % maschi) sottoposti a
terapia negli ultimi 5 anni (1999–2003). L’elaborazione statistica dei dati raccolti è avvenuta
predisponendo un software di analisi e calcolo e un database per la gestione dei pazienti. Il
valor medio di Attività somministrata è risultato pari a 4166 MBq ± 1550 MBq (1 STD); in
particolare nel 4 % dei casi l’attività somministrata è risultata essere inferiore a 2500 MBq,
nel 55 % dei casi compresa tra 2550 e 5550 MBq e nel 41 % dei casi superiore a 5550 MBq.
L’attività presente al momento della dimissione (4 giorni dopo la somministrazione) è stata
valutata interpolando le misure di captazione e confrontata con il limite di legge di 600 MBq:
il 66 % dei paziente presenta, al quarto giorno dopo la terapia, un’attività inferiore a 200
MBq, il 22 % compresa tra 200 e 400 MBq, l’11% compresa tra 400 e 600 MBq e solo l’1 %
superiore a 600 MBq, con una necessità di prolungare il ricovero. L’attività media presente
nei pazienti alla dimissione è risultata pari a 184,2 MBq ± 159,1 MBq (1 STD). Per ciascun
paziente è stato calcolato il giorno di dimissibilità (valor medio è di 1,8 ± 0,7 giorni (1 STD).
Dall’analisi complessiva di questo parametro risulta che nell’8 % dei casi i pazienti risultano
dimissibili dopo 1 giorno, nel 60 % dei casi entro 1 - 2 giorni, nel 24 % dei casi entro 2 - 3
468

giorni, nel 7 % dei casi entro 3 – 4 giorni e solo nello 1 % dei casi oltre i 4 giorni. E’ stata
calcolata la dose ai diversi organi a rischio (Metodo ICRP). Il valor medio della dose al
midollo è risultato pari a 0,2 Gy ± 0,1 Gy (1 STD) mentre quello ai polmoni di 0,2 Gy± 0,1
Gy (1 STD). La dose allo stomaco (somministrazione orale della terapia) ha valore medio pari
a 2,5 Gy ± 0,9 Gy, quella alla vescica è di 2,2 Gy ± 0,8 Gy mentre quella ai reni è di 0,3 Gy ±
0,1 Gy. La dose media all’intestino è di 0,3 ± 0,9 Gy .Per le donne è stata valutata la dose
all’utero che è risultata avere un valore medio di 0,2 Gy ± 0,1 Gy. Tutte le dosi valutate sono
ampiamente al di sotto delle tolleranze previste rendendo la terapia sicura e giustificata. Il
valore medio di dose efficace ottenuto è di 28,4 Sv ± 10,3 Sv di cui il contributo dovuto alla
tiroide rappresenta circa il 99 % della dose complessiva. Per gli operatori coinvolti nella
terapia (medici, fisici, personale tecnico e ausiliario) la legge prevede un limite di esposizione
annua di 20 mSv per la dose efficace e 500 mSv per la dose pelle. La procedura terapeutica è
stata suddivisa nelle diverse fasi, attentamente osservate e monitorate, per effettuare il calcolo
dosimetrico, confrontarlo con dati sperimentali derivanti dai dosimetri personali e verificarne
il rispetto dei limiti di legge come riportato in tabella (ipotizzando un’attività somministrata
pari al valor medio del campione in esame).
.
Dose totale annua efficace (mSv) e dose totale pelle
Medico Med. Nucl Fisico Specialista TRSM Med. Nucl. Ausiliario Infermieri
Dose efficace (mSv) 3.2 0.05 3.3 4.2 5.3
Dose pelle (mSv) 4.6 0.05 14.5 14.5 5.2
La dose efficace alla popolazione (limite 1 mSv/anno) e ai famigliari (vincoli di dose in un
ciclo terapeutico per adulti di età inferiore ai 60 anni pari a 3 mSv, per età superiore a 60 anni
pari a 10 mSv) è stata calcolata con lo stesso modello e confrontata dalla lettura dei dosimetri
ambientali posti negli ambienti più critici (tabella seguente).
Dose totale annua efficace (mSv) ricevuta dai famigliari e dalla popolazione
Popolazione
Famigliare
600 MBq alla dimissione
469
Famigliare
400 MBq
Famigliare
200 MBq
0.12 2.3 1.6 0.8
Per il famigliare si è ipotizzato che sempre uno stesso individuo fosse per 8 ore al giorno a
una distanza di 1 m dal paziente, per un mese, con un’attività alla dimissione pari a 600, 400 o
200 MBq Come si può osservare tutti i valori rientrano entro i limiti previsti dalla legge.
CONCLUSIONI
Dai risultati riportati si evince che il trattamento radiometabolico del carcinoma tiroideo con
I-131 predisposto presso l’U.O.A. di Medicina Nucleare dell’Ospedale ‘Umberto I’ risulta
efficace e sicuro dal punto di vista radioprotezionistico. Le dosi ricevute dagli operatori, dai
famigliari e dalla popolazione rientrano ampiamente nei limiti di legge e ne garantiscono
l’adeguatezza, come confermato anche in letteratura. La complessità del trattamento
coinvolge diverse figure professionali e richiede una stretta collaborazione e una procedura
ben pianificata e definita. Nel prossimo futuro sarà auspicabile un’ottimizzazione della
procedura diminuendo i giorni di ricovero, per permettere l’accesso a questa terapia ad un più
alto numero di pazienti. L’esigenza sociale è urgente essendo le liste di attesa molto lunghe e i
posti disponibili in Piemonte esigui.

Leandra Silvestro Filone tematico A4
Prevenzione dell’obesità in eta’ pediatrica: correlazione fra alimentazione
e metabolismo ormonale nel primo anno
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze pediatriche e dell’Adolescenza
METODI E RISULTATI
Con il nostro studio abbiamo preso in considerazione un campione di 276 lattanti sani di età
non superiore ai 22 mesi giunti all’osservazione del Reparto Lattanti dell’OIRM di Torino fra
il 2003 ed il 2005. In questo gruppo di soggetti abbiamo selezionato quelli con età inferiore a
12 mesi di vita (n = 184; 101 M e 83 F) su cui abbiamo indagato i livelli sierici di ghrelin,
leptina, IGF-I ed insulina, per i quali abbiamo cercato di valutare l’eventuale influenza
esercitata dal tipo di allattamento su ciascuno di essi. Sono state inoltre indagate le relazioni
presenti tra gli ormoni ed il genere, l’età e parametri auxometrici quali la lunghezza, la
circonferenza cranica, il peso, il BMI e le pliche cutanee.
Dai risultati è emerso l valore medio (±DS) dell’IGF-I nel campione totale è risultato di 37.6
(±15.6) ng/ml (v.n.16-91 ng/ml); i livelli sierici di IGF-I sono risultati significativamente più
alti nei bambini allattati con latte adattato (LA) rispetto a quelli allattati con latte materno
(LM) nel campione totale (p=.028) e nel gruppo A (p=.029). Il valore medio (±DS) della
leptina nel campione totale è risultato di 4.4 (±3.9) ng/ml; nel gruppo A le femmine (F) hanno
riportato valori significativamente più alti dei maschi (M) (p=.030); distinguendo in base al
tipo di allattamento la leptina è risultata significativamente più alta nei bambini allattati con
LM nel campione totale (p=.005), nel gruppo A (p=.042) e nel gruppo B (p=.012). Il valore
medio (±DS) del ghrelin nel campione totale è risultato di 3026 (±1386) pg/ml; nel gruppo A
sono emersi valori significativamente più alti nei bambini allattati con LA (p=.007).
Per i parametri antropometrici (peso, lunghezza e circonferenza cranica) non sono emerse
differenze statisticamente significative tra M e F e tra bambini allattati con LM e bambini
allattati con LA. Nel gruppo C i bambini allattati con LA hanno mostrato valori maggiori di
BMI (p=.015), di spessore di plica sottoscapolare (p=.012) e di velocità di crescita ponderale
(p=.030). Sono risultate interessanti le seguenti correlazioni: la correlazione negativa tra
leptina e ghrelin (p=.027) nei bambini allattati con LM; positiva tra leptina e plica
sottoscapolare (p=.025) nei bambini allattati con LA; positiva tra leptina e peso (p

hanno un’azione stimolatoria sulla crescita, si può ipotizzare che i bambini allattati con LA
ricevano un maggiore stimolo a crescere. In accordo con tale ipotesi vi è l’osservazione che
nella fascia d’età 8-12 mesi i bambini allattati con LA mostravano una velocità di crescita
ponderale, un BMI e una plica sottoscapolare maggiori rispetto ai bambini allattati con LM.
E’ ipotizzabile che la diversa modalità di crescita nel corso del primo anno di vita tra i
bambini allattati con formula e quelli allattati al seno possa avere conseguenze a lungo
termine, in particolar modo possa esporre a un diverso rischio di sviluppare obesità.
L’allattamento con LM sembra proteggere da tali condizioni per diversi motivi: in primo
luogo per il più basso contenuto proteico rispetto al latte adattato, in secondo luogo per la
presenza nel latte materno di diversi fattori tra cui la leptina; questa a breve termine regola il
senso di sazietà del bambino riducendo quindi l’assunzione del cibo, mentre a lungo termine
potrebbe contribuire alla definizione di un livello di equilibrio energetico sul quale
l’organismo potrà regolarsi nelle età successive.
471

Fabiola Sinigaglia Filone tematico A2
Fattori di rischio trombotico: indagini sul meccanismo d’azione di
estrogeni, progestinici e colesterolo
Università “A. Avogadro” del Piemonte Orientale
Dipartimento di Scienze Mediche
CONTESTO E RAZIONALE
Il ruolo degli ormoni steroidei nella regolazione delle funzioni piastriniche è stato investigato
per anni, ma risultati contrastanti sono stati riportati. Per molti anni, inoltre, la questione
riguardante gli effetti degli estrogeni sulla fisiologia delle piastrine umane è stata messa in
discussione a causa della supposta assenza del recettore per gli estrogeni in queste cellule
anucleate. Recenti studi hanno dimostrato che gli estrogeni, accanto alla regolazione dei
processi trascrizionali, sono in grado di esercitare effetti rapidi, non-genomici sulle cellule
bersaglio. Inoltre, in piastrine umane sono stati identificati entrambi i recettori per gli
estrogeni, ma il recettore ERbeta sembra essere il più abbondantemente espresso. Si può
pertanto ipotizzare che le piastrine siano un bersaglio dell’azione estrogenica e che gli effetti
dell’estrogeno sul sistema vascolare siano, almeno in parte, espressione della diretta
modulazione della funzione piastrinica da parte degli steroidi. Inoltre, le piastrine, essendo
prive di nucleo, rappresentano un eccellente modello per lo studio delle vie di segnalazione
che mediano gli effetti non-genomici degli estrogeni.
METODI E RISULTATI
Il gruppo di lavoro ha cominciato a caratterizzare le vie di trasduzione del segnale accese
dagli estrogeni in piastrine umane verificando se l’ormone fosse in grado di modificare lo
stato di attivazione di alcuni specifici substrati ed in particolare della tirosin chinasi Src la cui
attività è potenziata nelle vie di segnalazione mediate dal recettore per gli estrogeni in
numerosi tipi cellulari. Il 17beta-estradiolo è in grado di determinare la rapida fosforilazione
in tirosina delle chinasi Src e Pyk2. Inoltre, la fosforilazione della chinasi Src viene
completamente abolita in seguito alla preincubazione delle piastrine con l’antagonista del
recettore per gli estrogeni ICI 182,780, dimostrando che questo effetto è mediato
dall’intervento di un recettore per estrogeni espresso nelle piastrine. Il 17beta-estradiolo,
inoltre, promuove la formazione, dipendente dall’attività di Src, di un complesso molecolare
di segnalazione che comprende Src, Pyk2 e la subunità regolatoria p85 della PI3-K associati
al recettore ERbeta. Mentre Pyk2 risulta essere fosforilato in maniera Src chinasi-dipendente,
non si osserva una significativa attivazione di PI3-K, in termini di fosforilazione in tirosina
della subunità regolatoria p85, né di fosforilazione in Ser e Thr di PKB/Akt, noto substrato di
PI3-K, lasciando supporre che tale proteina non sia coinvolta nella segnalazione estrogenica
in piastrine umane. Numerosi studi hanno dimostrato che il 17beta-estradiolo attiva la via di
segnalazione Src/Ras/ERK in vari tipi cellulari; a questo proposito è stato indagato se, nel
nostro modello sperimentale, l’estrogeno fosse in grado di determinare fosforilazione delle
MAP chinasi ERK. Il 17beta-estradiolo promuove una debole, ma rapida fosforilazione di
ERK già rilevabile a 30 secondi e che mostra poi due picchi di intensità massima a 3 e 9
minuti.
E’ stato poi interessante verificare la localizzazione subcellulare del complesso molecolare
Src-dipendente associato al recettore ERbeta. ERbeta risulta localizzato nella membrana
472

piastrinica ed in seguito a trattamento con 17beta-estradiolo non modifica la sua
localizzazione cellulare; inoltre identiche quantità di Src sono presenti nella membrana di
piastrine a riposo o trattate con estrogeno, tuttavia la forma attiva di Src associata alla
membrana aumenta rapidamente ed in modo transiente. In seguito a stimolazione con
estradiolo si verifica una significativa, ma transiente traslocazione di Pyk2 nella membrana
piastrinica, mentre identiche quantità di p85-PI3-K sono rilevabili in tutte la frazioni di
membrana analizzate.
La nostra attenzione si è poi rivolta all’isolamento delle rafts lipidiche, piccole piattaforme di
membrana altamente organizzate che svolgono un ruolo importante nei processi di attivazione
piastrinica. Il 17beta-estradiolo determina la traslocazione del recettore ERbeta alle frazioni
rafts in maniera tempo-dipendente: la massima associazione del recettore è stata osservata ad
1 minuto di trattamento delle piastrine con estrogeno. In piastrine stimolate con 17betaestradiolo
si verifica anche una rapida e transiente traslocazione della tirosin chinasi Src nelle
frazioni rafts; inoltre, la chinasi Src associata alle rafts risulta essere nella sua forma attiva. Il
17beta-estradiolo, poi, è in grado di determinare la fosforilazione della chinasi Pyk2 e la sua
associazione alle frazioni rafts; al contrario, p85-PI3-K risulta essere costitutivamente
associata alle rafts lipidiche ed il trattamento con estrogeno non è in grado di modulare la sua
associazione a questi microdomini.
Dal momento che il 17beta-estradiolo da solo si è dimostrato incapace di influenzare
direttamente la funzionalità piastrinica, è stata presa in considerazione la possibilità che esso
modulasse l’aggregazione piastrinica indotta da agonista. E’ stato osservato un forte
potenziamento estradiolo-dipendente dell’aggregazione indotta da basse dosi di trombina e di
U46619, analogo stabile del trombossano A2. Il 17beta-estradiolo è in grado di potenziare
l’esposizione sulla superficie piastrinica dell’integrina alphaIIbbeta3 nella sua conformazione
attiva in piastrine stimolate con basse dosi di trombina, potenziando così il processo di
aggregazione. Inoltre, l’inibizione dell’attività della chinasi Src blocca completamente
l’esposizione dell’integrina alphaIIbbeta3 indotta dall’agonista, confermando il ruolo centrale
di Src nella segnalazione inside-out in piastrine umane.
E’ stato poi dimostrato che sia l’estradiolo sia i due agonisti utilizzati causano attivazione
della chinasi Src, ma con cinetiche differenti e quando le piastrine sono trattate sia con il
17beta-estradiolo sia con trombina od U46619 la fosforilazione della chinasi Src aumenta
rapidamente in 15 secondi e non reverte, indicando che estrogeno e trombina od estrogeno ed
U46619 agiscono con un meccanismo additivo.
CONCLUSIONI
Questi dati identificano un nuovo possibile meccanismo con cui gli estrogeni influenzano il
sistema cardiovascolare: accanto agli effetti genomici sulle cellule endoteliali e muscolari
lisce della parete dei vasi, gli estrogeni possono sensibilizzare direttamente, attraverso
un’azione strettamente non-genomica, le piastrine ai più comuni agonisti fisiologici. Uno
sviluppo di questo lavoro potrà essere una migliore definizione a livello molecolare
dell’interazione estrogeni/piastrine ed in particolare una migliore caratterizzazione delle vie di
trasduzione del segnale coinvolte, servirà a comprendere il ruolo biologico degli estrogeni
relativamente alla funzionalità piastrinica.
473

Piero Sismondi Filone tematico C1
DNA microarray dedicati per la diagnosi di diverse forme cliniche di
carcinoma mammario
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Discipline Ginecologiche e Ostretiche
CONTESTO E RAZIONALE
Il tumore mammario è una patologia eterogenea che può risolversi sia in una completa
guarigione che in una morte precoce. Gli indicatori prognostici che attualmente aiutano a
classificare il tumore in base al rischio di recidiva, sono imprecisi: per quanto riguarda, ad
esempio, il coinvolgimento linfonodale, una percentuale di pazienti linfonodo negativi che
raggiunge il 30% può recidivare. Poiché la variabilità nel comportamento del tumore deriva
da complessi cambiamenti molecolari, piuttosto che da una singola alterazione, è necessario
adottare un approccio multifattoriale. L’analisi di espressione genica mediante DNA arrays
può essere un metodo adeguato di indagine in quanto, misurando il livello di espressione di
migliaia di geni in una volta sola, permette di valutare contemporaneamente un numero
elevato di variabili combinatoriali. Individuando il profilo genico specifico associato,
l’applicazione clinica della tecnologia degli arrays potrebbe permettere di selezionare pazienti
sane ad alto rischio per il tumore mammario oppure di seguire i cambiamenti che avvengono a
livello del tessuto mammario durante trattamenti associati con l’aumento del rischio di
patologia neoplastica, come nel caso della terapia ormonale sostitutiva.
METODI E RISULTATI
Nello studio effettuato sono state analizzate 30 biopsie di carcinoma mammario duttale,
prelevate da pazienti con intervallo libero da malattia 72 mesi (PF, prognosi favorevole). Per ogni gruppo sono stati preparati 3 pools di RNA
formati da 5 campioni; la misura è stata effettuata in doppio utilizzando la piattaforma
Affymetrix, GeneChip HU133A. Si è deciso di eseguire l’analisi di espressione su pool per
individuare geni con un’espressione differenziale significativa, però, per non escludere
dall’analisi geni con ampio range di espressione, i pools sono stati allestiti con un numero
ridotto di campioni. I campioni sono stati scelti utilizzando i seguenti criteri:
• diagnosi di carcinoma duttale invasivo, classificazione T ed N, assenza di metastasi (M0),
dati clinico-patologici completi e follow up aggiornato;
• trattamento chirurgico (mastectomia radicale o quadranctectomia, dissezione ascellare) e
radioterapia.
I dati sono stati analizzati utilizzando Affymetrix Microarray Suite 5 (MAS) e Bioconductor.
L’espressione differenziale è stata valutata mediante SAM (Significance Analysis of
Microarrays) e CyberT. Sono stati riscontrati 63 gene statisticamente rilevanti dal punto di
vista dell’espressione differenziale (fold change threshold: |1.5|; false discovery rate: 1.2%);
tra questi RRM2, MAD2L1, Secretoglobin 2A e SLPI risultano associati con la prognosi
sfavorevole, mentre EGR1, AGTR1 e FOSB correlano con la prognosi favorevole. La
validazione dei dati ottenuti mediante Microarray è stata effettuata mediante SYBR®Green-
Real-Time PCR sui campioni individuali di ciascun pool. Sono stati analizzati alcuni geni
selezionati casualmente (CITED1, SLPI, EGR1, ADAMTS, FOSB, CKMT, AGTR) e per
tutti è stata riscontrata corrispondenza tra microarray e Real-Time PCR. Per valutare
474

ulteriormente la funzione biologica dei geni in analisi e l’effettiva correlazione con la
patologia neoplastica è stata effettuata una ricerca in letteratura; la documentazione valutata
ha dato esiti coerenti con i risultati ottenuti che individuano questi geni come
differenzialmente espressi nei due tipi di campioni tumorali.
SLPI appartiene alla famiglia degli inibitori di proteasi che possono essere associati a
trasformazione tumorale.
CKMT è una creatina-chinasi mitocondriale che risulta overespressa in molti tumori a
prognosi sfavorevole e può essere associata ad inefficienza nell’eliminazione delle cellule
tumorali mediante apoptosi.
CITED1 è un coregolatore trascrizionale espresso in cellule derivate da melanoma; in
letteratura non c’è evidenza di correlazione con la prognosi.
ADAMTS codifica per una metalloproteasi che ha attività anti-angiogenica; sembra essere
necessaria per una normale crescita morfologica e funzionale. EGR1: molti studi suggerisco
che abbia funzione di oncosoppressore; nel tumore mammario se overespresso può inibire la
crescita del tumore.
FOSB: alti livelli di espressione di questo gene sembrano essere necessari alla normale
crescita e al normale differenziamento delle cellule di epitelio mammario; ridotti livelli
proteici di FosB possono essere coinvolti nel processo di dedifferenziamento che avviene
durante la tumorigenesi nel carcinoma mammario.
AGTR: (angiotensin II receptor) non è espresso in carcinoma mammario invasivo per cui si
può pensare che il relativo pathway di segnalazione non sia attivato in tumori di tipo invasivo.
I geni selezionati quindi potrebbero avere ruolo di marker prognostici per il carcinoma
mammario primario (Sfiligoi C. et al.,“Breast Cancer Molecular Profiling: Identification of a
Gene Subset Related to Prognosis”, 3rd EORTC-NCI meeting on cancer molecular marker,
18-20 aprile 2004). Inoltre i risultati conseguiti paragonando il sistema dei microarrays
all’analisi mediante Real-Time PCR dimostrano che questa nuova tecnologia può risultare una
via praticabile per una riclassificazione delle neoplasie.
Al fine di provare la consistenza dei dati ottenuti e di verificarne la ripetibilità, sono stati
individuati altri campioni tumorali coerenti con quelli analizzati in precedenza su cui
effettuare un’analisi di tipo analogo. Si è proceduto all’estrazione di RNA dai pezzi istologici
di carcinoma mammario selezionati, previa polverizzazione, mediante l’utilizzo del reagente
Concert (Invitrogen). La resa è risultata compresa tra i 100 e i 400 g di RNA totale ogni 20
mg di tessuto. Successivamente, si è proceduto alla valutazione qualitativa del prodotto
mediante BioAnalyzer (Agilent). Questo strumento permette di analizzare, mediante una
elettroforesi capillare, lo stato di integrità dell’RNA e la presenza di DNA genomico, inoltre
effettua una quantificazione più precisa della valutazione spettrofotometrica. Per i campioni
risultati di bassa qualità si è proceduto al trattamento con DNasi, per eliminare eventuali
tracce di DNA genomico, e successivamente ad una nuova analisi mediante BioAnalyzer.
Sono stati in questo modo selezionati 30 campioni: 15 corrispondenti a pazienti con intervallo
libero da malattia pari di 72 mesi e 15 recidivanti entro i 72 mesi. La procedura verrà
completata preparando 3 pools di RNA costituiti da 5 campioni per gruppo e utilizzando la
piattaforma Affymetrix, GeneChip HU133A per l’analisi di espressione genica in duplicato.
475

Vincenzo Soardo Filone tematico B1
Sicurezza alimentare e prodotti fitosanitari. Elaborazione di un percorso
formativo per gli addetti alla vendita.
Asl 19 – Dipartimento di Prevenzione
S.O.C. Igiene Alimenti e Nutrizione
CONTESTO E RAZIONALE
Il corretto impiego dei prodotti fitosanitari costituisce un importante fattore per la sicurezza
alimentare. E' ormai conoscenza acquisita il possibile rischio di intossicazione acuta e cronica,
non solo per gli operatori del settore, ma anche per i consumatori attraverso la possibile
assunzione di acqua ed alimenti in cui tali sostanze possono residuare. La recente normativa
in materia, in particolare il DPR 290/01, ha la finalità di garantire un elevato livello di tutela
della salute di consumatori ed utilizzatori. Lo stesso DPR all'art. 27 dà mandato alle Regioni
di organizzare appositi corsi obbligatori di formazione/aggiornamento per l'istruzione e
l'addestramento di coloro che intendono conseguire il cerificato di abilitazione alla vendita di
prodotti fitosanitari. La Regione Piemonte con DGR 5/8/03 n. 7-10295 ha individuato nei
Servizi di Igiene degli Alimenti e della Nutrizione (SIAN) dei Dipartimenti di Prevenzione
delle ASL la struttura sanitaria preposta all'attivazione dei corsi di formazione/aggiornamento
destinati a coloro che richiedano il rilascio/rinnovo del certificato di abilitazione alla vendita
di prodotti fitosanitari e coadiuvanti.
OBIETTIVO
La ricerca prevede la produzione di:
• "core curriculum" del modulo di insegnamento (aspetti sanitari) affidato al personale dei
SIAN individuato quale docente nei corsi;
• materiale didattico di base;
• panel di quiz di verifica dell'apprendimento.
MATERIALI E METODI
• La ricerca documentale di materiale scientifico/didattico è stata effettuata utilizzando
internet come strumento principale. E' stato inoltre acquisito materiale didattico cartaceo
(dispense) utilizzato da alcuni SIAN nei corsi in oggetto.
• Le informazioni sull'andamento generale dei corsi organizzati nelle ASL piemontesi sono
state acquisite attraverso la Direzione Regionale di Sanità Pubblica.
RISULTATI
Rispetto al programma didattico svolto nell'anno corrente, i corsisti hanno proposto un
maggior approfondimento delle problematiche legate alla vendita dei prodotti fitosanitari, in
particolare delle disposizioni normative vigenti. Tenendo conto di questa osservazione, è stato
realizzato un testo su CD, utilizzabile come testo didattico di base, per il modulo di
insegnamento "aspetti sanitari" nei corsi obbligatori di formazione/aggiornamento per i
476

soggetti richiedenti il rilascio/rinnovo del certificato di abilitazione alla vendita di prodotti
fitosanitari e coadiuvanti. Il prodotto va ad integrarsi con altro materiale regionale già in uso.
L'indice degli argomenti illustrati, che di seguito si riporta, corrisponde ai contenuti del
programma didattico elaborato per il modulo di insegnamento affidato al personale SIAN.
INDICE/PROGRAMMA
Prodotti fitosanitari: definizioni; Classificazione dei prodotti fitosanitari; Classificazione ed
etichettatura dei prodotti fitosanitari; Tossicologia umana; Primo soccorso; Prevenzione
intossicazioni: i DPI; Tossicità ambientale; Regolamentazione alla vendita; Normativa sui
pericoli da incidenti rilevanti e sulla sicurezza dei lavoratori; Trasporto, carico e scarico dei
prodotti fitosanitari; Uso e smaltimento dei prodotti fitosanitari; Sanzioni.
Il testo è realizzato in una forma grafica che visivamente consente di individuare differenti
aspetti nella consultazione: corsivo virgolettato: citazioni da normativa comunitaria, nazionale
o regionale; nero grassetto: normativa comunitaria, nazionale o regionale; blu grassetto:
parole chiave; viola: argomenti di approfondimento.
Al testo è abbinata una serie di slide realizzate in formato MS power point, con collegamenti
ipertestuali che rimandano a file di approfondimento in formato MS word. Le diapositive
possono essere utilizzate agevolmente come supporto didattico dai docenti del modulo
"sanitario" (personale sanitario dei SIAN).
E' stata infine prodotta una selezione di proposte di quiz a scelta multipla per la verifica
dell'apprendimento. Per ogni quesito sono possibili tre risposte, di cui una sola esatta.
PUBBLICAZIONI
• Argomenti di interesse sanitario per il rilascio del certificato di abilitazione alla vendita di
prodotti fitosanitari e relativi coadiuvanti - Art 23 DPR 290/2001 (ASL 17; ASL 18)
• Corso di formazione per venditori di prodotti fitosanitari (ASL16) - Corso di formazione
per venditori di prodotti fitosanitari (ASL19)
• Corso per venditori di prodotti fitosanitari e relativi coadiuvanti (ASL 10) - Guida al
corretto uso dei prodotti fitosanitari (Regione Abruzzo)
• Guida all'uso corretto dei prodotti fitosanitari (Regione Piemonte)
• Guida per i venditori di prodotti fitosanitari (Regione Veneto)
• Il manuale del commerciante di prodotti fitosanitari (Regione Emilia Romagna et al.)
• Metodologie per la sorveglianza sanitaria dei lavoratori esposti in agricoltura (ISPSL -
Dipatimento di Medicina del lavoro)
• Prontuario dei fitofarmaci (Muccinelli) ed. Edagricole, decima edizione - 2004.
477

Bruno Sona Filone tematico A1
Bio-sicurezza negli allevamenti suinicoli: verifica dell’attuale situazione,
valutazione e proposizione di un piano di adeguamento.
Asl 17
OBIETTIVI
Fotografia della reale situazione in tema di misure di profilassi diretta e biosicurezza
attualmente applicate, mediante controllo di un campione casuale di aziende suinicole;
valutazione dell’effettiva efficacia e della valenza sanitaria di tali misure sia in ambito della
singola azienda sia, soprattutto, nel contesto territoriale in cui la stessa è ubicata;
produzione di dati sul campione scientificamente e statisticamente corretti, che possano
essere successivamente utilizzati per poter elaborare correttivi e miglioramenti in modo
congruo ed efficace.
MATERIALI E METODI
Per motivi logistici la popolazione bersaglio è stata identificata nell'effettivo presente nel
territorio della sola A.S.L. 17 e non di tutta la Provincia di Cuneo, come inizialmente
preventivato. Tale adeguamento ha permesso una buona riduzione dei costi di realizzazione
del progetto senza peraltro incidere in modo significativo sull'esito dei risultati attesi. La
prima parte del lavoro ha visto l'attuazione di un campionamento casuale stratificato per
tipologia e classe di ampiezza delle aziende suinicole presenti su tale territorio. In merito alle
caratteristiche aziendali sono individuate quattro tipologie diverse:
• Ciclo Chiuso;
• Ciclo Aperto;
• Ingrasso;
• Altro (centro di selezione genetica, stalla di sosta, ecc.);
E' stata inoltre presa in considerazione un’ulteriore categoria di insediamenti identificati come
"allevamenti di tipo familiare per autoconsumo": si tratta di unità in cui è presente un numero
ridotto di capi (1 o 2 suini da ingrasso o 1 scrofa con relativa prole) destinati a non essere
commercializzati ma macellati e consumati in loco. In merito alle diverse tipologie gli
allevamenti risultano distribuiti sul territorio come riportato nella seguente tabella:
tipo A tipo B tipo C altro autoconsumo Tot.
ASL 17/1 Ser.Vet. Savigliano 184 12 59 4 5 264
ASL 17/1 Ser.Vet Fossano 138 13 52 2 39 244
ASL 17/2 Ser.Vet. Saluzzo 101 22 55 7 38 223
Tot. allevamenti 423 47 166 13 82 731
Per quanto riguarda gli allevamenti di tipo "intensivo" sono identificate, per ogni tipologia,
quattro classi diverse per ampiezza:
• con meno di 200 capi;
478

• da 201 a 500 capi;
• da 501 a 1000 capi;
• oltre 1000 capi.
I dati necessari relativi a tipologia e classe di ampiezza per il campionamento sono stati
ricavati dall'anagrafe suina del Servizio Veterinario dell'ASL 17. In considerazione del tempo
disponibile e delle risorse umane e materiali utilizzabili si è ritenuto di poter campionare il 5%
delle aziende per ogni categoria identificata per un totale di 37 allevamenti. E' stato eseguito
un sopralluogo preliminare in ogni singola azienda individuata, con rilevazione diretta dei dati
mediante compilazione di una apposita check-list composta da quattro schede relative a:
• dati generali dell’allevamento;
• biosicurezza interna;
• biosicurezza esterna;
• benessere animale.
Tale sopralluogo ha permesso l'acquisizione di documentazione cartacea e fotografica. Le
misure di profilassi diretta adottate sono state suddivise in tre gruppi:
1. misure di biosicurezza "minime", quelle cioè di cui ogni allevamento dovrebbe essere
dotato (recinzione, locale di isolamento e/o quarantena, adeguato sistema di lotta ai
roditori, materiale monouso per gli interventi in azienda e per eventuali visitatori,
disponibilità di idropulitrice a vapore ed idonei disinfettanti, contenitore per le carcasse
degli animali morti, ecc.);
2. misure di biosicurezza "standard" (accesso dei visitatori controllato, punto di disinfezione
degli automezzi in entrata/uscita, rampe di carico/scarico animali esterne, tutto pieno-tutto
vuoto nei singoli reparti, silos del mangime raggiungibili dall'esterno, stoccaggio carcasse
animali morti raggiungibile dall'esterno, controllo microbiologico dell'acqua di bevanda);
3. misure di biosicurezza "extra" (vaschette per la disinfezione delle calzature, uso di
schiumogeni-tensioattivi, controllo microbiologico del seme utilizzato in f.a.(*), controllo
chimico dell'acqua di bevanda, silos "dedicato" al mangime medicato, "zona filtro" fra le
porcilaie e le altre strutture aziendali, ecc.). (*) alla luce di quanto rilevato durante il
nostro lavoro il controllo microbiologico del seme, inizialmente valutato come misura
"extra", è stato successivamente inserito fra le procedure "standard".
La seconda fase della ricerca ha comportato l'elaborazione e la valutazione dei dati raccolti,
con eventuali integrazioni che si sono reputate necessarie. Ad ogni gruppo di misure è stato
attribuito un valore: 1 per ogni misura "minima", 2 per ogni misura "standard", 3 per ogni
misura "extra" adottata. La somma dei valori ha determinato un punteggio complessivo
teorico finale per ogni singola azienda, compreso fra 0 e 38. I valori rilevati sono stati
compresi fra 0 e 31.
RISULTATI
Lo studio ha evidenziato:
• gli allevamenti di proprietà sono generalmente gestiti in modo sufficiente, con attenzione
alle problematiche della prevenzione e del benessere;
• sta crescendo la consapevolezza che tali misure siano un mezzo per migliorare le
produzioni;
• alcune norme sono ancora viste come imposizioni e non come strumento produttivo;
• occorre prevedere una vigilanza continua soprattutto laddove la conduzione è delegata a
soggetti insensibili a tali problematice (soccide);
479

• generalmente la conoscenza della normativa è scarsa;
• in alcuni allevamenti, per ottenere un aumento delle produzioni, si sopperisce ai deficit
strutturali in tema di profilassi con l'implementazione delle misure di benessere (es.
riduzione della densità degli animali) e gestionali (TPITV, uso di particolari linee
genetiche, scelta dei fornitori, ecc). Ne deriva il fatto che non sempre i risultati in termini
di sanità animale sono correlabili alle misure di biosicurezza attuate.
RICADUTE PER IL SERVIZIO SANITARIO REGIONALE
Tutto il materiale iconografico ed i dati raccolti sono a disposizione del Servizio Sanitario
Regionale quale strumento per poter emanare linee guida o prowedimenti normativi in
materia di biosicurezza e prevenzione delle malattie infettive.
E' indispensabile che il servizio pubblico non si limiti ad una formale azione di controllo ma
fornisca attraverso personale specializzato il necessario supporto tecnico-professionale in
materia di gestione igienico-sanitaria degli allevamenti. La salvaguardia dello stato di salute e
di benessere degli animali sono dei "prerequisiti" per produzioni di elevato livello qualiquantitativo
in un contesto di compatibilità con le esigenze di salute pubblica.
480

Giovanni Succo Filone tematico C1
Nuovi percorsi diagnostici in rinologia pediatrica
Asl 2 - Dipartimento Chirurgia Generale e Specialistica
CONTESTO E RAZIONALE
Lo studio ha rappresentato la logica continuazione del Progetto regionale di Ricerca dal titolo
“comparazione di indagini rinologiche e di valori di inquinamento atmosferico in età
pediatrica”, proposto nel periodo compreso tra l’aprile 2003 ed il gennaio 2004 a 204 bambini
di età compresa fra tre e nove anni, residenti nella Provincia di Torino, in prossimità di
stazioni di rilevamento dei gas atmosferici predisposti dall’ARPA che presentassero
sintomatologia rinitica cronica superiore a tre settimane negli ultimi tre mesi. Tra il gennaio
2004 ed il dicembre 2004 è stato quindi possibile selezionare un ulteriore rilevante gruppo di
bambini (127) con analoga sintomatologia nei quali è stata operata una comparazione tra i dati
clinici rinologici ed i dati relativi all’inquinamento da agenti volatili outdoor.
OBIETTIVO
E’ stato quindi possibile offrire ad ulteriori 127 bambini “rinitici” un protocollo diagnostico
rinologico completo di I e II livello, al fine di giungere a precise conclusioni diagnostiche da
mettere a disposizione del Medico Pediatra Curante per l’impostazione di una scelta
terapeutica razionale.
METODI E RISULTATI
Come per la prima fase del progetto, i bambini sono stati suddivisi in categorie sulla base
dell’ubicazione della propria abitazione al fine di ottenere una stratificazione che ricalcasse la
suddivisione del territorio in siti (tipo A, B, C e D) diversi per quanto concerne la
concentrazione di inquinanti outdoors, sulla base dei dati forniti dall’ARPA. Questo al fine di
comparare i dati clinici (rinologici, allergologici e citologici) con i dati ARPA relativi
all’inquinamento rilevati in tre diverse aree residenziali:
1. Urbana, ad elevato tasso di inquinamento (siti ARPA B e C),
2. Suburbana a moderato tasso di inquinamento (sito D)
3. Rurale, a basso tasso di inquinamento (sito A).
Effettuato così l’inquadramento diagnostico è stato possibile inviare al Medico Pediatra
Curante i piccoli pazienti per l’impostazione della terapia, dopo aver inserito in un data base,
comune a tutti i Pediatri, i dati derivanti dalla visita.
A ciascuno dei “nuovi” bambini giunti alla nostra attenzione con sintomatologia rinitica
cronica è stato pertanto offerto il “pacchetto rinologico” diagnostico completo, comprendente
anamnesi, esame obiettivo otorinolaringoiatrico (rinoscopia anteriore e posteriore con fibre
ottiche flessibili pediatriche e rinocitogramma). Queste valutazioni, cosiddette di I livello,
sono state effettuate presso il Centro di Rinologia F. Bergadano attivo presso l’UOA di
Otorinolaringoiatria dell’ospedale Martini di Torino in un’unica seduta, sempre con accesso
diretto, con impegnativa del Pediatra di base, senza oneri aggiuntivi a carico del SSN né
dell’utente. Come per la prima parte dello studio, qualora se ne sia ravveduta l’opportunità
(per esempio in caso di positività per eosinofili al rinocitogramma, di anamnesi familiare
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positiva, di obiettività positiva per allergia) sono stati effettuati esami di II livello, come test
allergologici (Prick, PRIST, RAST, fino a test di provocazione nasale specifici ed aspecifici).
Considerato che tra gli obiettivi di questo secondo studio c’era quello di consolidare suddetto
algoritmo diagnostico aggiungendo esami di III livello, sono stati introdotti il test della
clearance muco-ciliare e la rinomanometria, ovviamente solo nei casi in cui ci si trovasse di
fronte a pazienti con sintomatologia persistente e ribelle. Il test della clearance che com’è noto
consente di valutare il grado di compromissione morfo-funzionale dell’epitelio respiratorio, è
risultato negativo o rallentato nella pressoché totalità della popolazione esaminata, a conferma
del fatto che nei piccoli pazienti, e la fisiologica ipertrofia del tessuto adenoideo e l’aumento
della viscosità del muco, determinano un’impropria funzione mucociliare. La rinomanometria
è stata effettuata soprattutto nei piccoli pazienti non collaboranti (cui non è stato quindi
possibile eseguire la fibroscopia e visualizzare interamente le fosse nasali), è stato possibile
esprimere in termini quantitativi l’esistenza di un’insufficiente pervietà nasale, totale o
limitata ad una singola fossa. Con l’analisi della curva rinomanometrica, eventualmente unita
a semplici test di dilatazione meccanica del vestibolo nasale o di instillazione di
vasocostrittori si è potuto localizzare un ostacolo a livello del vestibolo nasale, della fossa
nasale o del rinofaringe.
Al termine dello Studio sono state quindi correttamente classificate le forme rinitiche
nell’ambito delle seguenti varianti:
A. rinite cronica infettiva: 105
B. rinite infiammatoria allergica: 31
C. NARES: 10
D. rinite infettiva da ipertrofia adenoidea: 110
E. rinite cronica infiammatoria non infettiva: 46
F. altre forme di rinite: 39
I dati raccolti sono stati quindi incrociati con i dati relativi all’inquinamento atmosferico
pubblicati dall’ARPA e come per la prima parte dello studio si è evidenziato un trend di
maggiore frequenza di forme rinitiche croniche tipo A, D, E nei bambini residenti in
prossimità dei siti ARPA tipo B e C, caratterizzati da un più elevato tasso di inquinamento
atmosferico. Non sono state riscontrate differenze di concentrazione per forme rinitiche tipo
B, C, F nei bambini residenti pressi i siti con diverso tasso di inquinamento. Il compito di
impostare il protocollo terapeutico è stato demandato al Pediatra ed i risultati sono in continuo
monitoraggio e mediante follow-up e per mezzo di ulteriori indagini in caso di
persistenza/recrudescenza della sintomatologia.
L’obiettivo raggiunto è stato quello di aggiungere un dato, nella fattispecie il peso
dell’inquinamento volatile outdoor, nel complesso di informazioni necessarie al corretto
inquadramento diagnostico e nella valutazione degli outcomes terapeutici della rinite cronica
in età pediatrica.
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Nicola Surico Filone tematico A4
Ipotiroidismo subclinico da carenza iodica in gravidanza. Valutazione
nella popolazione novarese
Università “A. Avogadro” del Piemonte Orientale
Dipartimento di Scienze Mediche
CONTESTO E RAZIONALE
Come dimostrato da molti studi, condotti soprattutto negli ultimi trent’anni, lo stato ormonale
della tiroide materna gioca un ruolo fondamentale nel determinare il corretto sviluppo
neuropsichico del nascituro. Un’associazione causale tra l’ipotiroidismo in gravidanza e lo
scarso sviluppo cognitivo del bambino è stata posta sulla base di osservazioni di alcuni Autori
che hanno fatto emergere una correlazione inversa tra la gravità dell’ipotiroidismo materno,
come evidenziato da valori di TSH superiori al 98° percentile della normale popolazione, ed il
quoziente intellettivo nei figli di queste donne. E’ altresì emerso come non siano solo le
condizioni di ipotiroidismo clinicamente manifesto a costituire un rischio per l’esito della
gravidanza (aumentando queste la percentuale di morte fetale tardiva ed altre complicanze
ostetriche) e per il futuro sviluppo neuropsichico del bambino, ma anche gli stati di
ipotiroidismo subclinico, ossia quelle condizioni in cui la gravida, pur essendo asintomatica,
ha valori di tireotropina superiori alla norma. Tali considerazioni hanno avvalorato le
motivazioni, già poste in precedenza, in favore di uno screening routinario del TSH, al fine di
migliorare l’esito della gravidanza ed il benessere della madre. Le due cause principali di
ipotiroidismo subclinico nel corso della gestazione sono rappresentate dai disturbi
autoimmuni della tiroide materna e dalla carenza di iodio, che colpisce entrambe le funzioni
tiroidee materna e fetale: quest’ultima ci è sembrata di particolare interesse da indagare, dal
momento che il Novarese è una zona endemica per essa.
METODI E RISULTATI
Abbiamo pertanto studiato un totale di 676 gravide, con lo scopo di analizzare i loro tassi
ematici di TSH per valutare l’eventuale presenza di disturbi tiroidei in stato subclinico con
una frequenza tale da giustificare l’impostazione futura di programmi di screening e di
prevenzione volti a ridurre l’incidenza delle complicanze materno-fetali che ne possono
conseguire. Sono state escluse le pazienti con precedenti tireopatie note (es. ipo- od
ipertiroidismo già presenti prima della gravidanza) e quelle in terapia con farmaci che
potessero influenzare la funzione tiroidea (es. neurolettici - clorpromazina, aloperidolo;
antiaritmici - amiodarone; glucocorticoidi; antiemetici - metoclopramide; mezzi di contrasto,
etc.).
Tutte le donne erano residenti in Novara o nelle zone afferenti alla sua provincia ed avevano
dato il loro consenso all'inclusione nello studio. In 14 delle 676 gravide il TSH non si è potuto
misurare, lasciando così un totale di 662 donne (97.93%) per le quali i risultati sono stati
disponibili. In prima giornata successivamente al parto (spontaneo o taglio cesareo), insieme
agli esami di routine è stato dosato dunque il TSH mediante metodiche radioimmunometriche,
considerandolo nella norma se compreso nel range 0.2-3.5 mU/L. Si è considerato che una
donna avesse un disturbo tiroideo subclinico nel caso in cui avesse un valore di TSH < 0.2 o >
3.5 mU/L. Per quanto riguarda l'analisi statistica dei dati, per i valori di TSH considerati sono
stati calcolati i parametri statistici di base (media, mediana, campo di variazione, varianza,
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deviazione standard, asimmetria standard ed accentramento standard) e sono stati applicati tre
tests statistici per valutare se la distribuzione normale fosse appropriata per descrivere la
popolazione in studio (chi-quadro, Kolmogorov-Smirnov, EDF).
E’ emerso come solo 9 delle 662 donne per le quali i risultati sono stati disponibili (1.36%)
avessero valori di TSH < 0.2 mU/L, contro le 85 (12.8%) che li avevano invece > 3.5 mU/L.
Dal momento che il valore di P nei tests condotti è sempre inferiore a 0.01, possiamo
affermare che la popolazione in oggetto non presenti una distribuzione normale dei valori di
TSH con una confidenza del 99 %, per cui risulta essere una popolazione a maggior incidenza
di ipotiroidismo subclinico.
Ci troviamo pertanto d’accordo con la proposta, avanzata da alcuni Autori che hanno condotto
studi analoghi in vari Stati Europei, secondo la quale tutte le donne dovrebbero iniziare ad
integrare la loro dieta abituale, nel corso della gravidanza e dell’allattamento, con 200-300
mg/die di iodio, sottoforma di tavolette di KI o KIO3 o composti vitaminici-minerali
(sconsiglieremmo invece il sale iodato, usato come strategia preferenziale nella maggior parte
dei programmi di salute pubblica volti alla correzione dei disturbi da carenza di iodio, poiché
questo non è il vettore ideale in gravidanza e durante l’allattamento, a causa della necessità di
limitare l’apporto di sale), previa esclusione, attraverso il dosaggio degli autoanticorpi antitiroide,
di un disturbo autoimmune, nel qual caso la somministrazione di iodio potrebbe
potenziare il disturbo stesso; in tal caso, l’approccio terapeutico più indicato sarebbe infatti
senz’altro la somministrazione di tiroxina.
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Luca Tamagnone Filone tematico C1
Semaforine e loro recettori come obiettivo diagnostico e terapeutico nel
trattamento dei tumori umani
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Oncologiche
CONTESTO E RAZIONALE
Le metastasi sono la causa piu’ frequente di morte per tumore. Pertanto, lo studio dei
meccanismi della progressione invasiva e metastatica dei tumori e’ un obiettivo primario della
ricerca di base e clinica, al fine di migliorare la valutazione prognostica e soprattutto allo
scopo di trovare nuove terapie efficaci. E’ noto che la progressione dei tumori e’ un processo
a tappe multiple, che inizia con la crescita del tumore in situ, continua con l’acquisizione di
invasivita’ locale, seguita dalla disseminazione e la crescita in sedi lontane. Mentre numerose
alterazioni genetiche sono state implicate nelle prime fasi della progressione tumorale, sono
poche quelle che siano state associate alla progressione verso la metastasi. Con questo studio
ci si proponeva di studiare il potenziale ruolo nella progressione neoplastica di uno specifico
gruppo di geni, codificanti le Semaforine e i loro recettori. Le semaforine sono una grande
famiglia di segnali molecolari coinvolti nel controllo della migrazione cellulare, del
differenziamento, e di molte altre funzioni biologiche; i loro recettori sono le plexine e le
neuropiline. La semaforina 4D e il suo recettore specifico PlexinaB1 attivano il programma di
crescita invasiva ed angiogenesi mediato dalla tirosina chinasi MET. Per altre semaforine si
sospetta invece un ruolo onco-soppressore: ad esempio, sono state osservate frequenti perdite
di eterozigosita’ (LOH) in tumori polmonari non a piccole cellule dei geni Sema3B e Sema3F.
Infine, la Sema3A agisce come regolatore dell’angiogenesi.
METODI E RISULTATI
Si e’ studiato il livello di espressione della PlexinaB1, il recettore della Sema4D che associa
Met e media la crescita invasiva di cellule tumorali in vitro, in un ampio spettro di tumori
umani (in collaborazione con il Prof. G. Valente, Universita’ del Piemonte Orientale).
Lo studio e’ stato condotto su campioni fissati e inclusi in paraffina. I tumori sono stati
studiati con la tecnica della immunoistochimica, utilizzando tra l’altro un anticorpo diretto
contro la Plexina-B1 ottenuto nel nostro laboratorio del proponente (EC-3).
Dall’analisi e’ emerso che l’espressione di PlexinaB1 e’ elevata in alcuni tipi di tumori (ad
esempio carcinoma mammario e carcinoma prostatico) ma non si e’ osservata una
significativa correlazione tra il livello di espressione e il grado di malignita’ del tumore. Non
e’ stato possibile studiare l’espressione di altre semaforine o loro recettori per la non
disponibilita’ di anticorpi validi. Proprio per questo motivo, abbiamo avviato la produzione di
anticorpi anti-peptide diretti contro PlexinaB2, Sema4D e PlexinaD1.
Per verificare il ruolo patogenetico in vivo dei geni allo studio e’ stato impiegato un modello
sperimentale di progressione neoplastica, costituito dal trapianto di cellule di carcinoma
mammario umano MDA-MB435 o di carcinoma bronchiale A549 in topi nonimmunocompetenti.
Queste cellule tumorigeniche sono state tradotte ex-vivo con vettori
lentivirali che inducono una aumentata espressione di una ampia serie di semaforine o
plexine, al fine di studiare come si modifica il loro comportamento tumorigenico. Dopo una
opportuna caratterizzazione in vitro, queste verranno introdotte a livello sottocutaneo in topi
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nudi e lo sviluppo di tumori locali e’ stato valutato lungo un periodo di 6-8 settimane. Al
termine dell’eseprimento, dopo il sacrificio degli animali, si sono valutate le caratteristiche
morfologiche e molecolari dei tumori primitivi (incluso indice di proliferazione, apoptosi,
neoangiogenesi) e delle eventuali metastasi ematogene a livello polmonare. In alcuni casi
abbiamo osservato che la semaforina induce una ridotta velocita’ di accrescimento del tumore
(es. Sema3B, articolo in preparazione). Al contrario, si e’ talora osservata una aumentata
invasivita’, accompagnata dalla formazione di molte metastasi a distanza (Sema3E;
Christensen et al., 2005 e articolo in preparazione).
La cosa che ci ha sorpreso e’ che l’espressione di queste semaforine nelle cellule tumorali non
produceva differenze di comportamento quando queste ultime venivano analizzate in coltura,
ma solo dopo il loro impianto nel modello animale. Questa osservazione suggerisce che le
semaforine prodotte dalle cellule tumorali abbiano la capacita’ di regolare il complesso di
eventi che costituiscono la reazione tissutale al tumore. Questi comprendono ad esempio: il
reclutamento di leucociti nella sede del tumore e la neo-angiogenesi tumorale. Lo studio di
questi processi nei campioni tumorali e’ in corso. Un altro risultato interessante e’ quello
ottenuto con la espressione di una semaforina solubile, la Sema3A in cellule metastatiche
A549 derivate dal carcinoma polmonare. Abbiamo osservato che il tumore primitivo risultava
ridotto in dimensioni, anche se non ai livelli indotti da altre semaforine analoghe. Questi dati
sono coerenti con uno studio indipendente condotto in cellule di mesotelioma (Catalano et al.,
2004). La cosa piu’ interessante e’ pero’ che l’espressione di questa semaforina in cellule
tumorali ha eliminato quasi completamente l’insorgenza di metastasi a distanza nel nostro
modello sperimentale. Ulteriori studi sono in corso per validare il potenziale terapeutico di
questa molecola (o di molecole derivate) nel bloccare la progressione neoplastica.
CONCLUSIONI
La PlexinaB1 e’ espressa in un sottogruppo di tumori umani; tuttavia non e’ emersa una
correlazione con il grado di malignita’ o la tendenza a metastatizzare. Si ipotizza dunque un
altro meccanismo alla base dell’attivazione di questo recettore. La espressione di Sema3E, in
modelli sperimentali animali, sembra essere responsabile di un comportamento altamente
invasivo e metastatico dei tumori mammari. Il meccanismo responsabile e’ attualmente allo
studio. La Sema3A sembra agire come inibitore del processo invasivo metastatico in un
modello sperimentale di tumorigenesi.
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Martina Tarantola Filone tematico A6
Studio di alcuni parametri correlati allo stress nel vitellone
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Produzioni Animali, Epidemiologia ed Ecologia
MATERIALI E METODI
Il progetto di ricerca è iniziato nel mese di giugno 2004, con un primo prelievo di sangue (T1)
ai 32 vitelloni di razza piemontese stabulati in 4 aziende diverse scelte in base sia alla loro
vicinanza/lontananza dal macello sia dal tipo di stabulazione (animali tenuti legati alla catena
o liberi nei box.). Sono stati quindi formulati dei questionari con domande relative ai
parametri strutturali dell’aziende, alla gestione dell’animale, all’alimentazione. Sono stati
eseguiti dei prelievi di sangue dopo sei mesi (T2) e a fine ciclo, a circa 18 mesi di età, ovvero
prima del trasporto (T3) e al loro arrivo al macello (T4). E’ stata valutata la funzionalità del
sistema immunitario mediante i test di migrazione leucocitaria e la misurazione della
concentrazione sierica di IgG; quindi lo stress ossidativo, utilizzando il test TBARS (dosaggio
dell’ossidazione delle LDL con sostanze reattive all’ac. tiobarbiturico) e il test di Greiss
(concentrazionei plasmatica dei nitriti). E’ stato inoltre valutato, con metodiche RIA, il
dosaggio di cortisolo e progesterone. Al momento della macellazione sono stati prelevati
campioni di timo per la valutazione di eventuali alterazioni morfopatologiche.
RISULTATI
Concentrazione ematica di cortisolo(ng/ml)
Animali allevati a stabulazione libera: non sono emerse differenze statisticamente
significative tra T1 (4.6 ± 0.6) T2 (4.5 ± 0.9), e T3 (4.0 ± 0.7) mentre in seguito a trasporto T4
i livelli di cortisolo sono aumentati in modo statisticamente significativo (9.2 ± 1.0), P< 0.003
(Student’s t test). Animali allevati a stabulazione fissa: i livelli sierici di cortisolo sono
risultati aumentare in modo statisticamente significativo a T2 6.7 ± 0.9 e T3 6.7 ± 0.8 rispetto
a T1 3.0 ± 0.6, P< 0.05 (Tukey Multiple Comparison test). Anche in questo caso il trasporto
degli animali al macello ha determinato un aumento statisticamente significativo dei livelli
ematici dell’ormone (T4 20.6 ± 1.2.), P< 0.0001 (Student’s t test). Per quanto riguarda i
risultati ottenuti prima del trasporto, si può dire che tra animali allevati a stabulazione libera e
fissa esistono differenze statisticamente significative: liberi: 4.0 ± 0.7, fissi: 6.7 ± 0.8, P< 0.02
(Student’s t test). Tale differenza è stata inoltre confermata in seguito al trasporto degli
animali al macello, liberi: 9.2 ± 1.0, fissi: 20.6 ± 1.2, P< 0.0001 (Student’s t test).
Concentrazione ematica di progesterone(ng/ml)
Animali allevati a stabulazione libera: i livelli ematici di progesterone si sono rivelati
relativamente costanti con un’unica variazione statisticamente significativa a T3: T1 AB 0.12
± 0.02, T2 A 0.19 ± 0.03, T3 B 0.091 ± 0.025, A vs B P= 0.02 (Tukey Multiple Comparison
test).Negli stessi animali le concentrazioni di progesterone hanno subito un aumento dopo il
trasporto che tuttavia non si è rivelato statisticamente significativo. Animali allevati a
stabulazione fissa: l’unica differenza statisticamente significativa individuata è stata la
diminuzione dei livelli di progesterone a T3: T1 AB 0.09 ± 0.03, T2 A 0.12 ± 0.02, T3 B 0.05
± 0.002. A vs B P= 0.02 (Tukey Multiple Comparison test). Tuttavia occorre sottolineare la
variabilità dei dati come dimostrato dai valori di SEM. Il trasporto al macello ha determinato
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un incremento statisticamente significativo dei livelli ematici di progesterone analogamente a
quanto osservato per il cortisolo: T3 0.05 ± 0.002, T4 0.39 ± 0.08, P= 0.0002 (Student’s t
test). Paragonando infine i livelli ematici di progesterone prima del trasporto tra soggetti a
stabulazione libera e fissa emerge che questi ultimi presentano concentrazioni
tendenzialmente inferiori di ormone, benché tale differenza non appaia statisticamente
significativa. Il trasporto sembra invece indurre effetti maggiori nel gruppo degli animali
allevati a stabulazione fissa in cui l’incremento di progesterone risulta significativamente
maggiore rispetto agli animali a stabulazione libera: Liberi:0.12 ± 0.03, fissi: 0.39 ± 0.08 P=
0.01 (Student’s t test).
Misurazione della concentrazione sierica delle IgG: non sono state riscontrate differenze
statisticamente significative.
Chemiotassi: non sono state rilevate differenze statisticamente significative, eccetto per i
soggetti in stabulazione fissa rispetto ai soggetti a stabulazione libera, prima del trasporto;
questi ultimi hanno presentato una maggiore percentuale di migrazione (P

Corrado Tarella Filone tematico C1
Lunghezza del telomero come marker di istopatogenesi nelle patologie
linfoproliferative mature della serie
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale
CONTESTO E RAZIONALE
I telomeri sono le estremità fisiche dei cromosomi. Essi, fisiologicamente, subiscono un
progressivo accorciamento nel corso delle ripetute divisioni cellulari, fino al raggiungimento
di una lunghezza che innesca un meccanismo di senescenza cellulare promuovente un
progressivo arresto proliferativo. La maggior parte delle cellule tumorali, invece, dopo un
iniziale marcato accorciamento telomerico, riattivano l’enzima telomerasi, mantenendo
lunghezze telomeriche che permettono loro di sfuggire alla senescenza e di crescere
illimitatamente. Nei tumori ematologici la lunghezza telomerica (TL) e l’attività telomerasica
(TA) riflettono la storia replicativa del linfocita B dal quale derivano, risultando quindi molto
eterogenei.
METODI E RISULTATI
Sulla base di queste premesse ci siamo prefissati i seguenti obiettivi ottenendo i risultati sotto
riportati.
1. Valutare eventuali differenze di TL tra i vari sottotipi di NHL.
A tale scopo abbiamo condotto uno studio volto a valutare la lunghezza dei frammenti di
restrizione telomerica (TRF) su 123 campioni di sangue periferico, midollare o linfonodi,
ottenuti da 117 pazienti affetti dalle più comuni patologie linfoproliferative. Nel complesso, la
popolazione in esame si è dimostrata estremamente eterogenea in termini di TL, con un TRF
medio di 6170 bp e una deviazione standard di ±1985 bp. La mediana dei TRF nell'intera
popolazione in studio è risultata essere di 6060 bp (1896-11200 bp). Non sono state osservate
correlazioni significative tra la TL e le caratteristiche demografiche, i parametri clinici o i
parametri biologici.
2. Confrontare la lunghezza dei frammenti terminali di restrizione dei telomeri (TRF)
con il tipo istologico di linfoma.
Abbiamo osservato marcate differenze in termini di TL tra i diversi sottotipi istologici. Il
linfoma follicolare (FL), il linfoma di Burkitt (BL) e il linfoma diffuso a grandi cellule
(DLBCL), presentano i più alti valori di TRF (7383, 9471 e 7789 bp, rispettivamente). Al
contrario, la leucemia linfatica cronica (CLL) e il linfoma mantellare (MCL) presentano
telomeri corti (3582, 4346 bp) con una lunghezza spesso al limite della soglia della
senescenza. Valori di TRF intermedi sono presenti nel linfoma della zona marginale (MZL)
(5969 bp) e nel mieloma multiplo (MM) (6283 bp). Confrontando la TL dei linfomi indolenti
trattati convenzionalmente (sopravvivenza mediana superiore a 3 anni: CLL, FL, MZL) con i
sottotipi più aggressivi (sopravvivenza mediana inferiore a 3 anni: BL, DLCL, MCL) non
abbiamo notato significative differenze di lunghezza del DNA telomerico a favore dei primi.
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Pertanto le variazioni di lunghezza non possono essere attribuite ad una più marcata cinetica
proliferativa, come ipotizzato in particolare da studi condotti sulla CLL.
3) Valutare se la TL e la TA correlino con l'origine istologica rispetto al centro
germinativo (GC).
Data l'elevata eterogeneità in termini di esperienza del GC in diversi sottotipi istologici
(inclusi MCL, CLL, DLCL e MZL) abbiamo voluto osservare se esistesse un'associazione tra
origine rispetto al GC e TL. La derivazione dal centro germinativo è stata valutata mediante
l’approccio a tutt’oggi più affidabile, ovvero la presenza o l’assenza di mutazioni somatiche
nella sequenza della regione variabile riarrangiata delle immunoglobuline, che distingue le
cellule “GC-inexperienced” e “GC-experienced”. Queste ultime vengono poi suddivise in
“GC-derived” e “post GC-derived” mediante la ricerca delle “ongoing somatic mutations”
(OSM),effettuata mediante valutazione della variabilità intraclonale del riarrangiamento
clonale delle immunoglobuline. Effettivamente, le cellule di linfomi originati dal GC (BL, FL,
DLBCL) possiedono telomeri molto più lunghi rispetto ai tumori non derivanti dal GC (CLL,
MCL, MM). Questa osservazione suggerisce come nella linfomaigenesi di questi tumori
avvenga solo una minima erosione telomerica, contenuta dalla spiccata TA della cellula
bersaglio dell'evento trasformante. Questa evidenza avvalora l'ipotesi che la cellula interessata
dall'evento tumorigenico sia telomerasi positiva ”ab initio”, e che quindi nel corso della
tumorigenesi nel GC, non sia richiesta la riattivazione di questo enzima. Si può quindi
ipotizzare che all'interno del GC sia fisiologicamente inattivo un importante checkpoint
antineoplastico, che spiegherebbe la maggior incidenza di tumori originanti dal GC rispetto a
quelli non originanti dal GC.
RICADUTE E POSSIBILI SVILUPPI
La lunghezza del telomero costituisce pertanto un importante marcatore di istopatogenesi
nelle malattie linfoproliferative della serie B. Da un lato l’analisi delle TL può diventare un
utile strumento prognostico e di orientamento terapeutico, in quanto consente di fornire in
modo semplice ed efficace importanti dati sull’istopatogenesi dei disordini linfoproliferativi.
Dall’altro i sottotipi di linfoma a telomero molto corto da noi identificati rappresentano un
attraente bersaglio per l’induzione della senescenza farmacologica nelle cellule tumorali, un
meccanismo antitumorale oggetto di estesa valutazione preclinica. Alla luce dei dati fino a
questo momento ottenuti, attualmente stiamo perseguendo due obiettivi di ricerca:
• verificare il valore prognostico della lunghezza del telomero nella CLL, nel linfoma
diffuso a grandi cellule e nel mieloma multiplo.
• Studiare l’efficacia di un inibitore non nucleosidico della telomerasi, il BIBR1532
(Boehringer), su linee cellulari di patologie linfoproliferative caratterizzate da differente
lunghezza del DNA telomerico
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Pierpaolo Terragni Filone tematico C1
ARDS e ventilazione oscillatoria ad alta frequenza nella prevenzione
della VILI: analisi delle immagini TAC
ASO S. Giovanni Battista – S.C.U. Anestesia e Rianimazione 3
METODI E RISULTATI
Nell'ambito del progetto “ARDS e ventilazione oscillatoria ad alta frequenza nella
prevenzione della VILI: analisi delle immagini TC” (TER/001) negli ultimi due anni sono
stati trattati presso il Servizio di Terapia Intensiva diretta dal Prof. V.M. Ranieri dell'Ospedale
San Giovanni Battista di Torino più di 60 pazienti affetti da ARDS. Parte dei suddetti pazienti
provenivano da reparti medico/chirurgici dello stesso Ospedale San Giovanni Battista; alcuni
invece sono afferiti al nostro servizio essendo la Terapia Intensiva diretta dal Prof. Ranieri
uno dei centri di riferimento a livello nazionale per il trattamento dell'insufficienza
respiratoria acuta ed in particolare dell'ARDS. La mortalità di questa popolazione è risultata
essere in linea con quella dei migliori centri a livello internazionale grazie anche al
trattamento ventilatorio individualizzato basato sullo studio dei parametri di meccanica
respiratoria e di morfologia del parenchima polmonare tramite l'impiego della TC torace.
Molti dei pazienti affetti da ARDS e trattati presso il nostro centro hanno beneficiato di
trattamenti più o meno prolungati con ventilazione oscillatoria ad alta frequenza (HFO).
Nonostante l'elevato grado di criticità dei casi clinici in esame lo studio TC del parenchima
polmonare è stato eseguito su 3 pazienti grazie alla disponibilità e competenza dei colleghi
radiologi diretti dal Prof. Davini. Particolarmente in un caso, trattato con ventilazione
differenziale con HFO per più di trenta giorni, l'analisi TC ha permesso di modificare
sostanzialmente il trattamento ventilatorio del paziente contribuendo sicuramente a
determinarne il netto miglioramento delle condizioni cliniche e la dimissione dalla Terapia
Intesiva e dall'Ospedale.
Da questa esperienza unica nel suo genere è nata una pubblicazione [1] su una rivista
internazionale ad elevato impact factor che è servita da spunto ad altri gruppi di lavoro per
intraprendere strategie terapeutiche fino ad allora difficilmente applicabili clinicamente anche
se ben supportate sul piano teorico; si tratta infatti del primo case report di ventilazione
differenziale dell'adulto in cui i parametri ventilatori sono stati definiti in base ai dati derivati
dall'esame TC. Sulla scia dei confortanti risultati ottenuti dai primi pazienti il protocollo di
studio è stato esteso a tutti i pazienti affetti da ARDS ricoverati presso la nostra divisione. In
questo breve lasso di tempo sono stati così studiati circa 25 pazienti tramite l'analisi TC e i
relativi parametri bioumorali di flogosi (mediante l'analisi delle citochine pro ed
antinfiammatorie) sia locali (su lavaggio broncoalveolare) che sistemici su plasma.
I risultati ottenuti sono ora in corso di analisi statistica sia da parte nostra sia da parte di altri
gruppi europei che si sono dimostrati sin dall'inizio, in base ai dati preliminari, estremamente
interessati al protocollo da noi adottato e coi quali la collaborazione è tuttora aperta. In sintesi
dai risultati del progetto “ARDS e ventilazione oscillatoria ad alta frequenza nella
prevenzione della VILI: analisi delle immagini TC” è risultato che il trattamento ventilatorio
secondo il protocollo NIH, che attualmente costituisce il gold standard del trattamento nei
pazienti affetti da ARDS, non è completamente protettivo in tutti i pazienti (riscontro di segni
d'iperinflazione alla TC e rialzo dei valori di IL 6 su BAL ). Questa sarebbe la prima evidenza
presente in letteratura in tal senso e spingerebbe ulteriormente a cercare di migliorare il
trattamento e quindi migliorare l'outcome della popolazione in esame. Inoltre i risultati di
491

questo progetto sono stati presentati, suscitando notevole interesse, sia al congresso europeo
(ESICM di Amsterdam 2005) sia a quello italiano (SIAARTI) di Terapia Intensiva [2-3].
PUBBLICAZIONI
1. Terragni P, Rosboch G, Corno E, Menaldo E, Tealdi A, Borasio P, Davini O, Viale A,
Ranieri V: Indipendent High Frequency Oscillatory Ventilation in the management of
asymmetric Acute Lung Injury. Anesth Analg 2005; 100: 1793-1796
2. Terragni P, Rosboch G, Tealdi A, Menaldo E, Corno E, Bonetto C, Davini O, Ranieri
VM: ”CT-SCAN EVIDENCE OF HYPERINFLATION DURING NIH PROTECTIVE
STRATEGY VENTILATION IN ARDS PATIENTS “Int Care Med 2005; 31: S1; 274.
3. G.L. Rosboch, A. Tealdi, P. Terragni, E. Menaldo, E. Corno, C. Bonetto, D.M. Locane, F.
Guerriero, O. Davini, V.M. Ranieri. “Iperinflazione dinamica durante ventilazione
secondo protocollo NIH in pazienti affetti da ARDS. Studio TC”; Minerva
Anestesiologica 2005; Vol 71, Suppl. 2 al N° 10.
492

Luciana Tessitore Filone tematico A2
p27 Kip1 , un nuovo marcatore delle lesioni preneoplastiche colorettali
Università del Piemonte Orientale “Amedeo Avogadro”
Dipartimento di Scienze Chimiche, Alimentari, Farmaceutiche e Farmacologiche
OBIETTIVI
Abbiamo focalizzato il nostro studio sul ruolo della p27 Kip1 e delle lesioni preneoplastiche che
sono considerate predittive per lo sviluppo del carcinoma colorettale. La p27 Kip1 è un inibitore
del complesso ciclica-cinasi (CDKI) considerata un oncosoppressore poiché è frequentemente
inattivato nei tumori umani in seguito ad alterazioni post-trascrizionali e raramente a
delezione del gene. Abbiamo selezionato la p27, CDKI della famiglia Cip/Kip, per il nostro
studio perchè topi KO per la p27 Kip1 e non per la p21 sviluppano iperplasia in vari organi e
tumori ipofisari e la sovraespressione della p27 in linee cellulari di carcinoma mammario è
più citotossica della p21. In particolare, abbiamo valutato i livelli di espressione e la
localizzazione intracellulare della proteina p27 nella lesione preneoplastica colorettale e li
abbiamo confrontati con l’espressione e la localizzazione della proteina nella mucosa distante
dalla lesione preneoplastica.
METODI E RISULTATI
Le nostre analisi sono state effettuate su campioni ottenuti da ratti maschi F344 sottoposti
inizialmente ad un protocollo di cancerogenesi, il quale prevede la somministrazione sottocute
di due dosi da 150mg/Kg di 1,2-dimetilidrazina (DMH) a distanza di una settimana e in
seguito ad un regime dietetico arricchito di AIN 76 e acqua ad libitum. Dopo sedici settimane
dal trattamento con DMH i topi sono stati sacrificati per valutare la presenza di foci di cripte
aberranti (ACF) e foci depleti di mucine (MDF). Abbiamo condotto le nostre analisi su 30
ACF e 30 MDF e sulla corrispettiva mucosa sana dello stesso animale. I dati relativi alla
proteina nucleare e citoplasmatica sono presentati come percentuale dell’espressione della
p27 Kip1 in tutte le cellule esaminate (ACF o MDF o mucosa sana).
In particolare, la p27 Kip1 è espressa esclusivamente nel nucleo degli MDF nell’11± 0,8% delle
cellule, è citoplasmatica nel 2,0 ± 1,1% ed è sia nucleare che citoplasmatica nel 2,3 ± 0,8%. I
valori nella mucosa sana sono: 27,5±2,0% per la p27 Kip1 nucleare, il 3,0 ± 1,2% per la p27 Kip1
citoplasmatica e il 8,0 ± 0,6% per la proteina sia nucleare che citoplasmatica. Negli ACF la
proteina è localizzata nel nucleo nel 8,2 ± 01,1%, nel citoplasma nel 2,4 ± 0,6% e sia nucleare
che citoplasmatica nel 5,0 ± 1,6% mentre nella mucosa sana la p27 è espressa a livello
nucleare nel 32,9 ± 2,3%, esclusivamente nel citoplasma nel 2,1 ± 0,65%, e sia nel nucleo che
nel citoplasma nel 12 ± 0,3%. Abbiamo in seguito analizzato l’espressione di altri inibitori del
complesso ciclina cinasi (CDKI), la p21 e la p16 INK4 e l’abbiamo confrontata con quella della
p27.
La proteina p21 Cip1 appartiene alla famiglia degli inibitori universali Cip/Kip e in determinate
situazioni è in grado di inibire l’apoptosi mediata da prostaglandina-A2 e Fas. La p21 Cip1 si
riduce nel cancro al colon di tipo sporadico e nelle cellule tumorali non polipose (HNPCC)
che sopravvivono alla terapia radiante ma non nei tumori ereditari colorettali. La mancanza di
espressione di p p21 Cip1 è associata ad un deficit del meccanismo di riparazione del DNA in
una linea cellulare di tumore al colon. Abbiamo preso in considerazione 5 campioni di ACF e
493

5 di MDF per valutare la variazione dei livelli di espressione tra questi due tipi di lesioni
preneoplastiche e tra la lesione e la corrispondente mucosa sana. I dati ottenuti dimostrano che
la p21 è espressa negli MDF a livello nucleare nel 23,6±10,7%, a livello citoplasmatico nel
0,5±0,7% e a livello nucleare/citoplasmatico nel 4,4±3,9%, mentre nel tessuto sano
corrispondente è espressa un 28,6±17,6% a livello nucleare, un 1,6±1,5% a livello
citoplasmatico e un 3,0±2,4% a livello nucleare e citoplasmatico. Negli ACF si valuta un
21,1±15,7% di p21 nucleare, un 3,2±3,8% di proteina citoplasmatica e un 1,8±3,0% di
proteina localizzata sia nel nucleo che nel citoplasma. Nella mucosa sana è espresso un
30,8±21,0% di p21 nucleare, un 0,6±1,3% di proteina citoplasmatica e un 3,9±4,9% di p21 a
livello nucleare e citoplasmatico.
La proteina p16 INK4 è un membro della famiglia INK4 ed inibisce specificamente le cinasi Cdk
4 e Cdk6. Il gene p16INK4a è frequentemente inattivato in molti tumori umani mediante
delezione omozigotica, mentre nel carcinoma colorettale mediante un meccanismo
epigenetico, l'ipermetilazione del DNA. Abbiamo valutato l’espressione della p16 INK4 nelle
lesioni preneoplastiche colorettali, in particolare, in 9 MDF, in 11 ACF e nella corrispettiva
mucosa sana. I dati ottenuti dimostrano che negli MDF la p16 è localizzata nel nucleo nel
29,7±13,7%, a livello del citoplasma nel 1,4±1,96% e sia a livello nucleare che citoplasmatico
nel 2,4±2,7% dei casi. Se confrontiamo questi dati con la mucosa sana osserviamo che la p16
è espressa nel 24,6±11,9% a livello nucleare, nel 1,05±1,5% a livello citoplasmatico e nel
5,5±3,77% sia nel nucleo che nel citoplasma. Negli ACF la proteina è espressa a livello
nucleare nel 31,27±13,1% , a livello citoplasmatico nel 0,59±1,55% e a livello
nucleare/citoplasmatico nel 3,72±3,69, mentre nella mucosa sana si osserva un’espressione di
p16 nel nucleo nel 37,22±18,1% dei casi, nel citoplasma nel 1,54±3,9% e in entrambi, nucleo
e citoplasma nel 5,45±5,21% dei casi esaminati. L’espressione e la localizzazione della
proteina p16 non varia significativamente tra ACF ed MDF e la rispettiva mucosa sana.
Nel complesso, questi dati dimostrano che la p21 e la p16 a differenza della p27 non sono
inattivate nelle lesioni preneoplastiche MDF e ACF.
In conclusione, l’unico inibitore del complesso ciclina cinasi che può essere indicato come
marcatore prognostico del processo cancerogenetico del colon è la p27. Sviluppi futuri
saranno rivolti ad aumentare la casistica delle lesioni preneoplastiche per verificare il ruolo
della p21 e della p16 nella progressione del cancro al colon.
494

Mauro Torchio Filone tematico C1
Le linee guida computerizzate come strumento di supporto alla
decisione interattivo con la cartella clinica
ASO S. Giovanni Battista – Laboratorio di Informatica Clinica
OBIETTIVI
Il progetto di ricerca sulle linee guida (LG) computerizzate interattive con la cartella clinica
(CC) si è svolto, con la collaborazione del Dr Alessio Bottrighi (Dottorando in Informatica),
nell’ambito dello sviluppo di GLARE (Guidelines Acquisition, Representation and
Execution), un sistema informatizzato indipendente dal dominio per l’acquisizione e la
consultazione di LG. In primo luogo si è ultimata l’implementazione della LG sull’ictus
ischemico adottata dall’Azienda Molinette, ora consultabile sia in fase di acquisizione che di
consultazione. Come previsto, l’attività si è quindi focalizzata principalmente su due
problemi:
• definizione e sviluppo di un approccio automatizzato alla contestualizzazione di LG sulla
base delle risorse localmente disponibili;
• studio delle ulteriori estensioni necessarie per ottenere una piena integrazione di GLARE
con il DataBase Managing System (DBMS) ospedaliero e implementazione iniziale di
alcune di tali estensioni.
METODI E RISULTATI
L’attività di analisi e studio è stata completata nell’ambito della prima borsa (6 mesi), che ha
inoltre portato alla implementazione di alcune delle specifiche definite in fase di analisi; la
seconda borsa ha consentito di completare il modulo di contestualizzazione e di implementare
ulteriori specifiche concernenti l’integrazione col DBMS ospedaliero. Per contestualizzare
una LG clinica in base alle risorse disponibili localmente si è implementato un modulo di
preprocessamento (MPP) che prende in input una LG in formato XML (creata da GLARE) e
restituisce la nuova LG contestualizzata in un file XML (importato da GLARE e poi salvato
tramite il DBMS Cachè). Questo MPP visita la linea guida e identifica le sequenze di azioni
ammissibili in base alle richieste di risorse e alle risorse disponibili; sequenze non ammissibili
non sono incluse nella LG contestualizzata, che risulta contenere solo sequenze di azioni
localmente eseguibili. Parallelamente ai suddetti studi e alla implementazione dei meccanismi
di contestualizzazione, si è portato avanti il processo, già prima intrapreso, di integrazione di
GLARE con il DBMS ospedaliero basato su Caché. L’architettura di GLARE è basata su un
modello a tre livelli: il più alto è quello del sistema, ovvero i moduli di acquisizione e di
esecuzione con le relative interfacce grafiche, il più basso è quello del DBMS, dove sono
memorizzati i dati; quello intermedio è uno strato di documenti XML che funziona da
interlingua per lo scambio di conoscenza tra gli altri due strati. E’ stato necessario operare sia
sul livello del sistema sia sul livello XML. Per prima cosa si è definito il flusso di dati tra il
sistema GLARE e la CC del paziente come segue:
1. selezione del paziente su cui istanziare la specifica LG (mediante query SQL) dal DBMS
ospedaliero;
2. caricamento dei dati (mediante una serie di query SQL) dal DBMS ospedaliero e
creazione del documento XML relativo alla CC del paziente;
495

3. interazione del sistema GLARE con il documento XML che è l’immagine della CC del
paziente contenuta nel DBMS ospedaliero;
4. eventuale aggiornamento, a fine lavoro, del DBMS ospedaliero con eventuali dati
aggiornati del paziente.
Il vantaggio di tale schema di interazione è quello di ottenere una piena integrazione pur
limitando l’interazione diretta tra GLARE e DBMS (necessariamente piuttosto lenta)
solamente alle fasi di istanziazione e di fine sessione di lavoro. I cambiamenti da effettuare al
sistema per realizzare le modifiche architetturali sono risultati i seguenti:
1. modulo di gestione del documento XML rappresentante la CC di un paziente, ovvero il
modulo di interazione tra DBMS ospedaliero e sistema GLARE (per il caricamento e il
salvataggio dei dati del paziente a inizio e fine sessione di lavoro rispettivamente);
2. motore di esecuzione delle linee guida sui pazienti (che deve ora interagire con
l’immagine XML dei dati del paziente);
3. interfaccia grafica in fase di esecuzione.
Per quanto riguarda il primo punto definito, si è dovuto creare un modulo che tramite JDBC
interagisca con il DBMS per recuperare, come sopra descritto, i dati, e li converta in un
documento XML; inoltre questo modulo deve gestire durante l’esecuzione l’eventuale
aggiornamento del documento XML, nel caso che siano introdotti nuovi dati nella CC, e il
salvataggio di questi dati, sempre sfruttando JDBC. Si è dapprima individuata ed
implementata la struttura del documento XML relativa all’immagine della CC del paziente:
tale struttura, definita nell’ottica di fruibilità del sistema GLARE e non secondo la
strutturazione definita nel DBMS ospedaliero (il modulo di caricamento/salvataggio si
occupa, infatti, di fare tale conversione), differenzia tra i dati presenti nel DBMS ospedaliero
e i dati dovuti ad un nuovo inserimento. Così, alla fine di una sessione di lavoro, si
identificano velocemente i nuovi dati e l’aggiornamento del DBMS riguarda solamente quei
dati, così da minimizzare il numero di query di update sul DBMS ospedaliero.
Successivamente si è definito, realizzato e verificato il modulo per il caricamento
dell’immagine XML della CC, che crea il documento XML corrispondente ai dati della CC
del paziente selezionato. Grazie a tale estensione è stato possibile analizzare in maggiore
dettaglio anche le modifiche da effettuare al motore di esecuzione, non più direttamente
interattivo con un database ma con il documento XML prima creato. Le modifiche al motore
di esecuzione riguardano il modo per ottenere i dati relativi al paziente e per gestire eventuali
dati nuovi: nella precedente versione del sistema GLARE queste due operazioni erano fatte
eseguendo opportune query SQL, nella nuova architettura a tre livelli il motore di esecuzione
lavorerà direttamente sul documento XML attraverso opportuni metodi del classe JAVA che
implementa il modulo descritto nel punto uno. Ovviamente, in base al cambiamento
dell’interazione del flusso dei dati tra sistema GLARE e DBMS, la scrittura sul DBMS di
eventuali nuovi dati avviene in modo sincrono alla fine dell’esecuzione della LG.
PUBBLICAZIONI
1. Terenziani P., Montani S., Bottrighi A., et al. A Context-Adaptable Approach to Clinical
Guidelines. Proc. MEDINFO 2004, San Francisco, M. Fieschi et al. eds., IOS Press,
Amsterdam, 169 – 173, 2004.
2. Terenziani P., Montani S., Bottrighi A., et al. Clinical Guidelines Adaptation: Managing
Authoring and Versioning Issues. Proc. AIME 2005, Aberdeen, UK, July, 2005, in:
Lecture Notes in Artificial Intelligence 3581, Silvia Miksch, Jim Hunter, Elpida Keravnou
eds., Springer-Verlag, Berlin, 151-155.
3. Terenziani P., Montani S., Bottrighi A., et al. The GLARE approach to clinical guidelines:
main features. Stud Health Technol Inform, 2005, 101: 162 – 166
496

Pier-angelo Tovo Filone tematico C1
Impiego di TaqMan PCR per la diagnosi precoce, il follow-up e la terapia
di bambini con infezione perinatale da HCV
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Scienze Pediatriche e dell’Adolescenza
CONTESTO E RAZIONALE
La più frequente modalità di trasmissione del virus dell'apatite C (HCV) nei bambini è
rappresentata dal contagio materno-fetale. Lo studio multicentrico europeo da noi coordinato
e finanziato dalla Commissione Europea ha dimostrato che il tasso di trasmissione verticale
del virus è di circa il 5%, ma può essere maggiore in alcune categorie di donne, come quelle
con co-infezione da HIV. Va rilevato che circa l'1% delle donne in età fertile in Piemonte è
infettata dall’HCV. Il momento in cui avviene la trasmissione del virus ed i fattori di rischio
rimangono poco chiari, mentre la loro conoscenza è fondamentale per lo sviluppo di possibili
strategie preventive. Anche la storia naturale dell'infezione verticale da HCV è scarsamente
delineata. L'HCV tende a persistere nella maggior parte dei bambini infetti. L’infezione
cronica è caratterizzata da un'evoluzione subdola, che può però esitare in cirrosi ed
epatocarcinoma. Le finalità della nostra ricerca erano molteplici.
RISULTATI
Descriviamo i risultati ottenuti in funzione degli obiettivi che ci eravamo prefissati.
1. Diagnosi precoce di infezione in lattanti esposti: definizione della sensibilità e
specificità di una metodica di PCR real-time.
La diagnosi precoce di infezione verticale da HCV si basa sull’evidenza di HCV-RNA
plasmatico tramite metodiche di espansione dell’RNA virale (PCR). Gli anticorpi specifici,
acquisiti passivamente dalla madre durante la gravidanza, possono infatti persistere in circolo
sino ai 18 mesi di vita, rendendo pertanto inattendibili, a fini diagnostici, i comuni test
umorali. Nostre precedenti indagini (J Med Virol 2003; 69:195-201) hanno documentato la
scarsa sensibilità di certe metodiche di PCR qualitativa. In linea con quanto programmato
abbiamo messo a punto una tecnica di real-time PCR con sistema TaqMan, utilizzando un
aparecchio ABI PRISM 7700. Essa comporta l'amplificazione della regione altamente
conservata 5' UTR di HCV. La sonda impiegata è un oligonucleotide coniugato nelle
posizioni 5' ad un fluorocromo denominato Reporter e nella posizione 3' ad un Quencer che,
nella forma di oligo intatto, ha la funzione di catturare la fluorescenza emessa dal Reporter.
Nella reazione di amplificazione la DNA-polimerasi scinde l'oligo legato
complementariamente alla sequenza bersaglio e libera nel mezzo di reazione il Reporter, la
cui luce emessa non verrà più mascherata dal Quencer, bensì catturata da una serie di fibre
ottiche ed inviata ad una CCD-camera in grado di quantificare l'entità degli impulsi luminosi.
Questi vengono poi paragonati ad una curva plasmidica contenente il target a concentrazioni
note. Il risultato ottenuto viene espresso in numero di copie virali per ml di plasma.
L'affidabilità del test per la determinazione dell'HCV-RNA tramite TaqMan è stata analizzata
a fondo e si è rivelata elevata. Oltre alle caratteristiche di maggior sensibilità, vogliamo
sottolineare il significativo risparmio economico di tale metodica rispetto a quelle tradizionali.
Con questa tecnica sono poi stati testati campioni sequenziali di bambini nati da donne
sieropositive per HCV. I risultati ottenuti, unitamente a quelli emersi da campioni di altri
497

centri europei, hanno permesso di evidenziare che, su 54 bambini nati da madri HCV positive
sottoposti al test HCV-RNA PCR entro i primi tre giorni di vita, un terzo era viremico. Dei 37
bambini negativi alla nascita, solo 1 non è stato ulteriormente testato per HCV-RNA, ma
considerato infetto in quanto anticorpo positivo oltre i 18 mesi di età. Tra gli altri 36 bambini,
l'età mediana del primo test positivo per l’RNA virale è stata di 3 mesi, con un range di 12
giorni -15 mesi. In particolare, su 34 bambini negativi alla nascita e testati a tre mesi, 27 sono
apparsi positivi. La ricerca di HCV-RNA eseguita nei primi tre giorni di vita si è rivelata
quindi in grado di identificare un terzo dei bambini infetti. I bambini risultati negativi possono
aver acquisito l'infezione durante il parto o durante l'ultimo periodo di gestazione. Dal
momento che fra questi ultimi molti furono allattati artificialmente, in accordo con i dati della
letteratura, si può infatti escludere una trasmissione significativa attraverso all'allattamento al
seno. I risultati di questa indagine sono stati inviati, congiuntamente a quelli emersi da altri
gruppi europei, ad una importante rivista per la loro pubblicazione (con citazione del grant
della Regione Piemonte)
2. Follow-up di bambini con infezione verticale da HCV.
La storia naturale dell'infezione vertical da HCV è scarsamente delineata. Trattandosi di
un'infezione cronica per lo più asintomatica nei primi anni di vita, risulta importante riuscire a
stabilire possibili markers prognostici (quali il livello di carica virale nel plasma o di ALT).
Le determinazioni della carica virale eseguite con la nostra metodica sono state analizzate nel
contesto dello studio multicentrico europeo su una popolazione di 266 bambini con infezione
da verticale da HCV seguiti prospetticamente per una mediana di 4,2 anni (range 3 mesi – 15
anni). I risultati ottenuti suggeriscono che i bambini possono essere suddivisi in tre grandi
categorie: 1) circa il 20% è in grado di eliminare il virus circolante e mantiene valori normali
di ALT, 2) il 50% sviluppa un’infezione cronica asintomatica con viremia intermittente, 3) i
rimanenti 30% vanno incontro ad epatite cronica attiva con viremia persistente. Sulla base di
questi ed altri risultati sono state redatte delle linee guida europee per il corretto approccio
della copia madre-bambino sieropositiva per HCV che sono state inviate per la pubblicazione
(con citazione del grant della Regione Piemonte) .
3. Terapia con interferon-peghilato (PEG-IFN) e ribavirina.
Non è stato possibile attivare il monitoraggio della carica virale dei pazienti pediatrici in
terapia per la non disponibilità del farmaco. Infatti la ditta Roche (Italia) che aveva garantito
la disponibilità di entrambi prodotti, per problemi interni non è stata in grado di metterli a
disposizione del nostro come di tutti gli altri centri coinvolti nel 2004. Il protocollo
concordato potrà quindi essere operativo solo nel corso del 2005. L'allestimento di una tecnica
di laboratorio sensibile e specifica per la diagnosi di infezione nonché per la quantificazione
nel tempo della carica virale hanno quindi consentito di un significativo passo aventi sia in
chiave di sensibilità ed attendibilità metodologica che di risparmio dei costi.. L'integrazione
dei nostri dati in un contesto più ampio, quale lo studio multicentrico finanziato dalla
Commissione Europea, ha infine permesso di ottenere risultati di sicuro rilievo internazionale.
498

Anna Chiara Trompeo Filone tematico A5
Influenza dell'analgesia e della sedazione sullo svezzamento del paziente
dal ventilatore in Terapia Intensiva
ASO S. Giovanni Battista – S.C.U. Anestesia e Rianimazione 3
CONTESTO E RAZIONALE
La Terapia Intensiva (ICU) è un ambiente poco confortevole sia per il paziente che per i
famigliari, ed il paziente critico e' spesso spaventato, sofferente e disorientato. L'agitazione
nel paziente di ICU può essere dovuta ad un dolore non adeguatamente trattato, e questo può
essere a sua volta responsabile dello sviluppo della risposta da 'stress” caratterizzata da
tachicardia, aumentato consumo di ossigeno, ipercoagulabilità ed immunosoppressione, con
aumentato rischio di complicanze cardiocircolatorie e respiratorie. I pazienti ricoverati in ICU
presentano un'alterazione qualitativa e quantitativa di sonno che è in parte responsabile di una
vera forma di disfunzione d'organo precedentemente sottostimata, definita 'delirio” che può
colpire fino all'80% dei pazienti ricoverati in ICU. Una deprivazione di sonno potrebbe
influire sullo sviluppo del delirio, che in terapia intensiva può colpire fino all' 87% dei
pazienti ed è da considerare una vera e propria disfunzione d'organo. Esso e' caratterizzato da
modificazioni improvvise ed altalenanti dello stato mentale, disattenzione, alterato livello di
coscienza eventualmente accompagnato ad agitazione. Uno degli obiettivi di ogni ICU e'
mantenere un livello ottimale di 'comfort' del paziente garantendo un adeguato controllo del
dolore, dell'ansia e del delirio. Le linee guida per la sedazione e l'analgesia in Terapia
Intensiva (redatte dall'American College of Critical Care Medicine e dalla Society of Critical
Care Medicine) sono state pubblicate nel 2002. Rimane da definire la scelta del miglior
farmaco in base alle caratteristiche farmacocinetiche. L'insorgenza di delirio sembra essere
associata ad indici di outcomes peggiori quali l'aumento dei giorni di ventilazione,
l'allungamento dei tempi di degenza sia in ICU sia in ospedale ed è un predittore indipendente
di incremento di mortalià a 6 mesi.
MATERIALI E METODI
Sono stati arruolati nello studio 29 pazienti post operati (21 M) ventilati meccanicamente per
un periodo superiore alle 48 ore, ricoverati presso il reparto di Terapia Intensiva dell'Azienda
Ospedaliera S. Giovanni Battista di Torino. I pazienti sono stati divisi in due gruppi in base al
tipo di sedazione ed analgesia utilizzata (gruppo 1) e (gruppo 2). Abbiamo anche verificato se
la strategia terapeutica del gruppo 1 comporti una riduzione del numero di giorni con delirio
in ICU e l'eventuale riduzione dei costi. Al raggiungimento di un Ramsay 2, momento nel
quale il paziente risultava contattabile, è stata eseguita anche la valutazione del delirio (CAM-
ICU) ed i pazienti sono poi stati classificati come deliranti (D) e non deliranti (ND). I pazienti
avevano un'età media pari a 66±11. All'ingresso in ICU sono state raccolte le caratteristiche
demografiche, la tipologia di intervento ed gli indici di gravità. Quotidianamente fino alla
dimissione sono stati registrati i dati su: eventuali insufficienze d'organo (SOFA), tipologia di
ventilazione, tipologia ed dosaggio di farmaci analgesici o sedativi utilizzati valutandone
l'effetto con apposite scale (RAMSAY ed NRS). Durante la fase avanzata di svezzamento dal
ventilatore con PS

Sono state analizzate poi Sleep efficiency, architettura e frammentazione del sonno.Sono stati
utilizzati i test più appropriati per ogni gruppo.Si tratta di t-test, Mann-Whitney U test e Fisher
S exact test. E' stato applicato un modello di regressione multipla per descrivere la relazione
tra la qualità del sonno e le differenti variabili.
RISULTATI
Il delirio è stato riscontrato in 12 pazienti e studiando le caratteristiche del sonno nei due
gruppi solo la percentuale di REM è risultata essere diversa e significativa . La percentuale di
REM nei pazienti con delirio è risultata essere tra 0-9.8% cosicché è stato scelto come cut-off
il 10% per dividere i pazienti in REM sleep deprived (RD) e normal REM (NR) e valutare
così le possibili correlazioni tra sonno, delirio,durata della ventilazione e analgesia e
sedazione. I due gruppi presentavano caratteristiche di base simili in termini di età,genere,
incidenza di sepsi, comorbidità. Il gruppo RD, diciannove pazienti (65%), presentava una
maggior incidenza di sepsi, sepsi severa e shock settico (84% vs 50%) anche se non
statisticamente significativa, ma all'inizio dello studio aveva una condizione di maggior
gravità misurata con il SAPS II score (p

Mariella Trovati Filone tematico C1
Modelli organizzativi per l'automonitoraggio glicemico nel diabete di tipo
2: valutazione del rapporto costi-benefici.
Azienda Ospedaliera San Luigi di Orbassano
OBIETTIVO
Scopo del progetto è verificare se la modalità con cui viene effettuato l’autocontrollo
glicemico domiciliare dai pazienti diabetici di Tipo 2 non in trattamento insulinico comporti
differenze nei risultati clinici e nel rapporto rapporto costo-beneficio.
MATERIALI E METODI
Sono stati arruolati in modo randomizzato pazienti affetti da diabete di Tipo 2 non in
trattamento insulinico in compenso glicemico non ottimale (HbA1c>6.5%) seguiti in followup
presso la SCDU di Malattie Metaboliche e Diabetologia dell’ASO San Luigi Gonzaga di
Orbassano, randomizzandoli nei seguenti bracci:
a) senza autocontrollo;
b) in autocontrollo glicemico con prescrizione di strisce reattive secondo il fabbisogno
“minimo” previsto dalla normativa regionale (50 strisce annue),con indicazione ad
effettuare ogni mese un profilo glicemico giornaliero di quattro punti;
c) in autocontrollo glicemico con prescrizione di strisce reattive tale da permettere la
esecuzione quindicinale di un profilo glicemico giornaliero di 6 punti;
d) in autocontrollo glicemico come al punto “b” con la raccomandazione di riferire
telefonicamente all’équipe diabetologica eventuali problemi evidenziati dai profili per
ottenere consigli anche prima delle prefissate visite di controllo.
Poiché nel nostro ambulatorio i pazienti che non effettuano autocontrollo glicemico sono
caratterizzati dalla incapacità di svolgerlo correttamente e presentano abitualmente una
minore attitudine a seguire in modo adeguato le prescrizioni terapeutiche, non è stato valutato
nei risultati il gruppo “a”, perché la sua inclusione avrebbe indotto ad attribuire
all’autocontrollo risultati derivanti dalla differente compliance terapeutica. Sono stati inclusi
nei gruppi di randomizzazione “b”, “c” e “d” solo soggetti già in autocontrollo domiciliare,
che hanno continuato ad usare i reflettometri in possesso. Ciò ha permesso di valutare
retrospettivamente la qualità del compenso nei sei mesi precedenti, marcatore della
compliance terapeutica. Per evitare discrepanze relative ad un differente impegno educativo e
clinico della èquipe diabetologica, tutti i pazienti sono stati invitati a recarsi a controllo
specialistico ogni tre mesi, presentando i profili glicemici effettuati nel frattempo, ed a seguire
incontri interattivi di educazione sanitaria a piccoli gruppi, al termine dei quali veniva
consegnato materiale didattico sull’autocontrollo, con indicazione scritta degli obiettivi
glicemici raccomandati.
RISULTATI
Descriviamo i risultati ottenuti nei pazienti che hanno seguito il protocollo proposto secondo
tutte le indicazioni ricevute, permettendo di ricavare indicazioni cliniche accurate. Dei
soggetti arruolati, 148 hanno portato a termine in modo soddisfacente lo studio. Poiché i
pazienti del gruppo “d” non hanno raccolto l’invito a contattare anche solo telefonicamente
l’èquipe curante qualora i profili glicemici presentassero valori che inducevano a concordare
501

modificazioni terapeutiche prima del controllo trimestrale, essi sono stati uniti al gruppo “b”
nell’analisi dei risultati. Per l’analisi dei risultati, i pazienti sono stati dunque suddivisi in due
gruppi, definiti A e B:
a) gruppo A (n=70), con schema di autocontrollo non intensivo, consistente in un profilo
glicemico al mese con quattro punti glicemici giornalieri, ed utilizzazione del numero di
strisce concesse dalla Regione Piemonte senza variazioni del piano terapeutico standard;
b) gruppo B (n=78), con schema terapeutico “intensivo” consistente in un profilo glicemico
quindicinale con sei punti glicemici giornalieri. Le variazioni del piano terapeutico nel
gruppo B erano giustificate dal compenso glicemico non ottimale che rappresentava un
criterio di inclusione.
I risultati sono espressi come m±SD. I due gruppi -scelti con metodica randomizzata- non
differivano significativamente per sesso (M/F = 41/29 vs 47/31), età (63.1±9.44 vs 65.8±9.2
anni), durata di malattia (10.6±8.9 vs 10.6±8.5 anni), indice di massa corporea (29.1±4.91 vs
28.1±3.5), circonferenza vita (103.4±12.1 vs 102.1±8.8 cm) ed HbA1c (7.97±0.72% vs
8.1±0.8%). La terapia effettuata dai due gruppi era la seguente: solo dieta: 4.3% e 10.3%; solo
metformina: 14.3% e 15.4%; solo sulfoniluree: 22.9% e 23.1%; solo glinidi 11.4% e 6.4%;
sulfoniluree+metformina: 42.9% e 42.3%; glinidi+metformina: 4.3% e 2.5%. Il compenso
glicemico nei sei mesi precedenti era stato stabile in entrambi i gruppi, a dimostrazione di una
simile compliance terapeutica: in particolare, i pazienti del gruppo A avevano presentato una
modesta variazione di HbA1c da 8.26±0.93% a 7.97±0.72% (p=0.013), i pazienti del gruppo
B non avevano presentato alcuna variazione (8.08± 0.75% vs 8.08±0.86%,p=ns).
Al sesto mese dalla randomizzazione:
1. i pazienti del gruppo A presentavano le seguenti variazioni rispetto al basale: a)Glicemia a
digiuno (137.65±32.17 vs 138.74±26.07 mg/dl,ns); b)Glicemia dopo colazione
(149.47±32.51 vs 153.31±30.3 mg/dl, ns); c)Glicemia dopo pranzo (157.44±36.01 vs
161.9±36.9 mg/dl,ns); d)Glicemia dopo cena (162.85±39.77 vs 159.93±32.8 mg/dl,ns);
e)HbA1c (7.78±1.05 vs 7.97±0.72%, ns);
2. i pazienti del gruppo B presentavano le seguenti variazioni rispetto al basale: a)Glicemia a
digiuno (129.61±27.33 vs 137.5±28.29 mg/dl, p=0.013); b)Glicemia dopo colazione
(147.62±29.4 vs 158.3±35.86 mg/dl, p=0.004); c)Glicemia prima di pranzo (124.56±25.71
vs 134.99±34.84 mg/dl, p=0.003); d)Glicemia dopo pranzo (157.32±27.93 vs 163.9±34.38
mg/dl, ns); e)Glicemia prima di cena (120.27±27.06 vs 129.42±32.8 mg/dl, p=0.037);
f)Glicemia dopo cena (153.22±29.42 vs 162.88±30.08 mg/dl, p=0.002); e)HbA1c
(7.6±0.73 vs 8.09±0.84%, p=0.001).
L’indice di massa corporea non ha subito significative modificazioni nei due gruppi (da
29.1±4.9 a 29.1±4.8 nel gruppo A; da 28.1±3.5 a 28.0±3.6 nel gruppo B.Variazioni
terapeutiche (tipo e/o dosaggio dei farmaci) sono state effettuate nel 28.6% dei pazienti del
gruppo A e nel 42.3% dei pazienti del gruppo B. Nel gruppo B, in 2 pazienti è stata introdotta
l’insulina in terapia. Dato il disegno dello studio, si esclude che un maggior contatto con
l’èquipe diabetologica o una differente educazione terapeutica giustifichino le differenze di
risultato, ascrivibili al differente tipo di autocontrollo effettuato.
In conclusione, lo studio dimostra che un regime moderatamente più intensivo di
autocontrollo domiciliare permette di avvicinarsi meglio agli obiettivi glicemici proposti,
rendendo il paziente più responsabilizzato nella gestione della malattia e la èquipe
diabetologica meno timorosa nell’introdurre modificazioni terapeutiche potenzialmente in
grado di indurre ipoglicemie, in quanto dispone di maggiori elementi di giudizio. La riduzione
nei valori di HbA1c raggiunta nel gruppo B giustifica completamente il lieve incremento della
spesa per l’autocontrollo.
502

Giancarlo Ugazio Filone tematico A3
Monitoraggio delle particelle ultrafini nell’ambiente di vita e di lavoro,
indoor e outdoor.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale
CONTESTO E RAZIONALE
L’inquinamento dell’aria da materiale particellare inalabile (particolato di dimensioni 0.3, >0.5, >0.7, >1.0, >3.0 e >5.0 µm. Le condizioni climatiche sono state monitorate tramite
centralina termometro-igrometro-barometrica, anemometro e pluviometro e sono state
effettuate determinazioni di confronto in ambiente indoor domestico.
RISULTATI
La composizione percentuale su base dimensionale è stata costante in tutti i dosaggi, con il
90% del PM presente inferiore a 0.5 µm (6% 0.5-0.7, 2% 0.7-1.0, 1% 1.0-3.0, 0.5% 3.0-5.0 e
0.2% >5.0 µm). Il numero totale di particelle/litro è invece risultato decisamente variabile nei
diversi giorni e, in misura minore, siti di prelievo, con un incremento medio >300% rispetto al
valore indoor. Concentrazioni di picco di PM0.5 (> 500.000/l) sono state riscontrate nel
periodo invernale, anche in occasione delle giornate ecologiche.
CONCLUSIONI
I risultati dello studio dimostrano come, numericamente, le particelle ultrafini costituiscano la
parte preponderante del particolato sospeso, confermando l’importanza di misurazioni per
conteggio in luogo delle tradizionali basate sulla massa. L’attuazione di restrizioni al traffico
veicolare non ha determinato alcun effetto riscontrabile sui livelli di PM totale, diversamente
dalla presenza/assenza di vento e precipitazioni o l’utilizzo di impianti di riscaldamento nei
mesi freddi.
503

Giovanni Vacca Filone tematico C1
Trattamento farmacologico dello shock cardiogeno
Università “A. Avogadro” del Piemonte Orientale
Dipartimento di Scienze Mediche
CONTESTO E RAZIONALE
Lo scopo del presente progetto di ricerca è stato quello di valutare l’effetto del Levosimendan,
farmaco già utilizzato per il trattamento dello shock cardiogeno post pericardiotomico e dello
scompenso cardiaco congestizio, sul recupero funzionale del cuore in corso di shock
cardiogeno causato da ischemia miocardica. Gli studi sinora condotti hanno evidenziato come
il Levosimendan possa esplicare effetti cronotropo ed inotropo positivi, vasodilatanti, e antistunning.
Il suo meccanismo d’azione, che lo rende efficace per il recupero della funzionalità
miocardica e ne giustifica le proprietà emodinamiche, è rappresentato dall’aumento della
sensibilità della troponina-C al calcio intracellulare, dalla inibizione della fosfodiesterasi III e
dalla attivazione dei canali del potassio ATP-dipendenti delle cellule muscolari lisce.
Mentre gli studi condotti per valutare l’efficacia del Levosimendan nel recupero funzionale a
seguito di una ischemia miocardica globale sono piuttosto numerosi, le informazioni relative
agli effetti emodinamici del farmaco in questione in caso di ischemia regionale del miocardio
sono a tutt’oggi scarse. Inoltre, i dati di letteratura sembrano evidenziare come in questo caso
il Levosimendan, se somministrato per via sistemica, tenda addirittura a peggiorare la
funzionalità miocardica nella zona colpita da ischemia. Gli effetti negativi del farmaco
nell’area ischemica vengono imputati dagli autori alla perdita del meccanismo di
autoregolazione del flusso coronarico conseguente alla riduzione della pressione arteriosa
indotta dal Levosimendan. Questo effetto, unito al furto di sangue dalle zone subendocardiche
a quelle subepicardiche, provocherebbe un peggioramento della irrorazione nella zona di
miocardio già colpita dalla ischemia. Anche l’aumento della frequenza cardiaca, secondario
non solo all’azione diretta del farmaco in esame, ma anche alla riduzione della pressione
arteriosa che scatena riflessi nervosi cardiovascolari, contribuirebbe al peggioramento della
funzionalità miocardica. Sulla base di queste osservazioni, abbiamo ritenuto opportuno
somministrare il Levosimendan per via intracoronarica, riducendo in tal modo gli effetti
emodinamici sistemici nocivi sopra descritti, per valutarne l’efficacia nello shock cardiogeno
postischemico indotto da una ischemia regionale del miocardio.
METODI E RISULTATI
La ricerca è stata condotta su un totale di 12 maiali del peso di circa 70 kg anestetizzati con
pentobarbitone sodico e fentanyl secondo dosi già utilizzate in altri studi nel medesimo
laboratorio, intubati e ventilati artificialmente. Negli animali sono state registrate le pressioni
arteriosa, venosa centrale e ventricolare sinistra, da cui è stato ricavato il ± dP/dtmax quale
indice di contrattilità miocardica e di rilasciamento ventricolare. In tutti gli animali sono stati
monitorati l’elettrocardiogramma e la frequenza cardiaca. La vena femorale di sinistra è stata
cateterizzata per infondere farmaci e per mantenere il bilancio idroelettrolitico. Il flusso
ematico coronarico è stato registrato posizionando la sonda di un flussimetro elettromagnetico
sul ramo discendente anteriore della coronaria sinistra. In 6 degli 12 maiali l’ischemia
regionale è stata effettuata occludendo un ramo collaterale della coronaria discendente
anteriore per un periodo di circa 4 ore. La durata di 4 ore per l’ischemia è stata scelta in
504

quanto in esperimenti preliminari in cui l’ischemia regionale aveva una durata di circa 3 ore
l’analisi istologica non aveva evidenziato segni particolari di alterazione ischemica.
Tutti i parametri sono stati registrati mediante un poligrafo e memorizzati per successive
elaborazioni.
In tutti gli esperimenti il Levosimendan è stato somministrato in bolo, in un intervallo di
tempo di 10 minuti, all’interno della coronaria discendente anteriore utilizzando dosi, ricavate
da dati di letteratura, che corrispondono ad una somministrazione in bolo sistemica pari 12 e
24 µg/Kg. Le dosi somministrate sono state calcolate in relazione al flusso coronarico di base
registrato durante i vari esperimenti. Le registrazioni dei parametri emodinamici sono state
effettuate prima e dopo la somministrazione del farmaco e proseguite per un periodo di tre
ore. L’analisi statistica dei dati ottenuti è stata effettuata mediante il t test di Student per dati
appaiati. Un valore di p< 0,05 è stato assunto come indice di significatività statistica.
In assenza di ischemia miocardica la somministrazione intracoronarica di dosi equivalenti a
12 µg/Kg e 24 µg/Kg del farmaco in esame, ciascuna effettuata in 3 maiali, non ha
determinato variazioni statisticamente significative della pressione arteriosa, della frequenza e
della contrattilità mocardica mentre ha determinato un aumento medio del flusso ematico
coronarico pari rispettivamente al 26.3% and 41.3% dei rispettivi valori di controllo. Tali
effetti si sono manifestati entro il primo minuto della somministrazione e sono perdurati
inalterati per le tre ore di osservazione.
L’analisi istologica del miocardio sottoposto a sofferenza ischemica della durata di 4 ore è
stato effettuato su frammenti fissati in formalina e colorati con ematossilina-eosina e con
metodo tricromico secondo Masson. Tale indagine ha evidenziato la presenza di necrosi
parcellare delle fibrocellule muscolari, infiltrazione granulocitaria neutrofila ed eosinofila in
sede interstiziale, ectasia capillare interstiziale isolata e con microtrombi di eosinofili, chiaro
segno di danno di natura ischemica.
Nei 6 maiali l’ischemia regionale ha determinato una riduzione della pressione arteriosa del
6.3%, della contrattilità miocardica del 13.3% ed un aumento della frequenza cardiaca del
15.9%.
La somministrazione intracoronarica di Levosimendan, iniettato a monte della zona di
emergenza del vaso collaterale alle dosi equivalenti ai 12 µg/Kg (3 maiali) e 24 µg/Kg (3
maiali), ha determinato un aumento della pressione arteriosa rispettivamente del 5% e del 7
%, della contrattilità miocardica del 12.4% e del 14.9% e del flusso ematico coronarico del
22% e del 34.7% dai rispettivi valori di controllo. Le variazioni osservate sono risultate
statisticamente significative. E’ interessante fare notare come mentre la dose corrispondente ai
12 µg/Kg non abbia determinato variazioni significative della frequenza cardiaca, la dose di
24 µg/Kg ha invece determinato un aumento statisticamente significativo di tale parametro.
PUBBLICAZIONI
Grossini E, Caimmi PP, Molinari C, Teodori G, Vacca G. Hemodynamic effect of
intracoronary administration of levosimendan in the anesthetized pig. J Cardiovasc Pharmacol
46: 333-342, 2005.
505

Sergio Vai Filone tematico C2
Individuazione precoce dei difetti congeniti diagnosticabili in epoca
neonatale
Asl 6
OBIETTIVI
I difetti congeniti, definiti come anomalie di origine prenatale, identificati durate la gestazione
o nel periodo neonatale, che interferiscono in modo serio sia sulla sopravvivenza che sul
benessere fisico del neonato comprendono malformazioni maggiori, che sono state oggetto
dello studio. In particolare si è fatto riferimento alle 35 malformazioni universalmente
classificate secondo l’International Clearinghouse for Birth Defectc Monitoring System
(ICBDMS), utilizzando i codici ICD9-CM. Come indicatore attualmente è stato utilizzato il
tasso di prevalenza nei nati vivi (PNV), con numeratori e denominatori dedotti dal CEDAP,
sebbene sia in corso una revisione manuale dei dati per il calcolo del PNV in quanto il
CEDAP si è rivelato un sistema imperfetto poiché gravato da un lato da una significativa
sottonotifica e dall’altro perché con l’adozione della dimissione precoce un numero di
malformazioni (generalmente a carico dell’apparato cardiovascolare) viene evidenziato in
epoca neonatale nella vista post-nascita o nel primo bilancio di salute a 2-3 settimane di vita.
A questa revisione partecipa oltre al quadrante coinvolto la Neonatologia e TIN
dell’Università degli Studi di Torino (Dr.ssa Prandi). È in corso d’opera l’ambizioso proposito
della definizione dell’importantissimo indicatore quale il tasso di prevalenza totale [PT= (nati
vivi malformati+ nati morti malformati+ aborti terapeutici con malformazione/(nati vivi+ nati
morti)] che è senz’altro quello metodologicamente più corretto in quanto include la
valutazione della mortalità fetale (per lo meno di una parte).
METODI E RISULTATI
Nel 2004 i nati residenti sono stati 8732 di cui 3810 nati presso i Punti nascita del quadrante
(ASL 2, 3, 5, 6) e 4922 al di fuori del quadrante ( 4081 presso il S. Anna). Si è osservata
inoltre una discreta migrazione all’interno del quadrante, soprattutto fra le ASL 2 3 e 5. Le
malformazioni maggiori a carico dei nati residenti nell’anno 2004 con parto espletato nei
Punti Nascita del quadrante sono state 20 (PNV= 5.25‰) di cui 3 a carico dell’apparato
cardio-vascolare, 2 dell’’intestino, 1 ernia diaframmatica, 7 ipospadie, 4 agenesie renali, 2
polidattilie, 1 difetto di riduzione degli arti. Le malformazioni maggiori a carico dei nati
residenti nell’anno 2004 con parto espletato al di fuori del quadrante sono state 16 (PNV=
3.25‰) di cui 2 a carico del SNC, 3 dell’apparato cardio-vascolare, 1 anotia, 2
labiopalatoschisi, 1 atresia esofagea, 1 ipospadia, 4 polidattilie, 1 ernia diaframmatica, 1
difetto di riduzione degli arti. Di esse (dati in revisione), poche erano state segnalate durante
la gravidanza.
L’adozione di criteri che definiscono un adeguato (non solo sufficiente) esame ecocgrafico in
gravidanza, che in alcuni casi dovrebbero superare i limiti prefissati da alcune società
scientifiche, potrebbe verosimilmente evitare alcune “sgradite” sorprese alla nascita o nelle
ore a seguire, garantendo altresì l’espletamento del parto in struttura idonea. Non vi è peraltro
associazione statisticamente significativa tra riscontro di malformazione e follow-up della
gravidanza (numero di ecografie, percorso pubblico – ospedaliero, consultoriale - o privato).
I difetti congeniti del metabolismo continuano a costituire una reale difficoltà di gestione
anche quando inviati presso strutture di III livello, anche per la sovrapposizione del quadro di
506

presentazione delle malattie metaboliche e patologie più comuni (es. sepsi) e la necessità di
una diagnosi differenziale o la concomitanza delle medesime, con conclusioni anche tragiche
come ad esempio l’occorso decesso di un neonato con iperammoniemia.
Una corretta consulenza genetica costituisce una altro caposaldo della gestione dei difetti
congeniti e a tal proposito è in corso di definizione una diversa collaborazione con il SCDU
Genetica Medica Az. Ospedaliera S.Giovanni Battista (Dr.Grosso) per l’organizzazione di
audit sui casi clinici. Infatti, se da un lato l’acquisizione di ausili informatici quali il POSSUM
e il LDDB consentono in un approccio gestaltico o induttivo/deduttivo l’inquadramento del
caso, non si può prescindere nelle situazioni complesse da una discussione collegiale del caso
clinico, dalla formazione continua e specifica, dall’adozione di griglie valutative e da un
approccio sistematico non limitato al solo pediatra sentinella, ma diffuso presso tutto lo staff
neonatologico ( medico ed infermieristico). Tutto ciò ha indotto nel corso dello studio un
miglioramento nell’approccio complessivo anche legato alla presa di coscienza che oltre ad
una generica gestione al difetto congenito in se, è in prima istanza utile e perseguibile
realizzare specifici percorsi che hanno come oggetto le malformazioni maggiori definite
dall’ICBDMS (35) e l’EUROCAT (45) anche se adeguate alle risorse della singola struttura
ma illustrato nella sua diversità all’utenza per evitare l’impressione di disomogeneità ed
inadeguatezza delle cure, in una situazione di migrazione sanitaria quale quella osservata.
In funzione della prevalenza dei difetti a carico dell’apparato cardio-vascolare, il supporto di
un servizio di cardiologia (anche di I livello in termini di valutazione neonatologica) risulta
essere essenziale nella gestione pratica e penalizzante la sua assenza (es. realtà ciriecese). A
tal proposito oltre alla formazione (anche se pur di I livello) dello specialista neonatologo od
ostetrico e soprattutto cardiologo per la valutazione strumentale cardiologica del neonato, la
telemedicina potrebbe costituire una valida integrazione.
CONCLUSIONI
In sintesi si può concludere che lo studio intrapreso ha soddisfatto gli obiettivi proposti o
almeno ha evidenziato che:
1. è possibile realizzare anche in centri di II livello adeguati percorsi assistenziali e creare un
network,
2. il CEDAP attualmente non costituisce un strumenta valido per la costituzione di registri di
malformazione (per la notevole sottonotifica) e comunque non sufficiente;
3. occorre migliorare in termini di sensibilità ed accuratezza la diagnosi prenatale.
507

Adriano Vanni Filone tematico B2
Determinazione di prodotti tossici di trasformazione di fitofarmaci nei
controlli sulla sicurezza di prodotti alimentari
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Chimica Analitica
OBIETTIVO
'Individuare eventuali prodotti di degradazione (pdd) di pesticidi (che da precedenti lavori
risultano avere tossicità più elevata di quella del principio attivo (pa) di partenza, associata a
maggiore persistenza) nei trattamenti su campioni di frutta e verdura, in collaborazione con
l'ente di controllo, per sviluppare un metodo che consenta di verificare anche dopo la
scomparsa per degradazione del pa, a distanza di tempo, l'avvenuto trattamento dell’alimento
con pesticidi.
METODI E RISULTATI
Campioni considerati
Campioni di frutta e verdura (12+14) già sottoposti ad un primo accertamento sulla presenza
di fitofarmaci, svolto dal Polo Chimico Regionale Alimenti dell' ARPA di La Loggia (To).
Particolare attenzione è stata data a campioni provenienti da colture biologiche.
Analiti considerati (in campioni tradizionali e biologici)
Fungicidi dicarbossidiimidici: Procimidone, Iprodione e Vinclozolin di cui sono noti possibili
pathways degradativi e i relativi pdd (è stata in particolare considerata la 3,5 DCA comune a
tutti). E stato anche avviato lo studio del comportamento abiotico del Cyprodinil (fungicida
anilinopirimidinico di più recente introduzione) determinandone il percorso degradativo e
identificandone i pdd.
DETERMINAZIONE DEI PESTICIDI E LORO PDD
Estrazione
Il metodo di letteratura è stato ottimizzato introducendo un passaggio di sonicazione e
lavorando a pH 8.5 (migliore.riproducibilità). Ogni subcampione (3 repliche) omogenato (l0
g) è stato posto a contatto con 20 ml di CH3COOC2H5 e l0 g di Na2S04 e sonicato (30').
Recuperato il surnatante, filtrato su PTFE 0.2 µm, evaporato il solvente a secco e ripreso in
CH3OH (2 ml) si è ottenuto l'estratto per la determinazione in LC-MS.
Quantificazione
Estratti i pa dalle matrici e analizzati in LC-MS, dall'area dei picchi, utilizzando opportune
rette di taratura, corrette per l'effetto delle matrici (metodo delle aggiunte standard) e tenendo
conto delle rese di estrazione (calcolate), si sono quantificati i vari pa e il loro comune pdd.
Condizioni operative ottimizzate
HPLC-DAD. Colonna C18, 125x2mm (3 µm), 0.3 ml/min, Vol. iniettato: 20 µl. Eluenti:
H2O+0.5% HCOOH/CH3CN+0.5% HCOOH – grad. 30-100 CH3CN+0.5% HCOOH in 25’
508

λ= 235,10nm e 250,10 nm.
MS
dry. gas: 71/min, 300C, 325C(vap. gas), 60psi, 3000V, corona 5 µ A
PROCIMIDONE, IPRODIONE, 3,5-DCA: APCI+, SIM, 80V
VINCLOZOLIN: APCI-, SIM, 60V .
Quantificazione dei pa e del pdd nelle matrici
MATRICE PA LMR CONC (ppm) CONC (ppm) CONC (ppm)
(ppm) (a) ARPA (b) ±RSD pa (e) ±RSD pdd
Pomodoro 697 (1) 2 0.32 n.r. 0.53±2.1 %
Pomodoro 830 (1) 2 0.14 0.14: ±10.0 % 0.50±0.1 %
Pomodoro 529 (1) 2 0.05 0.10 ±7.5% n.r.
Pomodoro 400 (2) 2 0.27 0.23± 43.7 % 0.47±0.2 %
Peperone 288 (1) 2

In buon accordo con dati dell' ARP A sull' assenza dei pa in esame per questi campioni è
tuttavia da sottolineare la presenza, al di sopra del LOD, della 3,5 DCA in campioni di
zucchine (0.03±3.0 % ppm), mele (0.02±0.0% ppm), arance A (0.07±28.9% ppm) e B
(0.03±2.0 % ppm); questo farebbe supporre un avvenuto trattamento dell'alimento nel corso
della sua coltivazione, in un tempo sufficientemente lontano dalla commercializzazione tale
da permettere la quasi completa scomparsa del pa somministrato.
CYPRODINIL
È stata studiata la degradazione in condizioni abiotiche del Cyprodinil ottenendo una
degradazione del pa pari al 99.6%.
Prelievi di soluzione a vari tempi hanno permesso sia di studiare i profili degli spettri UV -
VIS dei complessi formatisi nel corso della reazione (che forniscono i radicali OH necessari
per la degradazione del pa) sia di determinare in LC-DAD, in condizioni ottimizzate (di
seguito riportate), l'andamento della degradazione. Si sono determinati in LC-MS i pdd del
Cyprodinil ché sono risultati essere suoi idrossiderivati con gruppi OH in varie posizioni degli
anelli della molecola.
HPLC-DAD
Colonna C18, 125x2mm (3 µm), 0.3 ml/min, VoI. iniettato: 20µl
Eluenti: H2O /CH3CN - grado 0-30%; 3-30%; 25-100% λ = 210,4 e 270,4 nm
MS: ESI+, SCAN (50-300), 80V, dry. gas: l0 l/min, 300C, 40psi, 3500V
510

Franco Veglio Filone tematico C1
Dosaggio degli steroidi ibridi serici e urinari nella diagnosi differenziale
dell’iperaldosteronismo primitivo.
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale
CONTESTO E RAZIONALE
L’estensione della ratio tra aldosterone e PRA ad una popolazione più vasta di ipertesi ha
portato a diagnosticare sempre più casi di iperaldosteronismo primitivo, soprattutto in stadi
precoci della patologia e in condizione di normokaliemia. La prevalenza di questa forma di
ipertensione secondaria è così aumentata drasticamente negli ultimi anni. Molti autori hanno
proposto un’utilità del dosaggio degli steroidi ibridi 18-idrossicortisolo (18-OHF) e 18oxocortisolo(18-oxoF)
e del precursore dell’aldosterone 18-idrossicorticosterone(18-OHB)
nella diagnosi differenziale dei diversi sottotipi di iperaldosteronismo primitivo. Tutti sono
concordi nel ritenere che soggetti con adenomi monolaterali (APA) o una forma monogenica
definita iperaldosteronismo glucocorticoide soppressibile (GRA) presentano valori di 18-
OHF, 18-oxoF e 18-OHB più elevati rispetto alle iperplasie surrenaliche bilaterali (IHA), agli
ipertesi essenziali e ai normotesi. Il 18-oxoF (18-oxocortisolo) e il 18-OHF (18idrossicortisolo),
prodotti a livello della corteccia surrenalica, sono definiti ibridi per la
condivisione di alcune caratteristiche proprie dell’aldosterone e altre del cortisolo. Il 18-OHB
(18-idrossicorticosterone) è ritenuto essere l’immediato precursore dell’aldosterone; in
condizioni di normalità, le sue concentrazioni plasmatiche sono costanti rispetto a quelle
dell’aldosterone ed è influenzato dai medesimi fattori del suo prodotto finale. Gli APA
secernono una quantità maggiore anche di questo steroide, il cui dosaggio potrebbe quindi
fornire informazioni aggiuntive.
OBIETTIVO
Scopo del nostro lavoro è stato sviluppare un nuovo percorso per la diagnosi dei sottotipi di
iperaldosteronismo primitivo utilizzando il dosaggio degli steroidi ibridi sierici e urinari e del
18-OHB plasmatico.
METODI E RISULTATI
Abbiamo quindi incluso in questo studio retrospettivo 136 soggetti con ratio
(aldosterone/PRA) positiva (superiore a 400) e livelli di aldosterone plasmatico superiori a
150 pg/ml confermati in due misurazioni. La positività della ratio, ha imposto l’esecuzione di
test di secondo livello volti a confermare o escludere la presenza di iperaldosteronismo
primitivo. Una volta quindi, accertata la presenza di questa forma di ipertensione arteriosa
secondaria è stato necessario individuare il sottotipo per impostare una terapia mirata. In
totale abbiamo eseguito 123 test da carico salino in soggetti di età media di 51.4 anni (±9.9
anni) di cui 64 erano di sesso femminile e 59 maschile e 13 test al captopril (11 maschi e 2
femmine) in pazienti di età media 50.2 (±8.7) anni. Parallelamente sono state raccolte le urine
delle 24 ore per il dosaggio del 18-OHF, del 18-oxoF, della sodiuria, dell’aldosteronuria e
della creatininuria. Durante l’esecuzione del test di conferma al carico salino sono stati
prelevati campioni sierici per il dosaggio di 18-OHF, 18-oxoF e 18-OHB basale e al termine
dell’esame.
511

Il dosaggio degli steroidi è stato eseguito con metodo ELISA seguendo la metodica proposta
da Celso Gomez-Sanchez. In base ai risultati ottenuti dal dosaggio di questi steroidi a livello
urinario e plasmatico abbiamo sviluppato una nuova flow chart per la diagnosi di sottotipo di
iperaldosteronismo attribuendo al 18-OHF urinario un ruolo chiave per diagnosticare forme di
iperaldosteronismo senza l’utilizzo del test di conferma e con conseguente riduzione dei costi.
Dopo la conferma della positività della ratio è utile eseguire il dosaggio del 18-OHF urinario.
Il cut off per escludere ogni forma di ipertensione secondaria è 50µg/24 h; se il valore è
superiore (come nella maggior parte dei casi) proponiamo di eseguire, se disponibile, il
calcolo del prodotto dell’aldosterone in clinostatismo, per quello dello steroide ibrido urinario.
Un valore superiore a 36.500 è diagnostico di iperaldosteronismo, pertanto l’esecuzione di un
test di conferma come il carico salino sarebbe pleonastica. Al contrario, se il prodotto è
inferiore non siamo in grado di discriminare a priori se l’ipertensione sia sottesa da una forma
secondaria o no; riteniamo quindi si debba eseguire il test da carico salino. Una alternativa a
questo percorso, anche se con un’accuratezza inferiore, è il riscontro di un valore superiore o
uguale di 250 µg/24 h di 18-OHF urinario che, come già detto, discrimina con la massima
specificità un iperaldosteronismo.
Dopo aver ottenuto la conferma della diagnosi di iperaldosteronismo l’iter diagnostico
prevede l’esecuzione della TC surreni che può dare quattro tipi di risposte. La TC può essere
negativa, si tratta quindi di un’iperplasia bilaterale per cui è necessaria una terapia con
antialdosteronici. Si ricorre al cateterismo venoso solo in caso di elevata probabilità di APA
(potassio < 3 mEq/l; aldosteronuria > 30µg/24 h; aldosterone plasmatici > 250 pg/ml; età < 50
anni; ipertensione arteriosa di grado 3). All’estremo opposto è la dimostrazione di una massa
surrenalica superiore ai 3 cm; in questo caso è necessario asportare il nodo per il rischio di
evoluzione verso la malignità. Di fronte invece al riscontro di una massa di dimensioni
comprese tra i 2 e i 3 cm, la letteratura propone di eseguire il cateterismo venoso selettivo per
valutare un’eventuale lateralizzazione.
I nostri risultati danno invece prova che il riscontro di un valore di 18-OHF urinario superiore
a 450µg/24 h discrimina per un adenoma senza dover sottoporre ad AVS il paziente.
Riassumendo, gli steroidi ibridi e il 18-OHB plasmatici hanno analogo comportamento
essendo stimolati dal SRA e dall’ACTH; essi si riducono dopo carico salino, tuttavia il loro
dosaggio non ha dimostrato utilità nella diagnosi dei sottotipi di iperaldosteronismo. Il
dosaggio, invece del 18-OHF urinario, peraltro il più rapido e semplice da eseguire, è molto
informativo e permette di ridurre il numero di pazienti da sottoporre a test di conferma.
PUBBLICAZIONI
1. Increased diagnosis of primary aldosteronism, including surgically correctable forms, in
centers from five continents. P.Mulatero, M.Stowasser, KC. Loh, C.E.Fardella, R.Gordon,
L.Mosso, C.E. Gomez-Sanchez, F.VEGLIO, W.F.Young Jr.J Clin Endocrinol Metab,89(
3): 1045-50 , 2004.
2. Genetics of primary aldosteronism. P.Mulatero, F.Morello, F.VEGLIO. J Hypertension,
22(4): 663-70, 2004.
3. Diagnosis of primary aldosteronism: from screening to subtype differentiation. Mulatero
P, Dluhy RG, Giacchetti G, Boscaro M, VEGLIO F, Stewart PM.Trends Endocrinol
Metab,16(3):114-9; 2005.
512

Alessandro Vercelli Filone tematico A2
Neuroprotezione nella retina ischemica e glaucomatosa
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Anatomia, Farmacologia e Medicina Legale
CONTESTO E RAZIONALE
Nel nostro studio abbiamo analizzato gli effetti dell’ipertono oculare (elemento fondamentale
della patologia glaucomatosa, causa importante ancor oggi di molti casi di cecità per
degenerazione e perdita delle cellule gangliari retiniche) sulla morte neuronale nella retina, in
un modello sperimentale nel ratto. Tale modello induce una ischemia transitoria della retina,
con morte neuronale dovuta a meccanismi eccitotossici e con modalità di apoptosi, necrosi e
autofagia.
METODI E RISULTATI
Il modello consiste nell’indurre (mediante inserimento di una cannula nel corpo vitreo) un
aumento della pressione endoculare per 60 minuti: è stato utilizzato un sistema a caduta di
fisiologica (in base al principio di Pascal) per innalzare la pressione endoculare di ratti adulti a
120 mm Hg per 1 ora. Con questa metodica il maggior numero di cellule morte (sia nello
strato delle cellule gangliari che in quelli più profondi) è stato riscontrato a 6-12 ore
dall’insulto ischemico, tale numero decresce progressivamente fino ad annullarsi a 7 giorni.
La morte neuronale è stata valutata contando il numero di nuclei picnotici su retine montate a
piatto in toto e su sezioni trasversali di retina, con le comuni colorazioni per il sistema
nervoso (cresil violetto). I dati sono poi stati confermati mediante la tecnica TUNEL (per la
visualizzazione della frammentazione del DNA) e con tecnica immunoistochimica per la
caspasi 3 attivata (la caspasi 3 attivata è un enzima “esecutore” della morte neuronale).
Avendo in passato, sempre con tecnica immunoistochimica, messo in evidenza alcune
molecole la cui espressione varia in seguito ad ipertono (JNK, fosfo-c-Jun, p38, fosfoErk e
fosfoElk, cioè della MAP chinasi), si è proceduto ad intervenire sulla loro attività mediante
degli inibitori più o meno specifici iniettati nel corpo vitreo. Alcuni animali di età compresa
tra le 7 e le 10 settimane di vita sono stati sottoposti a iniezione intravitreale di inibitori
specifici (D-JNKI) ed aspecifici (SP600125) delle MAP chinasi. I ratti sono stati sacrificati 7
giorni dopo l’intervento e sono stati confrontati con animali di controllo (sola iniezione del
solvente in cui è disciolto il farmaco). Le retine intere, una volta montate a piatto, sono state
colorate per poi essere sottoposte ad analisi quantitativa mediante il programma Neurolucida.
L’analisi dei vetrini ha evidenziato differenze tra i due gruppi, significative negli animali
trattati con SP600125. In una serie parallela di animali, nello stesso modello sperimentale,
abbiamo valutato la possibilità che l’ischemia retinica provochi un tipo particolare di morte
neuronale, detto per autofagia, mettendo in evidenza la sua occorrenza nelle prime fasi
consecutive all’ischemia. Questo riscontro ci permetterà di utilizzare altri farmaci con cui
intervenire sui meccanismi di morte neuronale nella retina. I manoscritti relativi a queste due
osservazioni sperimentali sono in fase di preparazione.
PUBBLICAZIONI
L. Palanza, S. Jhaveri, S. Donati, R. Nuzzi and A. Vercelli "Quantitative spatial analysis of
the distribution of NADPH-d-positive neurons in the developing and mature rat retina." In
stampa su Brain Research Bulletin
513

Elisabetta Versino Filone tematico D2
Tubercolosi a Torino nel XXI secolo: ruolo dei determinanti socio
ambientali
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia
OBIETTIVI
Il presente progetto si poneva come la continuazione di un progetto di ricerca già finanziata
dal Vs. Ente nell’anno 2000. Lo studio pone dunque come continuazione di quello
precedentemente descritto, allo scopo di sorvegliare il fenomeno dell’andamento della TB tra
i residenti torinesi per un ulteriore triennio (periodo 2000-2002).
MATERIALI E METODI
La città di Torino (1 117 154 residenti nel 1981) è servita da sette ospedali generali che
curano pazienti con TB, da un ambulatorio che è riferimento provinciale per la diagnosi,
prevenzione e cura della malattia (Dispensario di Igiene Sociale - DS), e da un ospedale
infettivologico, riferimento per l’AIDS (Amedeo di Savoia - AS). Inoltre, fuori dalla città è
localizzato un grande ospedale pneumologico (San Luigi di Orbassano - SL). Per effettuare
una stima dell’incidenza di TB fra i residenti, si è deciso di estrarre manualmente tutte le
cartelle cliniche con diagnosi principale o secondaria di TB dal 2000 AL 2002 di SL, AS, DS.
Le informazioni raccolte sono state: localizzazione della malattia, patologia concomitante,
isolamento batterico (diretto e/o colturale), test cutaneo, Rx torace, con la relativa
classificazione radiologica ed esame bioptico.
Da questa rilevazione sono state identificate schede, caricate su supporto magnetico. I dati
ottenuti sono da considerarsi preliminari in quanto è ancora da verificare la residenza
anagrafica e sono ancora da effettuare controlli di completezza rispetto al sistema di notifica.
Sono così stati identificati 314 casi di TB periodo 2000-2002. Sulla base di ciò sono stati
calcolati di tassi di incidenza annuali età specifici e standardizzati sulla popolazione italiana
nell’anno 1981. I denominatori dei tassi sono stati ottenuti dalla BDDE.
RISULTATI
La tabella 1 presenta la distribuzione dei casi incidenti nel periodo 2000-2002 per ospedali e
fascia di età; si sottolinea come tali valori non corrispondano al numero di ricoveri per
tubercolosi, in quanto il presente studio si concentrava sui NUOVI CASI. LA tabella mostra
come la malattia tenda a concentrarsi nella fascia d’età giovane adulta.
514

Tabella 1. Casi di TB incidenti nel periodo 2000-2002 per ospedale e fascia d’età
2000 2001 2002
Ospedale N (%)
Amedeo di Savoia 9 (9.5) 25 (21.6) 27 (26.2)
Dispensario ASL4 7 (7.4) 15 (12.9) 7 (6.8)
San Luigi 79 (83.2) 76 (65.5 69 (67)
TOTALE 95 (100) 116(100) 103(100)
Classe d’eta’ N (%)
=75 7 (7.4) 16 (13.8) 10 (9.7)
TOTALE 95 (100) 116(100) 103(100)
Tabella 2. Tassi di incidenza di tubercolosi nel periodo 2000-2002, età specifici e
standardizzati sulla popolazione italiana 1981
515
2000 2001 2002
Classe d’eta’ Tasso *100000
=75 3.9 18.98 11.44
Tasso standardizzato 9.53 12.24 10.21
CONCLUSIONI
Secondo il nostro studio, la tendenza dei tassi di incidenza di tubercolosi a Torino sembra
continuare secondo il trend già evidenziato nell’articolo prima citato. Occorre qui sottolineare
che i casi non sono ancora stati verificati per residenza anagrafica, per cui si parla qui di casi
PRESENTI in Torino e non di casi RESIDENTI. Lo studio soffre dell’attuale limitazione di
non aver potuto effettuare il linkage con lo studio longitudinale torinese e con il registro
AIDS. L’esecuzione di tale linkage consentirà di arricchire i risultati dello studio,
concentrandosi sul ruolo di AIDS, stato sociale ed immigrazione; tali dati verranno resi
disponibili all’Ente appena possibile.

Alessandro Vigo Filone tematico C1
Utilità della Polisonnografia nel percorso diagnostico-assistenziale di
patologie pediatriche (OSAS, ALTE, Prematuranza)
Ospedale Infantile Regina Margherita
Centro SIDS
CONTESTO E RAZIONALE
Il ruolo di un Centro S.I.D.S. modernamente inteso non può che identificarsi con quello di un
Centro di studio del sonno in età pediatrica che finalizza la massima parte della propria
attività assistenziale all’inquadramento diagnostico dei disturbi respiratori del sonno ed alla
prevenzione della Sudden Infant Death Syndrome (SIDS).
OSAS
La patologia respiratoria del sonno in età pediatrica è rappresentata principalmente dalla
Sindrome delle Apee Ostruttive nel Sonno (OSAS) che interessa circa il 3% della popolazione
pediatrica altrimenti sana ed è secondaria nella maggior parte dei casi ad un quadro di
ipertrofia adenotonsillare. In Italia, il 43% degli interventi chirurgici di tonsillectomia
consegue a una diagnosi di O.S.A.S. La letteratura scientifica sottolinea ormai da molto tempo
come la diagnosi clinica di O.S.A.S. sia scarsamente affidabile, generando un problema di
appropriatezza delle scelte terapeutiche. Un inquadramento preciso dell’O.S.A.S.
necessiterebbe di uno studio strumentale del sonno: data l’impossibilità pratica di sottoporre
tutti i pazienti con sospetto di O.S.A.S. ad un’indagine polisonnografica completa in regime di
ricovero (per l’assoluta carenza di strutture e personale specialistico), sono state messe a
punto delle metodiche di indagine semplificate che pur mantenendo un accettabile standard di
affidabilità rendono possibile l’effettuazione domiciliare dell’esame senza sorveglianza diretta
da parte di personale tecnico. Si tratta del monitoraggio notturno cardiorespiratorio integrato
con saturimetria validata e della polisonnografia respiratoria notturna.
Strettamente connesso al problema dell’appropriatezza diagnostica è quello della valutazione
del rischio operatorio nel paziente pediatrico. La consuetudine generalmente diffusa di
attendere i 4 anni di età per procedere alla chirurgia adenotonsillare, anche in pazienti che
sono sintomatici dai primi mesi-anni di vita, consegue proprio alla consapevolezza,
confermata in parte dalla letteratura (per i pazienti < ai 2 anni di età), della maggior
suscettibilità di questi pazienti a sviluppare complicanze peri- e postoperatorie. La diretta
conseguenza di questo modo di procedere è l’impossibilità pratica a intervenire per risolvere
un’OSAS in questa fascia di età: e la letteratura ci dice che sono proprio i pazienti che
soffrono di un OSAS più grave (e quindi necessitano di una correzione rapida) ad aver un
maggior rischio operatorio. Esistono buone evidenze che uno studio semplificato del sonno
possa individuare con ragionevole affidabilità i pazienti a rischio, prevedendo per loro
modalità di intervento protette (monitoraggio cardiorespiratorio e saturimetrico perioperatorio
di 24 ore e disponibilità di struttura rianimatoria per eventuali necessità).
La prevenzione della SIDS
Le attività tradizionali di diffusione delle corrette pratiche di prevenzione (nella nostra
Regione inserite in prima pagina nell’agenda di salute del bambino, che lo accompagna dalla
nascita), e l’osservatorio epidemiologico (che in Piemonte consiste in una attività di indagine
specifica con procedure codificate per ogni caso di morte nel primo anno di vita da parte del
516

personale dei SISP opportunamente) sono importanti e necessarie ma assolutamente non
sufficienti: va garantita anche una corretta indagine diagnostica sui casi a rischio, che può
esitare, quando necessario, in un intervento terapeutico mirato e/o nella decisione ponderata
(dati i costi economici per la comunità e quelli relativi al disagio provocato alla famiglia) di
intraprendere una monitorizzazione continua domiciliare, assistendo il paziente in
telemedicina. La recente letteratura scientifica ha individuato nell’ambito della popolazione a
rischio di SIDS 2 principali categorie di pazienti che sono:
1. i bambini nati pretermine
2. i bambini affetti da Apparent Life Threatening Event (ALTE).
1. L’effettuazione di un MCR per 24 ore nei bambini nati pretermine (

343 Monitoraggi Cardiorespiratori (MCR-Traccia ECG, Escursione Toracica e Saturazione
d’Ossigeno) per individuare:
1. possibili eventi estremi, quali desaturazioni, bradicardie e\o apnee (prematuri e lattanti
ALTE) per precisare quando possibile la diagnosi causale e decidere in merito ad una
eventuale monitorizzazione domiciliare continua;
2. desaturazioni nel sonno (bambini sospetti OSAS) per decidere in merito ad intervento di
adenotonsillectomia ed individuare i pazienti a rischi perioperatorio.
Nei lattanti con pregressa ALTE è stata effettuata contemporanea pHmetria esofagea a 2
canali per correlare gli eventi suddetti, quando presenti, ad eventuale Reflusso Gastro-
Esofageo Acido Patologico ed in tal caso avviare adeguata terapia. Per una più precisa
definizione diagnostica, quando necessario sono state effettuate:
181 Polisonnografie Respiratorie a 8 canali (flusso nasale registrato attraverso nasocannula,
escursione toracica, escursione addominale entrambe registrate con bande pletismografiche,
saturazione d’ossigeno, frequenza cardiaca, russamento, movimento e posizione corporea).
Eseguite nell’ambito dell’iter diagnostico dell’OSAS quando l’esito del MCR è negativo o
non conclusivo per OSAS.
30 Polisonnografie a 19 canali (9 canali EEG, 2 canali Elettrooculografia, elettromiografia
mentoniera, flusso nasale, escursione toracica. escursione addominale, saturazione d’ossigeno,
Traccia ECG, russamento e posizione corporea) eseguite quale approfondimento diagnostico
di II livello su neonati nati pretermine con persistenza di eventi patologici nelle registrazioni
del MCR domiciliare e su lattanti affetti da ALTE con MCR patologici o eventi recidivanti.
I MCR, le pHmetrie ed le Polisonnografie a 8 canali sono state avviate in regime
ambulatoriale (con preparazione degli strumenti, applicazione dei sensori al bambino ed
adeguata istruzione della famiglia circa le modalità d’esecuzione degli esami stessi) ed
effettuati in regime domiciliare.
Le polisonnografie a 19 canali sono state eseguite in regime di ricovero notturno (durata
quindi di 12 ore), con l’assistenza di un tecnico di neurofisiologia opportunamente
convenzionato con i fondi del Progetto presso la Terapia Intensiva Neonatale, in uno spazio
gentilmente concesso dal Prof. Fabris, Direttore di tale Struttura, poiché a tutt’oggi il Centro
di Riferimento per la SIDS non ha a disposizione posti letto dedicati. Ciò comporta una
importante limitazione per l’attività diagnostico assistenziale: nel caso della polisonnografia a
19 canali ad esempio, questa può essere effettuata solo su pazienti con età e peso adeguati ad
una culla neonatale, escludendo a priori lattanti, divezzi e bambini (nonostante la presenza di
strumentazione idonea e personale adeguatamente preparato per l’esecuzione di questo esame
in qualunque fascia di età pediatrica). Data la disponibilità di un solo giorno alla settimana del
locale concesso non è stato ancora possibile esaurire il debito orario previsto nella
convenzione, che risulta pertanto ancora in corso.
518

Marco Vincenti Filone tematico B2
Sviluppo di metodi analitici per l'individuazione e la quantificazione di
microinquinanti negli alimenti
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Chimica Analitica
CONTESTO E RAZIONALE
Il 23 novembre 1970 la Comunità Europea deliberava la Direttiva 70/524/CEE relativa agli
additivi permessi nell’alimentazione degli animali destinati al consumo umano. Da allora
molte delle sostanze contenute in quella direttiva sono state vietate con successivi
aggiornamenti e modifiche. Infatti studi chimici, clinici e tossicologici, volti ad assicurare la
sicurezza alimentare per il consumatore, individuano progressivamente nuovi rischi per la
salute umana, conseguenti all’assunzione attraverso gli alimenti di sostanze che esplicano
attività biochimiche e farmacologiche indesiderate. Ne consegue che il controllo in fase di
allevamento (sui mangimi utilizzati e sul latte) e post-macellazione (urine, muscolo, fegato)
per le sostanze vietate deve rendersi progressivamente più accurato e più sofisticato.
MATERIALI E METODI
In questo progetto sono stati studiate diverse classi di antibiotici e di ormoni anabolizzanti
utilizzate in ambito veterinario, illegalmente e legalmente, e che possono essere divise in due
categorie: (a) sostanze vietate; (b) sostanze il cui uso è consentito, entro certe dosi, tempo (tra
la somministrazione e la macellazione dell’animale), limiti di residuo (nelle carni, nel latte).
Il progetto originario prevedeva come obiettivo primario la messa a punto di metodiche
chimico-analitiche per la determinazione di sulfamidici, nitrofurani e cloramfenicolo, a cui far
seguire un’eventuale successiva estensione del lavoro ad altre classi di antibiotici. L’obiettivo
primario è stato raggiunto e la fase di validazione dei metodi è in corso. Segnalazioni di
opportunità da parte della Regione Piemonte ci hanno indotto a estendere la ricerca
metodologica alla sola classe degli antibiotici di tipo chinolonico, ma nel contempo ad
allargare le ricerche ad alcuni importanti ormoni anabolizzanti e corticosteroidi. Alcuni dei
metodi sviluppati e proposti hanno già raggiunto un livello di verifica e di approfondimento
considerevole (cloramfenicolo, steroidi anabolizzanti), mentre per altri è da poco iniziata la
fase di validazione analitica su diverse matrici. Al momento, pertanto, i metodi messi a punto
non sono ancora stati pubblicati, in relazione ai tempi necessari allo svolgimento di protocolli
di validazione completi, che sono in corso.
La messa a punto di metodi per la ricerca delle sostanze citate in matrici biologiche
diversificate mediante tecniche HPLC-MS e HPLC-MS/MS ha previsto, come di regola, le
seguenti fasi: (i) individuazione delle caratteristiche chimiche e chimico-fisiche della
molecola (struttura, solubilità, eventuale assorbimento della luce); (ii) ricerca bibliografica;
(iii) reperimento degli standards analitici; (iv) messa a punto della metodica di analisi sugli
standards; (v) messa a punto delle metodiche di estrazione su matrici biologiche diverse; (vi)
valutazione dei recuperi, del limite di rilevabilità, della sensibilità e altri parametri statistici.
519

RISULTATI
I risultati raggiunti per gli analiti di interesse sono riassunti di seguito.
Cloramfenicolo. Sostanza vietata dall’Unione Europea (CE 2701/94). Poiché il
cloramfenicolo è uno degli antibiotici più frequentemente utilizzati nell’allegamento animale
e viene di regola addizionato ai mangimi, è stato messo a punto un metodo di estrazione di
tale antibiotico dai mangimi (per il momento, mangimi bovini), e di successiva purificazione
degli estratti e analisi in HPLC-MS (analisi in condizioni isocratiche utilizzando metanolo e
acido formico).
Nitrofurani e Nicarbazine. Sostanze vietate con il Regolamento Europeo 1442/95. E’ stata
messa a punto la metodica di separazione ed analisi mediante HPLC-MS (analisi in gradiente
utilizzando acetato di ammonio ed acetonitrile).
Sulfamidici. E’ stata messa a punto la metodica di separazione ed analisi mediante HPLC-MS
(separazione in gradiente utilizzando ammonio acetato-metanolo). La maggiore difficoltà che
si riscontra in tali analisi è data dall’elevato numero di sostanze appartenenti a questa famiglia
di farmaci, comunemente utilizzate nelle terapie antibatteriche. Nel nostro caso abbiamo preso
in considerazione nove diversi sulfamidici.
Chinolonici. E’ stata messa a punto la metodica di separazione ed analisi mediante HPLC-
MS di quattro diversi antibiotici di tipo chinolonico (analisi in gradiente con acetato di
ammonio, acetonitrile e tetraidrofurano).
Ormoni steroidei. Dal 1996 è in vigore la direttiva europea 96/22/CEE relativa al controllo di
residui nei prodotti di origine animale che non tollera la presenza di anabolizzanti sintetici
(categoria A3: sostanze ad effetto anabolizzante-sostanze non autorizzate-steroidi). E’, quindi,
indispensabile il controllo puntuale e capillare sia in fase di allevamento sia postmacellazione.
Le urine rappresentano la matrice ideale per il controllo durante queste fasi,
poiché gli ormoni, una volta esplicata la loro azione, vengono inattivati dal fegato e quindi
eliminati per via urinaria. Pertanto, è stata messa a punto una metodica di estrazione delle
urine bovine (solido-liquido su colonne di immunoaffinità), e, in parte, su mangimi
(estrazione solido-liquido su colonne C18) con successiva analisi mediante HPLC-MS (analisi
in gradiente utilizzando diclorometano e metanolo) per testosterone, epitestosterone,
boldenone, boldione ed androstenedione. E’ stata, inoltre, messa a punto l’analisi dei derivati
glucuronati di testosterone, epitestosterone, β-boldenone su urine (estrazione con colonne C18
e gradiente ammonio acetato-metanolo), e di corticosteroidi quali prednisone, flunisolide,
triamcinolone acetonide, flumetasone, triamcinolone, beta- e desametasone, sempre sulle
urine.
Per i seguenti composti è stata effettuata una ricerca bibliografica sui metodi analitici esistenti
in letteratura: (i) Coccidiostatici (11 molecole vietate con il regolamento della Comunità
Europea 2205/01); (ii) Carbadox e Olaquindox (vietati dal regolamento della Comunità
Europea 2788/98); (iii) Zinco-Bacitracina, Spiramicina, Virginiamicina, Fosfato di Tilosina
(vietati con il regolamento della Comunità Europea 2821/98).
520

Elsa Viora Filone tematico C2
Valutazione dell’appropriatezza dell’ecografia in gravidanza dopo
adeguata preparazione degli operatori
A.S.O. O.I.R.M. S. Anna
Centro di Ecografia e Diagnosi Prenatale
CONTESTO E RAZIONALE
La prevenzione e la diagnosi precoce, in epoca prenatale, di patologie congenite (
malformazioni, anomalie genetiche, da ipossia fetale) possono migliorare significativamente
l’esito neonatale con positive conseguenze sui costi emozionali, sociali e finanziari che
gravano sulle famiglie coinvolte e sulla società. Il D.M. n. 245 del 20 ottobre 1998 prevede la
possibilità di effettuare tre esami ecografici nel corso della gravidanza. Quando si valuta il
ruolo dell’ecografia in gravidanza è importante distinguere tra ecografia “standard” ( di primo
livello) riservata alle donne che fanno riferimento ai centri operanti su tutto il territorio
regionale, ed ecografia dettagliata , ad alta risoluzione in tempo reale, riservata alle donne che
presentano un rischio maggiore di anomalie fetale strutturali ( o sulla base della storia
familiare, o anamnestica , o su indicazioni attuali ); quest’ultimo tipo di ecografia è
generalmente riservata ai Centri di secondo e terzo livello, richiede oltre che un maggior
dispendio di tempo, anche l’utilizzo di operatori ecografisti altamente esperti.
La Regione Piemonte ha messo in atto un procedimento per cercare di migliorare sia la
quantità che la qualità delle prestazioni erogate nell’ambito dell’ecografia in gravidanza
effettuando nel 2002 un Corso di Formazione in Ecografia Ostetrica, finanziato
dall’Assessorato alla Sanità, rivolto a tutti i medici ostetrici-ginecologi operanti presso le
Strutture Pubbliche ( ASL-ASO ) della regione, al quale ha partecipato almeno un medico per
ogni Dipartimento Materno-Infantile.
Il corso si è svolto, per la parte teorica durata 4 giorni, presso l’Azienda Materno-Infantile
OIRM-Sant’Anna, ed è stato ripetuto due volte per poter offrire la possibilità di frequentare al
maggior numero possibile di operatori senza creare disagio all’organizzazione del lavoro nelle
singole ASL-ASO. La parte pratica, della durata di 1 settimana, è stata organizzata in due fasi:
• i singoli operatori medici ( massimo due alla volta) hanno frequentato per un giorno il
Centro di Ecografia e Diagnosi Prenatale dell’Ospedale Sant’Anna- Dipatimento 1 , per
assistere all’attività ambulatoriale e prendere visione dell’organizzazione del Centro.
• Gli operatori medici del Centro di Ecografia e Diagnosi Prenatale dell’Ospedale
Sant’Anna- Dipatimento 1 , si sono recati per quattro giorni consecutivi presso ogni
Dipartimento Materno Infantile della Regione per svolgere insieme l’attività e discutere
l’organizzazione del Servizio di Ecografia ,la modalità di esecuzione dell’esame, la
refertazione scritta dell’esame ecografico secondo le Linee Guida proposte dalla SIEOG
(Società Italiana di Ecografia Ostetrica e Ginecologica), la documentazione da allegare e
l’archiviazione dei dati.
Ogni Dipartimento Materno Infantile ha ottenuto uno specifico finanziamento per l’acquisto
di un ecografo dedicato agli esami in gravidanza. Abbiamo valutato quale è stato l’impatto di
questa preparazione teorico-pratica degli operatori dei servizi territoriali (effettuata anche “in
loco”) nella pratica clinica ai fini di un miglioramento delle prestazioni in termini di
appropriatezza.
521

MATERIALI E METODI
Presso il Centro di Ecografia e Diagnosi Prenatale dell’Ospedale Sant’Anna viene utilizzato
un soft-ware che consente la refertazione e l’archiviazione sia dei dati anamnestici della
paziente che degli esami ecografici effettuati per cui è stato possibile esaminare tutta la
documentazione relativa alla casistica del periodo preso in esame. Sono stati considerati due
periodi:
1. dal 1 gennaio 2000 al 31 dicembre 2001,
2. dal 1 gennaio 2003 al 31 dicembre 2004.
Di ogni periodo sono stati valutati il n° di esami con indicazione “sospetta patologia fetale” e
sono stati inclusi in questo gruppo tutti gli esami che avevano come indicazione: sospetta
malformazione, oligo/polidramnios, screening positivo e gravidanza a rischio per
malformazione. E’ stato quindi considerato il n° di invii con tali indicazioni nei due periodi ed
il rapporto fra tale numero ed il numero totale degli esami effettuati. E’ stato inoltre
considerato il numero di casi in cui effettivamente è stata rilevata una patologia fetale
(malformazione oppure iposviluppo) e quindi il rapporto tra i casi inviati (n° pazienti inviate)
e di casi in cui era presente una patologia fetale (n° feti in cui era presente una patologia).
RISULTATI
Sono stati effettuati:
• 28.136 esami ecografici in gravidanza nel periodo dal 1 gennaio 2000 al 31 dicembre
2001,
• 31.845 esami ecografici in gravidanza nel periodo dal 1 gennaio 2003 al 31 dicembre
2004.
1. Nel periodo dal 1 gennaio 2000 al 31 dicembre 2001 sono stati eseguiti 4.461 esami per
sospetto di patologia malformativa fetale pari al 15,8% degli esami totali. Sono state
inviate 1.890 gravidanze per sospetto di patologia fetale e di queste in 254 casi (pari al
13,4%) è stata riscontrata una patologia fetale.
2. Nel periodo dal 1 gennaio 2003 al 31 dicembre 2004 sono stati eseguiti 6.048 esami
ecografici esami per sospetto di patologia malformativa fetale pari al 19 % degli esami
totali. Sono state inviate 2.887 gravidanze per sospetto di patologia fetale e di queste in
467 casi (pari al 16,1%) è stata riscontrata una patologia fetale.
Tutti i dati sono riassunti nella tabella:
N° di esami N° esami effettuati N° pazienti inviate Patologie fetali
per sospetto di per sospetto di diagnosticate
patologia fetale patologia fetale
Periodo 01/01/2000-
31/12/2001
28.136 4.461 (15,8%) 1.890 254 (13,4%)
Periodo 01/01/2003-
31/12/2004
31.845 6.048 (19%) 2.887 467 (16,1%)
Totale 59.981 10.509 (17,5%)
Tale aumento sia in numero assoluto sia in proporzione degli esami effettuati per sospetto di
patologia fetale ha portato indirettamente ad una riduzione del numero di prestazioni
diagnostiche improprie e quindi anche ad una riduzione delle liste d’attesa relative
all’ecografia cosiddetta di II-III livello. Inoltre si è avuto un miglioramento nella
appropriatezza degli invii, infatti si è osservato un aumento, oltre che in numero assoluto
anche in percentuale, di casi con patologie fetali confermate all’esame di secondo livello.
522

Pierantonio Visentin Filone tematico A3
Benchmarking sulla sicurezza delle attività sanitarie e di ricerca
ASO San Giovanni Battista di Torino
S.C.D.U. Geriatria
CONTESTO E RAZIONALE
Nel monitoraggio nazionale sul D.L.gs 626/94, la Regione Piemonte si è discostata dalla
metodologia adottata dalle altre Regioni, facendo autocompilare i questionari dalle aziende e
sovrastimando l’applicazione del decreto. Mancano confronti fra aziende sanitarie
sull’applicazione del 626 e non vi sono operazioni di benchmarking (confronti valutativi) per
favorire il trasferimento delle buone pratiche prevenzioanali.
OBIETTIVI
1. Valutare l’applicazione del 626 nelle aziende sanitarie del Piemonte, con raccolta delle
informazioni da parte dei RLS, per conoscere il punto di vista dei lavoratori.
2. Confrontare i modelli prevenzionali delle aziende sanitarie per sviluppare ipotesi di
intervento.
3. Avviare un benchmarking tra operatori della prevenzione, per favorire il trasferimento dei
modelli organizzativi virtuosi.
MATERIALI E METODI
DISEGNO DELLO STUDIO. Studio osservazionale con rilevamento trasversale dei dati nel
maggio 2004.
PARTECIPANTI. 76 RLS di 28 aziende sanitarie e universitarie piemontesi: 7 ASO, 22 ASL,
2 Enti ospedalieri autonomi afferiti al SSN dopo l’inizio dello studio, 2 Università degli Studi
(non hanno partecipato 5 ASL per indisponibilità dei RLS). Il benchmarking è stato proposto
a RSPP e Medici competenti di 7 aziende.
VARIABILI. Norme del D.L.gs 626/94 (Titolo I, Capo I, II, IV, V, VI). Misure per l’
emergenza, la tutela della salute riproduttiva, la protezione da rischi ospedalieri; indice casemix
e infortuni.
ANALISI. Variabilità; distribuzione di frequenze; confronti fra gruppi con test t di Student
per dati non appaiati per le variabili continue, con test esatto di Fisher per le variabili
dicotomiche (package statistico SPSS).
RISULTATI
1. Le 28 aziende hanno 48.009 dipendenti, occupati in 1.148 Strutture Complesse che hanno
ricoverano 383.392 pazienti nel 2004 (range dell’indice case-mix = 0,56 – 1,62). Solo 10
Direttori generali (38,5%) hanno attribuito le deleghe secondo le indicazioni della
Regione Piemonte; il 44,0% dei Direttori non ha designato i Dirigenti, il 52,0% non ha
designato i Preposti; i Gruppi di Coordinamento 626 Aziendali sono pressoché inesistenti.
523

Gli organici dei SPP sono inferiori agli standard fissati dalla Regione (media 55,1%, range
25,1-94,2%). Nel 44,4% delle aziende il documento di valutazione è redatto senza la
consultazione preventiva dei RLS, nel 34,6% non riporta la programmazione degli
interventi; un’azienda sanitaria sarebbe ancora priva del documento di valutazione dei
rischi! Solo nel 46,4% delle aziende presenta esaurientemente tutti gli argomenti previsti
per la riunione periodica; nel 28% la riunione periodica è svalutata a semplice
adempimento burocratico-formale, nel 26,9% il verbale non viene fatto firmare ai RLS e
nel 7,1% non viene nemmeno redatto. Le procedure sono presenti in tutti i luoghi di
lavoro solo nel 57,1% delle aziende. Pur affidando molti servizi a ditte esterne, il 21,4%
delle aziende non formalizza la cooperazione per la prevenzione con altri Datori di lavoro
(art. 7 del D.L.gs 626/94) e manca persino la convenzione fra SSN e Università. Molti dei
76 RLS non vengono consultati per la valutazione dei rischi (35,1%), l’individuazione,
programmazione, realizzazione e verifica della prevenzione (43,5%), la designazione
degli addetti al SPP (42,3%) e alla prevenzione incendi, pronto soccorso ed evacuazione
(31,9%). Spesso è negata la documentazione dovuta su macchine e impianti (64,0%),
sostanze pericolose (52,0%), organizzazione e ambienti di lavoro (51,3%), infortuni e
malattie professionali (39,7%), misure di prevenzione (35,1%), valutazione dei rischi
(29,3%).
2. Nei confronti fra aziende, nelle ASO i componenti dei SPP sono il 68,9% dello standard
regionale, mentre nelle ASL sono solo il 46,3% (p

SUGGERIMENTI DELLA RICERCA
Sono indispensabili politiche ad ampio raggio per la tutela del lavoro negli ospedali
(dall’identificazione delle priorità per gli investimenti fino all’adeguamento delle funzioni di
controllo). Interventi strutturali ed organizzativi devono procedere parallelamente, perché si
osservano gravi irregolarità anche in reparti appena ristrutturati. La DGR n. 38-25949 del
16/11/98 e le linee-guida prot. n. 6577/27.002 del 29/4/02 vanno applicate, oppure è
necessario modificarle. Vanno incentivate le aziende che hanno buoni sistemi di prevenzione
aziendale, che fanno la consultazione dei RLS e che adottano correttamente le procedure;
vanno sostenute con azioni mirate le aziende ad elevata complessità.
NOTA: la relazione conclusiva include dati sui rischi specifici e sugli incidenti occupazionali.
525

Enrico Zanalda Filone tematico A5
Patologia mentale e disabilita' sociale: "un modello di intervento per la
prevenzione e la riabilitazione in ambito lavorativo"
Asl 6 Dipartimento di Salute Mentale
CONTESTO E RAZIONALE
Il presente progetto è stato avviato per offrire un sostegno ai pazienti cronici in buon
compenso psichico in carico al nostro servizio ed inseriti in una fase "avanzata" del
programma riabilitativo, nel corso del quale vengono attivati dei "Tirocini Orientativi
Formativi" (T.O.F.). La scelta di offrire uno spazio strutturato che consenta di affrontare le
difficoltà prevalentemente di ordine relazionale è nata dalla riflessione che la maggior parte
dei fallimenti riscontrati avevano avevano come causa principale il disagio nell'adeguamento
al contesto relazionale dell'ambiente lavorativo. Di conseguenza, si è deciso di approntare
questo intervento organizzato con la realizzazione di due gruppi di self-help condotti da due
psicologi, al fine di accompagnare in itinere l'esperienza del tirocinio. Si è scelto il modello
del gruppo di Self- Help e lo si è adattato alle esigenze dei nostri pazienti per facilitare la
comunicazione e contenere i momenti di possibile crisi, valutando inoltre che l'impatto con
una "naturale" resistenza al cambiamento, dovuta ad ansia e senso di inadeguatezza, possa
determinare un'adesione solo parziale ad un programma che preveda situazioni nuove.
OBIETTIVI
1. Valutazione e riduzione delle problematiche relazionali in pazienti con disagio cronico.
2. Incremento dell'autostima, della capacità di aderire alle regole e della capacità di
interpretare correttamente le dinamiche relazionali presenti nell'ambiente di lavoro.
3. Miglioramento delle capacità di interazione all'interno dell'esperienza di tirocinio.
4. Attivazione della dimensione progettuale - spesso carente nei pazienti psichiatrici - volta
al prosieguo, una volta terminata l'esperienza TOF, della ricerca di un lavoro coerente con
le proprie capacità.
MATERIALI E METODI
Strumenti
I pazienti sona stati valutati prima dell'esperienza di gruppo e rivalutati al termine
dell'esperienza con gli stessi strumenti conoscitivi.
• Somministrazione di un questionario di autovalutazione per otto diverse dimensioni
(motivazione interna, autostima, autocritica, tolleranza della frustrazione, senso di
responsabilità, rispetto delle regole, desiderio di contatto sociale e capacità di contatto
sociale), che è stato costruito ad hoc dallo staff del Servizio scrivente ed è stato normato
su un campione di 125 soggetti (57 M; 68 F) appartenenti alla popolazione non
psichiatrica.
• Somministrazione della WAIS-R (Wechsler Adult Intelligence Scale, Wechsler 1981).
• Somministrazione del S.I.V. (Survey Interpersonal Value, L.V. Gordon 1960).
526

• Somministrazione dello STAI Xl e X2 (State-Trait Anxiety Inventory di Spielberger,
Gorsuch e Lushene, 1970).
• Somministrazione dell’intervista V.A.D.O. (Valutazione Abilità - Definizione Obiettivi)
strumento messo a punto da un gruppo di lavoro dell'IRCCS Fatebenefratelli di Brescia,
dell'Istituto Superiore di Sanità e dell'Istituto di Psichiatria del II Ateneo di Napoli.
• Valutazione da parte dello psichiatra referente attraverso una scheda di valutazione
relativa ai punti di forza e di debolezza del proprio paziente inviato al gruppo.
Modello d'intervento
Sono stati attivati due gruppi (6 soggetti per gruppo) di Self-Help (della durata di 9 mesi il
primo e di 6 mesi il secondo) a cadenza settimanale con incontri di 90 minuti per consentire ai
soggetti di:
• condividere la propria esperienza personale riconoscendo l'utilità formativa sia delle
espenenze positive sia di quelle negative.
• Ricevere sostegno nella rielaborazione delle difficoltà incontrate durante la realizzazione
di tirocini formativi.
• Utilizzare l'esperienza gruppale come training all'interazione sociale.
L'intervento dei conduttori ha spaziato da azioni rivolte alla facilitazione della comunicazione
sino ad interventi più direttivi quali l'organizzazione di role-playing e di simulazioni.
RISULTATI
• I due gruppi hanno evidenziato un miglioramento nella dimensione dell'espressività
personale ed un incremento di consapevolezza rispetto alle difficoltà relazionali, che sono
emerse e sono state riconosciute dai pazienti stessi.
• La maggior parte dei parametri misurati ha subito uno spostamento verso i valori
normativi.
• L'assiduità nella presenza al gruppo della maggior parte dei soggetti rappresenta un
risultato decisamente positivo con pazienti cronici.
• La valutazione offerta dagli psichiatri, rispetto al miglioramento della tenuta alla "cura"
evidenzia che la direzione intrapresa può portare ad un incremento della compliance.
• Anche dal punto di vista dei T.O.F. i risultati sono incoraggianti infatti, sui 12 pazienti che
hanno partecipato ai gruppi Self-Help sulle abilità sociali, possiamo evidenziare che:
- 2 soggetti sono passati dal Tirocinio all'assunzione
- 1 soggetto è passato dal corso di formazione al T. O.F.
- 6 soggetti hanno mantenuto il T.O.F.
- 2 soggetti non sono stati inseriti in T.O.F. ma verso di loro si è determinato un
cambiamento di progetto riabilitativo, più adeguato alle loro reali potenzialità, che sta
offrendo attualmente buoni risultati.
- 1 soggetto ha abbandonato il T.O.F. (per una riacutizzazione della sintomatologia).
CONCLUSIONI
L'impianto generale del Progetto offre buone prospettive rispetto all'incremento delle abilità
relazionali nell'ambiente di lavoro protetto che caratterizza i T.O.F.; ricordiamo che erano
527

soprattutto le difficoltà relazionali a causare i frequenti abbandoni ed i fallimenti negli
inserimenti lavorativi. I nostri risultati hanno evidenziato un netto miglioramento delle abilità
di coping da parte del gruppo sperimentale. Dalla messa a punto di un impianto progettuale di
questa portata, si può concludere che un'attenta analisi dei bisogni e delle potenzialità dei
pazienti, sostenuta anche con l'ausilio di strumenti di valutazione standardizzati, favorisca la
realizzazione di progetti riabilitativi integrati ed efficaci.
L'attivazione di un gruppo di self-help con queste caratteristiche, risulta essere un valido
strumento a sostegno del percorso riabilitativo intrapreso, considerato anche che una
riduzione degli abbandoni nei T.O.F. rappresenta un'ottimizzazione delle risorse impiegate dal
servizio.
528

Maria Maddalena Zanone Filone tematico C1
Espressione della nefrina nell’endotelio delle isole pancreatiche: ruolo
nel diabete di tipo 1 e nel trapianto di isole
ASO San Giovanni Battista di Torino
OBIETTIVI
La vascolarizzazione delle isole pancreatiche possiede aspetti unici che ne influenzano la
funzione. Infatti, con morfologia sorprendentemente simile alla rete capillare glomerulare
renale, le isole sono vascolarizzate da vasi che, penetrati nell’isola, si ramificano in una densa
rete di capillari sinusoidali, e, come nel glomerulo, l’endotelio in microscopia elettronica è
fenestrato. Questi capillari fenestrati sono fondamentali, non solo per il trasporto fisiologico
di ossigeno e sostanze nutritive, ma anche per la modulazione di segnali di comunicazione
intra ed extravascolari, ed indurrebbero l’espressione del gene dell’insulina durante lo
sviluppo embrionale. Inoltre, le cellule endoteliali (CE) appaiono regolare la sensilibilta’ ai
livelli di glicemia.
In questo contesto, ed alla luce della nota eterogenita’ di fenotipo e funzione tra le CE
derivate da tessuti diversi, nel presente programma di ricerca si sono isolate, purificate e
caratterizzate CE di isole pancreatiche umane, ed in particolare si e’ investigata la espressione
di una glicoproteina, la nefrina, caratteristica della membrana dei podociti del glomerulo
renale. Recenti studi indicano infatti che la espressione della nefrina non sarebbe limitata ai
podociti, ma sarebbe sorprendentemente espressa anche nel pancreas, con esatta
localizzazione pero’ ancora incerta. La nefrina, non avrebbe solo funzioni strutturali e di
regolazione della permeabilita’ cellulare, ma appare essere una proteina di adesione e di
segnale, coinvolta nella regolazione di proliferazione, differenziazione ed apoptosi cellulare.
RISULTATI
Sono state isolate, purificate e coltivate CE estratte da isole pancreatiche umane, ottenendo un
alto grado di purificazione. In microscopia elettronica a scansione le cellule appaiono
allungate, senza il caratteristico aspetto ad acciottolato delle CE; sono presenti fenestrature ed
il trattamento con TNF alfa determina una retrazione citoplasmatica con perdita dei contatti
tra le cellule. Le cellule esprimono tutti i classici marker endoteliali, quali CD105, CD 146,
CD31, e fattore VIII, valutati in citofluorimetria e, soprattutto, mantengono capacita’ di
attivarsi in risposta a diversi stimoli, tra i quali il TNF alfa, come indicato dalla upregolazione
di molecole di adesione (ICAM-1 e VCAM-1). La coltivazione delle cellule in
alte concentrazioni di glucosio ha determinato un progressivo raggrinzimento e distacco delle
cellule, con riduzione di circa il 20% del numero di cellule dopo una settimana, rispetto a
concentrazioni fisiologiche di glucosio.
Mediante tecniche di immunofluorescenza si e’ evidenziata la espressione della proteina
nefrina, esclusivamente nelle CE di isole pancreatiche, e non in altre cellule endoteliali quali
le HUVEC o HMEC, a conferma che la vascolarizzazione delle isole pancreatiche ha
caratteristiche peculiari ed e’ simile alla rete capillare glomerulare renale. Si sono utilizzati sia
anticorpi diretti contro il dominio intracellulare, in CE permeabilizzate, che contro quello
extracellulare, in CE non permeabilizzate. La espressione di nefrina e’ stata confermata in
citofluorimetria; in una analisi a due parametri inoltre, tutte le CE esprimenti nefrina erano
529

contemporaneamente positive anche per il fattore di von Willebrand, inequivocabilmente
confermando il fenotipo endoteliale di tali cellule.
Mediante staining con immunogold in microscopia a scansione, la nefrina appare localizzata
sulla superficie cellulare, senza accumulo a livello delle giunzioni tra le cellule, a differenza
di quanto descritto per i podociti. La espressione e’ stata confermata anche su sezioni di
pancreas umano in immunofluorescenza; la proteina si localizza esclusivamente all’interno
dell’isola di Langherans e colocalizza con i vasi, mentre e’ assente a livello del pancreas
esocrino.
L’espressione della nefrina e’ stata confermata a livello sia di proteina che di RNA nelle CE
estratte, mediante esperimenti di western blotting e di amplificazione genica, rispettivamente.
Nelle CE, in WB, il peso molecolare della nefrina e’ di circa 160 kDa, mentre i podociti, usati
come controllo, esprimono una proteina con un peso molecolare piu' elevato (180kDa), come
descritto. Tale discrepanza potrebbe essere dovuta alla espressione nelle CE di una variante, l'
alfa-nefrina, in cui non e’ presente un esone codificante per un dominio transmembrana. In
alternativa, la discrepanza potrebbe essere legata a modifiche post-trascrizionali della
proteina, quali una ridotta glicosilazione.
In studi di modulazione della espressione di tale proteina da parte di vari stimoli, si e’
evidenziato che il TNF alfa determina una ridistribuzione focale della proteina, in uno o piu’
aggregati (fenomeno di capping), come nei podociti, per effetto del TNF sul citoscheletro. La
coltura delle CE in alto glucosio, fino ad otto giorni, non appare invece modificare la
distribuzione o la espressione di nefrina. Anche nei podociti del resto, alti livelli di glucosio
non modificano la espressione della nefrina, che e’ invece ridotta da prodotti di glicosilazione
avanzata e dalla angiotensina.
Studi ulteriori sono necessari per chiarire quale potrebbe essere il ruolo della nefrina nelle
isole pancreatiche. Anche nelle CE di isola, la nefrina, potrebbe funzioni di segnale, coinvolta
in diversi processi cellulari, e non solo una funzione strutturale. Non sono comunque al
momento noti i meccanismi con cui tali segnali vengono modulati, ne’ quali siano i ligandi
della nefrina. Studi su animali indicano che le CE sono coinvolte nelle sensibilita’ dell’isola ai
livelli di glicemia; la delezione del VEFG, necessario per il mantenimento delle fenestrature
nelle CE, determina ispessimento del corpo cellulare ed una alterata tolleranza al glucosio.
Tali modifiche potrebbero coinviolgere la nefrina, in quanto si e’ dimostrato che la sua
espressione e’ ridotta nei glomeruli renali di topi trattati con anticorpi neutralizzanti anti-
VEGF.
530

Gian Paolo Zara Filone tematico C1
La Farmacogenetica per l’individualizzazione della terapia e la
prevenzione delle reazioni avverse da farmaci
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Anatomia, Farmacologia e Medicina Legale
OBIETTIVO
Il progetto si prefiggeva come obiettivo generale la nascita di un servizio di farmacogenetica
per la tipizzazione genetica di pazienti sottoposti a terapia con farmaci la cui eliminazione o
bioattivazione seguissero una via metabolica i cui enzimi coinvolti fossero soggetti ad un
polimorfismo genetico. Dall’obiettivo generale sono stati identificati e riportati nel
programma scientifico presentato alla Regione Piemonte alcuni obiettivi intermedi, comunque
fondamentali, nel raggiungimento dello scopo principale. Per questo motivo si proponeva
come primo obiettivo quello di valutare, attraverso uno studio di popolazione, la frequenza dei
polimorfismi genici nella popolazione piemontese ed in seguito, attraverso l’instaurazione di
una o più collaborazioni con i più importanti centri clinici regionali, verificare se l’analisi
farmacogenetica di alcune categorie di pazienti sarebbe stata in grado di capire e magari
risolvere, casi complessi emersi durante la terapia. Tutto questo nell’ottica di:
• migliorare l’efficacia della terapia;
• ridurre gli effetti collaterali;
• ridurre, in alcuni casi, la mortalità dei pazienti;
• ridurre l’uso improprio di farmaci e quindi lo spreco ad esso associato;
• ridurre, in alcuni casi, la durata delle degenza;
• migliorare la qualità della vita dei pazienti;
• migliorare nel complesso il rapporto costo-efficacia, soprattutto per patologie frequenti e/o
molto costose
METODI E RISULTATI
Il progetto è quindi proseguito attraverso due fasi: la prima che ha coinvolto la dottoressa
Loredana Serpe, vincitrice della borsa di studio prevista nel progetto, nell’istituzione di una
biobanca farmacogenetica dove attualmente sono conservati 200 campioni di DNA, RNA e
proteine provenienti da campioni ematici prelevati da volontari sani piemontesi, sia adulti che
bambini previo consenso informato, e la seconda che ci ha visto impegnati nella scelta di
quale polimorfismo studiare. La nostra decisione è ricaduta nello studio di alcuni
polimorfismi a carico di un enzima, la Tiopurina Metiltransfersi (TPMT), responsabile del
metabolismo di farmaci importanti nel trattamento delle leucemie, nei trapianti d’organo e
nelle malattie infiammatorie croniche. Infatti questa proteina è presente all’interno della
popolazione come tratto genetico autosomico dominante ed è soggetta a polimorfismi che
stratificano la popolazione. La frequenza dei polimorfismi rileva che 1 su 300 (0.3%)
individui presentano un bassa o nulla attività enzimatica (omozigoti TMPTL/TMPTL), l’11%
presentano un’attività intermedia (eterozigoti TMPTH/TMPTL) e l’89% presentano un
normale o alto livello di attività (omozigoti/wild type TMPTH/TMPTH). Di conseguenza,
pazienti con una bassa o assente attività (1/300), presenterebbero un alto rischio di sviluppare
effetti collaterali anche mortali. Questi pazienti potrebbero essere facilmente identificati,
531

prima dell’inizio della terapia, attraverso la genotipizzazione dell’enzima in questione e
dirottati verso terapie alternative. Tuttavia anche coloro che presentano una TMPT con attività
intermedia (eterozigoti) e iniziassero terapie con farmaci la cui metabolizzazione avvenisse
attraverso la TPMT, sarebbero a rischio di sviluppare reazioni avverse quindi, una conoscenza
a priori dei rischi, potrebbe guidare il medico nella scelta iniziale della dose per massimizzare
gli effetti terapeutici e ridurre gli effetti tossici.
A tuttora la dottoressa Serpe, dopo un apprezzabile lavoro di sviluppo di metodiche in
biologia molecolare (RFLP-PCR) per determinare i polimorfismi in esame dell’enzima
TPMT: (TPMT*1 wild-type e TPMT*3A, TPMT*3B, TTPMT*3C), ha identificato in 108
volontari sani le seguenti frequenze alleliche: 204/216 (94.4%) per TPMT*1, 2/216 (0.9%)
per TPMT*1/3A, 8/216 (3.7%) per TPMT*1/3B, 2/216 (0.9%) per TPMT*1/3C. Da questi
dati preliminari, in quanto lo screening è ancora in corso, si evince che fino a questo
momento, all’interno della nostra popolazione in esame, sono presenti degli eterozigoti
(soggetti che presentano un allele normale e uno mutato) ma nessun soggetto che presenta
entrambi gli alleli con le mutazione in studio. Mentre la dottoressa Serpe continuava nella sua
opera di reclutamento di volontari e nel suo lavoro di genotipizzazione, venivano intrapresi i
primi contatti con i centri clinici regionali per valutare se l’analisi farmacogenetica di alcune
categorie di pazienti sarebbe stata in grado di comprendere e magari risolvere casi complessi
emersi durante la terapia. I contatti intrapresi hanno portato all’inizio di una collaborazione tra
la Sezione di Farmacologia del Dipartimento di Anatomia Farmacologia e Medicina Legale e
l’ospedale infantile Regina Margherita e precisamente nelle persone della Professoressa
Cristiana Barbera e nel dottor Gian Luigi Calvo, per lo studio genotipico, fenotipico e
metabolico in pazienti pediatrici affetti da morbo di Crohn sottoposti a terapia con
Azatioprina, un farmaco soggetto al metabolismo della TPMT.
La collaborazione ha portato alla stesura di un protocollo di studio che veniva sottoposto
all’approvazione del Comitato Etico Regionale ed in data 21/10/2004 veniva approvato previa
modifica di alcuni punti che prontamente venivano corretti. Brevemente lo studio si prefigge
di correlare, nel paziente pediatrico affetto da morbo di Crohn in terapia con Azatioprina, il
genotipo e il fenotipo dell’enzima metiltiopurina transferasi (TMPT) nonché i metaboliti 6tioguanina
(6-TG) e 6-metilmercaptopurina (6-MMP) con gli outcomes terapeutici.
532

Alessandro Zennaro Filone tematico C2
Valutazione dell’intervento terapeutico residenziale: indicatori di esito
clinico e verifica di qualità dell’intervento
Tiaré Onlus
OBIETTIVI E RISULTATI
Consideriamo raggiunti i principali obiettivi prepostici:
1. è stata individuata la batteria di assessment;
2. è stata avviata una sperimentazione in merito alla medesima su campioni clinici
provenienti da strutture terapeutiche operanti in ambito adolescenziale;
3. si è iniziata la realizzazione del portale clinico.
Per ciò che attiene i punti elencati, i risultati conseguiti possono essere così riassunti:
1. Batteria di Assessment: in seguito ad adeguato approfondimento della letteratura
scientifica internazionale sull’argomento, abbiamo individuato una batteria di strumenti
caratterizzata da scale e test che indagano, in modo particolare, tre aree di interesse
dell’intervento terapeutico, ovvero: la diagnosi, l’andamento e il comportamento del paziente.
In questa specifica fase, ci si è occupati di trovare appropriati indicatori clinici che siano
efficaci per la diagnosi e l’intervento riabilitativo-terapeutico nei contesti di cura psichiatrica.
La batteria risulta così composta:
• CGI (Clinical Global Impression).
• VFG (Valutazione Globale del Funzionamento) Tale strumento è in corso di sostituzione
con “L’asse k di Kennedy”, elaborazione più sofisticata della VGF in direzione
multifocale.
• BPRS 4.0 (Brief Psychiatric Rating Scale).
• PANSS (Positive and Negative Schizophrenic Symptoms)
• VABS (Vineland Adaptive Behavior Scales), differentemente degli strumenti precedenti,
finalizzati esclusivamente alla rilevazione dei sintomi, la VABS è stata inserita per
valutare le capacità residue dei pazienti, allo scopo di definire in termini di disabilità,
quanto siano stati compromessi dalla malattia mentale, in che aree di funzionamento, a
che livello di gravità in ciascuna di esse e soprattutto su quali elementi del vivere
quotidiano sia ancora possibile lavorare per il recupero funzionale.
• SEE (Simpson-Angus Scale)E' una scala di facilissima e rapida applicazione finalizzata
alla rilevazione degli effetti collaterali connessi con l'utilizzo dei neurolettici. E' stata
inserita ai fini di poter meglio addivenire ad una corretta valutazione del rapporto
costi/benefici, connesso con il trattamento.
• VSSS 54(Verona Service Satisfaction Scale)
• MACI (Millon Adolescent Clinical Inventory) Trattasi di uno strumento largamente usato
per la valutazione della personalità in adolescenza, in ambito internazionale, ma non
533

ancora disponibile alla comunità scientifica nazionale. L’uso è quindi sperimentale sotto
la diretta supervisione scientifica dell’Università della Valle d’Aosta (Prof. A. Zennaro)
• CBCL (Child Behaviour Check List)
• Scala di Valutazione dei sintomi in Asse II. Si tratta di uno strumento sperimentale,
elaborato in seno all’Università della Valle d’Aosta (Prof. A. Zennaro), per la rilevazione
e la valutazione dimensionale della sintomatologia (criteri) in asse II secondo il DSM IV
TR).
3. Sono state valutate e studiate più approfonditamente le dieci scale cliniche, ricercate tra la
letteratura nazionale e internazionale (di cui al paragrafo precedente), finalizzate alla
misurazione degli interventi ed allo studio del legame fra abilità e disabilità misurate, e
diagnosi categoriale e dimensionale. In questa fase abbiamo cercato di individuare, tra il
materiale raccolto, quei test diagnostici che meglio si adattavano ai nostri obiettivi
progettuali e che rispettavano alcuni criteri predominanti:
i. traduzione italiana;
ii. standardizzazione italiana;
iii. validità e attendibilità dei tests;
iv. praticità di somministrazione;
v. adattabilità alle caratteristiche dei pazienti accolti in strutture residenziali e
semiresidenziali.
4. Gli obiettivi prepostici prevedevano:
• lo studio dei percorsi di accreditamento e attualmente in corso per quanto concerne le
Comunità Terapeutiche.
• la analisi della manualizzazione dell’intervento, in corso o ultimata, nell’ambito di
percorsi di certificazione ISO cui si sono sottoposte alcune strutture residenziali.
• la analisi dei sistemi informativi clinici presenti presso strutture certificate o certificande,
per valutare la sovrapponibilità degli strumenti di rilevazione in uso.
Tali valutazioni preliminari hanno permesso la costruzione di un modello sperimentale di
manualizzazione, implementato in un portale sperimentale in cui sono stati inseriti gli
elementi comuni evidenziati e a cui potranno in seguito fare riferimento le strutture impegnate
nella ricerca ed i servizi pubblici di NPI. Il modello di manualizzazione, ha affrontato il
percorso di cura come successioni di steps del percorso clinico (accesso,osservazione iniziale,
elaborazione del progetto, verifica dello stesso, dimissione) ed ha permesso di integrare nel
sistema clinico la batteria testistica verificata, costruendo elementi di descrizione del rapporto
tra struttura e paziente. L’esportabilità, garantita attraverso la realizzazione del portale, di tali
elementi potrà permettere una sempre più ampia correlazione tra le valutazioni della
condizione psicopatologica, le valutazioni delle abilità/disabilità sociali e le modalità con cui
viene messo in atto il percorso riabilitativo. Tale definizione ha valore scientifico in quanto
permette di costruire riferimenti tra esito e processo, elemento di assoluta novità in ambito
residenziale psichiatrico. Il valore clinico del progetto sta nell’associazione tra processi di
erogazione del servizio e valutazione degli esiti nell’abito del Total Quality Management.
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Paolo Zola Filone tematico C1
Ossigenazione tumorale e COX2: fattori predittivi di risposta alla
chemioterapia e di prognosi nel cervicocarcinoma
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Discipline Ginecologiche e Ostretiche
OBIETTIVI
Gli obiettivi primari di questo studio sono stati la valutazione dello stato di ossigenazione
tumorale (mediante la determinazione dei livelli di emoglobina alla diagnosi e della densità
vascolare intratumorale – IMD) e della espressione di COX-2 nelle pazienti affette da
carcinoma della cervice uterina e l’analisi del loro possibile ruolo predittivo di risposta ai
trattamenti integrati impostati. L’obiettivo secondario è stata l’analisi della correlazione tra la
IMD, l’espressione di COX-2, gli indicatori di ipossia (livello preoperatorio di emoglobina) e
i fattori prognostici noti.
METODI E RISULTATI
Per il presente studio è stata analizzata una casistica consecutiva di 297 pazienti affette da
carcinoma invasivo della cervice uterina trattate presso la Cattedra di Ginecologia Oncologica
dell’Università di Torino dal 1984 al 2004. Le pazienti sono state trattate nel periodo
compreso tra il 1° Gennaio 1986 ad oggi. I dati relativi all’inquadramento clinico delle
pazienti e ai fattori prognostici e predittivi in studio sono stati ottenuti sulla base di una
revisione delle cartelle cliniche delle pazienti e poi riportati in un database relazionale. E’
stato quindi aggiornato il follow up mediante la consultazione dei referti delle visite
periodiche nell’ottica di condurre un’analisi di sopravvivenza per stabilire la valenza
prognostica dei fattori presi in esame.
Sulla base dei criteri del protocollo del presente studio, delle 297 pazienti esaminate sono
risultate eleggibili 73 pazienti (24.57 %) affette da carcinoma della cervice uterina localmente
avanzato. Tali pazienti sono state tutte sottoposte a trattamento chemioterapico neoadiuvante
a base di platino successivamente integrato con trattamento chirurgico radicale. Le ragioni di
esclusione sono state le seguenti: pazienti non sottoposte a terapie integrate multimodali o con
neoplasia di stadio clinico non compreso fra IB e IIB 171 (57.58%), pazienti di cui non sono
risultati disponibili esami di imaging quali TC dell’addome inferiore e/o Risonanza Magnetica
dell’addome inferiore 40 (13.47%), perse al follow up 13 (4.38%).
Nella seconda fase del progetto sono stati selezionati i campioni paraffinati prelevati in sede
di diagnosi o di intervento chirurgico ed in un secondo tempo è stata effettuata la
determinazione dell’IMD utilizzando una variante del metodo descritto da Weidner nel
carcinoma mammario: le sezioni microscopiche sono state marcate con tecnica
immunoistochimica con il marcatore endoteliale CD34 e la conta dei vasi è stata eseguita
nelle aree di maggiore densità capillare (hot spot). Inoltre è stata quantificata la percentuale di
cellule neoplastiche che esprimevano COX-2. La qualità dei preparati istologici non è risultata
soddisfacente in quanto l’effetto citopatico del trattamento neoadiuvante ha determinato
alterazioni del tessuto neoplastico tali da compromettere la corretta lettura dei preparati e
l’attendibilità dei risultati ottenuti. Per le ragioni sopra specificate la ricerca si è pertanto
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focalizzata sulla valutazione dei principali fattori clinici predittivi e prognostici dei trattamenti
integrati della cervice uterina.
Al fine di predire la risposta al trattamento chemioterapico neoadiuvante sono stati individuati
alcuni parametri clinico-patologici noti prima del trattamento quali il livello di emoglobina
alla diagnosi, l’età, la parità, l’eventuale stato di menopausa, il BMI, lo stadio clinico ,il
diametro tumorale, ed il grado nucleare. Al fine di determinare l’entità della risposta clinica al
trattamento di induzione e la valenza prognostica e predittiva dei parametri clinico-biologici
studiati, è stata definita una variabile percentuale per indicare la differenza fra la dimensione
tumorale valutata prima del trattamento e quella residua riscontrata all’esame istologico
definitivo. La variabile percentuale è stata stratificata in un primo momento in Risposta
Completa (RC: 71-100 %), Risposta Parziale 1 (PR1: 50-70 %), Risposta Parziale 2 (PR: 0-49
%). Successivamente, per ragioni correlate all’analisi statistica effettuata, tale variabile è stata
stratificata in “Risposta Ottimale” (risposta patologica completa o riduzione del diametro
tumorale > 50% ) ed in “Risposta sub-ottimale” (riduzione del diametro tumorale < 50%).
L’analisi della relazione tra i parametri clinico-biologici pre-trattamento e la risposta alla
chemioterapia neoadiuvante è stata effettuata mediante un modello di regressione logistica
univariata e multivariata.
RISULTATI
73 pazienti affette da carcinoma della cervice uterina localmente avanzato di cui 29 (39.7%)
di stadio Ib2, 22 (30.1%) di stadio IIa e 22 (30.1%) di stadio IIb sono state sottoposte a 3 cicli
di chemioterapia neoadiuvante con regime a base di platino seguiti da laparoisterectomia
radicale di tipo III. Una risposta completa al trattamento chemioterapico neoadiuvante è
risultata essere significativamente correlata ad alti livelli di emoglobina alla diagnosi (media
14.0 mg/dl): risposte quantificabili attorno al 50% od inferiori al 50% sono risultate correlate
rispettivamente a valori medi di emoglobina alla diagnosi pari a 12.7 mg/dl e 11.9 mg/dl (P =
0.002).
All’analisi multivariata i livelli di emoglobina alla diagnosi hanno dimostrato un’ottima
valenza come fattori predittivi di risposta alla chemioterapia neoadiuvante. Un cut-off
emoglobinico di 12 mg/dl ha permesso di distinguere un sottogruppo di pazienti (con Hb > o
= 12 mg/dl) ad alta probabilità di risposta al trattamento chemioterapico neoadiuvante da un
sottogruppo di pazienti (< 12 mg/dl) a bassa probabilità di risposta.
Le pazienti con risposta completa alla chemioterapia hanno presentato una sopravvivenza del
100% rispetto alle pazienti caratterizzate da una risposta > o = 50% ed alle pazienti con
risposta < 50% che si sono assestate rispettivamente al 93.1% ed al 53.8% (P = 0.0001). Le
pazienti con livelli emoglobinici alla diagnosi > 12 mg/dl hanno raggiunto una sopravvivenza
dell’87% rispetto a quella ottenuta dalle pazienti con livelli emoglobinici inferiori pari al 63%
(P = 0.008).
CONCLUSIONI
Nell’ambito della gestione terapeutica del carcinoma della cervice localmente avanzato, il
livello emoglobinico alla diagnosi ha mostrato una valenza prognostica e predittiva
indipendente in relazione alla risposta alla chemioterapia neoadiuvante. Nella nostra analisi
preliminare condotta su un campione ridotto è stato definito un cut-off emoglobinico
potenzialmente in grado di prevedere la tipologia di risposta “ottimale” o “non ottimale” al
trattamento neoadiuvante.
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Carla Maria Zotti Filone tematico D2
Le infezioni chirurgiche nel post-parto: studio di incidenza su parti
cesarei e parti vaginali
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia
OBIETTIVI
Obiettivo generale. Stimare la frequenza di infezioni correlate all’assistenza del parto vaginale
e del parto cesareo, con particolare attenzione alle infezioni del sito di incisione episiotomica
o laparotomia
Obiettivi specifici.
• Stimare l’incidenza di infezioni puerperali a seguito di parto vaginale su due campioni di
donne assistite con procedura di parto “sterile” o parto “pulito”.
• Descrivere sinteticamente le procedure assistenziali teoriche delle due strutture
identificate (una per il parto “sterile” e una per il parto “pulito”).
• Stimare l’incidenza di infezioni puerperali a seguito di parto cesareo elettivo e non
elettivo.
• Analizzare i principali fattori di rischio correlati alla gestione del parto Studio sui Parti
vaginali.
METODI E RISULTATI
Sono stati identificati due Punti Nascita Ospedalieri della Regione Piemonte con differenti
modelli operativi e procedure assistenziali per l’assistenza al parto (Ospedale A: Modello
“parto sterile”, Ospedale B: Modello “parto pulito”). La numerosità del campione di ogni
punto nascita, per una frequenza attesa di infezioni dell’1-3%, è risultata di 200 partorienti,
reclutate consecutivamente in alcuni giorni della settimana concordati con gli operatori. Per
ogni partoriente è stata compilata una scheda con le informazioni relative al parto, alle
procedure ed ai comportamenti assistenziali. Sono stati registrati i segni clinici compatibili
con la presenza di infezione nosocomiale rilevati direttamente o dalla cartella clinica. Nel
follow-up telefonico a trenta giorni è stata rilevata la presenza di sintomatologia ascrivibile ad
infezione e/o la diagnosi effettuata dal curante, la prescrizione di antibiotici, le procedure
assistenziali che l’episodio infettivo ha comportato.
Nell’Ospedale A sono stati compilati 200 questionari tra maggio e settembre 2004. Dalla
storia ostetrica, risulta che il 70,5% delle donne è alla prima esperienza di parto. Nel 71% dei
casi il travaglio è insorto spontaneamente, nel 29% dei casi è stato indotto. Per il 61% delle
donne la rottura delle membrane amniotiche è stata spontanea.
Nell’Ospedale B sono stati compilati 209 questionari tra luglio e dicembre 2004. Il 74,2%
delle donne è di nazionalità italiana; il 51,7% ha un’età compresa tra i 31 e i 40 anni, e il
48,8% ha un titolo di licenza media superiore. Il 44,5% delle donne è alla prima esperienza di
parto, il 41% alla seconda. Nell’89% dei casi il travaglio è insorto spontaneamente, mentre
nell’ 11% dei casi è stato indotto. Per il 96% delle donne la rottura delle membrane
amniotiche è stata spontanea.
In nessuno dei due campioni sono state rilevate infezioni e nel follow–up telefonico effettuato
entro 30 giorni dal parto le donne hanno segnalato problemi alla ferita, prevalentemente
dolore o dolore associato ad edema o gonfiore, non trattati o trattati localmente. Non essendo
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state osservate infezioni, non è stato possibile verificare correlazione tra insorgenza delle
infezioni, procedure e comportamenti assistenziali.
Tuttavia la ricerca ha fornito dati interessanti su alcuni fattori di rischio assistenziali: gli
operatori dell’Ospedale A tendono a visitare più frequentemente le donne in travaglio di parto
in fase attiva, rispetto agli operatori dell’Ospedale B (37% delle donne è stata visitata da sei a
dieci volte vs. 3,8%); le donne che hanno partorito nell’Ospedale A sono state sottoposte ad
episiotomia nel 51% dei casi, contro il 6,3% di quelle che hanno partorito nell’Ospedale B; la
tricotomia è stata praticata nel 7% dei casi nell’Ospedale B, vs. 55,5% delle donne
dell’Ospedale A; nell’Ospedale A non sono stati rilevati perinei integri, mentre nell’Ospedale
B ne sono stati rilevati 50 su 209; rispetto all’assistenza al perineo nell’Ospedale B si deduce
un maggiore rispetto delle raccomandazioni OMS e delle indicazioni Evidence Based.
Relativamente ai comportamenti degli operatori, emergono differenze rilevanti tra i due
ospedali, con una tendenza di entrambi a disattendere quanto raccomandato in letteratura
soprattutto rispetto al corretto lavaggio delle mani, all’utilizzo dei guanti, alla presenza di
monili durante l’assistenza al parto nell’Ospedale A e all’utilizzo dei dispositivi di protezione
individuale nell’Ospedale B. Nella popolazione di partorienti a basso rischio assistite con i
due tipi di parto non sono emersi vantaggi relativi al mantenimento di procedure
convenzionali (parto “sterile”) e sono al contrario emerse alcune ipotesi circa l’adozione di
procedure alternative che potrebbero tradursi in atti assistenziali razionali.
Studio sui Parti cesarei. Sono stati compilati 430 questionari nel periodo maggio-settembre
2005. Dall’analisi dei dati il campione è risultato costituito da un 77,5% di donne di età
superiore ai 30 anni; il 73% ha una scolarità superiore alla scuola dell’obbligo e per il 64,6%
si tratta della prima esperienza di parto mediante taglio cesareo, mentre per 126 delle restanti
152 donne si tratta della seconda e per 26 della terza esperienza. 130 donne sono state
sottoposte a TC quando già erano in travaglio (nel 50% dei casi insorto spontaneamente, nel
50% indotto). L’intervento è stato programmato nel 52% dei casi. Circa doccia e depilazione,
l’82% delle donne ha fatto la doccia, per lo più a casa (66%) e alla vigilia dell’intervento
(68%); il 98% delle donne è stata depilata, nell’80% dei casi poco prima dell’intervento e nel
97% con rasoio monouso. Nel 98% dei casi è stata eseguita l’incisione della cute secondo
Pfannestil, per la cui sutura sono stati utilizzati prevalentemente punti metallici (66,3%). Al
98,3% delle donne è stata effettuata la profilassi antibiotica; nell’83% dei casi l’antibiotico
utilizzato è un’associazione di ampicillina e sulbactam. L’infezione della ferita chirurgica è
insorta in 3 donne durante il ricovero; altre 18 infezioni sono state rilevate grazie al consulto
telefonico effettuato tra i 15 e i 30 giorni dopo la dimissione. Il tasso di infezione risulta
dunque complessivamente del 4,8%; 20 sono infezioni della ferita chirurgica, una è infezione
delle vie urinarie. Dal follow-up è emerso che circa il 10% delle donne ha dichiarato
l’insorgenza di altri problemi alla ferita (dolore e gonfiore); per il trattamento il 18,6% delle
donne si è rivolta al ginecologo privato, il 51,2% è andata in ospedale. La frequenza osservata
di infezioni si colloca in una situazione intermedia rispetto ai dati di letteratura, ma elevata se
si considera il ricorso al cesareo comunque superiore in Italia (35%) a tutti i paesi europei e la
situazione di basso rischio derivante dalla frequenza relativa di cesarei in elezione (52%).
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