lezione 27-28 linkage analisi 04/11/2010

CORSO INTEGRATO DI
GENETICA
a.a. 2010-2011
04/11/2010
Lezioni 27_28
Analisi di linkage
Analisi di mutazioni
Dott.ssa Elisabetta Trabetti

LINKAGE
Geni in loci vicini sullo stesso cromosoma - concatenati
Tendenza di loci (geni e/o marcatori)
vicini su un singolo cromosoma ad essere
trasmessi assieme, come una unità,
attraverso la meiosi

[Genetica - B.A. Pierce. Zanichelli 2005]

ANALISI di LINKAGE:
applicazioni
● Mappaggio di geni malattia e di nuovi
marcatori
● Diagnosi indiretta di malattia - Deve
essere nota la localizzazione
cromosomica del gene

LINKAGE - ricombinazione
P
1
2
1 2 1
M
F1 F2 F3
2
2
2
2 2
1
1
2
2

Meiosi informative e non
AD
Meiosi informative = individuare i gameti
ricombinanti e non
Locus marcatore A
Alleli 1 e 2

Determinazione della fase
Associazione degli alleli al locus marcatore con il locus malattia
50% ricombinazione Assortimento indipendente:
gene malattia NON è in linkage con il marcatore

θ =
Frazione di ricombinazione, θ
Probabilità che avvenga un evento di ricombinazione
tra due loci
n°meiosi ricombinanti n° soggetti ricombinanti
n° tot meiosi n°tot figli
θ = 0 loci molto vicini
θ = 0,5 loci molto lontani o su cromosomi diversi
θ = misura della distanza genetica
U di misura: centimorgan cM
= lunghezza genetica in cui 1% di ricombinazione (θ =0,01)
NB: distanza genetica non è strettamente proporzionale alla
distanza fisica (lunghezza in nucleotidi)

MISURA DELLA DISTANZA GENETICA
θ = n. figli ricombinanti/n. tot figli
= 1/8 = 0,125 = 12,5%
Distanza A-B = 12,5 cM

COSTRUZIONE DI MAPPE GENETICHE
Frazione di ricombinazione tra i loci:
A e B = 0,06
B e C = 0,07
A e C = 0,10
Frazione di ricombinazione tra i loci:
A e D = 0,04
D e B = 0,08
Ordine 3 loci sul chr

MAPPA GENETICA DEL CROMOSOMA 22

REQUISITI
Famiglie (numerose)
Affetti
Marcatori genetici
altamente polimorfi
uniformemente distribuiti
facile individuazione e basso costo
(A) Distinguere i due cromosomi omologhi dei genitori – marcatore linked
(B) Determinare la fase = cromosoma con allele patologico
(C) Quale cromosoma e’ stato trasmesso al probando

ANALISI di LINKAGE:
applicazioni
● Mappaggio di geni malattia e di nuovi
marcatori
● Diagnosi indiretta di malattia - Deve
essere nota la localizzazione
cromosomica del gene

1/2
1/2
1/1
1/2
Informatività diagnostica di un marcatore
nella analisi di linkage - AR
2/2
1/2
1/1
Famiglia non informativa
1/2 1/2
Famiglia parzialmente informativa
Famiglia pienamente informativa

Diagnosi prenatale CF mediante analisi
di Linkage
1-2 1-1
1-1 1-2
MWM P M CF V C+
1-2 1-1 1-1 1-2 2-2
MetH: extragenico, ∼1Mb
allele 2 p
allele 1 m: ?
?
• portatore (CF carrier)
o
• sano

1-2 1-2
1-2 1-1
MWM P M CF V C+
1-2 1-2 1-2 1-1 2-2
Diagnosi prenatale CF
Xv-2c: extragenico, ∼200 kb
allele 1 p
?
allele 1 m
Figlio affetto:
Feto:
1*p e 2*m
oppure
1*m e 2*p
1*p e 1 m
oppure
1*m e 1p
in entrambi i casi è
PORTATORE

1*-2 1-1*
1*-1* 1*-2
1-2* 1*-2
1*-2* 1-1*
MetH: sano o carrier
Xv-2c: carrier
Diagnosi prenatale CF
• sano o portatore
• portatore
Feto: carrier m causa CF

Fattori che determinano
l’accuratezza diagnostica nella analisi
di linkage
Vicinanza del marcatore al gene – frequenza di
ricombinazione
FC: KM19

Analisi di linkage e studio degli aplotipi
Aplotipo = serie di alleli in loci associati su un cromosoma (pat o mat)

LINKAGE disequilibrium
Specifica combinazione di alleli in fase a due o piu’
loci linked che si verifica più spesso di quanto
accadrebbe per puro caso
Associazione a livello di popolazione tra un particolare
allele marcatore e una malattia
In una popolazione molte persone non imparentate
hanno ereditato un cromosoma con una patologia da
un antenato comune

Locus “A”
alleli 1 e 2
M
1
M
2
LINKAGE
M
1
M
2
M
1
M
2
M
1
M
2
LINKAGE
DISEQUILIBRIUM
M
3
M
3
M
3
M
3
M
3
M
3
M
3
M
3

Locus A Locus B
Linkage
equilibrium
25%
25%
25%
25%
40%
10%
10%
Linkage
disequilibrium
parziale
40%
Linkage
disequilibrium
completo
50%
0%
0%
50%

Linkage disequilibrium e FC

GENETICA MOLECOLARE IN
MEDICINA
SVILUPPI SCIENTIFICI APPLICAZIONI MEDICHE
Mappatura gene Diagnosi indiretta
(linkage)˫
Identificazione gene Identificazione mutazioni
Classificazione mutazioni Diagnosi diretta
patologiche (mutazione)˫

Mutazione = variazione della sequenza nucleotidica
rispetto ad una sequenza di riferimento -> alterazione
ereditabile a carico della struttura primaria del DNA
senza alcuna implicazione sul significato funzionale di
tale cambiamento
• Effetti evolutivi = neutra, vantaggiosa, svantaggiosa
• Mutazione Patologica = produce una consistente
alterazione della funzione svolta da un gene,
determinando così l’insorgenza di una malattia
Polimorfismo = mutazione con frequenza >1% nella
popolazione

Le tappe dell'analisi molecolare
per le malattie genetiche
Identificare e sequenziare il gene
malattia
Cercare le mutazioni nel gene
Stabilire quali mutazioni sono patologiche
Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni
Disegnare pannelli popolazione specifici
Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di
interesse

Metodi per l’identificazione di
mutazioni
• Ricerca aspecifica di mutazione, ignota o
nota
• METODI: Sequenziamento del DNA, DGGE,
DHPLC, etc.

Fonti DNA
Il DNA può essere
ottenuto da qualsiasi
cellula nucleata
dell'organismo
DNA stampo
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Taq polymerase, Mg++
VILLI
CORIALI
AMNIOCITI
COLTURE
CELLULARI
SALIVA
DNA
MIDOLLO
OSSEO
PCR – Reazione a Catena della Polimerasi
DNA stampo
DNA polimerasi
Primer
SANGUE
CAPELLI
ALTRI
TESSUTI
Nuovo filamento
Nuovo filamento
Primer

Analisi della sequenza del DNA
Sequenza Normale
(esone 12, gene CFTR)˫
1885 G>T; GAA>TAA
Glu > Stop
˫Mutazione: E585X

Analisi con gradiente denaturante
(DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
La Temperatura di melting (Tm) di una molecola di
DNA dipendente strettamente dalla sua sequenza.
Frammenti di DNA che differiscono anche per un
singolo nucleotide hanno diversa Tm.
Negli eterozigoti possono formarsi molecole ibride,
costituite dall’unione di un filamento normale e da
un filamento mutato, che hanno Tm più bassa per la
presenza dell’appaiamento errato nel sito della
mutazione.
L’elettroforesi in gradiente denaturante separa le
molecole di DNA in funzione della diversa Tm.
E’così possibile identificare DNA normali e
mutati perchè si arresteranno ad una diversa
altezza nel gel.
ALLELE NORMALE ALLELE MUTATO
Concentrazione crescente di
denaturanti
G
T
G
C
G
C
MOLECOLE
OMODUPLICI
MOLECOLE
ETERODUPLICI
1 2 3
N/N N/M M/M
A
T
Denaturazione, mix,
rinaturazione
A
T
A
C
ETERODUPLICI
OMODUPLICI
GEL A GRADIENTE DENATURANTE

Analisi DGGE dell’esone 19 del gene CFTR
1 2 3 4 5 6 7 8 9
eteroduplici
- omoduplici Mutato
Corsie 1 , 2, 4, 8, 9: DNA che non presentano mutazioni in questo esone
Corsie 3, 5, 7: DNA con mutazioni in questo esone (da caratterizzare con sequenziamento)˫
Corsia 6: controllo positivo (eterozigote I1237V)
Normale

Ricerca di mutazioni con DHPLC
eteroduplici omoduplici
WT M
Denaturing
High
Performance
Liquide
Chromatography
eteroduplici
omoduplici

Le tappe dell'analisi molecolare
per le malattie genetiche
Identificare e sequenziare il gene malattia
Cercare le mutazioni nel gene
Stabilire quali mutazioni sono
patologiche
Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni
Disegnare pannelli popolazione specifici
Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di
interesse

Principali criteri per classificare una
mutazione come causa di malattia:
Correlazione con il fenotipo: la mutazione è presente
negli affetti, molto rara o assente nella popolazione
generale
Studi funzionali, in-vitro o in-vivo, dimostrano che la
mutazione causa alterazione o assenza della funzione
codificata dal gene
La mutazione causa una grave alterazione della
struttura proteica (delezioni, inserzioni, stop, frameshift,
alterazioni di splicing…)˫

Le tappe dell'analisi molecolare
per le malattie genetiche
Identificare e sequenziare il gene malattia
Cercare le mutazioni nel gene
Identificare quali mutazioni sono patologiche
Determinare se esiste una
distribuzione geografica/etnica delle
mutazioni
Disegnare pannelli di mutazioni
popolazione-specifici
Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di
interesse

Analisi della frequenza e della
distribuzione geografica delle mutazioni
Ricerca aspecifica delle mutazioni nei geni di almeno 100-
200 pazienti
Analisi di pazienti appartenenti a popolazioni/gruppi etnici
diversi
Selezionare le mutazioni causa di malattia tra tutte quelle
identificate
Stabilire il pannello di mutazioni da analizzare in modo da
coprire la maggior percentuale possibile di alleli patologici
in ogni popolazione/gruppo etnico

Pannello Mutazioni CF per Veneto e Sardegna:
Mutazione
F508del
R1162X
T338I
G542X
2183AA/G
N1303K
G1244E
711+5G/A
1717-1G/A
altre
TOT
81
-
20
9
9
5
3
-
1
18
146/156
Sardegna
n. %
52
-
13
6
6
3
2
-
1
11
94
107
22
-
21
6
9
-
6
5
27
203/225
Veneto
n %
48
10
-
9
3
4
-
3
3
10
90

Le tappe dell'analisi molecolare
per le malattie genetiche
Identificare e sequenziare il gene malattia
Cercare le mutazioni nel gene
Identificare quali mutazioni sono patologiche
Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni
Disegnare pannelli popolazione specifici
Selezionare i metodi di analisi più
adatti alla ricerca delle mutazioni di
interesse

Metodi per l’identificazione di
mutazioni:
• Analisi specifica di una
mutazione nota
• METODI: RE; RDB/ASO; OLA.

REVERSE DOT BLOT:
ibridazione inversa degli acidi nucleici
DNA N (normale)˫
DNA M (mutato)˫
N
a
C
g
t
G
c
a
T
g
t
A
c
M
1
2
3
sonda sonda
N M
sonda sonda
N M
sonda sonda
N M
omozigote
MM
eterozigote
NM
omozigote
NN

sonde
mutate
sonde
normali
RDB MULTIPLO
analisi mutazioni Fibrosi Cistica (gene CFTR)˫
Normale
F508del G542X 394delTT
STRIP A 1
eteroz.
2
R117H
3
S1251N
4 STRIP B
sonde
mutate
sonde
normali

Metodi per l’identificazione di mutazioni:
• 1) Ricerca diretta di mutazioni:
Applicazioni possibili
• 1a) Ricerca aspecifica di mutazione, ignota o nota:
• significato funzionale non necessariamente noto ->
identificazione nuove mutazioni, screening genetici di popolazioni
numerose, (diagnosi di malattia).
•
• 1b) Analisi specifica di una mutazione nota:
• mutazioni patologiche -> diagnosi di malattia;
• polimorfismi, marcatori DNA -> identificazione individuale
(medicina forense, trapianti midollo, …)˫
• 2) Analisi di Linkage:
• identificazione nuovi geni, diagnosi indiretta di malattia

Metodi per la diagnosi di malattie genetiche mediante
analisi del DNA
a) Analisi di mutazioni note nel soggetto (RE; RDB/ASO; OLA):
− Analisi diretta/specifica delle mutazioni
− Deve essere nota la sequenza del gene
− Devono essere nota l’alterazione molecolare delle mutazioni da analizzare
− Deve essere noto quali mutazioni geniche sono causa di malattia
− Caratteristiche di un buon sistema di analisi: rapido, economico, multiplo
b) Ricerca di mutazioni in un gene (Sequenziamento del DNA,
DGGE, DHPLC):
− Deve essere nota la sequenza del gene
− Identifica sia mutazioni nuove che note; patologiche che non patologiche
− Solo il sequenziamento consente di caratterizzare il difetto molecolare
− Consentono analisi più rapida di un gene quando si hanno molti individui in esame
− Screening di popolazione: identifica quali e quante mutazioni sono presenti
c) Analisi di Linkage
− Deve essere nota la localizzazione cromosomica del gene
− Deve essere disponibile la famiglia del probando e il DNA di almeno un familiare prossimo
che sia affetto
− Devono essere disponibili marcatori informativi molto vicini al gene interessato

Perchè la diagnosi molecolare?
• Diagnosi di una malattia è un atto clinico
• Analisi mutazioni serve a:
• Confermare diagnosi clinica
• Determinare le mutazioni specifiche per
successive analisi nei familiari
– Diagnosi Pre-Natale
– Identificazione dei portatori
• Migliorare conoscenze rapporto genotipo/fenotipo
e pato-fisiologia della malattia