Functional cloning
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Sequenziamento del DNA<br />
H<br />
deossinucleotide<br />
(AMP)<br />
H<br />
H<br />
di-deossinucleotide<br />
(dAMP)
Sequenziamento del DNA
Sequenziamento del DNA
Sequenziamento del DNA
Analisi di un marcatore che determina l’eliminazione di un sito di<br />
restrizione per l’enzima SfiI mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)<br />
DNA<br />
SfiI*<br />
genomico<br />
0.4kb 0.7kb<br />
primer<br />
forward<br />
primer<br />
reverse
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)<br />
+<br />
denat.<br />
anneal.<br />
extens.<br />
nuovo<br />
DNA<br />
II ciclo III ciclo
Analisi di un marcatore che determina l’eliminazione di un sito di<br />
restrizione per l’enzima SfiI mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)<br />
DNA<br />
SfiI*<br />
genomico<br />
0.4kb 0.7kb<br />
primer<br />
forward<br />
digestione<br />
prodotto della PCR<br />
con<br />
SfiI<br />
soggetti<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15<br />
elettroforesi<br />
primer<br />
reverse
Analisi di un marcatore che determina l’eliminazione di un sito di<br />
restrizione per l’enzima SfiI mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)<br />
1.1 kb<br />
0.7 kb<br />
0.4 kb<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M<br />
1.25 kb<br />
0.75 kb<br />
0.50 kb<br />
0.35 kb
<strong>Functional</strong> <strong>cloning</strong><br />
(clonazione funzionale)<br />
Identificazione e clonazione di<br />
un gene attraverso la sua<br />
funzione<br />
MALATTIA MALATTIA<br />
FUNZIONE<br />
(proteina)<br />
GENE<br />
MAPPATURA<br />
Positional <strong>cloning</strong><br />
(clonazione posizionale)<br />
Identificazione e clonazione di<br />
un gene attraverso la sua<br />
posizione<br />
MAPPATURA<br />
CLONAZIONE<br />
GENE<br />
FUNZIONE<br />
GENETICA<br />
FISICA
<strong>Functional</strong> <strong>cloning</strong><br />
L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza<br />
della posizione sul genoma:<br />
sulla base del prodotto proteico
strategia utilizzata per la clonazione del gene del fattore VIII della<br />
coagulazione, responsabile dell’emofilia A
<strong>Functional</strong> <strong>cloning</strong><br />
L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza<br />
della posizione sul genoma:<br />
sulla base del prodotto proteico<br />
oppure<br />
mediante l’uso di anticorpi specifici
mRNA<br />
estrazione mRNA totale<br />
traduzione in vitro<br />
proteine nascenti<br />
anticorpi specifici<br />
immunoprecipitazione del complesso polisomiale<br />
purificazione dell’mRNA specifico<br />
reverse-transcription per produrre il cDNA specifico<br />
utilizzo del cDNA per selezionare cloni specifici da<br />
cDNA libraries
<strong>Functional</strong> <strong>cloning</strong><br />
L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza<br />
della posizione sul genoma:<br />
sulla base del prodotto proteico<br />
oppure<br />
mediante l’uso di anticorpi specifici<br />
oppure<br />
mediante la sua similitudine a un gene paralogo della<br />
stessa specie o un gene ortologo di altre specie
Positional <strong>cloning</strong><br />
Identificazione e clonazione di un gene attraverso<br />
la sua posizione<br />
Il primo stadio consiste nel restringere il più possibile (
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