Genetica dei microrganismi 2 - Microbiologia Generale

Genetica dei microrganismi 2

Utilità dei mutanti 

• Una mutazione modifica o elimina la funzionalità di un particolare prodotto 

genico. 

• Si può dedurre la funzione cellulare del prodotto del gene osservando 

l’effetto del cambiamento genotipico sul fenotipo della cellula. 

• L’uso dei mutanti ha consentito di determinare le vie di biosintesi degli 

intermedi metabolici, la regolazione e le risposte all’ambiente, la successione 

di espressione di geni che controllano il ciclo cellulare etc. 

MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 05/13

Fig. 10.1 


Isolamento di mutanti 

• Screening: mutazione non selezionabile (es. 

cambiamento colore della colonia) 

• Selezione: mutazione che conferisce al mutante 

un vantaggio (es. resistenza ad un farmaco) 


Isolamento di mutanti: selezione positiva 


Isolamento di mutanti: selezione negativa 

Fig. 10.2 


Isolamento di mutanti: selezione negativa 


Test di Ames 

Misura il grado di mutagenicità 

potenziale di una data sostanza. 

Attualmente in questo test sono 

stati introdotti due elementi: 

1. ceppo batterico che utilizzi 

esclusivamente una via per il 

riparo del DNA soggetta ad errori 

2. l’uso di estratti di enzimi 

epatici 

Fig. 10.8 


Isolamento di ceppi mutanti 

Espressione fenotipica 

Dopo la mutagenesi affinché la cellula mutata esprima il corrispondente fenotipo è 

necessario un periodo di crescita. Questo fenomeno è definito ritardo fenotipico. Questo 

periodo sarà più breve nel caso di mutazioni dominanti, più lungo nel caso di mutazioni 

recessive. 


L’arricchimento di cellule mutanti 

Selezione 

positiva 

Selezione 

negativa 


L’arricchimento di cellule mutanti per la 

selezione negativa 


Identificazione dei cloni mutanti 

• Es. 1 - Isolamento di mutanti nel metabolismo: uso del tetrazolio 

• Cellule che fermentano abbassano il pH colonie bianche 

• Cellule che non fermentano colonie rosse 

• Es. 2 - Isolamento di mutanti che accumulano glicogeno: 

colorazione delle colonie con iodio. 

• Poiché questo trattamento uccide le cellule è necessaria la 

presenza di una piastra master: la colorazione viene effettuata 

su una replica. 


NB: I mutanti condizionali consentono l’analisi di geni essenziali in organismi aploidi 


Selezione e adattamento 

• Le colture pure sono veramente costituite da cellule 

geneticamente identiche? 

• La crescita dei microrganismi in condizioni di 

laboratorio li rende leoni o tartarughe? 


Genetica dei microrganismi 

scambi genici e ricombinazione 

Capitolo 10 Brock 

Capitolo 11 Stanier 

Capitolo 13 Prescott

La 

ricombinazione 

genetica 

• La ricombinazione genetica comporta 

lo scambio fisico tra elementi genetici 

diversi. 

• La ricombinazione omologa è molto 

importante e complessa (circa 25 geni 

in E. coli) che esistono più sistemi 

ridondanti. 

• Il processo inizia con un taglio, quindi 

il filamento viene divaricato da proteine 

con attività elicasica. Il complesso 

RecBCD contiene sia attività 

nucleasica che elicasica. Una proteina 

che lega il DNA a singolo filamento si 

associa al filamento di DNA (SSB), 

seguita dalla proteina RecA 


La 

ricombinazione 

genetica 

• Questo complesso facilita il 

riappaiamento con la sequenza 

complementare nel duplex 

adiacente mentre avviene lo 

scostamento del filamento residente 

(invasione del filamento). 

• Dopo l’appaiamento può avvenire 

lo scambio con la formazioni di 

estese regioni eteroduplex, dove 

ciascun filamento è originato da 

cromosomi differenti. 

• Infine si ha la risoluzione 

dell’eteroduplex ad opera della 

nucleasi e ligasi 


Ricombinazione 

non reciproca: 

modello di Fox 

• Nella ricombinazione non 

reciproca, soltanto una delle due 

doppie eliche conserva la sua 

lunghezza originaria. 

• Un pezzo del DNA donatore viene 

inserito, il resto viene degradato 

dalle nucleasi. 

• Una ricombinazione non reciproca 

si verifica durante la 

trasformazione batterica. 


Destino dei marcatori genetici 

• Nell’eteroduplex si possono 

avere degli appaiamenti 

difettosi. Il destino di un 

eteroduplex può seguire due 

vie: 

• 1 - la regione eteroduplex 

viene duplicata dando luogo a 

due omoduplex ovvero, le 

sequenze segregano l’una 

dall’altra. 

• 1 - un filamento 

dell’eteroduplex viene 

eliminato e rimpiazzato da un 

nuovo filamento di DNA 

(riparazione dell’appaiamento 

difettoso = mismatch repair). 


Genetica batterica 



Trasformazione batterica 


La trasformazione avviene in natura, ma 

non tutti i batteri possono essere 

trasformati naturalmente 



Trasformazione naturale in Streptococcus 

pneumoniae 

Il fattore di competenza viene sintetizzato durante la fase di 

crescita esponenziale. 

Affinché la trasformazione avvenga, il DNA donatore deve 

essere di grandi dimensioni (0,3/8X10 6 Dalton) e a doppia elica. 

L’idrolisi di uno dei due filamenti di DNA fornisce l’energia 

per far penetrare il filamento intatto. 

Streptococcus pneumoniae assorbe DNA di qualsiasi origine, 

ma solo DNA che trova una regione di omologia con il 

cromosoma verrà integrato nell’ospite. 


Trasformazione naturale 

• Nella maggior parte dei batteri la competenza è regolata e vi 

sono proteine specifiche che hanno il compito di prelevare e 

processare il DNA. 

• Uno dei meccanismi di attivazione della competenza in 

Bacillus fa parte di un sistema “quorum-sensing” regolato 

da un sistema a due componenti. 

• Le cellule producono un peptide che, quando si accumula, 

agisce su un sensore (ComP) che trasmette il segnale ad una 

proteina regolatrice (ComA) che attiva i geni della 

trasformazione. 


Formazione dell’eteroduplex 


Fase di eclissi del DNA trasformante 

• Se si usa il DNA di un ceppo 

trasformato per un’ulteriore 

trasformazione, solo dopo un 

certo periodo di tempo 

questo DNA assume la 

capacità trasformante. 

Spiegazione: per ottenere la 

trasformazione è necessario 

utilizzare DNA a doppia 

elica. In un primo momento 

il DNA si trova all’interno 

della cellula in forma di 

singolo filamento e quindi 

perde la sua capacità di 

trasformare un’altra cellula. 


Trasformazione naturale in Haemophilus 

E’ indispensabile la presenza 

di una sequenza di DNA di 

11 basi 

(5’AAGTGCGGTCA3’) 

presente 600 volte nel 

genoma (una ogni 4000bp). 

Per questo motivo si può 

ottenere la trasformazione 

solo con DNA omologo. 

Dopo l’aggiunta del DNA 

omologo le vescicole 

all’esterno scompaiono e ne 

compaiono alcune 

all’interno delle cellule. 

Queste vescicole vengono 

definite trasformasomi 

influenzae 



Trasformazione artificiale 

• Young cells are incubated with a CALCIUM CHLORIDE SOLUTION for 

approximately 30 min on ice. In some cases magnesium is also present. 

• The cells are concentrated and suspended as a thick suspension in the calcium 

solution. The cells may be mixed with reagents like glycerol and stored at -80oC for 

later use or they may be used immediately. 

• Cell-free DNA is then mixed with these competent cells on ice for approximately 30 

min followed by a brief mild heating (42°C 3’). 

• The transformed cells are incubated in a rich medium for approximately 1 to 1.5 hr. 

and then plated on medium containing materials that will detect the presence of the 

transformed genes. 


Trasformazione artificiale 

• L’elettroporazione è una tecnica che consiste nell’esporre la 

cellule a campi elettrici pulsanti, in modo da aprire piccoli pori 

nella membrana, attraverso i quali possono entrare molecole di 

DNA presenti al di fuori delle cellule. 

• Viene usata per procarioti, eucarioti, Archaea e batteri 


Coniugazione batterica 



• Nella coniugazione lo scambio dipende dal contatto fisico tra cellule, avviene anche 

in presenza di DNasi ed è polarizzato 


• Caratteristiche del plasmide F 

• rep: geni che ne permettono la replicazione 

• inc: geni per l’incompatibilità (IncF1) 

• phi: inibizione dei fagi 

• finP: inibizione della fertilità 


• tra: geni (13) necessari per il trasferimento (occupano 

circa 30 kbp). I geni tra del plasmide F sono sempre 

derepressi. Tra questi ci sono geni che codificano la 

sintesi dei pili F (pili sessuali). I pili F si legano alla 

proteina OmpA situata sulla membrana esterna delle 

cellule F - , dando inizio alla coniugazione 

• OriT: punto in cui viene prodotta una rottura (Origine 

del Trasferimento); successivamente ha inizio la 

replicazione tramite il meccanismo del cerchio rotante. 

La molecola di DNA potrebbe passare all’interno del 

pilo o in un altro punto di contatto 

• All’interno della cellula F - la molecola di DN A viene 

replicata e ricircolarizzata 

geni Tra 

B C F H G S D 

K 

E 

L 

A 

J 

finP 

OriT 

IS3 

Plasmide F 

inc 

rep 

IS3 

IS2 

MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 05/13 

γδ 

phi


I pili F si 

legano alla 

proteina 

OmpA 

In F viene 

prodotta una 

rottura nel sito 

OriT e la 

replicazione 

avviene con il 

meccanismo del 

rolling circle 



F viene replicato 

e 

ricircolarizzato 

nella cellula 

ricevente 

Le due cellule 

sono ora 

entrambe F + 


Ceppi Hfr (High frequency of 

recombination) 

• In questi ceppi il plasmide F è integrato nel cromosoma 

batterico 

• Durante la coniugazione vengono trasferiti anche geni 

cromosomici 

• I ceppi Hfr si formano a causa di un crossing-over tra regioni 

omologhe presenti nel cromosoma batterico e nel plasmide F 

(sequenze d’inserzione IS) 

• I ceppi riceventi divengono F + solo se rimangono in contatto un 

tempo sufficiente per il trasferimento dell’intero cromosoma 

(100 min circa). 

• La porzione che entra nella cellula ricevente può essere 

degradata oppure incorporata nel genoma dell’F - per 

ricombinazione. 




Esperimento di incrocio interrotto 

• Poiché il trasferimento del DNA avviene a velocità costante 

(40kbp/min), la coniugazione Hfr può essere usata per 

mappare le posizioni dei geni batterici 

• Per questo motivo sulla mappa genetica di E. coli la posizione 

dei geni è espressa in minuti. 

• Si possono mappare i geni che si trovano nel primo terzo di 

cromosoma. Utilizzando diversi ceppi Hfr in cui il plasmide F 

è integrato in diversi siti, si possono mappare tutti i geni 




Coniugazione F’ 

• A volte, quando il plasmide F si stacca dal cromosoma 

batterico, si possono avere degli errori e alcuni geni 

cromosomali vengono trasferiti (excisione imperfetta). 

• In un trasferimento il ricevente diventa parzialmente 

diploide (merodiploide). 

• La coniugazione F’ è importante perché 

• 1 - il comportamento del diploide parziale mette in 

evidenza se una mutazione è dominante o recessiva 

• 2 - è utile nella mappatura: se due geni vengono inseriti in 

un fattore F devono essere vicini. 

• Questo tipo di trasferimento viene anche chiamato 

sexduzione. 



Trasferimento di altri plasmidi mediato 

da F 

• Il plasmide F è capace di promuovere il trasferimento di 

altri plasmidi incapaci di trasferimento autonomo (es. 

ColE1) con un meccanismo simile al trasferimento di se 

stesso. 

• La capacità di un plasmide di essere mobilizzato dipende 

dalla presenza di una regione specifica del DNA chiamata 

mob. 


Altri sistemi coniugativi nei batteri Gram - 

• Il plasmide F può replicarsi in tutti i batteri enterici. In altri batteri Gram - esistono 

comunque plasmidi coniugativi. 

• A volte la frequenza di trasferimento è molto bassa e viene aumentata dalla presenza 

di una sequenza di inserzione. 

• Es R68: ha la capacità di replicarsi in molti batteri (ampio spettro di ospiti); si 

trasferisce con alta frequenza e con bassa frequenza mobilizza il cromosoma batterico 

o altri plasmidi. 

• R68.45 mobilizza il DNA cromosomico di P. aeruginosa con frequenza 10 5 superiore 

rispetto a R68. 

• La differenza tra i due è la presenza di una sequenza d’inserzione IS21 di 2,1 kb. 

• Le sequenze IS21 non sono presenti sul cromosoma quindi la ricombinazione 

omologa non è alla base del meccanismo di mobilitazione del cromosoma; si tratta 

piuttosto di un meccanismo di trasposizione che genera un’integrazione transitoria di 

R68.45 nel cromosoma.

Genetica dei microrganismi 2 - Microbiologia Generale

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?