Basi molecolari: Lezione 9 - Liceo Norberto Rosa

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Basi molecolari: Lezione 9 - Liceo Norberto Rosa

LE BIOTECNOLOGIE


CHE COSA SONO

LE BIOTECNOLOGIE?

Le biotecnologie sono tutte quelle tecnologie

che usano organismi viventi, o parti di essi allo

scopo di produrre quantità commerciali di

prodotti utili all'uomo, di migliorare piante ed

animali o sviluppare microrganismi utili per usi

specifici.


Le biotecnologie si possono

• TRADIZIONALI

• INNOVATIVE

dividere in due tipi:


BIOTECNOLOGIE

TRADIZIONALI

• Le biotecnologie tradizionali sono tecnologie produttive

utilizzate da millenni, quali l'agricoltura, la zootecnica e lo

sfruttamento delle attività fermentative dei microrganismi

• permettono incroci solo tra patrimoni genetici molto simili

perché si passa attraverso l’incrocio sessuale

• Risultati incerti ottenuti in tempi lunghi


BIOTECNOLOGIE INNOVATIVE

• grazie alle scoperte della microbiologia e della

genetica si giunge a manipolare il materiale

genetico

• Le tecniche di INGEGNERIA GENETICA fanno

cadere ogni barriera e promuove lo scambio di

specie molto diverse


NASCITA DELL’INGENERIA

GENETICA

• Griffith è il padre dell’ingegneria genetica. Si

deve a lui la scoperta che i batteri, attraverso un

processo definito trasformazione batterica,

possono acquisire, riconoscere e mantenere

materiale ereditario esterno, derivante da altri

batteri.

• L’avvento delle tecnologie del DNA

ricombinante o INGEGNERIA segna una linea di

demarcazione fra biotecnologie tradizionali e

biotecnoloie innovative, caratterizzate dal

cambiamento mirato di attività di organismi

ottenute modificandone il patrimonio genetico


INGEGNERIA GENETICA

L’insieme delle tecniche che consentono di isolare

frammenti di DNA, moltiplicarli, modificarli e

combinarli con materiale genetico di provenienza

diversa.


CAMPI DI APPLICAZIONE

• Le aree applicative delle

biotecnologie sono molteplici e

vanno dall’agricoltura, all’industria

alimentare, alla sanità, alla

protezione ambientale alla

produzione di energia


CLASSIFICAZIONE DELLE BIOTECNOLOGIE

• Le biotecnologie, per l'ampiezza dei settori in cui

possono avere ricadute, sono distinte, in base al

loro campo di applicazione, in:

• White Biotechnologies

• Green Biotechnologies

• Red Biotechnologies.


White Biotechnologies

È la branca che si occupa

dei processi biotecnologici

di interesse industriale.

Ad esempio la costruzione

di microrganismi in grado di

produrre sostanza chimiche,

enzimi


consentono di:

• ridurre l'inquinamento ambientale-biotecnologia

grigia-

• contenere la spesa energetica e di materie

prime

• migliorare le caratteristiche di prodotti alimentari

• fornire migliori alternative ai processi industriali

convenzionali.


• I bioprocessi sono scalabili anche a migliaia di

tonnellate e sono in genere più economici ed

ecocompatibili dei convenzionali processi

chimici.

• Microrganismi geneticamente modificati sono

in grado di produrre in maniera ottimale i

prodotti di interesse, grazie all'inserimento di

opportuni geni ed al corretto direzionamento

dei flussi metabolici cellulari.


Green biotechnology

È il settore applicato ai processi agricoli.

Tra le applicazioni, figura la modificazione

di organismi per renderli in grado di

crescere in determinate condizioni

ambientali o nutrizionali. Lo scopo di

questo settore è quello di produrre

soluzioni agricole aventi un impatto

ambientale minore rispetto ai processi

agricoli classici


Red biotechnology

È il settore applicato ai processi biomedici

e farmaceutici. Alcuni esempi sono

l'individuazione di organismi in grado di

sintetizzare farmaci o antibiotici, oppure lo

sviluppo di tecnologie di ingegneria

genetica per la cura di patologie.


ALCUNE APPLICAZIONI

• PRODUZIONE DI PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE

– Scelta della “fabbrica”

– Scelta del vettore

– Produzione di un DNA ricombinante

– Trasformazione batterica

– clonaggio


LE FABBRICHE : I BATTERI

La maggior parte

dei metodi utilizzati

per manipolare il

DNA utilizza i

batteri e in

particolare E.coli

perchè sono facili

da manipolare e

da coltivare


La nostra cellula ospite: Escherichia coli

• Batterio non patogeno

• crescita in terreno minimo

• alta frequenza replicativa

• buona conoscenza del suo genoma


Scelta del vettore : i plasmidi

• DNA circolare a doppio

filamento

• Presenti in numero variabile

di copie nella

cellula batterica

• Si replica in modo

indipendente dal DNA

genomico

• Spesso contiene geni che

conferiscono un vantaggio

al batterio che lo possiede


I plasmidi sono un ottimo vettore per

geni estranei alla cellula perché

possono essere introdotti nella

cellula con un processo di

TRASFORMAZIONE BATTERICA

e in tal modo veicolano i gene di

interesse


– I ricercatori possono inserire in un plasmide un

pezzo di DNA contenente un gene dando origine

a DNA ricombinante.

– Il plasmide viene poi introdotto nella cellula

batterica.

– Il batterio geneticamente modificato è messo in

coltura e si riproduce per formare un clone di

cellule (un gruppo di cellule identiche alla cellula

madre da cui derivano).

– Ogni cellula possiede una copia del gene e può

produrre la proteina


Trasformazione batterica in

• La trasformazione

batterica in natura è

un processo che

permette a diversi

batteri di scambiarsi

materiale genetico

natura


COSTRUZIONE DI UN DNA

RICOMBINANTE

Nei laboratori i plasmidi

vengono modificati

tagliandone alcuni tratti e

inserendone altri,

servendosi di enzimi

batterici: gli ENZIMI DI

RESTRIZIONE


GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE

Gli enzimi di restrizione sono enzimi di origine batterica che tagliano il

DNA in punti specifici, diversi per ciascun enzima. Si conoscono 1027

enzimi di restrizione in 861 tipi di batteri diversi : ognuno di essi riconosce

e taglia il DNA in una sequenza ben precisa

L’enzima si lega alla

doppia elica del DNA e

la percorre fino a

incontrare la sua

sequenza di

riconoscimento, di

grandezza variabile da 4

a 6 basi.


Queste estremità, dette sticky ends, sono

“appiccicose”, cioè tendono ad aderire a

sequenze di DNA complementari.

Intervento degli enzimi di restrizione

Apertura del DNA e formazione delle sticky ends


-Il tratto di DNA da

inserire nel plasmide

viene tagliato (enzimi

di restrizione) e

isolato(elettroforesi)

-Il plasmide viene tagliato

con gli stessi enzimi di

restrizione, è così pronto

ad integrare il tratto di

DNA

DNA Ricombinante

Preparazione del plasmide


LIGAZIONE: l’enzima DNA-ligasi che incolla le estremità dei filamenti

di DNA catalizzando la formazione di legami covalenti.

INSERTO

Ligasi

PLASMIDE + INSERTO

PLASMIDE RICOMBINANTE

PLASMIDE


PLASMIDE

RICOMBINANTE

TRASFORMAZIONE

BATTERIO TRASFORMATO

RICOMBINANTE

BATTERIO

TRASFORMAZIONE


Ghiaccio

SHOCK

TERMICO

L’ingresso effettivo dell’acido nucleico esogeno è provocato dallo

Shock termico

Bagnetto

termostatato

42°C per 45 secondi

Ghiaccio

30 min 1 min


•Produzione di DNA

ricombinante tramite l’uso di

enzimi di restrizione e

dell’enzima DNA-ligasi:

L’enzima di restrizione riconosce la sequenza

1

DNA

L’enzima di restrizione

taglia il DNA in frammenti

2

C T T A A

Aggiunta di un frammento di

DNA di provenienza estranea

Due frammenti si attaccano tra

loro appaiando le basi azotate

4

G

G A AT T C

C T TA A G

L’enzima DNA-ligasi

incolla i frammenti

5

G A A T T C

C T T A A G

A AT TC

A AT TC

G

3

G

Estremità coesiva

G A AT T C

C T TA A G

DNA ricombinante

G

C T T A A


BATTERIO RICOMBINANTE

RIPRODUZIONE

INOCULO IN PIASTRA

COLONIE DI E.COLI

SI OTTENGONO VARIE COPIE DI PLASMIDE RICOMBINANTE E QUINDI DEL FRAMMENTO DI DNA

D’INTERESSE


I geni dei plasmidi ricombinanti si possono clonare

– I plasmidi entrano nei batteri per

trasformazione.

– I batteri, con i plasmidi ricombinanti, sono

messi in condizione di riprodursi, dando

origine a un clone di cellule con molte copie

dei plasmidi e dei geni che trasportano.


SELEZIONE BATTERI TRASFORMATI

I batteri trasformati

crescono su terreno

selettivo contenente

ampicillina, in quanto

possiedono il gene per

la resistenza

all’antibiotico


-DNA ricombinante

-Plasmide+tratto DNA

In sintesi

-Selezione batteri

-Produzione di proteine

-Proliferazione

batteri

modificati


Clonazione di un

gene in un

plasmide

batterico:

1

2 Si tagliano

E.coli

entrambi i DNA

con un enzima di

restrizione

Cellula umana

Plasmide DNA

Gene V

Plasmide con

DNA ricombinante

Batterio

ricombinante

Si isola il DNA da due fonti diverse

Estremità coesive

3 Si mescolano le molecole di DNA che si

uniscono mediante

appaiamento di basi azotate

Gene V

Clone batterico in possesso di molte copie del gene umano

4 Si aggiunge DNA-ligasi per attaccare il DNA con

legami covalenti

5

6

Si inserisce il plasmide in un batterio tramite

trasformazione

Si clona il batterio


•Si può produrre DNA da clonare anche

mediante l’enzima trascrittasi inversa

L’enzima trascrittasi

inversa può essere usato

per ottenere librerie di

DNA complementare

(cDNA) contenenti solo i

geni espressi da un

particolare tipo di

cellula.


•cellule e organismi ricombinanti sono utilizzati

per ottenere prodotti genici su larga scala

– Le applicazioni della clonazione genica includono

la produzione di prodotti genici su larga scala per

usi medici e altri usi.

– I batteri si sono spesso dimostrati gli organismi

migliori per sintetizzare un prodotto proteico.

– Alcune volte è preferibile o necessario utilizzare le

cellule eucariotiche di lieviti e mammiferi.


•Per ottenere molte copie di una

specifica sequenza di DNA si utilizza

comunemente la tecnica PCR

Quando il campione di DNA

è scarso o impuro, la

reazione a catena della

polimerasi (Polymerase

Chain Reaction, o PCR) è un

metodo più appropriato per

ottenere un grande

quantitativo

di un particolare gene.

Molecola

iniziale

di DNA

1 2 4 8

Numero di molecole di DNA


•I geni clonati possono essere conservati in «librerie»

genomiche

•L’intera collezione di tratti di DNA clonati tramite shotgun,

derivanti dalla frammentazione di tutto il genoma di una

cellula, è chiamata libreria genomica.

Plasmide

ricombinante

Clone

batterico

Libreria plasmidica

oppure

Genoma tagliato con l’enzima di restrizione

Clone

fagico

DNA fagico

ricombinante

Libreria fagica

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