pZCV 5.7kb
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Mappa di restrizione di un plasmide per clonaggio e geni per la<br />
selezione della trasformazione.<br />
<strong>pZCV</strong><br />
<strong>5.7kb</strong><br />
Gli enzimi di restrizione da usare devono<br />
essere scelti tra quelli che tagliano<br />
all’interno di uno dei geni per la<br />
selezione (in questo caso resistenza per<br />
ampicillina, Amp R , e kanamicina , Kan R )<br />
in modo che, inserendo il DNA esogeno,<br />
la sua funzione si perde (HindIII, EcoRI,<br />
BamHI e SfiI).<br />
Inoltre, deve avere un solo sito di taglio<br />
nel plasmide (EcoRI, BamHI e SfiI)
<strong>pZCV</strong><br />
<strong>5.7kb</strong><br />
1.5kb<br />
Analizzare quindi il tratto di DNA che<br />
contiene il frammento da inserire nel<br />
plasmide.<br />
Gli enzimi di restrizione da usare devono<br />
coincidere con quelli già scelti per il<br />
plasmide (EcoRI, BamHI) e che non<br />
taglino all’interno del frammento da<br />
clonare.<br />
L’enzima che risponde a tutte le<br />
caratteristiche è BamHI
Digestione del plasmide con BamHI<br />
<strong>pZCV</strong><br />
<strong>5.7kb</strong><br />
Digestione del DNA da clonare con BamHI<br />
1.5kb<br />
- Si digeriscono vettore e frammento<br />
con BamHI;<br />
- si mescolano insieme secondo<br />
proporzioni che favoriscono<br />
l’incorporazione del frammento nel<br />
plasmide;<br />
- si legano con l’enzima ligasi per<br />
ottenere
<strong>pZCV</strong><br />
ricombinante<br />
7.2kb<br />
Amp<br />
Kan<br />
1) Si seminano i batteri su agar contenente<br />
l’antibiotico ampicillina per selezionare i<br />
batteri che hanno incorporato il plasmide<br />
2) Si fa una replica della coltura precedente<br />
(replica plating) su agar contenente<br />
l’antibiotico kanamicina. Solo i batteri con il<br />
plasmide «vuoto» possono crescere su<br />
kanamicina<br />
- Si trasformano batteri di ceppo<br />
adatto con questi plasmidi<br />
ricombinanti<br />
- si selezionano i batteri con i plasmidi<br />
ricombinanti nel seguente modo:<br />
RISULTATO<br />
Amp<br />
Amp+/Kan+<br />
Amp+/Kan-<br />
i batteri di interesse sono<br />
quindi quelli Amp+/Kan-
La conferma che l’esperimento è riuscito si ottiene<br />
dalla digestione del plasmide ricombinante con gli<br />
opportuni enzimi di restrizione e elettroforesi del<br />
DNA digerito<br />
<strong>pZCV</strong><br />
ricombinante<br />
7.2kb<br />
1 = DNA da colonia Kan+ digerito con BamHI<br />
(vettore vuoto -> 1 banda da 5.7 kb)<br />
2 = DNA da colonia Kan- digerito con BamHI<br />
(vettore ricomb. -> contiene il frammento da 1.5kb)<br />
3 = DNA da colonia Kan- digerito con SfiI<br />
(avendo un solo sito di riconoscimento nel plasmide<br />
ricombinante lo linearizza -> 1 banda da 7,2kb)<br />
7.2 kb<br />
5.7 kb<br />
1.5 kb<br />
Amp Kan<br />
1 2 3 M<br />
9.0 kb<br />
8.0 kb<br />
7.0 kb<br />
6.0 kb<br />
5.0 kb<br />
4.0 kb<br />
3.0 kb<br />
2.0 kb<br />
1.0 kb<br />
Amp+/Kan+<br />
Amp+/Kan-
Change language