ISOTR 13843 Validation of EnterolertDW Quanti-Tray - IDEXX ...

Validazione delle prestazioni del metodo in conformità alla norma 

ISO/TR 13843 per il sistema Enterolert * -DW e Quanti-Tray * per 

la determinazione quantitativa degli enterococchi nelle acque 

destinate al consumo umano. 

APRILE 2010 

One IDEXX Drive • Westbrook, Maine 04092 Stati Uniti 

idexx.it 

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*Enterolert, Define Substrate Technology, DST e Quanti-Tray sono marchi o marchi registrati 

di IDEXX Laboratories, Inc. o di suoi affiliati negli Stati Uniti e/o in altri Paesi. 

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d1. Introduzione 

Il metodo Enterolert*- DW, basato sulla tecnologia Defined Substrate Technology* (DST*), è stato 

elaborato per rilevare gli enterococchi in acqua potabile. Durante la crescita degli enterococchi nel 

terreno colturale liquido, gli enzimi da essi prodotti metabolizzano un substrato specifico per la βglucosidasi, 

modificando il colore del terreno colturale da blu a verde e confermando in questo 

modo la presenza di enterococchi in campioni di acqua potabile. 

Il sistema Enterolert-DW e Quanti-Tray* (Enterolert-DW/Quanti-Tray) viene utilizzato per 

l’isolamento e l’enumerazione degli enterococchi in campioni di acqua potabile. Una confezione di 

reagente Enterolert-DW viene aggiunta a un flacone sterile contenente il campione di acqua da 

analizzare. Una volta aggiunto il reagente in polvere, il recipiente viene agitato per dissolvere la 

polvere. 

La miscela contenente il campione/reagente disciolti viene versata in un Quanti-Tray o un Quanti- 

Tray 2000 e il vassoio viene sigillato con il sigillatore Quanti-Tray Sealer. Il vassoio viene quindi 

incubato a (41 ± 0,5) ºC per 24 ore. 

La quantificazione degli enterococchi confermati nel campione viene determinata mediante il 

conteggio del numero di pozzetti di colore verde nel Quanti-Tray usando il metodo statistico del 

numero più probabile (MPN). 

2. Applicazioni del sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray 

Il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray è stato concepito per analizzare campioni di acqua potabile e 

per offrire prestazioni paragonabili a quelle previste dalla norma ISO 7899-2:2000 Qualità dell’acqua 

– Ricerca ed enumerazione degli enterococchi intestinali – Parte 2: Metodo di filtrazione su 

membrana (ISO 7899-2) e Microbiologia dell’acqua potabile (2006) – Parte 5: Isolamento ed 

enumerazione degli enterococchi intestinali (membrane filtranti) (MoDW 2006, Parte 5) in relazione 

alle acque potabili. Il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray offre risultati quantitativi confermati per gli 

enterococchi in campioni di acqua potabile entro 24 ore. 

3. Identificazione degli organismi target (ISO/TR 13843 sezioni 10.2.1 e 9.2) 

Il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray rileva gli enterococchi in base all’attività della loro βglucosidasi 

utilizzando la tecnologia Defined Substrate Technology. Quando nel campione 

esaminato sono presenti enterococchi, il terreno colturale cambia colore, passando da blu a verde. 

Il sistema Quanti-Tray offre risultati quantitativi basati sul metodo statistico del numero più probabile 

(MPN). 

3.1 L’esame della coltura pura (ISO/TR 13843 sezione 10.2.1) 

Le reazioni tipiche del sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray sono state definite mediante l’impiego di 

colture pure di ceppi di riferimento provenienti dall’American Type Culture Collection (ATCC) 

inoculate nel terreno di coltura. Sono stati testati gli enterococchi bersaglio, oltre ai batteri gramnegativi 

e gram-positivi non bersaglio. I risultati tipici di questi ceppi di riferimento sono riportati nella 

Tabella 3.1. Questi ceppi vengono utilizzati da IDEXX per il normale controllo qualità del sistema 

Enterolert-DW/Quanti-Tray. 

IDEXX Laboratories, Inc. 

1

Tabella 3.1 Ceppi di riferimento di enterococchi e di batteri gram-negativi e gram-negativi non bersaglio 

utilizzati per confermare le tipiche reazioni positive e negative nel sistema Enterolert-DW/Quanti- 

Tray 

2BUBatterio 1BUCeppo BUReazione tipica di Enterolert-DW 

Enterococcus faecium ATCC 35667 Verde 

Enterococcus faecalis ATCC 33186 Verde 

Enterococcus hirae ATCC 8043 Verde 

Serratia marcescens** ATCC 43862 Blu (nessuna variazione di colore) 

Staphylococcus aureus*** ATCC 6538 Blu (nessuna variazione di colore) 

** Fino a 10 6 UFC/100 ml *** Fino a 10 4 UFC/100 ml 

3.2 Studi su sensibilità, specificità, tasso di falsi positivi/negativi, efficienza e selettività 

(ISO/TR 13843 sezione 9.2) 

In termini di metodiche microbiologiche,la norma ISO/TR 13843 fornisce la definizione delle 

caratteristiche di seguito riportata: 

a) numero di risultati positivi presuntivi confermati positivi (veri positivi) 

b) numero di risultati negativi presuntivi confermati positivi (falsi negativi) 

b) numero di risultati positivi presuntivi confermati negativi (falsi positivi) 

b) numero di risultati negativi presuntivi confermati negativi (veri negativi) 

1) Sensibilità = a/(a + b), frazione dei positivi totali correttamente assegnati nel conteggio presuntivo 

2) Specificità = d/(c + d), frazione dei negativi totali correttamente assegnati nel conteggio presuntivo 

3) Tasso di falsi positivi = c/(a + c), frazione dei positivi osservati assegnati incorrettamente 

4) Tasso di falsi negativi = b/(b + d), frazione dei negativi osservati assegnati incorrettamente 

5) Efficienza (E) = (a + d)/n 

6) Selettività (F) = lg [(a + c)/n] 

Per il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray, queste caratteristiche sono collegate al numero di 

pozzetti positivi per gli enterococchi che effettivamente contenevano batteri bersaglio e al numero di 

pozzetti realmente negativi per i batteri bersaglio. 

La valutazione della sensibilità, della specificità e della selettività del sistema Enterolert-DW/Quanti- 

Tray è stata ottenuta attraverso l’identificazione degli isolati batterici dai pozzetti positivi e negativi 

dei campioni testati. I campioni sono stati preparati aggiungendo ai campioni di acqua potabile 

volumi definiti di acqua reflua trattata o non trattata con cloro 

Nella presente validazione, i falsi positivi e negativi del sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray sono 

stati identificati mediante l’isolamento selettivo e l’identificazione batterica in 229 pozzetti positivi e 

in 186 pozzetti negativi selezionati casualmente tra campioni prelevati in 49 siti negli Stati Uniti, nel 

Regno Unito e in Italia, Belgio e Spagna. È stato utilizzato il sistema di identificazione biochimica 

VITEK ® II (bioMérieux, Inc. Durham, NC, USA). I risultati sono descritti in dettaglio rispettivamente 

nell’Appendice I e nell’Appendice II. 

Le caratteristiche di prestazione del sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray, definite in base alla norma 

ISO/TR 13843, sono elencate nella Tabella 3.2.1 


2

Tabella 3.2.1 Sensibilità, specificità, tasso di falsi positivi/negativi, efficienza e selettività del sistema 

Enterolert-DW/Quanti-Tray 

Caratteristica Risultati 

Sensibilità 95% 

Specificità 98% 

Tasso di falsi positivi 2% 

Tasso di falsi negativi 7% 

Efficienza 96% 

Selettività -0,3 

Gli isolati batterici di quattro (4) pozzetti positivi su 229 sono stati identificati come specie non 

enterococciche e tredici (13) isolati su 186 pozzetti negativi sono stati identificati come specie di 

enterococchi. Le specie batteriche che hanno fornito risultati falsi positivi e falsi negativi durante 

questa validazione sono riportate rispettivamente nelle Tabelle 3.2.2 e 3.2.3. 

Tabella 3.2.2 Identificazione batterica con falsi positivi mediante VITEK II 

Specie responsabile 

dei falsi positivi 


UOccorrenza 

(su 229 positivi) 

Lactococus raffinolactis 1 

Elizabethkingia meningoseptica 3 

Tabella 3.2.3 Identificazione batterica con falsi negativi mediante VITEK II 

Specie responsabile 

dei falsi negativi 

Occorrenza 

(su 186 negativi) 

Enterococcus hirae 2 

Enterococcus faecium 4 

Enterococcus avium 5 

Enterococcus faecalis 1 

Enterococcus casseliflavus 1 

Gli esiti di questa validazione indicano che il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray è sensibile e 

specifico (rispettivamente 95% e 98%). Il metodo, inoltre, è molto selettivo con un valore di -0,3, che 

risulta molto migliore del valore guida di -1 indicato dalla norma ISO/TR 13843 per i metodi per la 

conta delle colonie. Con un valore di efficienza calcolato di 96%, i dati suggeriscono che il metodo è 

altamente efficiente. I dati sull’identificazione indicano che il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray è in 

grado di rilevare un’ampia gamma di specie di enterococchi. 

4. Incertezza della conta (ISO 13843 sezione 10.2.1 e Allegato B) 

La ripetibilità e la riproducibilità sono due stime dell’affidabilità di un metodo che è possibile ottenere 

con una tecnica analitica. La ripetibilità (r) e la riproducibilità (R) vengono definite come segue: 

ripetibilità: grado di concordanza tra i risultati ottenuti da numerose prove indipendenti sotto 

condizioni definite,applicando lo stesso metodo analitico,su di uno stesso 

materiale,nello stesso laboratorio,eseguito dallo stesso operatore,in un breve 

intervallo di tempo 

3

iproducibilità: grado di concordanza tra i risultati ottenuti da numerose prove,applicando lo 

stesso metodo analitico,su uno stesso materiale,in laboratori differenti,con 

operatori diversi. 

Nel caso della conta di colonie microbiologiche su piastra agar o reazioni positive in un test 

MPN, l’analista rappresenta la ‘condizione’ che rimane invariata oppure che 

cambia. Pertanto, in questo contesto, la ripetibilità è la concordanza fra le 

conte ottenute con conteggi ripetuti da parte dello stesso analista, mentre la 

riproducibilità è la concordanza fra conte successive ottenute da parte di due 

o più analisti. 

L’Allegato B della norma ISO/TR 13843 fornisce le indicazioni per la determinazione del conteggio 

della ripetibilità e della riproducibilità utilizzando deviazioni standard relative (DSR) di conte ripetute. 

Contiene inoltre la raccomandazione secondo cui, quando si utilizzano colture pure, le DSR siano 

idealmente < 0,02 (vale a dire una deviazione non superiore al 2%). 

In questo caso,sono stati condotti studi sull’incertezza dei conteggi e i dati sono illustrati 

nell’Appendice III. Il conteggio è stato eseguito in modo che ciascun analista non fosse a 

conoscenza delle conte degli altri analisti e i valori MPN risultanti sono stati registrati come numeri 

interi. Le DSR calcolate dai valori MPN dei sistemi Enterolert-DW/Quanti-Tray inoculati con 

Enterococcus faecalis ATCC 19433 sono riportate nella Tabella 4.1. 

Tabella 4.1 Ripetibilità e riproducibilità del sistema Enterolert-DW 

OIncertezza dei conteggi 


UDeviazione standard 

relativa (DSR) 

Ripetibilità (r) 0,006 

Riproducibilità (R) 0,005 

I valori calcolati per gli enterococchi tipici sono molti inferiori al valore di < 0,02 (ISO/TR 13843 

sezione B1), il che indica come sia possibile ottenere un conteggio MPN affidabile per gli 

enterococchi con il metodo Enterolert-DW/Quanti-Tray. 

5. Robustezza (ISO/TR 13843 sezioni 10.2.2 e B.4) 

La caratteristica rilevante per la robustezza del metodo Enterolert-DW/Quanti-Tray è relativa al 

periodo di incubazione: 24 ore, con il risultato valido fino a 28 ore, come descritto nel metodo. 

Nell’Appendice IV sono riportati i risultati delle conte, in triplo, delle sospensioni delle colture di 

riferimento di E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae, E. mundtii e E. gallinarum analizzate 

utilizzando lo stesso lotto di Enterolert-DW dopo un periodo di incubazione di 24 e di 28 ore. 

Non sono state osservate variazioni nelle conte per 6 dei 7 tipi di ceppi certificati. Le conte di E. 

gallinarum ATCC 49573 sono risultate aumentate di un pozzetto positivo nel periodo tra 24 e 28 ore. 

Questo ceppo di E. gallinarum ATCC 49573 sembra mostrare un tasso di crescita relativamente più 

basso o un’attività enzimatica più debole rispetto agli altri ceppi batterici testati. 

I dati suggeriscono che il periodo di incubazione raccomandato di almeno 24 ore e non oltre 28 ore 

è robusto. Tuttavia, per alcuni ceppi di enterococchi che crescono lentamente o possiedono 

un’attività β-glucosidasica ridotta, può esistere un aumento marginale delle conte dopo 28 ore di 

incubazione rispetto alle conte effettuate dopo 24 ore di incubazione. 

L’aumento delle conte durante un periodo di incubazione stabilito (per es. 40-48 ore per metodi di 

filtrazione su membrana tipici quali ISO 7899-2 o MoDW 2006, parte 5) è un fenomeno noto, 

soprattutto con gli enterococchi rilevabili nell’ambiente. Tuttavia, per considerazioni pratiche e 

operative, le conte ottenute con il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray dopo un periodo di 

4

incubazione di 24 - 28 ore sono considerate accettabili, purché l’aumento delle conte dopo 

un’incubazione prolungata non sia troppo eccessivo. 

6. Limiti superiori di esercizio (ISO/TR 13843 sezioni 10.2.4 e 6.3.3) 

Il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray è un metodo MPN con una scala di conteggio definita tra 0 e 

201 per Quanti-Tray e tra 0 e 2.420 per Quanti-Tray/2000 determinata in base al numero di pozzetti 

presenti nel Quanti-Tray. 

In conformità alla norma ISO/TR 13843, sezione 6.3.3, per ragioni pratiche e statistiche, non è 

possibile stabilire alcun limite superiore per i metodi MPN “poiché la precisione non dipende 

semplicemente dal numero di particelle introdotte nel sistema di rilevazione”. 

7. Precisione (ISO/TR 13843 sezioni 10.2.5 e 9.5.5) 

La precisione di un metodo MPN viene descritta dagli intervalli di confidenza del 95% (IC) calcolati 

per ciascun valore MPN (ISO/TR 13843, sezione 9.5.5). 

Nell’Appendice V sono riportati gli intervalli di confidenza per le conte del sistema Enterolert- 

DW/Quanti-Tray, calcolati utilizzando il programma messo a disposizione on-line dal Bacteriological 

Analytical Manual (BAM) della US Food and Drug Administration (FDA) 

(http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html#excl).. 

La ripetibilità teorica per ciascun valore MPN può derivare dall’MPN e dai suoi intervalli di 

confidenza. 

Nell’Appendice VI, inoltre, sono illustrati i valori di incertezza relativi per ciascun MPN 

(log10DS,calcolato dai valori degli intervalli di confidenza del 95% dell’MPN) e la ripetibilità 

(incertezza standard relativa) come coefficienti di variazione (CV%). Questi coefficienti di Poisson 

possono essere utilizzati come valori minimi di precisione a cui è possibile combinare tutti i dati 

pertinenti posseduti da un laboratorio (per es. sulla variazione della chiarificazione del volume del 

test o dell’incertezza del conteggio) allo scopo di ottenere una stima complessiva di ripetibilità per 

ciascun valore MPN. 

8. Recuperi relativi (ISO/TR 13843 sezione 10.2.6 e ISO 17994) 

Il recupero relativo degli enterococchi spp. con il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray è stato 

confrontato al recupero con i metodi di riferimento ISO 7899-2 e MoDW 2006, parte 5, in conformità 

ai requisiti descritti nella norma ISO 17994:2004 Qualità dell'acqua - Criteri per definire una 

equivalenza tra metodi microbiologici (ISO 17994). 

In questa validazione sono stati utilizzati complessivamente 403 campioni di acqua potabile 

provenienti da diverse aree geografiche di Regno Unito, Italia, Spagna, Belgio e Stati Uniti. Gli 

stessi campioni sono stati usati in ciascuno dei tre metodi sottoposti a confronto. Di questi, 198 

campioni erano trattati con cloro e 205 campioni non lo erano. 

I dati confermati delle conte accoppiate per il confronto dei due metodi (sistema Enterolert-DW/Quanti- 

Tray e ISO 7899-2 oppure sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray e MoDW parte 5) sono stati trasformati 

utilizzando logaritmi naturali (ln) e sono state calcolate le differenze relative delle conte per ciascuna 

coppia (xi) applicando la formula [ln(ai) – ln(bi)] x 100% (dove ai e bi rappresentano le conte confermate 

accoppiate rispettivamente per il metodo esaminato e per quello di riferimento). 

Nota: se una delle conte risulta zero, prima della trasformazione logaritmica viene aggiunto 1 a 

entrambe le conte. 

La differenza relativa media e la deviazione standard sono state calcolate a partire dai dati. La 

valutazione dell’equivalenza si è basata sulla differenza relativa media e sull’incertezza estesa (U) 

[calcolata dalla deviazione standard del valore medio (U = 2s/√n)], da cui sono stati calcolati i limiti 


5

inferiore (xL) e superiore (xH) dell’intervallo di confidenza. Gli esiti dello studio sono riportati nelle 

Tabelle 8.1 e 8.2. 

L’analisi ha mostrato che il metodo Enterolert-DW/Quanti-Tray fornisce valori complessivamente 

maggiori di recupero rispetto alla norma ISO 7899-2. Questo risultato e’ dovuto principalmente alle 

differenze relative ottenute utilizzando matrici di campioni di acqua trattati con cloro. Per i campioni 

non trattati con cloro, la validazione riporta il risultato come “Metodi non diversi” per il confronto tra i 

due metodi. 

La conclusione generale del confronto tra il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray e MoDW 2006, 

Parte 5 è stata di “Metodi non diversi”; i risultati del sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray erano più 

elevati con i campioni trattati con cloro e non mostravano differenze per i campioni non trattati. 

Le differenze osservate nei recuperi tra il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray e i due metodi 

standard derivavano probabilmente dal peggioramento delle prestazioni dei metodi standard 

quando venivano usati i campioni trattati con cloro. Questa ipotesi è ulteriormente supportata dal 

tasso ridotto di falsi positivi (2%) e dall’elevata specificità (98%) determinati per il sistema 

Enterolert-DW/Quanti-Tray. Poiché si tratta di una validazione eseguita su aliquote degli stessi 

campioni, i risultati hanno indicato che i metodi standard non erano stati in grado di rilevare alcuni 

microrganismi bersaglio nello stesso campione di acqua. I recuperi relativi per ciascun metodo sono 

riassunti nell’Appendice VII. 

Durante questa validazione sono state osservate differenze significative nel recupero relativo tra i 

due metodi standard ISO 79-899-2 e MoDW 2006, Parte 5. I risultati sono riassunti nella Tabella 8.3. 

Tabella 8.1 Sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray vs. ISO 7899-2 

Matrice campioni di 

acqua potabile 


Differenza relativa 

media (%DR) 

Incertezza estesa 

BASSA (%XL) 

Tutte le matrici 18 11 26 

Matrice campioni trattati 

con cloro 

Matrice campioni non 

trattati con cloro 

31 19 43 

6 -3 13 

Tabella 8.2 Sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray vs. MoDW 2006, Parte 5 




media (%DR) 


BASSA (%XL) 

6 


ALTA (%XH) Conclusioni 

Enterolert-DW 

più alto 

Enterolert-DW 

più alto 

Nessuna 

differenza tra 

i metodi 



Tutte le matrici 3 -4 10 Nessuna 

differenza tra 

i metodi 

Matrice campioni trattati 

con cloro 



13 3 26 Enterolert-DW 

più alto 

-8 -15 0 Non conclusivo

Tabella 8.3 ISO 7899-2 vs. MoDW 2006, Parte 5 





media (%DR) 


BASSA (%XL) 

7 



Tutte le matrici -15 -14 -16 Metodi 

significativamente 

differenti 

Matrice campioni 




9. Riferimenti bibliografici 

-17 -15 -19 Metodi 


differenti 

-13 -12 -15 Metodi 


differenti 

• ISO 7899-2:2000 Qualità dell’acqua – Ricerca ed enumerazione degli enterococchi 

intestinali - Parte 2: Metodo di filtrazione su membrana. Ginevra: Organizzazione 

• Internazionale per la Standardizzazione. 

• The Microbiology of Drinking Water (2006) - Part 5 - The isolation and enumeration of 

enterococci by membrane filtration. Nottingham: Environment Agency 

• The Microbiology of Drinking Water (2002) - Part 3 - Practices and procedures for 

laboratories. Nottingham: Environment Agency 

• ISO/TR 13843:2000(E) Qualità dell’acqua – Guida alla validazione dei metodi microbiologici. 

• Ginevra: Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione. 

• ISO 17994:2004 Qualità dell'acqua - Criteri per definire una equivalenza tra metodi 

microbiologici. Ginevra: Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione.

Appendice I: Identificazione di isolati da pozzetti positivi con Enterolert-DW/Quanti-Tray 

UID campione UReazioni Enterolert-DW UID VITEK UID confidenza 

1 + E. gallinarum 99% 

2 + E. faecium 97% 





7 + E. faecalis 99% 






13 + E. hirae 99% 







20 + E. avium 92% 


22 + E. durans/hirae IC basso 


24 + E. seriolicida 99% 





29 + 


E. seriolicida/L. lactis 

ssp lactis IC basso 


31 + Lactococus raffinolactis 90% 









8



41 + E. hirae 95% 

42 + E. hirae 99% 


44 + E. hirae 95% 

45 + E. hirae 99% 





50 + E. hirae 99% 

51 + E. durans/faecium IC basso 



54 + E. durans 98% 




58 + E. hirae 99% 


60 + E. hirae 99% 





65 + E. durans 97% 



68 + E. hirae 95% 




72 + E. casseliflavus 89% 




76 + E. seriolicida / lactis IC basso 

77 + E. durans/faecium/hirae IC basso 




81 + E. durans/hirae IC basso 


9




84 + E. hirae 95% 


86 + E. seriolicida /lactis IC basso 




90 + E. avium 95% 












102 + E. faecium 96% 

103 + E. faecium 99% 

104 + E. faecium 92% 


106 + E. faecium 99% 

107 + E. durans/gallinarum/hirae IC basso 



110 + E. faecium 98% 

111 + Elizabethkingia meningoseptica 95% 



114 + E. faecium 98% 


116 + E. faecium 99% 

117 + E. casseliflavus/gallinarum IC basso 

118 + E. faecium 99% 



121 + E. faecium/gallinarum IC basso 


123 + E. hirae 99% 


10


124 + E. raffinosus 91% 

125 + E. faecium 99% 




129 + E. hirae 99% 

130 + E. durans 95% 


132 + E. seriolicida / lactis IC basso 

133 + E. faecium 86% 




137 + E. faecium 99% 

138 + E. hirae 99% 

139 + E. faecium 98% 


141 + E. faecium 98% 


143 + E. faecium 99% 

144 + E. faecium 99% 



147 + E. faecium 99% 

148 + E. faecium 99% 

149 + E. durans 85% 


151 + E. faecium/gallinarum IC basso 

152 + E. faecium 99% 

153 + E. faecium 94% 

154 + E. faecium 99% 


156 + E. hirae 91% 

157 + E. durans 94% 

158 + E. faecium 99% 

159 + E. faecium 98% 

160 + E. durans 98% 


162 + E. durans 92% 



165 + E. faecium 99% 


11


166 + E. faecium 99% 

167 + E. faecium 98% 




171 + E. durans 98% 

172 + E. faecium 99% 

173 + E. hirae 99% 

174 + E. faecium 99% 


176 + E. faecium 98% 

177 + E. hirae 95% 

178 + E. avium 90% 




182 + E. faecium 99% 

183 + E. hirae 99% 

184 + E. faecium 95% 




188 + E. faecium 93% 

189 + E. faecium 99% 

190 + E. faecium 93% 

191 + E. faecium 99% 



194 + E. faecium 99% 


196 + E. faecium 99% 


198 + E. faecium 98% 

199 + E. faecium 98% 


201 + E. faecium 91% 

202 + E. faecium 99% 



205 + E. faecium 97% 


207 + E. faecium 99% 


12


208 + E. faecium 98% 



211 + E. faecium 99% 

212 + E. casseliflavus/E. gallinarum IC basso 


214 + E. faecium 99% 

215 + E. durans 93% 

216 + E. faecium 98% 

217 + E. durans 99% 


219 + E. faecium 97% 


221 + E. faecium 98% 

222 + E. faecium 99% 


224 + E. faecium 97% 




228 + E. faecium 99% 

229 + E. faecium 98% 


13

Appendice II: Identificazione di isolati da pozzetti negativi con Enterolert-DW/Quanti-Tray 

UID 

campione 

UReazioni 

Enterolert-DW 


UID VITEK UID confidenza 

1 - Nessuna ND 


3 - E. hirae 99% 

4 - E. hirae 95% 











15 - E. faecium 99% 


















33 - Nessuna 

34 - Nessuna 

35 - E. avium 99% 

36 - E. avium 99% 





14

UID 

campione 

UReazioni 

Enterolert-DW 




















58 - E. avium 99% 
























15

UID 

campione 

UReazioni 

Enterolert-DW 










89 - E. avium 99% 






95 - E. faecalis 99% 










105 - E. casseliflavus 99% 


















16

UID 

campione 

UReazioni 

Enterolert-DW 



123 - E. avium 99% 








131 - E. faecium 98% 

































17

UID 

campione 

UReazioni 

Enterolert-DW 


























18

Appendice III: Incertezza dei conteggi per il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray 

Campione 

Enterolert-DW/Quanti-Tray in MPN/100 ml Ripetibilità Riproducibilità 

Analista A 

Conta 1 


Analista A 

Conta 2 

Analista B 

Conta 

Analista C 

Conta Media DS DSR Media DS DSR 

1 16 16 16 16 16,00 0,0000 0,0000 16,00 0,0000 0,0000 

2 16 16 16 16 16,00 0,0000 0,0000 16,00 0,0000 0,0000 

3 21 21 21 21 21,00 0,0000 0,0000 21,00 0,0000 0,0000 

4 21 21 21 21 21,00 0,0000 0,0000 21,00 0,0000 0,0000 

5 22 22 22 22 22,00 0,0000 0,0000 22,00 0,0000 0,0000 

6 27 27 27 27 27,00 0,0000 0,0000 27,00 0,0000 0,0000 

7 27 27 27 27 27,00 0,0000 0,0000 27,00 0,0000 0,0000 

8 36 36 36 36 36,00 0,0000 0,0000 36,00 0,0000 0,0000 

9 25 25 25 25 25,00 0,0000 0,0000 25,00 0,0000 0,0000 

10 34 34 34 34 34,00 0,0000 0,0000 34,00 0,0000 0,0000 

11 38 38 38 38 38,00 0,0000 0,0000 38,00 0,0000 0,0000 

12 31 31 31 31 31,00 0,0000 0,0000 31,00 0,0000 0,0000 

13 32 32 32 32 32,00 0,0000 0,0000 32,00 0,0000 0,0000 

14 31 31 31 31 31,00 0,0000 0,0000 31,00 0,0000 0,0000 

15 27 27 27 27 27,00 0,0000 0,0000 27,00 0,0000 0,0000 

16 45 45 45 45 45,00 0,0000 0,0000 45,00 0,0000 0,0000 

17 45 45 45 45 45,00 0,0000 0,0000 45,00 0,0000 0,0000 

18 45 45 45 45 45,00 0,0000 0,0000 45,00 0,0000 0,0000 

19 41 43 41 43 42,00 1,4142 0,0011 41,67 1,1547 0,0008 

20 56 56 56 56 56,00 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000 

21 50 50 50 50 50,00 0,0000 0,0000 50,00 0,0000 0,0000 

22 50 50 50 50 50,00 0,0000 0,0000 50,00 0,0000 0,0000 

23 50 50 50 50 50,00 0,0000 0,0000 50,00 0,0000 0,0000 

24 56 56 56 56 56,00 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000 

25 70 70 70 70 70,00 0,0000 0,0000 70,00 0,0000 0,0000 

26 70 70 70 70 70,00 0,0000 0,0000 70,00 0,0000 0,0000 

27 59 59 59 59 59,00 0,0000 0,0000 59,00 0,0000 0,0000 

28 56 56 56 56 56,00 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000 

29 62 62 62 62 62,00 0,0000 0,0000 62,00 0,0000 0,0000 

30 70 70 70 70 70,00 0,0000 0,0000 70,00 0,0000 0,0000 

19 

Somma 

Somma 

DSR 0,0011 DSR 0,0008 

DSR 0,0061 DSR 0,0051

Appendice IV: Valutazione della robustezza di Enterolert-DW con ceppi identificati 


E. faecium ATCC 35667 

E. faecalis ATCC 33186 

E. faecalis ATCC 19433 

E. durans ATCC 11576 

E. hirae ATCC 8043 

E. mundtii ATCC 43187 

E. gallinarum ATCC 49573 

Numero di pozzetti positivi 

Rip 24 ore 28 ore % variazione 

1 15 15 0% 

2 10 10 0% 

3 10 10 0% 

1 23 23 0% 

2 21 21 0% 

3 21 21 0% 

1 13 13 0% 

2 17 17 0% 

3 13 13 0% 

1 19 19 0% 

2 18 18 0% 

3 30 30 0% 

1 23 23 0% 

2 19 19 0% 

3 24 24 0% 

1 11 11 0% 

2 19 19 0% 

3 17 17 0% 

1 25 26 4% 

2 27 28 4% 

3 37 38 3% 

20

Appendice V: Tabella degli MPN 

N. pozzetti 

Limiti intervallo di confidenza al 95% 

positivi MPN/100 ml Inferiore Superiore 

0

N. pozzetti 

Limiti intervallo di confidenza al 95% 

positivi MPN/100 ml Inferiore Superiore 

43 94,5 68,2 135,4 

44 101,3 73,1 146,0 

45 109,1 78,6 158,7 

46 118,4 85,0 174,5 

47 129,8 92,7 195,0 

48 144,5 102,3 224,1 

49 165,2 115,2 272,2 

50 200,5 135,8 387,6 

51 > 200,5 146,1 infiniti 


22

Appendice VI: Intervalli di confidenza del 95% e ripetibilità teorica per ogni valore di MPN 

per il sistema Enterolert-DW/Quanti-Tray a 51 pozzetti 

N. pozzetti 

positivi 


MPN per 

campione 

da 100 ml Inferiore Superiore 

IC al 95% Ripetibilità teorica 

23 

DS ripetibilità 

(Log10SD) 

Incertezza standard 

relativa (CV%) 

0

N. pozzetti 

positivi 


MPN per 

campione 

da 100 ml Inferiore Superiore 

IC al 95% Ripetibilità teorica 

24 

DS ripetibilità 

(Log10SD) 

Incertezza standard 

relativa (CV%) 

35 59,1 42,0 84,4 0,0776 17,9 

36 62,4 44,6 88,8 0,0770 17,7 

37 65,9 47,2 93,7 0,0765 17,6 

38 69,7 50,0 99,0 0,0761 17,5 

39 73,8 53,1 104,8 0,0758 17,4 

40 78,2 56,4 111,2 0,0756 17,4 

41 83,1 59,9 118,3 0,0756 17,4 

42 88,5 63,9 126,2 0,0757 17,4 

43 94,5 68,2 135,4 0,0761 17,5 

44 101,3 73,1 146,0 0,0768 17,7 

45 109,1 78,6 158,7 0,0778 17,9 

46 118,4 85,0 174,5 0,0794 18,3 

47 129,8 92,7 195,0 0,0819 18,9 

48 144,5 102,3 224,1 0,0859 19,8 

49 165,2 115,2 272,2 0,0929 21,4 

50 200,5 135,8 387,6 0,1094 25,2 

51 > 200,5 146,1 infiniti - -

Appendice VII:Enterolert-DW vs. ISO 7899-2 e MoDW 2006, parte 5, risultati del 

recupero relativo 

Numero 

campione 


Matrice campioni trattati con cloro 

Enterolert-DW 

(MPN/100 ml) 

ISO 7899-2 

(UFC/100 ml) 

MoDW 2006, parte 5 

(UFC/100 ml) 

1 23 80 95 

2 69 70 86 

3 7 7 11 

4 54 78 87 

5 79 96 106 

6 116 90 100 

7 10 6 10 

8 52 79 95 

9 68 61 72 

10 39 48 59 

11 47 43 52 

12 9 10 13 

13 58 53 60 

14 57 58 70 

15 18 2 2 

16 45 48 54 

17 109 29 43 

18 64 43 53 

19 53 82 87 

20 70 73 78 

21 13 62 72 

22 83 67 71 

23 56 22 25 

24 124 75 89 

25 34 26 29 

26 62 63 73 

27 119 66 72 

28 74 77 78 

29 16 4 7 

30 96 37 50 

31 183 172 181 

32 101 60 68 

33 123 129 153 

34 56 31 38 

35 201 203 208 

36 173 141 153 

37 62 154 167 

38 41 26 33 

39 0 0 0 

25

Numero 

campione 



Enterolert-DW 

(MPN/100 ml) 

ISO 7899-2 

(UFC/100 ml) 


(UFC/100 ml) 

40 12 3 8 

41 95 85 116 

42 13 3 7 

43 68 74 95 

44 9 2 3 

45 201 156 161 

46 142 79 114 

47 13 139 149 

48 5 4 6 

49 21 0 0 

50 74 17 18 

51 165 114 130 

52 74 17 29 

53 118 55 72 

54 45 3 6 

55 201 123 124 

56 159 97 103 

57 39 79 103 

58 40 5 6 

59 24 6 7 

60 25 19 25 

61 51 22 25 

62 35 16 18 

63 35 16 18 

64 59 56 57 

65 49 28 31 

66 14 5 5 

67 50 40 44 

68 61 45 49 

69 28 19 20 

70 63 50 54 

71 56 57 63 

72 30 48 52 

73 56 54 55 

74 40 95 102 

75 56 45 50 

76 16 9 12 

77 64 84 90 

78 65 104 105 

79 27 6 8 

80 35 31 39 

26

Numero 

campione 



Enterolert-DW 

(MPN/100 ml) 

ISO 7899-2 

(UFC/100 ml) 


(UFC/100 ml) 

81 70 22 28 

82 15 17 22 

83 78 46 48 

84 49 72 87 

85 144 44 53 

86 5 2 3 

87 63 72 81 

88 58 87 96 

89 66 36 37 

90 55 12 14 

91 8 0 0 

92 1 0 0 

93 78 13 15 

94 57 27 35 

95 75 48 53 

96 123 22 34 

97 24 0 0 

98 74 5 7 

99 43 48 50 

100 59 29 35 

101 16 16 18 

102 8 1 1 

103 66 43 46 

104 38 45 46 

105 38 52 54 

106 53 38 41 

107 37 22 24 

108 44 39 41 

109 91 42 51 

110 91 48 51 

111 48 19 21 

112 5 3 5 

113 95 41 51 

114 86 34 45 

115 106 41 56 

116 68 39 47 

117 55 30 32 

118 78 40 48 

119 165 123 132 

120 165 103 112 

121 106 109 118 

27

Numero 

campione 



Enterolert-DW 

(MPN/100 ml) 

ISO 7899-2 

(UFC/100 ml) 


(UFC/100 ml) 

122 119 105 119 

123 159 121 133 

124 31 24 31 

125 137 110 124 

126 106 103 117 

127 96 90 94 

128 114 79 86 

129 98 76 93 

130 70 73 85 

131 53 73 82 

132 61 71 77 

133 11 9 13 

134 137 70 80 

135 98 67 77 

136 70 65 78 

137 44 70 76 

138 37 22 28 

139 49 25 30 

140 44 36 37 

141 37 28 34 

142 37 29 35 

143 21 4 5 

144 50 22 27 

145 42 24 33 

146 31 22 30 

147 26 20 24 

148 17 46 52 

149 31 43 55 

150 23 48 54 

151 17 61 70 

152 48 53 61 

153 31 25 32 

154 22 42 48 

155 48 36 44 

156 63 41 51 

157 50 42 49 

158 116 98 103 

159 130 80 86 

160 137 82 86 

161 106 82 85 

162 94 78 81 

28

Numero 

campione 



Enterolert-DW 

(MPN/100 ml) 

ISO 7899-2 

(UFC/100 ml) 


(UFC/100 ml) 

163 47 31 38 

164 39 44 51 

165 130 49 56 

166 159 69 78 

167 103 52 57 

168 12 41 44 

169 28 36 43 

170 19 41 45 

171 21 34 40 

172 27 33 34 

173 5 0 0 

174 5 7 8 

175 11 2 2 

176 37 18 22 

177 22 12 17 

178 58 51 58 

179 48 59 68 

180 6 30 36 

181 9 29 36 

182 7 25 31 

183 10 16 22 

184 13 23 29 

185 5 23 32 

186 2 0 0 

187 32 38 49 

188 29 33 40 

189 26 40 49 

190 26 44 49 

191 33 37 39 

192 29 37 39 

193 1 3 4 

194 159 122 127 

195 155 131 138 

196 64 29 40 

197 65 42 48 

198 22 74 91 

29

Numero 

campione 


Matrice campioni non trattati con cloro 

Enterolert-DW 

(MPN/100 ml) 

ISO 7899-2 

(UFC/100 ml) 


(UFC/100 ml) 

1 15 21 23 

2 19 20 25 

3 8 21 22 

4 20 18 27 

5 17 21 27 

6 23 29 35 

7 15 17 18 

8 17 19 23 

9 23 20 24 

10 24 23 25 

11 21 24 29 

12 21 20 26 

13 17 25 29 

14 29 20 23 

15 20 22 29 

16 201 22 25 

17 21 21 25 

18 17 18 23 

19 21 23 33 

20 29 27 30 

21 25 29 32 

22 17 21 22 

23 35 29 32 

24 41 21 25 

25 34 29 31 

26 25 20 22 

27 28 26 30 

28 44 21 25 

29 25 21 23 

30 31 53 54 

31 39 50 51 

32 35 50 51 

33 34 51 52 

34 30 51 52 

35 42 51 54 

36 36 51 54 

37 35 48 49 

38 17 64 65 

39 32 57 58 

40 76 53 55 

41 72 44 44 

42 72 49 53 

43 61 51 57 

44 44 42 51 

45 59 45 50 

46 48 51 70 

47 63 49 63 

48 33 58 65 

30

Numero 

campione 



Enterolert-DW 

(MPN/100 ml) 

ISO 7899-2 

(UFC/100 ml) 


(UFC/100 ml) 

49 23 47 52 

50 28 29 30 

51 23 35 37 

52 30 44 44 

53 26 38 41 

54 28 35 40 

55 34 34 37 

56 47 32 35 

57 35 37 39 

58 19 35 37 

59 33 40 41 

60 41 28 30 

61 42 37 40 

62 52 34 37 

63 45 34 38 

64 34 36 40 

65 49 33 36 

66 33 35 37 

67 21 21 23 

68 39 32 38 

69 44 25 32 

70 32 23 25 

71 21 26 29 

72 19 19 22 

73 19 23 28 

74 18 21 26 

75 19 22 29 

76 23 21 26 

77 17 16 17 

78 23 17 24 

79 25 29 32 

80 33 26 32 

81 30 34 36 

82 38 39 41 

83 32 39 47 

84 35 31 38 

85 34 33 40 

86 47 32 37 

87 21 29 34 

88 37 40 48 

89 51 37 42 

90 41 35 37 

91 32 36 38 

92 32 28 30 

93 10 17 18 

94 31 28 31 

95 36 30 36 

96 38 33 39 

97 118 34 36 

31

Numero 

campione 



Enterolert-DW 

(MPN/100 ml) 

ISO 7899-2 

(UFC/100 ml) 


(UFC/100 ml) 

98 201 29 30 

99 29 30 31 

100 65 31 33 

101 165 35 37 

102 35 26 26 

103 52 20 22 

104 173 37 38 

105 44 38 39 

106 44 36 39 

107 183 36 40 

108 144 37 39 

109 183 31 33 

110 42 19 24 

111 53 14 15 

112 44 18 26 

113 4 11 14 

114 32 15 20 

115 47 15 18 

116 50 13 19 

117 67 12 19 

118 29 18 22 

119 49 21 25 

120 4 3 4 

121 4 4 5 

122 5 6 6 

123 5 4 4 

124 2 3 4 

125 1 2 2 

126 2 4 4 

127 2 4 5 

128 5 4 5 

129 2 3 3 

130 40 39 46 

131 43 31 37 

132 40 27 34 

133 38 32 37 

134 30 28 36 

135 24 31 35 

136 33 29 43 

137 38 36 46 

138 35 39 44 

139 41 31 39 

140 12 10 12 

141 11 8 14 

142 15 15 17 

143 12 14 16 

144 15 9 10 

145 11 15 16 

146 11 9 10 

32

Numero 

campione 



Enterolert-DW 

(MPN/100 ml) 

ISO 7899-2 

(UFC/100 ml) 


(UFC/100 ml) 

147 14 13 15 

148 11 11 13 

149 15 12 13 

150 5 35 42 

151 22 33 40 

152 21 30 36 

153 15 35 40 

154 44 34 39 

155 36 29 35 

156 25 32 37 

157 28 30 33 

158 35 30 34 

159 32 28 32 

160 26 41 45 

161 34 28 32 

162 31 30 35 

163 29 30 32 

164 21 36 39 

165 25 26 31 

166 21 38 39 

167 24 23 28 

168 34 28 30 

169 24 35 38 

170 35 32 42 

171 50 25 35 

172 32 33 40 

173 35 36 44 

174 38 37 41 

175 29 33 41 

176 27 28 35 

177 34 28 35 

178 40 33 41 

179 26 35 45 

180 28 38 42 

181 28 33 38 

182 25 38 41 

183 29 32 36 

184 33 30 30 

185 22 33 39 

186 33 60 61 

187 31 43 51 

188 31 50 55 

189 35 48 52 

190 37 41 46 

191 30 44 48 

192 26 46 47 

193 29 36 40 

194 37 41 46 

195 29 37 42 

33

Numero 

campione 



Enterolert-DW 

(MPN/100 ml) 

ISO 7899-2 

(UFC/100 ml) 


(UFC/100 ml) 

196 31 36 42 

197 27 39 44 

198 30 34 39 

199 22 36 43 

200 37 40 43 

201 43 38 41 

202 36 38 40 

203 35 39 41 

204 15 25 28 

205 17 25 26 

34

ISOTR 13843 Validation of EnterolertDW Quanti-Tray - IDEXX ...

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