E. coli - IDEXX Laboratories

Validazione di Colilert ® -18/Quanti-Tray ®
per l’enumerazione di E. coli e batteri
coliformi in acqua
gennaio 2008
One IDEXX Drive • Westbrook, Maine 04092 USA
idexx.com
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Validazione di Colilert-18/Quanti-Tray
per l’enumerazione di E. coli e batteri coliformi
in acqua
IDEXX LABORATORIES, INC
ONE IDEXX DRIVE
WESTBROOK, MAINE 04092
USA
VERSIONE FINALE CORRETTA 30 gennaio 2008

1 Introduzione
Validazione di Colilert ® -18/Quanti-Tray ® per l’enumerazione
di E. coli e batteri coliformi in acqua
Il metodo Colilert ® -18/Quanti-Tray ® è un test appositamente studiato per
l’enumerazione MPN di E. coli e batteri coliformi in acqua potabile ed altre acque
simili, trattate e non trattate.
Colilert-18 rileva simultaneamente E. coli e coliformi totali in acqua. È basato su
tecnologia DST (Defined Substrate Technology). Il reagente DST è mescolato con
100 ml di campione e incubato come test di presenza/assenza (PA), oppure come
test MPN (Most Probable Number, numero più probabile). Quando i batteri coliformi
metabolizzano il nutriente indicatore ONPG, il campione diventa giallo. Quando l’E.
coli metabolizza un secondo nutriente indicatore, il MUG, il campione diventa
fluorescente sotto illuminazione UV. Colilert-18 consente la rilevazione
contemporanea di questi batteri a 1 cfu/100ml entro 18 ore, in presenza di un
numero di batteri eterotrofi fino a 2 x 10 6 per campione da 100 ml.
Quanti-Tray è stato studiato per la realizzazione di conte batteriche quantitative da
campioni di 100 ml utilizzando reagenti DST. La miscela reagente/campione viene
inserita in una sacca Quanti-Tray, poi chiusa mediante il sigillatore Quanti-Tray
Sealer e messa in incubatrice. La sacca è realizzata in modo da presentare 51
pozzetti di miscela reagente/campione dopo la sigillatura. Il sigillatore è uno
strumento a rulli riscaldati azionato a motore, progettato per sigillare Quanti-Tray.
Viene conteggiato il numero di pozzetti positivi e, con l’ausilio di un’apposita tabella,
viene determinato l’MPN dei batteri coliformi e/o di E. coli.
2 Applicazioni di Colilert ® -18/Quanti-Tray ®
Colilert ® -18/Quanti-Tray ® è stato ideato in primo luogo per l’analisi dell’acqua potabile
e di acque simili. Con questa funzione è largamente approvato in Nord America (Stati
Uniti, Canada e Messico), in Sud America (Brasile, Argentina, Cile e Colombia), in
Europa (Danimarca, Germania, Ungheria, Islanda, Irlanda, Italia, Norvegia, Spagna e
Regno Unito) e in Estremo Oriente (Giappone e Corea). È inoltre approvato per
l’analisi delle acque in bottiglia dalla International Bottled Water Association e di
acqua purificata per uso farmaceutico dalla US Pharmacopeial Convention. Negli
Stati Uniti, inoltre, è stato approvato dall’USEPA per la rilevazione di batteri coliformi
ed E. coli dall’analisi di acque sorgive e sotterranee, e per l’enumerazione di E. coli
dall’analisi di acque ambientali, a scopo ricreativo e di scarico.
3 Identificazione degli organismi target (ISO/TR 13843 sezioni 10.2.1 e 9.2)
Nel metodo Colilert ® -18/Quanti-Tray ® , per batteri coliformi si intendono i batteri che
producono una colorazione gialla mediante l’azione della β-galattosidasi sulla ortonitrofenil-β-D-galattosidasi
(ONPG), mentre per E. coli si intendono i batteri coliformi
che producono, inoltre, una fluorescenza blu sotto illuminazione UV tramite l’azione
della β-glucuronidasi sul 4-metilumbelliferil-β-D-glucuronide (MUG).
3.1 La sfida della coltura pura (ISO/TR 13843 sezione 10.2.1)
Le definizioni delle reazioni per batteri target e non target sono state confermate
sfidando Colilert ® -18/Quanti-Tray ® con colture pure di ceppi di riferimento di E. coli,
1

atteri coliformi e batteri non coliformi gram-negativi presi dalla Raccolta di colture di
tipo americano. Le reazioni tipiche di questi ceppi di riferimento sono riportate nella
Tabella 1. Questi ceppi vengono utilizzati da IDEXX per il normale controllo qualità di
Colilert-18/Quanti-Tray.
Tabella 1 Ceppi di riferimento di E. coli, batteri coliformi e batteri gramnegativi
non target utilizzati per confermare le tipiche reazioni
positive e negative in Colilert ® -18/Quanti-Tray ®
Batterio N. ATCC* Reazione in Colilert-18
Escherichia coli 25922
Colorazione giallo intenso
Forte fluorescenza blu sotto UV
Citrobacter freundii 8090
Colorazione giallo intenso
Nessuna fluorescenza sotto UV
Klebsiella pneumoniae 31488
Colorazione giallo intenso
Nessuna fluorescenza sotto UV
Enterobacter aerogenes 13048
Colorazione giallo intenso
Nessuna fluorescenza sotto UV
Nessuna crescita
Pseudomonas aeruginosa 10145 Nessuna colorazione gialla
Nessuna fluorescenza sotto UV
Nessuna crescita
Aeromonas hydrophila 35654 Nessuna colorazione gialla
Nessuna fluorescenza sotto UV
* Raccolta di colture di tipo americano
3.2 Studi di sensibilità, specificità e selettività (ISO/TR 13843 sezione 9.2)
In termini di metodiche microbiologiche, ISO/TR 13843 fornisce la definizione di
queste caratteristiche di seguito riportata:
Sensibilità – frazione dei positivi totali correttamente assegnata nel conteggio
presuntivo;
Sensibilità – frazione dei negativi totali correttamente assegnata nella conta
presuntiva;
Selettività - rapporto fra il numero di colonie target e il numero totale di colonie nel
volume del campione.
Per Colilert-18/Quanti-Tray, queste caratteristiche sono collegate al numero di
pozzetti positivi per i coliformi o l’E. coli che effettivamente contenevano batteri target
e al numero di pozzetti realmente negativi per i batteri target. La valutazione della
sensibilità, della specificità e della selettività di Colilert-18/Quanti-Tray è stata
ottenuta attraverso l’identificazione degli isolati positivi di β-galattosidasi e βglucuronidasi
dai pozzetti positivi generati utilizzando campioni naturali ottenuti
aggiungendo acque di fiume all’acqua potabile declorinata. Per ottenere campioni di
acqua potabile declorinata mischiata da 1 litro sono state utilizzate tre sorgenti di
acqua di superficie (due fiumi e un serbatoio di acqua di superficie). Dopo
l’incubazione, sono stati selezionati 100 pozzetti gialli, ma non fluorescenti, dai 30
campioni (3 – 5 di ciascuno). Questi ultimi sono stati selezionati in modo da garantire
l’inclusione di tutte le intensità di colore giallo incontrate. Allo stesso modo, sono stati
selezionati 100 pozzetti gialli e fluorescenti per coprire tutte le intensità di
fluorescenza incontrate. Dei 30 campioni, erano disponibili solo 54 pozzetti negativi,
2

due dei quali presentavano una crescita torbida. Le reazioni positive e/o negative alla
β-galattosidasi e alla β-glucuronidasi sono state confermate e gli isolati sono stati
individuati utilizzando pannelli di identificazione miniaturizzati BBL Crystal E/NF
(Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA).
3.2.1 Calcolo dei tassi di falsi negativi, del tasso di falsi positivi, della
sensibilità, della specificità, e della selettività
I dati di identificazione di ciascun parametro sono stati suddivisi in quattro categorie:
a = numero di pozzetti positivi risultati contenere coliformi o E. coli (veri positivi);
b = numero di pozzetti negativi risultati contenere coliformi o E. coli (falsi negativi);
c = numero di pozzetti positivi risultati non contenere coliformi o E. coli (falsi
positivi);
d = numero di pozzetti negativi che presentavano crescita e risultavano non
contenere coliformi o E. coli (veri negativi);
La sensibilità, la specificità, la selettività, il tasso di falsi positivi e i tassi di falsi
negativi per coliformi ed E. coli risultanti dai dati sono stati calcolati nel modo
seguente:
Sensibilità = a / (a+b)
Specificità = d / (c+d)
Selettività = log10 [(a+c) / (a+b+c+d)]
Tasso falsi positivi = c / (a+c)
Tasso falsi negativi = b / (b+d)
Un altro parametro, l’efficienza (E), che indica la frazione di pozzetti correttamente
assegnati, è stato calcolato come E = (a+d) / (a+b+c+d).
3.2.2 Coliformi non E. coli
Da tutti e 100 i pozzetti gialli, ma non fluorescenti, sottocoltivati, sono stati ottenuti
isolati di β-galattosidasi. Non è stata osservata alcuna reazione β-glucuronidasi su
queste piastre. Le reazioni dell’indolo e dell’ossidasi, i profili BBL Crystal E/NF e le
identificazioni di questi isolati sono illustrati nell’Appendice A1. Tutti sono stati
identificati come membri β-galattosidasi positivi e β-glucuronidasi negativi degli
enterobatteri diversi dall’E. coli. In totale sono state recuperate 23 specie di coliformi
(Tabella 2).
3.2.3 E. coli
Da tutti e 100 i pozzetti gialli fluorescenti sottocoltivati, sono stati ottenuti isolati di βglucuronidasi.
Le reazioni dell’indolo e dell’ossidasi, i profili BBL Crystal E/NF e le
identificazioni di questi isolati sono illustrati nell’Appendice A2. Novantanove isolati
sono stati identificati come E. coli. L’isolato restante è stato identificato come
Klebsiella oxytoca. Questo isolato presentava una reazione β-glucuronidasi positiva
nel proprio pannello Crystal E/NF.
3.2.4 Pozzetti negativi
3

Sono stati sottocoltivati quarantaquattro pozzetti negativi, di cui soltanto due
presentavano una crescita. Questi due pozzetti producevano colonie β-galattosidasi
e β-glucuronidasi negative che erano ossidasi positive e indolo negative (Appendice
A3). Entrambe sono state identificate come Shewanella putrefaciens dal sistema
BBL Crystal E/NF. Dai restanti 52 pozzetti non si è avuta alcuna crescita.
Tabella 2 Identificazione di batteri coliformi (numero di isolati) recuperati da
pozzetti coliformi non E. coli positivi di Colilert ® -18/Quanti-Tray ®
Cedecea lapegei (1) Kluyvera ascorbata (12)
Citrobacter amalonaticus (2) Kluyvera ascorbata (3)
Citrobacter amalonaticus (10) Leclercia adecarboxylata (1)
Enterobacter aerogenes Pantoea agglomerans (9)
Enterobacter aerogenes Serratia fonticola (1)
Enterobacter aerogenes Serratia fonticola (3)
Enterobacter aerogenes Serratia fonticola (1)
Enterobacter aerogenes Serratia fonticola (1)
Escherichia vulneris (4) Serratia fonticola (4)
Hafnia alvei (1) Serratia fonticola (1)
Klebsiella oxytoca (4) Serratia fonticola (1)
Klebsiella oxytoca (6)
3.3 Identificazione delle caratteristiche legate alla sensibilità e alla specificità
3.3.1 Batteri coliformi
Nell’ambito del test Colilert-18/Quanti-Tray, i coliformi sono organismi che producono
una colorazione gialla con o senza fluorescenza e i risultati per i parametri calcolati
sono:
Sensibilità = a / (a+b) = 200 / (200+0) = 1
Specificità = d / (c+d) = 2 / (0+2) = 1
Selettività = log10 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log10 [(200+0) / (200+0+0+2)] = -0,004
Tasso falsi positivi = c / (a+c) = 0 / (200+0) = 0
Tasso falsi negativi = b / (b+d) = 0 / (0+2) = 0
Efficienza (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (200+2) / (200+0+0+2) = 1
3.2.3 E. coli
Nell’ambito del test Colilert-18/Quanti-Tray, gli E. coli sono organismi che producono
una colorazione gialla con o senza fluorescenza e i risultati per i parametri calcolati
sono:
Sensibilità = a / (a+b) = 99 / (99+0) = 1
Specificità = d / (c+d) = 102 / (1+102) = 0,99
Selettività = log10 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log10 [(99+1) / (99+0+1+102)] = -0,305
Tasso falsi positivi = c / (a+c) = 1 / (99+1) = 0,01
Tasso falsi negativi = b / (b+d) = 0 / (0+102) = 0
Efficienza (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (99+102) / (99+0+1+102) = 0,995
I risultati delle analisi dei dati mostrano che per i batteri coliformi il metodo Colilert-
18/Quanti-Tray è altamente sensibile e specifico, con un tasso zero di falsi positivi e
4

falsi negativi. Il metodo, inoltre, è molto selettivo con un valore di
-004, che risulta molto migliore del valore guida di -1 indicato da ISO/TR 13843 per i
metodi per la conta delle colonie. Il metodo si può dire molto efficace per i batteri
coliformi, con un valore di efficacia pari a 1. I dati di identificazione mostrano che
Colilert-18/Quanti-Tray recupera un’ampia gamma di batteri coliformi.
Anche per l’E. coli, il test Colilert-18/Quanti-Tray è molto sensibile e specifico. La
selettività (-0,305) è inferiore a quella dei batteri coliformi, come ci si aspetterebbe da
un sistema di test doppio in cui l’E. coli è un sottoinsieme del gruppo dei batteri
coliformi. Il valore è migliore anche rispetto al valore guida di ISO/TR 13843. Il
metodo è molto efficace (E = 0,995) per la rilevazione di E. coli.
4 Incertezza della conta (ISO 13843 sezione 10.2.1 e Allegato B)
La ripetibilità e la riproducibilità sono due stime dell’affidabilità che è possibile
ottenere con un metodo analitico. Utilizzando adeguati campioni naturali, possono
rappresentare una valutazione dell’intero metodo o dell’incertezza della conta
insieme alla lettura dei risultati di un metodo. Il risultato prodotto da qualsiasi metodo
dipende dalla facilità con cui gli analisti possono eseguire una conta di colonie o di
reazioni MPN positive. Questa sarà influenzata dalle caratteristiche della morfologia
delle colonie di organismi target e non target su un agar di enumerazione, oppure
dalla chiarezza delle reazioni positive e negative nei test MPN a base di terreno di
coltura. Di conseguenza, le valutazioni dell’incertezza della conta possono dare
un’indicazione di qualsiasi potenziale problema che potrebbe verificarsi a seguito
dell’ampio utilizzo di un metodo.
La ripetibilità (r) e la riproducibilità (R) vengono definite come segue:
Ripetibilità prossimità di accordo fra i risultati di misurazioni successive della
stessa misura e svolte nelle medesime condizioni
Riproducibilità prossimità di accordo fra i risultati di misurazioni sulla stessa
misura e svolte in condizioni differenti
Nel caso della conta di colonie microbiologiche su piastra agar o reazioni positive in
un test MPN, le medesime o differenti “condizioni” sono rappresentate dall’analista
che esegue la conta. Pertanto, in questo contesto, la ripetibilità è l’accordo fra le
conte ottenute con conteggi ripetuti da parte dello stesso analista, mentre la
riproducibilità è l’accordo fra le conte ottenuto con conteggi ripetuti da parte di due o
più analisti. La valutazione della riproducibilità è generalmente più informativa della
valutazione della ripetibilità.
L’Allegato B di ISO/TR 13843 fornisce delle linee guida sulla valutazione della
ripetibilità e della riproducibilità del conteggio utilizzando deviazioni standard relative
(DSR) di conte ripetute. Inoltre, vi è la raccomandazione che, quando si utilizzano
colture pure, le DSR siano idealmente < 0,02 (vale a dire non oltre la deviazione del
2%). Studi sull’incertezza dei conteggi sono stati condotti da analisti di IDEXX e i dati
sono illustrati nell’Appendice B. Il conteggio è stato eseguito in modo che ciascun
analista non fosse a conoscenza delle conte degli altri analisti e gli MPN risultanti
sono stati registrati come numeri interi. Le DSR calcolate dagli MPN di Colilert-
18/Quanti-Tray, inoculati con coliforme tipico (Klebsiella pneumoniae ATCC 33186)
ed E. coli (ATCC 25922) erano:
Klebsiella pneumoniae Ripetibilità = 0,022
Riproducibilità = 0,020
5

Escherichia coli Ripetibilità = 0,000
Riproducibilità = 0,007
I valori del coliforme tipico sono dell’ordine del valore guida di < 0,02 (ISO/TR 13843
sezione B1), mentre quelli per E. coli sono molto al di sotto del valore guida, il che
indica come sia possibile ottenere un conteggio MPN affidabile per Klebsiella
pneumoniae ed E. coli con Colilert-18/Quanti-Tray.
5 Robustezza – sensibilità al tempo (ISO/TR 13843 sezioni 10.2.2 e B.4)
Due aspetti relativi alla robustezza riguardano Colilert ® -18/Quanti-Tray ® . Si tratta del
periodo di incubazione raccomandato di 18-22 ore e della durata del prodotto fino a
15 mesi con immagazzinamento a 4-25°C per il mezzo di Colilert-18. Nell’Appendice
C sono illustrate le conte replicate delle analisi delle sospensioni di bassi numeri di
colture di riferimento di E. coli, Klebsiella pneumoniae e Citrobacter freundii dopo
un’incubazione di 18 e 22 ore per lo stesso lotto di Colilert-18 immagazzinato per un
periodo fino a 541 giorni a 25°C.
5.1 Robustezza dei tempi di incubazione
Si sono avuti 48 risultati accoppiati per le conte dopo incubazione di 18 e 22 ore. Per
E. coli, tutte e 48 le conte accoppiate erano le stesse dopo i due tempi di
incubazione, mentre per Klebsiella pneumoniae 47 conte (il 98%) erano le stesse e
la conta accoppiata rimanente mostrava un aumento di un solo pozzetto positivo
dopo incubazione di 22 ore. Ad ogni modo, per Citrobacter freundii vi erano conte
aumentate dopo incubazione di 22 ore rispetto all’incubazione di 18 ore di 13
campioni (il 27%). Tutte queste conte più elevate, tranne una, erano aumenti di solo
uno o due pozzetti positivi. Questo ceppo di Citrobacter sembra mostrare un tasso di
crescita relativamente più basso o una cinetica degli enzimi più debole rispetto agli
altri batteri testati.
I dati indicano che per E. coli e batteri coliformi robusti, quali Klebsiella pneumoniae,
il periodo di incubazione raccomandato di 18-22 ore è robusto, ma che per alcuni
batteri coliformi a crescita più lenta o produttori di enzimi deboli, può esserci un
aumento delle conte dopo un’incubazione di 22 ore rispetto a un’incubazione di 18
ore.
L’aumento delle conte in un periodo di incubazione stabilito (per es. 18-24 ore per i
tipici metodi a filtrazione di membrana quali ISO 9308-1) è un fenomeno noto,
soprattutto con i coliformi ambientali. Tuttavia, per considerazioni pratiche e
operative, le conte dopo un’incubazione di 18 ore sono considerate accettabili,
purché l’aumento delle conte dopo un’incubazione prolungata non sia eccessivo.
5.3 Robustezza dell’immagazzinamento di Colilert ® -18
Il mezzo di Colilert ® -18 ha una durata dichiarata di 12 mesi, immagazzinato a 4-
25°C. I dati dei tre batteri testati con lo stesso lotto di mezzo immagazzinato a 25°C
non mostrano alcuna differenza di prestazioni con un immagazzinamento fino a 541
giorni, ben oltre l’anno previsto. Si è scelta una temperatura di immagazzinamento
più elevata in modo da mettere alla prova la stabilità del mezzo di Colilert-18 più di
quanto non lo fosse con un immagazzinamento a temperature di refrigerazione.
6 Limite di esercizio superiore (ISO/TR 13843 sezioni 10.2.4 e 6.3.3)
6

Il test Colilert ® -18/Quanti-Tray ® è un metodo MPN con una gamma di conteggio
arbitraria da 0 a 201, fissata dal numero di pozzetti della sacca Quanti-Tray. In base
a ISO/TR 13843 sezione 6.3.3, per ragioni pratiche e statistiche, non è possibile
stabilire alcun limite superiore per i metodi MPN “poiché la precisione non dipende
semplicemente dal numero di particelle introdotte nel set di rilevazione”.
7 Precisione (ISO/TR 13843 sezioni 10.2.5 e 9.5.5)
La precisione di un metodo MPN viene descritta dagli intervalli di confidenza del 95%
calcolati per ciascun valore MPN (ISO/TR 13843 sezione 9.5.5). Gli intervalli di
confidenza per le conte di Colilert ® -18/Quanti-Tray ® , calcolati utilizzando il
programma messo a disposizione on-line dal Bacteriological Analytical Manual
(BAM) della US Food and Drug Administration (FDA)
(http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html#excl), sono riportati nell’Appendice D.
Una ripetibilità teorica per ciascun MPN può derivare dall’MPN e dai suoi intervalli di
confidenza. Nell’Appendice D, inoltre, sono illustrati i valori di incertezza relativi per
ciascun MPN (log10SD, calcolato dai valori degli intervalli di confidenza MPN del
95%) e la ripetibilità (incertezza standard relativa) come coefficienti di variazione
(CV%). Questi valori Poisson possono essere utilizzati come valori minimi di
precisione a cui è possibile combinare tutti i dati pertinenti posseduti da un
laboratorio (per es. alla variazione della decantazione del volume del test o
dell’incertezza del conteggio) allo scopo di ottenere una stima complessiva di
ripetibilità per ciascun MPN.
8 Bibliografia
8.1 Standard ISO
ISO 9308-1:2000 Qualità dell’acqua – Rilevazione ed enumerazione di Escherichia
coli e batteri coliformi – Parte 1: Metodo di filtrazione a membrana. Ginevra:
International Organisation for Standardization.
ISO/TR 13843:2000(E) Qualità dell’acqua – Linee guida sulla validazione dei metodi
microbiologici. Ginevra: International Organisation for Standardization.
7

Appendice A Dati degli studi di sensibilità, specificità e selettività (v. Sezione
3.2)
Appendice A1 Identificazione di isolati da pozzetti gialli ma non fluorescenti di
Colilert ® -18/Quanti-Tray ®
Rif. isolati Ossidasi Indolo Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza
Y1 - + 5765637153 Enterobacter sakazakii 0,5861
Y2 - - 4764417153 Pantoea agglomerans 0,7217
Y3 - + 4724477151 Kluyvera cryocrescens 0,9829
Y4 - - 7764477153 Enterobacter cloacae 0,9962
Y5 - + 4764477151 Kluyvera cryocrescens 0,6287
Y6 - - 4724467153 Pantoea agglomerans 0,7127
Y7 - + 5764475555 Klebsiella oxytoca 0,9825
Y8 - - 4760427053 Pantoea agglomerans 0,9481
Y9 - - 5764637051 Kluyvera ascorbata 0,9264
Y10 - - 5766477152 Enterobacter cloacae 0,9886
Y11 - - 7424676151 Citrobacter freundii 0,9335
Y12 - - 7764672153 Enterobacter cloacae 0,8268
Y13 - - 7764476157 Enterobacter sakazakii 0,6102
Y14 - + 5764637151 Kluyvera ascorbata 0,9925
Y15 - + 5765677151 Kluyvera ascorbata 0,8702
Y16 - - 4764627151 Escherichia vulneris 0,5764
Y17 - - 7734457051 Pantoea agglomerans 0,9932
Y18 - + 5765477157 Klebsiella oxytoca 0,8524
Y19 - - 7766276157 Serratia liquefaciens 0,5712
Y20 - - 5764476153 Enterobacter cloacae 0,8943
Y21 - - 3764217153 Cedecea lapagei 0,9835
Y22 - - 5764427151 Pantoea agglomerans 0,7613
Y23 - + 7764637157 Enterobacter sakazakii 0,9734
Y24 - + 5764627452 Leclercia adecarboxylata 0,999
Y25 - - 7764627555 Klebsiella pneumoniae 0,9154
Y26 - - 0764437152 Pantoea agglomerans 0,8776
Y27 - - 7765275557 Serratia rubidaea 0,9942
Y28 - - 4760056153 Enterobacter asburiae 0,9504
Y29 - - 5765276157 Serratia liquefaciens 0,5545
Y30 - + 5764617151 Kluyvera ascorbata 0,982
Y31 - + 5764677557 Klebsiella oxytoca 0,9555
Y32 - - 7564677151 Enterobacter cloacae 0,9987
Y33 - - 4560477153 Enterobacter cloacae 0,9961
Y34 - - 5464454151 Citrobacter freundii 0,9998
Y35 - - 5464654155 Citrobacter freundii 0,9994
Y36 - - 5764427151 Pantoea agglomerans 0,7613
Y37 - - 5664456055 Citrobacter freundii 0,9973
Y38 - - 4764475555 Klebsiella pneumoniae 0,9241
Y39 - + 5760467555 Klebsiella pneumoniae 0,9413
Y40 - - 4764627051 Escherichia vulneris 0,9475
Y41 - - 5764677150 Enterobacter cloacae 0,8043
Y42 - - 4760473151 Enterobacter cloacae 0,9673
Y43 - + 5764637151 Kluyvera ascorbata 0,9925
8

Y44 - - 5766476156 Enterobacter sakazakii 0,8111
Y45 - - 7765627157 Enterobacter sakazakii 0,9416
Y46 - + 5774677153 Kluyvera ascorbata 0,9439
Y47 - - 7775677555 Klebsiella pneumoniae 0,9853
Y48 - - 7765627157 Enterobacter sakazakii 0,9416
Y49 - - 5464477553 Enterobacter cloacae 0,9999
Y50 - - 7775637153 Enterobacter cancerogenus 0,5033
Y51 - + 4774437151 Kluyvera cryocrescens 0,8422
Y52 - - 5764677557 Enterobacter aerogenes 0,8747
Y53 - - 5464457051 Citrobacter freundii 0,9962
Y54 - - 7764272153 Enterobacter cloacae 0,8189
Y55 - - 5766477152 Enterobacter cloacae 0,9886
Y56 - - 5764476152 Enterobacter cloacae 0,9048
Y57 - - 5764256057 Serratia plymuthica 0,8677
Y58 - + 5764676557 Serratia odorifera 0,7963
Y59 - + 5420677151 Citrobacter amalonaticus 0,8735
Y60 - - 5766476152 Enterobacter cloacae 0,6927
Y61 - - 5470473153 Enterobacter cloacae 0,9996
Y62 - + 5774637151 Kluyvera ascorbata 0,9864
Y63 - + 5764676153 Kluyvera ascorbata 0,9308
Y64 - - 4764476057 Enterobacter sakazakii 0,7089
Y65 - - 5766476153 Enterobacter cloacae 0,6618
Y66 - - 7765671151 Enterobacter cloacae 0,937
Y67 - - 7764477153 Enterobacter cloacae 0,9962
Y68 - - 5764276057 Serratia plymuthica 0,8302
Y69 - - 4675477153 Enterobacter cloacae 0,9921
Y70 - - 5765276057 Serratia plymuthica 0,6877
Y71 - - 5624657151 Citrobacter freundii 0,996
Y72 - - 5725654447 Serratia fonticola 0,9933
Y73 - - 5766477152 Enterobacter cloacae 0,9886
Y74 - - 5764477555 Klebsiella pneumoniae 0,9919
Y75 - - 5724627052 Escherichia vulneris 0,9987
Y76 - - 5766476153 Enterobacter cloacae 0,6618
Y77 - + 5420677151 Citrobacter amalonaticus 0,8735
Y78 - - 7767276157 Serratia liquefaciens 0,6819
Y79 - - 5420444051 Citrobacter freundii 0,9799
Y80 - - 7764276557 Serratia marcescens 0,9547
Y81 - - 5766477153 Enterobacter cloacae 0,9872
Y82 - - 5423614153 Hafnia alvei 0,9847
Y83 - + 5764627151 Kluyvera ascorbata 0,9942
Y84 - + 5765677557 Klebsiella oxytoca 0,9715
Y85 - - 5765476553 Enterobacter cloacae 0,9226
Y86 - - 5767476152 Enterobacter cloacae 0,7434
Y87 - + 5764637051 Kluyvera ascorbata 0,9876
Y88 - - 5764276057 Serratia plymuthica 0,8302
Y89 - + 5664677151 Kluyvera ascorbata 0,9349
Y90 - - 4464654141 Citrobacter freundii 0,999
Y91 - - 5764627051 Escherichia vulneris 0,6454
Y92 - - 5764455555 Klebsiella pneumoniae 0,9504
Y93 - - 5765647151 Pantoea agglomerans 0,6856
Y94 - - 7765256157 Serratia spp, 0,9846
9

Y95 - - 5765477153 Enterobacter cloacae 0,9957
Y96 - + 5464654151 Citrobacter freundii 0,9771
Y97 - + 5765637151 Kluyvera ascorbata 0,8306
Y98 - - 5764427151 Pantoea agglomerans 0,7613
Y99 - - 5764077153 Enterobacter cloacae 0,9948
Y100 - - 5420656050 Citrobacter freundii 0,994
10

Appendice A2 Identificazione di isolati da pozzetti gialli e fluorescenti di
Colilert ® -18/Quanti-Tray ®
Rif. isolati Ossidasi Indolo Profilo Crystal E/NF Identificazione Confidenza
F1 - + 5464444171 Escherichia coli 0.9998
F2 - + 5461444171 Escherichia coli 0,9737
F3 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F4 - + 4464444171 Escherichia coli 0,9813
F5 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991
F6 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F7 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F8 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F9 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F10 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F11 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F12 - + 4464444171 Escherichia coli 0,9813
F13 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F14 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F15 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F16 - + 5425444571 Escherichia coli 0,9679
F17 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F18 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F19 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F20 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F21 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F22 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F23 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F24 - + 5465444161 Escherichia coli 0,9976
F25 - + 5465444161 Escherichia coli 0,9976
F26 - + 5464044171 Escherichia coli 0,999
F27 - + 5465446071 Escherichia coli 0,9945
F28 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F29 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F30 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F31 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F32 - + 5425444571 Escherichia coli 0,9679
F33 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F34 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F35 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F36 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F37 - + 5464044171 Escherichia coli 0,999
F38 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F39 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F40 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991
F41 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F42 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F43 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F44 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F45 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F46 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
11

F47 - + 5665444171 Escherichia coli 0,9962
F48 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F49 - + 5465404171 Escherichia coli 0,9314
F50 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F51 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991
F52 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F53 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F54 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F55 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F56 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F57 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F58 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F59 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F60 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F61 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F62 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F63 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F64 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F65 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F66 - + 5665444171 Escherichia coli 0,9962
F67 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F68 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F69 - + 5435444171 Escherichia coli 0,9803
F70 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F71 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F72 - + 4464444171 Escherichia coli 0,9813
F73 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F74 - + 5724444571 Escherichia coli 0,9999
F75 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991
F76 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F77 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F78 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F79 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F80 - - 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F81 - + 5424444061 Escherichia coli 0,8035
F82 - + 5464044171 Escherichia coli 0,999
F83 - + 5465446071 Escherichia coli 0,9945
F84 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F85 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F86 - + 5564044171 Escherichia coli 0,9911
F87 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F88 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F89 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F90 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F91 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F92 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F93 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F94 - + 5420444571 Escherichia coli 0,9983
F95 - + 5425444571 Escherichia coli 0,9679
F96 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F97 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
12

F98 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F99 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991
F100 - + 5765475577 Klebsiella oxytoca 0,7486
13

Appendice A3 Identificazione di isolati da pozzetti negativi di Colilert ® -
18/Quanti-Tray ®
Rif.
isolati
β-Gal β-Gal Ossidas
i
Profilo Crystal
Indolo
E/NF
Identificazione Confidenza
N1 NESSUNA CRESCITA
N2 NESSUNA CRESCITA
N3 NESSUNA CRESCITA
N4 - - + - 3103310212 Shewanella putrefaciens 0,9994
N5 NESSUNA CRESCITA
N6 NESSUNA CRESCITA
N7 NESSUNA CRESCITA
N8 NESSUNA CRESCITA
N9 NESSUNA CRESCITA
N10 NESSUNA CRESCITA
N11 NESSUNA CRESCITA
N12 NESSUNA CRESCITA
N13 NESSUNA CRESCITA
N14 NESSUNA CRESCITA
N15 NESSUNA CRESCITA
N16 NESSUNA CRESCITA
N17 - - + - 3103310212 Shewanella putrefaciens 0,9994
N18 NESSUNA CRESCITA
N19 NESSUNA CRESCITA
N20 NESSUNA CRESCITA
N21 NESSUNA CRESCITA
N22 NESSUNA CRESCITA
N23 NESSUNA CRESCITA
N24 NESSUNA CRESCITA
N25 NESSUNA CRESCITA
N26 NESSUNA CRESCITA
N27 NESSUNA CRESCITA
N28 NESSUNA CRESCITA
N29 NESSUNA CRESCITA
N30 NESSUNA CRESCITA
N31 NESSUNA CRESCITA
N32 NESSUNA CRESCITA
N33 NESSUNA CRESCITA
N34 NESSUNA CRESCITA
N35 NESSUNA CRESCITA
N36 NESSUNA CRESCITA
N37 NESSUNA CRESCITA
N38 NESSUNA CRESCITA
N39 NESSUNA CRESCITA
N40 NESSUNA CRESCITA
N41 NESSUNA CRESCITA
N41 NESSUNA CRESCITA
N43 NESSUNA CRESCITA
N44 NESSUNA CRESCITA
N45 NESSUNA CRESCITA
N46 NESSUNA CRESCITA
14

N47 NESSUNA CRESCITA
N48 NESSUNA CRESCITA
N49 NESSUNA CRESCITA
N50 NESSUNA CRESCITA
N51 NESSUNA CRESCITA
N52 NESSUNA CRESCITA
N53 NESSUNA CRESCITA
N54 NESSUNA CRESCITA
15

Appendice C Conte replicate da sospensioni di E. coli, Klebsiella
pneumoniae e Citrobacter freundii di Colilert ® -18/Quanti-Tray ®
dopo un’incubazione di 18 e 22 ore utilizzando Colilert-18
immagazzinato a 25°C per un massimo di 541 giorni (v. Sezione
5)
Post- Escherichia coli
Numero di pozzetti positivi
Klebsiella pneumoniae Citrobacter freundii
produzione
%
%
%
giornaliera 18 h 22 h cambia 18 h 22 h cambia 18 h 22 h cambia
mento
mento
mento
8 2 2 0 12 12 0 11 11 0
4 4 0 11 11 0 14 14 0
7 7 0 15 15 0 16 16 0
15 9 9 0 9 9 0 2 3 + 50 %
16 16 0 19 19 0 5 5 0
8 8 0 13 13 0 7 7 0
24 14 14 0 14 14 0 14 14 0
9 9 0 12 12 0 16 16 0
10 10 0 16 16 0 18 18 0
30 13 13 0 18 18 0 18 18 0
17 17 0 16 16 0 18 18 0
11 11 0 13 13 0 8 8 0
36 8 8 0 18 18 0 16 16 0
13 13 0 13 13 0 15 15 0
14 14 0 17 17 0 16 16 0
44 8 8 0 24 24 0 11 12 + 9 %
5 5 0 14 14 0 16 18 + 13 %
9 9 0 19 19 0 10 11 + 10 %
56 13 13 0 10 10 0 6 7 + 17 %
4 4 0 16 16 0 7 14 + 100 %
4 4 0 14 14 0 11 11 0
84 10 10 0 14 14 0 11 11 0
8 8 0 16 16 0 8 8 0
8 8 0 19 19 0 12 12 0
111 9 9 0 20 20 0 20 20 0
5 5 0 12 12 0 17 17 0
21 21 0 12 12 0 17 17 0
138 3 3 0 14 14 0 8 9 + 13 %
2 2 0 15 15 0 10 10 0
9 9 0 12 12 0 13 13 0
175 7 7 0 15 16 + 7 % 16 16 0
11 11 0 20 20 0 20 21 + 5 %
12 12 0 22 22 0 30 30 0
205 10 10 0 17 17 0 18 18 0
8 8 0 20 20 0 18 18 0
14 14 0 18 18 0 22 22 0
269 8 8 0 13 13 0 14 14 0
10 10 0 26 26 0 17 17 0
10 10 0 19 19 0 14 14 0
319 13 13 0 15 15 0 4 5 + 25 %
18 18 0 17 17 0 13 15 + 15 %
13 13 0 11 11 0 13 14 + 8 %
367 2 2 0 12 12 0 17 17 0
18

11
10
541 7
10
9
11
10
7
10
9
0
0
0
0
0
19
21
20
13
17
16
21
20
13
17
16
0
0
0
0
0
20
21
11
11
8
20
21
11
12
9
0
0
0
+ 9 %
+ 13 %

Appendice D Intervalli di confidenza del novantacinque per cento e
ripetibilità teoriche per ogni valore MPN per Colilert ® -18/Quanti-
Tray ® a 51 pozzetti (v. Sezione 7)
N. di pozzetti
con reazione
positiva
MPN per
campione da
100 ml
Intervalli di
confidenza del 95%
Inferiore Superiore
20
Ripetibilità teorica
Deviazione
standard
ripetibilità
Log10SD
Incertezza
standard
relativa
CV%
0

36 62,4 44,6 88,8 0,0770 17,7
37 65,9 47,2 93,7 0,0765 17,6
38 69,7 50,0 99,0 0,0761 17,5
39 73,8 53,1 104,8 0,0758 17,4
40 78,2 56,4 111,2 0,0756 17,4
41 83,1 59,9 118,3 0,0756 17,4
42 88,5 63,9 126,2 0,0757 17,4
43 94,5 68,2 135,4 0,0761 17,5
44 101,3 73,1 146,0 0,0768 17,7
45 109,1 78,6 158,7 0,0778 17,9
46 118,4 85,0 174,5 0,0794 18,3
47 129,8 92,7 195,0 0,0819 18,9
48 144,5 102,3 224,1 0,0859 19,8
49 165,2 115,2 272,2 0,0929 21,4
50 200,5 135,8 387,6 0,1094 25,2
51 > 200,5 146,1 infiniti - -
21