Liposomi cationici come sistemi di veicolazione di farmaci

Giovanna Mancini
Liposomi cationici come sistemi di veicolazione di farmaci
CNR – Istituto di Metodologie Chimiche
Nanotecnologie e Salute
ISS - 10-11 maggio 2012

Liposomi cationici
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
lipide cationico
lipide neutro
+
H3N O
+
N O
Alternativa ai vettori virali in terapia genica
Selettività per alcuni tessuti nella veicolazione di farmaci
endotelio sistema vascolare dei tumori, fegato, polmoni
CNR – Istituto di Metodologie Chimiche
O
O -
P
O
O
H O
O
O
O
DOTMA
DOPE
P. L. Felgner, T. R. Gadek, M. Holm, R. Roman, H. W. Chan, M.
Wenz, J. P. Northrop, G. M. Ringold, M. Danielsen Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 1987, 84, 7413

Liposomi cationici e anfifili gemini
H 3 C
+
N
+
N
(CH 2 ) 14
O
H OCH 3
SS
O -
P
O
H
O
OCH3 +
N
H O
H 3 C
O
O
(CH 2 ) 14
O
H 3 C
+
N
(CH 2 ) 14
DMPC
H OCH 3
meso
OCH3 +
N
H 3 C
(CH 2 ) 14
CNR – Istituto di Metodologie Chimiche
H
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+

Liposomi cationici e anfifili gemini
H 3 C
+
N
+
N
(CH 2 ) 14
H OCH 3
O
H
SS
O -
P
O
OCH3 +
N
O
H 3 C
H O
(CH 2 ) 14
O
O
O
H 3 C
+
N
(CH 2 ) 14
H OCH 3
DMPC
meso
OCH3 +
N
H 3 C
(CH 2 ) 14
CNR – Istituto di Metodologie Chimiche
H
R
NH N
N
R
R
HN
R=
R
OH
m-THPC
R
+
+N H N
N
R
R
H N
+
+
R
+
+
+ +
+
+
+
+
+

Liposomi cationici e anfifili gemini
Caratterizzazione chimico fisica e valutazione biologica
DMPC/gemini
5:5
+/- = 2
Complessazione DNA: meso > SS
Compattamento DNA: meso > SS
Tossicità: SS > meso
Trasfezione
(Cos-7, fibroblasti umani, LA7) meso > SS
J. Med. Chem. 2005, 48, 5378
CNR – Istituto di Metodologie Chimiche
R
+
+
+ +
R
+
N H N
N H N
+
R
+
R
+
+
+
+
+
+
DMPC/gemini
6:4
SS
meso
Potenziale di superficie: SS > meso
Intorno del farmaco: SS ≠ meso
Up take cellulare (LN229, C6) meso > SS
Distribuzione intracellulare SS ≠ meso
Mol. Pharm. 2010, 7, 130

Liposomi cationici: interazione con le cellule
Meccanismi internalizzazione
macropinocytosis
Chlorpromazine
clathrinassociated
endocytosis
non coated
invagination
Bafilomycin A1
lipid rafts
caveolae
Filipine
Inhibitors:
Chlorpromazine
Filipine
Bafilomycin A1

Liposomi cationici: interazione con le cellule
Meccanismi internalizzazione
[m-THPC] = 5x10-7 M,
[lipidi totali]=2.5x10 -5 M (gemini 40%)
LN229
Uptake of m-
THPC
DMPC/S
S
DMPC/Mes
o
Meso / clatrina
SS / caveolae

Liposomi cationici: interazione con modelli di membrana
Modelli
DMPC
DPPG
+
+
CNR – Istituto di Metodologie Chimiche
DMPC/gemini
5:5
+/- = 2
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
DMPC/gemini
6/4
?
?

Liposomi cationici: interazione con modelli di membrana
Calorimetria a Scansione Differenziale
Modello
O
O
O
P O -
O
+
N
O
H
O
O
DMPC
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
DMPC/SS 6:4
DMPC/meso 6:4

Liposomi cationici: interazione con modelli di membrana
Calorimetria a Scansione Differenziale
--
--
HO
O
O
Modello
HO
O
P O- Na +
O
O
--
H
O
--
-- --
--
O
--
--
--
DPPG
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
DMPC/SS 6:4
--
--
--
DMPC/meso 6:4

Lipoplessi: interazione con modelli di membrana
Calorimetria a Scansione Differenziale
Modello
O
O
O
O
+
N
P O -
O
H
O
O
DMPC
+
DMPC/SS 5:5
DMPC/meso 5:5

Lipoplessi: interazione con modelli di membrana
Calorimetria a Scansione Differenziale
--
--
HO
O
O
Modello
HO
O
P O- Na +
O
O
--
H
O
--
-- --
--
O
--
--
--
DPPG
+
DMPC/SS 5:5
DMPC/meso 5:5

Conclusioni
La comprensione dei processi molecolari alla base delle
caratteristiche biologiche delle nanoparticelle e’
indispensabile per una progettazone razionale di sistemi
specifici ed efficienti
CNR – Istituto di Metodologie Chimiche

CNR – Istituto di Metodologie Chimiche, Roma
Cecilia Bombelli
Luisa Giansanti
Universita’ della Tuscia, Viterbo
Stefano Borocci
Istituto Superiore di Sanita’, Roma
Giuseppe Arancia
Giuseppina Bozzuto
Marisa Colone
Agnese Molinari
Annarita Stringaro
Laura Toccacieli

Gemini
meso
5.3 Å 74.0 º 6.0 Å 176.7 º
CNR – Istituto di Metodologie Chimiche
SS
N N O C C O N N O C C O
Langmuir 2006, 22, 9333

CNR – Istituto di Metodologie Chimiche
nude pDNA
pDNA in DMPC
SS
meso

Liposomi cationici per la trasfezione del DNA
Formulazione
H 3 C
+
N
Caratterizzazione chimico-fisica
Elettroforesi, dicroismo circolare (CD)
Valutazione biologica
Tossicità
(CH 2 ) 14
H
H OCH 3
OCH3 +
N
H 3 C
(CH 2 ) 14
+
N
Efficienza di trasfezione rispetto ad un prodotto commerciale
CNR – Istituto di Metodologie Chimiche
O
O -
P
O
O
H O
DMPC
O
O
O
+/- = 2
[DMPC] / [gem] = 1
tampone HEPES
gem = SS, meso
pDNA
d=100 nm
pDNA (GFP)
C. Bombelli, F. Faggioli, P. Luciani, G. Mancini, M. G. Sacco J. Med. Chem. 2005, 48, 5378

Liposomi cationici per la trasfezione del DNA
Caratterizzazione chimico-fisica
Complessazione
Compattamento
B-DNA
elettroforesi,
DNA = 500 ng
1 h a 60 V su gel di agarosio 1%
ψ-DNA
B-DNA
CNR – Istituto di Metodologie Chimiche
ψ-DNA
N.J. Zuidam, Y. Barenholz, A. Minsky
FEBS 1999, 457, 4819
1 kb M
meso
meso SS >
SS
pDNA

Liposomi cationici per la trasfezione del DNA
Caratterizzazione chimico-fisica
Complessazione
Compattamento
B-DNA
elettroforesi,
DNA = 500 ng
1 h a 60 V su gel di agarosio 1%
ψ-DNA
B-DNA
CNR – Istituto di Metodologie Chimiche
1 kb M
meso
meso SS >
pDNA
pDNA in DMPC
SS
meso
SS
pDNA
meso SS
>

Liposomi cationici per la trasfezione del DNA
Valutazione biologica
Tossicità
Efficienza di trasfezione
Cellule GFP-positive
[DMPC] = 8.5 μM,
[CA] = 8.5 μM
[pDNA] = 8.5 μM
meso > fugene > SS LA7
CNR – Istituto di Metodologie Chimiche
Valutazione vitalità con il metodo di esclusione del Trypan blue
[gem] = 425 μM 0% vitalità
meso SS >
[gem] = 213 – 21.3 μM
[gem] = 8.5 μM 100% vitalità
Cos-7
fibroblasti
Fugene
meso/DMPC

Liposomi cationici per la trasfezione del DNA
Correlazione
H 3 C
H 3 C
+
N
(CH 2 ) 14
+
N
(CH 2 ) 14
H
H OCH 3
meso
H
H OCH 3
SS
OCH3 +
N
H 3 C
OCH3 +
N
H 3 C
(CH 2 ) 14
(CH 2 ) 14
CNR – Istituto di Metodologie Chimiche
complessazione : ++++
grado di ψ−phase : ++++
complessazione : +++
grado di ψ-phase : +++
trasfezione buona
trasfezione modesta

Liposomi cationici e anfifili gemini
H 3 C
+
N
(CH 2 ) 14
H
H OCH 3
SS
OCH3 +
N
H 3 C
(CH 2 ) 14
J. Med. Chem. 2005, 48, 5378
H 3 C
+
N
(CH 2 ) 14
COS-7
LA7
fibroblasti umani
H OCH 3
meso
OCH3 +
N
H 3 C
(CH 2 ) 14
CNR – Istituto di Metodologie Chimiche
H
+
N
liposomi cationici
O
O -
P
O
R
O
H O
O
NH N
N
R
R
HN
O
O
R=
R
m-THPC
DMPC
OH
COLO206
C6
U118
DBTRG
LN229
J. Med. Chem. 2005, 48, 4882; Int. J. Cancer 2007, 121, 1149