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g a pablo cirrone
tesine del corso di
biologia e genetica
corso integrato di biologia e
genetica, scuola di medicina e
chirurgia, università di catania
Anno Accademico 20012 - 2013

Tesine del corso di Biologia e Genetica,
Corso integrato di Biologia e Genetica, Scuola di Medicina e Chirurgia,
Università di Catania
c○ Anno Accademico 20012 - 2013.
website:
http://pablocirrone.wikispaces.com/
e-mail:
pablo.cirrone@lns.infn.it

I N D I C E
1 procarioti, eucarioti e virus 3
1.1 Introduzione 3
1.2 I procarioti 4
1.2.1 Gli Archaea 4
1.2.2 Bacteria 5
1.2.3 Caratteristiche dei Procarioti 6
1.3 Gli Eucarioti 8
1.3.1 Strutture principali di una cellula eucariota 9
1.3.2 Differenze più significative tra Procarioti ed Eu-
1.4 I Virus 16
carioti 14
2 ciclo cellulare e duplicazione del dna 21
2.1 Il ciclo cellulare 21
2.1.1 Fasi del ciclo cellulare 22
2.1.2 I punti di controllo 23
2.2 Duplicazione del DNA 23
2.2.1 Introduzione 23
2.2.2 Il DNA (o Acido Dessosiribonucleico) 24
2.2.3 La replicazione del DNA 25
3 il concetto di gene e trascrizione degli rna 31
3.1 Il concetto di Gene 31
3.2 La trascrizione degli RNA 31
3.3 Caratteristiche generali della trascrizione 33
3.4 Un esempio approfondito: la trascrizione negli eucario-
ti 36
3.4.1 Funzionamento della RNA polimerasi II 37
3.4.2 Termine della trascrizione 39
4 codice genetico e sintesi proteica 41
4.1 Il codice genetico 41
4.1.1 Introduzione 41
iii

iv Indice
4.1.2 Definizione 41
4.2 Il processo di traduzione 42
4.2.1 L’apparato di traduzione: i ribosomi e il tRNA 43
4.2.2 La traduzione 46
4.2.3 La traduzione negli eucarioti 49
5 mutazioni, polimorfismi, metodologie analitiche 51
5.1 Le mutazioni 51
5.1.1 Introduzione 51
5.1.2 Le mutazioni geniche o puntiformi 53
5.1.3 Le mutazioni cromosomiche 55
5.1.4 Le mutazioni genomiche 60
5.1.5 Altri fenotipi patologici legati a mutazioni 62
5.1.6 Tabelle riassuntive di alcune patologie 65
5.2 Il polimorfismo in biologia molecolare 65
5.3 Il DNA ricombinante 68
5.3.1 Introduzione 68
5.3.2 Schema semplificato della DNA ricombinante 68
5.4 Metodologie analitiche associate al DNA ricombinante 69
5.4.1 Gel elettroforesi 70
5.4.2 Ibridazione molecolare o metodo di Southern blot 70
5.4.3 Amplificazione del DNA in vivo 71
5.4.4 Amplificazione del DNA in vitro 72
5.4.5 Il sequenziamento enzimatico 73
6 genetica umana formale e molecolare 75
6.1 Introduzione 75
6.2 Gli esperimenti di Mendel 75
6.2.1 Caratteri, Loci, geni 76
6.2.2 Le tre leggi di Mendel 77
6.3 Variazioni alla Genetica Mendelliana 79
6.3.1 Dominanza incompleta 79
6.3.2 Codominanza 80
6.3.3 Allelia multipla 80
6.3.4 Pleiotropia 81
6.3.5 L’epistasi 81
6.3.6 Il linkage e il crossing over 82
6.4 I cromosomi umani 83

7 struttura molecolare e funzionale delle membrane cel-
lulari 85
7.1 Introduzione 85
7.2 I vari modelli di membrana 86
7.2.1 Il modello a mosaico fluido 88
7.3 Struttura delle membrane biologiche 89
7.4 Il doppio strato lipidico 89
7.5 Le proteine di membrana 92
7.6 I carboidrati di membrana 94
7.7 Meccanismi di trasporto 94
7.8 Diffusione semplice 95
7.9 Diffusione facilitata 96
7.9.1 Preteine trasportatrici o carrier o permeasi 96
7.9.2 I canali ionici 97
7.9.3 Caratteristiche più importanti della diffusione fa-
cilitata 99
7.10 Il trasporto attivo 100
7.11 Il trasporto attivo diretto 101
7.12 La pompa Na + /K + 102
7.12.1 Il ciclo della pompa Na + /K + 102
7.12.2 I ruoli funzionali della pompa Na + /K + 104
7.13 Il trasporto attivo indiretto 104
8 trasduzione del segnale 105
8.1 Introduzione 105
8.2 I tipi di segnalazione cellulare 105
8.3 I Recettori 106
8.4 Funzionamento dei recettori 109
8.5 Meccanismi molecolari di trasduzione del segnale 110
indice analitico 114
indice v

glossario
indice vii
allele In genetica si definisce allele o fattore ogni variante di sequenza
di un gene.
allelia multipla Si parla di allelia multipla quando a un solo carattere
fenotipico corrispondono più di due alleli dello stesso gene.
alcune dimensioni utili • Genoma umano: 3.3 · 10 9 coppie di
basi;
• Cromosoma X: ∼ 150 M coppie di basi;
• Cromosoma Y: ∼ 50 M coppie di basi;
• Genoma di E. Coli: 4.6 M di coppie di basi in 1 cromosoma
circolare
eritrociti I globuli rossi (o eritrociti o emazie) sono delle cellule del
sangue (nei Mammiferi sono prive di nucleo e si chiamano ema-
zie, nei Vertebrati non Mammiferi, come ad esempio gli uccelli,
sono nucleate e si chiamano eritrociti, nell’uso comune questi ter-
mini sono intesi come sinonimi), adibite al trasporto dell’ossigeno
dai polmoni verso i tessuti e di una parte dell’anidride carbonica
dai tessuti ai polmoni, che provvedono all’espulsione del gas all’e-
sterno del corpo. I globuli rossi sono prodotti dal midollo osseo
rosso (eritropoiesi), hanno una vita media di 120 giorni e vengono
distrutti dal fegato e dalla milza (eritrocateresi).
introne Si definiscono introni le regioni non codificanti di un gene (eu-
cariotico o di archeobatteri e cianobatteri) che, insieme agli esoni,
vengono trascritte dalle RNA polimerasi. A differenza degli esoni,
gli introni, in seguito al processo di splicing del trascritto primario
(pre mRNA), non si ritrovano negli mRNA maturi.
leucociti I leucociti (dal greco, leukós ’bianco’ e kytos ’cellula’, ’cavi-
tà’) ovvero i globuli bianchi o WBC, sono cellule del sangue. La
funzione principale dei leucociti è quella di preservare l’integrità
biologica dell’organismo tramite l’attuazione di meccanismi di di-
fesa diretti contro microorganismi patogeni di varia natura (virus,
batteri, miceti, parassiti) e contro corpi estranei penetrati nell’or-
ganismo previo superamento delle barriere costituite dalla cute e
dalle mucose.

viii indice
nucleoplasma E’ quella parte di una cellula eucariotica separata dal
citoplasma da una doppia membrana. Il nucleoplasma contiene il
nucleolo, la coromatina e in esso avviene la sintesi dell’RNA e la
sua maturazione.
pleiotropia La pleiotropia (dal greco pleion - molteplice, e tropein, -
cambiamento) è un fenomeno genetico per il quale un unico gene
è in grado di influenzare aspetti multipli del fenotipo di un essere
vivente. Tale capacità, in realtà, è soltanto apparente perché l’ef-
fetto primario del gene rimane unico, ma determina una serie di
conseguenze. Un tipico caso di malattia che mostra effetti pleio-
tropici è la Fenilchetonuria (o PKU). La fenilchetonuria (OMIM
261600), causata nella maggior parte dei casi da una mutazione
recessiva di un gene sul cromosoma 12 (un autosoma), determina
negli individui omozigoti per l’allele mutato l’assenza dell’enzima
fenilalanina idrossilasi. Ciò impedisce la conversione dell’aminoa-
cido fenilalanina in tirosina. La mancanza di questo aminoacido
causa effetti pleiotropici quali problemi nella sintesi di proteine,
degli ormoni tiroxina e adrenalina, e carenza di melanina.
pirofosfato L’idrolisi dell’ATP (Adenosin Three Phosfate) in AMP
(Adenosin Mono-Phosfate), produce l’anione P2O 4−
7 , detto pirofosfato:
ATP → AMP + PPi
(0.1)
Quando un nucleotide è incorporato all’interno di una catena na-
scente di DNA o RNA attraverso l’azione di una polimerasi viene
rilasciato PPi
promotore Si indica con promotore il sito del DNA ove si lega l’RNA
polimerasi prima di iniziare la trascrizione.
stroma Tessuto che forma l’impalcatura di sostegno di un organo, en-
tro la quale si dispongono le cellule proprie dell’organo stesso che
nel loro insieme costituiscono il parenchima. A parte il sistema
nervoso centrale, il cui lo stroma è costituito dalle cellule della
neuroglia, in tutti gli altri organi la struttura di sostegno è formata
da tessuto connettivo le cui fibre si dispongono in vario modo a

indice 1
formare tralci, sepimenti, reticolati, a seconda dell’organizzazione
strutturale della parte. Nello stroma di un organo decorrono vasi
sanguigni, vasi linfatici e nervi propri dell’organo stesso.
tripsina La tripsina è un enzima, appartenente alla classe delle idrola-
si, che catalizza il taglio proteolitico con specificità per l’arginina e
la lisina. Nel sito attivo presenta una sequenza specifica che pren-
de il nome di triade catalitica, ovvero Ser195-His57-Asp102. Que-
sti residui amminoacidici, nonostante siano distanti nella struttura
primaria, si trovano vicini nella struttura terziaria della proteina.
Il substrato della tripsina è rappresentato da una proteina basica.
Il pH ottimale per l’attività catalitica della tripsina è in un range
tra 7 e 9; in realtà ha attività catalitica anche ad altri pH ma l’i-
drolisi mediata da tale proteasi, a pH differenti da quello ottimale,
risulta più lenta.
La tripsina è dunque in grado di ridurre le proteine a polipeptidi
più piccoli o singoli aminoacidi che possono essere assimilati dal-
l’intestino: è pertanto un enzima fondamentale nella digestione
delle proteine.
È prodotta dal pancreas sotto forma di tripsinogeno inattivo, che
viene quindi secreto nell’intestino tenue dove viene attivato e tra-
sformato in tripsina per mezzo di un taglio proteolitico operato
dall’enzima enteropeptidasi. La tripsina risultante, con lo stesso
meccanismo di taglio proteolitico, è in grado di attivare altre mole-
cole di tripsinogeno. Questo meccanismo di attivazione è comune
a molte serin proteasi, ed è utile a prevenire l’autodigestione nel
pancreas.
In laboratorio, viene utilizzata per staccare dalla piastra le cellu-
le in coltura, che crescono per adesione. In primo luogo bisogna
rimuovere il terreno di coltura residuo il quale contiene un ini-
bitore della tripsina (alfa-1 antitripsina), poi lavare le cellule con
soluzione salina e aggiungerci la tripsina che staccherà le cellule.

1 P R O C A R I OT I , E U C A R I OT I E
V I R U S
1.1 introduzione
La cosiddetta teoria cellulare individua nella cellula l’unità fondamen-
tale, sia funzionale che morfologica, degli organismi viventi. Una cel-
lula, infatti, può essere definita, come la più piccola unità vitale di un
organismo che:
• ha un programma genetico;
• è in grado di attuarlo in maniera autonomo;
• è in grado di trasferirlo alla progenie;
Tale definizione di cellula è, peraltro, avvalorata dalla esistenza de-
gli organismi unicellulari, come i batteri e i protozoi, dove ogni cellula
corrisponde ad un individuo: in questo caso, infatti, ogni cellula risulta
essere funzionalmente indipendente a svolgere una attività vitale.
Anche negli organismi pluricellulari, tuttavia, dove le singole attività
vitali sono affidate a gruppi di cellule, le cellule sono potenzialmente in
grado di vivere in maniera indipendente quando rimosse dall’individuo
di cui fanno parte e se sono mantenute in ambiente appropriato.
In base alla loro organizzazione interna e al loro grado di complessi-
tà della loro regione nucleare, le cellule dei diversi organismi possono
essere divise in due gruppi principali:
• Quello del gruppo dei Procarioti (da pro = prima e karyon= nu-
cleo); Le cellule procariotiche possiedono infatti il DNA di forma
circolare e di dimensioni molto ridotte rispetto quello degli eu-
carioti, che si trova libero nel citoplasma in una regione definita
nucleoide. Il citoplasma delle cellule procariotiche è privo di strut-
ture membranose, ad eccezione dei mesosomi, che derivano dal
ripiegamento della membrana plasmatica. I principali organismi
procarioti sono i batteri, che si dividono per scissione binaria.
3

4 procarioti, eucarioti e virus
• Quello del gruppo degli Eucarioti (da eu = tipico, vero e karyon =
nucleo); le cellule eucariotiche possiedono un involucro nucleare
che separa le diverse molecole di DNA lineare, organizzate in cro-
mosomi, dal resto della cellula. L’interno della cellula eucariotica
è caratterizzato dalla presenza di numerosi organelli intracellula-
ri rivestiti da membrana, come l’apparato di Golgi ed il reticolo
endoplasmatico. Le cellule eucariotiche si dividono mediante il
processo di mitosi e costituiscono la maggior parte degli organismi
pluricellulari, come ad esempio protisti, funghi, piante ed animali.
Esistono, inoltre, più piccoli e più semplici agglomerati di materia vi-
vente: i virus. Essi possiedono un patrimonio genetico, ma per esprimer-
lo hanno bisogno di un’altra cellula: essi quindi non possono rientrare
nella definizione data di cellula come unità vitale fondamentale.
1.2 i procarioti
I procarioti, generalmente classificati in due gruppi principali o sotto-
regni (i Bacteria e gli Archaea), rappresentano i più semplici organismi
esistenti. Essi sono tutti unicellulari, anche se possono frequentemente
trovarsi in forme aggregate. Essi sono caratterizzati dall’avere dimensio-
ni ridotte, da 0.2 µm a 30m e una struttura molto semplice.
I procarioti si distinguono quindi in due gruppi:
• archaea, archaeobacteria: vivono spesso in situazioni di tempe-
ratura e pH molto inospitali, hanno caratteristiche (metaboliche,
genetiche, strutturali) differenti da batteri (eubatteri) ed eucarioti.
Secondo le recenti classificazioni, non fanno parte del regno dei
batteri.
• bacteria, batteri: alcuni gruppi sono i micoplasmi, le rickettsie, gli
attinomiceti, le spirochete, le pseudomonas e gli azotofissatori.
1.2.1 Gli Archaea
Gli archei o archibatteri (Archaea o Archaeobacteria) sono una suddivi-
sione sistematica fondamentale, al più basso livello, della vita cellulare.

1.2 i procarioti 5
Possono considerarsi regno o dominio a seconda degli schemi classifi-
cativi, ma mostrano strutture biochimiche tali da considerarsi un ramo
basilare, presto distaccatosi dalle altre forme dei viventi.
Secondo alcuni degli schemi classificativi, peraltro piuttosto fluidi e
soggetti alla revisione basata sulle più recenti tecniche biomolecolari po-
tevano considerarsi uno dei due regni in cui sono divisi gli organismi
procarioti. Nonostante non sia del tutto sicura la filogenesi del gruppo,
gli archei sono (insieme agli eucarioti e agli eubatteri) uno dei fonda-
mentali gruppi degli esseri viventi. Sono costituiti da singole cellule
mancanti di nucleo e assieme ai batteri sono stati in passato classificati
come procarioti o monere. Originariamente sono stati classificati esami-
nando gli ambienti più estremi di vita, ma successivamente sono stati
trovati in tutti gli habitat.
1.2.2 Bacteria
Il regno bacteria, dei batteri (sing. batterio o battere) o eubatteri, com-
prende microrganismi unicellulari, procarioti, in precedenza chiamati
anche schizomiceti, di dimensioni solitamente dell’ordine di pochi mi-
crometri, ma che possono variare da circa 0, 2µm dei micoplasmi fino a
30µm di alcune spirochete. Secondo la tassonomia proposta da Robert
Whittaker nel 1969, assieme alle cosiddette alghe azzurre o cianoficee,
oggi più correttamente chiamate cianobatteri, i batteri costituivano il
regno delle monere. La classificazione proposta da Thomas Cavalier-
Smith riconosce invece due domini: Prokaryota (comprendente i regni
archaea e bacteria) ed eukarya (comprendente tutti gli eucarioti, sia
monocellulari che pluricellulari).
Fra loro si distinguono per forma in:
• Bacilli: a bastoncino; si dividono in Clostridia (anaerobi) e Bacilli
(anaerobi e/o aerobi)
• Cocchi: a sfera; se si dispongono a coppia si chiamano diplococ-
chi, a catena si chiamano streptococchi, a grappolo si chiamano
stafilococchi, a forma di cubo si chiamano sarcine
• Vibrioni: a virgola
• Spirilli: a spirale

6 procarioti, eucarioti e virus
• Spirochete: con più curve
Un’altra importante suddivisione è quella che li raggruppa secondo l’op-
timum di temperatura alla quale possono crescere. Per questa suddivi-
sione si hanno, tre sottoclassi:
• batteri criofili o psicrofili
• batteri mesofili
• batteri termofili
Un’ultima classificazione è basata sulla loro relazione rispetto a un
organismo:
• Batteri commensali (simbionti), batteri che sono normalmente pre-
senti sulla superficie di un determinato tessuto, senza causare
malattia e/o possono svolgere funzioni che possono essere utili
all’organo stesso.
• Batteri patogeni, batteri la cui presenza indica patologia e infezio-
ne
• Patogeni facoltativi, non causano sempre malattia, dipende dal-
l’individuo e dalla loro concentrazione
• Patogeni obbligati, causano in modo indipendente un processo
morboso
1.2.3 Caratteristiche dei Procarioti
In quasi tutti i procarioti il plasmalemma (o membrana plasmatica, o
membrana cellulare) è circondato da una membrana, detta parete cellu-
lare composta da peptidoglicano (una molecola formata da una matrice
di zuccheri legate tra di loro da catene polipeptidiche trasversali). Il
plasmalemma svolge funzioni che negli eucarioti sono svolte da orga-
nelli specifici: è sede di numerosi processi molecolari, può avere un
ruolo importante nella sua replicazione e svolge buona parte delle fun-
zioni vitali della cellula. La più importante fra queste è indubbiamente
quella di trasporto, in cui il movimento delle sostanze idrosolubili (dal-
l’esterno verso il citoplasma e viceversa) è sia facilitato che controllato.

1.2 i procarioti 7
Figura 1: 1.Capsula, 2.Parete cellulare, 3.Membrana citoplasmatica,
4.Citoplasma, 5.Ribosomi, 6.Mesosoma, 7.Nucleoide (DNA),
8.Flagello
Il plasmalemma è anche la sede di particolari molecole proteiche, i re-
cettori, in grado di riconoscere e legare chimicamente composti di varia
natura (ligandi)provenienti dal mezzo esterno e penetrati attraverso la
parete. Il legame ligando/recettore innesta all’interno della cellula una
serie di reazioni il cui svolgimento permetterà alla cellula di rispondere
adeguatamente alle sollecitazioni ambientali.
La Figura 1 rappresenta lo schema di una tipica cellula propcariote
Una delle caratteristiche principali delle cellule procariotiche, indice
della loro semplicità strutturale e funzionale, è la mancanza di organelli
e compartimenti isolati che invece sono una caratteristica delle cellule
eucariotiche. Vale infatti su di esse, una osservazione generale: in esse il
DNA, gli enzimi e gli altri costituenti sono liberi nel citoplasma; tutte le
reazioni metaboliche quindi, non sono compartimentalizzate e l’intera
cellula opera come una unità singola
Le cellule procariotiche contengono una singola e grande molecola di
DNA circolare (cui eventualmente si aggiungono repliconi autonomi),
localizzato all’interno di una struttura a contorni irregolari, immersa
nel citoplasma senza la presenza di membrane limitanti e chiamata nu-
cleoide . La dimensione del DNA procariotico può variare da 250m a
1500m e si presenta, a differenza del DNA eucariotico, privo di proteine
associate.

8 procarioti, eucarioti e virus
La zona del citoplasma attorno al nucleoide, che appare elettron-densa
al microscopio elettronico, è caratterizzata dalla presenza di piccole par-
ticelle, approssimativamente sferiche e dal diametro di 20 − 50 nm che
sono chiamate ribosomi (da ribo- + sòma=corpo; dimensioni 25 − 50nm).
Nei batteri i ribosomi contengono più di 50 proteine differenti in com-
binazione con vari tipi di acido Ribonucleico (RNA o rRNA). Come nel
caso delle cellule procariotiche, i ribosomi rappresentano i siti cellulari
dove gli amminoacidi vengono assemblati a costituire le proteine.
Altra caratteristica delle cellule procariotiche è quella di essere in gra-
do di muoversi rapidamente grazie all’azione di un lungo flagello filifor-
me che si diparte dalla sua superficie. I flagelli dei batteri sono costi-
tuiti da una lunga catena di molecole proteiche. Generalmente la loro
struttura è costituita da un’unica proteina, la flagellina. I flagelli bat-
terci, che producono movimento avvitandosi nel mezzo acquoso, sono
strutturalmente differenti dai più grandi complessi di flagelli eucariotici.
1.3 gli eucarioti
La transizione dai procarioti agli eucarioti ha rappresentato una delle
transizioni evolutive più importanti; questa transizione, secondo molti
studiosi, è seconda solo a quella dell’evoluzione delle cellule fotosinteti-
che. Il problema di come possa essere avvenuto questo passaggio è stato
fonte di un’accesa discussione.
Secondo l’ipotesi più diffusa, per circa 2 miliardi di anni, quindi per
un tempo maggiore alla metà di quello trascorso dall’inizio della vita,
sono esistite solo cellule procariota.
L’origine della cellula eucariota, secondo la teoria attuale e unica accet-
tata per questo salto evoluzionistico, risalirebbe secondo le stime all’in-
circa 1,5 miliardi di anni fa in pieno precambriano, quando alcuni batteri
procarioti si stabilirono all’interno di altri organismi in una sorta di sim-
biosi interna permanente. Vi sono attualmente sufficienti prove, analisi
ed osservazioni per affermare che gli eucarioti derivano dai procarioti,
attraverso il meccanismo di endosimbiosi (Serial Endosymbosis Theory),
postulato in forma completa da Lynn Margulis negli anni sessanta.
Questa origine può essere distinta in due tappe:
• la prima comporta la formazione del fagocita primario

1.3 gli eucarioti 9
• la seconda comporta la non digestione degli organelli (perossiso-
mi, mitocondri, cloroplasti).
1.3.1 Strutture principali di una cellula eucariota
La caratteristica principale di una cellula eucariotica è quella di essere
costituita da un complesso sistema di membrane che, oltre a separare la
cellula dal mezzo esterno, concorre a definire, da un punto di vista mor-
fologico, la regione nucleare e suddivide il citoplasma in compartimenti
distinti detti organelli .
La figura 1 rappresenta uno schema riportante le caratteristiche prin-
cipali di una cellula Eucariote.
Il plasmalemma o membrana cellulare
La membrana più esterna è quella detta, come nel caso dei procarioti,
membrana plasmatica. Essa è adibita a molteplici funzioni tra le quali
quella del trasporto, appare la più importante. tale funzione è attuata
grazie alla presenza di canali proteici che attraversano il film lipidico
della membrana.
Nel plasmalemma alloggiano anche numerosissime proteine a funzio-
ne recettrice, molte delle quali sono funzionalmente connesse a sistemi
biochimici interni che vengono attivati non appena il recettore sulla su-
perficie cellulare, si accoppia al suo specifico ligando. Allo stesso mo-
do, anche le interazioni cellula/cellula sono affidate al plasmalemma e
questo è cruciale sia nella formazione degli organismi pluricellulari che
nello sviluppo di sistemi di aticorpo. In contrasto con i procarioti, il pla-
smalemma eucariotico non contiene molecole implicate nel metabolismo
energetico.
Il nucleo
Nelle cellule eucariote esiste, all’interno del cistoplasma, una zona sepa-
rata chiamata regione nucleare, nucleoplsma o nucleo . Tale zona è separata
dal citoplasma da una membrana nucleare costituita da due membra-
ne concentriche. Citoplasma e nucleoplasma possono comunicare at-
traverso piccole aperture (70 − 90nm di diametro) poste sulla mebrana
nucleare detti annulus. L’annulus sembra controllare il passaggio delle

10 procarioti, eucarioti e virus
Tabella 1: Schema di una tipica cellula Eucariote

molecole più grosse come RNA e proteine.
1.3 gli eucarioti 11
Nel nucleo, la maggior parte dello spazio è occupato da agglomerati
di fibre sottili, irregolarmente ripegate. Tali fibre, che hanno un diame-
tro compreso tra i 10ei30nm, contengono il DNA nucleare associato a
due tipi principali di proteine: gli istoni e le proteine non-istoniche. Gli
istoni svolgono una funzione prevalentemente strutturale. Le proteine
non-isoniche, al contrario, sovraintendono ad una delle più importan-
ti funzioni cellulari: la regolazione della attività genica. L’insieme del
DNA e delle proteine ad esso associato costituisce la cromatina nucleare.
A differenza dei procarioti, il DNA eucariotico non è concentrato in
una singola molecola circolare ma suddivisa in un certo numero di mo-
lecole lineari. Ogni singola molecola, unita alle proteine associate, costi-
tuisce un cromosoma .
All’interno della cromatina sono poi presenti i nucleoli, corpuscoli forte-
mente addensati che, pur non possedendo alcuna membrana, mostrano
contorni chiaramente ben definiti. I nucleoni rappresentano quella parte
di cromatina specializzata nella sintesi ed assemblaggio delle subunità
ribosomiali.
Il nucleo occupa il più alto livello gerarchico fra i centri di controllo di
tutte le attività cellulari. Le informazioni per la sintesi delle proteine
cellulari sono codificate nel DNA cromatinico. Ogni segmento di DNA
contenente l’informazione per sintetizzre una particolare molecola pro-
teica, costituisce un gene . L’informazione genica viene copiata trami-
te un RNA messaggero o mRNA, molecola che raggiunge il citoplasma
attraversando la membrana nucleare al livello del complesso del poro.
Il citoplasma
Il citoplasma occupa circa la metà del volume totale della cellula e vi si
trovano disperse tutte le sostanze chimiche vitali tra cui sali, ioni, zucche-
ri, una grande quantità di enzimi e proteine e la maggior parte dell’RNA.
Il liquido costituisce circa il 75-85 per cento delle sostanze contenute nel
citoplasma, ed è formato inoltre da sali minerali, sostanze organiche e
inorganiche. La matrice citoplasmatica può essere definita plasmagel o
plasmasol a seconda dello stato di aggregazione delle proteine.

12 procarioti, eucarioti e virus
Nelle cellule eucariote, il citoplasma contiene un’intelaiatura forma-
ta da una complessa rete di filamenti costituiti da proteine fibrose e/o
globulari che costituiscono il citoscheletro. Il citoscheletro conferisce alla
cellula la sua forma caratteristica, rende possibili gli spostamenti degli
organuli cellulari e coordina funzioni biologiche fondamentali.
Gli organuli cellulari principali contenuti nel citoplasma sono:
• I Mitocondri (da mitos = filo e chondros = granulo): lunghi tra 1 µm
e 4 µm, essi sono spesso chiamati le ’centrali energetiche’ della
cellula, in quanto sono la sede di quelle reazioni ossidative che
rilasciano l’energia necessaria allo svolgimento delle diverse atti-
vità cellulari. Il combustibile che loro usano per queste reazioni è
rappresentato dai derivati chimici di tutte le più importanti mole-
cole biologiche, come i carboidrati, i grassi, le proteine e gli avidi
nucleici. Il nome che hanno, riflette la sua variabile morfologica:
essi infatti possono presentarsi come corpuscoli filiformi o come
granuli compatti, in relazione al tipo cellulare considerato o, nella
medesima cellula, in funzione del momento metabolico.
I mitocondri sono organelli parzialmente autonomi e sono provvi-
sti di un loro DNA, di ribosomi, di enzimi e di altri fattori richiesti
dai processi di trascrizione e sintesi proteica.
• i Ribosomi eucariotici: di diametro compreso tra i 25 nm e i 35 nm,
sono organelli che possono travarsi liberi nel citoplasma - o anco-
rati al reticolo endoplasmatico ruvido - e sono le particelle respon-
sabili della sintesi proteica. La loro funzione è quindi quella di
sintetizzare le proteine leggendo le informazioni contenute in una
catena di RNA messaggero (mRNA). I ribosomi liberi sintetizzano
quelle proteine che faranno parte integrante delle strutture cellu-
lari (proteine strutturali). Quelli invece legat agli elementi mem-
branosi, verranno impegati nell’assemblaggio di quelle molecole
proteiche destinate alle membrane (come i recettori di membrana),
o che verranno racchiuse in vescicole e stipate nel citoplasma o,
infine, che andranno a far parte dei materiali secreti dalla cellula.
• I Lisosomi (da lysis=dissoluzione e soma=corpo; dimensioni tipi-
che tra 50 nm e 1µm di diametro): è una vescicola presente in
numerose copie in cellule eucariote e rappresenta il sistema dige-
rente della cellula in quanto è responsabile della degradazione e

1.3 gli eucarioti 13
della digestione (distruzione) di molecole estranee e macromoleco-
le ingerite dalla cellula via endocitosi così come di macromolecole
endogene. I lisosomi si occupano del turnover degli altri organel-
li della cellula stessa. Attraverso questo stesso processo i globuli
bianchi sono in grado di disfarsi di microrganismi patogeni o cel-
lule morte precedentemente fagocitate. La degradazione avviene
per mezzo di enzimi idrolitici (chiamati per questo idrolasi acide)
contenuti nell’organello in grado di degradare proteine, lipidi e
carboidrati nei loro costituenti elementari per poi, quando possibi-
le, venire riutilizzati in altro modo o essere espulsi. Questi enzimi
si attivano a pH bassi (4,8), e questo è importante poiché riduce il
pericolo della distruzione della cellula ospitante qualora vi sia la
liberazione accidentale di tali enzimi nel citoplasma (che ha pH 7).
Per
• Il Perossisoma (o microbodies) è un organello cellulare vescicola-
re di circa 0,5-1 µm di diametro separato dal citoplasma da una
membrana che contiene almeno 50 enzimi ossidativi. In genera-
le i perossisomi sono considerati comparti metabolici specializza-
ti, contenenti enzimi in grado di trasferire idrogeno da diverse
sostanze e legarlo all’ossigeno per la formazione di perossido di
idrogeno (H2O2). In una cellula epatica vi possono essere fino
a 600 perossisomi all’interno dei quali è a volte rintracciabile un
nucleo denso che contiene vari enzimi come l’urato ossidasi, la ca-
talasi, il D-amminoacido ossidasi. I perossisomi esercitano molte
azioni che vanno dall’ossidazione degli acidi grassi a lunga cate-
na (detta beta-ossidazione), alla sintesi del colesterolo e degli aci-
di biliari nelle cellule epatiche, alla produzione di plasmalogeni.
Intervengono altresì nel metabolismo degli amminoacidi e delle
purine e prendono parte al processo di smaltimento dei composti
metabolici tossici.
I perossisomi elaborano al loro interno il perossido di idrogeno
(H2O2), (da cui presero il nome) a seguito dei processi di ossida-
zione, catalizzati da vari enzimi (urato ossidasi, glicolato ossida-
si, amminoacido ossidasi) che per svolgersi necessitano di ossige-
no molecolare (O2). Il perossido di idrogeno è altamente reattivo
ed ha azione ossidante per cui viene subito eliminato dall’enzima
catalasi

14 procarioti, eucarioti e virus
• L’apparato di Golgi: è un organulo di composizione lipo-proteica.
Esso è formato da cisterne membranose appiattite, impilate le une
sulle altre, deputate alla glicosilazione, cioè produzione di glico-
lipidi e glicoproteine (mediante l’aggiunta di residui glucidici).
L’apparato di Golgi ha una funzione molto importante ovvero di
rielaborare, selezionare ed esportare i prodotti cellulari. Questo
organulo può interagire con altri (come il reticolo endoplasmati-
co rugoso) per indirizzare ed etichettare certe vescicole contenenti
prodotti cellulari verso la loro destinazione, che può essere quello
di confluire in altri organi o ingranare nella membrana plasmatica
e farne uscire il contenuto.
• Il centriolo: è un organello presente nella maggior parte delle cel-
lule animali, in alcuni funghi, alghe e piante inferiori. Nella va-
riante base ha struttura cilindrica cava (lunga circa 0,5 micron e
larga 0,2) la cui parete è formata da nove triplette di microtubuli
ed è dotato di appendici all’estremità distale.
I centrioli si trovano in coppia e solitamente sono disposti tra di
loro a formare un angolo retto. Assieme ad un materiale elettron-
denso che li circonda, chiamato materiale pericentriolare (PCM),
costituiscono ciò che Theodor Boveri denominò centrosoma, il più
importante centro organizzatore dei microtubuli della cellula.
Essi svolgono una funzione essenziale durante la mitosi, in quan-
to sono coinvolti nell’assemblaggio del fuso mitotico, pur non
enucleando direttamente i microtubuli.
1.3.2 Differenze più significative tra Procarioti ed Eucarioti
Gli eucarioti si distinguono dai procarioti anche per numerose caratteri-
stiche a livello molecolare quali, ad esempio:
• diverse proprietà delle sequenze genomiche regolatrici
• geni organizzati in introni ed esoni con conseguente processamen-
to (splicing) del trascritto primario
• trascrizione e traduzione di un trascritto sono eventi separati nello
spazio e nel tempo

1.3 gli eucarioti 15
• i trascritti eucariotici non sono (quasi) mai policistronici, ossia por-
tano una sola ORF percentuale di DNA non codificante molto più
elevata
• DNA associato ad istoni
• diversa percentuale di G-C nel genoma
• presenza di colesterolo nella membrana cellulare, tranne che nei
funghi, nelle piante e in alcuni protisti che, pur essendo eucarioti
non presentano colesterolo nella membrana.
• Solo negli eucarioti si ha riproduzione sessuale: le cellule eucario-
te presentano due modi di divisione: la mitosi e la meiosi. Tutte le
cellule possono dividersi attraverso il processo di mitosi, ma solo
quelle diploidi possono subire la meiosi.

16 procarioti, eucarioti e virus
La tabella 3 riporta in forma schematica le principali caratteristiche
morfologiche e molecolari e le principali differenze tra eucarioti e proca-
rioti.
1.4 i virus
I virus (o vira, virales, virii a seconda degli schemi tassonomici ed am-
biti di indagine) sono entità biologiche con caratteristiche di parassita
obbligato, la cui natura di organismo vivente o struttura subcellulare è
discussa, così come la trattazione tassonomica. Per tale ragione sono
considerati l’anello di congiunzione tra composto chimico e organismo
vivente. La singola particella virale viene denominata virione.
Le dimensioni dei virus partono da circa 10 nm, i più grandi possono
raggiungere i 450 nm e il mimivirus i 750-800. Alcuni virus filamentosi
superano di poco in lunghezza il micron.
Possono essere responsabili di malattie in organismi appartenenti a
tutti i regni biologici: esistono infatti virus che attaccano batteri (i batte-
riofagi, vedi Figura 2), funghi, piante e animali, compreso l’uomo.
Figura 2: Tipico Virus Batteriofago

Tabella 2: Principali difference tra una cellula procariotica e una eucariotica
Procarioti Eucarioti
1.4 i virus 17
Sono più strutturati e complessi
Hanno maggiori dimensioni (fino a 10 volte)
Non presentano compartimentalizzazione La compartimentalizzazione è una loro caratteristica
fondamentale
Contengono i cosiddetti organuli: compartimenti
specializzati in funzioni specifiche
Nucleo non ben definito e la zona dove è Nucleo ben definito e diviso dal citoplasma da
concentrato il DNA è chiamato nucleoide una membrana specifica
La membrana plasmatica è rivestita da una Questo non è vero per gli eucarioti (tranne che
parete che ne conferisce una grossa rigidità per i funghi, le piante e la maggior parte dei
protozoi)
I cromosomi sono contenuti nel nucleoide Cromosomi contenuti nel nucleo
Il patrimonio genetico è costituito da un singo- Contengono vari cromosomi solitamente in
lo cromosoma: un DNA di forma circolare a forma lineare e il loro numero è specie-specifico
doppio filamento
Il DNA è quasi privo di proteine associate Il DNA è associato a proteine istoniche e non
istoniche
I ribosomi eucariotici sono più grandi di quelli
procariotici perchè contengono più proteine
Il plasmalemma contiene molecole implicate nel Il plasmalemma non le contiene
metabolismo energetico
La lunghezza massima del DNA è di circa Il DNA totale può arrivare fino ad 1 metro
1500 mu m

18 procarioti, eucarioti e virus
I virus sono mediamente circa 100 volte più piccoli di una cellula e
possiedono di alcune caratteristiche fondamentali:
• tutti posseggono un relativamente piccolo genoma costituito da
DNA o RNA, che trasporta l’informazione ereditaria;
• tutti posseggono, quando all’esterno della cellula ospite, una co-
pertura proteica (capside) che protegge questi geni; entità simili
ma prive del capside appartengono ai viroidi.
• alcuni posseggono un ulteriore rivestimento che si chiama peri-
capside, di natura lipoproteica;
• alcuni posseggono strutture molecolari specializzate ad iniettare il
genoma virale nella cellula ospite.
Il loro comportamento parassita è dovuto al fatto che non dispongo-
no di tutte le strutture biochimiche e biosintetiche necessarie per la loro
replicazione. Tali strutture vengono reperite nella cellula ospite in cui il
virus penetra, utilizzandole per riprodursi in numerose copie. La ripro-
duzione del virus spesso procede fino alla morte della cellula ospite, da
cui poi dipartono le copie del virus formatesi.
I virus sono tutti parassiti endocellulari obbligati. All’esterno delle
cellule ospiti sono costituiti da un virione, formato da una capsula pro-
teica (detta capside) contenente il RNA. I virus degli Eucarioti possono
possedere anche una membrana che avvolge il capside detta peplos o
pericapside. Talvolta tra il capside e il peplos presentano un ulteriore
strato proteico che prende il nome di tegumento. I virioni non possie-
dono metabolismo: vengono quindi trasportati passivamente finché non
trovano una cellula da infettare. L’infezione di una cellula ospite richie-
de il legame con proteine specifiche di membrana. Nelle cellule infettate
i virus perdono la loro individualità strutturale: consistono negli acidi
nucleici e nei loro prodotti che assumono il controllo di parte dell’attivi-
tà biosintetica cellulare al fine di produrre nuovi virioni. In alternativa,
alcuni virus possono inserire fisicamente il loro genoma in quello dell’o-
spite in modo che sia replicato insieme ad esso. Il genoma virale inserito
in quello dell’ospite, detto provirus, riprende la sua individualità e pro-
duce nuovi virioni in caso di danneggiamento della cellula ospite.
Una particella virale completa, o virione, è costituita da una o più
molecole di acidi nucleici, rivestite da subunità di natura proteica (cap-

1.4 i virus 19
someri) legate all’acido nucleico ed ordinate in modo da formare un ele-
mento di rivestimento, detto capside. Questo svolge innanzi tutto una
funzione di protezione dell’acido nucleico virale (il genoma del virus);
interviene anche nei processi di traslocazione del virus all’ospite e al vet-
tore; determina le caratteristiche antigeniche del virus. I virus possono
avere un rivestimento lipidico - fosfolipidico derivante dalla membrana
cellulare della cellula ospitante; eventuali Glucidi di superficie presenti
provengono interamente da essa. Virus con detto rivestimento possono
essere subordinati ad esso per la loro infettività, ingannando il sistema
immunitario dell’organismo ospite. Il capside è composto da proteine
codificate dal genoma virale e la sua forma può servire come base per
la distinzione morfologica. Proteine associate con acidi nucleici sono
noti come nucleoproteine e l’associazione di proteine del capside virale
con acido nucleico virale è chiamato nucleocapside. In generale abbia-
mo quattro fondamentali tipi morfologici di virus: Elicoidali, Poliedrici,
Dotati di rivestimento e Complessi, come i batteriofagi.

2 C I C L O C E L L U L A R E E
D U P L I C A Z I O N E D E L D N A
2.1 il ciclo cellulare
Il ciclo cellulare, o ciclo di divisione cellulare, è la serie di eventi che
avvengono in una cellula eucariote tra una divisione cellulare e quella
successiva. La durata del ciclo cellulare varia col variare della specie, del
tipo di cellula e delle condizioni di crescita. Negli organismi pluricellu-
lari alcune cellule una volta raggiunta la maturità perdono la capacità di
dividersi.
Il ciclo cellulare è un processo geneticamente controllato, costituito
da una serie di eventi coordinati e dipendenti tra loro, dai quali dipende
la corretta proliferazione delle cellule eucariotiche. Gli eventi moleco-
lari che controllano il ciclo cellulare sono ordinati e direzionali: ogni
processo è la diretta conseguenza dell’evento precedente ed è la causa
di quello successivo. È caratterizzato da cinque fasi: G1,S,G2, mitosi e
citodieresi(non presente in figura) G sta per GAP (Intervallo).
Molti geni coinvolti nella progressione del ciclo cellulare sono stati
individuati agli inizi degli anni settanta grazie ad uno studio condot-
to da Lee Hartwell e collaboratori sul lievito Saccharomyces cerevisiae,
un microrganismo eucariotico unicellulare che si presta molto bene alle
analisi genetiche; grazie a questo lavoro furono isolati e caratterizzati
mutanti che presentavano alterazioni nelle diverse fasi del ciclo cellulare
(Hartwell, 1974).
Nelle cellule eucariotiche la progressione attraverso le varie fasi del ci-
clo cellulare risulta essere finemente regolata dalle chinasi ciclina-dipendenti
o CDK (Cyclin-dependent Kinases) una famiglia di proteine chinasi la
cui attività dipende dalla loro associazione con delle subunità proteiche
regolative dette cicline; queste ultime sono proteine instabili, sintetiz-
zate e degradate periodicamente, che si accumulano in fasi del ciclo
specifiche e che non solo attivano le CDK, ma ne determinano anche la
specificità di substrato.
Leland H. Hartwell, R. Timothy Hunt e Paul M. Nurse hanno vinto il
21

22 ciclo cellulare e duplicazione del dna
Premio Nobel per la Fisiologia e la Medicina nel 2001 per la loro scoper-
ta del ruolo centrale di queste molecole nel ciclo cellulare. Le scoperte
sono state ottenute studiando il ciclo cellulare rispettivamente nel lie-
vito gemmante Saccharomyces cerevisiae, nelle uova del riccio di mare
Sphaerechinus granularis ed nel lievito a fissione Schizosaccharomyces
pombe.
Negli eucarioti multicellulari la necessità di rispondere a una maggio-
re quantità di stimoli esterni ed interni ha permesso l’evoluzione di mol-
teplici e diverse CDK: i vari complessi CDK - ciclina che si formano du-
rante il ciclo cellulare di tali organismi cambiano sia per quanto riguarda
la subunità regolatoria (ciclina) sia per quanto riguarda la subunità cata-
litica (CDK). In ogni periodo del ciclo cellulare è presente quindi un solo
tipo di complesso CDK - ciclina cataliticamente attivo e, a seconda del
complesso formatosi, vengono fosforilate molecole bersaglio differenti.
Oltre all’azione regolatoria della ciclina, il complesso CDK - ciclina è
anche soggetto all’azione di inibitori in grado di legarsi a tale complesso
e di renderne inattiva la subunità catalitica: questa classe di proteine
prende il nome di CKI (CDK Inhibitors). Inoltre, determinati siti della
subunità catalitica delle CDK risultano essere bersaglio di molte chinasi
e fosfatasi che, determinando lo stato di fosforilazione del complesso, ne
modulano più finemente la sua attività.
2.1.1 Fasi del ciclo cellulare
vIl ciclo cellulare è un evento molto importante, per questo motivo è re-
golato in tutte le sue dimensioni. Affinché l’informazione genetica venga
correttamente trasmessa dalla cellula madre alle cellule figlie, il genoma
deve essere prima duplicato durante il periodo di tempo denominato
fase S e in seguito i cromosomi devono venire segregati nelle due cellule
figlie durante la fase M. La fase M è a sua volta composta da due proces-
si, strettamente collegati: la mitosi, durante la quale i cromosomi della
cellula sono divisi tra le due cellule figlie e la citodieresi, che comporta
la divisione fisica del citoplasma della cellula.

2.1.2 I punti di controllo
2.2 duplicazione del dna 23
Il ciclo cellulare è un processo estremamente importante; errori in questo
processo potrebbero compromettere la vitalità cellulare. Per tale motivo,
nel ciclo cellulare, sono presenti dei punti di controllo o checkpoints,
localizzati a livello delle transizioni G1/S e G2/M. Infatti, tra le fasi S
ed M ci sono normalmente due periodi di tempo detti gap: G1 fra la
fine della mitosi e l’inizio della fase S e G2 fra il termine della fase S e
l’inizio della fase M. In questi periodi di tempo si ha la maggior parte
della sintesi proteica con conseguente aumento della massa cellulare e
la realizzazione dei controlli che impediscono l’inizio della fase succes-
siva se non è stata completata quella precedente. Le fasi G1 e G2 sono
quelle che possono subire la maggior variabilità di durata e in alcuni
casi particolari possono anche essere eliminate, contrariamente alle fasi
S e M che sono essenziali e che rappresentano due eventi chiave del ciclo
cellulare. L’insieme delle fasi G1, S e G2 è globalmente identificato come
interfase. Si dice che le cellule che hanno smesso di dividersi, in modo
temporaneo o irreversibile, sono in uno stato di quiescenza (fase G0).
Le cellule nervose e quelle striate dei muscoli scheletrici, ad esempio,
rimangono in questo stadio per tutta la vita dell’organismo. Le cellule
che non vanno più incontro a divisione in seguito ad invecchiamento o a
danneggiamento del DNA sono invece chiamate senescenti. È da osser-
vare che la mitosi produce sempre due cellule geneticamente identiche
alle cellula madre e che la maggior parte degli organuli citoplasmatici si
distribuisce casualmente nelle cellule figlie.
2.2 duplicazione del dna
2.2.1 Introduzione
Durante la fase S dell’interfase, le cellule replicano il loro DNA in prepa-
razione alla divisione mitotica e meiotica, con un accurato ed efficiente
processo. Una volta completata la replicazione, la maggior parte dei
pochi errori introdotti viene corretta da meccanismi di riparazione che
analizzano il DNA al fine di trovare appaiamenti errati nelle basi ed altre
irregolarità. Il risultato è una duplicazione quasi perfetta dell’informa-

24 ciclo cellulare e duplicazione del dna
zione genetica L’accurato ed efficiente processo di replicazione del DNA,
che avviene immediatamente prima del processo di divisione cellulare,
permette ad ogni cellula il mantenimento di quel grado di ordine che
è necessario al trasferimento della informazione genetica della cellula
parentale che si trova pronta a essere suddivisa in due cellule figlie.
I pochi errori che rimangono dopo la duplicazione e la riparazione
del DNA (le mutazioni), sono molto importanti per il processo evolutivo,
in quanto rappresentano la principale sorgente di variabilità su cui agi-
sce la selezione naturale. Le mutazioni, parimenti, sono alla base della
comparsa dei fenotipi patologici caratterizzanti la maggior parte delle
malattie cui un essere vivente incorre durante la sua vita.
2.2.2 Il DNA (o Acido Dessosiribonucleico)
Il DNA è un lungo polimero lineare costituito da subunità ripetute, i
nucleotidi e esso rappresenta, insieme all’RNA (acido ribonucleico), la mo-
lecola informazionale di tutti gli esseri viventi. La sequenza dei nucleo-
tidi negli acidi nucleici costituisce un codice che conserva e trasmette le
istruzioni necessarie per assemblare tutti i tipi di proteine.
Un nucleotide, da un punto di vista chimico, è costituito da tre unità
legate tra di loro da legami di tipo covalente (Figura 3):
1. Una base contenente azoto
2. uno zucchero a cinque atomi di carbonio
3. Uno o più gruppi fosfato
Per formare il DNA e l’RNA i nucleotidi si uniscono tra di loro at-
traverso legami detti fosfodiesterici che si formano tra il carbonio 5’ dello
zucchero (ribosio o desossiribosio) e il carbonio 3’ dello zucchero succes-
sivo. Sono cinque le basi che formano gli acidi nucleici, due appartenenti
alla classe delle purine (l’adenina e la guanina) e tre appartenenti a quella
delle pirimidine (l’uracile, la timina e la citosina). Nel DNA l’accoppia-
mento delle basi avviene attraverso legami ad idrogeno doppi o tripli e
sempre in modo che la Citosina è legata alla Guanina e l’Adenina alla
Timina. Nell’RNA la Timina è sotituito dall’Uracile.
Come fu proposto per la prima volta nel 1953, nelle cellule il DNA
esiste come una doppia elica che contiene due catene di nucleotidi in-
trecciate. Le basi sono attaccate agli zuccheri e si estendono all’interno

2.2 duplicazione del dna 25
Figura 3: Struttura chimica di un nucleotide (adenina)
.
verso l’asse dell’elica. Nella doppia elica del DNA, le due catene nucleo-
tidiche procedono in direzioni opposte e sono, quindi, antiparallele: i
legami fosfato di una catena, per esempio, se disegnati dal basso verso
l’alto, si estendono dal carbonio 5’ dello zucchero inferiore al carbonio 3’
dello zucchero superiore per ciascun legame. Sull’altra catena i legami
5 ′ → 3 ′ procedono in direzione opposta dall’alto verso il basso. Que-
sta caratteristica della struttura del DNA ha un importante significato
sia per la sua replicazione sia per la trascrizione dell’RNA, poichè una
nuova catena di DNA o RNA che si sta copiando deve procedere nella
direzione opposta rispetto quella del suo stampo (3 ′ → 5 ′ ).
2.2.3 La replicazione del DNA
Il meccanismo di duplicazione è di tipo semiconservativo
Il cosidetto ’stampo del DNA’ o DNA templating è il meccanismo che
le cellule adoperano per copiare la sequesnza nucleotidica di una delle
catene del loro DNA in una complementare (Figura 4).
Poichè i due filamenti nucleotidici che costituiscono il DNA, sono
complementari, ognuno di esso può servire come stampo per la sintesi
della metà mancante quando questi si separano dopo lo srolotamento. Il
meccanismo che da origine a molecole replicate, ognuna delle quali for-
mate dal vecchio filamento nucleotidico usato come stampo ( o template)
e da quello nuovo è indicato come replicazione semiconservativa.

26 ciclo cellulare e duplicazione del dna
Figura 4: La doppia elica del DNA agisce da stampo per la propria
duplicazione.
Schema della replicazione
L’assemblaggio dei singoli nucleotidi del DNA nel filamento è cataliz-
zato da un gruppo di enzimi noto come DNA polimerasi. Questi enzimi
utilizzano come substrati i quattro nucleotidi nella nella forma di nu-
cleosidi trifosfati: la dedossiadenosina trifosfato (dATP), la desossiguanosina
trifosfato (dGTP), la desossicitidina trifosfato (dCTP) e la timidina trifosfato
(TTP).
Le DNA polimerasi differiscono dalle RNA polimerasi (gli enzimi che
come vedremo, sintetizzano le catene di RNA) oltre che per la presenza
del desossiribosio al posto del ribosio come zucchero, principalmente
per la necessità della oresenza di un innesco, o primer, per iniziare la
sintesi. Esse sono in grado, in fatti, di iniziare una sintesi solo aggiun-
gendo nucleotidi alla fine di un filamento nucleotidico preesistente che
agisce da innesco per la reazione. In natura è l’RNA usato come innesco
e ad un certo punto, dopo che la sintesi del DNA ha avuto inizio, esso è
degradato e sostituito da DNA.
Lo schema della polimerizzazione di una nuova catena di DNA è
mostrato in Figura 5.
Essa procede a partire dall’innesco (primer strand). L’enzima DNA
polimerasi (non mostrato in figura) si lega al gruppo 3’-OH dell’innesco
e riconosce la prima base che deve essere copiata sullo stampo. Nella
Figura 5 questa prima base è la guanina. La presenza della guanina,
determina il legame dell’enzima con il substrato dCTP (desossicitidina tri-
fosfato) che viene prelevato dal gruppo di nucleotidi circostanti. E’ da

2.2 duplicazione del dna 27
Figura 5: La doppia elica del DNA agisce da stampo per la propria
duplicazione.

28 ciclo cellulare e duplicazione del dna
notare come, tutti e quattro i nucleotidi trifosfati (dATP, dGTP, dCTP
e TTP) collidono e legano debolmente la DNA polimerasi, ma normal-
mente solo il nucleotide che da luogo al corretto appaimento con la base
presente nello stampo (in questo caso dCTP), si legherà.
Il forte legame che si viene a creare tra enzima e substrato, mantiene
il dCTP appaiato alla guanina dello stampo in una posizione tale da
favorire la formazione del legame covalente tra il gruppo 3’-OH (che si
trova al termine dell’innesto) ed il gruppo fosfato più interno legato al
carbonio 5’ del dCTP. A questo punto gli ultimi due fosfati (il pirofosfato)
vengono eliminati, mentre il rimanente fosfato viene legato all’ossigeno
del 3’-OH, dando luogo al legame fosfodiesterico 3 ′ → 5 ′ tra l’innesco e il
nucleotide aggiunto.
In seguito alla formazione del primo legame fosfodiesterico, l’enzima
si sposta verso la successiva base dello stampo di DNA (che nel no-
stro caso è una adenina). In questo caso l’enzima preleverà una TTP e
catalizzerà la formazione del secondo legame fosfodiesterico tra la timi-
na e l’adenina. Il processo quindi si ripete continuando ad aggiungere
nucleotidi complementari in successione al filamento nascente di DNA.
E’ chiaro che ogni nucleotide che viene aggiunto ad un gruppo 3’-OH
fornisce, a sua volta, un gruppo 3’-OH necessario alla successiva reazio-
ne. Ne consegue che un gruppo 3’-OH è sempre presente sull’estremi-
tà della catena crescente e che quindi la sintesi procede in direzione
5 ′ → 3 ′ . Tutte le DNA polimerasi aggiungono i nucleotidi solo in
questa direzione.
La reazione che aggiunge nucleotidi al filamento nascente di DNA si
svolge secondo la stessa procedura che viene seguita dalla cellula nel
corso della trascrizione dell’RNA. Essa si differisce tuttavia per la pre-
senza dell’innesco (o primer) e per il fatto che nella duplicazione del
DNA, la doppia elica stampo deve srotolarsi completamente affinché
la replicazione sia semiconservativa. Sdrolotamento e duplicazione del
DNA procedono in prossimità di una forcella che si muovo in modo
unidirezionale lungo lo stampo di DNA. Per oroginare una forcella uni-
direzionale, i due filamenti nucleotidici dello stampo di DNA si devono
srotolare e reoplicare simultaneamente nella stessa direzione. Tuttavia,
poichè i due filamenti sono antiparalleli, solamente uno di essi si presen-
ta al meccanismo di replicazione nella direzione richiesta 3 ′ 5 ′ mentre
l’altro mostra una direzione non funzionale. Questo problema viene ri-
solto da un meccanismo specifico che fa in modo di replicare questo fila-

2.2 duplicazione del dna 29
mento in piccoli frammenti disposti in direzione opposta al movimento
della forcella.
I meccanismi specifici della replicazione
Ricerche specifiche in sistemi procariotici ed eucariotici hanno suggerito
un modello che, pur essendo diverso nei dettagli, è applicabile ad en-
trambi i gruppi di organismi ed anche a molti virus che li infettano. Ta-
le modello che include tre meccanismi peculiari (svolgimento del DNA,
sintesi dell’innesco e movimento unidirezionale della forcella), coinvolge
l’attività coordinata di fattori ed enzimi specializzati.
• Svolgimento del DNA Tale meccanismo dipende da un enzima
detto elicasi che si muove lungo lo stampo a doppia elica, proprio
di fronte alla DNA polimerasi, separando al suo passaggio i fi-
lamenti dello stampo. Per effettuare la reazione di svolgimento,
l’elicasi utilizza una molecola di ATP per ogni giro di elica svolto.
Il processo di svolgimento causa degli arrotolameneti forzati della
doppia elica del DNA e, quindi, delle zone nelle quali c’è una ad-
densamento forzato della catena. Al fine di allentare la tensione
meccanica che così si viene a creare, intervengono degli enzimi,
detti DNA topoisomerasi, che producono una rottura di fronte alla
forcella permettendo il rilascio degli avvolgimenti.
• Sintesi dell’innesco e polimerizzazione Quando il DNA si svolge
una RNA polimerasi specializzata, chiamata primasi sintetizza gli
inneschi. La primasi si attacca al filamento stampo e catalizza
la sintesi di un innesco di RNA (l’RNA primer) lungo da 5 a 10
nucleotidi. Gli inneschi vengono assemblati su entrambi i lati della
forcella in direzione 5 ′ 3 ′ : lungo un filamento nella direzione di
svolgimento, lungo l’altro nella direzione opposta.
La DNA polimerasi aggiunge nucleotidi in modo sequenziale agli
inneschi. Come per la sintesi degli inneschi, la polimerizzazione
procede in direzione 5 ′ 3 ′ su ambedue i lati della forcella, in modo
che i nucleotidi siano aggiunti ad un filamento nella direzione
dello srotolamento e all’altro nella direzione opposta.
Dopo aver svolto la propria funzione gli inneschi vengono rimossi
o dalle molecole di DNA polimerasi oppure da una RNAasi spe-
cializzata in questa funzione in questa funzione. Una differente

30 ciclo cellulare e duplicazione del dna
DNA polimerasi colma le lacune (gap) originate dalla rimozione
degli inneschi aggiungendo nucleotidi sino ad appaiare anche le
ultime basi rimaste. Poichè la DNA polimerasi, poi, non è in grado
di collegare l’estremità 3’ del gap riempito all’estremità 5’ del fram-
mento successivo, rimane una interruzione nel singolo filamento.
Questa interruzione viene riparata dal’ultimo enzima principale
coinvolto nella duplicazione del DNA, la DNA ligasi. Utilizzando
ATP o NAD quali fonti di energia, essa determina la formazio-
ne dell’ultimo legame diesterico necessario all’assemblaggio dei
frammenti in un’unica catena nucleotidica di DNA.

3 I L C O N C E T TO D I G E N E E
T R A S C R I Z I O N E D E G L I R N A
3.1 il concetto di gene
Allo stato attuale delle nostre conoscenze sulla biologia molecolare, mol-
ti autori preferiscono non fornire una definizione univoca e precisa del
concetto di gene.
Se agli inizi degli anni 60, in fatti, si tendeva a definire un gene come
un concetto che prevedeva una esatta corrispondenza tra un tratto di
catena DNA e la catena polipeptidica risultante, via via che lo studio sui
meccanismi relativi all’epressione del gene veniva approfondito, appera
chiaro ch tale concetto non era sempre verificato. E’ il caso per esempio
della formazione degli rRNA o dei tRNA che derivano da tratti di DNA
a cui non corrispondono proteine.
Negli anni successivi si cercò di dare una definizione più generale di
gene, cercando di associare ad esso il concetto di unità trascrizionale. An-
che questa definizione non è immune da critiche perchè c’è chi tende ad
inserire nella struttura del gene tutte le varie sequenze regolative e va
anche considerato la condizione in cui lo stesso gene dia più prodotti.
Tutto ciò porta molti autori a non dare una definizione univoca del con-
cetto di gene ritenendo che sia impossibile abbracciarne tutti gli aspetti
con una semplice frase che ne esaurisca le caratteristiche.
3.2 la trascrizione degli rna
In biologia molecolare, la trascrizione è il processo mediante il quale
le informazioni contenute nel DNA vengono trascritte enzimaticamente
in una molecola complementare di RNA. Concettualmente, si tratta del
trasferimento dell’informazione genetica dal DNA all’RNA. Nel caso in
cui il DNA codifichi una proteina, la trascrizione è l’inizio del processo
che porta, attraverso la produzione intermedia di un mRNA, alla sintesi
di peptidi o proteine funzionali.
31

32 il concetto di gene e trascrizione degli rna
Figura 6: Esempio della struttura di un gene codificante RNA. Il promotore
è localizzato a monte della sequenza codificante mentre la
sequenza terminatrice è a valle. La sequenza codificante inizia
con il nucleotide +1
.
L’espressione del programma genetico cellulare, localizzato nella mo-
lecola del DNA, è effettuata attraverso una serie di processi che posso-
no essere raggruppati in due funzioni principali: 1) la trascrizione, 2)
la traduzione, secondo un flusso di espressione che coinvolge diverse
strutture della cellula.
In questo capitolo analizzeremo il processo della trascrizione, che consi-
ste nella sintesi di una molecola di RNA, la cui sequenza ribonucleotidi-
ca è complementare a quella di uno stampo a DNA.
Non tutto il DNA di una cellula è trascrivibile: lo è solo quello che pos-
siede un’organizzazione che contraddistingue strutture complesse chia-
mate “geni”. Sebbene i geni presentino organizzazione diversa nelle
cellule procariotiche ed eucariotiche e, nell’ambito della stessa cellula,
siano differentemente strutturati in relazione con il tipo di RNA da sin-
tetizzare, è possibile individuare una organizzazione generale se si tiene
conto delle loro regioni funzionali. La Figura 6 riporta un esempio della
struttura di un gene.
Come dette in precedenza, fino a poco tempo fa la funzione degli
RNA era strettamente connessa con la sintesi proteica e essi veniva-
no classificati in tre rigide categorie tutte coinvolte in questa funzio-
ne: l’RNA messaggero (o mRNA), l’RNA ribosomiale (rRNA) e l’RNA
transfer (o tRNA). Tale suddivisione oggi può essere considerata obso-
leta in quanto nella cellula sono presenti numerosi altre classi di RNA
che hanno anch’esse un ruolo importante nel metabolismo cellulare: i

3.3 caratteristiche generali della trascrizione 33
piccoli RNA nucleari (snRNA), i piccoli RNA citoplasmatici (scRNA), i
piccoli RNA nucleolari (snoRNA). Il ritrovamento in cellule eucariotiche
di doppi filamenti di RNA-RNA di difficile interpretazione funziona-
le (i microRNA) fa intuire la complessità delle attività (ancora in parte
sconosciute) in cui questa molecola è coinvolta.
3.3 caratteristiche generali della tra-
scrizione
La sintesi degli RNA segue regole che sono generali per la polimerizza-
zione degli acidi nucleici e che riguardano la necessità dell’esistenza di
uno stampo che detta la direzione della crescita della catena polinucleo-
tidica e la direzione stessa di crescita che avviene dal terminale 5’P al
terminale 3’OH. i nucleotidi che vengono adoperati sono ribonucleosidi
trifosfato in 5’ e precisamente l’adenosina trifosfato (ATP), la Guanosina
trifosfato (GTP), la Citidina trifosfato e l’Uridina Trifosfato UTP).
Contrariamente alla duplicazione del DNA, la reazione generale della
polimerizzazione non richiede alcuna molecola che faccia da innesco.
Il processo di trascrizione avviene grazie all’enzima RNA-polimerasi.
Nelle cellule eucarioti ci sono tre diverse molecole di RNA-polimerasi,
che occupano diversi siti. Ciascuno di questi enzimi è responsabile della
trascrizione di una differente classe di geni. L’RNA-polimerasi I, che
risiede nel nucleolo, è responsabile della trascrizione dei geni per la pro-
duzione di tutto l’RNA ribosomiale (o rRNA). Questo è l’enzima con
la più elevata attività di sintesi. L’RNA-polimerasi II, localizzata nel
nucleoplasma (la parte di nucleo che esclude il nucleolo), è responsa-
bile della sintesi del precursore dell’RNA messaggero (mRNA). l’RNA-
polimerasi III, l’enzima con l’attività minore, anch’essa presente nel nu-
cleoplasma, che sintetizza l’RNA di trasporto (tRNA). Nella fase di ini-
zio l’RNA-polimerasi si lega alla doppia catena del DNA, aprendola in
corrispondenza di una particolare sequenza, chiamata promotore . Il
promotore è una speciale sequenza di nucleotidi che non verrà trascritta,
situata sul DNA all’inizio del gene. Successivamente l’RNA-polimerasi
scorre lungo il DNA rompendo i ponti Idrogeno tra le basi azotate com-
plementari ed aprendo la doppia elica come una cerniera. In questo
modo una delle due catene viene esposta alla copiatura e fa da stampo

34 il concetto di gene e trascrizione degli rna
per la sintesi di una molecola di RNA messaggero ad essa complemen-
tare. Mentre l’RNA-polimerasi scorre sul filamento-stampo del DNA
vengono agganciati ad esso dei ribonucleotidi complementari. Quando,
durante la trascrizione, nel DNA si incontreranno particolari sequenze
di basi alla fine del gene (terminatore) si avrà il termine della trascrizio-
ne. Il filamento di RNA messaggero si stacca ed il DNA si richiude e si
riavvolge Poiché i due filamenti si legano tramite appaiamento delle ba-
si azotate complementari, questi sono tra loro antiparalleli. Il prodotto
della trascrizione è denominato trascritto primario e consiste probabil-
mente in un filamento di RNA che si estende dal promotore al termi-
natore. Non si ha dimostrazione di ciò perché esso è molto instabile e
quindi difficile da isolare. La fase cruciale della produzione delle diver-
se forme di RNA è la maturazione a partire dai precursori. I complessi
trascritti primari degli rRNA e tRNA di procarioti ed eucarioti vengo-
no modificati in forme mature più semplici. Gli mRNA dei procarioti
non subiscono quasi mai modificazioni, mentre l’assemblaggio dell’mR-
NA degli eucarioti è piuttosto complesso. Negli eucarioti la trascrizione
genera dei precursori nucleari degli mRNA (trascritti primari), che ven-
gono in seguito convertiti negli mRNA maturi attraverso un processo
(splicing) che prevede la rimozione degli introni e il ricongiungimento
delle parti codificanti (esoni). Lo splicing avviene grazie a un apparato
enzimatico complesso in grado di riconoscere sequenze specifiche pre-
senti nelle zone di giunzione esone-introne, di rimuovere gli introni e di
ricongiungere correttamente tra loro i vari esoni. Una volta maturati, gli
mRNA, come le subunità ribosomiche e i tRNA, passano nel citoplasma
per svolgere la loro funzione nella sintesi proteica.
L’RNA messaggero (mRNA) rappresenta la classe di RNA più ete-
rogenea; infatti è costituita da filamenti contenenti tanti codoni quanti
sono gli amminoacidi delle proteine da loro codificate. RNA messagge-
ri codificanti per piccole proteine sono costituiti da alcune centinaia di
nucleotidi, quelli codificanti per proteine grandi ne comprendono varie
migliaia. Ogni mRNA è caratterizzato dal codone d’inizio. I tre codo-
ni UAA, UGA e UAG rappresentano invece il segnale di terminazione
della sintesi della catena polipeptidica. La precisione nell’andamento
lineare dei ribonucleotidi in gruppi di tre, non solo determina il corret-
to allineamento degli amminoacidi in una proteina, ma anche un esatto
punto di inizio e di conclusione della sua sintesi. L’RNA di trasporto
(tRNA) trasferisce ai ribosomi i vari amminoacidi che, uniti tra loro con

3.3 caratteristiche generali della trascrizione 35
legame peptidico, formano le proteine. Molti trascritti primari che ori-
ginano dai geni per i tRNA sono discretamente più lunghi rispetto alle
piccole molecole mature che si riversano nel citoplasma e che conten-
gono molte basi modificate. Come tutte le macromolecole trasportate
dal nucleo al citoplasma, anche i tRNA maturi vengono trasportati attra-
verso i pori nucleari, probabilmente associati a proteine specifiche che
ne facilitano il passaggio. Una volta giunti nel citoplasma, i tRNA ma-
turi si presentano come molecole piccole, costituite da 75-80 nucleotidi
che si appaiano tra loro in zone specifiche con ponti idrogeno tra basi
complementari, interrotte da tratti a singolo filamento. Tale situazione
determina una particolare conformazione a “trifoglio”, caratteristica per
tutti i tRNA. Nella cellula, tuttavia, questa molecola ha una complessa
organizzazione a forma di L rovesciata e contorta a spirale, poiché le
due anse laterali del trifoglio si avvicinano tra loro formando l’angolo
fra i bracci della L. Si distinguono circa venti tRNA, ciascuno specifico
per un determinato amminoacido. La parte più caratteristica della mo-
lecola del tRNA è l’ansa terminale, detta anticodone poiché porta tre
basi complementari ai codoni degli mRNA. Gli RNA ribosomiali (rR-
NA) costituiscono una famiglia di molecole che, assemblate insieme a
più di 50 diverse proteine, formano i ribosomi. I ribosomi sono gli or-
ganuli citoplasmatici che utilizzano le informazioni genetiche dell’RNA
messaggero e gli amminoacidi portati dagli RNA di trasporto per assem-
blare le proteine. Sono costituiti da due subunità classificate in termini
di Svedberg (S), una misura del coefficiente di sedimentazione di parti-
celle in sospensione sottoposte a centrifugazione: gli organuli cellulari
vengono infatti separati tramite centrifugazione in base alla loro diversa
densità. La lunghezza delle molecole di rRNA, la qualità delle proteine
costituenti ciascuna subunità e di conseguenza la grandezza di queste
ultime varia tra procarioti ed eucarioti. In base ai loro coefficienti di se-
dimentazione, i ribosomi sono stati suddivisi in due classi: - I ribosomi
70 S sono caratteristici dei procarioti e sono formati da una subunità 30
S e da una 50 S. - I ribosomi 80 S sono caratteristici degli eucarioti e
sono formati da una subunità 40 S e da una 60 S. Negli eucarioti i geni
che codificano gli rRNA sono localizzati nel nucleolo, che si rappresen-
ta come un corpicciolo sferico situato nel nucleo. Tale conformazione è
dovuta all’intensa attività trascrizionale che si attua al livello di questi
geni e dal quasi contemporaneo assemblaggio degli RNA alle proteine
ribosomiali.

36 il concetto di gene e trascrizione degli rna
3.4 un esempio approfondito: la tra-
scrizione negli eucarioti
Rispetto al caso dei procarioti, l’apparato di trascrizione negli organismi
eucariotici risulta molto più complesso. Tale complessità è legata da un
lato all’apparato enzimatico sia le sequenze non trascritte che modulano
l’attività del gene a questo livello.
Per la trascrizione negli eucarioti esistono tre RNA polimerasi: la
RNA polimerasi I, II e III. Esse hanno funzioni diverse e riconoscono,
quindi, promotori diversi. Ciascuna polimerasi è deputata alla sintesi di
un dato tipo di RNA come sintetizzato nella Tabella ??.
Tabella 3: Principali difference tra una cellula procariotica e una
eucariotica
Nome Localizz. Cellulare
Tipo RNA trascritto
RNA polimerasi I Nucleolo 45S(28S; 18S; 5.8S; rR-
NA)
RNA polimerasi II Nucleoplasma mRNA, snRNA,
snoRNA, miRNA
RNA polimerasi III Nucleoplasma tRNA; 5S rRNA; scR-
NA e alcuni snRNA
Tutte e tre le polimerasi sono costituite da un core, capace di polime-
rizzare e da fattori generali di trascrizione: i cosiddetti GTG (General
Transcription Factors). La differenza tra le varie polimerasi è proprio
legata alle varie subunità GTF che le compongono. Per esempio, i GTF
della RNA polimerasi II sono almeno sette: TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE,
TFIIF; TFIIH e TFIIJ. Questi lavorano di concerto con il core enzimatico,
per riconoscere il promotore , legare saldamente il DNA, srdotolarlo ed
interagire con altre proteine.
L’RNA polimerasi I riconosce tre sequenze come elemento promotore:
due sequenze che costituiscono l’elemento promotore core, situato da
-35 a + 15 rispotto al punto di inizio della trascrizione, ed una sequenza
detta elemento promotore a monte che si trova da -150 a -50.

3.4 un esempio approfondito: la trascrizione negli eucarioti 37
L’RNA polimerasi II riconosce il promotore caratterizzato da una se-
quenza particolare definita TATA box. Tale sequenza è localizzata ad
una distanza compresa tra -30 e -25 nucleotidi dal sito di inizio. Talvolta
è necessaria anche un’altra sequenza, distante circa -80 nucleotidi, defi-
nita CAAT box. Ma il funzionamento della RNA polimerasi II mostra
ulteriori elementi di complessità:
• ci sono infatti altre sequenze del DNA, localizzate fino a -200 basi
dall’inizio, possono legare degli attivatori. Questi sono delle protei-
ne che, a loro volta, possono essere connesse con l’RNA polimerasi
grazie all’azione di coattivatori o corepressori.
• Le sequenze di DNA che sono coinvolte con la modulazione della
trascrizione, possono arrivare ad essere distanti più di -1000 basi.
Queste sequenze vengono definite enhancer e legano proteine re-
golatrici che incrementano l’efficienza della trascrizione fino a 100
volte.
I promotori per l’RNA polimerasi I e per l’RNA polimerasi III non
hanno nè TATA box nè CAAT box.
3.4.1 Funzionamento della RNA polimerasi II
Il momento più importante dell’attività dell’RNA polimerasi II è il rico-
noscimento della TATA box da parte della TATA-binding protein o TBP,
che è una componente della TFIIB. A sua volta la TBP è associata ad altri
8-12 fattori, detti TAF (TBP Associated Factors). Il complesso TBP+TAF
costituisce il fattore TFIID. In seguito al legame di TFIID si possono le-
gare in sequenza TFIIA e TFIIB. Questo è un altro importante momento
perchè TFIIB è in grado di legare un attivatore posizionato più a monte
sul DNA. Ciò genera la formazione di una curva sul DNA che è essen-
ziale per la trascrizione. Si legano poi TFIIE, TFIIF, TFIIH e TFIIJ ed il
core dell’RNA polimerasi II per consentire lo srotolamento del DNA e
l’inizion della sintesi dell’mRNA grazie all’idrolisi di una molecola di
ATP.
Le Figure 7 e 8 schematizzano l’azione della RNA polimerasi II in
tutte le sue parti e le sue interazioni con le proteine attivatrici.

38 il concetto di gene e trascrizione degli rna
Figura 7: Attività dell’RNA polimerasi II ed interazione con l’attivatore
.
Figura 8: Il coattivatore coopera nell’induzione della trascrizione
legando TFIIB all’attivatore
.

3.4 un esempio approfondito: la trascrizione negli eucarioti 39
3.4.2 Termine della trascrizione
la trascrizione di un frammento di DNA, che solitamente rappresenta un
gene, inizia grazie ad una specifica sequenza di basi che prende il nome
di promotore. Il fine ultimo della traduzione è quello di formare seg-
menti di RNA corrispondenti a specifici geni espressi e, di conseguenza,
rendere possibile la formazione di materiale proteico, ribosomiale o al-
tri tipi di RNA. Per questo motivo se esiste un promotore deve esistere
anche un terminatore che possa indicare all’RNA polimerasi dove fer-
mare l’assemblaggio di RNA. In effetti il terminatore esiste nella catena
di DNA ma opera in maniera leggermente differente rispetto a quanto
abbiamo visto per il complesso fattore sigma-promotore. Esistono, a tal
proposito, due tipi di possibile terminazione:
• Terminazioni rho dipendenti.
• Terminazioni rho indipendenti od intrinseche.
Le replicazioni rho-indipendenti
In questo caso, un certo numero di coppi CG caratterizzano i siti ove la
trascrizione termina. Questi siti sono formati da catene palindromiche
che, sull’RNA, portano alla formazione di anse. Sembra che il forte
rallentamento della polimerasi al sito terminatore costituisca il segnale
per il rilascio del trascritto.
Le replicazioni rho-indipendenti
La proteina ρ è strutturalmente un esamero di circa 275 KDalton. Ha
caratteristica ATP-asica nel senso che può idrolizzare l’ATP per ricavare
energia ed è coinvolta nella cosiddette terminazione rho-dipendente.
La possibilità di idrolizzare il nucleotide trifosfato appariva una parti-
colarità insolita per una proteina che, in origine, sembrava dover blocca-
re la traduzione per semplice ingombro sterico, ovvero per interposizio-
ne tra la RNA polimerasi e la catena di DNA letta. In realtà la proteina
rho riconosce una specifica sequenza nell’RNA trascritto e grazie alla
presenza di questo gruppo di basi si lega ad essa e prosegue in direzio-
ne opposta rispetto alla direzione di sintesi della molecola di mRNA. In
altre parole, la proteina ρ, una volta riconosciuta la sequenza tipica, si

40 il concetto di gene e trascrizione degli rna
lega all’RNA ed “insegue” la catena lungo il verso della propria sintesi
fino a giungere alla RNA-polimerasi.

4 C O D I C E G E N E T I C O E
S I N T E S I P R OT E I C A
4.1 il codice genetico
4.1.1 Introduzione
Come detto nel Capitolo 3, l’espressione del programma genetico di una
cellula è effettuata attraverso due momenti principali: la trascrizione
e la traduzione. Il processo di trascrizione cellulare porta alla sintesi
di molecole di RNA a partire dal DNA. La traduzione è il passo in cui
la molecla intermedia di RNA (in particolare l’mRNA) viene letta per
sintetizzare le proteine. Si usa la parola traduzione in qanto il passaggo
da RNA a proteina prevede, in effetti, una traduzione dal linguaggio in
cui il DNA è scritto (il linguaggio dei nucleotidi che costituiscono gli
acidi nuckeici) a quello in cui le proteine sono scritte (il linguaggio degli
amminoacidi). Questa traduzione, inoltre, necessita la comprensione del
codice necessario a passare dai nucleotidi agli amminoacidi e per questo
si definisce codice genetico l’informazione contenuta nel DNA e RNA che
poi vengono tradotti in catene di amminoacidi, cioè in proteine.
4.1.2 Definizione
Essendo 22 il numero di amminoacidi che costituiscono le proteine tra-
dotte a partire dall’mRNA ed essendo solo 4 i nucleotidi che possono
variare in una catena di RNA, è evidente che l’unità elementare codifi-
cante deve essere costituita da un numero di nucleotidi maggiore di uno.
Ad un solo nucleotide infatti, non può corrispondere un amminoacido
perchè in tal caso avremmo una corrispondenza di quattro nucleotidi
con quattro amminoacidi.
Poichè le basi dell’RNA sono quattro (adenina, guanina, citosina ed
uracile, che nel DNA è sostituito dalla timina), un semplice calcolo com-
binatorio ci fa capire che l’unità elementare deve essere costituita da
tre nucleotidi. Sono quindi 4 3 = 64 le triplette (o codoni) che possono
41

42 codice genetico e sintesi proteica
codificare in un amminoacido. In realtà 61 di essi codificano gli ammi-
noacidi, mentre i restanti tre (UAA, UAG, UGA) codificano segnali di
stop (stabiliscono, cioè, a che punto deve interrompersi l’assemblamen-
to della catena polipeptidica). Poiché gli amminoacidi che concorrono
alla formazione delle proteine sono 20, essi in generale sono codificati
da più di un codone (con l’eccezione di triptofano e metionina). Il codi-
ce genetico è pertanto detto degenere e codoni distinti che codificano il
medesimo amminoacido si dicono sinonimi.
Possiamo a questo punto dare una definizione operativa di codice ge-
netico come l’insieme di codoni (o triplette) di acidi nucleici a cui cor-
rispondono i vari amminoacidi più i codoni di termine. Due proprietà
fondamentali del codice genetico sono:
• Per produrre la corretta sequenza di amminoacidi di una proteina
i codoni sono letti in modo continuo
• E’ degenere perchè più triplette codificano per lo stesso amminoa-
cidi
La Figura 9 riporta tutte i 64 codoni con i corrispondenti amminoaci-
di codificati. La degenerazione del codice è evidente dal fatto che più
codoni codificano per lo stesso amminoacido. I codoni UAA, UAG e
UGA non codificano nessun amminoacido e sono detti codoni non-senso.
I codoni non-senso rappresentano dei segnali di stop nella fase di tradu-
zione anche se, talvolta, possono anche codificare per gli amminoacidi
selenocisteina e pirrolisina.
Il codice genetico descritto è universale, cioè in tutti gli organismi
(procarioti ed eucarioti), il codice è esattamente identico con l’eccezione
di alcuni codoni mitocondriali che, invece, hanno un diverso significato
rispetto quelli dell’mRNA citoplasmatici.
4.2 il processo di traduzione
L’mRNA, sintetizzato nel nucleo cellulare e poi migrato all’interno del
citoplasma, sarà quindi letto e tradotto dal cosiddetto apparato di tradu-
zione che interpreterà le varie triplette di nucleotidi. La lettura dell’mR-
NA avviene in direzione 5’P → 3’OH, mentre la direzione della sintesi

4.2 il processo di traduzione 43
Figura 9: Figura che riporta i 64 codoni e gli amminoacidi corrispondenti
ad ognuno di essi
.
della corrispondente proteina va dall’estremo ammino-terminale (NH2)
a quello carbossi-terminale (COOH).
4.2.1 L’apparato di traduzione: i ribosomi e il tRNA
I ribosomi
I ribosomi sono organelli immersi nel citoplasma - o ancorati al reticolo
endoplasmatico ruvido - e sono le particelle responsabili della sintesi
proteica. La loro funzione è quindi quella di sintetizzare le proteine
leggendo le informazioni contenute in una catena di RNA messaggero
(m-RNA).
Furono messi in evidenza per la prima volta al microscopio elettronico
nel 1953 dal biologo rumeno George Emil Palade, scoperta che gli valse
il Premio Nobel. Il termine ribosoma fu invece proposto nel 1958 dallo
scienziato Richard B. Roberts.
I ribosomi sono formati da tre molecole di RNA ribosomiale e da

44 codice genetico e sintesi proteica
proteine che si associano a formare due subunità di dimensioni differenti
(una più grande dell’altra). I ribosomi dei batteri, degli archea e degli
eucarioti differiscono sensibilmente tra loro sia per la struttura sia per le
sequenze di RNA.
Un ribosoma batterico ha una massa di circa 2700 kDa, un diametro
di circa 20 nm ed un coefficiente di sedimentazione di 70 S. Esso si può
suddividere in due parti o subunità, una più grande ed una più piccola:
• una subunità grande di 50 S avente almeno 34 proteine e due
molecole di RNA (23 S e 5 S),
• una subunità piccola di 30 S contenente almeno 21 proteine (S1-
S21) ed un RNA di 16 S.
Il ribosoma della cellula eucariota (fatta eccezione per quelli contenuti
nei mitocondri e nei cloroplasti), invece, è più grande ed ha una massa
molecolare di 4000 kDa, un diametro di 23 nm ed un coefficiente di se-
dimentazione di 80 S. Anch’esso è composto da due subunità, maggiore
a 60 S e minore a 40 S:
• la subunità maggiore è costituita da tre molecole di rRNA, una a
28 S, una a 5,8 S e un’ultima a 5 S.
• la minore consta di una sola catena di rRNA 18 S. Nel complesso
le due subunità presentano inoltre più di 80 proteine.
Le singole molecole di rRNA (tranne la 5 S) vengono sintetizzate nei
nucleoli come RNA 45 S. Il DNA contenuto nel nucleolo viene trascrit-
to dalla RNA polimerasi I a partire da più punti della catena di DNA,
in strutture che vengono dette ad albero di Natale; il tronco verrebbe
rappresentato dal DNA, i rami dalle molte catene di rRNA che vengono
trascritte nello stesso momento. rRNA 45 S appena trascritto è detto pre-
rRNA; in seguito a tagli, esso darà origine a rRNA 18 S (per la subunità
minore del ribosoma) e 32 S, il quale verrà tagliato ulteriormente in 28 S
e 5,8 S. Nel pre-rRNA sono presenti pseudouridine e basi azotate meti-
late. La funzione di queste modifiche nelle basi si pensa sia di evitare il
taglio enzimatico, o favorire le interazioni dell’RNA interne alla catena
o con altre molecole. La Figura 10 mostra un confronto tra le dimensioni
delle varie parti dei ribosomi eucariotici e procariotici.

4.2 il processo di traduzione 45
Figura 10: Confronto tra le dimensioni dei ribosomi eucariotici e
procariotici
.
I tRNA
I tRNA o RNA transfer, sono quella categoria di acidi ribonucleici depu-
tati al trasporto degli amminoacidi ai ribosomi dove le catene polipepti-
diche verranno formate. Essi vengono generalmente raffigurati con una
forma a trifoglio (vedi Figura 11) mentre analisi a diffrazione X mostra-
no che la loro struttura tridimensionale è ad L rovesciata come quella
raffigurata in Figure 12.
Partendo dalla estremità 3’-OH, la prima sequenza che si incontra è
la 5’P-CCA-3’OH. Tale parte della molecola è definito accettore perchè è
quello deputato a legare l’amminoacido (Figura 11). L’enzima che lega
l’amminoacido al sito accettore si chiama amminoacil-tRNA-sintetasi. l
primo braccio che si incontra (a sinistra della Figura 11, è quella che è
definita l’ansa TΨC (Ψ = pseudouracile). Si ritiene che la funzione prin-
cipale dell’ansa TΨC abbia la funzione principale di ancorare meglio
il tRNA al ribosoma interagendo l’rRNA 5S della sub-unità maggiore.
Proseguendo ancora verso l’estremità 5’ si incontra un’ansa variabile la
cui funzione è quella di mantenere costanti le dimensioni dei vari tRNA.
Proseguendo ancora si giunge all’ansa dell’anticodone: questa possiede
tre nucleotidi che si appaiono in disposizione antiparallela, ai tre nucleo-
tidi del codone dell’mRNA. ll quarto e ultimo braccio termina con l’ansa

46 codice genetico e sintesi proteica
.
Figura 11: Rappresentazione a trifoglio del tRNA
D che contiene diidrouracile. Essa contribuisce a influenzare il ripiega-
mento della molecola del tRNA. Con il riarrangiamento dello scheletro
dell’ansa dell’anticodone, inizia una serie di cambiamenti conformazio-
nali nel tRNA che portano allo smascheramento dei siti di legame per
il ribosoma in altre posizioni del tRNA, come l’ansa D e l’ansa TphiC.
Dal momento che questi cambiamenti conformazionali sono dipenden-
ti dall’interazione corretta codone-anticodone, essi contribuiranno alla
specificità dipendente dal codone della reazione di legame del tRNA.
Quindi, il rafforzamento dell’interazione del tRNA complementare con
il ribosoma è ottenuta attraverso siti di legame non specifici che vengono
messi in gioco dai cambiamenti conformazionali dipendenti dal codone
del tRNA.
4.2.2 La traduzione
Il processo di traduzione che porterà alla formazione di una proteina a
partire dalla lettura di un tratto di mRNA, può essere concettualmente
e temporalmente diviso in due fasi:

4.2 il processo di traduzione 47
Figura 12: Rappresentazione tridimensionale di una molecola di tRNA
(L’inserto riporta, per confronto, la struttura bidimensionale
a trifoglio)
.
1. La fase ATP dipendente
2. La fase GTP dipendente
La fase ATP-dipendente è quella che porta al legame di un certo ammi-
noacido con uno specifico tRNA. Tale complesso, anche detto amminoacil-
tRNA, è mediato da una specifica classe di enzimi detti amminoacil-
tRNA sintetasi. La formazione del complesso avviene in due fasi: la
prima è la formazione dell’anidride mista tra il COOH dell’amminoaci-
do ed il residuo fosforico dell’AMP (che deriva dall’ATP per liberazione
del pirofosfato). La seconda fase è la reazione (mediata dall’amminoacil-
tRNA sintetasi) del complesso amminoacil-AMP con il terminale 3’OH
del tRNA con conseguente perdita dell’AMP ed idrolisi del pirofosfato
formatosi in precedenza.
La fase GTP-dipendente può essere a sua volta divisa in tre fasi:
• L’inizio
• L’allungamento
• Il termine

48 codice genetico e sintesi proteica
L’inizio
L’inizio della traduzione avviene a seguito di una corretta interazione,
all’interno del citoplasma, tra ribosoma, tRNA e mRNA. Inoltre la giu-
sta cornice di lettura sull’mRNA deve essere individuata. Sull’mRNA
deve essere indiviaduato il corretto codone che rappresenta il segnale di
inizio della traduzione (generalmente la tripletta AUG o GUG). Si è inol-
tre visto che (Shine e Dalgarno, 1974) che al 5’ dell’mRNA, prima della
tripletta di inizio, c’è un segnale specifico costituito da basi (generalmen-
te 5’-AGGAGGU-3’) complementari alla sequenza 3’-UCCUCA-5’ posta
invece sull’rRNA 16S. Tale segnale consente alla subunità minore del ri-
bosoma di adagiarsi sull’mRNA posizionandosi in modo da individuare
l’AUG di inizio e, quindi, la giusta cornice di lettura. A questo punto
il primo amminoacido specificato dalla sequenza AUG iniziatrice, viene
portato: esso è la formil-metionina. A questo punto si verifica l’assem-
blaggio della subunità maggiore del ribosoma (la 50S) il cui complesso
risulta essere molto stabile. Il ribosoma è a questo punto completo e su
di esso si individua:
• Un sito P (peptidilico, occupato dal tRNA fmet
• Un sito A (amminoacilico), vuoto, posizionato sulla tripletta suc-
cessiva
• Un sito E (exit)
L’allungamento
Si intende per allungamento quella fase della traduzione durante la quale
arriva nel sito A un successivo amminoacido, richiesto dalla tripletta se-
guente. L’allungamento è mediato da fattori specifici EF-Ts-Tu e EFG. La
posizione del tRNA sul ribosoma dovrà essere tale che il centro peptidil-
transferasico della subunità maggiore (rRNA 5S e 23S) possa favorire la
formazione del legame pedtidico fra il COOH dell’amminoacido legato
al tRNA che occupa il sito P e l’NH2 dell’amminoacido posto sul tRNA
giunto sul sito A. terminata questa fase, il fattore EFG (detto di allunga-
mento) promuovo lo slittamento del ribosoma sulla tripletta successiva..
In questa fase il sito E sarà caratterizzato dal tRNA ormai scarico che
ora verrà espulso dal sistema.

Termine della traduzione
4.2 il processo di traduzione 49
La presenza di più codoni non senso, stimola la comparsa dei fattori di
rilascio RF1, RF2 e RF3 che in combinazione EFG, promuovo la libe-
razione della catena polipeptidica. Il fattore RRF (Ribosome Releasing
Factor) dividerà quindi novamente le due subunità dei ribosomi.
4.2.3 La traduzione negli eucarioti
L’inizio della traduzione eucariotica è molto più complesso. Abbiamo
visto che dopo la trascrizione l’mRNA viene processato mediante gli
eventi di “maturazione” che consistono nel capping e nella poliadeni-
lazione. Questi eventi servono per aumentare il livello di traduzione e
sono assenti nei procarioti. Esistono differenze sostanziali tra i fattori
di inizio della traduzione rispetto ai procarioti. La risposta è afferma-
tiva in quanto negli eucarioti ci sono un numero maggiore di elementi
che coadiuvano l’inizio del processo che rendono più complesso tutto
il sistema. C’è da considerare che l’mRNA eucariotico presenta alcune
strutture peculiari tra cui il CAP ed una potenziale forcina che devono
essere trattate affinché il ribosoma possa compiere il proprio lavoro.
Se nei procarioti il primo aminoacido incorporato nella neonascente
catena polipeptidica è la formilmetionina negli eucarioti il corrispettivo
aminoacido è la metionina. Il codone principale di start è sempre AUG
ma c’è una diversità riguardante il modo con il quale il ribosoma arriva
a questo codone rispetto a quanto avviene nei batteri. Esperimenti han-
no dimostrato che esiste una sequenza consensus altamente conservata
che circonda il codone di start. La sequenza prende il nome dalla sua
scopritrice Marylind Kozak che la propose nel 1975. Questa sequenza è:
CCA/GCCAUGC
Esistono delle variazioni a questa sequenza che, comunque, è un mo-
dello che fa parte delle cosiddette regole di Kozak che determinano la
formazione ideale di un ORF, ovvero di un open reading frame. Un ORF
non è altro che una parte dell’mRNA che, potenzialmente, può codifica-
re per una proteina; questa sequenza è data dalla presenza di una zona
di “inizio” e da un terminatore, la cui struttura verrò proposta in avanti.
Gli mRNA eucariotici vengono definiti monocistronici, essendo il ci-
strone corispondente ad un solo messaggio. Ciò li differenzia dagli mR-
NA batterici che vengono invece detti policistronici possedendo nella

50 codice genetico e sintesi proteica
loro sequenza l’informazione per produrre più di una proteina.
La Figura 13 mostra il meccanismo con il quale, al livello dei ribosomi,
è costruita la catena polipeptidica a partire dall’mRNA.
Figura 13: Rappresentazione grafica della traduzione dell’mRNA in una
catena polipeptidica in un sito ribosomiale
.

5 M U TA Z I O N I ,
P O L I M O R F I S M I ,
.
M E TO D O L O G I E
A N A L I T I C H E
5.1 le mutazioni
5.1.1 Introduzione
I genomi di tutti gli organismi viventi (inclusi quelli mitocondriali) non
rappresentano entità statiche, ma piuttosto sono soggetti a differenti tipi
di variazioni ereditabili che globalmente, vanno sotto il nome di muta-
zioni. La mutazione è pertanto definibile come un evento casuale ma
stabile che, di fatto, produce un cambiamento ereditabile del patrimo-
nio genetico. Tale variazioni, nella maggior parte dei casi, avvengono
a livello nucleotidico; riguardano cioè la qualità, il numero, la sequen-
za dei nucleotidi del DNA e modificano il significato dell’informazione.
Questo tipo di mutazione vengono dette mutazioni geniche o puntifor-
mi. Ad un’altra categoria appartengono le mutazioni che alterano la
struttura dei cromosomi o addirittura il loro numero; queste prendono
rispettivamente il nome di mutazioni cromosomiche e genomiche.
Volendo provare a schematizzare le principali caratteristiche e i prin-
cipali aspetti delle mutaioni possiamo dire che esse possono essere:
• dominanti: se interessano un allele dominante;
• recessive: se interessano un allele recessivo.
Possono interessare le cellule:
• somatiche: si manifesteranno se sono dominanti, se si verificano
in un certo stadio dello sviluppo e se insorgono in alcune parti
dell’organismo (se sono coinvolti geni delle crescita cellulare si
può avere la trasformazione tumorale della cellula). NON sono
trasmissibili alla progenie;
51

52 mutazioni, polimorfismi, metodologie analitiche
• germinali: coinvolgono i gameti e quindi SONO ereditabili.
Ricordando quelo che abbiamo già detto, le mutazioni in base all’am-
piezza del cambiamento possono essere:
• geniche o puntiformi: uno o più nucleotidi;
• cromosomiche: uno o più cromosomi;
• genomiche: intero genoma.
Le mutazioni possono ancora essere distinte in:
1. indotte: sono causate da agenti mutageni;
2. spontanee: insorgono in condizioni normali in assenza di specifici
agenti esterni identificabili.
Le mutazioni spontanee sono molto rare. Hanno un ruolo importante
in fenomeni biologici quali l’evoluzione e la cancerogenesi, e probabil-
mente sono implicate anche nell’invecchiamento, malattie autoimmuni,
neurodegenerazione, aterosclerosi. Il tasso di mutazione spontanea è il
risultato di una serie di fattori endogeni ed esogeni che possono essere
sia mutageni che antimutageni. Spontaneamente sono prodotti tutti i
tipi di mutazione genica: sostituzione di base, inserzioni, duplicazioni
e delezioni. Le mutazioni indotte si verificano con maggiore frequen-
za in alcuni siti definiti punti caldi (hot spots), come quelli contenenti
5-metil-citosina.
Le cause possono essere:
• esogene: presenza nell’ambiente di agenti mutageni come radia-
zioni cosmiche, radionuclidi, analoghi di base del DNA e altri
composti chimici che possono interagire casualmente con il DNA;
• endogene: sono correlate a processi fisico-chimici, quali rottura
dell’elica del DNA in seguito ad idrolisi, oppure errori che si
verificano nel corso dei processi fisiologici.
Si definisce tasso di mutazione è la probabilità che una particolare
mutazione si verifichi nel tempo. Nell’uomo il tasso di mutazioni spon-
tanee per geni singoli è compreso in un range che va da 10 −4 a 10 −6
/gene/generazione.

5.1.2 Le mutazioni geniche o puntiformi
5.1 le mutazioni 53
Sono cambiamenti della sequenza nucleotidica del DNA. Si possono
verificare per: sostituzione di base; inserzione/duplicazione/delezione
(anche dette di frameshift). Il cambiamento può riguardare una o poche
basi; nel primo caso si parla più propriamente di mutazioni puntiformi.
Le sostituzioni di base si suddividono in:
• transizioni: sostituzione di una purina (A, G) con un’altra purina
o di una pirimidina (T, C) con un’altra pirimidina; è mantenuto
l’orientamento purina:pirimidina nelle due eliche;
• transversioni: sostituzione di una purina con una pirimidina o vi-
ceversa; l’orientamento delle purine e pirimidine nelle due eliche
è invertito.
La mutazione frameshift è dovuta a inserzione o delezione di una o po-
che coppie di basi (mai nel numero di tre o multipli di tre) in regioni
codificanti o non. Ne deriva uno scorrimento del frame di lettura dal
sito mutato in poi. Se la base o sequenza inserita è identica a quella
precedente si parla di duplicazione.
Le sostituzioni di basi possono creare mutanti:
• di senso o missense (cioè di significato diverso): inserimento di
un aminoacido sbagliato in un polipeptide per cui si ha la produ-
zione di una proteina difettosa. Determinano una riduzione della
funzione.
• nonsenso: la tripletta modificata non codifica per alcun aminoaci-
do ma per un codone di stop (UAA, UGA, UAG) per cui si ha la
produzione di proteine tronche. Le conseguenze di un simile cam-
biamento sono spesso gravi perchè il danno è più esteso rispetto
ad una mutazione missense.
• Un altro tipo di mutazione puntiforme è quella detta per inser-
zione o delezione che sono le responsabili delle cosiddette muta-
zioni frameshift (o scivolamento della cornice di lettura). Queste
mutazioni sono così denominate perchè al semplice inserimento
o eliminazione di un nucleotide ne consegue, durante la traduzio-
ne sui ribosomi, una lettura del messaggio fuori fase a partire dal
punto della mutazione in poi.

54 mutazioni, polimorfismi, metodologie analitiche
La conseguenza fenotipica di ciò potrà essere:
• sia la sintesi di una catena polipeptidica non del tutto funzionale
• sia la produzione di un frammento polipeptidico tronco se, per
caso, con lo scivolamento si forma un codone nonsense (di stop)
prematuro.
Sia nel caso delle sostituzioni di base che in quello delle inserzioni pos-
sono occorrere le cosiddette mutazioni neutre e silenti. La mutazione
è detta silente quando porta alla formazione di una nuova tripletta che
codifica per lo stesso aminoacido a causa della degenerazione del codice
genetico quindi non c’è una variazione fenotipica. La mutazione è detta
neutra quando non ha effetto sul fenotipo (perchè la nuova tripletta co-
difica per un amminoacido con le stesse caratteristiche chimico-fisiche di
quello originale) e passa inosservata. Una mutazione neutra si verifica
quando:
• la tripletta mutata codifica per un aminoacido diverso che però
non altera la funzione della proteina;
• la mutazione coinvolge un gene che codifica per una proteina non
indispensabile;
• il gene mutato non si esprime;
• la mutazione è soppressa da un’altra mutazione.
Una caratteristica delle mutazioni geniche, in particolare di quelle
puntiformi, è la reversibilità cioè la capacità di ridare, in seguito ad una
successiva mutazione, il fenotipo normale.
Espansioni di triplette di nucleotidi
Distribuite sia in tutto il genoma umano come in quello di altri organi-
smi si trovano delle sequenze di DNA ripetute in tandem e di lunghezza
variabile. Esse sono dette microsatelliti quando sono costituite da 1 a 6
nucleotidi, minisatelliti quando hanno una lunghezza più lunga e du-
pliconi se sono tanto lunghe da includere interi geni.
Può accadere che in una data regione di DNA, che codifica per una
proteina, si presentino ripetizioni in tandem di soli tre nucleotidi. La
presenza della ripetizione di un numero così piccolo di nucleotidi, può

5.1 le mutazioni 55
provocare l’insorgenza di mutazioni. Tale mutazioni (chiamate di espan-
sione delle triplette), in particolare, riguardano la diminuzione o l’au-
mento di tali ripezioni. Questo si traduce in un variazione del numero
di copie di trinucleotidi presenti in un certo gene. Tale variazione, in
negativo (diminuzione) o in positivo (espansione) può portare a fenotipi
patologici. In particolare le patologie sono legate a quelle che prendono
il nome di espansioni instabili che corrispondono al caso in cui la ri-
petizione è molto pronunciata. In quest’ultimo caso, in fatti, si possono
determinare alterazioni di alcuni domini fondamentali per la proteina
da sintetizzare. In casi estremi, l’espansione di tali triplette causa o la
perdita dell’espressione genica o l’alterazione completa della loro funzio-
nalità. L’espressione riguarda soprattutto, triplette quali CAG o CGG la
cui ripetizione risulta contenuta (ma entro certi limiti) nella popolazione
generale. Tali limiti sono invece superati negli individui affetti da talune
condizioni patologiche, a decorso progressivo, che causano degenerazio-
ne del sistema nervoso. L’espansione è probabilmente dovuta a due tipi
di eventi:
1. durante la replicazione del DNA, in presenza di semplici sequen-
ze ripetute, a causa di appaiamenti sfalsati, si può verificare o
scivolamento del filamento di stampo sul filamento in sintesi (o
viceversa) e ciò determina l’inserimento o la delezione di singole
unità ripetute. Tale fenomeno è detto slippage mispairing.
2. eventi di crossing over ineguali possono provocare l’aumento o
la diminuzioni di grosse regioni contenenti ripetizione da una
generazione all’altra
Queste mutazioni, inoltre, sono anche dette dinamiche perchè, nel corso
delle diverse generazioni, si può osservare espansione così come riduzio-
ne delle triplette. Proprio da questo deriva il nome ’instabili’. Tra le pato-
logie determinate dalle espansioni instabili ricordiamo l’Atrofia muscolare
spinale e bulbare, il Morbo di Huntington, la Sindrome dell’X-Fragile.
5.1.3 Le mutazioni cromosomiche
Le mutazioni cromosomiche possono essere classificate in due gruppi
principali: numeriche (poliploidia e aneuploidia): cambiamenti nel nu-
mero di interi assetti cromosomici oppure modificazioni nel numero di

56 mutazioni, polimorfismi, metodologie analitiche
singoli cromosomi; strutturali (aberrazioni cromosomiche): modificazio-
ni nella sequenza del DNA lungo l’asse del cromosoma in seguito ad
eventi di rottura del cromosoma stesso. Quando questi eventi di rot-
tura sono seguiti da riunioni e quindi una riorganizzazione struttura-
le del cromosoma, si parla di riarrangiamenti strutturali, altrimenti si
definiscono delezioni.
Le mutazioni cromosomiche numeriche
Si distinguono in:
• Poliploidia: cambiamento di interi assetti cromosomici cioè il nu-
mero dei cromosomi di un organismo è un multiplo del numero
aploide di quella specie.
• Aneuploidia: modificazione del numero di singoli cromosomi che
determinano un ineguale numero a carico della coppia cromoso-
mica
Le anomalie che interessano gli autosomi sono spesso letali (aborti pre-
coci o morte perinatale) oppure si accompagnano a fenotipi anormali
facilmente rilevabili (es. trisomia del cromosoma 18 nel bovino che si
associa ad una grave forma di brachignatismo; trisomia del cromosoma
27 nel cavallo associata ad artrogrifosi). Le anomalie che interessano i
cromosomi sessuali sono compatibili con la vita ma si associano a gravi
problemi di fertilità o in taluni casi a sterilità.
Tipico esempio di aneuplodia è la sindrome di down. Essa prende il
nome dal medico di base inglese John Langdon Down, che la descrisse
nel 1866 con la semplice osservazione. Nel 1958 Jerome Lejeune, geneti-
sta francese, osserva la correlazione tra la presenza della sindrome e la
presenza in tre copie del cromosoma 21 nelle cellule (trisomia 21), dimo-
strando per la prima volta nella storia della Medicina il legame specifico
tra una sindrome e una variazione del materiale genetico. Si riscontra in
tutte le regioni geografiche e in tutti i gruppi etnici con la stessa frequen-
za: 1/400 concepiti, e 1/700 nati vivi, poiché in molti casi si ha aborto
spontaneo. I sintomi comprendono: una facies caratteristica (rima pal-
pebrale obliqua dall’alto verso il basso dall’esterno all’interno, radice
appiattita del naso, lingua grande in proporzione alla bocca, pieghe del-
le palme delle mani - dermatoglifi - caratteristiche, ampio spazio tra il

5.1 le mutazioni 57
I e il II dito del piede); ritardo mentale, in realtà di grado molto varia-
bile anche a seconda dell’educazione ricevuta, che interessa il pensiero
simbolico, con affettività e socialità conservate; malformazioni cardiache
nel 30 − 40% dei casi; ipotonia muscolare; aumentato rischio di leucemia,
in particolare megacarioblastica (proliferazione anomala di cellule di ti-
po megacariocitario); disturbi immunitari ed endocrini; invecchiamento
biologico precoce per alcuni aspetti simile a quello osservato nel morbo
di Alzheimer.
Le mutazioni cromosomiche numeriche dei cromosomi sessuali
Esempi di mutazioni cromosomiche numriche legate ai cromosomi ses-
suali sono:
1. La sindrome di Turner o monosomia X (X0): soggetti con genitali
esterni femminili ma con gonadi assenti o atrofiche;
2. la sindrome di Klinefelter (XXY): soggetti fenotipicamente maschi-
li ma con atrofia testicolare e ginecomastia;
3. la sindrome del triplo X (XXX): soggetti fenotipicamente femmi-
nili a volte normali ma sterili, in altri casi presentano mancato
sviluppo somatico.
4. Freemartinismo o mosaicismo ertitrocitario (XX/XY): è un esem-
pio di intersesso che si verifica soprattutto nella specie bovina (ra-
ramente nelle specie ovina e suina), nel 92% delle gravidanze ge-
mellari quando i due feti gemelli sono di sesso opposto. I maschi
sono generalmente normali e fertili mentre le femmine sono ste-
rili. Fenotipicamente presentano i genitali esterni, ma in genere
l’utero non è sviluppato e le ovaie possono presentare contempo-
raneamente tessuto ovarico e testicolare. Negli stadi iniziali dello
sviluppo si verifica una fusione delle membrane fetali, con con-
seguente anastomosi dei vasi placentari, in tal modo si verifica
uno scambio degli ormoni prodotti nei due feti di sesso diverso
e dei linfociti e delle altre cellule del sangue. Gli ormoni ma-
schili sono secreti dal testicolo del vitello prima che l’ovaio della
gemella sia completamente sviluppato e impediscono il normale
accrescimento sia dell’ovaio che delle vie genitali.

58 mutazioni, polimorfismi, metodologie analitiche
Le mutazioni cromosomiche strutturali
Tali mutazioni prevedono la rottura ed il rimaneggiamento della struttu-
ra dei cromosomi. Affinchè una variazione di struttura del cromosoma
sia tale è necessario che sia visibile al microscopio; essa deve pertan-
to coinvolgere almeno 6x10 6 coppie di basi, cioè lo 0.2% del genoma
umano. Esistono quattro tipi principali di mutazioni cromosomiche che
implicano cambiamenti nella struttura del cromosoma:
• delezioni e duplicazioni: comportano un cambiamento nella quan-
tità di DNA;
• inversioni: comportano un cambiamento nell’orientamento di un
tratto cromosomico;
• traslocazioni: implicano un cambiamento nella localizzazione di
un segmento cromosomico
Tutte queste mutazioni hanno origine da una o più rotture nel cro-
mosoma. Se una rottura si verifica all’interno del gene, la sua funzione
può andare perduta. Pertanto i danni saranno strettamente correlati al-
l’informazione genetica che viene persa. Da un punto di vista clinico,
sono interessanti le anomalie bilanciate cioè associate a situazioni di eu-
ploidia, che non comportano alterazioni fenotipicamente visibili ma che
spesso sono associate a problemi di fertilità.
La delezione è caratterizzata dalla perdita di un tratto di un cro-
mosoma in seguito ad una rottura che può essere indotta da diversi
agenti eziologici: la temperatura, le radiazioni (in particolare quelle
ionizzanti), virus, sostanze chimiche o da errori nella ricombinazione.
Mancando un segmento cromosomico, le delezioni non sono reversibili.
Le conseguenze dipendono da geni o dalle parti di geni che vengono
rimossi.
La duplicazione è caratterizzata dal raddoppiamento di un tratto di
un cromosoma. La dimensione del tratto duplicato può variare ampia-
mente e segmenti duplicati possono trovarsi in punti diversi del genoma
oppure in una posizione tandem (cioè l’uno vicino all’altro testa-coda).
L’inversione Si verifica quando un segmento cromosomico viene ta-
gliato e poi reintegrato nel cromosoma dopo rotazione di 180 ◦ rispetto
all’orientamento originale. Vi sono due tipi di inversione:
1. Inversione pericentrica: comprende il centromero;

2. Inversione paracentrica: non comprende il centromero.
5.1 le mutazioni 59
Il materiale genetico non viene perduto, però possono esservi delle
conseguenze fenotipiche se i punti di rottura sono all’interno di un gene
o entro regioni che controllano l’espressione di un gene. Le conseguenze
meiotiche:
• se l’inversione è allo stato omozigote, la meiosi è normale;
• se l’inversione è allo stato eterozigote, il crossing-over comporta
gravi conseguenze genetiche.
I prodotti del crossing-over saranno diversi a seconda del tipo di in-
versione. A causa della presenza di un tratto invertito su un omologo,
l’appaiamento dei cromosomi omologhi richiede la formazione di anelli
o anse di inversione, contenenti i tratti invertiti.
La traslocazione è una mutazione cromosomica consistente nel cam-
biamento di posizione di segmenti cromosomici e quindi delle sequenze
geniche in essi contenute. Non vi è né aumento né perdita di materiale
genetico. Vi sono tre tipi di traslocazioni semplici:
• La traslocazione intracromosomica non reciproca (entro un cromoso-
ma): cambiamento di posizione di un tratto cromosomico entro lo
stesso cromosoma;
• La traslocazione intercromosomica non reciproca (tra cromosomi): spo-
stamento di un segmento cromosomico da un cromosoma ad un
altro non omologo;
• La traslocazione intercromosomica reciproca: scambi di tratti non
omologhi tra tratti non omologhi.
Un famoso esempio di traslocazione è quello rappresentato dal cromo-
soma Philadelfia. In questo caso si osserva una traslocazione reciproca che
vede coinvolti i cromosomi 9 e 22. In particolare il proto-oncogene abl, in
seguito ad uno scambio reciproco, passa dal cromosoma 9 al cromosoma
22. Questo semplice spostamento induce una trasformazione neoplasti-
ca che condurrà alla leucemia mieloide cronica con crescita incontrollata
dei mieloblasti (cellule staminali dei globuli bianchi del sangue).
Un’altro tipo di traslocazione è quella non-reciproca dovuta al trasfe-
rimento di una estremità di un cromosoma sul centromero di un cromo-
soma acrocentrico. E’ questo il caso della cosiddetta fusione centrica o

60 mutazioni, polimorfismi, metodologie analitiche
traslocazione robertsoniana. Nel 5% dei casi la sindrome di Dawn (det-
ta sindrome di Dawn familiare) è dovuta ad una forma di traslocazione
robertsoniana. Negli altri casi la sindrome di Dawn è legata alla trisomia
del cromosoma 21 che è un tipo di mutazione genomica (vedi 5.1.4).
5.1.4 Le mutazioni genomiche
Le mutazioni genomiche sono quelle che, più generalmente, possono
interessare l’intero genoma. In pratica sono quelle mutazioni che sono
legate ad una variazione del numero dei cromosomi totali.
Gli individui di una specie che portano nelle proprie cellule un nu-
mero cromosomico differente da quello caratteristico vengono detti ete-
roploidi ed eteroplodia viene detta la mutazione corrispondente. Un
assetto diverso del numero dei cromosomi sono la conseguenza di er-
rori della distribuzione ei cromosomi durante le divisioni cellulari. Tali
assetti possono essere divisi in due categorie:
• Euplodia: condizione in cui il numero di cromosomi è variato per
interi set aploidi;
• Aneuploedia: quando la variazione del numero cromosomico è
riferita ad una singola coppia o unità cromosomica. Essa è quindi
riferita ad uno o a pochi cromosomi.
Gli individui sono detti monoploidi quando presentano soltanto il
numero n di cromosomi caratteristico della specie (in pratica il termine
monoploide è equivalente alla aploidia). La condizione di poliploidia,
invece, si ha la variazione di numero per interi multipli del set aploide.
Esistono così individui triploidi, tetraploidi, etc. Nella specie umana,
la triplodia e la tetraplodia sono condizioni che si riscontrano con una
qualche frequenza (circa il 25% di aborti spontanei sarebbe causata da
queste condizioni) e non sono compatibili con la vita. Tutte i fenotipi
patologici che si riscontrano non sono quindi legati a stati di eupledia
ma di aneuplodia.
Vediamo ora di elencare alcune aneuplodie umane le cui conseguen-
ze fenotipiche sono fondamentalmente provocate dall’azione cumulati-
va di dosaggi genici anomali. La Figura 14 riporta l’elenco di alcune
aneuploidie umane da non disgiunzione.

5.1 le mutazioni 61
Figura 14: Alcune aneuploidie umane da non disgiunzione
.

62 mutazioni, polimorfismi, metodologie analitiche
Naturalmente dobbiamo dobbiamo distinguere tra aneuplodie auto-
somiche e aneuplodie che interessano i cromosomi sessuali (dette aneu-
plodie sessuali). Tra le prime ricordiamo la Trisomia del cromosoma 21
(conosciuta con il nome più famoso di sindrome di Down), la Trisomia
del cromosoma 18 (o sindrome di Edwards) e la Trisomia del cromosoma 13
(o sindrome di Patau).
Tra le aneuploidie sessuali ricordiamo la Trisomia XXY anche detta
Sindrome di Klinefelter, la Trisomia XYY e la Monosomia del cromosoma
X o sindrome di Turner.
5.1.5 Altri fenotipi patologici legati a mutazioni
Ipercolesterolemia familiare
Si tratta di una patologia autosomica dominante che interessa 1/5000
individui. Essa è caratterizzata da colesterolemia elevata pari a 300-600
mg/dl, dovuta all’accumulo di colesterolo-lipoproteine a bassa densità
(LDL). L’ipercolerestemia familiare è principalmente causata da assenza
o alterazione dei recettori di superficie che legano e regolano l’entrata
delle LDL nelle cellule. Fino ad oggi sono state identificate più di 400
diverse mutazioni del gene che codifica per il recettore delle LDL (gene
localizzato sul cromosoma 19 in una regione di 45 Kb).
Malattia (o corea) di Huntington
E’ una malattia neurodegenerativa che colpisce 1/10000 individui il cui
fenotipo patologico si manifesta intorno ai 40-45 anni con movimenti
muscolari involontari, movimenti spasmodici delle braccia, delle gambe
e del busto (noti come corea). La malattia porta poi a problemi di tipo
psichiatrici fino a demenza e, generalmente, porta alla morte entro 10-15
anni dall’insorgenza dei primi sintomi.
L’anomalia che causa la malattia riguarda l’espansione di una triplet-
ta di nucleotidi (CAG) nel primo esone del gene IT-15 che mappa sul
braccio corto del cromosoma 4. Tale gene codifica la proteina hunting-
tina che è indispensabile per la vita dei neuroni. In questa malattia,
la ripetizione della tripletta un numero di volte molto alto (fino a più
di un centinaio contro le max 30 di una condizione normale), prooca
un incremento del numero di copie dell’amminoacido glutammina nella

5.1 le mutazioni 63
proteina huntingtina. Tale aumento provoca la formazione di una pro-
teina anomala che non soltanto è incapace di mantenere la sua normale
funzione di stimolare la trascrizione del fattore per il differenziamento
e la sopravvivenza dei neuroni, ma forma anche aggregati divenendo
insolubile e tossica e provocando la morte delle cellule nervose.
Fibrosi cistica o mucoviscidosi
la fobrosi cistica è una malattia autosomica recessiva disabilitante con
esito spesso letale e con una incidenza di 1/2000 nelle popolazioni cau-
casiche. Essa è caratterizzata da una secrezione anomala di muco delle
ghiandole esocrine e dalla produzione eccessiva di sale dalle ghiandole
sudoripare. Il muco denso prodotto ostruisce progressivamente i dotti
pancreatici, bronchiali, spermatici. Ciò causa un blocco del trasporto
degli enzimi digestivi dal pancreas all’intestino tenue, una congestione
di bronchi e polmoni con conseguenti difficoltà respiratorie e suscettibi-
lità alle infezioni virali e batteriche. Gli enzimi che rimangono bloccati
nel pancreas tendono progressivamente a distruggerlo: esso inizia in-
fatti una produzione di cisti fino ad una forma degenerativa di natura
fibrosa. La malattia è causata dalla mutazione di un gene molto gran-
de costituito da circa 250 K coppie di basi. Esso mappa nella regione
q31 del braccio lungo del cromosoma 7 e che codifica per una proteina
transmembrana della membrana citoplasmatica (tale proteina è chiama-
ta CFTR). Tale proteina costituita da 1480 amminoacidi, regola il flusso
di ioni cloro nella cellula per cui difetti in essa producono una anomalia
nel movimento di tali ioni con conseguente alterazione della secrezio-
ne di liquidi necessari per fluidificare il muco prodotto dalle ghiandole.
Per questo motivo il muco secreto rimane molto denso e viscoso. Le
mutazioni identificate nella proteina sono di tipo missenso, frameshift,
delezioni, inserzioni e di splicing.
Emoglobinopatie
Con questo termine si identifica una classe eterogenea di patologie ere-
ditarie che insorgono per effetto di alterazioni strutturali e funzionali
dell’emoglubina. Sono state descritte più di 700 forme anomale di emo-
globina anche se non tutte sono causa di patologie. Alcune di queste
anomalie portano ad instabilità dei tetrameri, mancata riduzione dello
ione ferro, mancato legame dell’eme.

64 mutazioni, polimorfismi, metodologie analitiche
Anemia falciforme
Questa patologia è una delle piùcomuni malattie ereditarie con una inci-
denza di circa 1/500 nati nella popolazione afroamericana. Essa rimane
ancora una delle cause principali cause di morte tra la popolazione di
colore del mondo perchè non è curabile malgrado se ne conoscano bene
le sue basi molecolari. Essa prende il nome dalla presenza nel circolo
sanguigno di eritrociti a forma di falce, una conformazione che assumo-
no i globuli rossi dovuta alla presenza della emoglobina anomala detta
emoglobina S (HbS). Tutto ciò è causato da una mutazione missenso, la
sostituzione di una timina con una adenina (CTC → CAC) nel sesto
codone del primo esone del gene che codifica per le globine β.
Talassemie
Per talassemia si intende una ben definita categoria di emoglobinopatie
dovute ad un difetto di sintesi delle globine α o β. La sintesi di una
delle due globine può essere ridotta o addirittura assente e quindi le
molecole di emoglobina che si formano sono alterate e tendono a non
legare l’ossigeno in modo efficiente con la conseguenza che gli individui
mostreranno danni spesso letali.
Si conoscono due tipi di talassemie: la talassemia α e la talassemia β.
Nella talassemia α la mancanza delle catene globiniche α è da ricondur-
re ad un evento mutazionale che porta alla perdita o delezione di uno
o entrambi i geni della globina α. Queste delezioni sono spesso dovute
ai meccanismi di crossing over ineguale ra sequenze omologhe dei geni
α. La talassemia sono generalmente dovute ad un deficit nella produ-
zione delle globine β a causa di mutazioni nel gene β che è presente
in unica copia sul cromosoma 11 e sono trasmesse secondo la modalità
autosomica recessiva.
Fenilchetonuria (PKU)
E’ la più comune malattia pediatrica congenita. E’ dovuta ad una caren-
za enzimatica e caratterizzata da aumentati livelli sierici dell’amminoa-
cido fenilalanina e da ritardo mentale. Essa è dovuta alla mutazione di
un gene localizzato sul cromosoma 12 (locus 12q24.1) ma esistono altre
cause. La frequenza nelle popolazioni caucasiche è di circa 1/11000 nati
vivi.

5.2 il polimorfismo in biologia molecolare 65
Da un punto di vista molecolare la malattia è provocata dalla mutazio-
ne di un gene che codifica per la fenilalanina idrossilasi (PAH) che è un
enzima che converte l’amminoacido fenilalanina in tirosina. L’assenza di
tale enzima rende impossibile tale reazione e provoca gli aumenti della
fenilalanina. La fenilanalina, d’altro canto, è un amminoacido essen-
ziale, tuttavia un suo eccesso causa problemi allo sviluppo del sistema
nervoso. I bambini affetti da fenilchetonuria (omozigoti recessivi) accu-
mulano la fenilalanina che viene convertita non in tirosina ma in acido
fenilpiruvico che è un prodotto tossico per il sistema nervoso centrale.
Ciò provoca ritardo mental e morte precoce.
La PKU è una tipica malattia genetica che mostra effetti pleiotropici.
Un individuo affetto da PKU, infatti, risulta incapace di sintetizzare la
tirosina, ma ciò induce la carenza di produzione di proteine fondamen-
tali come gli ormoni tiroxina e adrenalina così come la melanina. Sono
per esempio frequenti i malati di fenilchetonuria che hanno carnagione e
occhi chiari per deficit di melanina e possiedono livelli particolarmente
bassi di adrenalina.
5.1.6 Tabelle riassuntive di alcune patologie
Le Figure ?? e ?? riportano alcuni importanti esempi di patologie auto-
somiche a carattere dominante e recessivo.
5.2 il polimorfismo in biologia mole-
colare
Da un punto di vista generale, il polimorfismo in biologia si verifica
quando due o più fenotipi diversi esistono contemporaneamente nel-
la stessa popolazione. Per essere classificati come tali, i polimorfismi
devono occupare allo stesso tempo lo stesso habitat e appartenere ad
una popolazione pammittica (cioè soggetta ad accoppiamento casuale).
ll polimorfismo è comune in natura, legato alla biodiversità, alla varia-
bilità genetica e alla capacità di adattamento. Gli esempi più comuni
sono il dimorfismo sessuale che avviene in molti organismi, le forme
di mimetismo nelle farfalle, l’emoglobina umana e i gruppi sanguigni.

66 mutazioni, polimorfismi, metodologie analitiche
Figura 15: Esempi di patologie autosomiche dominanti
.
Figura 16: Esempi di patologie autosomiche recessive
.

5.2 il polimorfismo in biologia molecolare 67
Il polimorfismo è conseguenza del processo evolutivo, è ereditabile, e
viene modificato dalla selezione naturale.
Esiste però una accezione più specifica del termine polimorfismo, usato
in biologia molecolare per descrivere i marcatori genetici legati alle
mutazioni che avvengono al livello del DNA. I polimorfismi del DNA,
anche detti polimorfismi genetici sono estremamente utili in biologia
perchè usati come marcatori genetici.
La scoperta dei polimorfismi genetici è stata possibile quando si è avu-
ta la possibilità di analizzare direttamente i ’fenotipi’ del DNA. Al livello
del DNA, è infatti sufficiente la differenza di una singola base tra due
sequenze omologhe per creare due alleli diversi. In alcuni casi la varia-
zione di una singola coppia di basi può dare vita ad un prodotto genico
anche sensibilmente diverso dl prodotto normale che a volte. è anche fa-
cilmente individuabile con una analisi fenotipica o con analisi proteiche.
Tuttavia, la maggior parte delle volte, differenze di singole coppie di ba-
si in loci omologhi non hanno alcuna evidente conseguenza biologica o
perchè la mutazione non compoeta nessun cambiamento nella proteina
prodotta o semplicemente perchè il cambiamento avviene in una regio-
ne non codificante del genoma. Proprio il fatto di essere innoque rende
queste mutazioni non selezionate, quindi molto diffuse ed equidisper-
se per l’intera lunghezza di ogni cromosoma. Esse rappresentano così
una importante collezione di siti che possono essere estremamente utili
per la mappatura genetica. Tali marcatori vengono quindi definiti poli-
morfismi genetici indicando con questo termine la presenza simultanea
nella popolazione di alleli che presentano una qualsiasi variazione di se-
quenza. Ai fini pratici, per essere considerato un polimorfismo, un allele
deve avere nella popolazione una frequenza maggiore dell’1%.
Lo sviluppo di tecniche molecolari quali il Southern blotting e in se-
guito l areazione a catena della polimerasi (PCR) e il sequenziamento
del DNA hanno permesso negli anni di ben identificare i polimorfismi
genetici. Da un punto di vista molecolare possono essere classificati co-
me polimorfismi di sequenza quando tra due alleli vi è la variazione di una
sola coppia di basi (RFLP, restriction fragment lenght polymorphism e
SNP, Single Nucleotide Polymorphism) e polimorfismi di lunghezza quan-
do la differenza tra due alleli è dovuta all’inserzione/delezione di un
certo numero di basi.

68 mutazioni, polimorfismi, metodologie analitiche
5.3 il dna ricombinante
5.3.1 Introduzione
La base metodologica per la maggior parte degli studi di genetica è rap-
presentata dalla tecnologia del DNA ricombinante. Tale tecnologia per-
mette l’isolamento di un singolo gene umano e il suo successivo utilizzo
per la produzione della corrispondente proteina con sistemi in vitro. Lo
sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante si è fondamentalmente
basato sulla scoperta, purificazione e caratterizzazione di enzimi capaci
di permettere una manipolazione accurata del DNA in vitro. In prati-
ca questa tecnologia permette di selezionare una specifica sequenza di
DNA, manipolarla opportunamente, copiarla e isolarla in modo poi da
produrre la corrispondente proteina. Naturalmente, per avere la possibi-
lità di studiare in modo accurato la proteina che viene prodotta dal gene
isolato, occorre produrne in quantità sufficiente. La tecnologia del DNA
ricombinante deve quindi anche prevedere delle tecniche in grado di
moltiplicare il tratto di DNA clonato. Tali tecniche vengono dette di am-
plificazione del DNA e possono avvenire in vivo (clonaggio in batteri)
o in vitro (con l’uso della metodica della PCR, Polimerasy Chain Reac-
tion). La stessa tecnica può essere applicata alla popolazione di mRNA
di un particolare tipo cellulare previa conversione in molecole di DNA
complementare (cDNA). Nei paragrafi successivi analizzeremo breve-
mente le componenti essenziali della metodica del DNA ricombinante e
i principali sistemi di amplificazione e analisi del DNA prodotto.
5.3.2 Schema semplificato della DNA ricombinante
La tecnologia del DNA ricombinante prevede diversi passaggi. Innan-
zi tutto il DNA o l’RNA devono essere estratti e purificati attraverso
l’utilizzo di specifici enzimi.
Una volta estratto, l’acido nucleico deve essere opportunamente ma-
nipolato. Gli enzimi che permettono questa manipolazione (che avviene
in vitro) possono essere raggruppati in tre categorie fondamentali:
1. DNA polimerasi;
2. nucleasi o enzimi di restrizione;

5.4 metodologie analitiche associate al dna ricombinante 69
3. e ligasi.
Le DNA polimerasi effettuano la sintesi di DNA a partire da uno
stampo che può essere DNA (in questo caso si chiamano DNA polime-
rasi DNA-dipendenti) o RNA (DNA polimerasi RNA-dipendenti). Esempi
di DNA polimerasi sono la DNA polimerasi I di E. Coli, i frammenti
di Klenow (derivati dalla DNA polimerasi I ma eliminando da essa la
componente esonucleasica), la Taq polimerasi (una DNA polimerasi ter-
moresistente isolata per la prima volta nel batterio Thermus acquaticus)
e la trascrittasi inversa (RT) che è un enzima isolato da retrovirus che
permette la sintesi di filamenti di DNA utilizzando come stampo l’RNA.
Le nucleasi possono essere suddivise in esonucleasi ed endonucleasi. Le
esonucleasi sono in grado di rimuovere nucleotidi alle estremità delle
molecole di DNA, mentre le endonucleasi tagliano le molecole a singolo
o a doppio filamento, all’interno con una modalità sequenza-dipendente
o sequesnza-indipendente. Esempi di endonucleasi per DNA a doppio
filamento sequenza-dipendente (tagliano il DNA in specifici punti) sono
gli enzimi di restrizione di tipo II mentre quelli che tagliano le stesse
molecole in modo casuale sono le desossiribonucleasi (DNasi).
Le ligasi permettono di unire due molecole di DNA tagliate, ad esem-
pio, con lo stesso enzima di restrizione. Questi enzimi (detti DNA ligasi)
catalizzano la formazione di un legame fosfodiesterico tra due filamenti
di DNA se un filamento possiese un 3’-OH libero e l’altro un 5’-fosfato
libero. Le DNA ligasi, sono in grado di unire tra di loro DNA a doppio
filamento ma non a singolo. Nella cellula la DNA ligasi svolge il ruolo
di saldare le interruzioni presenti nello scheletro del DNA dopo la re-
plicazione. Quando questo enzima deve essere adoperato in laboratorio,
esso viene estratto dl fago T4.
5.4 metodologie analitiche associate
al dna ricombinante
Una volta che il DNA è stato frammentato e manipolato, al fine di ese-
guire una mappa genetica completa e quindi non solo conoscere la po-
sizione dei vari frammenti genici in funzione di specifici siti di restri-
zione, ma anche di separare i vari frammenti ottenuti in funzione del

70 mutazioni, polimorfismi, metodologie analitiche
loro peso molecolare e di identificare ben specifiche sequenze nucleo-
tidiche in essi contenuti è stato necessario sviluppare delle tecniche di
analisi specifiche. Tra le tecniche più significative ricordiamo la gel elet-
troforesi che permette di frazionare i frammenti di DNA in funzione del
loro peso molecolare e l’ibridazione molecolare che permette invece di
identificare una specifica sequenza di nucleotidi. Esistono poi tecniche
per analizzare le sequenze nucleotidiche in modo preciso e sistemi di
amplificazione in-vivo e in-vitro dei tratti di DNA senza i quali sarebbe
impossibile applicare le varie tecniche di analisi perchè non si avrebbe
materiale e quindi statistica sufficiente.
5.4.1 Gel elettroforesi
Gli acidi nucleici sono molecole cariche negativamente (la carica negati-
va è dovuta ai gruppi fosfato delle catene dei DNA e RNA) e quindi, se
poste all’interno di un campo elettrico, migreranno verso il polo di ca-
rica opposta. Se molecole di DNA di diversa dimensione sono poste in
un campo elettrico e in una matrice che funzioni da setaccio, in grado di
rallentare le molecole più piccole e permettendo il passaggio più facile a
quelle più grandi, e tali molecole vengono opportunamente colorate, si
ottengono delle tipiche bande la cui distanza di migrazione dal punto di
origine è strettamente legata alla dimensione delle molecole. In partico-
lare risulta che tale distanza è inversamente proporzionale al log10 della
loro dimensione. La matrice che funge da setaccio è un gel di agarosio
o policrilammide.
Il gel di agarosio permette una eccellente separazione di frammenti di
DNA compresi tra 100 bp e 15 Kbp.
5.4.2 Ibridazione molecolare o metodo di Southern blot
L’analisi attraverso l’elettroforesi in gel di agarosio permette di deriva-
re la distribuzione in dimensione delle diverse molecole di DNA ma
niente ci dice circa altre loro caratteristiche come ad esempio, la loro
sequenza nucleotidica: in una stessa banda, infatti, possono migrare
pezzi di DNA con la stessa dimensione ma sequenza nucleotidica diver-
sa. L’ibridazione molecolare è una tecnica che permette di distingue-
re, nelle bande da elettroforesi, bande di DNA caratterizzate da speci-

5.4 metodologie analitiche associate al dna ricombinante 71
fiche sequenze nucleotidiche. Questo sistema si basa su due passaggi
fondamentali:
1. il trsferimento (blotting) del DNA in stato denaturato dal gel ad
un supporto più resistente e maneggevole
2. il rilevamento di una particolare sequenza mediante l’ibridazione
molecolare
L’ibridazione molecolare si basa sulla formazione di un doppio fila-
mento (per ricostruzione dei legami idrogeno) tra le basi complementa-
ri di due filamenti singoli. Il processo viene definito ibridizzazione in
quanto i due filamenti complementari che vengono ricostruiti apparten-
gono a due diverse molecole: un filamento è infatti rappresentato dalla
sonda di DNA in soluzione e l’altro filamento è il DNA bersaglio che
deve essere analizzato. Si comprende quindi come le speci molecolari
coinvolte nella metodica devono essere presenti in stato denaturato e
che la specie bersaglio sia presente in eccesso rispetto quella della sonda
ciò facilitando le collisioni con le molecole sonda.
Il principio della ibridazione è poi basato sull’utilizzo di sonde marcate
(con materiale radioattivo o non radioattivo) in modo tale che essa possa
essere rivelata dopo l’ibridazione e, quindi, possa essere possibile iden-
tificare la sequenza bersaglio alla quale si è legata. Per il DNA il sistema
attualmente in uso prende il nome di Southern blot messo a punto nel
1975 da Edwin Southern.
5.4.3 Amplificazione del DNA in vivo
I metodi di amplificazione adoperati nella tecnologia del DNA ricombi-
nante hanno lo scopo di produrre elevate quantità di una determinata
sequenza mediante la sua replicazione indipendente rispetto a quella del
DNA cellulare, seguita da un facile isolamento di tali molecole dalle cel-
lule che la contengono. Tale obiettivo può essere raggiunto inserendo del
DNA esogeno, mediante l’uso degli enzimi di restrizione, in opportuni
vettori dotati di origine per la riproduzione procariotica. Ciò permette
di replicare il DNA esogeno un numero di volte superiore a quello del
genoma endogeno (perchè può essere attaccato a vari siti) e di poterlo
ottenere in forma pura utilizzando per il taglio lo stesso enzima usato
per la sua inserzione. Nella magior parte dei casi le cellule ospiti sono

72 mutazioni, polimorfismi, metodologie analitiche
rappresentate da E. coli anche se talvolta vengono utilizzate anche cel-
lule eucariotiche come il lievito. I vettori più utilizzati sono i plasmidi,
ideali per il clonaggio di frammenti di DNA relativamente piccoli ( fino
ad un massimo di circa 10 Kb) mentre per dimensioni più elevate (fino
a 100 Kb) si i vettori adoperati sono basati sul batteriofago λ.
5.4.4 Amplificazione del DNA in vitro
La PCR
L’amplificazione del DNA in vitro può essere ottenuta attraverso attra-
verso la metodologia della reazione a catena della polimerasi o PCR (Poli-
merasy Chain Reaction). La PCR, grazie alla sua sensibilità e rapidità
di esecuzione, ha permesso il raggiungimento di obiettivi molto impor-
tanti quali l’identificazione personale su base genetica o la diagnosi di
malattie genetiche o di infezioni da patogeni in tempi molto brevi e con
quantitativi molto ridotti di DNA di partenza.
Un ciclo PCR è costituito da tre fasi:
1. La denaturazione del DNA che deve fare da stampo (a 94 gradi
per pochi minuti);
2. L’annealing di due inneschi ( o primer) oligonucleotidici che per-
mettono di definire una ben determinata regione di DNA;
3. L’estensione, cioè la sintesi dei filamenti complementari da parte
della DNA polimerasi in presenza dei quattro desossiribonucleo-
tidio trifosfato.
I due primer sono di lunghezza normalmente compresa tra 18 e 30 nu-
cleotidi e sono complementari ai due filamenti e definiscono la regione
da copiare. Essi hanno sempre orientamento 5’ → 3’ in modo che all’in-
terno della regine definita, il primer di sinistra dirige la sintesi verso de-
stra e quello di destra verso sinistra. La reazione di annealing è una nor-
male ibridazione DNA/DNA e viene effettuata intorno alla temperatura
di 60 ◦ C. Tale temperatura è comunque influenzata sia dalla lunghezza
che dalla sequenza dei primer stessi. La scelta di una temperatura otti-
male è fondamentale perchè essa permette un corretto appaiamento tra
primer e stampo ed un appaiamento ridotto o nullo con altre sequenze.
La terza fasi della catena viene effettuata attraverso polimerasi termore-
sistenti intorno alla temperatura di 72 ◦ C per 1-2 minuti. Generalmente

5.4 metodologie analitiche associate al dna ricombinante 73
con una data quantità di polimerasi iniziale si è in grado di effettuare cir-
ca 30-35 cicli di PCR sufficienti a produrre una amplificazione del tratto
di DNA di circa 10 9 .
RT-PCR: retrotrascrizione associata alla PCR
L’enzima di manipolazione trascrittasi inversa permette di ottenere una
copia del DNA (detto cDNA o DNA complementare) a partire dall’mR-
NA. La combinazione di questo processo di retrotrascrizione con la pro-
cedura PCR e detto RT-PCR e permette di estendere l’uso della PCR
all’analisi sia quantitativa che qualitativa dell’espressione genica.
La RT-PCR si basa su due passaggi:
1. La sintesi di DNA a singolo filamento utilizzando come stampo
l’mRNA;
2. La successiva amplificazione di questo con la PCR
Naturalmente nella RT-PCR i primer adoperati sono specifici per un da-
to mRNA e essa permette l’nalisi della espressione genica di specifici
messaggeri di cui si conosce già la sequenza.
La real-time PCR
La RT-PCR permette di capire molto bene se una data sequenza è con-
tenuta nel DNA ma non riesce a fornire un valore quantitativo preci-
so della quantità di tale sequenza: è una misura molto approssimativa
infatti fare ciò semplicemente amplificando lo stampo e misurando la
quantità del prodotto con la gel elettroforesi perchè dopo un certo nu-
mero di cicli si perde la proporzionalità tra la quantità di stampo iniziale
e quella finale del prodotto. Una misura quantitativa della quantità di
una data sequenza all’interno del DNA è invece ottenuta attraverso la
real-time PCR che permette di monitorare in tempo reale la formazione
del prodotto nel corso della PCR.
5.4.5 Il sequenziamento enzimatico
L’analisi dettagliata delle catene nucleotidiche che compongono il DNA,
ovvero la possibilità di sequenziare il DNA nei suoi singolo compo-
nenti, è oggi possibile attraverso diverse tecniche analitiche. Tra que-

74 mutazioni, polimorfismi, metodologie analitiche
ste il sequenziamento di Sanger (o sequenziamento enzimatico) è for-
se quello più famoso ed efficiente. Esso permette, attraverso l’utilizzo
di miscele contenenti, oltre che il DNA denaturato che fa da stampo,
la DNA polimerasi, tre desiribonucleotidi (dei quettro necessari) an-
che un particolare nucleotide (il di-desossiribonucleotide) di fermare
la catena di crescita del DNA in particolari punti definiti proprio dal
tipo del di-desossiribonucleotide aggiunto. Effettuando questo tipo di
reazione in quattro provette diverse (ciascuna dove è stato fatto agire
un diverso di-desossiribonucleotide) e poi analizzando le sequenze con
gel-elettroforesi, si riesce ad ottenere la sequenza nucleotidica anche di
lunghe (fino a 400-600 nucleotidi) catene di DNA.

6 G E N E T I C A U M A N A
F O R M A L E E M O L E C O L A R E
6.1 introduzione
La Genetica (dal greco γɛσ = nascita, origine) è la scienza dell’ereditarietà.
Essa studia la trasmissione delle caratteristiche ereditarie che distinguo-
no un individuo da un altro. La Genetica nasce tra la fine dell’800 e
l’inizio del ’900, avendo come base gli studi del monaco naturalista Jo-
hann Gregor Mendel condotti per anni nell’orto del monastero di Brno
(CZ) e le sempre più avanzate conoscenze citologiche e molecolari.
I caratteri studiati da Mendel a metà dell’800 (e i cui studi rimasero
sostanzialmente incompresi fino all’inizio del ’900) non sono altro che
il risultato dell’espressione dei geni, cioè i tratti di DNA presenti nel ge-
noma in duplice copia e la cui espressione è modulata dall’interazione
con l’ambiente. Mendel comprese, dopo molte prove, che negli organi-
smi doveva trovarsi un qualcosa, sotto forma di singole unità, capace di
determinare le caratteristiche ereditabili di singoli caratteri. Egli riten-
ne quindi essenziale seguire questi singoli caratteri preparando prove di
incrocio dai cui risultati dedurre leggi più generali.
6.2 gli esperimenti di mendel
Per i suoi esperimenti Mendel iniziò a seguire i semplici caratteri eredita-
ri del Pisum sativum (Pisello odoroso) che mostrava caratteri facilmente
distinguibili e discriminabili. Per condurre efficacemente le sue prove
egli selezionò le cosiddette linee pure, cioè popolazioni di soggetti che,
opportunamente incrociati molte volte, mostravano sempre lo stesso ca-
rattere.
Una delle prime importanti osservazioni che Mendel fece è che le carat-
teristiche del soma degli individui non risultava avere una importanza
nella trasmissione ereditaria, mentre risultava fondamentale la natura
e la qualità degli elementi coinvolti nei processi ereditari, ovvero la co-
75

76 genetica umana formale e molecolare
stituzione genetica. In questa costituzione genica egli individuò quel
qualcosa che è ereditabile e che determina una data caratteristica di un
individuo. Questo qualcosa sono i caratteri.
Alla fine dei suoi studi Mendel propose forse una delle più importanti
teorie della biologia: i caratteri sono determinati da unità ereditarie che
egli definì fattori e sono portati dalle cellule germinali una di origine
paterna e una materna. I fattori di Mendel furono in seguito denominati
geni e poi alleli. Essi costituiscono il genotipo e cioè la struttura gene-
tica dell’organismo, mentre l’aspetto, cioè la manifestazione dei caratte-
ri, costituisce il fenotipo. E’ chiaro quindi come, in effetti, quello che
Mendel chiamava carattere è in effetti il fenotipo di quel dato organismo.
Da un punto di vista più rigoroso, oggi diciamo che in un singolo
individuo, per ciascun carattere esistono due fattori mendeliani, cioè due
coppie di geni (anche detti allelomorfi o più semplicemente alleli) che
rappresentano le forme alternative dello stesso gene.
6.2.1 Caratteri, Loci, geni
Dai primi del ’900, lo sviluppo delle tecniche microscopiche, permise
di osservare, per la prima volta, le cellule in divisione. da questi e da
altri studi emerse un parallelismo tra il comportamento dei cromosomi
e la trasmissione dei caratteri ereditari, facendo così nascere la suppo-
sizione che cromosomi e caratteri ereditari fossero tra loro correlati. Si
fece quindi strada l’idea che ciascun carattere mendeliano avesse una
localizzazione fisica in un punto specifico di un cromosoma, detto locus.
Nelle cellule degli organismi diploidi esistono due copie dei cromoso-
mi (i cromosomi omologhi), una di origine paterna e una materna, che
sono appunto caratterizzate dall’avere la stessa sequenza dei loci geneti-
ci. Nel singolo individuo, poi, per ciascun carattere, esistono due fattori
mendelliani (oggi diciamo due copie geni), detti allelomorfi o, più sem-
plicemente, alleli. Gli alleli, rappresentano le forme alternative di uno
stesso gene. In questo schema ogni coppia di caratteri (o meglio, ogni
coppia di fenotipi) è rappresentata da una coppia di alleli e ciascun in-
dividuo possiede due alleli che sono localizzati in loci corrispondenti
dei cromosomi omologhi. Da un punto di vista descrittivo, per descri-
vere l’ereditarietà dei caratteri, Mendel indicava i relativi fattori con una
lettera dell’alfabeto. In questo formalismo, una lettera maiuscola rappre-

6.2 gli esperimenti di mendel 77
senta l’allele dominante (ex A) mentre la stessa lettera minuscola (ex a)
indica l’allele recessivo. Se andiamo quindi per esempio a considerare il
caso di un carattere dominante in una linea pura, la specie in questione
avrà i due alleli con lo stesso carattere: si dice che questi individui sono
omozigoti dominanti. Se il carattere è invece recessivo, ma sempre pre-
sente nei due alleli, l’individuo si dirà omozigote recessivo. Nel caso in
cui i due alleli sono uno di tipo dominante e l’altro recessivo, l’individuo
si dirà a genotipo eterozigote (ex Aa).
6.2.2 Le tre leggi di Mendel
Mendel chiamava carattere quella data condizione somatica osservata
nella pianta del pisello. Per esempio egli studiò il carattere (colore del
fiore) nelle sue due forme fenotipiche alternative: porpora e banco. Gli
studi di Mendel mostravano che nei vari incroci alcuni caratteri erano
maggiormente rappresentati e si manifestavano con maggiore frequenza.
Egli chiamò questi caratteri dominanti e recessivi gli altri. Nel caso
degli esperimenti con le piante di pisello il colore bianco dei fiori risulta
un carattere dal fenotipo recessivo, mentre quello porpora dal fenotipo
dominante.
I primi esperimeneti furono condotti da Mendel adoperando solo
piante con un fenotipo ben selezionato e autofecondando le varie ge-
nerazioni. Esperimenti successivi furono invece condotti con incroci tra
piante che differivano per due coppie di caratteri antagonisti (due carat-
teri, ciascuno con due fenotipi alternativi) allo scopo di verificare come
i caratteri potevano influenzarsi tra di loro.
Mendel cominciò i suoi esperimenti incrociando due varietà di pisel-
lo, uno a fiore bianco e uno a fiore rosso, portando con un pennellino il
polline di uno sul pistillo dell’altro. Egli osservò che nella prima gene-
razione (F 1 ) appariva un solo carattere: quello dominante mentre quello
recessivo non appariva mai. La Prima Legge, detta anche Legge della
uniformità degli ibridi di prima generazione, cita così: Incrociando 2
individui omozigoti per un carattere, ma con un carattere dominante e
uno recessivo, si ottiene una prima generazione con individui eterozigo-
ti, ma che mostrano tutti il carattere dominante, mentre quello recessivo
non compare Mendel ripetè lo stesso esperimento anche con altri ca-
ratteri, come fusto alto e fusto basso, pisello giallo e pisello verde ecc.;

78 genetica umana formale e molecolare
ma il risultato non cambiò. Lasciò poi che le piante della prima gene-
razione si autofecondassero, generando nuove piante, e osservò che il
carattere recessivo appariva solo per un 1/4, mentre quello dominante
per i 3/4. La Seconda Legge o legge della separazione dei caratteri
dice che: Incrociando 2 individui eterozigoti per un carattere, nella se-
conda generazione (F 2 ) i 2 caratteri di partenza ricompaiono in quantità
numeriche esprimibili con numeri semplici, in rapporto di 3:1 Pure qui
l’esperimento funzionò anche con altre coppie di caratteri, come seme
liscio e seme rugoso. Mendel considera poi un seme giallo liscio e un
seme verde rugoso. Nella 1 a generazione ottenne tutti individui con
semi gialli lisci come, d’altronde, cita la legge. Ma nella 2 a generazione
ottenne piante così distribuite: 9/16 con il seme giallo liscio - 1/16 verde
rugoso - 3/16 giallo e rugoso - 3/16 Verde e liscio. Quindi la Terza Legge
di Mendel, o Legge dell’indipendenza dei caratteri, si può formulare
così: Incrociando individui con più caratteri distinti si ottengono nella
2 a generazione individui nei quali i caratteri si trasmettono indipende-
mente l’uno dall’altro. Se i caratteri sono 2, il rapporto sarà 9 : 3 : 3 :
1
Le tre leggi di Mendel si possono riassumere in questo modo:
La prima legge di Mendel
Anche detta legge della dominanza. Essa dice che tutti i soggetti della
prima generazione (F1), prodotti dall’incrocio di due individui parentali
di linea pura, che differiscono per un carattere e mostrano cioè due fe-
notipi alternativi, presentano solo uno dei due caratteri (fenotipo) che
viene detto dominante mentre la forma alternativa che rimane latente è
detta recessiva.
La seconda legge di Mendel
Anche detta legge della segregazione dei caratteri. Essa dice che i sog-
getti della prima generazione (F1) incrociati tra di loro producono una
progenie dove compaiono entrambi i fenotipi parentali (in pratica riap-
pare il fenotipo recessivo che era scomparso) con un rapporto costante
3/4 per il dominante e 1/4 per il recessivo.

La terza legge di Mendel
6.3 variazioni alla genetica mendelliana 79
Anche detta della segregazione indipendente dei caratteri. Essa dice
che nell’incrocio di due soggetti che differiscono per due caratteri (due
coppie di fenotipi quindi), ciascuno di essi viene trasmesso ed ereditato
indipendentemente uno dall’altro. Nella progenie infatti, i caratteri
compaiono in tutte le possibili combinazioni in quanto le due coppie di
alleli risiedono su due diverse coppie di cromosomi omologhi.
6.3 variazioni alla genetica mendel-
liana
Fu comunque presto evidente che non tutti i risultati sperimentali appa-
rivano coerenti con i principi mendeliani e ci si rese altrettanto presto
conto che l’espressione del genotipo non è così semplice e diretta come
si poteva dedurre dagli esperimenti Mendel. Infatti, non tutti i caratteri
ereditari rientrano nel principio secondo cui un dato fenotipo è speci-
ficato da un solo fattore, un gene, di cui esistono due alleli: uno per il
fenotipo dominante e uno per quello recessivo. Esistono quadri ereditari
più complessi che danno per esempio ragione del fatto che:
• La maggior parte dei fenotipi risente dell’azione di più geni;
• Il fenotipo può essere determinato da alleli che non consentono
una dominanza completa;
• Il fenotipo può risentire di influenze che derivano dall’ambiente
6.3.1 Dominanza incompleta
Per alcune specie eterozigote, quando di esse si incrociano due fenotipi
differenti (vedi per esempio il caso dei fiori rossi e bianchi della Mirabi-
lis jalapa), si ottiene per la generazione F1 il 100% di fiori con fenotipo
intermedio rosa. Questo caso non esprime il fatto che ci sia una mesco-
lanza tra i caratteri, ma che il fenotipo degli eterozigoti non è uguale
a quello degli omozigoti dominanti ma risulta invece intermedio tra i
fenotipi dei due omozigoti.
La legge della dominanza (prima legge di Mendell), dunque, appare non

80 genetica umana formale e molecolare
categorica in quanto la dominanza può essere più o meno completa. nel
caso appena citato della Mirabilis jalapa i caratteri si dicono a dominanza
incompleta. In questo caso nell’ibrido si esprime l’allele dominante de-
terminando la colorazione intermedia che consente la netta distinzione
tra eterozigoti ed omozigoti.
6.3.2 Codominanza
Una ulteriore eccezione al principio della dominanza mendelliana si ve-
rifica quando due alleli si esprimono in eguale misura producendo
un fenotipo che è rappresentativo di entrambi gli omozigoti. Questa
condizione è indicata con il termine di codominanza ed i due alleli sono
detti codominanti. In questo caso quindi, l’espressione di ciascu alle-
le è pienamente riconoscibile a livello fenotipico in quanto entrambi si
esprimono contemporaneamente ed in maniera completa.
6.3.3 Allelia multipla
Ogni gene può avere varie forme alternative che specificano fenotipi di-
versi e tale forme prendono il nome di alleli. Inoltre molti geni possono
essere presenti nelle popolazioni in più di due forme alleliche: possono
cioè esservi tre o più alleli per lo stesso locus e si parla in questo caso di
allelia multipla o poliallelia.
Cerchiamo di spiegare meglio il concetto di allelia multipla.In ciascun
individuo diploide, per ciascun carattere esistono soltanto due loci gene-
tici: uno su un cromosoma e l’altro sul suo omologo. Ciascuno di questi
due loci, a sua volta, può contenere forme alleliche differenti dello stesso
gene: quindi un individuo avrà sempre e solo due alleli di un gene (uno
in un locus e uno nell’altro) anche se però possono esistere più di due
forme alternative (cioè più di due alleli). Gli alleli di una serie allelica
(cioè quelli che sono varianti dello stesso gene) possono avere tra di loro
differenti relazioni di dominanza e recessività. L’allele che è maggior-
mente diffuso vie detto allele selvatico o wilde-type, mentre gli altri
alleli alternativi sono detti mutanti. L’esistenza di più forme alleliche
per uno stesso lucus aumenta il numero di combinazioni genotipiche e
fenotipiche per un determinato carattere.

6.3.4 Pleiotropia
6.3 variazioni alla genetica mendelliana 81
L’approccio classico della genetica Mendelliana partiva dall’assunto che
ad un gene corrispondesse un solo e ben specifico fenotipo. Ciò non
è vero e si verifica spesso come un singolo allele può avere più di un
effetto sul fenotipo di un individuo. Tale fenomeno, che prende il nome
di pleiotropia, è proprio quella condizione per cui un allele esercita
effetti multipli sul fenotipo di un organismo.
nella specie umana alcune malattie ereditarie, come l’anemia falcifor-
me, la fibrosi cistica, l’albinismo, la fenilchetonuria sono la chiara mani-
festazione di alleli responsabili di fenotipi clinici in cui si evidenzia la
contemporanea presenza di difetti in diversi organi o apparati.
6.3.5 L’epistasi
Nei casi in cui un gene può interferire o mascherare l’espressione di un
altro gene si parla di epistasi (da ɛπι = sopra e στασισ= posizione e,
quindi che sta sopra). Questo fenomeno si ha in tutti quei casi nei qua-
li l’espressione di un dato carattere è il frutto dell’interazione tra più
geni (non allelici) e tra i geni e l’ambiente. Quindi anche se differenti
coppie di alleli che stanno su coppie diverse di cromosomi omologhi, si
comportano indipendentemente le une dalle altre (secondo il principio
della segregazione indipendente), questo non sempre comporta nella tra-
smissione, la loro indipendenza di espressione. Le interazioni possono
realizzarsi direttamente ed immediatamente tra i prodotti genici delle
due coppie di alleli o in tappe successive. Ad esempio, quando alcuni
geni agiscono in modo sequenziale, a cascata, come nelle vie metaboli-
che, un allele che codifica un enzima non funzionante interromperà la
catena delle reazioni per il resto della catena. Il gene che condiziona
l’espressione è detto epistatico, quello che è regolato dal primo, invece
ipostatico (che sta sotto).
Tutte le volte in cui è presente un gene che può essere considerato
a monte la cui espressione influenza l’espressione dei geni che stanno a
valle si dice che si è in presenza di un effetto epistatico.

82 genetica umana formale e molecolare
6.3.6 Il linkage e il crossing over
Via via che gli studi di genetica avanzavano e le conoscenza progredi-
vano a partire dagli studi di Mendel, ci si rese conto che il numero di
caratteri ereditari osservabili in ogni specie superava di gran lunga il nu-
mero di cromosomi. Risultò quindi evidente che ogni cromosoma doves-
se contenere l’informazione per più caratteri o, in altri termini, dovesse
contenere più loci genici. Questa ipotesi, ovviamente, implica che ci sia
una concatenazione fisica per tutti quesi loci che sono localizzati sullo
stesso cromosoma, al contrario di quanto affermavano le conclusioni di
Mendel sulla segregazione indipendente dei caratteri ereditari.
Quello che presto si dimostrò, effettuando esperimenti di tipo men-
delliano, è che tutti gli alleli dei loci presenti sullo stesso cromosoma
segregano tutti insieme durante la meiosi. Essi, come si dice comune-
mente, sono associati o concatenati o in linkage. egli esperimenti ese-
guiti, oltre i cromosomi parentali che subivano linkage si ottenne anche
che un certo numero di cromosomi erano ricombinanti per effetto del
meccanismo del crossing over. ll meccanismo del crossing over, per la sua
natura casuale, porta a fenotipi scambiati rispetto ai parentali e meno
frequenti rispetto a essi.
Il crossing over
In quasi tutti gli organismi in cui avviene la meiosi, incluso l’uomo, è
stato possibile evidenziare da un punto di vista citologico, la formazio-
ne di strutture che tengono insieme i due cromosomi di ciascuna coppia
di omologhi, l’uno di origine paterna e l’altro di origine materna. Nella
meiosi I, infatti, i due cromosomi omologhi sono connessi prima dalla
formazione di una struttura proteica (il complesso sinaptonemale), poi
dalla formazione di rotture a doppio filamento e infine dalla interazione
fisica delle molecole di DNA attraverso lo scambio di materiale geneti-
co esattamente nei siti delle rotture a doppio filamento. I siti nei quali
avvengono sia queste rotture a doppio filamento come gli scambi di ma-
teriale genetico tra cromosomi omologhi, sono detti siti di ricombina-
zione o di crossing over. Grazie a questo processo durante la meiosi, si
generano cromosomi con nuove combinazioni alleliche : sono i cormo-
somi ricombinanti, che contengono sempre la stessa sequenza di loci
genici, ma con gli alleli miscelati tra quelli paterni e materni.

Il crossing over ineguale
6.4 i cromosomi umani 83
Il Crossing over ineguale si verifica tra cromosomi omologhi non com-
pletamente appaiati che da, come risultato, uno scambio non reciproco
di materiale genetico e la comparsa di cromosomi di lunghezza diver-
sa. La condizione del crossing over ineguale è favorito in regioni conte-
nenti sequenze ripetute disposte a tandem (vedi la tesina numero 5 sui
polimorfismi di lunghezza).
6.4 i cromosomi umani
Il corredo cromosomico o cariotipo umano contenuto in ciascuna cellula
somatica di ogni individuo, consiste di 46 cromosomi, suddiviso in 23
coppie di omologhi, dei quali 44 sono autosomi e di una coppia di cromo-
somi sessuali. Questi ultimi nella donna sono omologhi e sono indicati
con XX mentre nel maschio sono parzialmente omologhi e sono indicati
con XY. Tale corredo cromosomico è per questo motivo detto diploide,
ed è tale non solo nelle cellule somatiche ma anche in quelle della linea
germinale che si sono differenziate. Esso è invece aploide, cioè dimezza-
to (23 cromosomi, un rappresentante per ciascuna coppia di omologhi)
nei gameti maturi. Alla fecondazione, l’unione dei due gameti ristabi-
lisce il numero diploide dei cromosomi; lo zigote, quindi, avrà un set
paterno e uno materno ma con un numero di combinazioni cromosomi-
che possibili che è straordinariamente elevato e pari a 2 23 . Il numero
così alto di possibili combinazioni, insieme alla ulteriore variabilità de-
terminata dai numerosi crossing over per ciascuna coppia di cromosomi,
garantiscono la assoluta individualità ad ogni figlio prodotto anche se,
ovviamente, tale variabilità sarà minore nel caso del concepimento di
gemelli omozigoti.
Prendendo come punto di riferimento la posizione del centrometro
dei cromosomi in fase di divisione, i cromosomi umani possono distin-
guersi, da un punto di vista morfologico in:
• metacentrici: se il rapporto tra la lunghezza dei due bracci del
cromosoma è all’incirca uguale ad 1;
• submetacentrici: se il centrometro è posto in posizione submedia-
na;

84 genetica umana formale e molecolare
• acrocentrici: se il centrometro è quasi terminale
Va ricordato anche che il DNA dei centromeri è costituito da sequenze
di DNA altamente ripetute (da 5 Kb a 15 Kb) e che i cromosomi acro-
centrici presentano anche dei bracci molto piccoli con una appendice
globulare detta satellite che contiene alcune centinaia di copie di geni
che codificano per l’RNA ribosomiale.
La Figura 17 mostra una tipica micrografia della piastra metafasica di
un individuo umano normale di sesso maschile.
Figura 17: micrografia della piastra metafasica di un individuo umano
normale di sesso maschile
.

7 S T R U T T U R A M O L E C O L A R E
E F U N Z I O N A L E D E L L E
M E M B R A N E C E L L U L A R I
7.1 introduzione
Tutte le cellule sono circondate da una membrana detta membrana pla-
smatica, che separa il citoplasma (interno) e gli organuli cellulari in esso
contenuti dall’ambiente esterno. Oltre alla membrana plasmatica le cel-
lule sono fornite di altre membrane dette membrane interne o membra-
ne endocellulari, che circondano gli organuli cellulari (mitocondri, nu-
cleo, lisosomi, vacuoli ecc.). Il fine principale delle membrane cellulari e’
quello di isolare l’ambiente interno da quello esterno. In tal modo, le rea-
zioni metaboliche sono possibili in compartimenti cellulari perfettamen-
te isolati non solo dall’ambiente extracellulare, ma anche dall’ambiente
intracellulare. Si parla in questi casi di compartimentalizzazione.
Dal punto di vista morfologico le membrane cellulari sono pressoche’
identiche. La loro struttura molecolare invece e’ varia pur mantenendo
una certa similitudine.
Da un punto di vista funzionale le membrane interne, con l’eccezione
delle membrane mitocondriali, sono strettamente collegate tra di loro
avendo probabilmente un’origine comune. Queste membrane vengo-
no indicate come membrane del GERL (Golgi-Reticolo Endoplasmatico-
Lisosomi).
La membrana plasmatica ha un’origine ed alcuni funzioni comuni alle
membrane del GERL, ma se ne differenzia largamente per alcune carat-
teristiche strutturali e per le diverse funzioni metaboliche cui e’ preposta.
Le membrane cellulari sono strutture insolubili in acqua. Tale caratteri-
stica e’ loro conferita dalla presenza di lipidi come costituenti principali
(dal 20 all’80
Le membrane cellulari sono definite come strutture idrofobiche, do-
tate cioe’ di forze di repulsione che per ragioni termodinamiche impe-
discono alle molecole apolari, che le compongono, di interagire con le
molecole polari come l’acqua. Esempi di molecole apolari che incon-
treremo nelle strutture biologiche sono le catene alifatiche e i gruppi
85

86 struttura molecolare e funzionale delle membrane cellulari
aromatici.
Una sostanza fortemente apolare, come un grasso neutro, e’ incapace
di organizzarsi in membrana, ma in acqua formera’ piccole vescicole
galleggianti.
La formazione di una membrana e’ ottenuta da una specie particolare
di lipidi detti bipolari o anfipatici che sono: i fosfolipidi, il colesterolo e
i glicolipidi.
La doppia polarita’ permette che queste molecole si orientino in modo
da esporre la parte polare alle molecole di acqua e di nascondere ad essa
la porzione apolare. In presenza di aria tali molecole si posizionano alla
superficie dell’ acqua esponendo all’aria la porzione apolare. In assenza
di una superficie libera si organizzano in micelle o vescicole. Sulla su-
perficie esterna di tali micelle saranno localizzate le teste polari, mentre
nella parte interna la porzione apolare. Situando le molecole anfipatiche
in una condizione nella quale si creino due ambienti acquosi, uno inter-
no e l’altro esterno alla micella, si ottiene una struttura bimolecolare, in
cui i lipidi sono paralleli e presentano le teste polari sulla superficie su-
periore ed inferiore, e le code apolari nello spazio interno. La condizione
appena descritta e’ esattamente quella che si riscontra nelle membrane
cellulari. La membrana plasmatica infatti separa due ambienti acquosi,
il citoplasma e l’ambiente extracellulare
7.2 i vari modelli di membrana
Fino al momento in cui, nei primi anni a partire dal 1950, la micro-
scopia elettronica è stata applicata allo studio della struttura cellulare,
nessuno aveva visualizato una membrana. Molto tempo prima che le
mebrane fossero realmente viste, prove indirette avevano già portato ad
ipotizzarne l’esistenza. I ricercatori, infatti, avevano tentato di capire
l’organizzazione molecolare delle membrane per più di un secolo. Gli
studi hanno portato alla formulazione del modello a mosaico fluido per
la struttura della membrana. Questo modello, che oggi si ipotizza ap-
pliccabile a tutte le membrane biologiche, ipotizza una membrana come
un mare fluido di fosfolipidi ed altri lipidi con proteine che galleggiano
come “iceberg” in esso e su esso.
Le prime osservazioni degne di nota si devono allo scienziato Charles

7.2 i vari modelli di membrana 87
Overton nel 1890. Overton notò che le cellule smbravano circondate da
una sorta di strato selettivamente permeabile che permetteva a sostanze
diverse di entarre e uscire dalla cellula, con velocità differente. Eglì tro-
vò una correlazione tra la natura lipofilica di una sostanza e la facilità
con cui essa poteva entrare nella cellula. Da queste osservazioni Over-
ton concluse che i lipidi erano presenti sulla superficie cellulare, come
una sorta di rivestimento. Dieci anni dopo Irving Langmuir, studiò il
comportamento dei fosfolipidi purificati e disciolti i un solvente organi-
co (benzene). Ponendo la miscela di fosfolipidi in benzene sull’acqua,
quando il benzene evaporava si formava un monostrato di fosfolipidi in
maniera che la testa polare restasse immersa nell’acqua, mentre la por-
zione apolare si esponeva all’aria. Queste osservazioni divennero la base
per ulteriori studi sulle membrane.
Due fisiologi tedeschi, Gorter e Grendel, nel 1952 cercarono di scopri-
re quanti strati lipidici sono presenti nella membrana plasmatica. Utiliz-
zando gli eritrociti o globuli rossi dl sangue, estrassero da un numero
noto di essi i fosfolipidi e utilizzando il metodo di Langmuir, stratifi-
carono questi su una superficie acquosa. Calclarono l’area coperta dal
film di fosfolipidi e dedussero che ogni globulo rosso doveva possedere
due strati di fosfolipidi. Ovviamente le teste polari erano orientate verso
l’acqua e verso l’aria, proteggendo la porzione apolare. In questo modo
si formava una membrana trilaminare.
Il solo modello del doppio strato lipidico non spiegava molte delle
caratteristiche delle membrane biologiche. Ad esempio il passaggio di
ioni potassio attraverso un doppio strato lipidico impiega giorni, mentre
in una membrana plasmatica naturale solo ore. Hugh Davson e James
Danielli, al fine di spiegare alcune proprietà, ipotizzarono la presenza
di proteine. Nel 1935 proposero che le membrane biologiche erano for-
mate da due strati di fosfolipidi rivestiti esternamente da uno strato di
proteine. Il loro modello definito a “sandwich” era quindi costituito da
proteine-lipide-proteine. Nel 1954 i due scienziati aggiunsero altre prove
al loro modello e definirono che alcune proteine sono inserite nella mem-
brana in modo da formare dei pori polari. Una delle prove che insinuò
dei dubbi su questo modello si ottenne sottoponendo all’azione delle fo-
sfolipasi, enzimi capaci di degradare i fosfolipidi rimuovendone le teste
polari, le membrane. Tale azione enzimatica degradava le membrane di-
mostrando che non era presente uno strato proteico di protezione, come
proposto dai due ricercatori. Le osservazioni al microscopio elettronico

88 struttura molecolare e funzionale delle membrane cellulari
verificarono direttamente la presenza della membrana plasmatica attor-
no ad ogni cellula. Si constatò anche che la maggior parte degli organuli
delle cellule eucariotiche era delimitato da membrane. Ma la scoperta
più importante si ottenne con l’uso dell’ osmio, quale “colorante” per
microscopia elettronica. Si potè osservare che al livello della membrana
apparivano due linee scure (l’osmio reagisce con le teste polari) separate
da una zona centrale chiara (vedi figura precedente). Tale modello defi-
nito di colorazione trilaminare era sempre presente in tutte le membrane
osservate. J. David Robertson propose che tutte le mebrane cellulari han-
no in comune una struttura fondamentale che eglì denominò membrana
unitaria.
7.2.1 Il modello a mosaico fluido
Il modello a mosaico fluido proposto da S. Jonathan Singer e Garth
Nicolson nel 1972, presenta due caratteristiche principali. Il modello
ipotizza una membrana come un mosaico di proteine incluse in mo-
do discontinuo in un doppio strato lipidico fluido (ricco di acidi grassi
insaturi).
Mosaico di proteine
Vennero distinte tre classi di proteine di membrana:
1. le proteine integrali o intrinseche di membrana immerse nello
doppio strato lipidico.
2. le proteine periferiche o estrinseche, più idrofile e localizzate sulla
superficie della membrana legate con legame non covalente alle
teste polari.
3. le proteine ancorate ai lipidi, proteine idrofile presenti sulla super-
Fluidità
ficie della membrana, ma ancorate ad essa a causa del loro legame
covalente con i lipidi.
La maggior parte dei componenti lipidici di una membrana è in costan-
te movimento. Le proteine di membrana sono in grado di spostarsi

7.3 struttura delle membrane biologiche 89
lateralmente ad eccezione di quelle ancorate ad elementi strutturali del
citoscheletro.
7.3 struttura delle membrane biolo-
giche
Le membrane biologiche hanno di solito uno spessore variabile tra i 4.0
ed i 10.0 nm. Sono composte essenzialmente da lipidi e proteine di-
sposti in un modello estremamente semplificato a formare una struttura
trilaminare: una fascia esterna di natura proteica, una fascia intermedia
formata da uno strato lipidico bimolecolare ed una terza fascia, orienta-
ta verso l’interno dell’ambiente cellulare, costituita ancora da materiale
proteico. Su questa distribuzione dei componenti sono stati elaborati
diversi modelli di struttura delle membrane cellulari di cui il più attua-
le è quello «a mosaico fluido». In questo modello la continuità della
membrana è data da uno strato bimolecolare di fosfolipidi disposti in
modo da orientare la parte apolare, (le catene idrocarboniose degli acidi
grassi che li costituiscono), verso la zona più interna della membrana
(strato idrofobico) e la parte polare, (le teste dei fosfolipidi costituite
da glicerolo e basi organiche), verso l’ambiente acquoso rispettivamen-
te all’esterno e all’interno della membrana stessa. L’intelaiatura delle
membrane cellulari è costituita da un doppio strato di lipidi le cui te-
ste idrofile formano le superfici interna ed esterna e le code idrofobe si
uniscono al centro della membrana; il doppio strato ha uno spessore di
circa 4,5 nanometri. Come già detto, le proteine, che costituiscono gli
altri componenti della membrana, possono essere di due tipi. Alcune
dette periferiche sono disposte su entrambe le facce della membrana. Le
altre, dette integrali, penetrano nella membrana per un breve tratto o,
l’attraversano completamente da sole o a coppie.
7.4 il doppio strato lipidico
Come si deduce dal nome, è una doppia sequenza in parallelo di mo-
lecole lipidiche direzionate in modo preciso. Esso è la matrice di base

90 struttura molecolare e funzionale delle membrane cellulari
della membrana oltre che la struttura “portante” delle molecole protei-
che, il cui buon funzionamento dipende in grandissima parte dal mante-
nimento nel tempo e nello spazio delle caratteristiche proprie dei lipidi
componenti.
La particolarità del doppio strato lipidico che subito risalta è il carat-
tere anfipatico: i lipidi sono costretti quindi a disporsi sempre e soltanto
secondo una certa direzione, l’uno rispetto all’altro sia nello stesso mo-
nostrato, sia nel bilayer, il che ha una ragione d’essere in quanto rende
conto di una struttura avente il minor contenuto in energia libera tra
le possibili. Ne deriva che la membrana grazie ai propri lipidi possie-
de le fondamentali proprietà di autoaggregazione e autosigillazione. I
lipidi che si rintracciano normalmente in una membrana cellulare sono
riconducibili a tre tipi: i fosfolipidi, il colesterolo ed i glicolipidi.
Nella Figura 20 sono indicate con GP le glicoproteine nella superficie
esterna della membrana; catene disaccaridiche e oligosaccaridi che con
residui terminali di acido sialico si proiettano nello spazio intercellulare.
G: gangliosidi sulla superficie esterna che proiettano nello strato lipidico
della membrana una catena a due atomi di carbonio e nello spazio inter-
cellulare danno origine a una porzione idrofilica contenente residui di
acido sialico. MP monostrato proteico nella superficie esterna ed interna
della membrana. Le catene polipeptidiche si arrotolano in una caratteri-
stica formazione ad elica. Gli aminoacidi polari si trovano in superficie
mentre gli aminoacidi idrofobici penetrano la regione non-polare dello
strato lipidico. Si possono vedere proteine che penetrano parzialmen-
te nella compagine lipidica e in un punto (al centro) vi è una proteina
che attraversa in linea retta l’intera zona lipidica. T: teste polari dei fo-
sfolipidi. GL: glicerolo.CI: code idrocarburiche dei fosfolipidi. Le code
idrocarburiche possono essere costituite da acidi grassi saturi o insaturi;
queste ultime, più mobili, possono perdere il loro allineamento ordinato
in seno alla compagine lipidica. LL: strato lipidico bimolecolare costitui-
to da fosfolipidi e colesterolo (il nucleo steroidico è raffigurato in seno
alla matrice lipidica). Il monostrato proteico (MP) e il doppio strato
lipidico (LL) costituiscono l’unità strutturale della membrana.
I fosfolipidi sono molecole lipidiche caratterizzate dalla presenza di
un gruppo fosfato variamente sostituito (residui tipici sono: la colina e
la serina- presenti rispettivamente sempre e solo sulla faccia esterna ed
interna della membrana -, l’etanolammina, l’inosotolo). Tale fosfato è
esterificato ad una molecola di glicerolo, a sua volta portante, sempre in

7.4 il doppio strato lipidico 91
Figura 18: Rappresentazione schematica della struttura di una membrana
biologica.
legame estereo, due molecole di acido grasso, in catena carboniosa da 14
a 24 atomi, di cui uno saturo ed uno insaturo (in conformazione cis), che
porta alla formazione di una tipica “piega” nella struttura complessiva,
avente funzione di ostacolarne l’impacchettamento. I doppi legami sono
importanti perché esaltano la fluidità del doppio strato lipidico, oltre al
fatto di contribuire ad abbassare la temperatura di congelamento della
struttura. Il residuo, il fosfato ed il glicerolo formano la cosiddetta testa
idrofila (polare) del fosfolipide, posizionata sempre verso l’esterno del
bilayer, cioè esposta verso la faccia esterna o interna della membrana,
ma mai nell’interno del doppio strato lipidico. I due acidi grassi forma-
no invece la coda idrofoba (apolare) del fosfolipide, racchiusa sempre
nella parte interna della membrana. Stando ferme queste condizioni, i
fosfolipidi sono comunque in grado di subire dei cambiamenti di posi-
zione (movimenti accessibili), quali la diffusione laterale su di uno stesso
monostrato (circa 10 volte al secondo), la rotazione rispetto al gruppo fo-
sfato, la flessione delle code idrocarburiche e più raramente (all’incirca
1 volta ogni due settimane) il cosiddetto flip-flop, cioè il passaggio da

92 struttura molecolare e funzionale delle membrane cellulari
un monostrato all’altro. É importante valutare appieno questi eventi per
capire pienamente la definizione che si dà alla membrana di “mosaico
fluido”.
Il colesterolo, molecola caratterizzata dalla struttura ciclica centrale
dello steroide, piana e rigida, nella quale si individuano da un alto un
gruppo di testa polare (residuo idrossilico) e dall’altro un gruppo di co-
da idrocarburico apolare si inserisce tra i fosfolipidi (in genere secondo
un rapporto di circa 1 a 1) in modo direzionato ed esalta la stabilità
meccanica della membrana, regolandone al tempo stesso la fluidità.
I glicolipidi sono molecole composte da due acidi grassi esterificati
ad una catena variamente diramantesi (in toto da 1 a 15 zuccheri) di
gruppi glucidici di diverso tipo. Sono presenti soltanto sulla faccia ester-
na (circa il 5% dei lipidi totali) della membrana e quindi contribuiscono
in modo precipuo alla sua asimmetria. I glicolipidi si distinguono in
neutri e aventi carica: i primi, detti anche glicosfingolipidi, codificano le
differenze fra specie, fra individui della stessa specie e tra cellule dello
stesso organismo, fungendo quindi da marcatori cellulari; gli altri, detti
gangliosidi, recano residui di acido sialico (che è carico negativamente)
e sono presenti in particolare a livello di neuroni (ne costituiscono il 6%
in massa).
7.5 le proteine di membrana
La qualità e la quantità di molecole proteiche presenti in un doppio
strato lipidico determinano in modo univoco la funzionalità della mem-
brana stessa. Esse genericamente si suddividono in proteine periferi-
che, quando sono posizionate in uno dei monostrati, e transmembrana,
quando invece estrudono da una parte all’altra del bilayer lipidico. Inte-
ressanti sono soprattutto queste ultime. Nelle proteine transmembrana
si individuano (prendendo come riferimento il bilayer) una parte idrofi-
la rivolta verso l’esterno ed una parte idrofoba verso l’interno, in modo
da assicurare la massima interazione con la componente lipidica della
membrana stessa e quindi la massima stabilità alla molecola, il che risul-
ta naturalmente in una migliore funzionalità (si ricordi infatti che una
membrana il cui assetto lipidico sia alterato, funzionerà pure in modo
anomalo o parziale!). Per lo stesso motivo, poi, si tratta in genere di

7.5 le proteine di membrana 93
strutture peptidiche ad α-elica o a β- foglietto, proprio perchè queste
sono le strutture secondarie che assicurano il maggior numero di lega-
mi idrogeno tra peptidi. Una ulteriore suddivisione che si tende a fare
tra le transmembrana è quella basata sulla forma, per cui si riconoscono
proteine bastoncellari, che sono in genere recettori e marcatori cellulari,
e proteine globulari, che fungono in genere da canali proteici.
Lipidi e proteine hanno una notevole libertà di movimento per quan-
to riguarda la diffusione laterale in seno al doppio strato fosfolipidico.
Un preciso grado di fluidità è molto importante per il corretto funzio-
namento della membrana e per la sopravvivenza della cellula. Infatti,
è stato dimostrato che una membrana non assolve più alle sue funzio-
ni biologiche quando i lipidi sono presenti in forma rigida e compatta,
come succede per l’esposizione delle membrane alle basse temperature.
D’altro canto un’eccessiva fluidità, quale quella che si può avere alle alte
temperature, comporta drammatici cambiamenti nella permeabilità del-
la membrana, che perde così ogni sua selettività, comportandosi come
un sistema instabile in 10 cui la funzionalità di gran parte delle protei-
ne viene certamente compromessa. Un opportuno grado di fluidità è
pertanto indispensabile affinchè, a livello delle membrane biologiche, si
possano attuare importantissimi processi biochimici essenziali per la vi-
ta, quali reazioni enzimatiche, processi di trasporto e la respirazione cel-
lulare. Le proteine inglobate meno profondamente nel doppio foglietto
lipidico possono servire alle interazioni delle membrane con l’esterno:
con gli ormoni, con i neurotrasmettitori, con gli autacoidi o con altre
sostanze presenti in circolo (ad es. gli xenobiotici) che, combinandosi
con queste proteine più superficiali, meno profondamente inglobate nel-
la struttura membranosa, danno origine al trasferimento d’informazioni
all’interno dell’ambiente cellulare. L’interazione dell’agente esterno con
il proprio recettore conduce ad alterazioni della componente proteica o
lipidica della membrana (o di entrambe) che possono ripercuotersi in
variazioni di attività di enzimi o di trasportatori o di altro. Tutti que-
sti fenomeni sono resi possibili dalla fluidità della componente lipidica
della membrana.
Le proteine che invece attraversano l’intera compagine della membra-
na servono a fare da ponte attraverso lo strato lipidico e possono per-
mettere il passaggio di molecole che altrimenti non varcherebbero la
barriera idrofobica della membrana stessa. Alcune proteine delimitano
delle zone idrofile, dei canali attraverso cui fluiscono acqua, ioni e mole-

94 struttura molecolare e funzionale delle membrane cellulari
cole idrofile di piccole dimensioni come l’urea e l’alcool. La rigidità e la
pervietà del canale dipendono dalla fluidità della componente lipidica
della membrana. Altre proteine esplicano la funzione di trasportatori. I
trasportatori possono oscillare dall’esterno all’interno.
7.6 i carboidrati di membrana
I glucidi presenti si trovano soltanto sul monostrato lipidico esterno del-
la membrana contribuendo alle caratteristiche di asimmetria. Si indivi-
duano come catene laterali attaccate ai protidi o ai lipidi e si differenzia-
no perciò in:
• glicoproteine (che sono la quasi totale maggioranza delle proteine
totali di membrana), caratterizzate dalla presenza di più catene
glucidiche variamente differenziate per qualità e quantità,
• glicolipidi (che sono circa 1 su 10 dei lipidi totali esterni), caratte-
rizzati dalla presenza di una sola catena glucidica.
Nel loro complesso i carboidrati formano uno strato esterno alla mem-
brana (ed alla cellula in toto) che viene chiamato in vario modo (rive-
stimento, mantello cellulare, glicocalice; ben evidenziabile con una co-
lorazione al rosso rutenio). Le funzioni di tali catene glucidiche sono
molteplici: ancorare le proteine e orientarle nella membrana; stabilizzar-
le, soprattutto se di tipo periferico; svolgere funzione di riconoscimento
inter/intracellulare, funzionando da veri e propri marker.
7.7 meccanismi di trasporto
Nei paragrafi precedenti abbiamo descritto la composizione chimica del-
le membrane cellulari. Passando allo studio delle loro funzioni, dobbia-
mo tra queste annoverare quella che forse è la fondamentale: la regola-
zione del flusso di ioni e molecole tra l’interno e l’esterno delle cellule e
viceversa.
La membrana plasmatica rappresenta una vera e propria barriera tra il
citoplasma e l’ambiente extracellulare, anche se essa, con varie strategie,
può in effetti essere attraversata più o meno facilmente. Essa risulta

7.8 diffusione semplice 95
selettivamente permeabile: esistono infatti, tre different modalità di
trasporto grazie alle quali la cellula mantiene costante la compsizione
intracellulare ed il pH, regola il volume, introduce i nutrienti ed elimina
i composti tossici. Questi processi funzionali sono:
• la diffusione semplice;
• la diffusione facilitata;
• il trasporto attivo.
I primi due meccanismi di trasporto non necessitano di alcun apporto
energetico e ricavano l’energia necessaria o dal gradiente elettro-chimico
presente ai due lati della membrana o dalla stessa molecola. Il trasporto
attivo, invece, è un processo che avviene contro gradiente e richiede
energia libera per essere attuato. tale energia libera viene ricavata dalla
idrolisi dell’ATP.
Un tipico esempio di diffusione semplice è quello che riguarda la mo-
lecola di ossigeno (O2) e il suo trasporto attraverso gli eritrociti. L’ossige-
no, che è una piccola molecola apolare, attraversa rapidamene il doppio
strato lipidico degli eritrociti che lo catturano (al livello dei polmoni do-
ve è presente in elevata concentrazione di pressione parziale) per poi
rilasciarlo nei tessuti periferici dove invece la sua concentrazione è più
bassa. Un comportamento esattamente opposto, ma sempre in modaltà
di diffusione semplice, è quello della anidride carbonica (CO2).
7.8 diffusione semplice
La diffusione semplice attraverso la componente lipidica della membra-
na viene prodotta dal movimento casuale delle molecole che produce un
flusso netto delle sostanze dal compartimento a più alta concentrazione
a quello a concentrazione più bassa. Tale trasferimento avviene senza
consumo di energia e prosegue fino ad una condizione di equilibrio
delle concentrazioni.
Un altra tipologia di diffusione semplice è quella detta per osmosi.
L’osmosi si verifica nel caso di due soluzioni acquose che contengono
quantità diverse di soluto e che si trovano da parti opposte rispetto una
membrana semipermeabile che permette il passaggio del solvente (ac-
qua) ma non quello del soluto (per esempio lo zucchero). In questo caso

96 struttura molecolare e funzionale delle membrane cellulari
l’acqua comincia a passare dalla soluzione più diluita verso quella più
concentrata fino al momento in cui le due soluzioni non raggiungono
la stessa concentrazione (soluzioni isotoniche). L’osmosi è un fenome-
no essenziale per la vita della cellula perchè le membrane cellulari sono
semipermeabili e la presenza o di soluzioni isotoniche o ipotoniche nella
quale la cellula può trovarsi immersa, può causare la morte della cellula.
Per evitare queste conseguenze, la cellula deve sempre trovarsi in con-
dizioni isotoniche rispetto all’ambiente che la circonda. Dovrà quindi
in qualche modo regolare finemente la concentrazione ai due lati della
membrana. Le cellule animali utilizzano principalmente una pompa det-
ta pompa Na + /K + per trasportare continuamente ioni sodio all’esterno.
La pompa Na + /K + è un tipico esempio di trasporto attivo che, quindi,
necessita di energia per poter essere attuato.
7.9 diffusione facilitata
I processi di diffusione semplice e osmosi che abbiamo analizzato, ri-
guardano solo poche sostanze e non sono sufficienti a garantire tutti gli
scambi che la cellula necessita. In particolare, si vede che il doppio stra-
to fosfolipidico risulta impermeabile alle molecole di grosse dimensioni,
alle molecole polari e agli ioni (in pratica a quei sistemi che presentano
una carica netta differente da zero). Per queste molecole, se il processo è
esoergonico la cellula è in grado di attuare un processo detto di diffusio-
ne facilitata che comporta l’utilizzo di particolari le proteine trasportatrici,
dette anche carrier o permeasi o di cosiddetti canali ionici.
7.9.1 Preteine trasportatrici o carrier o permeasi
Le proteine trasportatrici sono proteine inglobate nella mebrana cellu-
lareche si combinano con le particelle da trasportare accelerandone il
movimento attraverso il doppio strato fosfolipidico della membrana. E’
comunque importante notare che il flusso netto delle molecole si veri-
fica sempre secondo il gradiente di concentrazione e cioè dalle regioni
a concentrazione più elevata a quelle più bassa. Da un punto di vista
energetico questo significa che tali processi non necessitano di apporto
di energia dall’esterno anche se le permeasi contribuiscono a facilitare il

7.9 diffusione facilitata 97
passaggio. le permeasi, infatti, una volta legata la molecola da traghetta-
re, subiscono generalmente un cambiamento conformazionale che rende
possibile il transito attraverso la membrana.
Un esempio particolarmente significativo di questo tipo di trasporto
è rappresentato da trasportatore del glucosio dei globuli rossi, anche noto
come GLUT1. Questa molecola presenta dei siti di legami per il gluco-
sio, su entrambi i lati della membrana cellulare e media il trasporto del
glucosio nel seguente modo:
1. ll glucosio si lega alla proteina sul lato esterno della membrana
cellulare;
2. a questo punto si verifica un cambiamento conformazionale della
proteina trasportatrice;
3. il glucosio sul versante intracellulare si dissocia dalla proteina
vettore;
4. a questo punto il ciclo di trasporto è completato con il ritorno di
GLUT1 alla sua conformazione iniziale (senza il glucosio legato)
Il ciclo descritto può avvenire in entrambe le direzioni in dipendenza
delle concentrazioni relative, intracellulari ed extracellulari, di glucosio.
Analisi della sequenza del cDNA hanno evidenziato che GLUT1, cosìco-
me altri trasportatori di membrana, presenta una struttura con 12 regio-
ni idrofobiche ad alfa-elica che attraversano interamente il doppio strato
lipidico creando una cavità centrale attraverso il quale passa il glucosio.
7.9.2 I canali ionici
L’utilizzo dei canali ionici è il secondo modo con cui è attuato il trasporto
facilitato. I canali ionici sono macromolecole proteiche che attraversano,
a tutto spessore, una membrana biologica e che consentono il passaggio
di ioni, nella direzione determinata dal loro gradiente elettrochimico. In
genere, gli ioni tendono a spostarsi da una regione a maggiore concen-
trazione verso una a concentrazione minore, ma in presenza di un gra-
diente elettrico è possibile che non vi sia flusso transmembranarfio di
ioni, anche in presenza di un gradiente di concentrazione. La presenza
di cariche fisse forti sull’imboccatura del canale rende la sua permea-
bilità inversamente proporzionale al raggio anidro degli ioni in quanto

98 struttura molecolare e funzionale delle membrane cellulari
viene allontanato l’alone idrico di solvatazione (es: canale per il sodio).
La presenza di cariche fisse deboli sull’imboccatura del canale rende la
sua permeabilità inversamente proporzionale al raggio idrato degli ioni
(es: canale del potassio). I canali la cui permeabilità (e quindi la loro
specificità) non è correlata né al raggio anidro né a quello idrato, pre-
sentano all’interno una sequenza di specificità che consiste in una serie
di cariche e in una determinata conformazione spaziale che permette il
passaggio solo a determinate specie ioniche.
La Figura ?? mostra una rappresentazione schematica di un canale
ionico
Figura 19: Rappresentazione schematica di un canale ionico: 1 - subunità
proteiche (tipicamente 4 o 5 per canale), 2 - vestibolo
esterno, 3 - filtro selettivo, 4 - diametro del filtro selettivo, 5 -
sito di fosforilazione, 6 - membrana cellulare.
Due tipi particolari di canali ionici sono quelli voltaggio- e chemio-
dipendenti (canale a controllo di ligando). Tali strutture sono in grado
di passare da uno stato di apertura ad uno di chiusura o inattivazione
in seguito a stimolazioni elettriche o chimiche. In ogni caso una delle
caratteristiche principali dei canali di membrana a trasporto facilitato è

7.9 diffusione facilitata 99
che essi permettono una regolazione rapida e fina del passaggio delle
molecole.
I canali chemio-dipendenti sono in grado di aprirsi dopo aver lega-
to un certo messaggero (ligando); sono presenti nelle membrane post-
sinaptiche e si aprono dopo aver legato un neurotrasmettitore. I canali
ionici attivati da ligando sono anche noti come recettori recettori iono-
tropici. Sono costituiti da proteine di membrana con struttura simile ad
altri canali ionici ma che contengono un sito in grado di legare un li-
gando (recettore), solitamente nel dominio extracellulare. Questi sono i
recettori su cui agiscono tipicamente i neurotrasmettitori veloci. Alcuni
esempi sono il recettore colinergico nicotinico, il recettore GABA A e i
recettori del glutammato del tipo NMDA (N-metil-D-aspartato), AMPA
(α-amino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolopropionato) e kainato.
I canali voltaggio-dipendenti si aprono in seguito ad una depolariz-
zazione della membrana; per esempio, i canali al sodio e potassio pre-
senti nelle membrane assoniche permettono la propagazione di impulsi
elettrici nelle cellule nervose.
Per il ruolo che essi svolgono in importanti funzioni cellulari, le mu-
tazioni a carico dei geni che cosificano per le proteine costituenti i canali
ionici, sono responsabili di numerose patologie. Inoltre un sempre mag-
giore conoscenza della struttura e del funzionamento di questi traspor-
tatori appare oggi essenziale per il molecular modelling di farmaci da
utilizzare in interventi terapeutici mirati.
7.9.3 Caratteristiche più importanti della diffusione facilitata
Il trasporto facilitato presenta delle peculiarità molto importanti:
• La specificità,
• la saturabilità,
• l’inibizione,
• la cooperazione
• e l’effetto trans
La specificità permette il passaggio di selettivo di particolari specie ioni-
che e non di altre. Inoltre la velocità con la quale il trasporto facilitato
avviene può anche essere influenzata da altri soluti che sono coinvolti

100 struttura molecolare e funzionale delle membrane cellulari
nel sistema e questi possono sia provocare inibizione o possono produrre
un effetto cooperativo e aumentare il trasporto.
Come è facile intuire la velocità la velocità di trasporto degli ioni co-
munque aumenta con l’aumentare della della differenza di concentrazio-
ne della specie ai due lati della membrana.. Esiste tuttavia una velocità
massima del processo di trasferimento che è legata al numero di per-
measi o di canali ionici presenti. Questo effetto è detto di saturazione
della velocità di trasferimento. L’effetto trans, infine, che si verifica so-
lo per le permeasi, dipende invece dalla capacità che hanno altri soluti
presenti sul lato trans della membrana (il lato verso il quale è diretto il
flusso) di modulare il passaggio delle sostanze attraverso le permeasi.
7.10 il trasporto attivo
Premettiamo subito che il trasporto attivo si verifica in tutti quei casi
in cui il trasporto avviene contro un gradiente di concentrazione. Esso,
quindi, necessita di un apporto di energia esterna per potere avvenire.
L’ambiente intracellulare e quello extracellulare sono caratterizzati da
una distribuzione ineguale di specie ioniche quali Na + , K + , Ca 2+ eH + .
In particolare Na + è presente con una concentrazione di circa 150 mM
all’esterno della cellula e di soli 10-20 mM all’interno. Esattamente oppo-
sta risulta la concentrazione degli ioni K + che hanno una concentrazione
di circa 100 mM all’interno e di soli 5 mM all’esterno. Ancora più mar-
cata è la differenza nel caso dello ione Ca 2+ che ha una concetrazione
citosolica circa 10000 volte inferiore a quella extracellulare. Il traspor-
to attivo è quel processo che rende possibile il mantenimento di queste
elevate differenze di concentrazioni e che, quindi permette un continuo
passaggio di molecole contro il loro gradiente di concentrazione. Que-
sto tipo di trasporto di membrana è detto attivo e necessita di energia
per potere avvenire. Anche il trasporto attivo è mediato da proteine.
Esse sono in grado di legare, in maniera selettiva, un particolare soluto
e quindi di trasportarlo attraverso la membrana in seguito a modifiche
conformazionali (come avveniva per le permeasi ma, in quel caso, non
avevamo un consumo di energia). La caratteristica peculiare di queste
proteine è quella non solo di essere in grado di accoppiarsi con il solu-
to da trasportare, ma anche di avere la capacità di legare ed idrolizzare

7.11 il trasporto attivo diretto 101
molecole di ATP. Ciò significa che il trasporto dei soluti contro gradiente
elettrochimico, richiede dispendio di energia da parte della cellula. Le
proteine che effettuano questo tipo di trasporto vengono dette pompe
ATP-dipendenti o ATPasi.
Si distinguono due tipi di trasporto attivo:
• Il trasporto attivo diretto o primario
• e il trasporto attivo indiretto o secondario.
Nel primo caso l’energia derivante dalla idrolisi dell’ATP viene di-
rettamente adoperata dalla pompa per il trasporto delle particelle (che
in questo caso sono sempre ioni con carica positiva). Nel caso del tra-
sporto indiretto, l’energia necessaria al trasporto contro gradiente non è
fornita direttamente dall’ATP ma dall’esistenza di un gradiente elettro-
chimico che, a sua volta, è ottenuto attraverso un trasporto diretto. Nel
trasporto indiretto si instaura generalmente il cosidetto meccanismo del
co-trasporto (simporto o antiporto), nel quale viene utilizzata l’energia del
gradiente elettrochimico degli ioni Na + e H + , per favorire il movimento
(contro gradiente) di molecole organica di varia natura (ad esempio il
glucosio) e di ioni sia con carica positiva che negativa.
7.11 il trasporto attivo diretto
Il trasporto attivo diretto viene mediato attraverso quatro tipi di ATPasi:
le ATPasi di tipo P, V, F e ABC. In questo paragrafo analizzeremo in
dettaglio la classe di pompa di tipo P della quale fa parte (tra le altre) la
pompa Na + /K − .
Le ATPasi di tipo P sono costituite da due subunità: una detta di ti-
po α con funzionalità catalitiche ed una detta di tipo β con probabile
funzione modulatoria. Queste proteine, nella maggior parte dei casi, so-
no strutturate in tetrameri, α2β2. La subunità alfa è in grado di legare
l’ATP che viene idrolizzato in ADP e fosfato inorganico che poi viene
trasferito si uno specifico residuo di acido aspartico (che si trova sempre
sulla unità α. L’idrolisi della ATP e la successiva fosforilazione della
subunità alfa inducono in queste proteine dei cambiamenti conforma-
zionali; questi, a loro volta, determinano l’espsizione di siti di legami
ad alta o a bassa affinità per gli ioni specifici, che ne consentono dap-

102 struttura molecolare e funzionale delle membrane cellulari
prima il legame su un versante della cellula e successivamente il rilascio
sul versante opposto. La figura ?? mostra lo schema del meccanismo di
funzionamento di una pompa ATPasi di tipo P con la descrizione della
idrolisi dell’ATP e con la successiva fosforilazione.
Figura 20: Schema del meccanismo di funzionamento di una pompa AT-
Pasi di tipo P con la descrizione della idrolisi dell’ATP e con
la successiva fosforilazione.
7.12 la pompa Na + /K +
Questa pompa, che è presente sulla membrana di quasi tutte le cellule
animali è costituita dal tetramero α2β2. La subunità alpha è un po-
lipeptide transmembranario non glicosilato di circa 120000 Da, mentre
la parte β (di dimensioni circa 50000 Da) è un polipeptide glicosilato
ed è localizzato sul versane esterno della membrana. La α è responsa-
bile sia della idrolisi della ATP che del trasporto degli ioni. la β non
sembra necessaria per il trasporto degli ioni ma sembra avere un ruolo
fondamentale per il corretto ripiegamento della subunità α.
Il trasporto mediato dalla pompa Na + /K + prevede il trasferimento
di tre ioni Na + all’esterno della cellula e due ioni K + all’interno per
ogni molecola di ATP idrolizzata. In questo modo la pompa Na + /K +
contribuisce in modo diretto alla diversa distribuzione di cariche ai due
lati della membrana.
7.12.1 Il ciclo della pompa Na + /K +
Il ciclo di trasporto della pompa Na + /K + può essere compreso attraver-
so lo schema riportato in Figura 21 e può essere diviso in 6 fasi.

7.12 la pompa Na + /K + 103
Figura 21: Schema del meccanismo di funzionamento della pompa
Na + /K +
Fase 1: La conformazione E1 della proteina è tale che essa espone, sul
versante interno della cellula, di tre siti di legame ad alta affinità per il
Na + . Questo consente all’enzima ATPasidi legare tre ioni Na + , sebbene
la concentrazione di questo ione sia molto bassa.
Fase 2: il legame tra la pompa e Na + induce il legame dell’ATP sulla
subunità α, la sua successiva idrolisi e, infine, il successivo trasferimento
del fosfato inorganico su un residuo di acido aspartico.
Fase 3: La fosforilazione della subunità α determina la trasformazione
della proteina dalla sua conformazione E1 ad una differente conforma-
zione (che chiameremo E2) caratterizzata dll’esposizione, nel versante
extracellulare, di siti a bassa affinità per Na + : ciò provoca che gli ioni
Na + precedentemente acquisiti vengano rilasciati.
Fase 4: Il rilascio degli ioni Na + lascia liberi due siti ad alta affinità
per il K + , che quindi si legherà facilmente alla pompa sebbene la sua
concentrazione extracellulare sia molto bassa.
Fase 5: Il legame degli ioni K + induce la defosforilazione del re-
siduo di acido aspartico e ciò produce il ritorno della proteina alla
conformazione E1.
Fase 6: A questo punto la pompa ATPasi espone, sul versante citoso-

104 struttura molecolare e funzionale delle membrane cellulari
lico della cellula due siti che sono a bassa affinità per K + che vengono
quindi rilasciati all’interno. la pompa si trova ora quindi nella sua fase
iniziale e può cominciare di nuovo il suo ciclo.
7.12.2 I ruoli funzionali della pompa Na + /K +
Molteplici sono i ruoli funzionali che la pompa Na + /K + assolve. Essa
funge da pompa elettrogenica, in quanto è determinante nel mantenere
la differenza nella distribuzione delle cariche elettriche tra i due versanti
della membrana plasmatica. Questa differenza di potenziale è importan-
tissima in quanto costituisce il fondamento essenziale per la generazione
dell’impulso nervoso nei neuroni e nelle cellule muscolari. La pompa
risulta inoltre indispensabile per il mantenimento dell’equilibrio osmo-
tico delle cellule animali. Infine, il gradiente elettrochimico degli ioni
Na + , generato dalla pompa Na + /K + viene utilizzato, nelle cellule ani-
mali, come fonte di energia nel trasporto attivo di tipo secondario di
zuccheri ed amminoacidi.
7.13 il trasporto attivo indiretto
Il trasporto attivo di zuccheri, amminoacidi e di altre molecole organiche
contro gradiente di concentrazione è spesso associato ad un cotrasporto
con ioni Na + (per le cellule animali) o con protoni (per quelle vegetali).
le proteine che mediano questo tipo di trasporto, detto secondario o
indiretto, non utilizzano energia che deriva direttamente dalla idrolisi
dell’ATP, ma piuttosto quella accumulata nel gradiente elettrochimico
generato dalle pompe ATPasi.
Un esempio di trasporto attivo secondario è quello che permette il
movimento, contro gradiente di concentrazione, di glucosio dal lume in-
testinale verso l’interno dell’enterocita (le cellule dell’epitelio intestinale)
attraverso un meccanismo di simporto con il Na + mantenuto dalla pom-
pa Na + /K + . Il glusosio che con questo meccanismo indiretto penetra
nell’enterocita, successivamente passa al sangue per diffusione facilitata
secondo il gradiente di concentrazione.

8 T R A S D U Z I O N E D E L
S E G N A L E
8.1 introduzione
negli organismi multicelluari le cellule non sono entità isolate, ma hanno
un comportamento sinergico e comunicano tra di loro con un processo
definito di segnalazione cellulare. Questo processo è indispensabile
per regolare la formazione dei tessuti, la loro struttura tridimensionale
e per guidare l’organizzazione dei vari tessuti all’interno degli organi e
controllarne il funzionamento.
Da un punto di vista biuologico, la segnalazione cellulare è un pro-
cesso molto complesso che consiste nella produzione e nel rilascio di
segnali di natura sia chimica che elettrica, i quali vengono poi veico-
lati fino alle cellule bersaglio permettendo lo scambiuo di informazio-
ni. Il continuo passaggio di stimoli tra i neuroni, per esempio, è alla
base del funzionamento del sistema nervoso, così come la capacità di
gni singola cellula di sopravvivere, proliferare, differenziarsi all’inter-
no di un tessuto dipende da segnali esterni provenienti da altre cellule
dell’organismo.
8.2 i tipi di segnalazione cellulare
Le principali molecole responsabili dello scambio di informazione tra le
cellule sono fattori solubili quali i neurotrasmettitori, gli ormoni i fat-
tori di crescita o le citochine, la cui struttura chimica può essere molto
varia. A seconda del raggio di azione dei fattori solubili che possono
difondere nello spazio pericellulare oppure essere rilasciati nel circolo
sanguigno o linfatico, la segnalazione cellulare si distingue in paracrina,
autocrina ed endocrina. Nel caso della comunicazione paracrina, una
sostanza rilasciata da una cellula va ad agire su una cellula posta nel-
le immediate vicinanze. La comunicazione autocrina prevede che una
cellula secerna una molecola segnale che va ad agire sulla cellula stessa
105

106 trasduzione del segnale
che l’ha prodotta oppure su cellule dello stesso tipo che risponderanno
in maniera coordinata. Esistono anche casi di comunicazione delle cellu-
le che non sono mediate da fattori chimici dispersi nei liquidi fisiologici,
ma, invece, da contatto tra le singole cellule o tra cellule e strutture della
matrice extra-cellulare. Questi tipi di contatto, che possono essere defi-
niti di posizione, forniscono importanti informazioni alla cellula sulla
sua localizzazione all’interno di un tessuto. Un esempio è rappresentato
dalla migrazione dei leucociti che, per attivare la risposta infiammatoria,
devono uscire dal circolo sanguigno e penetrare nel connettivo dell’orga-
no sede dell’infiammazione. In questo caso le interazioni con le cellule
endoteliali della parete vasale prima, e con lo stroma poi, forniscono ai
leucociti informazioni sulla loro posizione, permettendo la corretta atti-
vazione dei processi infiammatori ed immuni. La Figura 22 mostra i vari
tipi di segnalazione cellulare. Quella dipendente da contatto (A), quella
paracrina (B) che dipende da segnali rilasciati nello spazio extracellula-
re e che agiscono localmente sulle cellule vicine; Segnali sinaptici (C),
effettuati tra i neuroni che trasmettono i segnali elettricamente; Quella
endocrina (E) dipendente dalle cellule endocrine che rilasciano ormoni
all’interno del flusso sanguigno per la loro distribuzione in tutto il corpo.
8.3 i recettori
I segnali necessari per le comunicazioni intercellulari, siano ormoni o
molecole della matrice extracellulare, una volta giunti sulla cellula ber-
saglio, esercitano la propria azione attraverso specifici recettori cellulari.
I recettori sono proteine che, a seguito dell’interazione con la moleco-
la segnale, denominata ligando funzionano come interruttori molecola-
ri, determinando l’accensione di particolari vie metaboliche che possono
modificare le funzioni cellulari. Esiste una specificità di legame tra pro-
teine recettrici ed i rispettivi ligandi, per cui ne consegue che la capacità
di una cellula di rispondere a determinati stimoli è definita dal corredo
di recettori in essa presenti.
le caratteristiche fondamentali che i recettori devono avere nei con-
fronti dei loro ligandi sono due: la specificità e l’affinità di legame.
Il recettore ed il suo ligando si riconoscono attraverso una specifi-

Figura 22: Meccanismi di segnalazione cellulare.
8.3 i recettori 107
cità detta sterica. La specificità di interazione è cioè assicurata dalla
presenza nella struttura tridimensionale del ligando di una regione chi-
micamente e strutturalmente complementare alla molecola del recettore
e detta sito di legame. La complementarietà tra ligando e recettore è
assicurata dalla possibilità di formare, in modo spontaneo e reversibile,
legami di natura debole. Ovviamente l’affinità di legame definisce le
concentrazioni di ligando necessarie per formare il complesso ligando-
recettore: più elevato è il numero di legami che si formano tra ligando e
recettore e maggiore sarà l’affinità. Poichè poi in una cellula, la concen-
trazione del recettore è sempre costante, per aumentare la probabilità
di formazione del complesso Ligando-Recettore e quindi attivare il ber-
saglio (ovvero spostare a destra la reazione) è necessario aumentare la
concentrazione del ligando. La maggior parte dei fattori di segnalazione
non è in grado di passare direttamente attraverso le membrane cellula-
ri data la loro natura idrofilica ed il peso molecolare elevato; Queste
molecole, pertanto, devono trasdurre i segnali all’interno del citoplasma
senza penetrarle all’interno della cellula ma riconoscendo e legando spe-
cifici recettori localizzati sulla membrana cellulare. Questi recettori di

108 trasduzione del segnale
membrana che costituiscono la maggior parte del sistema recettoriale
della cellula, sono proteine intrinseche che attraversano il doppio strato
lipidico della membrana. Generalmente sono organizzate in tre regioni
funzionalmente distinte: la regione extracellulare che forma la tasca di
legame per il ligando specifico; la parte transmembrana, che può esse-
re monopasso o multipasso e, infine una regione interna, rivolta verso
il citoplasma della cellula. Sulla base di questa struttura, le molecole
di segnale idrofiliche restano al di fuori della cellula, legono il dominio
esterno del recettore, che a sua volta si accende come un interruttore a
tempo e attiva una cascata di segnali all’interno della cellula tramite la
porzione esposta nel versante citoplasmatico della mambrana.
Esistono però classi particolari di molecole segnale di natura lipidi-
ca, come ad esempio di ormoni steroidei, l’ormone tiroideo, la vitami-
na D e I derivati dei retinoidi. Queste molecole, di natura idrofobica,
hanno una struttura planare simile a quella del colesterolo e durante il
trasporto attraverso il torrente circolatorio sono associati a trasportatori
proteici; una volta raggiunto il bersaglio queste sostanze sono in grado
di attraversare il doppio strato lipidico delle membrane in modo spon-
taneo (per diffusione semplice) proprio grazie alla loro gli idrofobicità
e, giunte nel citoplasma, legano recettori proteici intracellulari. il fatto
che la loro azione richiede l’intervento di recettore, permette un’azione
mirata degli ormoni steroidei solo nelle cellule che presentano il recet-
tore corrispondente. La Figura 23 illustra il meccanismo dei recettori di
membrana così come di quelli intracellulari.
I recettori intracellulari sono costituiti da tre regioni funzionalmente
distinte: una che attiva la trascrizione, una seconda che lega il DNA in
sequenze specifiche ed una terza che lega l’ormone. In condizioni di ri-
poso il recettore si trova legato ad una molecola inibitrice che maschera
il sito legante il DNA. Quando l’ormone si lega, la molecola del recettore
cambia di conformazione rilasciando la proteina e smascherando il sito
legante il DNA. In questo modo il complesso ormone-recettore può in-
teragire con le sequenze del promotore del gene bersaglio regolandone
la trascrizione. In Figura 24 è mostrato il meccanismo di funzionamento
di un tipico recettore intracellulare che, raggiunto da un ligando, sco-
pre la sua parte che si accoppia al DNA e stimola l’espressione di geni
specifici.

8.4 funzionamento dei recettori 109
Figura 23: Meccanismo dei recettori di membrana (A) e di quelli
intracellulari (B).
8.4 funzionamento dei recettori
I recettori a discolo da interruttori molecolari in grado di attivare la
produzione di segnali chimici che modificano svariate funzioni cellulari
quali l’attività metabolica, la motilità dell’espressione genica la prolife-
razione o il differenziamento. Questi eventi avvengono grazie alla mo-
dificazione di uno o più funzioni enzimatiche. Ovviamente, perché la
segnalazione possa svolgersi, è necessario che si verifichi la stretta intera-
zione tra ligando e recettore; Quest’ultimo subisce così un cambiamento
conformazionale che induce l’attivazione di enzimi specifici che al loro
volta sono i diretti controllori di specifiche attività cellulari. La regolazio-
ne delle attività enzimatiche si attua tramite la modifica della struttura
terziaria dell’enzima stesso in modo reversibile. Esistono differenti modi
per alterare la struttura terziaria di una proteina, ma il metodo più comu-
ne, in risposta alle molecole segnale, consiste nell’aggiunta di un gruppo
fosfato su specifici residui amminoacidi. Questo processo si chiama fo-
sforilazione e gli amminoacidi fosforilabili sono quelli che hanno un

110 trasduzione del segnale
Figura 24: Meccanismo dei recettori intracellulari che sono costituiti da
molecole capaci di legare il DNA. In forma inattiva (B) il recettore
è legato a proteine inibitrici; nel momento in cui il
ligando lega il recettore si verifica una modifica della molecola
che comporta il distacco della proteina inibitrice e l’attacco
di proteine co-attivatrici (C). Il complesso può allora legare il
DNA ed attivare/reprimere l’espressione di genispecifici
residuo ossidrilico disponibile per il legame al gruppo fosfato: la serina,
la treonina o la tirosina. L’aggiunta di questo gruppo causa quindi una
riorganizzazione dei legami che controllano la struttura terziaria della
proteina e porta con sé ad una transizione funzionale. La fosforilazione
di una proteina è un evento transitorio, che viene determinato dall’a-
zione di enzimi in grado di staccare il gruppo fosfato dalla proteina e
quindi di spegnere la risposta. La formazione di un legame covalente
richiede l’intervento di un enzima che operi la fosforilazione. Gli enzimi
che sono in grado di fosforilare proteine o altri substrati sono denomi-
nati chinasi. Wuelli che invece operano la defosforilazione sono detti
fosfatasi. Chinasi e fosfatasi sono quindi due classi di enzimi chiave
nella regolazione delle attività cellulari. E’ altrettanto importante sotto-
lineare che, essendo essi stessi degli enzimi, sono soggetti a regolazione
funzionale da parte dei recettori nel processo della segnalazione.
8.5 meccanismi molecolari di trasdu-
zione del segnale
Per trasduzione del segnale, si intende l’nsieme di fenomeni che, nella
cellula, permette il propagarsi di un segnale e lo scatenarsi di un even-
to finale a seguito di uno stimolo iniziale. Il termine trasduzione sta

8.5 meccanismi molecolari di trasduzione del segnale 111
a indicare che non si tratta di una semplice trasmissione, ma, in analo-
gia con quanto avviene in un trasduttore, i segnali extracellulari sono
convertiti in risposte cellulari e in molti casi si ha trasferimento di ener-
gia e/o trasformazione di una forma di segnale in un’altra. Processi
di trasduzione del segnale si hanno nel caso del legame di ormoni co-
stituiti da peptidi o proteine e di fattori di crescita a recettori specifici
presenti sulla superficie cellulare. Questi, successivamente, trasferisco-
no il segnale dell’avvenuto legame con l’ormone o con i fattori di cre-
scita a proteine intracellulari. Per es., nel caso dell’adrenalina: questa
molecola forma un complesso con un recettore specifico, una proteina
inserita nella membrana cellulare. Il complesso ormone-recettore atti-
va una proteina G, così chiamata perché lega i nucleotidi guanilici. La
proteina G è formata da tre subunità, α, β, e γ, unite tra loro. Di que-
ste, la ? lega il GDP. L’attivazione comporta la sostituzione del GTP al
GDP sulla subunità α, che si dissocia dalle altre due subunità. L’ α-
GTP si associa, attivandola, all’adenil-ciclasi, un enzima che catalizza
la formazione di AMP ciclico (cAMP), a partire da ATP. Il cAMP che,
per la funzione che svolge, è denominato anche secondo messaggero, si
associa, attivandola, alla proteina-chinasi, che catalizza la fosforilazione
della fosforilasi-chinasi, enzima che a sua volta catalizza la fosforilazio-
ne della glicogeno-fosforilasi. Quest’ultimo è l’enzima che catalizza la
degradazione del glicogeno in glucosio-1-fosfato. L’ormone ha come
obiettivo quello di provocare un aumento nella concentrazione di gluco-
sio: il segnale è trasmesso dalla membrana cellulare al citosol, attraverso
una serie di interazioni specifiche proteina-proteina a cascata, i cui com-
ponenti sono per lo più delle proteine enzimatiche, in grado cioè di
amplificare il segnale, in quanto ogni molecola di enzima catalizza a sua
volta la modificazione di un numero di molecole del substrato-enzima
successivo.
Da un punto di vista molecolare si possono identificare tre principali
meccanismi di funzionamento dei recettori:
1. Recettori che attivano le proteine G (vedi esempio precedente);
2. Recettori collegati ad enzimi;
3. recettori che attivano canali ionici
Mentre le prime due classi rappresentano la stragrande maggioranza, i
recettori che attivano canali ionici sono coinvolti soprattutto nella comu-

112 trasduzione del segnale
nicazione tra le cellule nervose dove il segnale scambiato evoca risposte
elettriche.
Le Figure 25 e 26 riportano i modelli di funzionamento delle tre classi
di recettori.
Figura 25: Recettori che attivano canali ionici

8.5 meccanismi molecolari di trasduzione del segnale 113
Figura 26: Recettori accoppiati a proteine G (in alto) e recettori associati
ad enzimi (in basso)

I N D I C E A N A L I T I C O
Citoplasma, 11
Cromosoma, 11
Eritrociti, 64
Eucarioti, 8
Gene, 11
Istoni, 11
Leucociti, 106
Nucleo, 9
Nucleoide, 7
114
Oraganelli cellulari, 9
Pleiotropia, 65
Procarioti, 4
Promotore, 33, 36
Recettori, 106
Ribosomi, 8
Stroma, 106
Virus, 16