Fase mobile - Scuoletoscane.it

La cromatografia è il metodo più diffuso per effettuare
separazioni analitiche analitiche.
Fu inventata e così denominata da un
botanico russo, Mikhail Tswett, nel 1906.
Separò pigmenti vegetali come clorofille
e xantofille, fll ffacendo d passare etere ddi
petrolio attraverso una colonna riempita
con carbonato di calcio. I vari pigmenti pg
davano luogo alla formazione di strati di
diverso colore.

Etere di petrolio
CaCO 3
Esperimento di Tswett
Miscela di pigmenti
pigmenti
separati

Principi generali
La cromatografia è un metodo di separazione che sfrutta la diversa
affinità delle molecole e degli ioni nei confronti di due fasi differenti.
Fase stazionaria: è fissa (solido o liquido supportato). Rappresenta la
resistenza alla migrazione di un soluto.
FFase mobile bil ( (o eluente): l t ): li liquido id ogass che h sscorre ssulla ll ffase s fiss fissa; ; provoca lla
migrazione di un soluto nella direzione del suo scorrimento.
La migrazione differenziale:

Esperimento fondamentale
a. Caricamento in colonna di una miscela di
fase stazionaria è saturata dall’eluente
dall eluente.
tre sostanze (A, B, C); la
b. Via via che viene aggiunto l’eluente, i diversi componenti si separano
e formano delle bande (ben ( visibili nel caso di sostanze colorate). )
c,d. Raccolta di frazioni di volume noto in uscita dalla colonna.

Dinamica della separazione p
Durante l’eluizione si realizza una sorta di competizione tra fase
stazionaria e fase mobile nei confronti delle sostanze eluite eluite.
Ogni componente della miscela tende a distribuirsi tra le due fasi
passando passan o (in (ncon condizioni z on ideali) a ) attraverso attra rso una serie s r infinita nf n ta di stati stat
di equilibrio che si realizzano in ogni strato di spessore infinitesimo
della colonna.

Dinamica della separazione
I componenti maggiormente
ttrattenuti tt ti ddalla ll ffase
stazionaria si muovono più
lentamente con il flusso di fase
mobile.
I componenti più debolmente
trattenuti dalla fase
stazionaria z
rapidamente.
si muovono mu più pù
Per la differente mobilità, i componenti del campione si
separano in bande discrete (analisi qualitativa e
quantitativa).
tit ti )

Classificazione delle tecniche
cromatografiche g f
Le tecniche
cromatografiche possono
essere suddivise in base a:
- tipo di fase mobile;
- meccanismo di
separazione;
- tecnica di eluizione eluizione.

Classificazione f in base al tipo p di fase f
mobile

Classificazione f in base al tipo p
di eluizione

Classificazione f in base al meccanismo di
separazione

Adsorbimento
A
Fase stazionaria: solido in polvere; sulla superficie dei granuli si trovano dei
siti attivi in grado di stabilire legami deboli con le molecole della miscela da
separare.
Fase mobile: se é un liquido si parla di cromatografia liquido-solido (LSC); se é
un gas, s di cr cromatografia m t r fi gas-solido s s lid (GSC) (GSC).
Durante l’eluizione l eluizione, le molecole si
ciascuna sostanza si ripartiscono
tra le due fasi, in misura variabile
secondo l’entità lentitàdell’adsorbimento dell adsorbimento.

Adsorbimento
la quantità di adsorbato dipende dalla
superfice di contatto tra il gas ed il solido.
ma dipende anche dalla
pressione del gas e dalla
temperatura
Ri ld d il it
Riscaldando il sistema
le molecole di gas
tendono a staccarsi dalla
fase fissa

Adsorbimento
Equazione di Freundlich
L’ L’adsorbimento d bi t è ill illustrato t t d da d detta tt equazione i
Cf = a P 1/n in cui : :Cf = conc conc. . nella fase fissa
C f
saturazione
pressione pressione
P = pressione del gas, a ed n
dipendono p dalla natura delle
sostanze e dalla temperatura
In genere genere si scelgono le
condizioni operative
lontane dalla saturazione
ddove ve ll’andament andamento è quasi
rettilineo

Ripartizione p
L1 inn questa rappresentazione rappresentaz one i puntini punt n
indicano le molecole di sostanza S ;
L2
le freccette invece indicano il movimento
di queste tra le due fasi sino al
raggiungimento dell’equilibrio

Ripartizione – Equaz. di Nernst
La sostanza S si scioglie ripartendosi tra le due fasi
L1 e L2 secondo l’equazione l equazione di di Nernst C CL1 L1/C /C L2 = K
(costante)
C CL1 L1= L1 = Conc
C L2 =
Conc di d S in n L1 L ;
= Conc di S in L2
K = dipende dalle sostanze presenti e dalla temperatura.
C L1
C L2

Ripartizione p
Fase stazionaria: é un liquido, che impregna un solido granulare
inerte inerte, in cui le sostanze da separare si solubilizzano solubilizzano. Esse si
ripartiscono fra le due fasi (immiscibili tra loro), secondo la diversa
solubilità in ciascuna di esse.
K = Cs/Cm
K = coefficiente di ripartizione.
Cs = concentrazione della sostanza nella
fase stazionaria.
Cm = concentrazione della sostanza nella
fase mobile mobile.
FFase mobile: bil seèè un gas sii parla l di cromatografia fi gas-liquido li id (GLC) (GLC),
se invece é un liquido, di cromatografia liquido-liquido (LLC).

Nelle colonne
cromatografiche la
la
ripartizione si realizza
impregnando con una
sostanza oleosa i
microgranuli che
riempiono la colonna
Ripartizione
Rp
sito di ripartizione
molecole di gas
sito di
adsorbimento

Ripartizione Rp /A /Adsorbimento
Si deduce che sia il diagramma g dell’adsorbimento che
quello della ripartizione hanno lo stesso andamento.
andamento
A
Per descrivere la separazione si
preferisce quindi parlare di:
concentrazione in fase fissa
B concentrazione concentrazione in in fase fase mobile mobile
C mobile

Scambio ionico
Fase stazionaria: polimeri con gruppi ionici o ionizzabili, acidi o
basici (resine a scambio ionico), in grado di scambiare gli ioni mobili
ddella ll resina i con quelli lli presentii nella ll soluzione l i a contatto con essa.
Si instaura una competizione fra i controioni della fase stazionaria
e quella della miscela in analisi nei confronti dei siti attivi presenti
sulla fase stazionaria.

Esclusione
FFase stazionaria: t i i gellcon porii lle cuiidi dimensioni i i variano i iin bbase
alla composizione chimica e al modo in cui viene preparato.
Le molecole di analita disciolte nella fase mobile penetrano nel
Le molecole di analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nel
gel e vi permangono per un certo tempo. Quelle grandi sono
escluse daiporiedesconodallacolonnaintempimoltobrevi.

Affinità
a. Le molecole da separare si legano a gruppi funzionali
specifici f ddella ll ffase stazionaria mediante d una reazione reversibile. bl
b. e c. Eluendo con una fase opportuna, si rompono i legami con
la fase stazionaria e si recuperano le molecole molecole.

Il cromatogramma
Fatta eccezione per la TLC e la PC, tutte le
separazioni cromatografiche si concludono
con un tracciato i edd ognii sostanza eluita l i è
detto picco cromatografico.
Il tracciato descrive l’andamento del
rivelatore in funzione del tempo o del
volume di eluente eluente, a t t =0 =0.
tM: tempo morto = tempo di ritenzione di una
sostanza non trattenuta dalla fase stazionaria
tR: tempo di ritenzione = tempo impiegato da
ciascuna sostanza per scorrere attraverso la
colonna, l ddal l tt=0 0 fi fino all momento t iin cuiinon sii hha il
massimo del picco.
h: altezza del picco p = distanza tra il massimo e la linea di base.
w b: larghezza alla base del picco = lunghezza del segmento interpolato
all’intersezione fra le tangenti ai flessi della gaussiana e la linea di base.

Selettività l i i à
La selettività indica la capacità p di un
sistema cromatografico di eluire specie
chimiche diverse a velocità il più possibile
diverse diverse, in modo tale che siano ben separate
l’una dall’altra all’uscita della colonna.

Efficienza
Indica la capacità di un sistema cromatografico
di eluire tutte le particelle di una data specie
chimica con la stessa velocità, in modo da
fornire bande e picchi molto stretti.
Si può esprimere facendo riferimento alla
larghezza del picco (ad es. wb ), che è diversa
per ogni specie chimica. Essa, però, dipende dal
tempo p di ritenzione.
Bassa efficienza
Buona efficienza

Risoluzione
Indica il grado di separazione dei picchi ottenuti al rivelatore di un
sist sistema m ccromatografico; m t fic ; bbande nd bben n sseparate p t lun lungo lla ccolonna l nn generano n n
picchi distinti e sufficientemente stretti da non sovrapporsi. In tal
caso si dice che i picchi sono “ben risolti”.
Effetto della selettività, dell’efficienza e del fattore di ritenzione
sulla risoluzione.
Selettività ed efficienza insufficienti: i
picchi i hi ddei i componenti ti A e B sii
sovrappongono.

Se si migliora la selettività (ad es.
cambiando la fase stazionaria) si ottiene
una buona risoluzione: i tempi di ritenzione
cambiano e i picchi sono separati.
Se si migliora g l’efficienza, , la risoluzione
diventa accettabile: le basi dei picchi si
restringono e i picchi risultano nettamente
separati separati.
La colonna ha una buona efficienza, ma la
risoluzione i l i è iinsoddisfacente ddi f t (b (basso ffattore tt
di ritenzione). La risoluzione può migliorare
iniettando una minore quantità di miscela.