dott. Davide Nicoli e

DIPARTIMENTO DI
MEDICINA DI LABORATORIO
Direttore: Claudio Dotti
Referenti ORIA: Davide Nicoli
Roberto Ugolotti

PROGETTI DI RICERCA
LAB.BIOLOGIA MOLECOLARE
Bruno Casali
Davide Nicoli
Enrico Farnetti
Loretta Fornaciari
Laura Pattaccini
Alessia Ciarrocchi
Raffaele Frazzi

Progetto interdipartimentale ed
interdisciplinare per la creazione di
una “Tissue Tissue bank” bank dei linfomi
A cura di:
Francesco Merli (DH ematologico)
ematologico
Riccardo Valli (Anatomia Patologica)
Raffaele Frazzi (DH ematologico/Lab
ematologico/Lab.Biologia
.Biologia molecolare)
Silvia Serra (Anatomia Patologica)
nell’ambito nell ambito del progetto aziendale Linfocare

Scopi
Una biobanca (Tissue Tissue bank) bank)
ha come scopo la conservazione di cellule,
tessuti ed organi ai fini di ricerca. La sistematica archiviazione archiviazione
di tali
materiali biologici e la loro integrazione con le informazioni cliniche cliniche
ad
essi correlate svolge un ruolo centrale nella ricerca traslazionale e negli
studi di efficacia sui farmaci.
Descrizione sintetica del progetto
Parte dei tessuti bioptici verranno destinati al laboratorio di Biologia
Molecolare per fini di criopreservazione e ricerca. Tali tessuti potranno
essere utilizzati per la purificazione di acidi nucleici (DNA o RNA),
proteine, oppure per la preparazione di sospensioni cellulari da utilizzare
per caratterizzazioni molecolari e/o fenotipiche. fenotipiche.
I dati così cos ottenuti
saranno inseriti in una banca dati ed utilizzati per correlare le le
caratteristiche cliniche con quelle genetiche e molecolari ottenute ottenute
dagli
studi sulle biopsie.
Tempi
Sono stati presi accordi con l’Anatomia l Anatomia Patologica e definito il percorso che
il frammento bioptico, bioptico,
previo consenso informato, potrà potr seguire per
essere utilizzato in questo progetto. Sono stati inventariati ed acquistati
gran parte dei materiali necessari per la realizzazione di tale studio.
Attualmente è in corso la valutazione da parte del Comitato Etico della
AO S.Maria Nuova.

Studio delle variazioni molecolari indotte dal
trattamento con doxorubicina o Interferon-γ Interferon in
modelli sperimentali di Linfoma di Hodgkin
A cura di:
Raffaele Frazzi, Francesco Merli, Bruno Casali.
Strutture: Day Hospital di Ematologia, Laboratorio di Biologia Molecolare.
Molecolare.
È noto che i pazienti affetti da linfoma di Hodgkin sono caratterizzati da deficienze
dell’immunit
dell immunità cellulo-mediata
cellulo mediata e che presentano una ridotta proliferazione dei
linfociti T ed una ridotta sintesi di citochine di tipo Th1 (a cui appartiene IFN-γ). IFN ). Le
ricerche che stiamo conducendo hanno lo scopo di caratterizzare l’attivit attività di IFN-γ IFN
su linee cellulari di linfoma di Hodgkin derivate da sclerosi nodulari o cellularità cellularit
mista. Gli esperimenti sono focalizzati su proteine coinvolte nella nella
regolazione del
ciclo cellulare e nel processo di apoptosi. apoptosi.
Tutti gli esperimenti vengono condotti
anche con doxorubicina, doxorubicina,
un farmaco utilizzato convenzionalmente nella
polichemoterapia ABVD.
Gli estratti totali o citoplasmatici vengono analizzati mediante Western blotting e le
eventuali variazioni nelle proteine di interesse quantificate e rapportate ad una
proteina costitutiva (actina ( actina). ). La microscopia a fluorescenza viene utilizzata per
valutare eventuali danni al DNA o al nucleo (saggio TUNEL) oppure oppure
per la
valutazione dell’apoptosi
dell apoptosi mediante AnnV / Ioduro di propidio. propidio.
Sono stati utilizzati
anche saggi immunoenzimatici e prevediamo di utilizzare la citofluorimetria in un
prossimo futuro.

PROGETTI BIOLOGIA MOLECOLARE IN FASE DI
CONCLUSIONE
-MICROARRAY: Genotipizzazione mediante microarray di geni
di suscettibilità e farmacogenomica dei linfomi di Hodgkin
(in collaborazione con Sequenom Inc, USA)

Ruolo del fattore di trascrizione Id1 nella
formazione e nella progressione dei tumori
della tiroide
Alessia Ciarrocchi, Roberto Valcavi, Simonetta Piana, Giorgio Gardini, Bruno
Casali
Unità operative coinvolte: Biologia Molecolare; Endocrinologia;
Anatomia Patologica
Progetto della durata di tre anni, resoconto attività primo anno

I carcinomi della tiroide sono le neoplasie endocrine piu’ diffuse e la loro
incidenza e’ in progressivo aumento.
I carcinomi tiroidei sono generalmente lesioni indolenti, con bassa
frequenza di proliferazione e potenziale metastatico.
Tuttavia una ridotta frazione di carcinoma tiroidei e’ altamente aggressiva
e conduce alla morte del paziente in pochi mesi (poco differenziati e
anaplastici).
Attualmente la diagnosi dei carcinomi tiroidei si basa esclusivamente su
caratteristiche morfologiche del tessuto tumorale in quanto non si
conoscono marcatori molecolari prognostici di elevata malignita’.
La mancanza di tali marcatori riflette una scarsa conoscenza dei
meccanismi molecolari coinvolti nella formazione e progressione dei
tumori tiroidei

Scopo del progetto:
Caratterizzazione di nuovi meccanismi molecolari coinvolti
nell’insorgenza e nella progressione dei tumori tiroidei
Possibili ricadute:
1) Identificazione di nuovi marcatori per la diagnosi dei tumori tiroidei
2) Identificazione di nuovi target per lo sviluppo di trattamenti
alternativi nei tumori piu’ aggressivi che non rispondono alle terapie
attualmente in uso.

Analisi della funzione della proteina Id1
nella formazione e progressione dei
tumori tiroidei
Id1 e’ un regolatore della trascrizione che influenza il differenziamento e
la proliferazione di diversi tipi cellulari.
Nei tumori della mammella l’espressione di Id1 e’ predittiva di un elevato
potenziale metastatico.
Id1 controlla l’espressione di molti geni fra cui geni coinvolti nella
progressione del ciclo cellulare (proliferazione) e nell’interazione della
cellula con il microambiente circostante (invasivita’).
Id1 e’ un importante fattore proangiogenetico.

1. Analisi dell’espressione della
proteina Id1 nei tumori tiroidei
mediante immunoistochimica e
correlazione dei livelli di
espressione con il grado di
malignita’ del tumore
Approccio Sperimentale
2. Analisi della funzione
molecolare di Id1 in colture
cellulari derivanti da tumore
tiroidei.
3. Identificazione dei geni regolati
da Id1 nelle cellule di tumore
tiroideo.

Stato di avanzamento del progetto
1. Analisi dell’espressione di Id1 nei tumori tiroidei
Carcinoma Papillare
Cellule Alte
Carcinoma Papillare
Sclerosante Ben Differenziato
Carcinoma Follicolare
Insulare Poco
Differenziato
Carcinoma Follicolare
Ben Differenziato
Carcinoma Papillare
Insulare Poco Differenziato
Tumori analizzati 18
Positivi 13
Ben differenziati 13/18
Positivi 10/13
Poco differenziati 5/18
Positivi 3/5
Deceduti con metastasi 4/18
Positivi 3/4

BCaPC
WRO
Stato di avanzamento del progetto
2. Analisi della funzione di Id1 nelle cellule di tumore
tiroideo
TPC-1
Sw579
actina
Id1
BCaPC tumore papillare
WRO tumore follicolare
TPC-1 tumore papillare
SW579 tumore
anaplastico
Id1 è maggiormente espresso nelle
cellule meno differenziate e più
aggressive di tumore anaplastico
(SW579)
Cloni Id1 Cloni Controllo
Es. di cloni che iper esprimono Id1
Induzione dell’espressione di Id1 in cellule di tumore papillare (BCaPC)
Isolamento di cloni singoli mediante selezione
Analisi delle funzioni cellulari mediante confronto cloni che
iperesprimono Id1 vs cloni controllo
Funzioni cellulari analizzate:
1)Proliferazione cellulare
2)frequenza di ingresso nel ciclo cellulare
3)potenziale di invasione
4)grado di differenziamento

Stato di avanzamento del progetto
3. Identificazione dei geni regolati da Id1 nelle cellule tumorali
Confronto dei profili di espressione genica fra tre cloni che esprimono
diversi livelli di Id1 e tre cloni controllo mediante microarray.
Geni che sono controllati da Id1 dovrebbero avere diversi livelli di
espressione nei cloni analizzati mentre I geni che non sono controllati
da Id1 dovrebbero essere espressi allo stesso modo in tutti I cloni.
I geni target di Id1 sono I mediatori della sua funzione e sono quindi
soggetti importanti per futuri studi nell’ambito della caratterizzazione
molecolare dei tumori tiroidei
I risultati di questo esperimento dovrebbero essere disponibile in trequattro
settimane

Progetto interdipartimentale per la determinazione del
profilo di metilazione del promotore del gene MGMT
Il gene MGMT (O 6 -Metil Guanina Metil Transferasi) codifica per
una proteina che rimuove il gruppo metile in posizione O 6 della
Guanina aggiunto dagli agenti alchilanti mantenendo la stabilità
della molecola di DNA.
Nei gliomi umani, uno
dei geni silenziati, a
seguito della metilazione
del promotore, è MGMT.

Materiali e Metodi
Estrazione del DNA da tessuto fresco ottenuta da biopsia cerebrale in
neuronavigazione, seguita dalla conversione delle citosine non metilate in
uracile tramite Epitect Bisulfite Kit (Qiagen).
Nested-Methylation Specific-Polymerase Chain Reaction utilizzando primers
specifici per il frammento metilato e per quello non-metilato seguita da gel
elettroforesi.
Campioni analizzati: a tutt’oggi sono stati analizzati 10 pazienti

Valutazione dello stato di metilazione del promotore
della cicloossigenasi -2
(COX-2) nel Tumore dello stroma Gastrointestinale
(GIST)
1: Chirurgia Laparoscopica e metabolica,
2: Laboratorio di Biologia Molecolare,
Arcispedale S.Maria Nuova di Reggio Emilia
COX-2 interviene nel controllo di numerosi meccanismi e funzioni cellulari:
infiammazione, differenziazione, proliferazione, apoptosi.
Aumentati livelli di COX-2 circolante potrebbero influenzare la crescita, l’agressività e
la progressione del tumore.
Ulteriori studi sono in corso per valutare se lo stato di metilazione sia correlato con le
caratteristiche clinico-patologiche del GIST e per allestire una metodica quantitativa
in grado di associare il livello di metilazione all’espressione fenotipica della proteina.

Materiali e Metodi
Estrazione del DNA da tessuto fresco e da tessuto paraffinato, seguita dalla
conversione delle citosine non metilate in uracile tramite Epitect Bisulfite
Kit (Qiagen).
Nested-Methylation Specific-Polymerase Chain Reaction utilizzando primers
specifici per il frammento metilato e per quello non-metilato seguita da gel
elettroforesi.
Campioni analizzati: 21, dei quali 14 da tessuto fissato in formalina ed
incluso in paraffina e 7 da tessuto fresco.

PROGETTO REUMATOLOGIA

Sottoprogetti
• Studio cellulare e molecolare dei farmaci biologici reumatologici (in
collaborazione con Reumatology Dep. University of Washington, Seattle USA)
• Studio degli SNPs (single nucleotide polymorphisms) dei principali
geni coinvolti nei pathway infiammatori utilizzando tecniche di
genotipizzazione dei TAG-SNPs mediante microarray (in
collaborazione con SEQUENOM Inch.)

Tumore ovarico e proteomica
U.O. Ginecologia e Ostetricia
Lab di Biologia Molecolare, ASMN, RE
Scopo dello studio è valutare le modificazione della glicosilazione
dell’aptoglobina nei tumori ovarici.
Per glicosilazione si intende una modificazione post-traduzionale di una proteina, che
vede l'aggiunta di zuccheri (una catena o singoli carboidrati) alla catena peptidica.
Sviluppo del progetto
Valutare la proteomica dell’aptoglobina nei campioni (tessuto tumorale,
normale e nel plasma)
Caratterizzazione molecolare della glicosilazione della proteina con HPLC e
con le Lectine
Valutare l’associazione con parametri isto-patologici e clinici

PROGETTI DI RICERCA
LAB.GENETICA
1) Gemelli monozigoti con fenotipo normale e cariotipo a mosaico,
discordante su liquido amniotico e concordante su sangue
2) Protocollo diagnostico per la determinazione del numero di
ripetizioni CGG del gene FMR1 nella diagnosi dell’X fragile.
3) Diagnostica FISH con sonde molecolari non commerciali
4) Studio della disomia uniparentale dei cromosomi 7,11,14,15
5) Diagnosi genetica nei fenotipi Turneriani e prevenzione
del gonadoblastoma

PROGETTI L.A.C.C.E.
RICERCA
DNA libero circolante nel plasma come biomarcatore diagnostico
e indicatore prognostico nel cancro del polmone.
(Chirurgia toracica, L.A.C.C.E. ) (Paci, Maramotti, Bellesia)
NUOVE METODICHE
1) Determinazione di Bcr-Abl quantitativo
2) Determinazione di JaK2
3) Determinazione della Emoglobina Lepore
4) Determinazione di Zap-70
5) Determinazione di Beta-cross Laps
INNOVAZIONE TECNOLOGICA
CORE-LAB. (Dott.Dotti)