Dicroismo circolare

POLARIZZAZIONE DELLA LUCE E
DICROISMO CIRCOLARE
EBF – 07

Tecniche ottiche
La maggior parte dei metodi di indagine dei sistemi biologici usati
in biofisica sfruttano l’interazione fra onde elettromagnetiche e
materia:
Assorbimento ottico
Fluorescenza
Microscopia ottica
Dicroismo circolare
Spettroscopia NMR
Cristallografia a raggi X

Onde elettromagnetiche
Un’onda elettromagnetica è una perturbazione del campo
elettro-magnetico che si propaga nello spazio.
Nel vuoto, la velocità di propagazione di un’onda e.m. è:
c = 310 8 m/sec = 300 000 km/sec
In un’onda e.m. i campi E (campo elettrico) e B (campo
magnetico) sono perpendicolari fra di loro e perpendicolari
alla direzione di propagazione dell’onda.

Onde elettromagnetiche
La frequenza (n) di un’onda è il numero di oscillazioni che
l’onda compie nell’unità di tempo e si misura in Hertz (Hz).
La lunghezza d’onda (λ) è la distanza fra due massimi (o
minimi) consecutivi e si misura in metri.
Frequenza e lunghezza d’onda
sono legate dalla relazione:
n = c

piano yz
piano yz
piano yz
Onde elettromagnetiche
x
x
x
L’intensità di E in un punto oscilla
nel tempo passando da un valore
positivo massimo (a t1) ad un
valore negativo minimo (a t3).
Se l’onda è monocromatica (di
frequenza ν), tale oscillazione si
ripete nel tempo con un periodo
costante pari a T = 1/ν.
In figura è rappresentato il caso di
un’onda piana linearmente
polarizzata: E oscilla lungo l’asse z
ed è uniforme sul piano yz.

E
Polarizzazione della luce
La polarizzazione di un’onda e.m. è la direzione di
oscillazione del campo elettrico. Se tale direzione è
fissa nel tempo, l’onda è linearmente polarizzata:
z
x
Ex
Ey
E z
=
=
=
0
0
E
0
2
sen
x ct

Polarizzatori
E
B
Un polarizzatore è un
filtro ottico in grado di
far passare soltanto la
componente di E lungo
una direzione specifica
(asse del polarizzatore)

Polarizzazione della luce
Le lenti “polaroid” trasmettono
selettivamente solo la luce
verticalmente polarizzata.
Se ruotiamo il polarizzatore a
90° rispetto alla sorgente di
luce linearmente polarizzata
l’intensità trasmessa è zero.

Polarizzazione della luce

E
E
y
z
Polarizzazione della luce
Luce circolarmente polarizzata:
Luce levogira Luce destrogira
2
2
x, t = E sin x ct
0
x, t = E0
sin x ct 2
E
E
y
z
2
2
x, t = E sin x ct
0
x, t = E sin x ct
0
2

Dicroismo circolare
Il dicroismo circolare è la proprietà di alcuni materiali
di assorbire in maniera diversa onde circolarmente
polarizzate in versi opposti (levogire e destrogire):
DA() = A L() – A D() = [e L() – e D()] C d
A L
A D
CD

NH 2
Amminoacidi e zuccheri sono chirali
COOH H
R
L-Isomero D-Isomero
Una molecola è detta chirale
se non è sovrapponibile alla
propria immagine speculare

Cromofori e dicroismo circolare
• Affinché un dato cromoforo dia luogo ad
un segnale CD, il cromoforo deve essere
intrinsecamente chirale o deve trovarsi
in un ambiente chirale.
• In molti casi è proprio l’interazione fra
un dato cromoforo e l’ambiente chirale
della biomolecola a far sì che ci sia
dicroismo circolare.

ε (M -1 cm -1 )
Spettri CD di proteine nel lontano UV
lunghezza d’onda (nm)
lunghezza d’onda (nm)
Le bande dello spettro CD nel lontano UV dipendono alla
struttura secondaria (l’assorbimento del legame peptidico
dipende dall’ambiente asimmetrico che lo circonda)
Dε (M -1 cm -1 )

Ellipticity (mdeg)
Spettri CD di proteine
nel lontano UV
Wavelength (nm)
mioglobina
lisozima
trioso fosfato
isomerasi
chimotripsina

Dicroismo circolare
Cosa succede se inviamo luce linearmente
polarizzata su un campione che presenta
dicroismo circolare?

Luce linearmente polarizzata
Il vettore campo elettrico totale
(in viola) può essere pensato
come la somma di due vettori (in
verde) che ruotano uno in senso
orario e l’altro in senso antiorario.
Un’onda linearmente polarizzata
è pari alla somma di due onde
circolarmente polarizzate aventi
stessa ampiezza e fase opposta

Dicroismo circolare
Quando un fascio di luce linearmente polarizzata attraversa
un materiale che presenta dicroismo circolare le sue due
componenti circolarmente polarizzate (cioè le componenti
destrogira e levogira) vengono assorbite in maniera diversa.
La luce trasmessa del campione sarà
ellitticamente polarizzata.

Polarizzazione
lineare
Luce ellitticamente polarizzata
Polarizzazione
ellittica
Se le due componenti circolarmente polarizzate (E L ed E R) non
hanno la stessa intensità la polarizzazione risultante è ellittica.

Luce ellitticamente polarizzata
Un’onda e.m. linearmente polarizzata
che attraversa un materiale che presenta
dicroismo circolare viene convertita in
un’onda ellitticamente polarizzata.
E’ per questo motivo che il segnale
CD può anche essere espresso in
termini di ellitticità .
= 0 : onda linearmente polarizzata
= +/-45° : onda circolarmente polarizzata
Tipicamente assume valori molto piccoli (mdeg)

Ellipticity Ellipticity (mdeg) (mdeg)
20
15
10
5
0
5
10
Spettri CD nel lontano UV
a-helix
b-sheet
turn
polypro type II
180 200 220 240 260
Wavelength/nm
Wavelength (nm)

Struttura secondaria e dicroismo circolare
Elica poliprolina, π e 3 10
(eliche levogire)
α-elica
(legami idrogeno)
spettro dipende dal tipo di turn
β-turn I, β-turn II,
-turn, …
anti-parallela parallela
β-sheet
(legami idrogeno)
Irregolare
(disordinata)

Spettri CD nel lontano UV
α-helix 192 nm
+ band – band
208 nm
222 nm
β-sheet 195-200 nm 210-220 nm
β-turn (type I) 205-210 nm 185-195 nm
β-turn (type II) 220-230 nm 190-200 nm
polypro II helix 210-220 nm 190-200 nm
random coil … 195-200 nm
La posizione dei picchi dipende molto dall’ambiente
che circonda i vari elementi di struttura secondaria

Analisi degli spettri CD nel lontavo UV
In prima approssimazione lo spettro CD di una
proteina può essere considerato la somma di 3
contributi: α-eliche, β-sheet e random coil.
t = x α α + x β β + x C C
t è l’ellitticità totale (misurata), α il contributo
delle α-eliche, β il contributo dei foglietti β e C
è il contributo di tratti random coil.

Esempio di fit di dati CD: mioglobina

Ellipticity (mdeg)
Analisi degli spettri CD di
proteine nel lontano UV
0.8 α, 0.0 β, 0.0 turn, 0.2 coil
0.4 α, 0.1 β, 0.3 turn, 0.2 coil
0.5 α, 0.15 β, 0.1 turn, 0.25 coil
0.1 α, 0.35 β, 0.2 turn, 0.35 coil
Wavelength (nm)

Dicroismo circolare delle proteine
• Gli spettri CD nel lontano UV (180 nm – 250 nm)
sono sensibili alla struttura secondaria delle
proteine (legame peptidico).
• Gli spettri CD nel vicino UV (250 nm – 350 nm)
sono sensibili alla struttura terziaria delle proteine
(amminoacidi aromatici).

Spettri CD nel vicino UV

Dicroismo circolare degli acidi nucleici
I polimeri di DNA e di RNA
danno luogo ad un segnale
CD nell’UV.
I cromofori che assorbono in
questa regione sono le basi
azotate.
L’ambiente che circonda le
basi è essenziale nel
determinare il segnale CD.

Dicroismo circolare degli acidi nucleici
Z-DNA
A-DNA
B-DNA
A-DNA B-DNA Z-DNA
La forma Z-DNA (elica levogira) è
stata rilevata per la prima volta con
misure CD. Il segno più netto della
transizione B-Z è lo spostamento da
200 a 185 nm dell’incrocio con
l’asse delle ascisse.

Uso empirico della spettroscopia CD
Ad alta temperatura si riduce la chiralità attorno ai
cromofori del polimero di RNA a causa della riduzione
nell’accoppiamento fra le basi azotate (melting)

Folding delle proteine: Barnasi
La barnasi è una ribonucleasi batterica costituita da
una singola catena di 110 aminoacidi (12.4 kDa).

Folding delle proteine: Barnasi
E’ un sistema-modello per gli studi sul folding delle proteine:
– diversi elementi di struttura secondaria differente
– nessun ponte di-solfuro
– nessun gruppo prostetico

Struttura della Barnasi con VMD
1) Caricare la struttura (Extensions\Data\PDB Data Query): 1A2P
2) Visualizzare una singola catena polipeptidica (Chain A) in
rappresentazione a nastri (NewCartoon, SecondaryStructure).
3) Evidenziare (Extensions\Analysis\Sequence Viewer) i seguenti
residui del core idrofobico:
Phe56, Leu63, Trp71, Leu89, Tyr97, Tyr103, Phe106
4) Evidenziare (Solvent, Volume) il volume occupato da tutti gli
atomi della proteina.
5) Evidenziare eventuali ponti salini (es. Arg69 - Asp93).

Struttura della Barnasi
core
idrofobico
Arg69
Asp93

Spettro CD della Barnasi
Ellipticity (mdeg)
+12
+8
+4
0
-4
-8

Denaturazione termica della Barnasi
Ellipticity at 230 nm (mdeg)
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
-3.0
(Barnasi in urea 3 M)
La spettroscopia CD può essere utilizzata per seguire
la denaturazione termica (o chimica) di una proteina.

Denaturazione delle proteine
obs = f D D + f N N f D + f N = 1
K eq =
f D = [D] / ( [D] + [N] )
f N = [N] / ( [D] + [N] )
[D] f D obs – D
=
[N] 1 – f D N – D
=

Denaturazione delle proteine
DH, DS, T m ?

Denaturazione termica delle proteine
Mb at 96 °C
Mioglobina
Mb at 52 °C

Denaturazione termica delle proteine
Mioglobina