Cellule Staminali - Phoenix Stem Cell Foundation

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Cellule Staminali: una presentazione introduttiva
Federico Di Gesualdo
Scientific Staff of Phoenix Stem cell Foundation for Human Life
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Cellule staminali: proprietà propriet
Pluripotenza
Clonogenicità
Clonogenicit
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Capacità Capacit di self-renewal
self renewal

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Ci sono molti tipi di cellule
staminali…
• Embrionic Stem Cells (ESC)
• Adult Stem Cells, including
Hemopoietic Stem Cells (HSC),
Mesenchymal Stem Cells (MSC),
and many others…
• Umbelical Cord Blood Stem Cells
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Embrionic Stem Cells
• Situate nella massa interna della blastocisti (embrione
del IV-V IV V giorno) in numero di circa 30 cellule
• Estrema plasticità plasticit differenziativa (pluripotenza
pluripotenza)
• Capacità Capacit replicativa illimitata in vitro senza segni di
differenzimento (propagate per due anni in vitro)
• Elevata espressione del fattore di trascrizione Oct-4 Oct
• Trascorrono la maggior parte della loro vita in fase S,
mancando del checkpoint di fase G1
• Non mostrano inattivazione del cromosoma X
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Sorgenti per l’ottenimento l ottenimento di ESC
• Embrioni congelati
“Immunosurgical isolation”
“Mechanical isolation”
“Utilizzo dell’ embrione intero”
• Aborti terapeutici
• Liquido amniotico
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Embrioni congelati
IMMUNOSURGICAL ISOLATION
Vengono utilizzati embrioni allo stadio di blastocisti
donati secondo il protocollo FIVET.
La zona pellucida viene digerita e gli embrioni
vengono incubati in siero contenente anticorpi anti-
trofoectoderma; trofoectoderma;
quindi questi sono esposti al
complemento che lisa le cellule del TE.
Le cellule della massa interna sono coltivate su un
feeder layer di cellule murine
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Embrioni congelati
MECHANICAL ISOLATION
La zona pellucida viene digerita e lo strato
trofoblastico viene rimosso meccanicamente.
Gli embrioni sono poi coltivati su un feeder layer
di fibroblasti murini inattivati (MEF), analogamente
alla precedente metodica.
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Embrioni congelati
UTILIZZO DELL’EMBRIONE DELL EMBRIONE INTERO
Le cellule della blastocisti (ICM+Trofoectoderma
( ICM+Trofoectoderma)
vengono coltivate direttamente su fibroblasti murini
embrionali inattivati finché finch le cellule della massa
interna raggiungono una dimansione tale da
poter essere rimosse meccanicamente e
coltivate separatamente
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Embrioni congelati
MECHANICAL ISOLATION
La zona pellucida viene digerita e lo strato
trofoblastico viene rimosso meccanicamente.
Gli embrioni sono poi coltivati su un feeder layer
di fibroblasti murini inattivati (MEF), analogamente
alla precedente metodica.
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Aborti terapeutici
L'interruzione volontaria della gravidanza, dopo
i primi novanta giorni, puo’ puo essere praticata:
a) quando la gravidanza o il parto comportino
un grave pericolo per la vita della donna; b)
quando siano accertati processi patologici,
tra cui quelli relativi a rilevanti anomalie o
malformazioni del nascituro, che determinino
un grave pericolo per la salute fisica o
psichica della donna
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Aborti terapeutici
CELLULE GERMINALI EMBRIONALI
• Le Cellule Germinali
Embrionali (EGC) sono
cellule pluripotenti che
derivano dalle Cellule
Primordiali Germinali (PGC),
precursori dei gameti. gameti.
• Nel topo è possibile isolarle
da embrioni del periodo
compreso tra I giorni 8.5 e
12.5 mentre nell’uomo nell uomo esse
sono isolabili da aborti
terapeutici della V-IX V IX
settimana di gestazione
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Aborti terapeutici
CELLULE GERMINALI EMBRIONALI
• Il tessuto viene sottoposto a dissociazione
•
meccanica e coltivato in un medium contenente
siero bovino fetale (15%), LIF e bFGF, bFGF,
in presenza di
un feeder costituito da fibroblasti murini inattivati
Hanno un potenziale replicativo inferiore alle ESC
(70-80 (70 80 duplicazioni)
• Esprimono AP, SSEA-1, SSEA 1, SSEA-4, SSEA 4, TRA-1-60, TRA 60, TRA-1- TRA
81, Oct-4 Oct
• In vitro danno luogo a corpi embrioidi
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Liquido amniotico
Intorno alla 16-17 16 17 settimana vengono
prelevati 10-20 10 20 ml di liquido amniotico che
viene centrifugato: le cellule ottenute
sono poi piastrate ed incubate. Le cellule
staminali più pi abbondanti ne liquido
amniotico sono le Cellule Staminali
Mesenchimali, ma esiste anche una
sottopopolazione che esprime marker di
ESC
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Liquido amniotico
CELLULE STAMINALI EMBRIONALI
• Cellule c-kit+ c kit+ (0.8%-1.4%)
(0.8% 1.4%)
• Forma arrotondata nella I settimana di coltura
• Successivamente aderiscono alla plastica e proliferano più pi
rapidamente
• Possono dare luogo a numerose duplicazioni (300)
mantenendo un cariotipo normale e hanno una spiccata
attività attivit telomerasica
• Esprimono Oct-4 Oct 4 e SSEA-4 SSEA 4 ma non SSEA-1 SSEA 1 e -3, 3, CD113 e
CD34
• In vitro danno luogo a corpi embrioidi
• Non generano teratomi se inoculate in topi immunodeficienti
• Utilizzabili per malattie congenite del neonato (uso autologo) o
per trattare pazienti adulti (uso eterologo)
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Embrionic Stem Cells
CORPI EMBRIOIDI
• Le ESC e le EGC poste in coltura su un
feeder layer (o anche come hanging drops, drops,
per quanto riguarda le cellule murine) si
aggregano dopo circa 7 giorni a formare i
Corpi Embrioidi (EBs ( EBs). ).
• Dopo un tempo variabile, in seno a ogni EB
le cellule si differenziano spontaneamente in
lineages appartenenti ai tre foglietti
embrionali: si possono identificare
cardiomiociti precoci (cellule battenti) e
precursori neuronali.
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Embrionic Stem Cells

Embrionic Stem Cells
PATHWAYS DI STAMINALITA’:
STAMINALITA :
LEUKEMIA INHIBITORY FACTOR
• gp130 è corecettore di numerose
•
citochine (IL-6, (IL 6, IL-11, IL 11, Oncostatina M,
Ciliary neutrophic factor)
LIF-gp130: LIF gp130: sufficiente per mantenere
la pluripotenza in cellule staminali
embrionali murine ma non in quelle
umane
• I pathways attivati da LIF si
intersecano con quelli attivati da
BMP-4, BMP 4, dando luogo sia a stimoli
anti-differenziativi anti differenziativi
differenziativi
che pro-
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Embrionic Stem Cells
PATHWAYS DI
STAMINALITA’: STAMINALITA : BONE
MORPHOGEIC PROTEIN-4
PROTEIN
• BMP-4 BMP 4 si lega agli
eterodimeri dei recettori
•
Ser-Thr Ser Thr di tipo 1 e 2
Vengono attivati i fattori di
trascrizione SMADs che
inducono l’espressione l espressione di
geni inibitori della
differenziazione in senso
ectodermico
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Embrionic Stem Cells
PATHWAYS DI STAMINALITA’: STAMINALITA : Oct-4 Oct 4 e Nanog
• Oct-4 Oct 4 è un fattore di trascrizione espresso nell’embrione
nell embrione
fino alla gastrulazione e permane nell’adulto nell adulto solo nelle
cellule germinali. È fondamentale per il mantenimento del
self-renewal
self renewal e dello stato indifferenziato di una cellula:
nelle ESC l’aumento l aumento della sua espressione induce
differenziazione in senso mesodermico od endodermico,
mentre una diminuzione determina una differenziazione
cellulare in senso ectodermico
• Nanog è espresso ad uno stadio leggermente più pi tardivo
rispetto ad Oct-4, Oct 4, ma, analogamente, nell’adulto nell adulto la sua
espressione è limitata alle cellule germinali. È essenziale
per il mantenimento della pluripotenza.
pluripotenza
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Adult Stem Cells
• Cellule presenti in vari tessuti dell’organismo dell organismo e che
partecipano alla rigenerazione del medesimo
• Sono state individuate cellule staminali in organi quali il
fegato ed il pancreas e in tessuti come quello muscolare
e adiposo, oltre alle ben caratterizzate Cellule Staminali
Emopoietiche e Mesenchimali di origine midollare
• Generalmente indicate come cellule multipotenti, multipotenti,
alcune
di esse sono state dimostrate essere in grado di
differenziarsi in tipi cellulari non appartenenti all’organo/ all organo/
tessuto di origine
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Haemopoietic Stem Cells
• Risiedono nel midollo osseo in particolari zone
denominate “nicchie nicchie” (1-2%) (1 2%) e si ritrovano anche nel
sangue periferico (0,05%)
• Esprimono le molecole CD133 e CD34: il CD133 è una
glicoproteina a 5 domini transmembrana, transmembrana,
il cui ligando e
la cui funzione non sono ancora stati individuati. Il CD34
è una glicoproteina transmembrana a singola catena di
110kDa, espressa da progenitori emopoietici sia della
linea linfoide che di quella mieloide. Il CD34 è inoltre
espresso da cellule endoteliali.
• Possono differenziarsi in tutti i tipi cellulari del sistema
emopoietico (cellule multipotenti)
multipotenti
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Haemopoietic Stem Cells Niche
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LT-HSC
Lin - Sca-1 + c-Kit +
Thy.1 lo IL-7Rα -
Flk2 - CD34 -/lo
ST-HSC
Lin - Mac-1 lo Sca-1 +
c-Kit + Thy-1 lo IL-7Rα -
Flk2 + CD34 +
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IL-7Rα + c-mpl -
Lin - Sca-1 lo c-Kit lo Thy-1 -
Flk2 + CD24 lo CD27 + CD34 +
CD43 + CD10 + CD38 + TdT +
IL-7Rα - c-mpl +
CLP
MPP Lin- Mac-1 lo Sca-1 +
c-Kit + Thy-1 - IL-7Ra -
Flk2 + CD34 +
Lin - Sca-1 - c-Kit + Thy-1 -
CD34 + FcγRII/III lo CD38 +
IL-3α lo CD45RA -
CMP
Epo-R -
Epo-R +
Lin
Pro-T Pre-T
-CD4-\lo c-Kit + Thy-1lo IL7Rα + CD34 +
NK
Pro-B B220 Pre-B
+ CD19- CD24- CD43 + AA4.1 + IL7Rα- B/Mφ
bipotent
GMP
Lin - Sca-1 - c-Kit + Thy-1 -
IL-7Ra - CD34 + FcγRII/III +
MEP
NK1.1 - IL-2Rβ +
Lin - Sca-1 - c-Kit + Thy-1 -
CD34 - FcγRII/III lo
B220 - CD19 + CD24 +
CD43 + AA4.1 + IL7Rα +
CFU-M
CFU-G
BFU-E CFU-E
CFU-Meg
Lin - Sca-1 - c-Kit + Thy-1 -
CD34 lo FcγRII/III lo
CD9 +

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Mesenchymal Stem Cells
• Cellule di origine midollare che si trovano però anche nel
tessuto adiposo (PLA cells)
• Crescono in adesione ed esprimono markers specifici
come CD29, CD44, CD105, CD166, etc. …
• Non esprimono markers di cellule emopoietiche
• Possono differenziarsi in diversi lineages cellulari in vitro
come osteociti, adipociti, cellule muscolari, condrociti, condrociti,
…
• Studi condotti in modelli sperimentali di danno al
miocardio hanno dimostrato di essere capaci di
migliorare la sopravvivenza degli animali in cui erano
state inoculate rispetto ai controlli non inoculati
• Svolgono un importante ruolo nel midollo osseo come
cellule della nicchia ematopoietica
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Capacità Capacit differenziativa delle MSC

Umbilical Cord Blood Stem Cells
• Raccolte dal sangue placentare alla nascita del
bimbo
• Si trovano cellule emopoietiche e mesenchimali
• Il primo utilizzo risale al 1988 su un ragazzo affetto
da anemia di Fanconi: Fanconi:
oggi viene impiegato per il
trattamento di malattie linfo o mieloproliferative
come la CLL, AML, CML, etc.
• Le cellule staminali emopoietiche (CD34+) isolate dal
cordone ombelicale sono già gi state utilizzate per il
trapianto di midollo allogenico: rispetto alle HSC
adulte, infatti, danno meno problemi di rigetto
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Ingegneria tissutale
"an an interdisciplinary field that applies the
principles of engineering and life sciences
toward the development of biological
substitutes that restore, restore,
maintain, maintain,
or improve
tissue function or a whole organ". organ".[1]
[1]
"understanding
understanding the principles of tissue growth,
and applying this to produce functional
replacement tissue for clinical use." use."[2]
[2]
1 Langer, Langer,
R & Vacanti JP, Tissue engineering. engineering.
Science 260, 920-6; 920 6; 1993.
2 MacArthur, MacArthur,
B. D. & Oreffo, Oreffo,
R.O.C. (2005). "Bridging " Bridging the gap". Nature 433, 19.

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Ingegneria tissutale
• Utilizzo di cellule isolate come materiale
di rigenerazione
• Utilizzo di materiali acellulari capaci di
indurre rigenerazione cellulare
• Utilizzo combinato di cellule e materiali
acellulari (scaffolds ( scaffolds)
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Ingegneria tissutale
UTILIZZO DI MATERIALI ACELLULARI
I) Sostituti dell’osso dell osso (biologici: DBM, collagene;
sintetici: ceramiche, polimeri): materiali con
proprietà propriet osteoconduttive o osteoinduttive, osteoinduttive,
spesso
usati in combinazione: composti di fosfati di calcio,
DBM+BMP2/7 o VEGF
II) Stent: Stent:
piccole strutture tubulari a maglia (Nitinol ( Nitinol o
acciaio) usate nelle stenosi arteriose. Essi possono
essere “ingegnerizzati
ingegnerizzati” per il rilascio di molecole
(VEGF, Sirolimus) o per la chemoattrazione di EPC
(α-CD34 CD34-coated coated stent) stent
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Ingegneria tissutale

Ingegneria tissutale
UTILIZZO COMBINATO DI CELLULE
E DI MATERIALI ACELLULARI
OPEN SYSTEMS: le cellule vengono fatte crescere e
differenziarsi in vitro e vengono poi seminate in
scaffold che forniscono un ambiente ottimale per la
crescita di queste cellule. Sistemi usati per creare
sostituti dell’osso, dell osso, della pelle, del pancreas, del
fegato
CLOSED SYSTEMS: le cellule sono seminate
direttamente sullo scaffold che funge da barriera
contro il sistema immunitario. Sistemi usati per il
trattamento del diabete, insufficienza epatica e
morbo di Parkinson
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Ingegneria tissutale
SCAFFOLDS
• Permettono l’attecchimento l attecchimento e la migrazione cellulare
• Rilasciano e trattengono cellule e fattori
• Sono biodegradabili (collagene, GAGs, GAGs,
fibrina,
poliesteri alifatici lineari p.e. acido polilattico),
polilattico),
biocompatibili e non immunogenici