Vettori Virali

Vettori Virali
5 classi di vettori virali sono attualmente in fase
avanzata di sperimentazione per la terapia genica
nell’uomo. Questi comprendono:
1) Gammaretrovirus
2) Lentivirus
3) Adenovirus
4) Il virus adenoassociato (AAV)
5) Herpesvirus

Retroviruses
Genoma a RNA dotati di envelope :
Codificano per un enzima, la
trascrittasi inversa (RT), che copia il genoma
in una forma di cDNAds.
Codificano anche per un enzima,
la integrasi, che promuove l’integrazione nel
DNA della cellula.

RETROVIRUS
• virus con envelope
• genoma di 9-11 Kb costituito da una molecola di
ssRNA
•alle sue estremita’ 5’ e 3’ sono presenti due sequenze
identiche, LTR (LTR: long terminal repeat,
comprendono promotore/enhancers)
LTR gag pol env
LTR
•Ciascuna LTR e’ composta da 3 regioni U3 R e U5
•La regione U3 al 5’ contiene il promotore del virus: la trascrizione avviene dal
primo nt di R e procede fino a U5 al 3’
•L’RNA trascritto funge da un lato da pre mRNA per la traduzione di tutte le
proteine virali, dall’altro costituisce il genoma virale incapsidato nel virione.

Retrovirus
Tra le due LTR sono presenti 3 geni essenziali per la
replicazione del virus.
•gag: codifica per le proteine del virus che si associano al
genoma virale e sono indispensabili per l’assemblaggio del
virione.
• pol: codifica per i 3 enzimi che sono propri della famiglia
dei Retrovirus: RT trascrittasi inversa, PR proteasi, IN
integrasi
• env: codifica per le proteine dell’envelope

1) Interazione di SU virale
con recettore
membrana plasmatica
2) Fusione tra envelope e
membrana cellulare
3) Rimozione
nucleocapside nel
citosol
4) RT retrotrascrive RNA
a ds-cDNA
5) PIC entra nel nucleo
quando la cellula e’ in
attiva divisione
6) Integrazione mediata
dall’enzima IN
7) Viene trascritto dalla
RNA polimerasi II
cellulare in mRNA che
rappresenta sia il
genoma che il
trascritto per le
proteine
8) Fuoriuscita nel citosol
gli mRNA per gag pol
ed env sono tradotti
per generare delle
poliproteine
Retrovirus life cycle
Complesso preintegrazione
(PIC)
9) l’assemblaggio del virione e’ stimolato da Gag che si lega al segnale di
packaging ψ nell’mRNA virale.
10)Env viene tradotta indipendentemente da gag e pol e matura in
proteine che vengono esposte sulla membrana cellulare.

How could we exploit retroviruses as vectors?

vettori retrovirali REPLICAZIONE DEFICIENTI
La maggior parte delle applicazioni dei vettori retrovirali richiedono
che non vi sia replicazione del virus dopo l'infezione iniziale.
A questo fine si possono sostituire parte o tutte le sequenze
codificanti del retrovirus con quelle che si desidera trasferire: in
questo modo il vettore stesso è incapace di produrre le proteine
necessarie alla propria replicazione.
Le funzioni richieste per l'infezione iniziale del vettore sono
generalmente fornite da una linea cellulare detta "packaging", che
consente la produzione di virus infettante ma incapace di replicarsi.
Cruciale nel giudicare l’efficacia del sistema vettore/linea di
packaging è la valutazione della frequenza con la quale si verifica la
comparsa di revertanti replicazione competenti (RCR) nella
popolazione di virus prodotto.

vettori retrovirali REPLICAZIONE DEFICIENTI
I geni virali gag, pol ed env sono sostituiti con il cDNA del gene di interesse.
Il vettore che si ottiene non è in grado di produrre le proteine virali necessarie per un altro ciclo di
infezione (vettore difettivo nella replicazione).
LTR gag pol env
LTR
LTR cDNA
LTR
LTR neo promoter cDNA LTR
• Viene mantenuta la regione essenziale che comprende i due LTR e la sequenza di packaging
(elementi-cis).
• Promotore: virale o eucariotico
• Marker di selezione (es. neomicina o -galattosidasi).
• Dimensione max del transgene: 7.5 Kb.

Retroviral vector
RETROVIRAL VECTOR ARE TYPICALLY
SEPARATED IN 2 COMPONENTS:
the packaging, that provides all the proteins required in
trans for production of viral particles that do not contain
viral RNA
the retroviral vector itself (in cis sequences), that carries
the gene of interest (therapeutic gene)

Cellule di packaging
La prima linea fu ottenuta trasfettando permanentemente cellule NIH 3T3 con un retrovirus MLV privato di
. La linea cellulare ottenuta complementa costrutti privi di gag, pol e env, ma i titoli ottenuti sono bassi e
la frequenza di ricombinazione con produzione di revertanti replicazione competenti (RCR) è troppo
elevata.
Per ridurre ulteriormente le possibilità di ricombinazione le proteine gag e pol sono state espresse su un
plasmide diverso da quello esprimente env (“split genome”), e non più sotto il controllo di LTR.

Retroviral vector
Gammaretrovirus
Transcript--syntesized by RNA pol II
CAP PBS SD SA
Gag Pol Env
U3 R U5
U3 R U5
CAP PBS SD SA
LTR driven vector
AAAAAA
U3 R U5
cDNA U3 R U5
P
Gag Pol
Env
P T
T
AAAAAA

PACKAGING
FUNCTIONS
(“trans”)
env
RETROVIRAL VECTOR-BASED SYSTEM
gag-pro-pol
Trans-acting element
viral proteins
“Packaging cell”
Vector particle

PACKAGING
FUNCTIONS
(“trans”)
env
gag-pro-pol
Therapeutic gene
RETROVIRAL VECTOR-BASED SYSTEM
VECTOR
(“cis”)
Trans-and cis-acting elements
Vector RNA
+
viral proteins
“Packaging cell”
Vector particle
infection but no replication!

PSEUDOTYPING
Ogni retrovirus è in grado di infettare un particolare tipo cellulare
grazie all’espressione di specifiche proteine codificate dai geni
env.
Si sfrutta la capacità di un retrovirus di incorporare le proteine env
di un altro retrovirus: modificando i geni env è possibile modificare
il tropismo virale e/o aumentare il titolo del vettore.
Le proteine env endogene o eterologhe vengono fornite in trans ad
un retrovirus difettivo per la replicazione.
La pseudotipizzazione piu’ efficiente e’ conferita dalle proprieta’
della proteina G, presente sull’envelope del virus della stomatite
vesicicolare (VSV-G). Si lega ai fosfolipidi presenti virutalmente
sulla membrana di tutti i tipi cellulari e innesca un meccanismo di
endocitosi.

Phenotypic mixing

Limitazioni all’uso dei gammaretrovirus
1) Devono infettare cellule in attiva replicazione;
2) Vi e’ un progressivo spegnimento dell’espressione del
gene veicolato per metilazione del promotore;
3) Possibile inattivazione di un oncosopressore o
attivazione di un oncogene dovuta alla integrazione
random

Vettori basati sui Lentivirus
La maggior parte delle cellule del nostro organismo e’ in
uno stato di quiescienza replicativa.
I vettori basati sui lentivirus hanno la capacita’ di infettare
le cellule in uno stato non replicativo.
Questa proprieta’ e’ legata alla specifica capacita’ del
complesso di pre-integrazione (PIC, formato da IN, Vpr, e
MA) dei lentivirus di attraversare I pori nucleari ed avere
accesso al genoma dell’ospite.

HIV genome
Il lentivirus da cui sono stati generati la maggior parte dei vettori finora disponibili e’ stato
HIV-1
Rispetto ai retrovirus, HIV-1 presenta in aggiunta a gag, pol, ed env, una serie di geni
addizionali che vengono definiti “geni accessori”, fondamentali per una serie di funzioni.
HIV-1 presenta 6 geni accessori: tat, rev, nef, vpr, vpu e vif che sono coinvolti in vari aspetti
del ciclo replicativo. Tutti questi geni codificano proteine che agiscono in
trans, regolando l’espressione di altri geni virali.
LTR Gag
Vif
Rev
Tat
LTR
Pol
Env Nef
Vpr Vpu

Vettori basati sui Lentivirus
• I primi vettori lentivirali basati su HIV-1 sono stati sviluppati allo
scopo principale di studiare diversi aspetti del ciclo replicativo del
lentivirus. Sono stati infatti messi a punto sistemi
– per la quantificazione dell’infezione virale
– per saggiare l’attività antivirale di diversi composti
– per studiare le funzioni di HIV-1 necessarie per la
penetrazione all’interno della cellula.
• I primi sistemi lentivirali prevedevano l’uso di due diversi costrutti:
– un costrutto per l’espressione del transgene e di tutte le proteine
virali regolatorie e strutturali, ad eccezione dell’envelope
– un altro costrutto esprimente l’envelope di HIV-1.
• La presenza di tutti gli elementi virali trans-attivanti rendeva il vettore
competente per la replicazione e quindi poco sicuro per applicazioni di
terapia genica.

Vettori lentivirali di prima generazione
• Nel corso degli anni, quindi, è stato sviluppato un sistema di
vettori lentivirali basati su HIV-1 di prima generazione, più simile
come struttura a quello oncoretrovirale, separando la componente di
packaging in due plasmidi:
– uno esprimente i geni gag, pol, vif e tat
– l’altro esprimente rev ed env
• Il vettore HIV-1 conteneva gli elementi necessari in cis ed il
transgene.
• La sicurezza di tali sistemi è stata migliorata, in quanto la
componente di packaging è stata privata della sequenza di
incapsidazione per impedire la sua incorporazione nella particella
virale.
• Inoltre, le LTR in posizione 5’ e 3’ sono state sostituite,
rispettivamente con il promotore precocissimo (immediate-early, IE)
del Cytomegalovirus umano (HCMV) e con segnali di
poliadenilazione del Virus Vacuolante della Scimmia (SV40).

Vettori lentivirali di seconda generazione
• Il passo successivo è stato quello di eliminare i geni accessori
vif, vpr, vpu, nef dal sistema di packaging senza influenzare
negativamente l’efficienza di trasduzione.
• Tale sistema di espressione è stato definito di seconda
generazione.
• Infine, l’eliminazione del gene tat dalla componente di
packaging è stata raggiunta sviluppando componenti vettoriali
con LTR chimeriche all’estremità 5’, costituite da sequenze
promotrici (o enhancer) derivate dal promotore di HCMV o da
quello del Virus del Sarcoma di Rous (RSV) nella regione U3

HIV-BASED LENTIVIRAL VECTOR SYSTEM

Vettori lentivirali self-inactivating (SIN)
• Un ulteriore progresso dal punto di vista della biosicurezza è stato
raggiunto più recentemente eliminando gli elementi trascrizionali di
HIV nel vettore, generando i cosiddetti vettori self-inactivating (SIN).
• La “self-inattivazione” si basa su una delezione a livello della regione
U3 della 3’ LTR (regione enhancer/promoter) del DNA utilizzato per la
produzione del vettore a RNA. Durante la retrotrascrizione, poiché
entrambe le regioni U3 del provirus integrato si generano a partire
dalla estremità 3’ del genoma virale, la delezione in U3 viene trasferita
alla LTR in posizione 5’ del DNA provirale.
• Quindi, i vettori SIN presentano entrambe le LTR inattive, essendo
prive della regione enhancer/promoter. Questo sistema permette
l’espressione del solo transgene, grazie alla presenza di un promotore
interno.

Provirus
DNA
DNA
RNAs
DNA
RNA
Self-inactivating (SIN) vector
5’LTR
U3 R U5
U3
R U5
P X
P X
Reverse transcription
P X
No viral transcript
3’LTR
U3 R U5
Poly (A)
site
Delete 3’LTR,
enhancers, promoter
AAA

Vettori di terza generazione
La produzione dei vettori richede la trasfezione delle cellule produttrici con 4
plasmidi:
1)Il primo corrisponde al vettore virale, ottenuto con tecnologia SIN;
2)Il secondo utilizzato nel packaging contiene esclusivamente geni gag e pol
3)Rev e’ fornito da un terzo plasmide, Rev e’ indispensabile in quanto nella cellula di
packaging legandosi a RRE nell’RNA del plasmide, consente il trasporto dei
messaggeri nel citoplasma.
4)Il quarto plasmide codifica per VSV-G
QUESTO SISTEMA DI PRODUZIONE NECESSITA SOLO DI 3 DEI 9 GENI DI
HIV-1 ED OFFRE PERTANTO UN PROFILO DI SICUREZZA
NOTEVOLMENTE MIGLIORATO.

LENTIVIRUS
Vantaggi
• Possono essere somministrati in vivo
• Non sono inattivati dal complemento
• Infettano sia cellule in divisione che quiescenti
• I transgeni possono essere espressi per tutta la vita dell’ospite
• Integrazione del materiale genetico recato dal vettore nel genoma
delle cellule bersaglio
Svantaggi
• Potenziale oncogeno perché si integrano nel genoma dell’ospite in
molteplici siti
• Possono provocare malattia nell’uomo
• Sono difficili da coltivare

Adenoviral vectors

ADENOVIRUS
• virus senza envelope, struttura icosaedrica regolare
• genoma di 36 Kb costituito da una molecola di DNAds
• il genoma è fiancheggiato da sequenze ITR (inverted
terminal repeats) che servono come origine di replicazione
• dopo l’infezione il virus entra nel nucleo della cellula ospite
e viene replicato
• non si integra nel genoma dell’ospite (resta episomale)
• infetta sia cellule in divisione che non in divisione
• dotato di ampio tropismo

Struttura degli adenovirus
• virus senza envelope
• capside a simmetria icosaedrica
• diametro di 60-100 nm

capside costituito da 252 proteine
(capsomeri) di cui 240 esoni e 12 pentoni
core contiene almeno 4 proteine
(TP, V , VII , Mu)
ESONI: Determinanti antigenici
PENTONI: Attività tossina-simile
FIBRE:
mediano il riconoscimento dei
recettori sulla superficie delle
cellule permissive (CAR,
integrine); sono responsabili
dell’emoagglutinazione

CICLO VITALE DI ADENOVIRUS
ADESIONE E ASSORBIMENTO
CAR è una proteina di adesione che è espressa ad alti livelli in:
- fegato, rene, cuore, cervello, pancreas, colon, prostata, endotelio
CAR non è espressa in:
- linfociti periferici, milza, muscolo scheletrico, e fibroblasti
Adenovirus del gruppo B riconoscono un recettore diverso dal CAR
Alcuni tumori in stadio avanzato perdono l’espressione del CAR
(pseudotipizzazione di vettori basati su genoma di adenovirus)

Organizzazione del genoma di AV
Il genoma contiene:
1)5 unita’ trascrizionali precoci, attivate immediatamente dopo l’infezione della
cellula (E1A, E1B, E2, E3 e E4)
2)2 unita’ trascrizionali precoci tardive (IX e IVa2)
3)Una unita’ trascrizionale maggiore tardiva (major late, ML), che e’ processata
per generare 5 famiglie di mRNA tardivi mediante processamento posttrascrizionale
(da L1 a L5)
Tutte queste unita’
trascrizionali sono
trascritte dall’RNA
polimerasi II.

Il ciclo infettivo degli adenovirus
• Avviene solo in cellule permissive e si divide in due fasi:
La prima, o fase early, comprende l’entrata del virus nella
cellula ospite e il passaggio del genoma virale nel nucleo, in
seguito vengono espressi selettivamente i geni precoci. Gli eventi
early modulano il metabolismo cellulare per favorire la
produzione di nuovo DNA virale e l’espressione dei geni late.
La seconda fase, dopo la trascrizione e la traduzione dei geni
tardivi, è caratterizzata dall’assemblaggio nel nucleo cellulare di
proteine strutturali e dalla maturazione di nuovi virioni.
• La fase early in cellule competenti dura circa 6-8 ore, mentre la
fase tardiva è generalmente più rapida: circa 4 – 6 ore.

Il ciclo infettivo degli adenovirus
• Dopo l’iniziale interazione del virus con il recettore, l’entrata
avviene attraverso un processo di endocitosi mediato da
clatrina
•Gli adenovirus hanno sviluppato un sistema per rompere e per
sfuggire dall’endosoma prima che questo acidifichi troppo
entrando nel citoplasma della cellula ospite.
• Alcune proteasi codificate dal virus distruggono parte del
capside virale mentre la parte rimanente del virus viene
trasportata alla membrana nucleare attraverso il sistema di
microtubuli della cellula e il genoma virale entra attraverso i pori
nucleari.
• A seguito di questo evento, hanno inizio la replicazione del
materiale genetico e i primi eventi trascrizionali.

Il ciclo infettivo degli adenovirus
• I geni sono trascritti su entrambi i filamenti e sono soggetti a
numerosi eventi di splicing.
• Le regioni early trascritte sono E1, E2, E3, E4; i prodotti genici
di E1 sono suddivisi in E1A e E1B. Il prodotto genico di E1A è un
fattore di regolazione trascrizionale necessario per dar inizio alla
trascrizione degli altri geni early.
• Il promotore MLP guida la trascrizione dei geni late (da L1 a L5);
i geni tardivi codificano proteine strutturali.
• La traduzione dei geni strutturali e l’assemblaggio delle
particelle virali avviene nel citoplasma e la loro formazione
comporta la lisi della cellula, in quanto, la gemmazione è un
evento compatibile solo per un numero limitato di virioni.
• Per ogni cellula infettata vengono prodotte circa 10.000
particelle virali.

FASI del CICLO VITALE DI ADENOVIRUS
- Avviene soltanto nel nucleo delle cellule permissive (cellule di origine
epiteliale) , il ciclo ha una durata di circa 32-36 ore (ciclo litico)
- Un unico ciclo di replicazione è in grado di sintetizzare
10.000 virioni per cellula infettata;
1° fase
2° fase

Geni di adenovirus
• E1A: coinvolto nell’attivazione della trascrizione e nella promozione
dell’entrata della cellula ospite in fase S (lega Rb inducendo il rilascio
del fattore di trascrizione E2F)
• E1B: blocca azione di p53, evitando entrata della cellula in apoptosi
• E2: codifica per 3 proteine coinvolte nella replicazione del DNA e
nella modulazione della trascrizione (DNA-pol; proteina terminale e
DNA-binding protein)
• E3: modula la risposta immunitaria
• E4: regola la trascrizione, la transizione dell’espressione da early a
late gene, la replicazione virale e l’assemblaggio dei virioni
• L1-5: coinvolti nella produzione e nell’assemblaggio delle proteine
del capside

Proprietà generali dei vettori adenovirali
•I vettori AdV sono in grado di infettare una grande varietà di
cellule mitotiche e post-mitotiche anche di tessuti con un
elevato grado di differenziamento, come il muscolo scheletrico, i
polmoni, il cervello e il cuore.
• I sierotipi comunemente usati per la costruzione dei vettori
ricombinanti sono il 2 e il 5. Questi sierotipi sono molto comuni
nell’uomo e sono oggi ben caratterizzati.
• La presenza di una immunità preesistente nei confronti dei
sierotipi più comuni riduce però l’efficienza della
somministrazione del vettore e dellespressione del gene
terapeutico. Per questo motivo sono stati studiati anche altri
sierotipi meno comuni o adenovirus non umani.

Proprietà dei vettori adenovirali - vantaggi
• I vettori adenovirali sono un valido veicolo per il trasferimento
genico proprio per la loro scarsa patogenicità nell’uomo.
• Possono essere prodotti ad alto titolo (nell’ordine di 10 11
Vp/ml) e la produzione e la purificazione in larga scala sono
relativamente facili.
• Gli adenovirus wild type possono incorporare solo 2 kb di DNA
estraneo senza modificare la loro stabilità e la loro infettività ma
nei vettori “gutless” si possono introdurre fino a 37 kb di
materiale genetico estraneo sotto il controllo di promotori
eterologhi.
• Il loro genoma si integra raramente nei cromosomi dell’ospite
ma rimane come epicromosoma nel nucleo cellulare: questo
implica un’espressione transiente del gene terapeutico..

Tecniche per la costruzione di vettori
adenovirali ricombinanti
• Esistono molti metodi di manipolazione del genoma virale
per la produzione di vettori. Quelli proposti per la terapia
genica sono divisi in tre classi:
prima generazione
seconda generazione
terza generazione o vettori “gutless”.
• I più usati in clinica sono stati finora i vettori di seconda
generazione. Sono costruiti con eliminazione delle cassette
geniche E1, E2, E3 e E4 per minimizzare la possibilità di
generare un adenovirus competente per la replicazione.

Vettori adenovirali di prima generazione
• Sono costruiti con la sostituzione delle cassette di espressione
delle regioni E1 e/o E3.
• La regione E1, codifica proteine necessarie per l’espressione di altri
geni early e dei geni late. Sono state fatte diverse rimozioni di questa
regione con un massimo La regione E1 è necessaria per la crescita virale
e viene fornita in trans da specifiche linee cellulari come 293, che
hanno la sequenza E1 incorporata stabilmente nel genoma.
• La regione E3 codifica prodotti genici antiapoptotici e inibisce
l’espressione di MHC; questi prodotti genici non sono essenziali per la
replicazione del virus in vitro e la complementazione nelle cellule di
packaging non è necessaria. Tuttavia, in alcune applicazioni, è richiesta
l’espressione dei prodotti di E3 per facilitare il rilascio delle particelle
virali dalle cellule infettate, ridurre la produzione di linfociti T citotossici
diretti contro il vettore e incrementare così la persistenza di espressione
del transgene.
•Gli adenovirus che mancano della regione E1 possono accettare
inserzioni di DNA esogeno fino a 5,1 kb, mentre quelli senza E1/E3 sino
a 8,2 kb.

E1A E1B
E3
Therapeutic
Transgene
(~ 5- 8 Kb)
L1 L2 L3 L4
L5
36 Kbp DNA Ad Genome
E2B
E2A E4
Early Generation Adenoviral Vector
replication defective

Vettori adenovirali di seconda generazione
• I vettori di prima generazione producono in vivo una immediata
risposta immunitaria molto efficiente, causata dall’espressione dei
geni virali; inoltre esiste il rischio di ricombinazione che porta al
ripristino della forma replicante del virus.
• Sono stati sviluppati, per questo, i vettori di seconda generazione con
un’ulteriore eliminazione di geni necessari per la replicazione virale. La
rimozione riguarda le regioni E4 oppure E2 (oltre a E1 e E3).
• Sono state costruite linee cellulari che forniscono in trans E2A,
codificante per una proteina terminale (TP) e per la DNA-polimerasi virale.
Può essere eliminato dal vettore e fornito in trans anche il gene E4, che
modula l’attività di trascrizione del virus e inibisce la sintesi proteica
dell’ospite.
•La rimozione del gene E4 porta alla riduzione dell’attività delle cellule T
helper e delle cellule B contro il vettore, ma è stato anche mostrato come i
vettori privi di E4 diano una bassa espressione del transgene.

L1 L2 L3 L4
L5
E1A E1B
E3
E2B
Therapeutic
Transgene
(~ 14 Kb)
E2A E4
Second Generation Adenoviral Vector
replication defective

Vettori adenovirali di terza generazione
• I vettori di terza generazione, detti anche “gutless vectors”,
mancano di tutti i geni virali e mantengono solo le regioni ITRs e le
sequenze di packaging Ψ.
• Per la loro propagazione questi vettori hanno bisogno di un sistema
di complementazione che comprende sia il virus helper che linee
cellulari che esprimono stabilmente E1.
• Il virus helper deve contenere tutti i geni richiesti per la replicazione
ed essere difettivo per la sequenza di packaging per evitare l’entrata di
geni virali nel capside dei virioni.
• Il vettore contiene invece solo le sequenze ITRs, il gene terapeutico e
il dominio Ψ che permette a queste sequenze di entrare nel capside
selettivamente e di essere rilasciato dalle cellule.
• I vantaggi di questi vettori sono lo spazio reso disponibile per
l’inserimento dei geni terapeutici e la riduzione delle probabilità di
eventi di ricombinazione che portino al ripristino di una forma
replicativa del vettore.

L1 L2 L3 L4
L5
E1A E1B
E3
ITR
E2B
Therapeutic
Transgene
ITR
Stuffer DNA
Stuffer DNA
E2A E4
Latest Generation Adenoviral Vector
“Gutless”; Helper-dependent; Minimal Ad

Rappresentazione schematica dei vettori adenovirali di prima,
seconda e terza generazione

PRODUZIONE DI VETTORI GUTLESS
1. Vettore virale: contiene solo sequenze ITRs e + la cassetta di
espressione del trangene
2. Cellule di packaging (293): esprimono gene E1
3. Virus Helper: E1-deleto, privo di sequenza . Fornisce elementi strutturali

PROPRIETA’ dei vettori adenovirali di prima,seconda e
terza generazione
Generazione
Prima
Seconda
Terza
(dipendenti da
vettori helper)
Delezioni
genomiche
E1
E1, E3
E1, E2a,
E2b, E3
E1, E3, E4
Tutte le
regioni
codificanti
Capacità
di
clonaggio
4 Kb
8 Kb
8-13 Kb
10 Kb
37 Kb
Principali vantaggi
Facile da produrre
Ridotte immunogenicità e
tossicità
Aumentata espressione dei
transgeni (dipende dal vettore)
Ampia capacità di clonaggio
Ridotte immunogenicità e
tossicità
Aumentata espressione dei
transgeni (dipende dal vettore)

Vantaggi
• Sicuri (non integrano nel genoma)
• Facilmente manipolabili
• Stabili
• Si ottengono alti titoli
• Ampio trofismo
• Infettano anche cellule quiescenti
• Possono veicolare inserti di grosse dimensioni (36Kb)
Svantaggi
VETTORI ADENOVIRALI
• Espressione transiente
• Alta risposta immunitaria

AdEasy Vector System per la produzione rapida di vettori
adenovirali ricombinanti
• Il sistema AdEasy Vector è stato sviluppato nel 1998 da He et al. per produrre
in modo rapido e semplice vettori adenovirali ricombinanti.
• La costruzione dell’adenovirus è condotta in due passaggi:
– 1) prima la cassetta di espressione è assemblata in un vettore di
trasferimento
– 2) successivamente, attraverso ricombinazione omologa, inserita nel genoma
adenovirale. L’ultima fase per la produzione del virus avviene nelle cellule HEK
293.
• L’inserimento del DNA, che sfrutta la ricombinazione omologa, è il sistema più
efficace per introdurre un gene in un adenovirus per due ragioni:
– (i) il DNA adenovirale è una molecola molta lunga e lineare che contiene siti
per molti enzimi di restrizione;
– (ii) il genoma è troppo grande (36 kb) per poter essere facilmente manipolato.

AdEasy Vector System per la produzione
rapida di vettori adenovirali ricombinanti
• La ricombinazione omologa però un evento raro, quindi, si sono
sviluppate diverse tecniche per la costruzione del vettore ricombinante.
• In particolare, il sistema AdEasy sfrutta una molecola di DNA
adenovirale circolare per generare il virus. Il DNA adenovirale circolare
contiene la resistenza ad un antibiotico (ampicillina o kanamicina) e
un’origine di replicazione batterica al posto della regione E1 che
consente allo stesso di replicarsi come plasmide in E. coli.
• Questi vettori sono stati modificati per aumentare le dimensioni del
loro genoma fino a circa 40 kb e sono stati privati del segnale di
packaging così da non poter entrare nei virioni.
• Il gene di interesse viene clonato in un piccolo plasmide contenente
parte del genoma adenovirale. Il plasmide ottenuto viene linearizzato e
co-trasfettato con Ad circolare nelle cellule helper. Tra le due molecole
di DNA avviene la ricombinazione e si creano genomi in grado di
replicarsi e di entrare nel capside, generando virus ricombinanti.

Protocollo dell’AdEasy Vector System (1)
• Il protocollo prevede il clonaggio del cDNA del gene terapeutico
all’interno del sito di multi clonaggio (MCS) del vettore di trasferimento
pShuttle-CMV contenente il gene per la resistenza alla kanamicina.
• La presenza del promotore eterologo di CMV (citomegalovirus) assicura
un’alta efficienza di espressione nelle cellule di mammifero.
• Il risultante plasmide viene linearizzato con l’enzima di restrizione Pme
I e co-trasformato nel ceppo BJ5183 di E. coli, altamente competente, con
pAdEasy-1, un plasmide di 33,4 kb contenente il DNA adenovirale del
sierotipo 5.
• Il pAdEasy-1 è privo delle regioni E1 e E3; le funzioni in E1 sono
complementate dalle cellule HEK 293, di rene umano.
• I ricombinanti corretti, con la cassetta per il gene terapeutico inserita
nella regione E1 del genoma adenovirale, sono selezionati per la loro
resistenza alla kanamicina e analizzati grazie a tagli di restrizione.

Protocollo dell’AdEasy Vector System (2)
• Il costrutto ricombinante adenovirale viene tagliato
dall’enzima di restrizione Pac I per esporre le sequenza ITRs
(inverted terminal repeats) e trasfettato nelle cellule 293 per
produrre le particelle virali.
• Dopo la ricombinazione si deve controllare la presenza del
gene terapeutico nel plasmide virale e selezionare solo i
ricombinanti corretti.
• Inoltre si deve amplificare trasformando le cellule batteriche
DH5α. Il ceppo DH5α di E. coli, al contrario di quello BJ5183,
non è molto efficiente per la ricombinazione ed è utilizzato per la
preservazione e l’amplificazione del DNA ricombinante virale dato
che l’intero genoma dell’AdEasy non è stabile nel DNA del ceppo
BJ5183 ed è sottoposto a rapida degradazione e riarrangiamenti.
• Una volta prodotto, il virus viene titolato con diversi metodi
prima dell’utilizzo.

Sistema AdEasy
- facile inserimento del
gene terapeutico
- rapida selezione dei
ricombinanti (resistenza
alla kanamicina)
- maggior stabilità del
genoma adenovirale

AdEasy Vector System - Vantaggi
• Rispetto ai metodi tradizionali, il tempo necessario per la
produzione di vettori adenovirali ricombinanti con il sistema
AdEasy è più breve.
• Oltre ai vantaggi nel clonaggio del gene terapeutico in modo
indiretto nel genoma adenovirale, il sistema permette di
risparmiare tempo nella selezione del vettore adenovirale
ricombinante direttamente nelle cellule batteriche.

Produzione in cellule HEK 293
Trasfezione mediante lipofectamina DNA Ad5 ricombinante in
cellule HEK293
↓
Si raccoglie sovranatante e lisato cellulare (I AVS)
↓
Trasduzione di nuove cellule HEK 293
↓
Si raccoglie sovranatante e lisato cellulare (II AVS)
↓
... (4. passaggi)

Placche di lisi in cellule HEK 293
MOI 100
MOI 10
CPE in HEK 293 trasdotte con Ad-CMV-HSV-TK30 MOI 10,100

Purificazione di vettori ricombinanti
Gradiente di CsCl

A
Misurazione del titolo virale
Risultati TCID 50
Micropiastre per la valutazione di TCID 50 colorate con cristal violetto.
A) Micropiastra di HEK 293 infettate con Ad-CMV-HSV-TK wt
B) cellule HEK 293 infettate con diverse diluizioni di Ad-CMV-mIL12.
B

Virus adeno-associati (AAV)
INTRODUZIONE
• I virus adeno-associati sono parvovirus non patogeni per l’uomo
• Per completare il loro ciclo vitale, dipendono da alcune proteine derivate
da altri virus (virus helper), soprattutto adenovirus ma anche virus
erpetici
• Diversamente dagli adenovirus, gli AAV possono integrarsi nel genoma
della cellula ospite in maniera sito-specifica.
• Uno svantaggio dell’impiego di AAV è la difficoltà di ottenere
preparazioni di AAV pure al 100% ossia prive di contaminazioni da virus
helper e da virus competente per la replicazione.
• Altro limite è dato dalla possibilità di inserire solo piccole quantità di
DNA eterologo (fino a 4.5 kb), dopo delezione dei due geni virali rep e cap.
Ma l’eliminazione del gene rep, fa perdere al vettore la capacità di
integrarsi in maniera sito-specifica.

Parvovirus: caratteristiche generali
Identificati solo nel 1960, sono virus molto piccoli e semplici.
La famiglia dei Parvoviridae contiene 6 generi suddivisi all’interno di 2
sottofamiglie:
Parvovirus
Erythrovirus
Dependovirus
Densovirus
Iteravirus
Contravirus
Parvovirinae:
Mice minute virus
B19 virus
Adeno - associated virus 2
Densovirinae:
Junonia coenia densovirus
Bombyx mori densovirus
Aedes aegypti densovirus
Vertebrati
Vertebrati
Vertebrati
Invertebrati
Invertebrati
Invertebrati
Esistono sierotipi diversi sia per caratteristiche strutturali sia funzionali,
hanno inoltre differenti tropismi cellulari (es. alcuni sierotipi non infettano il
muscolo scheletrico)
Possono essere suddivisi in due gruppi fondamentali:
virus difettivi, dipendono da un virus helper per la replicazione (es AAV2)
virus autonomi, competenti per la replicazione.

Parvovirus:
MORFOLOGIA
Formati da particelle icosaedriche, senza envelope, e costituiti soltanto
da proteine (50%), e DNA (50%)
3 proteine di rivestimento (capside): VP1, VP2 e VP3
2 proteine non strutturali: NS1, NS2.
Parvovirus Erithrovirus Dependovirus
(virus B19) (adeno associated virus

VIRUS ADENO-ASSOCIATI (AAVs)
• virus a DNAss, con polarità + o –
• capside icosaedrico
• no envelope
• genoma fiancheggiato da sequenze ITRs, che
contengono la sequenza di packaging
• solo due tipi di geni: cap (proteine del capside)
rep (proteine necessarie per la
replicazione e l’integrazione)
• per replicare necessita della presenza di un adenovirus o di un herpes
simplex virus (virus helper)
• in assenza di AdV o HSV, i virus AAV si integrano stabilmente nel genoma
della cellula ospite con un’alta frequenza, in una regione precisa del
cromosoma 19 (19q 13,3q-ter)
• una successiva superinfezione con AV o HSV attiva la replicazione del virus
integrato

Parvovirus:
GENOMA e REPLICAZIONE
• Genoma è una catena di ssDNA
• La replicazione dei virus autonomi avviene nel nucleo della cellula in fase S,
suggerendo il coinvolgimento della DNA polimerasi cellulare nel processo
• Il pretrattamento con vari agenti tossici (radiazioni UV, cicloesamide, agenti
carcinogeni chimici) possono sostituire la coinfezione con virus helper per la
replicazione degli AAV difettivi
Strutture a forcina in 5’e 3’che fungono da
primer per la replicazione del genoma virale
NS
Trascrizione e traduzione del genoma dei parvovirus

Genoma di AAV
• Il genoma di AAV codifica 2 proteine:
– Rep: non strutturale, regola la replicazione virale
– Cap: elementi strutturali capsidici

• Rep
– Rep68 + Rep78: regolano la
trascrizione virale e dirigono
l’inserzione del genoma virale
nel cromosoma 19.
– Rep52 + Rep40: regolano la
formazione del ssDNA
(genoma virale)
Le proteine di AAV
• Cap
– Vp1, Vp2, Vp3
– Tutte necessarie per la
formazione del capside

Prime fasi dell’infezione
• Recettore: heparan sulfate (HS) per AAV2, altri
recettori per altri sierotipi??? (la variabilità è
soprattutto localizzata sul capside)
• Presenza di HS quindi determinerà il tropismo
tissutale

• Replicazione avviene nel nucleo
anche di cellule quiescenti, in presenza
del virus helper
• In assenza di virus helper idoneo,
AAV penetra nel nucleo, si integra nel
genoma della cellula ospite e dà una
infezione latente
• Il sito d’integrazione specifico risiede a
livello del cromosoma 19 (19q13.3-
qter), in un locus definito AAVS1, vicino
al gene slow skeletal troponin T
Parvovirus:
REPLICAZIONE

Produzione di proteine strutturali
Replicazione
Tropismo cellulare
dei virus adeno-associati
Over-produzione di proteine non-strutturali
Morte cellulare
Cellule permissive: cellule del muscolo scheletrico, muscolo cardiaco, epitelio intestinale,
sistema ematopoietico
N.B.: Varia al variare dei sierotipi

Elementi necessari per un vettore
Elementi necessari in cis
• Solo le 2 ITR (145 basi ciascuna). Sono necessarie per
– replicazione
– packaging
– integrazione
AAV
Elementi necessari in trans
• Rep e Cap, forniti da un “AAV helper plasmid”
• co-infezione con un virus helper, di solito Adenovirus

ITR
145bp
ITR
ITR
I Vettori AAV :
ssDNA (4.7 Kb)
P REP P
CAP
P REP
inserto (circa 4 Kb)
P TRANSGENE
Non determinano una risposta immunitaria importante (solo risposta immunitaria
umorale)
Bassa capacità di inserzione del transgene (circa 4 Kb)
inserto (circa 2 Kb)
P TRANSGENE
Genoma di
AAV
Vettori AAV
tipo 1
Vettori AAV
tipo 2

Infezione con Adenovirus
+
Trasfezione di plasmide per esprimere
rep+cap
+
Trasfezione del vettore contenente il
transgene
Rischio di formare AAV wt per
ricombinazione
Occorre eliminare AdV

Eliminazione del virus helper
• Centrifugazione e separazione in gradiente di cloruro
di cesio
• riscaldamento a 56°C per 30 min

Vettori AAV Adenovirus-free
• E4 (ORF6) di AdV è la regione che possiede la
funzione helper
• Uso di un plasmide che fornisce le funzioni di
Adenovirus necessarie per la funzione helper, ma
che è incapace a formare la particella di Adenovirus

AAV Vector Production, 3-plasmid system

Trasfezione di un plasmide non
codificante tutto AdV ma solo
le funzioni necessarie per la
funzione helper (E4)

Vantaggi:
•Non sono responsabili di nessuna patologia umana
Vettori adeno-associati :
vantaggi-svantaggi
• Non determinano nessuna alterazione data dall’inserzione sito specifica
• Data la semplicità della struttura del genoma virale, è possibile eliminare totalmente i geni virali per la
costruzione di vettori AAV.
•Non sono patogeni per l’uomo
•Sono stabili
•Vengono ottenuti con alti titoli
•Alta efficienza di trasferimento genico
•Ampio tropismo
•Infettano sia cellule in divisione che non
•Integrazione del transgene
Svantaggi:
• Permettono l’inserzione di transgeni non più grandi di 4 Kb
• Vettori AAV rep -, possono essere interessati da inserzione random nel genoma della cellula ospite
• Difficoltà nell’ottenere preparazioni AAV pure al 100%, possibile presenza di virus competenti per la
replicazione
• Una elevata percentuale della popolazione possiede già anticorpi neutralizzanti anti-AAV2, il sierotipo più
utilizzato per il trasferimento genico.

Herpesvirus: caratteri generali
• La famiglia Herpesviridae comprende molti virus, patogeni
sia per l’uomo che per molti animali.
•Questi virus hanno alcune caratteristiche comuni, ma si
differenziano anche per molti aspetti, in modo tale da poterli
classificare in tre sottofamiglie sulla base dell’organizzazione
del genoma, del tropismo tissutale, della citopatologia, della
sede dell’infezione latente, nonché della patogenesi e sintomi
clinici.

• Le tre sottofamiglie sono:
Herpesvirus
Alphaherpesvirinae: a cui appartengono il virus
dell’herpes simplex di tipo 1 e 2 (HSV-1 e -2), il virus della
varicella-zoster (VZV), il virus della pseudorabbia (PRV),
l’herpesvirus equino di tipo 1 e 4 (EHV-1 e -4), l’herpesvirus
equino di tipo 3 (EHV-3) e l’herpesvirus bovino di tipo 1 (BHV-
1).
Betaherpesvirinae: a cui appartengono il citomegalovirus
umano e murino (HCMV e MCMV), gli herpesvirus umani di
tipo 6 e 7 (HHV-6 e -7).
Gammaherpesvirinae: a cui appartengono il virus di
Epstein-Barr (EBV), l ’ herpesvirus saimirii (HVS),
l’herpesvirus umano di tipo 8 (HHV-8) e l’herpesvirus equino
di tipo 2 e 5 (EHV-2 e 5).

• Gli herpesvirus sono in generale un gruppo diversificato di
virus a DNA di notevoli dimensioni, caratterizzati da una comune
morfologia del virione, strategia replicativa e capacità di
instaurare infezioni latenti/ricorrenti e litiche e, nel caso di EBV,
anche immortalizzanti.
• Gli herpesvirus sono virus ubiquitari e le loro infezioni sono
molto diffuse. Nell’uomo sono associati generalmente a patologie
benigne, ma possono essere anche responsabili di elevata
mortalità e morbilità in individui immunodepressi.
• La struttura del virione è comune a tutti gli herpesvirus:
presenta un genoma a DNA di notevoli dimensioni associato a
proteine che vanno a formare il nucleocapside, che è a sua volta
circondato da un rivestimento glicoproteico detto pericapside. Lo
spazio compreso tra capside e pericapside è detto tegumento e
contiene proteine ed enzimi virali che favoriscono l’inizio della
replicazione.

Struttura del virione di HSV-1
• Il virione di HSV, il cui diametro è di circa 180 nm, è
costituito da quattro elementi, comuni a tutti gli herpesvirus:
un core contenente una grossa molecola di DNA
un capside icosaedrico che racchiude il core
un tegumento amorfo che circonda il capside
un involucro esterno, detto pericapside o envelope, che
presenta sulla superficie corte spicole regolarmente
intervallate

HERPES SIMPLEX VIRUS (HSV-1)
• virus a DNAds
• capside icosaedrico
• envelope lipidico
• genoma costituito da almeno 80
geni, la metà dei quali non essenziali
Inizialmente effettua un’infezione produttiva nelle cellule epiteliali (ciclo litico),
risale poi attraverso le terminazioni dei nervi sensoriali fino ai gangli dorsali. Qui
stabilisce un’infezione latente (non necessita di espressione genica). Il ciclo litico
viene riattivato periodicamente: le nuove particelle virali vengono trasportate con
trasporto anterogrado e provocano lesioni a livello epiteliale

Elementi strutturali di HSV
• Genoma codifica 84 geni, divisi in:
– essenziali, necessari per la replicazione virale in colture
cellulari permissive
– non-essenziali, importanti in vivo, ad es. per interazione
virus-ospite, elusione del sistema immunitario, blocco delle
sintesi cellulari
questi possono esser deleti e sostituiti da TRANSGENI

Herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1)
Capacità di infettare sia cellule in attiva
proliferazione che non (ad esempio neuroni)
elevato neurotropismo e capacità di entrare in
latenza nei neuroni
ampio genoma, completamente sequenziato e facile da manipolare
1/3 dei geni non è essenziale per la replicazione: possibilità di sostituire geni virali con geni
esogeni
possibilità di fare delezione di geni essenziali per ottenere dei vettori non-replicativi

Replicazione di HSV-1
• Il processo di infezione inizia quando il virus interagisce con i
recettori cellulari. Le molecole recettrici riconosciute nelle fasi
iniziali del legame sono eparan solfato proteoglicani; anche le
proteine virali (principalmente gB, gD e gC) sono richieste nel
processo di attacco di HSV alla superficie cellulare.
• Il legame alla superficie cellulare attiva un processo mediato da
proteine virali di superficie che provoca la fusione del
pericapside con la membrana plasmatica cellulare, consentendo
al nucleocapside virale di penetrare direttamente nel citoplasma.
• In seguito all’ingresso del virus nella cellula, i capsidi sono
trasportati attraverso i pori nucleari ed il DNA virale si accumula
nel nucleo. In tale sede avvengono quindi la trascrizione, la
replicazione del DNA virale e l’assemblaggio dei nuovi capsidi.

• Il DNA virale viene trascritto dalla RNA polimerasi II dell’ospite,
tuttavia anche numerosi fattori virali vi partecipano.
• La sintesi dei prodotti genici virali è strettamente regolata
in modo coordinato e sequenzialmente ordinato a cascata, con i
prodotti genici virali raggruppabili in almeno 5 gruppi (, 1, 2, 1
e 2) sulla base di regolazioni sia trascrizionali che posttrascrizionali.

Replicazione di HSV-1

Geni
• I geni (precoci immediati o immediate early, IE) sono i primi ad
esser trascritti, e codificano le cinque proteine , dette polipeptidi
della cellula infettata (infected cell polypeptide, ICP) 0, 4, 22, 27
e 47.
• La sintesi delle proteine raggiunge il picco di sintesi
approssimativamente 2-4 ore post-infezione, ma hanno la
caratteristica di continuare ad accumularsi fino alle tarde fasi
dell’infezione.
• A quasi tutte le proteine di questo gruppo sono state attribuite
funzioni regolatrici, essendo indispensabili per la sintesi dei
gruppi di polipeptidi che seguono temporalmente ( e ).

Geni
• I geni (precoci ritardati o delayed early, DE) non sono infatti
espressi in assenza delle proteine .
• La sintesi delle proteine appartenenti ai gruppi 1 e 2
raggiunge il picco a circa 5-8 ore post-infezione. I geni 1 sono
espressi molto precocemente durante l ’ infezione, per cui
inizialmente sono stati confusi con i geni che codificano le
proteine .
• Tra i polipeptidi del gruppo 2 sono comprese la timidina
chinasi (TK) e la DNA polimerasi virale e la maggior parte delle
proteine virali coinvolte nel metabolismo dell ’ acido nucleico
virale (DNAsi, dUTPasi, ecc).
• A sequito della trascrizione dei geni inizia la replicazione del
DNA virale.

Geni
• I geni (tardivi o late, L) sono stati per convenienza suddivisi
in due gruppi, 1 e 2, che vengono espressi tardivamente
durante l’infezione; l’espressione delle proteine appartenenti a
questi due gruppi differisce nella regolazione temporale e
dipendenza dalla sintesi del DNA virale
•I geni di questi due gruppi sono principalmente strutturali,
infatti specificano glicoproteine di membrana e sono localizzati a
livello delle sequenze uniche del frammento corto del genoma
virale.

• Il DNA virale viene sintetizzato attraverso un meccanismo
detto a circolo rotante ( “ rolling circle ” ), formando
concatameri che vengono poi tagliati in monomeri e
impacchettati all’interno dei capsidi.
• L’assemblaggio delle particelle virali avviene in varie fasi:
dopo l’impacchettamento del DNA nei capsidi preassemblati,
avviene la gemmazione del virus attraverso il foglietto interno
della membrana nucleare.
• Una volta trasportati attraverso il citoplasma a livello di
membrana plasmatica, i neovironi vengono rilasciati
all’esterno della cellula.
• In colture di cellule permissive, l ’ intero processo si
completa in 18-20 ore.

Fase litica
• Attacco a cellule epiteliali, entrata cellulare e raggiungimento del nucleo
• Espressione di geni “immediate early” (IE), la cui trascrizione è attivata
da VP16 (proteina del tegumento con attività transattivante).
IE producono fattori necessari per l’espressione dei geni early (E),
importanti per la sintesi di DNA, e geni late (L), importanti per la
costituzione del capside e le glicoproteine dell’envelope
• Geni IE:
– ICP4 e ICP27: necessari per l’espressione di geni E e L
– ICP0 e ICP22: controllano la trascrizione ma non influenzano la
capacità di replicare del virus
– ICP47: regola la presentazione dell’antigene
• Il virus gemma dalla membrana nucleare, acquista 2 membrane di
pericapside e si fonde con la membrana cellulare per uscire, perdendo
una membrana

Fase latente
• Trasmissione agli assoni terminali dei neuroni del sistema nervoso
periferico
• Migrazione al corpo cellulare e instaurazione della fase latente
• silenziamento dei geni della fase litica ed espressione di LAT (latency
associated transcripts)
– antisenso di ICP0 e messaggeri che sopprimono l’espressione di
geni per la riattivazione litica
– non è prodotta alcuna proteina virale (anche se alcuni hanno
identificato ORF O e ORF P.
• Fase di latenza regolata da 2 promotori: LAP1 e LAP2 (latency active
promoters)
– LAP1 promuove l’espressione di LAT durante la fase di latenza
– LAP2 promuove l’espressione di LAT durante la fase litica

VETTORI HSV-1
• Grazie alla loro naturale capacità di stabilire infezioni latenti nei
neuroni, vengono utilizzati per il trasporto di geni nel CNS.
• L’espressione a lungo termine del transgene viene ottenuta
utilizzando dei promotori neurone-specifici, attivati durante il
periodo di latenza.
• Possono trasportare geni di grosse dimensioni (152Kb)
Esistono tre tipi di vettori HSV-1:
1. Attenuati
2. Non replicativi
3. Ampliconi

Vettori derivati da HSV-1
Vettori competenti nella replicazione o Gene replacement vector:
vettori in cui geni non essenziali per la replicazione sono stati
rimpiazzati con geni di interesse terapeutico.
Vettori difettivi nella replicazione: vettori in cui geni essenziali per la
replicazione (ad esempio ICP4, ICP27) sono stati deleti e geni non
essenziali per la replicazione rimpiazzati con geni di interesse
terapeutico.
Ampliconi: altamente difettivi che richiedono un virus “helper” o un
genoma virale helper per la replicazione e l’impacchettamento del
suo DNA. Contiene la minima sequenza cis-acting per la replicazione
e l ’ impacchettamento del DNA (origine di replicazione e la
sequenza di packaging)

Ampliconi di HSV
• Il genoma dell’amplicone è composto da copie multiple di
plasmide amplicone, che contiene un’origine di replicazione
(ori s) e il segnale di packaging (pac) del genoma di HSV-1.
• Le funzioni richieste per la replicazione, il packaging del
DNA e la produzione di particelle virali (i vettori ampliconi),
sono fornite o da virus helper o da sistemi helper free
(cosmide o HSV-BAC).

pac
ori
Vettore amplicone
Plasmide amplicone
pac
ori
X
Funzioni helper di HSV-1
~ 152 kb
Replicazione del DNA con meccanismo a “rolling circle”
e formazione del concatamero testa-coda

Plasmide amplicone
Produzione di vettori amplicone
oriS
a
Trasfezione
vettori amplicone
Infezione
Virus helper
Replicazione ed
impacchettamento
virus helper

Plasmide amplicone
Produzione di vettori amplicone
oriS
a
Trasfezione
vettori amplicone
E.coli F
U S
U L
Trasfezione
Replicazione ed
impacchettamento
cromosoma artificiale
batterico di HSV-1

Vettori amplicone: vantaggi
Non sono tossici per le cellule infettate in quanto non
contengono il genoma di HSV-1;
il carattere ripetitivo del genoma (fino a 152 kbp) permette
il trasferimento di copie multiple del transgene;
può infettare numerosi tipi di cellule;
Vengono utilizzati prevalentemente come vettori vaccinali

Nessuna replicazione
virale
Vettori erpetici non replicativi
coltura cellulare
X X
Nessuna produzione
di virus
virus difettivi in
geni essenziali
Crescita virale
linea cellulare
complementante

Vantaggi dei vettori basati
Molti aspetti della biologia di HSV sono favorevoli al suo
utilizzo come vettore per terapia genica:
• ampio spettro d’ospite
• elevata efficienza d’infezione
• cellulle non replicanti possono esser efficientemente
trasdotte ed
esprimere il/i transgene/i
su HSV
• possibilità di inserire nel genoma larghi frammenti di
DNA (circa metà degli 84 geni non sono essenziali)

Vantaggi dei vettori basati
su HSV
• virus ricombinante replicazione-difettivo può esser
facilmente preparato con alto titolo e con elevata
purezza, cioè non contaminato da virus wild-type
• lo stato di latenza può esser sfruttato per
l’espressione a lungo termine di transgeni nei
neuroni
• l’espressione abortiva di geni da parte di virus
ricombinanti replicazione-difettivi risulta in uno stato
simile alla latenza, permettendo l’espressione di
transgeni sia in cellule neuronali che non-neuronali

Svantaggi dei vettori HSV
Tuttavia, altri aspetti della biologia di HSV possono
rappresentare un problema nel suo utilizzo come
vettore
per terapia genica:
• Tossicità: l’infezione con HSV wild-type è tossica per
la cellula e invariabilmente risulta nella lisi di molti tipi
di cellule
• Espressione transiente: buon livello di espressione
dei transgeni, ma spesso poco duratura

Features of viral vector systems for their
Features of viral vectors
application in gene therapy