Prima di immergere la lastrina o la striscia di carta nell'eluente, è ...

ELUIZIONE
Prima di immergere la lastrina o
la striscia di carta nell'eluente, è
opportuno «condizionarla»
inserendola per 10-60 minuti
nella camera di sviluppo
Si sistema sul fondo della camera uno spessore di materiale inerte (vetro
o politene) e vi si appoggia sopra la lastrina.
La successiva fase di sviluppo
del cromatogramma può essere
eseguita con diverse tecniche.

Sviluppo discendente
L'eluente defluisce dall'alto verso il basso della lastrina e perciò è
richiesta una speciale camera di eluizione, con una vaschetta posta in
alto. Durante lo sviluppo l'eluente si sposta verso il basso per gravita e
quindi l'eluizione avviene in tempi più brevi; inoltre si amplifica lo
spostamento delle sostanze meno mobili.

Sviluppo orizzontale
Consente di realizzare sistemi più compatti
Richiedere minori quantità di eluente
Lo sviluppo orizzontale può essere realizzato a senso unico oppure
in senso circolare o radiale
(a) Camera per sviluppo a senso unico. Nel tipo più semplice (a sinistra), la lastra
cromatografica poggia su due sostegni;uno è avvolto in carta da filtro e consente
all'eluente di arrivare fino alla lastra. Alternativamente (a destra), la camera contiene due
vaschette, una per l'eluente e l'altra per la raccolta a fine corsa
(b) Camera per sviluppo radiale. La lastrina è circolare; l'eluente imbeve lo stoppino e
giunge così fino alla lastra.

Sviluppo Circolare
Nello sviluppo circolare le sostanze da separare migrano dal centro di una
lastra circolare verso il margine e formano, invece di macchie, degli anelli
concentrici. La lastra ha un foro centrale, in cui viene inserito uno stoppino
di cotone o di carta da filtro che pesca nell’eluente; la semina viene fatta
intorno al foro centrale oppure direttamente sulla parte di stoppino che ne
fuoriesce. Per effettuare più semine contemporaneamente, la lastra deve
essere incisa in modo da delimitare la superficie disponibile per ciascuna
sostanza; si realizza così uno sviluppo in senso radiale
Lo sviluppo circolare (o
radiale), a volte, consente
di migliorare la
separazione fra sostanze
che risultano molto
ravvicinate nello sviluppo
verticale
(R F ) radiale = (R F ) lineare

Cromatografia bidimensionale
Si semina una macchia in un angolo della lastrina e si effettua un
primo sviluppo con un eluente opportuno. Poi si ruota la lastrina di
90° e si effettua un nuovo sviluppo con un diverso eluente

RIVELATORI
Rivelazione con luce UV (a 254 e 366 nm ) per sostante fluorescenti
Per sostanze non fluorescenti si usano gli indicatori di fluorescenza:
• un silicato di zinco e magnesio attivato, che presenta un massimo di
assorbimento a 254 nm e da una fluorescenza verde;
• un pigmento inorganico che ha un massimo di assorbimento a 366 nm e da
una fluorescenza blu.

RIVELATORI
In alcuni casi, dopo l'eluizione si spruzza la lastrina con indicatori che
reagiscano con le sostanze da rivelare formando composti fluorescenti.
Gli indicatori più usati sono:
• rodamina B (soluzione allo
0,025-0,05% in etanolo),
adatta per usi generali;
• rodamina 6G (sol. all’ 1%
in acetone), adatta per
rivelare i lipidi;
• diclorofluorescina (sol. allo
0,01-0,2% in etanolo),
adatta per usi generali.

Rivelazione con reagenti chimici
Questi reagenti, vaporizzati sulle sostanze eluite, formano con esse
composti colorati. Per la vaporizzazione si usa un nebulizzatore a
pompetta o, ancora meglio, una bomboletta spray di gas inerte.
Nebulizzatori
Bombolette spray

Fotodensitometri
Sono dispositivi che permettono di registrare veri e propri
cromatogrammi a partire dalle lastrine eluite, eventualmente (ma non
necessariamente) sottoposte a colorazione delle macchie.
La sorgente luminosa è una lampada a deuterio (per misure fra 200 e 540
nm) oppure una lampada alogena (da 340 a 700 nm) o una lampada a vapori
di mercurio (per misure di fluorescenza).

Fotodensitometri
Scansione lineare. Il pennello
luminoso scorre lungo la direzione
di eluizione; questo sistema di
rivelazione è inadatto se il
percorso delle macchie ha subito
per qualsiasi motivo una distorsione
durante l'eluizione, a meno di
procedere a una semina lineare.
Scansione a zig zag. Il pennello
luminoso scorre in modo sincrono sia
lungo la direziono di eluizione (y) sia in
direzione perpendicolare a questa (x).
Il movimento lungo l'asse x viene
calibrato per ottenere anche un
controllo dello O nelle posizioni 1 e 2.

METODI DI ANALISI
ANALISI QUALITATIVA ANALISI QUANTITATIVA

METODI DI ANALISI: TLC PREPARATIVA
12

CROMATOGRAFIA SU COLONNA A BASSA PRESSIONE
La colonna viene riempita con una fase stazionaria (solida, liquida o in gel)
attraverso la quale viene fatta scorrere, per gravita o esercitando una
moderata pressione, la fase mobile (un liquido organico a bassa viscosità o
una soluzione acquosa). Le bande eluite vengono raccolte in frazioni
all'uscita dalla colonna. Oggi questa tecnica è detta cromatografia a
bassa pressione (Low Pressure Chromatography, LPC).
Cromatografia classica su colonna:
La fase mobile scorre lungo la colonna per
gravita, percolando dalla riserva posta in
alto. I diversi componenti della miscela (A,
B, C e D) vengono recuperati in raccoglitori
di frazioni

Sistemi automatici
Sistema automatico per l'esecuzione di una separazione cromatografica
isocratica su colonna, completo di collettore di frazioni.

Metodologie
Speciali
in
Analisi
Farmaceutica
Tipi di colonna
Il fulcro di un sistema per LPC è la colonna stessa, realizzata in vetro o in
materiale plastico, perlopiù trasparente; in genere la lunghezza varia da 10
a 100 cm e il diametro interno (abbreviato id) da 0,5 a 5 cm.
(a) versione molto semplificata della colonna “classica”;
(b) colonna con rubinetto;
(c) colonna con camicia per la termostatazione;
(d) colonna in nylon, che può essere tagliata in corrispondenza delle bande;
(e) versione moderna per dispositivi automatici.

Metodologie
Speciali
in
Analisi
Farmaceutica
Classificazione delle tecniche per LPC
La classificazione delle diverse tecniche in LPC si basa su un criterio
che tiene conto sia dello stato fisico delle due fasi sia del meccanismo
della separazione; le tecniche principali si possono suddividere in:
• cromatografia di adsorbimento-ripartizione;
• cromatografia di esclusione;
• cromatografia di scambio ionico;
• cromatografia di affinità.

Metodologie
Speciali
in
Analisi
Farmaceutica
CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO-RIPARTIZIONE
Questa tecnica prevede due varianti, molto simili fra loro dal punto
di vista operativo:
• cromatografia liquido-solido (Liquid-Solid Chromatography, LSC);
• cromatografia liquido-liquido (Liquid-Liquid Chromatography, LLC).
Il meccanismo di separazione può coinvolgere sia fenomeni di
adsorbimento, caratteristici della LSC, sia fenomeni di ripartizione,
caratteristici della LLC.

Fase stazionaria solida. In pratica, tutti i materiali usati in TLC sono
usati anche su colonna, con una preferenza per la silice e l'allumina.
Le particelle della fase stazionaria devono essere abbastanza piccole, per
minimizzare i fenomeni di diffusione e assicurare buone velocità di scambio;
questo consente di ottenere bande compatte. D'altra parte, le particelle non
devono essere troppo piccole, perché creerebbero una eccessiva resistenza al
flusso dell'eluente. In genere si usano granulometrie comprese fra 50 e 200
mesh. La distribuzione granulometrica deve essere la più ristretta possibile.
Fase stazionaria liquida. Il liquido viene
fatto adsorbire su un materiale di
supporto di tipo granulare, possibilmente
inerte; la granulometria è compresa fra 60
e 100 mesh, in modo che ogni granulo sia
rivestito abbastanza uniformemente di un
film di liquido, su cui avviene lo scambio
con la fase mobile.
Metodologie
Speciali
in
Analisi
Farmaceutica
FASE STAZIONARIA
In realtà, il materiale di supporto partecipa inevitabilmente al processo di
separazione; di conseguenza, per ridurre i fenomeni di adsorbimento
spesso si disattiva il supporto granulare. Nel caso dell'allumina si effettua
un riscaldamento prolungato a 800°C, mentre per il gel di silice si bloccano
i gruppi attivi superficiali aggiungendo acqua!!!

Metodologie
Speciali
in
Analisi
Farmaceutica
FASE MOBILE
I risultati ottenuti in TLC possono essere trasferiti alla separazione su
colonna
La tecnica su colonna si presta anche all'uso di diversi solventi durante
la stessa eluizione.

Metodologie
Speciali
in
Analisi
Farmaceutica
SCELTA DELLA FS E DELLA FM
Criterio fondamentale è che le due fasi abbiano polarità
diversa e una discreta affinità per la miscela da separare.
• La cromatografìa di ripartizione offre migliori prestazioni rispetto alla
cromatografia di adsorbimento
•L'uso dell'acqua come liquido di ripartizione consente un'ampia scelta per
l'eluente (o per la sequenza di eluenti) più adatto e consente così di
lavorare con una fase mobile di polarità ottimale.
•La miscela deve essere molto solubile nella fase mobile scelta
•Le diverse classi di composti organici sono trattenute da una fase
stazionaria polare (quindi molto attiva) come l'allumina nel seguente ordine
di forza decrescente: acidi e basi • alcoli e tioli • aldeidi e chetoni •
esteri e alogenuri • areni • alcheni e alchini • alcani
• Per una fase stazionaria non polare come il carbone attivo, invece,
l'ordine è inverso.
• In genere con la cromatografia di adsorbimento si effettua una
separazione per classi di composti, mentre con la cromatografia di
ripartizione si effettua anche una separazione dei composti in una
determinata classe (o serie omologa).
• Per accelerare l'eluizione di una specie chimica trattenuta piuttosto
tenacemente dalla fase stazionaria, si deve migliorare la sua affinità con
la fase mobile.

Metodologie
Speciali
in
Analisi
Farmaceutica
PRESTAZIONI
Le prestazioni di una separazione su colonna si misurano in base alle
caratteristiche di: selettività, efficienza, risoluzione, capacità e
riproducibilità.
La selettività, ossia la capacità di fornire bande ben distanziate,
dipende essenzialmente dalla coppia fase mobile/fase stazionaria,
oltre che dalla temperatura.
In LSC e in LLC, comunque, non si interviene quasi mai su questo
parametro, perché la maggior parte delle separazioni viene eseguita a
temperatura ambiente.
L'efficienza rappresenta la capacità del sistema di fornire bande
strette e dipende dai seguenti parametri:
a. granulometria del riempimento
b. geometria della colonna e, in LLC, anche
spessore del film del liquido di ripartizione
impregnato sul supporto.
c. La simmetria delle bande
d. la riproducibilità

Metodologie
Speciali
in
Analisi
Farmaceutica
TECNICA OPERATIVA
Preparazione della colonna
In LSC la fase stazionaria deve essere preparata attivandola (o
disattivandola)
In LLC il liquido di ripartizione deve essere miscelato con il materiale
di supporto secondo precisi rapporti
Riempimento per via secca Riempimento per via umida

Metodologie
Speciali
in
Analisi
Farmaceutica
Caricamento del campione in colonna
Arrestare il flusso dell’eluente in modo che
si crei un minimo battente di liquido in testa
1. Si pone un disco di carta da filtro sopra al materiale
di riempimento. Quindi si deposita uno strato sottile
(0,5-1 cm) di materiale granulare inerte o del cotone
idrofilo e lo si preme con una bacchetta di vetro. A
questo punto, con una pipetta si depone il campione,
disciolto nel minimo volume di eluente in modo che si
distribuisca su uno strato sottile.
2. Si ritaglia un disco di carta da filtro e lo si buca in
più punti con uno spillo; poi si fa assorbire il campione,
disciolto nel minimo volume di eluente, e si essicca il
disco. A questo punto si depone con delicatezza il disco in
testa al riempimento e lo si ricopre con un sottile strato
(0,5-1cm) di materiale inerte o cotone idrofilo.