Analisi quantitativa delle immagini
Analisi quantitativa delle immagini
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CENTRO GRANDI STRUMENTI<br />
Università Degli Studi Di Pavia<br />
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
16 Giugno 2010<br />
Immagini & Computer S.n.c.<br />
Via Don Carlo Riva 4<br />
20010 Bareggio (Mi)
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
“L’analisi <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong> rappresenta l’arte di trasformare<br />
una sensazione visiva irrazionale nella sua forma schematica e discreta<br />
consentendone la descrizione, la classificazione e l’interpretazione<br />
matematica e logica univoca <strong>delle</strong> sue componenti spaziali e temporali.”
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Il microscopio moderno è uno strumento di imaging multidimensionale in grado di<br />
visualizzare le strutture biologiche nel loro contesto spaziale naturale.<br />
2D<br />
3D<br />
Si è passati da una visione 2D fissa (dall‟alto – perpendicolare al piano del campione) ad<br />
una visione 3D libera nello spazio dove l‟osservatore può posizionarsi in qualsiasi punto<br />
della scena (oppure ruotare la scena rispetto alla propria posizione).
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Oltre alla reale rappresentazione del campione nello spazio, siamo oggi in grado di<br />
studiare altri parametri indispensabili per la comprensione dei comportamenti e dei<br />
processi biologici.<br />
Chimica<br />
(fluorescenza, lifetime)<br />
Cinetica<br />
(time-lapse)<br />
Sistemi<br />
Dinamici<br />
High<br />
Throughput<br />
Microscopio<br />
ottico<br />
<strong>Analisi</strong><br />
<strong>quantitativa</strong><br />
Biologia<br />
moderna<br />
Fisica<br />
(Fase, Polarizzazione)<br />
Struttura<br />
(spazio 3D)<br />
Sistemi<br />
Complessi<br />
High Contest<br />
Risultati
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Dimensioni spaziali:<br />
Molteplici fattori quali la morfologia 3D, la localizzazione, l‟orientamento, le<br />
microstruttura e la connettività, influenzano il comportamento cellulare.<br />
Dimensioni chimiche:<br />
Sonde fluorescenti possono essere coniugate con elementi biochimici presenti in tessuti<br />
e cellule con una elevata specificità.<br />
Lo studio dei processi biologici a livello sub cellulare, <strong>delle</strong> interazioni proteina /<br />
proteina, e <strong>delle</strong> dinamiche intracellulari consente di monitorare attività biofisiche e<br />
biochimiche specifiche.<br />
Dimensioni temporali:<br />
Il comportamento cellulare e le dinamiche ad esso associate possono essere studiate nel<br />
tempo.
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
L‟esplorazione del campione attraverso la visualizzazione del volume.<br />
BLEND MIP SHADING PROJECTION<br />
Visualizza tutti i punti lungo<br />
l‟asse di osservazione<br />
(trasparenza)<br />
Visualizza punti più<br />
luminosi lungo l‟asse<br />
di osservazione<br />
Utilizza sorgenti di<br />
illuminazione artificiali<br />
Utilizza sorgenti di<br />
illuminazione artificiali<br />
(genera ombre)<br />
Molti metodi unico obiettivo :<br />
vedere bene per interpretare e<br />
comprendere l‟evento.<br />
ISOSURFACE
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Il volume quale sorgente di informazioni<br />
<strong>Analisi</strong> statistica dei singoli canali (fluorocromi)
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Il volume rappresenta le strutture come esse sono nella realtà.<br />
Possiamo ruotarlo, tagliarlo e nasconderne parti alla vista rivelando od evidenziando<br />
particolari d‟interesse.<br />
Volume intero<br />
Tutte le informazioni a<br />
sinistra del piano di clipping<br />
sono nascoste<br />
Solo le informazioni relative al<br />
singolo canale a sinistra del piano<br />
di clipping sono nascoste
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La serie di piani focali che compongono il volume possono essere visualizzati sia<br />
ortogonalmente che obliquamente dando origine a nuove viste del nostro campione.<br />
Sezioni ortogonali<br />
Sezioni oblique<br />
Misura della distanza tra punti o<br />
strutture giacenti su piani<br />
ortogonali diversi<br />
Visualizzazione e valutazione di<br />
strutture ricostruite secondo un<br />
piano prospettico non originale.
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Uno dei metodi di rappresentazione del volume è basato sulla creazione <strong>delle</strong> Isosuperfici.
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Le isosuperfici (Isosurface) sono generate attraverso la creazione matematica di una<br />
struttura complessa di forme geometriche (triangoli) che descrivono la superficie del<br />
volume.<br />
Creazione della struttura<br />
„wire frame“<br />
Creazione della isosuperficie
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Le isosuperfici non hanno solo una valenza estetica ma risultano essenziali per la<br />
quantificazione del volume.<br />
Esse costituiscono il “guscio” che racchiude le nostre strutture dandogli forma e confini<br />
precisi.<br />
Intensità media, totale di<br />
fluorescenza<br />
Volume, superficie, diametri,<br />
descrittori di forma, etc.<br />
La struttura descritta dalle isosuperfici può essere misurata in dimensioni e forma.<br />
Il segnale in essa confinato può essere quantificato.
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La documentazione del campione attraverso la rappresentazione del volume.<br />
Creazione di filmati<br />
Esportazione dei filmati in formati standard.<br />
(AVI, MOV, QTVR)
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Misurare il volume e le sue componenti<br />
Volume ricostruito<br />
Sezioni ortogonali<br />
Misure di distanza lineari e non tra<br />
punti nello spazio reale appartenenti<br />
al volume.
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Misure di distanza<br />
Isosuperfici<br />
Distanza tra oggetti calcolata tra 2 punti localizzati sulla superfici esterne.<br />
Distanza tra oggetti calcolata tra i due centri dei volumi di interesse.
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Il profilo di intensità<br />
Profilo di distribuzione della intensità di fluorescenza (singolo fluorocromo)
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Definizione <strong>delle</strong> strutture che compongono il volume<br />
La isosuperficie costituisce il “guscio” che racchiude le nostra<br />
struttura dandogli forma e confini precisi e rendendola misurabile in<br />
dimensioni, forma e contenuto.<br />
Definizione dell‟intervallo di intensità che<br />
contiene gli oggetti (volume).
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Ottimizzazione dell‟immagine<br />
Ripristino <strong>delle</strong> caratteristiche<br />
originali <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong>.<br />
Rimozione del rumore<br />
Deconvolulzione<br />
Correzione degli artefatti<br />
Decadimento (Photobleaching,ect)<br />
Correzione Background<br />
Disomogeneità illuminazione<br />
Registrazione<br />
Mosaicatura<br />
Identificazione <strong>delle</strong> strutture<br />
Segmentazione<br />
Distinzione da altre strutture<br />
Codifica dei confini e misura<br />
Classificazione
Intensity<br />
Intensity<br />
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Definizione <strong>delle</strong> strutture che compongono il volume<br />
Problemi di disomogeneità del segnale<br />
D<br />
E<br />
A<br />
B<br />
C<br />
F<br />
Position<br />
Algoritmo di compensazione<br />
del background<br />
A B C D E F<br />
Position
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La valutazione del campione.<br />
Divisione <strong>delle</strong> strutture (volume splitting)<br />
Separazione strutture non<br />
riuscita in fase di definizione<br />
<strong>delle</strong> Isosurface<br />
Region Volume – Il raggio del singolo spot<br />
è determinato sulla base del volume della<br />
regione a cui esso appartiene.<br />
Region Border– Il raggio dell„oggetto è<br />
calcolato come la distanza minore dal<br />
centro verso il bordo<br />
Es. convesità o concavità<br />
della struttura, variazioni<br />
di intensità, ect.
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La valutazione del campione.<br />
Estrazione dei parametri<br />
Calcolo del volume, della superfice, della<br />
Intensità media ed integrata e della<br />
posizione di ogni oggetto
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La valutazione del campione.<br />
Filtraggio e classificazione <strong>delle</strong> strutture in base a parametri dimensionali e di intensità<br />
Filtraggio <strong>delle</strong> strutture<br />
Insieme <strong>delle</strong> strutture definite<br />
(isosuperfici)<br />
Classificazione <strong>delle</strong> strutture
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La valutazione del campione.<br />
Rappresentazione grafica e statistica <strong>delle</strong> misure<br />
Esportazione dei risultati in<br />
Excel o su file Ascii.
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La valutazione del campione.<br />
<strong>Analisi</strong> cinetica<br />
Valutazione del movimento <strong>delle</strong> strutture (variazione della<br />
posizione) rispetto al tempo ed allo spazio.<br />
Determinazione della direzione, velocità, accelerazione e<br />
tipologia del moto di ogni singolo oggetto.<br />
Quantificazione <strong>delle</strong> modifiche strutturali<br />
(Dimensioni) e chimiche (intensità del<br />
segnale) in relazione al tempo.<br />
La valutazione <strong>delle</strong> variazioni di intensità<br />
del segnale in oggetti fermi non è considerata<br />
analisi cinetica.
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La valutazione del campione.<br />
<strong>Analisi</strong> cinetica – tecniche di identificazione <strong>delle</strong> traccie<br />
Browniano<br />
Connesso<br />
Autoregressivo<br />
r<br />
t e t e<br />
t a<br />
t b<br />
t c<br />
t d<br />
t b<br />
t c<br />
r‘<br />
r<br />
r<br />
t a<br />
E‟ importante conoscere la natura del moto degli oggetti per poter selezionare l‟algoritmo adeguato alla loro<br />
identificazione e monitoraggio.
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La valutazione del campione.<br />
<strong>Analisi</strong> cinetica – analisi dei risultati<br />
Statistica Selezione (filtro) Rappresentazione
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La valutazione del campione.<br />
<strong>Analisi</strong> <strong>delle</strong> interazioni tra comparti cellulari<br />
‣ Distanza vescicole – Nuclei<br />
‣ Colocalizatione <strong>delle</strong> Vescicole (Intensità di un canale all‟interno<br />
del volume vescicolare)<br />
‣ Distanza Vescicole–Membrana (più vicina)<br />
‣ Numero di Vescicole per nucleo<br />
‣ Densità <strong>delle</strong> vescicole per nucleo<br />
‣ Associazione Nucleo – Cellula<br />
‣ Numero di vescicole per cellula, Densità <strong>delle</strong> vescicole per<br />
cellule, , Volume <strong>delle</strong> vescicole per cellula<br />
‣ Nuclei per Cellula<br />
‣ Volume del Nucleo / Volume del Citoplasma<br />
‣ Distanza media vescicole – Nuclei e vescicole vs Membrana (più<br />
vicina)<br />
‣ Intensità <strong>delle</strong> vescicole per cellula
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La valutazione del campione.<br />
<strong>Analisi</strong> <strong>delle</strong> interazioni tra comparti cellulari<br />
Statistica<br />
Rappresentazione
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La valutazione del campione.<br />
Colocalizzazione<br />
Colocalizzazione di oggetti<br />
Colocalizzazione di segnale<br />
Oggetti che risultano parzialmente in<br />
contatto o totalmente inseriti in altri<br />
oggetti.<br />
Parti di strutture che mostrano una parziale o<br />
totale sovrapposizione con altre strutture<br />
differentemente marcate.
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La valutazione del campione.<br />
Colocalizzazione<br />
L’analisi della colocalizzazione richiede:<br />
1. Basso livello di rumore<br />
2. Segnale non saturato<br />
3. Nessuna sovrapposizione tra gli spettri di emissione dei fluorocromi (bleedthrough)<br />
4. Funzione PSF dei singoli canali molto simile (richiede verifica PSF con bead multicolore)<br />
5. Registrazione perfetta tra i canali (verifica shifting ottico)<br />
Calcolo automatico della soglia di intensità per<br />
singolo canale.<br />
Channel A<br />
Fitted line along<br />
which algorithm<br />
proceeds<br />
PC=0 for voxels below<br />
thresholds<br />
Channel B
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La valutazione del campione.<br />
<strong>Analisi</strong> di filamenti<br />
•Misurazione dell‟albero dendritico<br />
•Identificazione <strong>delle</strong> spine e calcolo <strong>delle</strong> loro caratteristiche<br />
strutturali (volume, ect)<br />
•Diametro dei filamenti.<br />
•Statistica distribuzione spine<br />
•Orientamento dendriti<br />
•<strong>Analisi</strong> dei livelli dei branches (generazioni)<br />
•Classificazione spine
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La valutazione del campione.<br />
<strong>Analisi</strong> di filamenti
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
Chi offre tutte queste potenzialità ?<br />
La piattaforma di visualizzazione ed analisi 3D/4D<br />
IMARIS
Immagini & Computer Snc<br />
Via Don Carlo Riva 4<br />
Bareggio (Mi)<br />
GRAZIE PER LA VOSTRA ATTENZIONE !
<strong>Analisi</strong> <strong>quantitativa</strong> <strong>delle</strong> <strong>immagini</strong><br />
La valutazione del campione.<br />
<strong>Analisi</strong> cinetica – tecniche di identificazione <strong>delle</strong> traccie<br />
E‟ altresi importante la capacità del programma di prevedere l‟evoluzione del moto degli oggetti nel tempo a<br />
venire per poter mantenere la traccia identificata.
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