Applied Biosystems StepOne™ System Real-Time PCR System ...

Guida introduttiva 

Applied Biosystems StepOne 

Real-Time PCR System 

Esperimenti di genotipizzazione

Guida introduttiva 

Introduzione 

Applied Biosystems StepOne 

Real-Time PCR System 

Esperimenti di genotipizzazione 

Disegno 

dell'esperimento 

Preparazione delle 

reazioni 

Esecuzione 


Analisi 

dell'esperimento

© Copyright 2006, 2010 Applied Biosystems. All rights reserved. 

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A license to perform the patented 5’ Nuclease Process for research is obtained by the purchase of (i) both Licensed Probe and Authorized 5' Nuclease Core 

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foregoing patent claims for using only this amount of product for the purchaser’s own internal research. Separate purchase of an Authorized 5' Nuclease Core 

Kit would convey rights under the applicable claims of US patents, and corresponding patent claims outside the United States, which claim 5’ nuclease 

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purchaser's activities for a fee or other commercial consideration, is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. This product is for research use only. 

Diagnostic uses under Roche patents require a separate license from Roche. 

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A license to perform the patented 5’ Nuclease Process for research is obtained by the purchase of (i) both Authorized 5' Nuclease Core Kit and Licensed 

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Applera, Applied Biosystems, AB (Design), MicroAmp, and VIC are registered trademarks, and FAM, StepOne, and TAMRA are trademarks of 

Applied Biosystems or its subsidiaries in the U.S. and/or certain other countries. 

AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. 

SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. 

Excel, Microsoft and Windows are registered trademarks of Microsoft Corporation. 

All other trademarks are the sole property of their respective owners. 

N. di cat. 4377730 Rev. B 

06/2010 

RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Indice 

Premessa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v 

Come utilizzare questa guida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v 

Come ottenere ulteriori informazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii 

Come ottenere assistenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii 

Convenzioni sulla sicurezza utilizzate in questo documento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix 

Simboli sugli strumenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi 

Etichette di sicurezza sugli strumenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xii 

Sicurezza generale dello strumento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii 

Sicurezza dalle sostanze chimiche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiv 

Sicurezza dei rifiuti chimici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvi 

Sicurezza elettrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii 

Sicurezza LED . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xviii 

Sicurezza rischio biologico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xix 

Sicurezza della stazione di lavoro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xix 

Norme di sicurezza e di compatibilità elettromagnetica (EMC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . xx 

Capitolo 1 Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 

Informazioni sul sistema StepOne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 

Informazioni sugli esperimenti di genotipizzazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 

Come utilizzare questa guida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 

Informazioni sull'esperimento di esempio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 

Flusso di lavoro dell'esperimento di esempio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 

Capitolo 2 Disegno dell'esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 

Descrizione generale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 

Creazione di un nuovo esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 

Definizione delle proprietà dell'esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 

Definizione dei metodi e dei materiali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 

Impostazione dei Saggi SNP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 

Impostazione dei campioni e dei replicati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 

Impostazione del metodo di esecuzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 

Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 

Ordine dei materiali per l'esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 

Termine del flusso di lavoro del Design Wizard . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 

Guida introduttiva al sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System per gli esperimenti di 

genotipizzazione 

iii

Capitolo 3 Preparazione delle reazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 


Preparazione delle diluizioni del campione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 

Preparazione della miscela di reazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 

Preparazione della piastra di reazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 

Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 


Preparazione per l'esecuzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 

(Opzionale) Abilitazione delle notifiche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 

Avvio dell'esecuzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 

Monitoraggio dell'esecuzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 

Rimozione della piastra di reazione e trasferimento dei dati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 

Capitolo 5 Analisi dell'esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 


Apertura dell'esperimento per l'analisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 

Visulizzazione del Plot di discriminazione allelica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 

Visualizzazione del layout di piastra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 

Visualizzazione tabella Well (Pozzetto) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 

Visualizzazione del riepilogo CQ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 

Visualizzazione del Plot dei dati non elaborati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 

Visualizzazione del Plot multicomponente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 

Visualizzazione Plot di amplificazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 

Visualizzazione delle impostazioni di analisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 

Pubblicazione dei dati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 

Appendice A Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi . . . . . . . . . . 97 

Flusso di lavoro impostazione avanzata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 

Flusso di lavoro avvio rapido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 

Flusso di lavoro del templato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 

Flusso di lavoro esportazione/importazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 

Bibliografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 

Glossario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 

Indice. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 

iv 


genotipizzazione

Premessa 

Come utilizzare questa guida 

Scopo della guida 

A chi si rivolge 

Ipotesi assunte 

Convenzioni del 

testo 

La guida spiega come eseguire esperimenti di genotipizzazione sul sistema Applied 

Biosystems StepOne Real-Time PCR System. Questa guida funge da: 

• Tutorial, utilizzando i dati dell'esperimento di esempio forniti con il software del sistema 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System. 

• Guida, per i propri esperimenti. 

Questa guida è pubblicata per il personale di laboratorio e per i ricercatori principali che 

eseguono esperimenti di genotipizzazione utilizzando il sistema StepOne . 

La guida prevede che l'utente: 

• Abbia conoscenze sull'utilizzo del sistema operativo Microsoft Windows ® XP. 

• Abbia conoscenze sull'utilizzo di Internet e sui browser di navigazione in Internet. 

• Conosca le modalità di manipolazione dei campioni DNA e della loro preparazione per 

la PCR. 

• Abbia dimestichezza con la memorizzazione dei dati, il trasferimento di file e le 

funzioni di copia e incolla. 

• Abbia esperienza di collegamenti in rete, nel caso sia prevista l'integrazione del sistema 

StepOne nel flusso di dati preesistente del proprio laboratorio. 

La guida utilizza le seguenti convenzioni: 

• Il testo in Grassetto indica un azione dell'utente. Ad esempio: 

Digitare 0, quindi premere Enter (Invio) per ognuno dei campi rimanenti. 

• Il testo in Corsivo indica parole nuove o importanti e viene utilizzato anche per 

enfatizzare. Ad esempio: 

Prima di un'analisi, preparare sempre matrice fresca. 

• Un simbolo di freccia a destra () separa i comandi successivi selezionati da un menu a 

discesa o da un menu a scelta rapida. Ad esempio: 

Selezionare FileOpen (Apri). 



RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire. 

v

Premessa 


Messaggi di 

attenzione per 

l'utente 

Nella documentazione per l'utente Applied Biosystems compaiono due tipi di messaggi di 

attenzione. Ciascun messaggio presuppone un particolare livello di osservanza o l'esecuzione 

di una particolare operazione da parte dell'utente, secondo quanto descritto qui di seguito: 

Nota: – Fornisce informazioni che potrebbero essere di interesse o di aiuto ma non di 

importanza critica per l'uso del prodotto. 

IMPORTANTE! – Fornisce informazioni necessarie per il corretto funzionamento dello 

strumento, per l'uso accurato del kit di chimica o per l'uso sicuro di una prodotto chimico. 

Alcuni esempi dei messaggi di attenzione sono indicati qui di seguito: 

Nota: La funzione Calibrate (Calibra) è anche disponibile nella Control Console (Console di 

comando). 

IMPORTANTE! Per verificare la propria connessione client, è necessario un ID utente 

valido. 

Messaggi di 

sicurezza 

Nella documentazione per l'utente appaiono anche Messaggi di sicurezza. Per ulteriori 

informazioni, consultare “Messaggi di sicurezza” a pagina ix. 

vi 




Premessa 

Come ottenere ulteriori informazioni 

Come ottenere ulteriori informazioni 

Documentazione 

correlata 

La documentazione seguente è allegata al sistema StepOne : 

Documento 

n. di cat. 

inglese 

n. di cat. 

italiano 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting 

Started Guide for Genotyping Experiments 

4376786 4377729 


Started Guide for Presence/Absence Experiments 


Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative C T 

Experiments 

4376787 

4376785 

— 

4377742 


Started Guide for Standard Curve Experiments 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation, 

Maintenance, and Networking Guide 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation 

Quick Reference Card 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Site 

Preparation Guide 

4376784 4377736 

4376782 4377798 

4376783 4377792 

4376768 4378359 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System software Help — — 

La documentazione seguente è disponibile per l'acquisto da Applied Biosystems: 

Documento 

n. di cat. 

Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol 4375575 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation Performance 

Verification Protocol 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation Qualification- 

Operation Qualification Protocol 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Planned Maintenance 

Protocol 

4376791 

4376790 

4376788 

Custom TaqMan ® SNP Genotyping Assays Protocol 4334431 

Custom TaqMan ® Genomic Assays Protocol 4367671 

TaqMan ® SNP Genotyping Assays Protocol 4332856 

TaqMan ® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol 4362038 

Ordering TaqMan ® SNP Genotyping Assays Quick Reference Card 4374204 

Performing a Custom TaqMan ® SNP Genotyping Assay for 96-Well Plates Quick 

Reference Card 

Performing a TaqMan ® Drug Metabolism Genotyping Assay for 96-Well Plates 

Quick Reference Card 

4371394 

4367636 

Pre-Developed TaqMan ® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol 4312214 




vii

Premessa 

Come ottenere assistenza 

Documento 

Allelic Discrimination Pre-Developed TaqMan ® Assay Reagents Quick Reference 

Card 

n. di cat. 

4312212 

Nota: Per ulteriori documentazioni, consultare “Come ottenere assistenza” a pagina viii. 

Informazioni dalla 

Guida software 

(Help) 

La voce Help (Guida) del software StepOne descrive le modalità di utilizzo di ogni 

funzione dell'interfaccia utente. Accedere alla voce Help (Guida) dal software StepOne in 

uno dei modi seguenti: 

• Premere F1. 

• Fare clic su nella barra degli strumenti. 

• Selezionare Help (Guida)StepOne Help (Guida StepOne). 

Per trovare argomenti di interesse nella voce Help (Guida): 

• Esaminare l'indice. 

• Cercare un argomento specifico. 

• Cercare un indice alfabetico. 

Invio di commenti 

Applied Biosystems è lieta di ricevere i commenti e i suggerimenti dei clienti allo scopo di 

migliorare la propria documentazione per l'utente. È possibile inviare commenti tramite e- 

mail a: 

techpubs@appliedbiosystems.com 

IMPORTANTE! Utilizzare l'indirizzo e-mail sopra indicato esclusivamente per inoltrare 

commenti e suggerimenti relativi alla documentazione. Per ordinare documenti, scaricare file 

PDF o per aiuto su questioni tecniche, visitare il sito web all'indirizzo 

http://www.appliedbiosystems.com, quindi fare clic sul link per il Support (assistenza). 

(Vedere “Come ottenere assistenza” qui di seguito). 

Come ottenere assistenza 

Per le informazioni relative a servizi e assistenza tecnica più recenti per tutte le sedi, visitare 

il sito web all'indirizzo http://www.appliedbiosystems.com, quindi fare clic sul link 

Support (Assistenza). 

Nella pagina dell'assistenza clienti, è possibile: 

• Ricercare argomenti attraverso le domande frequenti (FAQ) 

• Inviare una domanda direttamente al servizio di assistenza tecnica 

• Ordinare documenti per l'utente Applied Biosystems, MSDS, certificati di analisi e altri 

documenti correlati 

• Scaricare documenti in PDF 

• Ottenere informazioni sull'addestramento del cliente 

• Scaricare aggiornamenti e patch del software 

viii 




Premessa 

Convenzioni sulla sicurezza utilizzate in questo documento 

Inoltre, la pagina dell'assistenza clienti fornisce l'accesso ai numeri di telefono e di fax in 

tutto il mondo per contattare l'assistenza tecnica e i punti vendita Applied Biosystems. 

IMPORTANTE! Contattare il Servizio clienti Applied Biosystems (Customer Care 

Center) quando suggerito da questa guida o in caso di necessità per programmare le 

operazioni di manutenzione (quali, manutenzione pianifcata annuale o 

verifica/calibrazione della temperatura) per il proprio strumento StepOne Strumento 

StepOne . Per ottenere un numero di telefono o un indirizzo e-mail del servizio clienti, 

andare su http://www.appliedbiosystems.com/support/contact. 


Messaggi di 

sicurezza 

Nella documentazione per l'utente di Applied Biosystems appaiono quattro diversi messaggi 

di attenzione in punti del documento dove risulta necessario essere ben consapevoli della 

possibilità di pericoli rilevanti. Ciascun messaggio—IMPORTANTE, ATTENZIONE, 

AVVERTENZA, PERICOLO—presuppone un particolare livello di osservanza o 

l'esecuzione di una particolare operazione da parte dell'utente, secondo quanto descritto qui di 

seguito. 

Definizioni 

IMPORTANTE! – Indica informazioni necessarie per il corretto funzionamento dello 

strumento, per l'uso accurato del kit di chimica o per l'uso sicuro di una prodotto chimico. 

– Indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non evitata, 

potrebbe causare lesioni di minore o moderata entità. Può inoltre essere utilizzata per mettere 

in guardia l'utente nei confronti di pratiche non sicure. 

– Indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non evitata, 

potrebbe causare lesioni gravi o morte. 

– Indica una situazione di pericolo incombente che, se non evitata, 

causerà morte o lesioni gravi. Questo messaggio viene utilizzato esclusivamente nelle 

situazioni di estremo pericolo. 

Ad eccezione di IMPORTANTE, ogni messaggio di sicurezza in un documento 

Applied Biosystems appare accanto a un figura di triangolo aperto contenente un simbolo di 

pericolo. Questi simboli di pericolo sono identici a quelli posizionati sugli strumenti 

Applied Biosystems (vedere “Simboli di sicurezza” a pagina xi). 




ix

Premessa 


Esempi 

IMPORTANTE! Creare un foglio elettronico separato per ogni piastra a 96-pozzetti. 

PERICOLO CHIMICO. TaqMan ® Universal PCR Master Mix può 

provocare irritazione degli occhi e della pelle. L'esposizione può provocare problemi in caso 

di ingestione o inalazione. Leggere la scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) e attenersi 

rigorosamente alle istruzioni relative alla manipolazione di questa sostanza. Indossare 

un'adeguata protezione oculare, indumenti e guanti di protezione. 

PERICOLO DI INFORTUNIO. Durante il funzionamento dello 

strumento, il pannello di copertura riscaldato e il blocco campione possono raggiungere 

temperature che superano anche i 100 °C. 

PERICOLO ELETTRICO. La continuità del circuito di messa a terra è 

vitale per il funzionamento in sicurezza. Non mettere mai in funzione il sistema con il 

conduttore di messa a terra scollegato. 

x 




Premessa 

Simboli sugli strumenti 

Simboli sugli strumenti 

Simboli elettrici 

sugli strumenti 

Sugli strumenti Applied Biosystems potrebbero essere visualizzati i seguenti simboli elettrici. 

Simbolo Descrizione Simbolo Descrizione 

Indica che l'interruttore di 

alimentazione dell'apparecchiatura 

è in posizione On (Acceso). 

Indica che l'interruttore di 

alimentazione dell'apparecchiatura 

è in posizione Off (Spento). 

Indica un interruttore di standby 

mediante il quale lo strumento 

viene commutato in una 

condizione di Standby. Se questo 

interruttore si trova in standby, 

potrebbe svilupparsi una tensione 

pericolosa. 

Indica le posizioni On/Off 

(Acceso/Spento) dell'interruttore di 

alimentazione a pulsante 

dell'apparecchiatura. 

Indica che un terminale può essere 

collegato alla messa a terra di un 

altro strumento. Non si tratta di un 

terminale di terra protetto. 

Indica un terminale di terra 

protetto che va collegato a terra 

prima di eseguire qualsiasi altro 

collegamento elettrico 

all'apparecchiatura. 

Indica un terminale che può 

ricevere o erogare corrente o 

tensione alternata. 

Indica un terminale che può 

ricevere o erogare corrente o 

tensione continua. 

Simboli di 

sicurezza 

Sugli strumenti Applied Biosystems potrebbero essere visualizzati i seguenti simboli elettrici. 

Ogni simbolo potrebbe apparire da solo o con un testo che spieghi il pericolo rilevante 

(vedere “Etichette di sicurezza sugli strumenti” a pagina xii). Questi simboli di sicurezza 

potrebbero inoltre apparire vicino alle indicazioni di PERICOLO, AVVERTENZA e 

ATTENZIONE riscontrabili in questo e in altri documenti. 

Simbolo Descrizione Simbolo Descrizione 

Rimanda alla consultazione del 

manuale per ottenere ulteriori 

informazioni e chiede all'utente 

di procedere con la giusta 

cautela. 

Indica la presenza pericolosa di 

superfici calde o di altre 

condizioni di alta-temperatura e 

chiede all'utente di procedere 

con la giusta cautela. 

Indica la presenza di parti in 

movimento e chiede all'utente di 

procedere con la giusta cautela. 

Indica la presenza di pericolo di 

folgorazione e chiede all'utente di 

procedere con la giusta cautela. 

Indica la presenza di un laser 

all'interno dello strumento e 

chiede all'utente di procedere 

con la giusta cautela. 




xi

Premessa 

Etichette di sicurezza sugli strumenti 

Simboli ambientali 

sugli strumenti 

I seguenti simboli sono applicabili a tutti i prodotti elettrici ed elettronici Applied Biosystems 

presenti sul mercato europeo dopo il 13 agosto 2005. 

Simbolo 

Descrizione 

Non eseguire lo smaltimento di questo prodotto come rifiuto urbano 

indifferenziato. 

Seguire le ordinanze locali per i rifiuti urbani per uno smaltimento corretto, allo 

scopo di ridurre l'impatto ambientale delle apparecchiature elettriche ed 

elettroniche fuori uso (WEEE). 

Clienti dell'Unione europea: 

Contattare l'ufficio di Assistenza Clienti Applied Biosystems locale per la raccolta 

e il riciclo dell'apparecchiatura. Consultare il sito web 

www.appliedbiosystems.com per un elenco degli uffici di Assistenza Clienti 

presenti nell'Unione europea. 

Etichette di sicurezza sugli strumenti 

Le seguenti dichiarazioni di ATTENZIONE, AVVERTENZA e PERICOLO potrebbero 

essere visualizzabili sugli strumenti Applied Biosystems in combinazione con i simboli di 

sicurezza descritti nella sessione precedente. 

Inglese 

CAUTION Hazardous chemicals. Read the 

Material Safety Data Sheets (MSDSs) before 

handling. 

CAUTION Hazardous waste. Refer to 

MSDS(s) and local regulations for handling 

and disposal. 

CAUTION Hot surface. 

DANGER High voltage. 

WARNING To reduce the chance of electrical 

shock, do not remove covers that require tool 

access. No user-serviceable parts are inside. 

Refer servicing to Applied Biosystems 

qualified service personnel. 

CAUTION Moving parts. 

DANGER Class 3B (III) visible and/or invisible 

LED radiation present when open and 

interlocks defeated. Avoid exposure to beam. 

Francese 

ATTENTION Produits chimiques dangeureux. 

Lire les fiches techniques de sûreté de 

matériels avant la manipulation des produits. 

ATTENTION Déchets dangereux. Lire les 

fiches techniques de sûreté de matériels et la 

régulation locale associées à la manipulation 

et l'élimination des déchets. 

ATTENTION Surface brûlante. 

DANGER Haute tension. 

AVERTISSEMENT Pour éviter les risques 

d'électrocution, ne pas retirer les capots dont 

l'ouverture nécessite l'utilisation d'outils. 

L’instrument ne contient aucune pièce 

réparable par l’utilisateur. Toute intervention 

doit être effectuée par le personnel de service 

qualifié de Applied Biosystems. 

ATTENTION Parties mobiles. 

DANGER Rayonnement visible ou invisible 

d’un faisceau LED de Classe 3B, (III) en cas 

d’ouverture et de neutralisation des 

dispositifs de sécurité. Evitez toute 

exposition au faisceau. 

Posizione delle 

avvertenze 

Il sistema StepOne presenta un'avvertenza nella posizione indicata qui di seguito: 

xii 




Premessa 

Sicurezza generale dello strumento 

Sicurezza generale dello strumento 

PERICOLO DI INFORTUNIO. Utilizzando lo strumento in un modo 

non specificato da Applied Biosystems potrebbero verificarsi lesioni personali o danni allo 

strumento. 

Spostamento e 

sollevamento dello 

strumento 

PERICOLO DI INFORTUNIO. Lo strumento deve essere spostato e 

posizionato esclusivamente dal personale o del venditore specificato nella guida applicabile 

di preparazione della sede. In caso di sollevamento o di spostamento dello strumento dopo lo 

sua avvenuta installazione, non tentare di sollevare o di spostare lo strumento senza 

l'assistenza di terzi, l'uso di una idonea apparecchiatura per lo spostamento e tecniche corrette 

di sollevamento. Il sollevamento senza le opportune precauzioni può provocare traumi dorsali 

dolorosi e permanenti. A seconda del peso, lo spostamento o il sollevamento di uno 

strumento può richiedere la presenza di due o più persone. 

Spostamento e 

sollevamento del 

Computer e del 

Monitor 

Non tentare di sollevare o di spostare il computer o il monitor senza 

l'assistenza di terzi. A seconda del peso del computer e/o del monitor, il loro spostamento può 

richiedere la presenza di due o più persone. 

Considerazioni prima del sollevamento del computer e/o del monitor: 

• Accertarsi di avere una presa comoda e sicura sul computer o sul monitor durante il 

sollevamento. 

• Accertarsi che il percorso di spostamento dal punto di partenza al punto di arrivo sia 

libero da eventuali ostacoli. 

• Non sollevare un oggetto e contemporaneamente ruotare il busto. 

• Mantenere la colonna vertebrale in una corretta posizione neutra mentre si esegue il 

sollevamento con le gambe. 




xiii

Premessa 

Sicurezza dalle sostanze chimiche 

• I partecipanti devono coordinare le proprie azioni di sollevamento e spostamento prima 

di cominciare il trasporto. 

• Invece di sollevare l'oggetto dalla confezione, ribaltare con attenzione la scatola su un 

lato e reggerla mentre qualcun altro fa scivolare il contenuto al di fuori di essa. 

Messa in funzione 

dello strumento 

Pulizia o 

decontaminazione 

dello strumento 

Accertarsi che chiunque utilizzi lo strumento abbia: 

• Ricevuto tutte le istruzioni sulle pratiche di sicurezza generali per i laboratori e su quelle 

specifiche per lo strumento. 

• Letto con attenzione tutte le informazioni contenute in tutte le MSDS pertinenti. Vedere 

“Schede di sicurezza dei materiali” a pagina xv. 

Prima di utilizzare un metodo di pulizia o di decontaminazione diverso 

da quelli raccomandati dalla ditta produttrice, verificare con la ditta stessa che il metodo 

proposto non danneggerà l'apparecchiatura. 


Avvertenze relative 

alle sostanze 

chimiche 

pericolose 

PERICOLO CHIMICO. Prima di manipolare eventuali sostanze 

chimiche, fare riferimento alle MSDS fornite dalla ditta produttrice e osservare tutte le 

relative precauzioni. 

PERICOLO STOCCAGGIO CHIMICO. Non raccogliere o riporre 

mai i rifiuti chimici in contenitori di vetro, che potrebbero incrinarsi o frantumarsi. I flaconi 

dei reagenti e delle sostanze chimiche di rifiuto possono essere soggetti a incrinature e a 

perdite. Tutti i flaconi contenenti sostanze di rifiuto vanno posti in contenitori di sicurezza in 

polietilene a bassa densità, con il coperchio ben chiuso e le maniglie bloccate in posizione 

verticale. Durante la manipolazione dei flaconi dei reagenti e delle sostanze chimiche di 

rifiuto, indossare occhiali di protezione, guanti e indumenti protettivi. 

Linee guida di 

sicurezza chimica 

Per ridurre al minimo i pericoli relativi alle sostanze chimiche: 

• Leggere con attenzione le informazioni contenute nelle MSDS fornite dalla ditta 

produttrice delle sostanze chimiche o dei materiali pericolosi, prima di riporli in 

magazzino, manipolarli o utilizzarli. (Vedere la sezione “Schede di sicurezza dei 

materiali” a pagina xv). 

• Ridurre al minimo il contatto con le sostanze chimiche. Durante la manipolazione dei 

rifiuti chimici, indossare gli opportuni corredi di protezione personale (ad esempio 

occhiali di protezione, guanti o indumenti protettivi). Per ulteriori linee guida relative 

alla sicurezza, consultare le MSDS. 

• Ridurre al minimo l'inalazione delle sostanze chimiche. Non lasciare aperti i contenitori 

delle sostanze chimiche e utilizzare tali sostanze solo in ambienti adeguatamente 

ventilati (ad esempio, cappa di aspirazione). Per ulteriori linee guida relative alla 

sicurezza, consultare le MSDS. 

xiv 




Premessa 


• Verificare regolarmente l'eventuale presenza di perdite o versamenti. In caso di perdite o 

versamenti, attenersi alle procedure per la pulizia delineate dalla ditta produttrice della 

sostanza chimica in questione nella MSDS ad essa corrispondente. 

• Rispettare tutte le leggi e le norme locali, regionali/provinciali e statali relative alla 

conservazione, alla manipolazione e allo smaltimento delle sostanze chimiche. 

Schede di 

sicurezza dei 

materiali 

Le ditte produttrici di sostanze chimiche forniscono le schede MSDS nelle spedizioni di 

sostanze chimiche pericolose ai nuovi clienti. Forniscono inoltre le MSDS al cliente alla 

prima spedizione di una sostanza chimica pericolosa di cui è stato sviluppato un 

aggiornamento delle MSDS. Le MSDS forniscono all'utente le informazioni di sicurezza 

necessarie per la conservazione, la manipolazione, il trasporto e lo smaltimento sicuri delle 

sostanze chimiche. 

Qualora, alla consegna di un lotto di sostanze chimiche pericolose si riceva una scheda 

MSDS aggiornata, accertarsi di sostituirla a quella in archivio. 

Come ottenere 

le schede MSDS 

Le MSDS per ogni sostanza chimica fornita da Applied Biosystems sono disponibili 

gratuitamente 24 ore al giorno. Per ottenere le MSDS: 

1. Visitare il sito web https://docs.appliedbiosystems.com/msdssearch.html 

2. Nel campo Search (Ricerca) della pagina MSDS Search (Ricerca MSDS): 

a. Digitare il nome, il numero di catalogo o altre informazioni relativi alla sostanza 

chimica che si pensa sia presente nel MSDS di interesse. 

b. Selezionare la lingua desiderata. 

c. Fare clic su Search (Ricerca). 

3. Per visualizzare, scaricare o stampare il documento di interesse: 

a. Fare clic con il pulsante destro sul titolo del documento. 

b. Selezionare: 

• Open (Apri) – Per visualizzare il documento 

• Save Target As (Salva oggetto con nome) – Per scaricare una versione PDF 

del documento in una destinazione da scegliere 

• Print Target (Stampa destinazione) – Per stampare il documento 

4. Per ottenere la copia di un MSDS inviata via fax o via e-mail, nella pagina Search 

Results (Risultati ricerca): 

a. Selezionare Fax o E-mail sotto al titolo del documento. 

b. Fare clic su RETRIEVE DOCUMENTS (RECUPERA DOCUMENTI) al 

termine dell'elenco dei documenti. 

c. Immettere le informazioni richieste. 




xv

Premessa 

Sicurezza dei rifiuti chimici 

d. Fare clic su View/Deliver Selected Documents Now (Visualizza/Consegna i 

documenti selezionati adesso). 

Nota: Per la MSDS di una sostanza chimica non distribuita da Applied Biosystems, 

contattare la ditte produttrice della sostanza. 

Sicurezza dei rifiuti chimici 

Pericolo rifiuti 

chimici 

RIFIUTI PERICOLOSI. Fare riferimento alle MSDS e ai regolamenti 

locali per la manipolazione e lo smaltimento. 

PERICOLO RIFIUTI CHIMICI. I rifiuti generati dagli strumenti 

Applied Biosystems sono potenzialmente pericolosi e possono provocare lesioni, malattie o 

morte. 

PERICOLO STOCCAGGIO CHIMICO. Non raccogliere o riporre 

mai i rifiuti chimici in contenitori di vetro, che potrebbero incrinarsi o frantumarsi. I flaconi 

dei reagenti e delle sostanze chimiche di rifiuto possono essere soggetti a incrinature e a 

perdite. Tutti i flaconi contenenti sostanze di rifiuto vanno posti in contenitori di sicurezza in 

polietilene a bassa densità, con il coperchio ben chiuso e le maniglie bloccate in posizione 

verticale. Durante la manipolazione dei flaconi dei reagenti e delle sostanze chimiche di 

rifiuto, indossare occhiali di protezione, guanti e indumenti protettivi. 

Linee guida di 

sicurezza per i 

rifiuti chimici 

Per ridurre al minimo i pericoli relativi ai rifiuti chimici: 

• Prima di riporre in magazzino, manipolare o smaltire rifiuti chimici, leggere con 

attenzione le informazioni contenute nelle MSDS fornite dalle ditte produttrici delle 

sostanze chimiche presenti nel contenitore dei rifiuti. 

• Procurare contenitori per rifiuti primari e secondari. (Un contenitore per rifiuti primario 

trattiene i rifiuti nell'immediato. Un contenitore secondario trattiene le eventuali perdite 

o versamenti provenienti dal contenitore primario. Ambedue i contenitori devono essere 

compatibili con i materiali di rifiuto e rispondere ai requisiti federali, regionali e locali 

per la conservazione in contenitori). 

• Ridurre al minimo il contatto con le sostanze chimiche. Durante la manipolazione dei 

rifiuti chimici, indossare gli opportuni corredi di protezione personale (ad esempio 

occhiali di protezione, guanti o indumenti protettivi). Per ulteriori linee guida relative 

alla sicurezza, consultare le MSDS. 

• Ridurre al minimo l'inalazione delle sostanze chimiche. Non lasciare aperti i contenitori 

delle sostanze chimiche e utilizzare tali sostanze solo in ambienti adeguatamente 

ventilati (ad esempio, cappa di aspirazione). Per ulteriori linee guida relative alla 

sicurezza, consultare le MSDS. 

• Manipolare i rifiuti chimici all'interno di una cappa di aspirazione. 

• Dopo avere svuotato un contenitore dei rifiuti, chiuderlo ermeticamente con il tappo in 

dotazione. 

xvi 




Premessa 

Sicurezza elettrica 

• Smaltire il contenuto della vaschetta e del flacone dei rifiuti in osservanza delle prassi di 

sicurezza di laboratorio e delle norme locali, regionali/provinciali e statali relative alla 

tutela dell'ambiente e della salute. 

Smaltimento dei 

rifiuti 

Nel caso durante il funzionamento dello strumento si sviluppino rifiuti potenzialmente 

pericolosi, è necessario: 

• Caratterizzare (se necessario, anche tramite analisi) i rifiuti generati dalle applicazioni, 

dai reagenti e dai substrati utilizzati nel laboratorio. 

• Tutelare la salute e la sicurezza di tutto il personale di laboratorio. 

• Verificare che i rifiuti generati dallo strumento vengano conservati, trasferiti, trasportati 

e smaltiti in conformità a tutte le norme locali, regionali/provinciali e/o statali vigenti. 

IMPORTANTE! I materiali radioattivi o a rischio biologico possono richiedere speciali 

tecniche di manipolazione ed essere soggetti a limitazioni relative allo smaltimento. 

Sicurezza elettrica 

PERICOLO DI FOLGORAZIONE. Sono possibili gravi folgorazioni 

qualora si utilizzi il sistema StepOne senza i propri pannelli di copertura in posizione. Non 

rimuovere i pannelli di copertura dello strumento. Quando i pannelli dello strumento sono 

rimossi, vengono esposti contatti ad alta tensione. 

Fusibili 

PERICOLO DI INCENDIO. L'uso di fusibili non idonei o di 

un'alimentazione ad alta tensione non corretta può danneggiare il sistema di cablaggio dello 

strumento, provocando un incendio. Prima di accendere lo strumento, verificare che i fusibili 

siano installati correttamente e che la tensione dello strumento corrisponda all'alimentazione 

presente in laboratorio. 

PERICOLO DI INCENDIO. Per una protezione continua contro il 

rischio di incendio, sostituire i fusibili esclusivamente con fusibili del tipo e dell'amperaggio 

specifici per lo strumento. 




xvii

Premessa 

Sicurezza LED 

Alimentazione 

PERICOLO ELETTRICO. La continuità del circuito di messa a terra è 

vitale per il funzionamento in sicurezza dell'apparecchiatura. Non mettere mai in funzione 

l'apparecchiatura con il conduttore di messa a terra scollegato. 

PERICOLO ELETTRICO. Utilizzare cavi di alimentazione configurati 

in maniera corretta e approvati per la tensione fornita nella propria struttura. 

PERICOLO ELETTRICO. Collegare il sistema in una presa elettrica 

dotata di messa a terra con capacità di corrente adeguata. 

Classificazione 

sovraccarico di 

tensione 

Il sistema sistema StepOne fa parte della categoria di installazione (sovraccarico di 

tensione) II ed è classificato come apparecchiatura portatile 

Sicurezza LED 

Per garantire un funzionamento sicuro del LED: 

• La manutenzione del sistema deve essere gestita da un Rappresentante tecnico 

Applied Biosystem. 

• Tutti i pannelli di copertura dello strumento devono trovarsi in posizione durante il 

funzionamento. Quando tutti i pannelli sono installati, non sono presenti radiazioni 

rilevabili. In caso di rimozione di un pannello durante il funzionamento del LED 

(durante l'assistenza a interblocchi di sicurezza disabilitati), si potrebbe venire 

esposti ad emissioni LED che superano la Classe 3B. 

• Non rimuovere le etichette di sicurezza né disabilitare gli interblocchi di sicurezza. 

xviii 




Premessa 

Sicurezza rischio biologico 

Sicurezza rischio biologico 

Rischi biologici 

generici 

RISCHIO BIOLOGICO. Campioni biologici quali tessuti, fluidi 

corporei, agenti infettivi e sangue umano e di altri animali rappresentano un veicolo 

potenziale di trasmissione di malattie infettive. Rispettare tutte le norme locali, 

regionali/provinciali e/o statali. Indossare gli opportuni corredi di protezione, tra cui 

protezioni oculari, maschere di protezione, indumenti/camici da laboratorio e guanti. 

Condurre ogni lavoro in strutture ben equipaggiate, utilizzando la corretta apparecchiatura di 

sicurezza (ad esempio, dispositivi di contenimento fisico). Addestrare il personale in base alle 

normative applicabili e ai requisiti dell'azienda/ente prima di lavorare con materiali 

potenzialmente infettivi. Leggere e seguire le linee guida applicabili e/o i requisiti delle 

normative presenti in: 

• Linee guida del U.S. Department of Health and Human Services pubblicate in Biosafety 

in Microbiological and Biomedical Laboratories (N. stock 017-040-00547-4; 

http://bmbl.od.nih.gov) 

• Occupational Safety and Health Standards, Bloodborne Pathogens (29 CFR§1910.1030; 

http://www.access.gpo.gov/ nara/cfr/waisidx_01/ 29cfr1910a_01.html). 

• Protocolli del Programma di biosicurezza della propria azienda/ente per il lavoro a 

contatto con materiali potenzialmente infetti. 

Ulteriori informazioni sulle linee guida per il rischio biologico sono disponibili all'indirizzo: 

http://www.cdc.gov 

Sicurezza della stazione di lavoro 

Una configurazione ergonomicamente corretta della propria stazione di lavoro può ridurre o 

prevenire effetti quali l'affaticamento, il dolore e la tensione. Ridurre al minimo o eliminare 

tali effetti configurando la stazione di lavoro in maniera tale da favorire posizioni di lavoro 

neutre o rilassate. 

PERICOLO MUSCOLOSCHELETRICO E DA MOVIMENTI 

RIPETITIVI. Questi pericoli sono causati da potenziali fattori di rischio che includono, in 

modo non esclusivo, il movimento ripetitivo, una posizione scorretta, sforzi accentuati, il 

mantenimento di posizioni statiche non salutari, la pressione da contatto e altri fattori 

ambientali correlati alla stazione di lavoro. 

Per ridurre al minimo i rischi muscoloscheletrici e i movimenti ripetitivi: 

• Utilizzare apparecchiature che sopportino in maniera comoda la posizione di lavoro 

neutra dell'utente e consentano un adeguato accesso a tastiera, monitor e mouse. 

• Posizionare tastiera, mouse e monitor in una posizione tale da promuovere posture 

rilassate del busto e della testa. 




xix

Premessa 

Norme di sicurezza e di compatibilità elettromagnetica (EMC) 

Norme di sicurezza e di compatibilità elettromagnetica 

(EMC) 

Norme di sicurezza 

per U.S.A. e 

Canada 

Norme EMC per il 

Canada 

Norme di Safety e 

di EMC 

per l'Europa 

Il sistema StepOne è stato testato ed è conforme a: 

UL 61010A-1/CAN/CSA C22.2 No. 1010.1-92, “Safety Requirements for Electrical 

Equipment for Measurement, Control, and Laboratory Use, Part 1: General 

Requirements.” 

UL 61010A-2-010/CAN/CSA 1010.2.010, “Particular Requirements for Laboratory 

Equipment for the Heating of Materials.” 

FDA “Radiation Control for Health and Safety Act of 1968 Performance Standard 21 

CFR 1040.10 and 1040.11,” se applicabile. 

Lo strumento è stato testato ed è conforme alla norma ICES-001, Comma 3: “Industrial, 

Scientific, and Medical Radio Frequency Generators.: 

Sicurezza 

Questo strumento soddisfa i requisiti europei per la sicurezza (Direttiva sulla bassa tensione 

73/23/CEE). Questo strumento è stato testato ed è conforme alla norma EN 61010-1:2001, 

“Safety Requirements for Electrical Equipment for Measurement, Control, and Laboratory 

Use, Part 1: General Requirements.” 

EN 61010-2-010, “Particular Requirements for Laboratory Equipment for the Heating of 

Materials.” 

EN 61010-2-081, “Particular Requirements for Automatic and Semi-Automatic Laboratory 

Equipment for Analysis and Other Purposes.” 

EMC 

Questo strumento soddisfa i requisiti europei per le emissioni e le immunità (Direttiva EMC 

89/336/CEE). Questo strumento è stato testato ed è conforme alla norma EN 61326 (Gruppo 

1, Classe B), “Electrical Equipment for Measurement, Control and Laboratory Use – EMC 

Requirements.” 

Norme EMC per 

l'Australia 

Questo strumento è stato testato ed è conforme alla norma AS/NZS 2064, “Limits and 

Methods Measurement of Electromagnetic Disturbance Characteristics of Industrial, 

Scientific, and Medical (ISM) Radio-frequency Equipment.” 

xx 




Capitolo 1 

Introduzione 

Questo capitolo comprende i paragrafi: 

■ Informazioni sul sistema StepOne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 

■ Informazioni sugli esperimenti di genotipizzazione. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 

■ Come utilizzare questa guida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 

■ Informazioni sull'esperimento di esempio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 

■ Flusso di lavoro dell'esperimento di esempio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 

Nota: Per ulteriori informazioni sugli argomenti trattati in questa guida, accedere alla 

voce Help (Guida) del software del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time 

PCR System premendo F1 oppure facendo clic su nella barra degli strumenti oppure 

selezionando Help (Guida)StepOne Help (Guida StepOne). 




1

Capitolo 1 Introduzione 

Informazioni sul sistema StepOne 

Informazioni sul sistema StepOne 

Informazioni sul 

sistema 

Informazioni 

sull'acquisizione 

dei dati 

Il sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System (sistema StepOne ) 

utilizza chimiche PCR fluorescenti PCR per fornire: 

• Rilevamento quantitativo delle sequenze target dell'acido nucleico utilizzando 

l'analisi PCR in tempo reale. 

• Rilevamento qualitativo delle sequenze target dell'acido nucleico utilizzando analisi 

end-point e con curva di melting. 

Il sistema StepOne acquisisce dati di fluorescenza non elaborati in punti diversi durante 

una PCR, in dipendenza del tipo di esecuzione: 

Tipo di esecuzione 

Punto di acquisizione dati 

Sessioni di 

analisi in 

tempo 

reale 

Sessioni di 

analisi 

end-point 

Curva standard 

Curva standard relativa 

C T comparativo (∆∆C T ) 

Genotipizzazione 

Presenza/assenza 

Lo strumento acquisisce dati dopo ogni fase di 

estensione della PCR. 

Lo strumento acquisisce dati prima e dopo la PCR. 

Per gli esperimenti di genotipizzazione, il software 

StepOne è abilitato anche ad acquisire dati durante 

la sessione di analisi (in tempo reale), come aiuto nella 

risoluzione di eventuali problemi. 

Lo strumento acquisisce dati prima e dopo la PCR. 

Indipendentemente dal tipo di esecuzione, un punto di acquisizione dati o di lettura 

consiste in tre fasi: 

1. Eccitazione – Lo Strumento StepOne illumina tutti i pozzetti della piastra di 

reazione all'interno dello strumento, eccitando i fluorofori in ogni reazione. 

2. Emissione – L'ottica dello Strumento StepOne focalizza la fluorescenza residua 

emessa dai pozzetti della piastra di reazione. L'immagine risultante acquisita dal 

dispositivo consiste unicamente nella luce che corrisponde al range ridotto delle 

lunghezze d'onda. 

3. Acquisizione – Lo Strumento StepOne assembla una rappresentazione digitale 

della fluorescenza residua acquisita durante un intervallo dalla durata fissa. Il 

software StepOne memorizza l'immagine fluorescente non elaborata per l'analisi. 

Se necessario, il software esegue letture aggiuntive come richiesto dai reagenti 

fluorescenti utilizzati nell'esperimento. 

Dopo una sessione di analisi, il software StepOne utilizza i dati di calibrazione 

(spaziale, del colorante e di background) per determinare la posizione e l'intensità dei 

segnali fluorescenti in ogni lettura, il colorante associato a ogni segnale fluorescente e il 

significato del segnale. 

Note 

2 





Informazioni sul sistema StepOne 3 

Saggi e materiali 

di consumo 

supportati 

Il sistema StepOne supporta gli esperimenti di genotipizzazione utilizando reagenti e 

protocolli standard sia con piatre MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plates, 

MicroAmp Fast 8-Tube Strips, sia con provette MicroAmp ® Fast Reaction Tubes with 

Caps with MicroAmp Fast 48-Well Trays. 

IMPORTANTE! Utilizzare solo materiali di consumo fast (piastre di reazione, strisce con 

provette e provette) con il sistema StepOne , anche quando viene eseguito un 

esperimento con reagenti standard. Sebbene i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan ® 

non utilizzino Master Mix fast o protocolli veloci, è necessario utilizzare materiali di 

consumo fast per eseguire gli esperimenti di genotipizzazione. 

G (o D) 

B 

C 

D 

# Materiale di consumo 

A 

B 

C 

D 

E 

F 

G 

MicroAmp Fast Optical 48-Well 

Reaction Plates 

MicroAmp Fast 48-Well Tray 

MicroAmp 96-well Splash-free Support 

Base 

MicroAmp Optical 8-Cap Strips 

MicroAmp Fast 8-Tube Strips 

MicroAmp ® Fast Reaction Tubes with 

Caps 

MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film 

E 

B 

C 

F 

B 

C 

Note 





Informazioni sugli esperimenti di genotipizzazione 


Esperimenti 

end-point 

Gli esperimenti di genotipizzazione consistono in esperimenti end-point. Negli esperimenti 

end-point: 

• I dati vengono acquisiti al termine del processo PCR. 

• Le reazioni sono caratterizzate dalla quantità del target accumulata al termine della PCR 

(Saiki et al., 1985). 

• Il datapoint rappresenta l'intensità normalizzata del colorante reporter oppure dell'R n . 

È possibile che alcuni esperimenti end-point includano datapoint pre-PCR. In caso 

affermativo, il sistema calcola il valore del delta R n (∆R n ) attraverso la formula seguente: 

R n (post-PCR) – R n (pre-PCR) = ∆R n 

Nota: In questa guida, il termine esperimento si riferisce all'intero sviluppo dell'esperimento, 

dal disegno dell'esperimento all'analisi dei dati. 

Dati PCR in tempo reale per esperimenti end-point 

Il software StepOne fornisce l'opzione dell'acquisizione dei dati in tempo reale sia per gli 

esperimenti di presenza/assenza sia per quelli di genotipizzazione. Nel caso un esperimento 

non riesca, i dati in tempo reale forniscono un aiuto importante nella determinazione delle 

cause. 

Informazioni sui 

saggi di 


SNP TaqMan ® 

Un saggio di genotipizzazione rileva varianti di una sequenza singola di acido nucleico, senza 

quantificazione del target. La presenza di due sonde in ogni reazione consente la 

genotipizzazione delle due possibili varianti all'area del polimorfismo singolo-nucleico (SNP) 

in una sequenza target. 

Ogni saggio di genotipizzazione SNP TaqMan ® consiste in una provetta singola e pronta per 

l'utilizzo contenente: 

• Due primer specifici per la sequenza per l'amplificazione del polimorfismo di interesse 

• Due sonde MGB specifiche per l'allele TaqMan ® per il rilevamento degli alleli per il 

polimorfismo specifico di interesse 

Note 

4 






Informazioni sulle 

sonde MGB 

TaqMan ® 

Ogni sonda MGB specifica per l'allele TaqMan ® presenta: 

• Un colorante reporter alla sua estremità 5´ 

– Il colorante VIC ® è legato alla estremità 5´ della sonda dell'allele 1 

– Il colorante FAM è legato alla estremità 5´ della sonda dell'allele 2 

La sonda etichettata con colorante VIC ® dell'allele 1 corrisponde al primo nucleotide 

interno alle parentesi quadre della sequenza di contesto nel file informazioni saggi 

(AIF) spedito con ogni ordine. La sonda etichettata con colorante FAM dell'allele 2 

corrisponde al secondo nucleotide interno alle parentesi quadre della sequenza di 

contesto nel file informazioni saggi (AIF) spedito con ogni ordine. Per la sequenza di 

contesto ATCGATT[G/T]ATCC, la sonda etichettata con colorante VIC ® si legherà 

all'allele contenente G e la sonda etichettata con colorante FAM si legherà all'allele 

contenente T. 

• Un minor groove binder (MGB), che aumenta la temperatura di melting (T m ) per una 

data lunghezza della sonda, consente il disegno di sonde più corte (Alfonina et al., 1997, 

Kutyavin et al., 1997). L'utilizzo di sonde più corte produce come risultato una maggiore 

differenza nei valori della T m tra le sonde abbinate non abbinate e una genotipizzazione 

più robusta. 

• Un quencher non fluorescente (NFQ) alla sua estremità 3´, consentendo per il 

rilevamento della fluorescenza del colorante reporter una sensibilità maggiore rispetto a 

un quencher fluorescente. 

IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'uso del colorante TAMRA come 

reporter o quencher con il sistema StepOne . 

5′ Saggio 

nucleasico 

La figura qui di seguito rappresenta una descrizione schematica del saggio nucleasico 5´. 

Durante la PCR: 

• Ogni sonda MGB TaqMan ® esegue un annealing specificamente alla sua sequenza 

complementare tra le regioni del forward primer e del reverse primer. 

• Quando la sonda oligonucleotide è intatta, la vicinanza del colorante quencher al 

colorante reporter impedisce l'emissione del segnale del reporter. 

• La polimerasi del DNA AmpliTaq Gold ® estende i primer legati al templato del 

DNA genomico. 

• La polimerasi del DNA AmpliTaq Gold ® ( 5´ nucleasica) separa le sonde che 

vengono ibridate alla sequenza del target. 

• La scissione delle sonde ibridate alla sequenza del target separa il colorante 

quencher dal colorante reporter, con aumento della fluorescenza del reporter. Il 

segnale di fluorescenza generato dall'amplificazione PCR indica quali alleli siano 

presenti nel campione. 

Note 




5



Riduzione al 

minimo della 

fluorescenza non 

specifica 

Lettura e analisi 

delle piastre 

Nei saggi TaqMan ® , la fluorescenza delle sonde legate non specificamente viene ridotta, 

poiché i mancati abbinamenti dei nucleotidi tra una sonda e una sequenza riducono le 

possibilità di scissione della sonda. La lunghezza ridotta della sonda comporta il mancato 

abbinamento di una coppia di basi con un effetto negativo maggiore sul binding. La 

sonda non abbinata non si lega strettamente all'allele, consentendo alla polimerasi del 

DNA AmpliTaq ® Gold di spostare la sonda senza separare il colorante. 

Il software StepOne esegue la genotipizzazione dei campioni di DNA simultaneamente 

dalla piastra di reazione. Primo, il software normalizza la fluorescenza dei coloranti 

reporter alla fluorescenza del colorante di riferimento passivo in ogni pozzetto. Quindi, il 

software visualizza le intensità normalizzate (R n ) dei coloranti reporter in ogni pozzetto 

del campione su un plot di discriminazione allelica, il che contrasta le intensità dei 

coloranti reporter delle sonde specifiche per l'allele. Infine, il software StepOne 

raggruppa in modo algoritmico i dati dei campioni e assegna una richiesta di genotipi ai 

campioni di ogni cluster in base alla loro posizione nel plot. 

Nota: L'algoritmo di clustering software StepOne non richiede genotipi quando in un 

esperimento è presente unicamente un genotipo. 

Note 

6 






Il clustering dei datapoint può variare lungo l'asse orizzontale (allele 1), l'asse verticale 

(allele 2) oppure diagonale (allele 1/allele 2). Questa variazione produce come risultato 

differenze nel grado di intensità fluorescente del colorante reporter dopo l'amplificazione 

PCR. La tabella qui di seguito indica la correlazione tra le sequenze e i segnali di 

fluorescenza in un campione. 

Un aumento sostanziale di… 

Indica… 

Fluorescenza unicamente della sonda etichettata con Omozigosità per l'allele 1 

colorante VIC ® 

Fluorescenza unicamente della sonda etichettata con Omozigosità per l'allele 2 

colorante FAM 

Fluorescenza sia delle sonde etichettate con colorante Eterozigosità dell'allele 1 / allele 1 

VIC ® sia con colorante FAM 

Note 




7




Utilizzo della 

guida come 

tutorial 

Utilizzando i dati dell'esperimento di esempio forniti con il software StepOne , è 

possibile utilizzare questa guida come tutorial per l'esecuzione di un esperimento di 

genotipizzazione sul sistema StepOne Seguire le procedure indicate nei capitoli da 2 a 

5: 

• Capitolo 2 - Disegno dell'esperimento utilizzando il design wizard nel software. 

• Capitolo 3 - Preparazione dell'esperimento, utilizzando i reagenti e i volumi 

calcolati dal design wizard nel Capitolo 2. 

• Capitolo 4 – Esecuzione dell'esperimento su uno Strumento StepOne . 

• Capitolo 5 - Analisi dei risultati. 

Per ulteriori informazioni, vedere “Informazioni sull'esperimento di esempio” a 

pagina 10. 

Utilizzando i dati dell'esperimento di esempio forniti con il software StepOne , è 

possibile utilizzare questa guida come tutorial per l'esecuzione di un esperimento di 

genotipizzazione sul sistema StepOne Seguire le procedure contenute nei capitoli 

appropriati: 

Capitolo 

Procedura 

2 Disegnare l'esperimento utilizzando il Design Wizard nel software StepOne . 

3 Preparare l'esperimento, utilizzando i reagenti e i volumi calcolati dal Design 

Wizard nel Capitolo 2. 

4 Eseguire l'esperimento su uno Strumento StepOne . 

5 Analizzare i risultati. 

Per ulteriori informazioni, vedere “Informazioni sull'esperimento di esempio” a 

pagina 10. 

Note 

8 






Utilizzo della 

guida per i propri 

esperimenti 

Dopo il completamento degli esercizi introduttivi nei capitoli da 2 a 5, è possibile 

utilizzare questo manuale come guida al flusso di lavoro del design wizard per i propri 

esperimenti di genotipizzazione. Ogni procedura nei capitoli da 2 a 5 contiene un set di 

linee guida che fornisce informazioni sulle modalità di esecuzione dell'azione per i propri 

esperimenti. È anche possibile utilizzare uno degli altri flussi di lavoro forniti nel 

software StepOne per l'esecuzione degli esperimenti. La tabella qui di seguito fornisce 

un riepilogo di tutti i flussi di lavoro disponibili nel software StepOne . 

Flusso di 

lavoro 

Design 

Wizard 

Impostazione 

avanzata 

Avvio rapido 

Templato 

Esportazione/ 

Importazione 

Descrizione 

Immette i parametri dell'esperimento secondo le indicazioni del 

wizard. 

Imposta un nuovo esperimento sulla base del disegno del 

proprio esperimento. Consente flessibilità nel disegno per 

utenti esperti. 

Esegue un nuovo esperimento senza informazioni di 

impostazione della piastra. 

Imposta un nuovo esperimento utilizzando le informazioni di 

impostazione provenienti da un templato. 

Importa disegni di esperimento dai file di testo ASCII contenenti 

le informazioni di impostazione dell'esperimento. 

Vedere... 

Capitolo 2 

pagina 98 

pagina 103 

pagina 108 

pagina 109 

Note 




9


Informazioni sull'esperimento di esempio 

Informazioni sull'esperimento di esempio 

Per illustrare come eseguire gli esperimenti di genotipizzazione, questa guida conduce 

l'utente attraverso i processi di disegno e analisi di un esperimento di esempio. 

L'esperimento di esempio rappresenta una tipica impostazione che è possibile utilizzare 

per familiarizzare rapidamente con il sistema StepOne . 

Descrizione 

Layout piastra di 

reazione 

L'obbiettivo dell'esperimento di genotipizzazione di esempio è quello di indagare 

sull'SNP rs8039, dove possibili genotipi sono AA, AC e CC. Nell'esempio, 20 campioni 

non noti di DNA genomico (gDNA) sono stati sottoposti a genotipizzazione utilizzando 

il saggio TaqMan ® Drug Metabolism Genotyping Assay con ID C__11711420_30. Le 

reazioni sono state impostate in modo tale che le sonde e i primer PCR, il target e 

entrambi gli alleli dell'SNP rs8039 siano presenti nello stesso pozzetto. La PCR è stata 

eseguita utilizzando la Master Mix TaqMan ® Universal PCR e secondo il protocollo 

descritto nella scheda di riferimento rapido Performing a TaqMan ® Drug Metabolism 

Genotyping Assay for 96-Well Plates Quick Reference Card (n. di cat. 4367636A). 

Il layout della piastra di reazione per l'esperimento di esempio è indicato qui di seguito. 


dai dell'esempio 

L'esperimento di esempio descritto in questa guida è incluso nel software StepOne . È 

possibile trovare il file per l'esperimento (Genotyping Example.eds) sul proprio 

computer: 

:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments\examples 

dove indica il disco rigido del computer sul quale è stato installato il software 

StepOne . L'unità predefinita di installazione è l'unità C. 

Note 

10 





Flusso di lavoro dell'esperimento di esempio 



flusso di lavoro 


La figura seguente indica il flusso di lavoro dell'esperimento di esempio di 

genotipizzazione. 

 

Avvio dell'esperimento 

Disegno dell'esperimento (Capitolo 2) 

1. Creazione di un nuovo esperimento. 

2. Definizione delle proprietà dell'esperimento. 

3. Definizione dei metodi e dei materiali. 

4. Impostazione dei saggi SNP. 

5. Impostazione dei campioni e dei replicati. 

6. Impostazione del metodo di esecuzione. 

7. Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione. 

8. Ordine dei materiali per l'esperimento. 

9. Fine del flusso di lavoro del Design Wizard. 

 

Preparazione delle reazioni (Capitolo 3) 

1. Preparazione delle diluizioni del campione. 

2. Preparazione della miscela di reazione. 

3. Preparazione della piastra di reazione. 

 

Esecuzione dell'esperimento (Capitolo 4) 

1. Preparazione per l'esecuzione. 

2. (Opzionale) Abilitazione delle notifiche. 

3. Avvio dell'esecuzione. 

4. Monitoraggio dell'esecuzione. 

5. Scaricamento della piastra di reazione e trasferimento dei dati. 

 

Analisi dell'esperimento (Capitolo 5) 

1. Visualizzazione del plot di discriminazione allelica. 

2. Visualizzazione del layout di piastra. 

3. Visualizzazione della tabella well (pozzetto). 

4. Visualizzazione del riepilogo CQ. 

5. Visualizzazione del plot dei dati non elaborati. 

6. Visualizzazione del plot multicomponente. 

7. Visualizzazione del plot di amplificazione. 

8. Visualizzazione delle impostazioni di analisi. 

9. Pubblicazione dei dati. 

 

Fine dell'esperimento 

Note 




11



Note 

12 




Capitolo 2 

Disegno dell'esperimento 


■ Descrizione generale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 

■ Creazione di un nuovo esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 

■ Definizione delle proprietà dell'esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 

■ Definizione dei metodi e dei materiali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 

■ Impostazione dei Saggi SNP. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 

■ Impostazione dei campioni e dei replicati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 

■ Impostazione del metodo di esecuzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 

■ Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 

■ Ordine dei materiali per l'esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 

■ Termine del flusso di lavoro del Design Wizard. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 


voce Help (Guida) nel software del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time 

PCR System premendo F1, facendo clic su nella barra degli strumenti oppure 


Note 




13

Capitolo 2 Disegno dell'esperimento 

Descrizione generale 


Questo capitolo spiega come utilizzare il Design Wizard per l'impostazione 

dell'esperimento di esempio di genotipizzazione. Il design wizard conduce l'utente 

attraverso le migliori scelte relativamente al disegno dell'esperimento. 

Flusso di lavoro 

Disegnare l'esperimento utilizzando il flusso di lavoro seguente: 

 



1. Creazione di un nuovo esperimento. 

2. Definizione delle proprietà dell'esperimento. 

3. Definizione dei metodi e dei materiali. 

4. Impostazione dei saggi SNP. 

5. Impostazione dei campioni e dei replicati. 

6. Impostazione del metodo di esecuzione. 

7. Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione. 

8. Ordine dei materiali per l'esperimento. 

9. Fine del flusso di lavoro del Design Wizard. 

 

 

 

 





Nota: Il flusso di lavoro di cui sopra rappresenta solo uno dei molteplici flussi di lavoro 

supportati dal software StepOne per l'impostazione degli esperimenti di 

genotipizzazione. Vedere “Utilizzo della guida per i propri esperimenti” a pagina 9 per 

ulteriori informazioni. 

Note 

14 





Creazione di un nuovo esperimento 

Creazione di un nuovo esperimento 

Avviare il software StepOne , quindi aprire il Design Wizard per creare un nuovo 

esperimento di genotipizzazione. 

Creazione di un 

esperimento 

1. Fare doppio clic su , oppure selezionare Start (Avvio)All Programs (Tutti i 

programmi)Applied Biosystems StepOneStepOne v1.0 per avviare il 

software StepOne . 

2. Fare clic su Design Wizard nella schermata Home per aprire il Design 

Wizard. 

Nota: Per creare un nuovo esperimento utilizzando l'impostazione avanzata, un 

templato dell'esperimento oppure l'avvio rapido, vedere Appendice A, “Flussi di 

lavoro degli esperimenti alternativi,” a pagina 97. 

2 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni, accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne 

facendo clic su oppure selezionando Help (Guida)StepOne Help (Guida 

StepOne). 

Note 




15


Definizione delle proprietà dell'esperimento 

Definizione delle proprietà dell'esperimento 

Nella schermata Experiment Properties (Proprietà dell'esperimento), immettere le 

informazioni di identificazione dell'esperimento, quindi selezionare il tipo di 

esperimento da disegnare. 

Completamento 

della schermata 

1. Fare clic sul campo Experiment Name (Nome esperimento), quindi immettere 

Genotyping Example (Esempio genotipizzazione). 

2. Fare clic sul campo Barcode (Codice a barre), quindi immettere Example 

(Esempio). 

3. Fare clic sul campo User Name (Nome utente) , quindi immettere Example User 

(Utente esempio). 

4. Fare clic sul campo Comments (Commenti), quindi immettere Genotyping 

Getting Started Guide (Guida introduttiva genotipizzazione). 

5. Selezionare Genotyping (Genotipizzazione) per il tipo di esperimento. 

6. Fare clic su Next > (Avanti). 

1 

2 

3 

4 

5 

Note 

16 





Definizione dei metodi e dei materiali 

Linee guida 

disegno 

Per ulteriori 

informazioni 

Per disegnare il proprio esperimento: 

• Immettere un nome dell'esperimento che sia descrittivo e facile da ricordare. 

• (Opzionale) Immettere un codice a barre fino a 100 caratteri per identificare la 

piastra di reazione utilizzata nell'esperimento. 

• (Opzionale) Immettere un nome utente fino a 100 caratteri per l'identificazione del 

titolare dell'esperimento. 

• Selezionare Genotyping (Genotipizzazione) come tipo di esperimento. 

Per ulteriori informazioni sul completamento della schermata Experiment Properties 

(Proprietà dell'esperimento), accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne 


StepOne). 


Nella schermata Methods and Materials (Metodi e materiali), definire: 

• Reagenti utilizzati per la genotipizzazione dei campioni 

• Stato (umido o secco) del templato del DNA di cui è in atto la genotipizzazione 

• Velocità di rampa più adatta alle reazioni PCR 

• Fasi da includere nel metodo 


disegno di 

esempio 

Completamento 


L'esperimento di esempio utilizza reagenti TaqMan ® e templato di DNA genomico 

(gDNA) nelle reazioni PCR. Poiché le reazioni non contengono reagenti TaqMan ® 

veloci, il Sistema StepOne esegue la sessione utilizzando la velocità di rampa standard. 

Inoltre, poiché il Sistema StepOne esegue il ciclo termico per la PCR, il metodo di 

esecuzione consiste nelle fasi di lettura pre-PCR, amplificazione e lettura post-PCR. 

1. Selezionare TaqMan ® Reagents (Reagenti TaqMan) per i reagenti. 

2. Selezionare Wet DNA (DNA umido) per il tipo di templato. 

3. Selezionare Standard (~2 ore per il completamento di un'esecuzione) per la 

velocità di rampa. 

4. Selezionare Pre-PCR Read and Amplification (Lettura e amplificazione pre- 

PCR) per aggiungere le fasi al metodo di esecuzione. 

Nota: La lettura post-PCR è necessaria. 

5. Selezionare Next > (Avanti). 

Note 




17



1 

2 

3 

4 

Linee guida 

disegno 


• Selezionare Other (Altro) se non è in atto l'utilizzo di reagenti TaqMan ® per 

amplificare e rilevare le sequenze target nell'esperimento. 

Nota: La schermata Reaction Setup (Imposta reazione) non è disponibile se viene 

effettuata la selezione Other (Altro). 

• Nel caso si utilizzi un templato diverso dal DNA genomico (gDNA) o dal cDNA, 

selezionare l'opzione (Wet DNA (DNA umido) o Dry DNA (DNA secco)) che 

descrive lo stato dei campioni. 

• Selezionare la velocità di rampa Standard per l'esecuzione dello strumento. 

IMPORTANTE! I saggi di genotipizzazione SNPTaqMan ® non supportano i 

reagenti fast. Di conseguenza, il Design Wizard non supporta la velocità di rampa 

rapida per gli esperimenti di genotipizzazione. Nel caso si desideri utilizzare 

velocità di rampa rapide, utilizzare il flusso di lavoro impostazione avanzata per 

impostare l'esperimento. 

• Nel caso ci si accinga ad eseguire l'amplificazione PCR su un termociclatore diverso 

dal Sistema StepOne , deselezionare l'opzione Amplification (Amplificazione). 

Nota: La lettura pre-PCR è opzionale, ma raccomandata. Il software StepOne 

utilizza la lettura pre-PCR per normalizzare i dati post-PCR. 

Note 

18 





Impostazione dei Saggi SNP 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sulla schermata Materials & Methods (Materiali e Metodi), 

accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o 



Nella schermata Set Up SNP Assays (Imposta saggi SNP), immettere il numero dei saggi 

SNP nell'esperimento, quindi definire le proprietà per ogni saggio SNP. 


disegno di 

esempio 

Completamento 


SNP Assays 

(Saggi SNP) 

L'esperimento di esempio valuta i campioni per l'rs8039 SNP. Poiché il saggio è un 

saggio di genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan ® (ID 

saggio C__11711420_30), è possibile importare le informazioni del saggio SNP dal file 

informazioni del saggio (AIF) spedito con il saggio oppure scaricato dal sito web 

Applied Biosystems. 

1. Per il numero di saggi SNP oggetto di studio, immettere 1. 

2. Fare clic su Yes (Sì) (Selezionare SNP Assay (Saggio SNP) dal SNP Assay 

Manager (Gestore saggio SNP)). 

3. Fare clic su Select SNP Assay(s) (Seleziona saggi SNP) dalla libreria. 

4. Fare clic su Import AIF (Importa AIF), quindi utilizzare l'Import SNP Assays 

(Importa saggi SNP) dalla finestra di dialogo AIF per importare il saggio SNP 

dall'AIF: 

a. Andare alla: 


b. Selezionare Text Files (File di testo) (*.txt) dall'elenco a discesa Files of 

type(File di tipo). 

c. Selezionare DME_SNP_185457113_426781-1.txt. 

d. Fare clic su Import (Importa). 

Note 




19



4a 

4c 

4d 

5. Nella finestra di dialogo SNP Import Properties (Proprietà importazione SNP), fare 

clic su OK. 

6. Selezionare il saggio SNP C__11711420_30 . 

7. Fare clic su Use Selected Marker(s) (Utilizza indicatori selezionati). 


4b 

Note 

20 






1 

2 

3 

4 

6 

5 

7 

Linee guida 

disegno 

Per disegnare i propri esperimenti: 

• Applied Biosystems raccomanda di valutare non più di 6 SNP su una piastra di 

reazione. 

Nota: Il Design Wizard consente non più di due SNP per piastra. I flussi di lavoro 

impostazione avanzata o avvio rapido non restringono il numero degli SNP che è 

possibile valutare. 

• Identificare ogni saggio SNP con un nome e un colore univoci. 

• Qualora i saggi non vengano scelti manualmente, verificare che i coloranti repoter 

assegnati a ogni allele siano corretti. 

IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'utilizzo del colorante 

TAMRA come reporter o quencher con il Sistema StepOne . 

Note 




21


Impostazione dei campioni e dei replicati 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sulla schermata Targets SNP Assays (Saggi SNP target), 




Nella schermata Set Up Samples and Replicates (Imposta campioni e replicati), 

immettere il numero di campioni nell'esperimento, immettere i nomi dei campioni, 

quindi immettere il numero dei controlli negativi e positivi. 


disegno di 

esempio 

Completamento 


Samples and 

Replictes 

(Campioni e 

replicati) 

L'esperimento di esempio valuta: 

• 20 campioni non noti 

• 2 controlli negativi 

• 2 controlli positivi (un eterozigote e un omozigote allele 2). 

1. Per il numero di saggi, immettere 20. 

2. Per il numero dei replicati, immettere 1. 

3. Fare clic su All Sample/ SNP Assay Reactions (Tutte le reazioni del 

campione/saggio SNP). 

4. Per il numero dei controlli negativi (pozzetti che non contengono templato), 

immettere 2. 

5. Per il numero dei controlli positivi (pozzetti che contengono campioni di genotipi 

noti), immettere 2. 

6. Per il Controllo positivo 1, selezionare Allele 1/Allele 2 Heterozygous 

(Eterozigote allele 1/allele 2). 

7. Per il Controllo positivo 2, selezionare Allele 2 Homozygous (Omozigote allele 2). 


Note 

22 






1 

2 

3 

4 

5 

6 

7 

Linee guida 

disegno 

Per ulteriori 

informazioni 


• Utilizzare tra 1 e 48 campioni. Assegnare ad ogni campione un nome e un colore 

univoci. 

• Applied Biosystems raccomanda l'utilizzo di almeno un controllo negativo per ogni 

saggio SNP. 

• Limitare il numero delle reazioni totali in ogni esperimento a 48 o meno. Qualora il 

numero delle reazioni totali richieste sia maggiore di 48, ridurre il numero dei saggi 

SNP, dei campioni, dei replicati oppure dei controlli positivi e negativi oppure 

suddividere le reazioni tra due o più piastre di reazione. 

Per ulteriori informazioni sulla schermata Samples & Replicates (Campioni e Replicati), 



Note 




23


Impostazione del metodo di esecuzione 


Nella schermata Run Method (Metodo di esecuzione), rivedere il volume di reazione e il 

metodo di esecuzione predefinito. Se necessario, modificare il volume di reazione e il 

metodo di esecuzione oppure sostituirli caricando un metodo di esecuzione dalla libreria. 


disegno di 

esempio 

L'esperimento di esempio esegue reazioni da 25-µl utilizzando il metodo del saggio di 

genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan ® indicato qui di seguito. Poiché il 

Sistema StepOne viene utilizzato per l'esecuzione del ciclo termico, il metodo di 

esecuzione contiene una fase ciclica per la PCR. 

Lettura 

pre-PCR 

Ciclo termico 

Lettura 

post-PCR 

Fase/Passaggio 

Fase di 

attesa 

Fase di 

attesa 

Denaturazio 

ne 

Cicli (50 cicli) 

Annealing/ 

Estensione 

Fase di 

attesa 

Temperatura 60 °C 95 °C 92 °C 60 °C 60 °C 

Tempo 

(hh:mm:ss) 

00:00:30 00:10:00 00:00:15 00:01:00 00:00:30 

Acquisizione dati Sì No No Sì Sì 

Nota: Nel metodo di cui sopra, l'acquisizione dei dati viene attivata per la fase di 

annealing/estensione consentendo al Sistema StepOne l'acquisizione dei dati in tempo 

reale durante la PCR. Sebbene i dati in tempo reale siano non necessari per la 

genotipizzazione, i dati sono utili in caso di mancata riuscita della risoluzione problemi 

PCR. 

Rivisualizzazione 


Run Method 

(Metodo di 

esecuzione) 

1. Fare clic sul campo Reaction Volume Per Well (Volume di reazione per 

pozzetto), quindi immettere 25. 

2. Fare clic sul campo Number of Cycles (Numero di cicli) della fase ciclica, quindi 

immettere 50. 

3. Fare clic sull'impostazione della temperatura del primo passaggio della fase ciclica 

(95 °C/00:20), quindi immettere 10:00. 

4. Regolare il primo passaggio della fase ciclica: 

a. Fare clic sull'impostazione della temperatura del primo passaggio (95 °C), 

quindi immettere 92 °C. 

b. Fare clic sull'impostazione della temperatura del primo passaggio (92 °C), 

quindi immettere 00:15. 

5. Fare clic sull'impostazione della temperatura del secondo passaggio (60 °C) della 

fase ciclica, quindi immettere 01:30. 

Note 

24 







1 

2 

4 

3 

5 

Linee guida 

disegno 

Per ulteriori 

informazioni 


• Immettere un volume/pozzetto di reazione da 10 a 30 µl. Applied Biosystems 

raccomanda un volume di reazione di 25 µl per gli esperimenti di genotipizzazione. 

• Rivedere il metodo di esecuzione predefinito. Qualora l'esperimento richieda 

impostazioni differenti, modificare il metodo predefinito come necessario. 

• Fare clic su Open Run Method (Apri metodo di esecuzione) per visualizzare una 

libreria di metodi di esecuzione. È possibile che la libreria contenga il metodo di 

esecuzione per l'esperimento. 

• Valutare l'inclusione dell'amplificazione nel metodo di esecuzione. I dati in tempo 

reale sono utili nella risoluzione problemi relativamente a un esperimento di 


Per ulteriori informazioni sulla schermata Run Method (Metodo di esecuzione), accedere 

alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help 

(Guida)StepOne Help (Guida StepOne). 

Note 




25


Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione 


Nella schermata Reaction Setup (Impostazione reazione), immettere il volume di 

reazione e il numero di reazioni in eccesso da preparare, quindi rivedere le impostazioni 

di concentrazione per la Master Mix PCR, per l'Assay Mix, il target campione diluito e 

gli stock di campioni ed effettuare le modifiche necessarie. 


disegno di 

esempio 

L'esperimento di esempio richiede una miscela di reazione sufficiente per 24 reazioni e 

un volume del 10 per cento per errori di pipettaggio. Ogni reazione da 25-µl consiste in: 

Componente 

µl/Pozzetto 

2✕ TaqMan ® Universal PCR Master Mix, No AmpErase ® UNG 12.50 

20✕ TaqMan ® Drug Metabolism Genotyping Assay 1.25 

Genomic DNA template (3 to 20 ng) + DNAse-free water 11.25 

Volume totale 25.00 

Completamento 


Reaction Setup 

(Imposta 

reazione) 

1. Fare clic sul campo Reaction Volume Per Well (Volume di reazione per 

pozzetto), quindi immettere 25 µl. 

2. Fare clic sul campo Excess Reaction Volume (Volume di reazione in eccesso), 

immettere 10%. 

3. Verificare che la concentrazione della Master Mix sia 2✕. 

4. Verificare che la concentrazione dell'Assay Mix TaqMan ® sia 20✕. 

1 

2 

3 

4 

5. Selezionare la scheda Sample Dilution Calculations (Calcoli diluizione del 

campione). 

Note 

26 






6. Fare clic sul campo Diluted Sample Concentration (Concentrazione campione 

diluito) (10✕ per miscela di reazione) , quindi immettere 30 ng/µl. 

7. Verificare che le concentrazioni di stock di tutti i campioni siano 100ng/µl. 

8. Stampare un rapporto del layout di piastra per riferimento: 

a. Fare clic su Print Reaction Setup (Stampa impostazione reazione). 

b. Nella finestra di dialogo, selezionare: 

• Istruzioni dettagliate di pipettaggio 

• Includi il layout di piastra nelle istruzioni 

• Utilizza il colore del campione come colore del pozzetto 

c. Fare clic su Print (Stampa). 

d. Nella finestra di dialogo Print (Stampa), selezionare le opzioni della stampante 

e di stampa, quindi fare clic su OK. 


8a 

5 

6 

7 

8b 

8b 

Note 




27


Ordine dei materiali per l'esperimento 

Linee guida 

disegno 

Per ulteriori 

informazioni 


• Immettere un volume/pozzetto di reazione da 10 a 30 µl. Applied Biosystems 

raccomanda un volume di reazione di 25 µl per gli esperimenti di genotipizzazione. 

• Immettere un volume di reazione in eccesso di almeno il 10 per cento per tenere 

conto di eventuali errori da pipettaggio non accurato e di altri errori sperimentali. 

• Nel caso venga utilizzato templato DNA secco, i componenti e i volumi vengono 

calcolati nuovamente. 

Per ulteriori informazioni sulla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione), 




Nella schermata Order Materials List (Ordine elenco materiali), rivedere l'elenco di 

materiali raccomandati per la preparazione della piastra di reazione, aggiungere gli 

articoli che si desidera ordinare al proprio ordine, quindi ordinare i materiali. 

Completamento 


Ordering 

Materials (Ordine 

materiali) 

1. Fare clic sul campo Gene Name (Nome gene) o RS Number (Numero RS), 

immettere rs8039, quindi fare clic su Find Assay (Trova saggio) per ottenere il 

saggio sul Applied Biosystems sito web: 

a. Nella finestra di dialogo Find Assay Results (Risultati ricerca saggio), 

selezionare il saggio C__11711420_30. 

b. Fare clic su Apply Assay Selection (Applica selezione saggio). 

1a 

1b 

Note 

28 






2. Nell'elenco dei materiali dell'esperimento, selezionare: 

• C__11711420_30 

• MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film 

• MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plates 

• TaqMan ® Universal PCR Master Mix, No AmpErase ® UNG 

3. Fare clic su Add Selected Items to Shopping List (Aggiungi gli articoli 

selezionati all'elenco acquisti). 

4. Fare clic sul campo Shopping Basket Name (Nome carrello acquisti), quindi 

immettere Example Experiment (Esperimento di esempio). 

5. Verificare che l'elenco acquisti dell'esperimento contenga i materiali desiderati e che 

le quantità siano corrette. 

6. Fare clic su Order Materials in List (Ordina i materiali presenti nell'elenco). 

7. Immettere le proprie Applied Biosystems informazioni di login dello Store, quindi 

fare clic su Login and Submit (Entra e inoltra) oppure fare clic su Register Now 

(Registrati subito) e completare il processo di registrazione. 

8. Dopo aver effettuato l’ordine, fare clic su Finish Designing Experiment (Termina 

il disegno dell'esperimento). 

1 

3 

2 

4 

6 

5 

Note 




29



Linee guida 

disegno 


• Verificare che il proprio computer abbia una connessione Internet senza restrizioni. 

• Selezionare tutti i materiali necessari per l'esperimento e aggiungerli all'elenco 

acquisti. 

IMPORTANTE! Il Sistema StepOne esegue solo materiali di consumo veloci 

(piastre di reazione, strisce con provette e provette). Quando viene eseguito un 

esperimento di genotipizzazione, eseguire le reazioni preparate con Master Mix 

TaqMan ® Universal PCR standard su un materiale di consumo veloce utilizzando 

condizioni PCR standard. 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sulla schermata Materials List (Elenco materiali), accedere alla 

voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help 


Note 

30 





Termine del flusso di lavoro del Design Wizard 


Nella finestra di dialogo Review Plate Layout (Rivisualizzazione layout di piastra), 

selezionare una opzione per terminare l'impostazione del design wizard, rivedere il 

layout di piastra e avviare l'esecuzione. 

Termine del 

Design Wizard 

1. Rivedere il layout di piastra. Se il layout di piastra non è corretto, selezionare 

Return to the Wizard (Ritorna al Wizard) e verificare i valori immessi. 

2. Selezionare Save Experiment (Salva esperimento). 

3. Nella finestra di dialogo Save Experiment (Salva esperimento), fare clic su Save 

(Salva)per salvare l'esperimento con nome Genotyping Example.eds. 

2 

1 

3 

Note 




31



Linee guida 

disegno 

Nel disegno dell'esperimento, esso viene salvato in 

:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments 

dove rappresenta la directory di installazione del software StepOne . 

Nota: Per modificare la cartella predefinita, selezionare Tools 

(Strumenti)Preferences (Preferenze), modificare la collocazione desiderata per il 

salvataggio, quindi fare clic su OK. 

Note 

32 




Capitolo 3 

Preparazione delle reazioni 



■ Preparazione delle diluizioni del campione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 

■ Preparazione della miscela di reazione. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 

■ Preparazione della piastra di reazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 





Note 




33

Capitolo 3 Preparazione delle reazioni 



Questo capitolo spiega come preparare le reazioni PCR per l'esperimento di 

genotipizzazione di esempio e fornisce le linee guida per la preparazione delle reazioni 

PCR relativamente al proprio esperimento. 


Preparare le reazioni PCR utilizzando il flusso di lavoro seguente: 

 

 




1. Preparazione delle diluizioni del campione. 

2. Preparazione della miscela di reazione. 

3. Preparazione della piastra di reazione. 

 

 

 




Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sulla preparazione dei saggi di genotipizzazione SNP 

TaqMan ® , vedere: 

• Protocollo Custom TaqMan ® SNP Genotyping Assays Protocol (N. di cat. 4334431) 

• Protocollo Custom TaqMan ® Genomic Assays Protocol (N. di cat. 4367671B) 

• Protocollo TaqMan ® SNP Genotyping Assays Protocol (N. di cat. 4332856C) 

• Protocollo TaqMan ® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol (N. di 

cat. 4362038A) 

• Scheda di riferimento rapido Performing a Custom TaqMan ® SNP Genotyping 

Assay for 96-Well Plates Quick Reference Card (N. di cat. 4371394A) 

• Scheda di riferimento rapido Performing a TaqMan ® Drug Metabolism Genotyping 

Assay for 96-Well Plates Quick Reference Card (N. di cat. 4367636A) 

• Protocollo Pre-Developed TaqMan ® Assay Reagents Allelic Discrimination 

Protocol (N. di cat. 4312214C) 

• Scheda di riferimento rapido Allelic Discrimination Pre-Developed TaqMan ® Assay 

Reagents Quick Reference Card (N. di cat. 4312212C) 

Nota: Le procedure del presente capitolo sono focalizzate sull'utilizzo di campioni di 

DNA umidi. Nel caso venga utilizzato DNA secco, consultare il protocollo della chimica 

che viene fornito con il kit PCR per i dettagli sulla ricostituzione e sulla preparazione per 

la piastra dei campioni da utilizzare. 

Note 

34 





Preparazione delle diluizioni del campione 

Preparazione delle diluizioni del campione 

Diluire lo stock del campione alle concentrazioni operative utilizzando i volumi calcolati 

dal software StepOne (vedere “Rivisualizzazione dell'impostazione della reazione” a 

pagina 26). 

Informazioni 

sull'esperimento 

di esempio 

I volumi calcolati per l'esperimento di esempio di genotipizzazione sono elencati qui di 

seguito. La concentrazione finale è 30.0 ng/µl. 

Provetta 

Nome 

campione 

Concentrazione 

stock campione 

(ng/µl) 

Stock 

campione 

(µl) 

Volume (µl) 

Acqua priva 

di DNAse 

(µl) 

Totale 

campione 

diluito (µl) 

1 Campione 1 100.0 0.66 1.54 2.20 

2 Campione 2 100.0 0.66 1.54 2.20 

… … … … … … 

21 Campione 21 100.0 0.66 1.54 2.20 

Materiali 

necessari 

Preparazione dei 

campioni 

• Acqua priva di DNAse per la diluizione del campione 

• Provette per microcentrifuga 

• Pipettatori e puntali per pipette 

• Stock campione 

• Vortexer 

• Centrifuga 

1. Etichettare una provetta per microcentrifuga separata per ogni campione: 

Campione 1, Campione 2,… fino al Campione 20. 

2. Aggiungere 1.54 µl di acqua priva di DNAse a ogni provetta vuota. 

3. Aggiungere 0.66 µl dello stock campione appropriato a ogni provetta. 

4. Agitare su Vortex ogni campione diluito da 3 a 5 secondi, quindi centrifugare 

brevemente le provette. 

Linee guida per la 

preparazione 

Per ulteriori 

informazioni 

Per preparare i campioni per il proprio esperimento: 

• Utilizzare acqua priva di DNAse per la diluizione dei campioni. 

• Utilizzare la stessa quantità di DNA per pozzetto per ogni esperimento. 

• Non riscaldare i campioni di DNA. 

Per ulteriori informazioni sulla preparazione dei saggi di genotipizzazione SNP 

TaqMan ® , fare riferimento al protocollo appropriato per i reagenti utilizzati nelle reazioni 

PCR (vedere “Per ulteriori informazioni” a pagina 34). 

Note 




35


Preparazione della miscela di reazione 


Preparare la miscela di reazione per l'esperimento utilizzando i volumi calcolati dal 

software StepOne . Il software StepOne determina quali componenti della miscela di 

reazione utilizzare sulla base delle selezioni effettuate nella schermata Methods and 

Materials (Metodi e Materiali) (vedere “Rivisualizzazione dell'impostazione della 

reazione” a pagina 26). Per gli esperimenti di genotipizzazione, la miscela di reazione 

contiene tutti i componenti eccetto il campione, il buffer o il controllo positivo. 

Materiali 

necessari 

Preparazione 

della miscela di 

reazione 

• Master Mix TaqMan ® Universal PCR veloce (2 ® ), No AmpErase✕ UNG 

• Saggio di genotipizzazione del metabolismo di farmaciTaqMan ® (20✕) 

• Acqua priva di DNAse 

• Provette per microcentrifuga 

• Pipettatori 

• Puntali per pipette 


PERICOLO CHIMICO. La Master Mix TaqMan ® 2✕ Universal 

PCR, No AmpErase UNG può provocare irritazione degli occhi e della pelle. 

L'esposizione può provocare problemi in caso di ingestione o inalazione. Leggere la 

scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) e attenersi rigorosamente alle istruzioni 

relative alla manipolazione di questa sostanza. Indossare un'adeguata protezione oculare, 

indumenti e guanti di protezione. 

1. Per il saggio SNP, aggiungere i volumi richiesti di ogni componente in una provetta 

dalle dimensioni appropriate: 

Volume di reazione 

Componente 

Per pozzetto(µl) 

24 Rxns. incluso 

10% in eccesso (µl) 

Secco Umido Secco Umido 

TaqMan ® Universal PCR Master Mix (2✕) 12.50 12.50 330 330 

SNP Assay Mix (20✕) 1.25 1.25 33 33 

H 2 O, priva di DNase 11.25 0 297 0 

Volume totale della miscela di reazione 25.00 13.75 660 363 

2. Pipettare la miscela di reazione con cautela su e giù, quindi tappare la provetta. 

3. Centrifugare brevemente la provetta. 

Note 

36 







preparazione 

Per preparare la miscela di reazione per il proprio esperimento, verificare che siano state 

eseguite le seguenti azioni: 

• Preparare le reazioni per ogni SNP separatamente. 

• Includere volume in eccesso nei propri calcoli allo scopo di compensare le perdite 

che si verificano durante il trasferimento dei reagenti. 

• Includere tutti i componenti necessari. 

• Preparare i reagenti secondo le istruzioni del produttore. 

• Proteggere l'Assay Mix dalla luce, nel congelatore, fino al momento dell'utilizzo. 

Una eccessiva esposizione alla luce può provocare effetti non desiderati sulle sonde 

fluorescenti. 

Prima dell'utilizzo: 

• Mescolare bene la Master Mix agitando la bottiglia. 

• Riportare l'Assay Mix in sospensione agitando su Vortex, quindi centrifugare 

brevemente la provetta. 

• Scongelare eventuali campioni congelati collocandoli su ghiaccio. Una volta 

scongelati, riportare in sospensione i campioni agitandoli su Vortex, quindi 

centrifugare brevemente le provette. 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sulla preparazione della miscela di reazione, fare riferimento al 

protocollo appropriato per i reagenti utilizzati nelle reazioni PCR (vedere “Per ulteriori 

informazioni” a pagina 34). 

Note 




37


Preparazione della piastra di reazione 


Caricare la piastra di reazione con la miscela di reazione riportata a pagina 36 e i 

campioni diluiti riportati a pagina 35. Le reazioni vengono aggiunte secondo il layout di 

piastra generato nel software StepOne (vedere “Impostazione dei campioni e dei 

replicati” a pagina 22). 

Materiali 

necessari 


• Piastra di reazione MicroAmp Fast Optical 48-Well 

• Pellicola adesiva MicroAmp Optical 48-Well 

• Pipettatori e puntali per pipette 

Nota: Il Sistema StepOne esegue unicamente materiali di consumo veloci 

MicroAmp . 

Preparazione 

della piastra di 

reazione: gDNA 

seccato 

1. Pipettare 1 µl del campione appropriato (da 3 a 20 ng di DNA genomico purificato) 

in ciascun pozzetto di una piastra di reazione ottica a 48 pozzetti. 

È necessario che tutti i pozzetti appartenenti allo stesso saggio di genotipizzazione 

contengano la stessa quantità del campione o del controllo. 

2. Asciugare i campioni per evaporazione a temperatura ambiente in ambiente privo di 

luce e privo di ampliconi. (Mentre è in atto la fase di asciugaggio coprire la piastra 

di reazione con un tessuto privo di lanugine.) 

3. Trasferire 25 µl della miscela di reazione in ogni pozzetto. 

IMPORTANTE! Controllare che non si verifichi contaminazione incrociata da 

pozzetto a pozzetto. 

4. Sigillare la piastra di reazione utilizzando una pellicola adesiva. 

5. Agitare su Vortex la piastra di reazione da 3 a 5 sec. 

6. Centrifugare brevemente la piastra di reazione. 

7. Verificare che il liquido si trovi sul fondo di ogni pozzetto della piastra di reazione. 

In caso contrario, centrifugare nuovamente la piastra a una velocità maggiore e per 

un tempo maggiore. 

IMPORTANTE! Non far sporcare il fondo della piastra di reazione. I fluidi e gli altri 

contaminanti che aderiscono al fondo della piastra di reazione possono contaminare 

il blocco campione, provocando un segnale di background esageratamente elevato. 

Note 

38 






Corretto 

Non corretto 

Liquido sul fondo 

del pozzetto. 

• Non centrifugato con forza sufficiente, 

oppure 

• Non centrifugato per un periodo di 

tempo sufficiente 

Preparazione 


reazione: gDNA 

umido 

1. Diluire ogni campione purificato di DNA genomico con acqua priva di DNase per 

ottenere una massa finale di DNA contenuta nel range da 3 a 20 ng per pozzetto di 

reazione. Il volume del campione di DNA e dell'acqua priva di DNase per reazione 

dovrebbe essere di 11,25 µl. 

2. In ogni pozzetto della piastra di reazione, pipettare una aliquota del controllo o del 

campione del volume (indicato nel passaggio 1) appropriato per il tipo di piastra di 

reazione: 

a. Per ogni reazione non nota, aggiungere 11,25 µl del campione nei pozzetti 

appropriati. 

b. Per ogni reazione di controllo negativo, aggiungere 11,25 µl di acqua priva di 

DNAse nei pozzetti appropriati. 

c. Per ogni reazione di controllo positivo, aggiungere 11,25 µl del controllo 

positivo nei pozzetti appropriati. 

IMPORTANTE! Verificare che il genotipo per il templato di controllo positivo 

aggiunto sia conforme al genotipo assegnato al pozzetto. 

3. Trasferire 13,75 µl della miscela di reazione nei pozzetti appropriati. 

4. Sigillare la piastra di reazione utilizzando una pellicola ottica adesiva. 

5. Agitare su Vortex la piastra di reazione da 3 a 5 sec, quindi centrifugarla 

brevemente. 

6. Centrifugare brevemente la piastra di reazione. 

IMPORTANTE! Non far sporcare il fondo della piastra di reazione. I fluidi e gli altri 

contaminanti che aderiscono al fondo della piastra di reazione possono contaminare 

il blocco campione, provocando un segnale di background esageratamente elevato. 

Note 




39



Corretto 

Non corretto 

Liquido sul fondo 

del pozzetto. 

• Non centrifugato con forza sufficiente, 

oppure 

• Non centrifugato per un periodo di 

tempo sufficiente 


preparazione 

Per preparare la piastra di reazione per il proprio esperimento: 

• Accertarsi di utilizzare i materiali di consumo appropriati. 

• Verificare che le posizioni delle reazioni siano conformi al layout di piastra nel 

software StepOne . 

• Nel caso siano in esecuzione meno di 40 reazioni, utilizzare strisce con provetta e 

non una piastra di reazione. 

• Caricare da 3 a 20 ng di DNA genomico purificato per reazione 

• È necessario che tutti i pozzetti appartenenti allo stesso saggio di genotipizzazione 

contengano la stessa quantità del campione o del controllo. 

• È possibile eseguire saggi multipli su una sola piastra di reazione, ma è necessario 

analizzarli separatamente. 

Note 

40 






• Nel caso venga utilizzata pellicola adesiva ottica per sigillare le piastre, sigillare 

ogni piastra come segue: 

Azione 

Esempio 

1. Posizionare la piastra di reazione ottica a 48 pozzetti sulla parte 

centrale della base di supporto splash free a 96 pozzetti. 

Verificare che la piastra sia aderente alla superficie superiore 

della base di supporto. 

2. Caricare la piastra di reazione ottica a 48 pozzetti come 

desiderato. 

3. Rimuovere una pellicola adesiva ottica singola dalla scatola. 

Flettere verso l'alto entrambe le linguette terminali. Tenere la 

pellicola adesiva ottica col lato posteriore verso l'alto. 

4. Con un solo rapido movimento, staccare la protezione dalla 

superficie centrale sigillante. Non toccare la superficie centrale 

sigillante. 

5. Tenendo la pellicola adesiva ottica per le alette terminali, 

adagiare la pellicola ottica sulla piastra di reazione a 48 pozzetti 

(con il lato adesivo posto a contatto con la piastra). Verficare che 

la pellicola ricopra completamente tutti i pozzetti della piastra. 

6. Muovere l'applicatore lentamente su tutta la pellicola adesiva, 

esercitando una ferma pressione, orizzontalmente e 

verticalmente, per garantire un contatto ottimale tra la pellicola e 

la piastra su tutta la superficie della piastra di reazione. 

7. Mentre è in atto l'utilizzo dell'applicatore per mantenere il bordo 

della pellicola in posizione, afferrare una estremità dell'aletta e 

tirare verso l'alto e strappare bruscamente. Ripetere per l'altra 

aletta. 

8. Ripetere il passaggio 7. Muovere l'applicatore orizzontalmente e 

verticalmente, con ferma pressione, sulla pellicola adesiva ottica 

per ottenere una sigillatura ermetica, a prova di evaporazione. 

9. Per garantire una sigillatura ermetica, passare la estremità 

dell'applicatore con ferma pressione sui quattro lati del bordo 

esterno della pellicola adesiva ottica. Ispezionare la piastra per 

verificare che tutti i pozzetti siano sigillati (controllare che sia 

presente una impronta di tutti i pozzetti sulla superficie della 

pellicola adesIva ottica). 

IMPORTANTE! Una azione impropria di rimozione della 

protezione dalla pellicola può provocare un effetto di 

appannamento sulla pellicola stessa, ma non influenza i risultati. 

L'appannamento scompare quando la pellicola entra in contatto 

con il pannello di copertura riscaldato nello strumento. 

Nota: Le pellicole adesive ottiche non aderiscono al semplice 

contatto. È necessaria l'applicazione di pressione per garantire una 

sigillatura ermetica, a prova di evaporazione. 

Note 




41



Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sulla preparazione della piastra di reazione, fare riferimento al 

protocollo appropriato per i reagenti utilizzati nelle reazioni PCR (vedere “Per ulteriori 

informazioni” a pagina 34). 

Note 

42 




Capitolo 4 

Esecuzione dell'esperimento 



■ Preparazione per l'esecuzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 

■ (Opzionale) Abilitazione delle notifiche. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 

■ Avvio dell'esecuzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 

■ Monitoraggio dell'esecuzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 

■ Rimozione della piastra di reazione e trasferimento dei dati . . . . . . . . . . . . . . . . 63 





Note 




43

Capitolo 4 Esecuzione dell'esperimento 



Questo capitolo spiega come eseguire una sessione di analisi sullo strumento Applied 

Biosystems StepOne Real-Time PCR System. 


Eseguire l'esperimento utilizzando il flusso di lavoro seguente: 

 

 

 





1. Preparazione per l'esecuzione. 

2. (Opzionale) Abilitazione delle notifiche. 

3. Avvio dell'esecuzione. 

4. Monitoraggio dell'esecuzione. 

5. Rimozione della piastra di reazione e trasferimento dei dati. 

 

 



Note 

44 





Preparazione per l'esecuzione 


Prepararsi all'esecuzione aprendo l'esperimento e caricando la MicroAmp Fast Optical 

48-Well Reaction Plate a chiusura ermetica nello Strumento StepOne . 

Apertura 


1. Nel software StepOne , fare clic su Open (Apri). 

2. Selezionare Genotyping Example.eds. 

3. Fare clic su Open (Apri). 

1 

2 

3 

Note 




45



Caricamento 


reazione 


strumento, la temperatura del blocco campione può superare i 100 °C. Se lo strumento è 

stato utilizzato di recente, tenere le mani lontane fino a quando il blocco campione non 

raggiunge la temperatura ambiente. 

IMPORTANTE! Indossare guanti privi di polvere per manipolare la piastra di reazione. 

1. Aprire il cassetto dello strumento. 

2. Posizionare le reazioni nel blocco campione. 

L'orientamento della piastra di reazione dipende dal tipo dei materiali di consumo 

utilizzati: 

• In caso di utilizzo di una piastra di reazione, posizionare il blocco campione 

con il pozzetto A1 nell'angolo posteriore sinistro. 

• In caso di utilizzo di strisce con provette di reazione, posizionare le strisce nel 

blocco campione. 

A1 

3. Chiudere con attenzione il cassetto dello strumento. 

Note 

46 





(Opzionale) Abilitazione delle notifiche 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sul caricamento della piastra di reazione, accedere alla voce 

Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help 



Abilitare le impostazioni delle notifiche in modo tale che il software StepOne invii un 

avviso tramite e-mail quando lo Strumento StepOne inizia l'esecuzione e quando questa 

viene completata, oppure nel caso si verifichi un errore durante l'esecuzione. 

L'abilitazione della funzione delle impostazioni delle notifiche è opzionale e non 

influenza le prestazioni del Sistema StepOne o la durata dell'esecuzione. 

IMPORTANTE! La funzione delle impostazioni di notifica è disponibile solo se il 

computer utilizzato per la sessione con Strumento StepOne è collegato a una rete 

Ethernet. 

Nota: Il sistema di notifica è disponibile anche per computer che eseguono il 

monitoraggio dello Strumento StepOne da remoto. Per ulteriori informazioni sul 

monitoraggio remoto, vedere “Monitoraggio remoto” a pagina 59. 


disegno di 

esempio 

Regolazione delle 

impostazioni di 

notifica 

Nell'esperimento di esempio, il software StepOne è impostato per inviare notifiche a tre 

utenti (ricercatore, supervisore e tecnico presso nomeazienda.com) quando il Sistema 

StepOne termina l'esecuzione e nel caso in cui si verifichino errori durante il 

funzionamento. Il server SMTP dell'esempio (www.nomeazienda.com) è impostato per 

la criptazione Secure Sockets Layers (SSL) e richiede l'autenticazione per l'uso. 

1. Nel software StepOne , fare clic su Run (Esegui) nella colonna di 

navigazione. 

2. Fare clic su Notification Settings (Impostazioni di notifica). 

3. Selezionare Enable Notifications (Abilita notifiche). 

4. Selezionare gli eventi che attiveranno le notifiche: 

a. Selezionare Instrument Error (Errore dello strumento). 

b. Selezionare Run Completed (Esecuzione completata). 

5. Fare clic sul campo Enter e-mail addresses for notifications (Immetti indirizzi e- 

mail per le notifiche), quindi immettere ricercatore@nomeazienda.com, 

supervisore@nomeazienda.com, tecnico@nomeazienda.com. 

6. Fare clic sul campo Outgoing Mail Server (Server posta in uscita) (SMTP), 

quindi immettere smtp.nomeazienda.com. 

Note 




47



7. Specificare le impostazioni di autenticazione: 

a. Selezionare No per Server requires authentication (Autenticazione del server 

necessaria). 

b. Fare clic sul campo User Name (Nome utente), quindi immettere supervisor 

(supervisore). 

c. Fare clic sul campo Password, quindi immettere password. 

3 

4 

5 

6 

7a 

7b 

7c 

Linee guida 

esecuzione 

Quando il Sistema StepOne viene impostato per la notifica automatica: 

• È necessario che il Sistema StepOne sia impostato per l'utilizzo in rete. Vedere la 

Guida per installazione, collegamento in rete e manutenzione del sistema 


• Determinare gli eventi da notificare tra: 

– Instrument Error (Errore dello strumento) – Induce il Sistema StepOne a 

notificare tramite e-mail ai destinatari tutti gli errori occorsi allo Strumento 

StepOne durante ogni esecuzione. 

– Run Started (Esecuzione avviata) – Induce il Sistema StepOne a notificare 

tramite e-mail ai destinatari tutte le volte che lo strumento avvia una esecuzione. 

– Run Completed (Esecuzione completata) – Induce il Sistema StepOne a 

notificare tramite e-mail ai destinatari tutte le volte che lo strumento completa 

una esecuzione. 

• Acquisire gli indirizzi e-mail per la ricezione delle notifiche. 

IMPORTANTE! Separare gli indirizzi con una virgola ( , ). 

Note 

48 





Avvio dell'esecuzione 

• Contattare l'amministratore dei sistemi oppure il reparto di Information Technology 

per 

– L'indirizzo di rete di un server simple mail transfer protocol (SMTP) 

– Un nome utente e una password per il server, qualora siano richiesti per l'accesso 

– L'impostazione Secure Sockets Layer (SSL) del server (on oppure off) 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sulla schermata Notification Settings (Impostazioni di 

notifica), accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o 



Avviare l'esecuzione in base al layout dello Strumento StepOne . La modalità di avvio 

dell'esecuzione dipende dal layout del Sistema StepOne : 

Layout Descrizione Vedere... 

Co-locato 

Il cavo giallo del Sistema StepOne collega il 

computer allo Strumento StepOne 

“Avvio co-locato” qui 

di seguito 

Indipendente • Il computer e lo Strumento StepOne non sono 

collegati, oppure 

• Il computer e lo Strumento StepOne sono 

collegati alla stessa rete. 

“Avvio indipendente” 

a pagina 50 

Avvio co-locato 

Eseguire la procedura seguente se il computer è collegato direttamente allo Strumento 

StepOne attraverso il cavo del Sistema StepOne . 

1. Nel software StepOne , fare clic su Temperature Plot (Plot di temperatura). 

2. Fare clic su START RUN (AVVIA ESECUZIONE) . 

Note 




49



2 

1 

Avvio 

indipendente 

Eseguire la procedura seguente se il computer e lo Strumento StepOne non sono 

collegati direttamente attraverso il cavo giallo del Sistema StepOne . 

1. Se il computer e lo Strumento StepOne sono collegati alla stessa rete, eseguire i 

passaggi 1a fino a 1f. In caso contrario, andare al passaggio 2. 

a. Nel software StepOne , fare clic su Send Experiment to Instrument 

(Invia esperimento allo strumento). 

b. Nella finestra di dialogo Send Experiment to Instrument (Invia esperimento 

allo strumento), fare clic su Browse (Sfoglia), selezionare il file 

Genotyping Example.eds, quindi fare clic su Open (Apri). 

c. Selezionare lo Strumento StepOne dal menu a discesa Select Instrument 

(Seleziona strumento). 

Nel caso lo strumento non sia elencato Strumento StepOne , impostare lo 

strumento per il monitoraggio come spiegato nella Guida per installazione, 

collegamento in rete e manutenzione del sistema Applied Biosystems StepOne 

Real-Time PCR System. 

Note 

50 






d. Fare clic su Send Experiment (Invia esperimento) per inviare l'esperimento 

allo Strumento StepOne attraverso la rete. 

1b 

1c 

1d 

e. Quando segnalato, fare clic su OK per chiudere la verifica. 

f. Andare al passaggio 3. 

2. Se lo Strumento StepOne non è collegato al computer, eseguire i passaggi 2a a 2d 

per utilizzare una unità USB per il trasferimento dell'esperimento. 

a. Collegare l'unità USB a una delle porte USB del computer. 

b. Nel software StepOne , selezionare Save (Salva) Save As (Salva con 

nome). 

c. Nella finestra di dialogo Save (Salva), individuare l'unità USB, quindi fare clic 

su Save (Salva). 

d. Rimuovere l'unità USB dal computer, quindi collegarla alla porta USB dello 

Strumento StepOne . 

o 

3. Sfiorare il touchscreen dello Strumento StepOne , quindi sfiorare . 

4. Nel Main Menu (Menu principale), sfiorare Browse Experiments (Sfoglia 

esperimenti). 

5. Nella schermata Browse Methods (Metodi per sfogliare), sfiorare (Cartelle). 

6. Nella schermata Choose an Experiment Category (Scegli una categoria di 

esperimento): 

• Sfiorare USB se il trasferimento dell'esperimento è stato eseguito attraverso 

una unità USB. 

• Sfiorare Default (Predefinito) se l'invio dell'esperimento è stato eseguito 

attraverso il collegamento a una rete. 

Note 




51



7. Nella schermata Browse USB/Default Experiments (Sfoglia esperimenti 

USB/predefiniti): 

a. Sfiorare Example Genotyping Experiment (Esperimento di esempio di 

genotipizzazione) per selezionare l'esperimento. 

b. Sfiorare Start Run (Avvia esecuzione). 

5 

7a 

7b 

8. Nella schermata Run Parameters (Esegui parametri): 

a. Sfiorare il campo Reaction Volume (Volume reazione) , utilizzare il tastierino 

per immettere 25 µl, quindi sfiorare Done (Fatto). 

b. Sfiorare Start Run (Avvia esecuzione). 

8a 

8b 

Note 

52 





Monitoraggio dell'esecuzione 


Monitorare lo sviluppo dell'esecuzione da un computer su cui è attivo il software 

StepOne oppure dal touchscreen dello Strumento StepOne . La modalità di 

monitoraggio dell'esecuzione dipende dal layout del Sistema StepOne : 


Co-locato 

Indipendente 

(collegato in 

rete) 

Indipendente 

(di base) 

Il cavo del Sistema StepOne collega il 

computer allo Strumento StepOne . 

Il computer e lo Strumento StepOne sono 


Il computer e lo Strumento StepOne non sono 

collegati. 

“Monitoraggio colocato” 

qui di seguito 

“Monitoraggio remoto” a 

pagina 59 

“Monitoraggio 

indipendente” a 

pagina 62 

Monitoraggio colocato 

Se il computer è collegato direttamente allo Strumento StepOne attraverso il cavo del 

Sistema StepOne , è possibile visualizzare lo sviluppo dell'esecuzione in tempo reale 

come descritto qui di seguito. Durante l'esecuzione, visualizzare periodicamente tutti i tre 

plot disponibili nel software StepOne per potenziali problemi. 

# Per… Azione 

A Arrestare l'esecuzione 1. Nel software StepOne , fare clic su STOP RUN (ARRESTA 

ESECUZIONE). 

2. Nella casella di dialogo Stop Run (Arresta esecuzione), fare 

clic su una delle seguenti opzioni: 

– Stop Immediately (Arresta immediatamente) per 

arrestare l'esecuzione immediatamente. 

– Stop after Current Cycle/Hold (Arresta dopo il ciclo 

corrente/Attendi) per arrestare l'esecuzione dopo il ciclo 

corrente oppure attendere. 

– Cancel (Annulla) per continuare l'esecuzione. 

B 

C 

D 

E 

Visualizzare i dati di 

amplificazione in tempo 

reale 

Visualizzare i dati della 

temperatura per 

l'esecuzione in tempo 

reale 

Visualizzare lo sviluppo 

dell'esecuzione nel 

metodo di esecuzione 

Abilitare/disabilitare le 

impostazioni di notifica. 

Selezionare Amplification Plot (Plot di amplificazione). 

Vedere “Informazioni sul Plot di amplificazione” a pagina 55 per 

ulteriori informazioni sul plot. 

Selezionare Temperature Plot (Plot di temperatura). 

Vedere “Informazioni sul Plot di temperatura” a pagina 56 per 


Selezionare Run Method View (Visualizzazione metodo di 

esecuzione). 

Vedere “Informazioni sulla visualizzazione del metodo di 

esecuzione” a pagina 57 per ulteriori informazioni sulla 

visualizzazione. 

Selezionare o deselezionare Enable Notifications (Abilita 

notifiche). 

Note 




53



A 

B 

E 

C 

D 

Note 

54 






Informazioni sul Plot di amplificazione 

Il Plot di amplificazione consente di visualizzare l'amplificazione del campione in 

seguito all'acquisizione da parte dello Strumento StepOne dei dati di fluorescenza 

durante una sessione di analisi. Qualora un metodo sia impostato per acquisire i dati in 

tempo reale, il Plot di amplificazione visualizza i dati per i pozzetti selezionati nella 

scheda View Plate Layout (Visualizza layout di piastra). Il plot evidenzia la fluorescenza 

del colorante normalizzata (∆R n ) e il numero di ciclo. La figura qui di seguito mostra il 

Plot di amplificazione come appare durante l'esperimento di esempio. 

Il Plot di amplificazione è utile per l'identificazione e l'esame dell'amplificazione 

anomala. L'amplificazione anomala può includere: 

• Fluorescenza aumentata nei pozzetti di controllo negativi. 

• Nessun aumento di fluorescenza nei pozzetti di controllo positivo. 

• Assenza di fluorescenza rilevabile per un determinato ciclo (dovuta all'utilizzo degli 

stessi reagenti sotto le stesse condizioni in esperimenti precedenti simili). 

Nel caso si noti amplificazione anomala o una completa assenza di segnale, risolvere il 

problema come spiegato nella Guida del software StepOne (fare clic su nella barra 

degli strumenti oppure selezionare Help (Guida)StepOne Help (Guida StepOne). 

Nota: Per visualizzare i dati nel Plot di amplificazione, selezionare i pozzetti da 

visualizzare nella scheda View Plate Layout (Visualizza layout di piastra). 

Per ulteriori informazioni sulla schermata Amplification Plot (Plot di amplificazione), 

accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su oppure 


Note 




55



Informazioni sul Plot di temperatura 

Durante una sessione di analisi, il Plot temperatura visualizza le temperature del blocco 

campione, del pannello di copertura riscaldato e dei campioni (calcolate) in tempo reale. 

La figura qui di seguito mostra il Plot della temperatura come appare durante 

l'esperimento di esempio. 

A 

B 

Per… 

Aggiungere/Rimuovere i plot della 

temperatura 

Modificare il tempo visualizzato 

dal plot 

Azione 

Selezionare Sample (Campione), Heated Cover 

(Pannello di copertura riscaldato)oppure Sample 

Block (Blocco campione) per alternare la presenza 

dei dati associati nel plot. 

Selezionare View (Visualizza)(durata temporale). 

C Restringere l'asse Y del plot Selezionare Fixed View (Visualizzazione fissa). 

A 

B 

C 

Il Plot della temperatura è spesso utile per l'identificazione di guasti hardware. Durante il 

monitoraggio del Plot della temperatura, osservare il campione, il pannello di copertura 

riscaldato e il blocco campione per rilevare eventuali comportamenti anomali. 

• In generale, i plot del campione e quello del blocco si rispecchiano 

approssimativamente l'uno con l'altro. Una deviazione significativa dei plot 

potrebbe indicare un problema. 

• Il pannello di copertura riscaldato deve mantenere costantemente la temperatura 

specificata nel metodo. Uno scostamento da tale temperatura uniforme potrebbe 

indicare un problema. 

Note 

56 






Nel caso si noti un plot di temperatura anomalo, risolvere il problema come spiegato 

nella Guida del software StepOne (fare clic su nella barra degli strumenti oppure 

selezionare Help (Guida)StepOne Help (Guida StepOne)). 

Per ulteriori informazioni sulla schermata Temperature Plot (Plot della temperatura), 

accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su oppure 


Informazioni sulla visualizzazione del metodo di esecuzione 

Dopo l'avvio dell'esecuzione, il Sistema StepOne visualizza lo sviluppo dell'esecuzione 

nella visualizzazione del metodo di esecuzione. La visualizzazione riporta lo sviluppo 

dell'esecuzione in riferimento al profilo termico del metodo. La figura qui di seguito 

indica la visualizzazione del metodo di esecuzione come appare nell'esperimento di 

esempio. 

A 

Per… 

Modificare il metodo di 

esecuzione 

(aggiungere cicli, una 

fase di attesa o una 

curva di melting) 

Azione 

1. Nel pannello di navigazione, fare clic su Run Method 

(Metodo di esecuzione). 

2. Nella schermata Run Method (Metodo di esecuzione), 

effettuare alcune delle seguenti azioni: 

– Immettere il numero di cicli da applicare alla fase ciclica. 

– Selezionare Add Melt Curve Stage to End (Aggiungi 

fase curva melt alla fine) nel caso si desideri 

aggiungere una fase di curva di melting alla fine 

dell'esecuzione. 

– Selezionare Add Holding Stage to End (Aggiungi fase 

di attesa alla fine) nel caso si desideri aggiungere una 

fase di attesa alla fine dell'esecuzione. 

3. Fare clic su Send to Instrument (Invia allo strumento). 

Note 




57



A 

Nota: Nel caso compaia un avviso, fare clic sull'errore per ulteriori informazioni e per 

risolvere il problema come spiegato nella Guida del software StepOne (fare clic su 

nella barra degli strumenti oppure selezionare Help (Guida)StepOne Help (Guida 

StepOne)). 

Per ulteriori informazioni sulla schermata Run Method (Metodo di esecuzione), accedere 

alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su oppure selezionando 

Help (Guida)StepOne Help (Guida StepOne). 

Note 

58 






Monitoraggio 

remoto 

Se lo Strumento StepOne è collegato a una rete, è possibile utilizzare la funzione di 

monitoraggio remoto del software StepOne per visualizzare lo sviluppo dell'esecuzione 

in tempo reale da qualunque computer in rete. 

IMPORTANTE! I computer in rete non sono abilitati a controllare lo Strumento 

StepOne ma solo a monitorarlo. 


A 

B 

C 

D 

Visualizzare i dati di 

amplificazione in tempo 

reale 

Visualizzare i dati della 

temperatura per 

l'esecuzione in tempo 

reale 

Visualizzare lo sviluppo 

dell'esecuzione nel 

metodo di esecuzione 

Abilitare/disabilitare le 

impostazioni di notifica. 

Fare clic su Amplification Plot (Plot di amplificazione). 

Vedere “Informazioni sul Plot di amplificazione” a pagina 55 per 


Fare clic su Temperature Plot (Plot temperatura). 

Vedere “Informazioni sul Plot di temperatura” a pagina 56 per 


Fare clic su Run Method View (Visualizzazione metodo di 

esecuzione). 

Vedere “Informazioni sulla visualizzazione del metodo di 

esecuzione” a pagina 57 per ulteriori informazioni sulla 

visualizzazione. 

Selezionare o deselezionare Enable Notifications (Abilita 

notifiche). 

Vedere “(Opzionale) Abilitazione delle notifiche” a pagina 47 per 

ulteriori informazioni sulle impostazioni di notifica. 

D 

A B C 

Per monitorare lo Strumento StepOne da remoto: 

1. Nel software StepOne , selezionareInstrument (Strumento) Remote Monitor 

(Monitoraggio Remoto). 

Note 




59



2. Nella barra di navigazione, selezionare lo Strumento StepOne . 

Se lo Strumento StepOne non è elencato nella barra di navigazione: 

a. Fare clic su Add Instrument (Aggiungi strumento). 

b. Fare clic sul campo Instrument Name (Nome strumento), quindi immettere il 

nome dello strumento. 

c. Fare clic sul campo Host Name (Nome host), quindi immettere l'indirizzo IP 

dello strumento. 

d. Fare clic su Save & Exit (Salva ed Esci). 

2b 

2c 

2d 

Nota: Per ulteriori informazioni sulla configurazione dello Strumento StepOne 

per l'utilizzo di rete o per il monitoraggio remoto, vedere la Guida per installazione, 

collegamento in rete e manutenzione del sistema Applied Biosystems StepOne 

Real-Time PCR System. 

Note 

60 






3. Fare clic su (Start monitoring this instrument (Avvia monitoraggio di questo 

strumento)) per lo strumento stesso. 

1 

2 

3 

Note 




61



Monitoraggio 

indipendente 

Nel caso sia stata avviata l'esecuzione dallo Strumento StepOne , è possibile 

visualizzare lo sviluppo dell'esecuzione dal touchscreen. La schermata Run Method 

(Metodo di esecuzione) visualizza il metodo per l'esperimento ed evidenzia le fasi del 

profilo termico nel modo in cui lo strumento le esegue. 


A 

B 

Aggiungere una curva 

di melting 

all'esecuzione 

Visualizzare il tempo 

residuo dell'esecuzione 

Sfiorare (Add Melt Curve (Aggiungi curva di melting)), 

quindi sfiorare OK. 

Sfiorare Display Experiment Time (Visualizza tempo 

esperimento), quindi sfiorare per ritornare alla schermata 

Run Method (Metodo di esecuzione). 

C Arrestare l'esecuzione Sfiorare STOP (ARRESTA), quindi sfiorare: 

• Stop (Arresta) per arrestare l'esecuzione dopo il 

completamento da parte dello Strumento StepOne del 

ciclo corrente o per metterla in fase di attesa. 

• Abort (Interrompi) per arrestare l'esecuzione 

immediatamente. 

• per continuare l'esecuzione senza alcuna modifica. 

D 

E 

Visualizzare le 

informazioni 


Visualizzare il log di 

errore 

Sfiorare View Experiment Information (Visualizza 

informazioni esperimento), quindi sfiorare per ritornare 

alla schermata Run Method (Metodo di esecuzione). 

Sfiorare la barra di stato per visualizzare il log di errore. 

D 

A 

B 

C 

E 

Note 

62 





Rimozione della piastra di reazione e trasferimento dei dati 


Quando lo Strumento StepOne visualizza il Main Menu (Menu principale), rimuovere 

la piastra di reazione dallo Strumento StepOne e trasferire i dati dell'esperimento al 

computer per l'analisi degli stessi. 

Scaricamento 


reazione 


strumento, la temperatura del blocco campione può superare i 100 °C. Tenere le mani a 

distanza fino a quando il blocco campione non raggiunge la temperatura ambiente. 

Nota: Quando lo Strumento StepOne completa una sessione di analisi, il sistema salva 

i dettagli dell'esecuzione nello storico dell'esecuzione, che resta nel sistema fino al 

completamento di un'altra sessione. 

1. Quando appare il Main Menu (Menu principale) nel touchscreen dello Strumento 

StepOne , sfiorare . 

2. Aprire il cassetto dello strumento. 

3. Rimuovere la piastra di reazione dal blocco campione. 

4. Chiudere il cassetto dello strumento con attenzione. 

IMPORTANTE! Non spegnere lo Strumento StepOne dopo una sessione. Lo strumento 

entra automaticamente in una modalità di ibernazione quando non è in uso. 

Per ulteriori informazioni sullo scaricamento dello Strumento StepOne , accedere alla 

voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su oppure selezionando Help 


Note 




63



Selezione di un 

metodo di 

trasferimento dei 

dati 

Trasferire l'esperimento al computer per l'analisi secondo il layout del Sistema 

StepOne : 


Co-locato 

Indipendente 

(collegato in 

rete) 

Indipendente 

(di base) 

Il cavo del Sistema StepOne collega il 

computer allo Strumento StepOne . 

Il computer e lo Strumento StepOne sono 


Il computer e lo Strumento StepOne non 

sono collegati. 

“Trasferimento dati colocati” 

qui di seguito 

“Monitoraggio remoto” a 

pagina 59 

“Monitoraggio 

indipendente” a pagina 62 

Trasferimento 

dati co-locati 

Trasferimento 

dati da remoto 

Se il computer è collegato direttamente allo Strumento StepOne attraverso il cavo del 

Sistema StepOne , non è necessaria alcuna azione. Il software StepOne trasferisce 

automaticamente i dati dell'esperimento allo Strumento StepOne dopo l'esecuzione. 

Se il computer e lo Strumento StepOne sono collegati alla stessa rete Ethernet, scaricare 

l'esperimento dallo Strumento StepOne attraverso la rete: 

1. Nel software StepOne , fare clic su Download Experiment from Instrument 

(Scarica l'esperimento dallo strumento). 

2. Nella finestra di dialogo Download Experiment from Instrument (Scarica 

l'esperimento dallo strumento), selezionare Select Instrument (Seleziona 

strumento). 

3. Selezionare Experiment (Esperimento)Genotyping_Example (Esempio di 

genotipizzazione). 

4. Nel campo Download File To (Scarica file su), fare clic su Browse (Sfoglia), 

selezionare una cartella per ricevere i dati dell'esperimento, quindi fare clic 

su Select (Seleziona). 

5. Fare clic su Download Experiment (Scarica esperimento) per scaricare 

l'esperimento dallo Strumento StepOne al computer attraverso la rete. 

2 

4 

3 

5 

Note 

64 






6. Quando segnalato, fare clic su OK per chiudere la verifica. 

6 

Trasferimento 

dati indipendente 

Se il computer non è collegato allo Strumento StepOne , utilizzare l'unità USB per 

trasferire l'esperimento allo Strumento StepOne : 

1. Qualora non sia già stato fatto, collegare una unità USB alla porta USB. 

o 

2. Sfiorare il touchscreen dello Strumento StepOne per attivarlo, quindi 

sfiorare . 

3. Nel Main Menu (Menu principale), sfiorare Collect Results (Acquisisci risultati) 

per salvare i dati in una unità USB. 

Se lo Strumento StepOne non riconosce l'unità USB, sfiorare OK, attendere 

30 sec, quindi sfiorare nuovamente Collect Results (Acquisisci risultati). 

4. Una volta eseguito il trasferimento dei dati, sfiorare OK. 

5. Rimuovere l'unità USB dallo Strumento StepOne , quindi collegarla alla porta USB 

del computer. 

6. Nel desktop del computer, utilizzare Esplora risorse di Windows per aprire l'unità 

USB. 

Note 




65



7. Copiare il file Genotyping Example.eds in 

:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments 

dove rappresenta la directory di installazione del software StepOne . 

Note 

66 




Capitolo 5 

Analisi dell'esperimento 



■ Apertura dell'esperimento per l'analisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 

■ Visulizzazione del Plot di discriminazione allelica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 

■ Visualizzazione del layout di piastra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 

■ Visualizzazione tabella Well (Pozzetto) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 

■ Visualizzazione del riepilogo CQ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 

■ Visualizzazione del Plot dei dati non elaborati. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 

■ Visualizzazione del Plot multicomponente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 

■ Visualizzazione Plot di amplificazione. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 

■ Visualizzazione delle impostazioni di analisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 

■ Pubblicazione dei dati. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 





Note 




67

Capitolo 5 Analisi dell'esperimento 



Questo capitolo spiega come visualizzare, analizzare e pubblicare l'esperimento 

analizzato. 


Come valutare i 

risultati 

 

 

 

 






1. Visulizzazione del Plot di discriminazione all’elica. 

2. Visualizzazione del layout di piastra. 

3. Visualizzazione della tabella Well (Pozzetto). 

4. Visualizzazione del riepilogo CQ. 

5. Visualizzazione del Plot dei dati non elaborati. 

6. Visualizzazione del Plot multicomponente. 

7. Visualizzazione del Plot di amplificazione. 

8. Visualizzazione delle impostazioni di analisi. 

9. Pubblicazione dei dati. 

 


La rivisualizzazione dei risultati avviene in tre passaggi: 

1. Eseguire una rivisualizzazione iniziale del Plot di discriminazione allelica (vedere 

pagina 70), del layout di piastra (vedere pagina 74) e della tabella pozzetto (vedere 

pagina 77) per valutare le richieste di genotipi da parte del software StepOne . 

2. Eseguire una revisione accurata del riepilogo CQ (vedere pagina 80) per valutare i 

campioni che hanno attivato gli indicatori CQ. Rivedere i dati non elaborati (vedere 

pagina 82) e i dati di amplificazione (vedere pagina 86) per i campioni che mostrano 

amplificazione anormale. 

3. Se necessario, definire le impostazioni di analisi (vedere pagina 91) oppure 

modificare le richieste manualmente (vedere pagina 95). 

Dopo aver valutato i risultati, è possibile pubblicare i risultati come spiegato in 

“Pubblicazione dei dati” a pagina 96. 

Note 

68 





Apertura dell'esperimento per l'analisi 

Apertura dell'esperimento per l'analisi 

Prepararsi per l'analisi aprendo l'esperimento. 



Apertura 


L'esperimento di esempio si trova in: 


dove indica il disco rigido del computer sul quale è stato installato il software 

StepOne . L'unità predefinita di installazione è l'unità C. 

1. Nel software StepOne , fare clic su Open (Apri). 

2. Selezionare Genotyping Example.eds. 

3. Fare clic su Open (Apri). 

1 

2 

3 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni, accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne 


StepOne). 

Note 




69


Visulizzazione del Plot di discriminazione allelica 


Eseguire una rivisualizzazione iniziale dei risultati nel Plot di discriminazione allelica, 

che contrasta la fluorescenza normalizzata del colorante reporter (R n ) per le sonde 

specifiche per l'allele del saggio SNP. Vedere “Lettura e analisi delle piastre” a pagina 6 

per una descrizione completa del plot. 




del plot 

Per l'esperimento di esempio, verificare che il Plot di discriminazione allelica visualizzi: 

• Cluster per i tre possibili genotipi (omozigote allele 1, omozigote allele 2 ed 

eterozigote allele 1/2) 

• Un cluster per i controlli negativi 

1. Nel pannello di navigazione, selezionare Allelic Discrimination Plot (Plot di 

discriminazione allelica). 

2. Selezionare C__11711420_30 dal menu SNP Assay (Saggio SNP). 

• Se viene abilitato l'Autocaller, il Plot di discriminazione allelica visualizza i 

simboli degli alleli per ogni campione valutato per l'SNP selezionato. 

I campioni vengono raggruppati nel plot come segue: 

Simbolo Vengono raggruppati sul… I genotipi dei campioni sono… 

● (rosso) Asse X del plot Omozigote per l'allele 1 del saggio SNP 

selezionato. 

● (blu) Asse Y del plot Omozigote per l'allele 2 del saggio SNP 

selezionato. 

● (verde) 

■ (nero) 

Nel mezzo tra i cluster 

omozigoti 

Angolo in basso a sinistra del 

plot 

Eterozigoti per entrambi gli alleli del saggio 

SNP selezionato (allele 1 e allele 2). 

Un controllo negativo. 

✕ (nero) Dovunque nel plot Indeterminati. 

• Qualora l'Autocaller sia non abilitato, il Plot di discriminazione allelica 

visualizza un simbolo a forma di X (✕ – Indeterminato) per ogni campione. 

3. Per ogni cluster nel plot: 

a. Fare clic e trascinare una casella intorno al cluster per selezionare i pozzetti 

assocati nel layout di piastra e nella tabella pozzetto. 

b. Verificare che i pozzetti voluti vengano selezionati nella tabella pozzetto. 

Ad esempio, nel caso venga selezionato il cluster nell'angolo in basso a sinistra 

del plot, è possibile selezionare unicamente i controlli negativi. La presenza tra 

i controlli negativi di un controllo negativo non noto può indicare la mancata 

riuscita dell'amplificazione del campione. 

Note 

70 






c. Ripetere i passaggi 3a e 3b per tutti gli altri cluster nel plot. 

Elemento 

Menu a discesa 

SNP Assay (Saggio 

SNP) 


Plot Type (Tipo di 

plot) 


Apply Call (Applica 

richiesta) 

Barra degli 

strumenti 

Legenda 

Descrizione 

Determina i dati del saggio SNP che il software StepOne 

visualizza nel plot. 

Determina il tipo di plot (cartesiano o polare) che il software 

StepOne utilizzerà per la visualizzazione dei dati. 

Quando un datapoint viene selezionato, questo menu consente 

l'assegnazione di una richiesta di un allele al datapoint all'interno 

dello scatterplot. 

Contiene strumenti per intervenire sullo scatterplot: 

• – Seleziona i datapoint facendo clic sui singoli datapoint 

oppure facendo clic e trascinando una casella intorno a un 

gruppo di datapoint. 

• – Seleziona i datapoint racchiudendoli in una 

circonferenza. 

• – Riposiziona lo scatterplot. 

• – Ingrandisce lo scatterplot. 

• – Rimpicciolisce lo scatterplot. 

Un chiarimento sui simboli presenti nello scatterplot. 

La figura qui di seguito indica il Plot di discriminazione allelica dell'esperimento di 

esempio. 

Note 




71



2 

3b 

3a 

Linee guida 

analisi 

Per analizzare il proprio esperimento: 

• Verificare che tutti i controlli presentino il genotipo corretto. 

• Nel caso si utilizzino controlli positivi, verificare le richieste per i controlli positivi: 

a. Nella tabella pozzetti, selezionare i pozzetti contenenti un controllo positivo 

per evidenziare i datapoint corrispondenti nel Plot di discriminazione allelica. 

b. Verificare che i datapoint per i controlli positivi siano raggruppati lungo l'asse 

appropriato del plot. Ad esempio, se viene selezionato l'allele 1 controllo 

positivo/allele 1, i controlli si raggrupperanno lungo l'asse X. 

c. Ripetere i passaggi a e b per i pozzetti contenenti gli altri controlli positivi. 

• Visualizzare il cluster dei controlli negativi per i campioni non noti la cui 

amplificazione sia non riuscita: 

a. Selezionare i datapoint del cluster nell'angolo in basso a sinistra del Plot di 

discriminazione allelica per selezionare le righe corrispondenti della tabella 

pozzetti. 

b. Verificare che i pozzetti selezionati nella tabella pozzetti siano controlli 

negativi e non campioni non noti. 

Note 

72 






• È possibile che i campioni raggruppati con i controlli negativi: 

– Non contengano DNA 

– Contengano inibitori della PCR 

– Siano omozigotici per una soppressione di sequenza 

• Verificare i risultati dei campioni non raggruppati in senso stretto o raggruppati con 

controlli negativi sottoponendoli nuovamente al test. 

• Se viene selezionato di eseguire reazioni di replicati, rivedere con cautela i gruppi di 

dati per gli outlier per verificare l'accuratezza delle richieste di genotipi. Se sono 

presenti outlier, verificare i risultati dei campioni associati sottoponendoli 

nuovamente al test. 

• Osservare il numero dei cluster nel plot. Se il Plot di discriminazione allelica 

contiene meno dei tre cluster di genotipi rappresentativi (eterozigotico, allele 1 

omozigotico e allele 2 omozigotico), è possibile che il software StepOne non abbia 

la capacità di eseguire la genotipizzazione dei campioni fino all'abilitazione della 

funzione 2-Cluster Calling. 

Se il plot contiene meno di tre cluster: 

a. Fare clic su Analysis Settings (Impostazioni di analisi). 

b. Fare clic su Edit Default SNP Assay Settings (Impostazioni modifica saggio 

SNP predefinito). 

c. Selezionare 2-Cluster Calling Enabled (2-Cluster Calling abilitata), quindi 

fare clic su Save Changes (Salva modifiche). 

d. Fare clic su Apply Analysis Settings (Applica impostazioni di analisi). 

e. Fare clic su Reanalyze (Rianalizza) per rianalizzare l'esperimento utilizzando 

la funzione 2-Cluster Calling. 

Nota: Le visualizzazioni dei risultati sono sincronizzate. Ad esempio, selezionando un 

pozzetto nel layout di piastra vengono selezionati i dati corrispondenti nella tabella 

pozzetti e nel Plot di discriminazione allelica. 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sul Plot di discriminazione allelica, accedere alla voce Help 

(Guida) del software StepOne facendo clic su o selezionando Help 


Note 




73


Visualizzazione del layout di piastra 


Rivedere i risultati dell'esperimento nel layout di piastra. Il layout di piastra visualizza 

l'impostazione specifica per il saggio e le proprietà di analisi per l'esperimento in un 

formato dei pozzetti corrispondente al tipo di piastra di reazione utilizzata per 

l'esecuzione. 



Per l'esperimento di esempio, verificare che il software StepOne abbia richiesto: 

• 6 campioni come omozigotici allele 1 (●) 

• 4 campioni come omozigotici allele 2 (●) 

• 12 campioni come eterozigotici (●) 

• 2 campioni come controlli negativi (■) 

Verificare che nessun pozzetto della piastra di reazione abbia attivato indicatori CQ. 

Visualizzazione 

del layout 

1. Fare clic sulla icona accanto al plot di discriminazione allelica per aumentare al 

massimo il layout di piastra. 

2. Fare clic su Show in Wells (Visualizza nei pozzetti), quindi selezionare o 

deselezionare un parametro da visualizzare con i pozzetti. 

3. Ripetere il passaggio 2 fino a quando il layout di piastra contenga tutti i parametri 

desiderati. 

Parametro 

Nome campione 

Operazione 

Nome saggio SNP 

ID saggio 

Allele 1 / Allele 2 

Coloranti allele 1 / 

Coloranti allele 2 

Colore saggio 

SNP 

Colore campione / 

Colore operazione 

Descrizione 

Il nome del campione applicato al pozzetto. 

L'operazione assegnata al pozzetto: 

• – Non nota 

• – Controllo negativo 

• – Controllo positivo 

Il nome dell'SNP valutato per il pozzetto. 

Il numero di ID del saggio dell'SNP valutato per il pozzetto. 

Il nome dell'allele associato per l'SNP valutato per il pozzetto. 

Il nome dei coloranti reporter e quencher dell'allele associato per l'SNP 

valutato per il pozzetto. 

Il colore dell'SNP valutato per il pozzetto. 

Il colore del campione o dell'operazione applicato al pozzetto. 

Note 

74 






Parametro 

Richiesta 

genotipo 

La richiesta di allele assegnata al campione: 

• ● Omozigotico 1/1 

• ● Omozigotico 2/2 

• ● Eterozigotico 1/2 

• ■ Controllo negativo 

• ✕ Indeterminata 

Descrizione 

Indicatore Il numero di indicatori attivati dal pozzetto come elencato nel simbolo ▲. 

La figura seguente indica il layout di piastra dell'esperimento di esempio di 


1 

2 

3 

Linee guida 

analisi 


• Il layout di piastra visualizza nell'angolo in basso a sinistra dei pozzetti 

omessi dall'utente; visualizza inoltre nell'angolo dei pozzetti omessi dalle 

impostazioni degli indicatori CQ. 

• Notare la posizione di alcuni campioni che attivano gli indicatori CQ (▲). La 

comprensione della posizione degli errori è di aiuto nella diagnosi di eventuali 

attività non riuscite. 

Note 




75



• È possibile selezionare l'intera piastra di reazione, alcune aree della piasra di 

reazione oppure pozzetti specifici: 

– Fare clic sull'angolo superiore sinistro della piastra di reazione per selezionare 

tutti i 48 pozzetti. 

– Fare clic sul tasto sinistro del mouse e trascinare attraverso l'area per effettuare la 

selezione. 

– Selezionare Sample (Campione), Target (Target) oppure Task (Operazione), 

dal menu Select Items (Seleziona voci) nella scheda View Plate (Visualizza 

piastra). Quindi selezionare il nome del campione, del target o dell'attività nel 

secondo menu Select Items (Seleziona voci) per selezionare pozzetti di un tipo 

specifico utilizzando lo strumento di selezione pozzetti. 

• È possibile regolare il layout di piastra: 

– Utilizzare i bottoni (Ingrandire), (Rimpicciolire) e (Adattare tutti) 

per aumentare o diminuire i pozzetti visualizzati. 

– Utilizzare le schede con freccia per espandere il layout di piastra fino a occupare 

l'intera schermata. 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sul layout di piastra accedere alla voce Help (Guida) del 

software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida)StepOne Help 

(Guida StepOne). 

Note 

76 





Visualizzazione tabella Well (Pozzetto) 


Rivedere i dettagli dei risultati dell'esperimento nella tabella pozzetti e identificare 

eventuali pozzetti con indicatori. La tabella pozzetti visualizza l'impostazione specifica 

per il saggio e le proprietà di analisi per l'esperimento in un formato tabella. 




della tabella 

Per l'esperimento di esempio, verificare che nessun pozzetto della piastra di reazione 

abbia attivato indicatori CQ. 

1. Selezionare la scheda View Well Table (Visualizza tabella pozzetto). 

2. Fare clic sull'intestazione della colonna Flag (Indicatore) per ordinare i dati in 

modo che i pozzetti che hanno attivato indicatori vengano visualizzati nella parte 

superiore della tabella. 

3. Verificare l'integrità dei controlli: 

a. Nel menu Group By (Raggruppa per), selezionare Task (Operazione) per 

organizzare le righe della tabella in base alla loro funzione sulla piastra di 

reazione. 

b. Verificare che ogni controllo non visualizzi indicatori ( ). 

c. Fare clic sulle icone – per eliminare i controlli negativi e positivi. 

4. Fare clic su > accanto alla tabella View Well (Visualizza pozzetto) per visualizzare il 

Plot di discriminazione allelica e la tabella pozzetti simultaneamente. 

La figura qui di seguito indica la tabella pozzetti dell'esperimento di esempio di 


1 

4 

3a 

2 

3c 

3c 

3c 

3b 

Pozzetto 

Omissione 

Colonna 

La posizione del pozzetto sulla piastra di reazione. 

Descrizione 

Un check mark indica che il pozzetto è stato rimosso dall'analisi. 

Indicatore Un indica che il pozzetto ha attivato il numero di indicatori elencati all'interno del simbolo. 

Nome campione 

Il nome del campione. 

Note 




77



Colonna 

Nome saggio SNP 

ID saggio 

Operazione 

Allele 1 / 2 

Colranti allele 1 / 2 

Allele 1 / 2 R n 

Rif pass 

Richiesta 

Qualità(%) 

Metodo 

Commenti 

Allele 1 / 2 C T 

Il nome del saggio SNP valutato per il pozzetto. 

Descrizione 

Il numero di ID del saggio dell'SNP valutato per il pozzetto. 

L'operazione assegnata al pozzetto (Non noto, controllo negativo o controllo positivo). 

Il nome dell'allele associato per l'SNP valutato per il pozzetto. 

Il nome dei coloranti reporter e quencher dell'allele associato per l'SNP valutato per il pozzetto. 

Segnale normalizzato (R n ) del colorante reporter dell'allele associato per l'SNP valutato per il pozzetto. 

Il segnale del colorante di riferimento passivo per il pozzetto. 

La richiesta di allele assegnata al campione, dove possibili richieste sono: 

• ● Omozigotico 1/1 – Omozigotico per l'allele 1 

• ● Omozigotico 2/2 – Omozigotico per l'allele 2 

• ● Eterozigotico 1/2 - Eterozigotico 

• ■ Controllo negativo 

• ✕ Indeterminata 

Il valore di qualità calcolato per la richiesta di genotipo. 

Il metodo utilizzato per assegnare la richiesta al campione (Auto se assegnato dal software StepOne 

oppure Manual se applicato da un utente). 

Commenti immessi per il pozzetto del campione associato. 

Ciclo soglia (C T ) del campione per l'allele associato per l'SNP valutato per il pozzetto. 

Colonne indicatori CQ 

La tabella pozzetti visualizza le colonne per gli indicatori CQ che sono attivati dai dati sperimentali. Se i dati dell'esperimento non 

attivano un indicatore CQ, il software StepOne non visualizza una colonna corrispondente per l'indicatore. 

Un ▲ in una delle seguenti colonne indica che il pozzetto associato ha attivato l'indicatore. 

BADROX 

Il pozzetto ha prodotto un segnale di riferimento passivo maggiore del limite definito nelle impostazioni 

di analisi. 

OFFSCALE Il pozzetto ha prodotto un livello di fluorescenza maggiore di quello misurabile dal Sistema StepOne . 

NOSIGNAL 

CLUSTER# 

PCFAIL 

SMCLUSTER 

AMPNC 

NOAMP 

Il pozzetto non ha prodotto un livello rilevabile di fluorescenza. 

Per l'SNP valutato per il pozzetto, il numero di cluster generati dai dati dell'esperimento è maggiore del 

limite definito nelle impostazioni di analisi. 

Il controllo positivo non produce un R n per l'allele associato maggiore del limite definito nelle 

impostazioni di analisi il che indica che l'amplificazione non è riuscita. 

Il numero dei datapoint nel cluster associato è minore del limite definito nelle impostazioni di analisi. 

Il pozzetto ha prodotto un R n maggiore del limite definito nelle impostazioni di analisi il che indica 

possibile amplificazione. 

Il pozzetto non ha prodotto un R n per l'allele maggiore del limite definito nelle impostazioni di analisi il 

che indica possibile mancata amplificazione. 

Note 

78 






Colonna 

Descrizione 

NOISE 

SPIKE 

EXPFAIL 

BLFAIL 

THOLDFAIL 

CTFAIL 

La fluorescenza di background (noise) prodotta dal pozzetto è maggiore di quella prodotta dagli 

altri pozzetti sulla piastra di reazione di un fattore maggiore del limite definito nelle impostazioni di 

analisi. 

Il Plot di amplificazione per il pozzetto contiene uno o più datapoint incompatibili con gli altri punti 

nel plot. 

Il software non è in grado di identificare la regione esponenziale del Plot di amplificazione per il 

pozzetto. 

Il software non è in grado di calcolare la linea di base più appropriata per i dati per il pozzetto. 

Il software non è in grado di calcolare una soglia per il pozzetto associato. 

Il software non è in grado di calcolare un ciclo soglia (C T ) per il pozzetto associato. 

Linee guida 

analisi 


• Nel caso si utilizzino controlli positivi, verificare anche l'integrità dei controlli 

positivi: 

a. Nel menu Group By (Raggruppa per), selezionare Task (Operazione) per 

organizzare le righe della tabella in base alla loro funzione sulla piastra di 

reazione 

b. Verificare che i controlli positivi non visualizzino indicatori (▲) e che la loro 

fluorescenza normalizzata del colorante reporter (R n ) sia appropriata per il 

genotipo (ad esempio, se si valuta l'allele 1/allele 1 di controllo positivo, è 

lecito attendere un aumento significativo dell'R n per la sonda dell'allele 1 e un 

aumento molto modesto per la sonda dell'allele 2). 

c. Ripetere il passaggio b per ogni controllo positivo. 

• Rivedere i dati per i campioni non noti. Per ogni riga che visualizza ▲ nella colonna 

indicatori, osservare i dati e gli indicatori attivati dal pozzetto associato. 

• Selezionare le aree della tabella o i pozzetti di un tipo specifico: 

– Facendo clic sul tasto sinistro del mouse e trascinando attraverso l'area per 

effettuare la selezione. 

– Selezionando Sample (Campione), Target o Task (Operazione) nel menu 

Select Items (Seleziona voci) nella scheda View Table (Visualizza tabella), quindi 

selezionando il nome del campione, del target o dell'operazione dal secondo 

menu Select Items (Seleziona voci) per selezionare i pozzetti di un tipo specifico 

utilizzando lo strumento di selezione pozzetti. 

• Raggruppare le righe del layout di piastra selezionando una opzione dal menu 

Group By (Raggruppa per). È possibile restringere o espandere l'elenco sia facendo 

clic sull'icona +/- posta accanto ai singoli elenchi sia facendo clic su 

Collapse All (Restringi tutti) o Expand All (Espandi tutti). 

Note 




79


Visualizzazione del riepilogo CQ 

• Omettere un pozzetto dall'analisi selezionando la casella di controllo Omit 

(Ometti) relativa a quel pozzetto. Per includere il pozzetto nell'analisi, 

deselezionare la casella di controllo Omit (Ometti). 

Nota: È necessario rianalizzare l'esperimento ogni volta si ometta o si includa un 

pozzetto. 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sulla tabella pozzetti accedere alla voce Help (Guida) del 




Rivedere il riepilogo degli indicatori CQ attivati dai dati dell'esperimento e risolvere i 

problemi relativi agli indicatori. Il riepilogo CQ visualizza una frequenza e una posizione 

per tutti gli indicatori CQ. Se un indicatore non compare nell'esperimento, la sua 

frequenza è 0. Se la frequenza non è 0, l'indicatore compare nella posizione del pozzetto 

elencata nella colonna posizioni. Facendo clic su un indicatore vengono visualizzati i 

dettagli relativi all'indicatore stesso, incluso un elenco di tutti i pozzetti con indicatori. 


dati dell'esempio 


del riepilogo 

Poichè l'esperimento di esempio non attiva alcun indicatore CQ (▲), la figura qui di 

seguito si riferisce a un esperimento diverso in cui i pozzetti che hanno attivato 

l'indicatore NOREPORTER. 

1. Nella colonna di navigazione, selezionare QC Summary (Riepilogo CQ). 

2. Rivedere il riepilogo indicatori e osservare il numero dei pozzetti che hanno attivato 

indicatori.. 

3. Nel riepilogo Flag Details (Dettagli indicatori), selezionare l'indicatore 

NOREPORTER. 

4. Rivedere le informazioni dettagliate visualizzate per l'indicatore NOREPORTER. 

5. Fare clic su View NOREPORTER Troubleshooting Information (Visualizza 

informazioni risoluzione problemi NOREPORTER) per visualizzare le 

informazioni relative alla risoluzione problemi per l'indicatore. 

La figura qui di seguito indica il riepilogo CQ per un esperimento di genotipizzazione 

con indicatori. 

Note 

80 






2 

3 

1 

4 

5 

Linee guida 

analisi 


• Selezionare ogni indicatore CQ nei Dettagli Indicatori con frequenza maggiore di 0, 

rivedere la frequenza e la posizione dei pozzetti che hanno attivato l'indicatore CQ, 

quindi fare clic sul link per la risoluzione problemi relativa all'indicatore. 

Nota: Quando viene selezionato un indicatore nella tabella Flag Details (Dettagli 

indicatori), la tabella pozzetti evidenzia i pozzetti che hanno attivato l'indicatore. 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sugli indicatori CQ, accedere alla voce Help (Guida) del 



Note 




81


Visualizzazione del Plot dei dati non elaborati 


Se necessario, rivedere il Plot dei dati non elaborate per rilevare le irregolarità negli 

spettri non elaborati acquisite dallo Strumento StepOne . 

Il Plot dei dati non elaborati visualizza l'ampiezza della fluorescenza non elaborata 

acquisita in ogni canale (da 1 a 3) durante il ciclo di esecuzione indicato dal cursore 

Show Cycle (Indica ciclo). Il plot visualizza gli spettri non elaborati per i pozzetti 

selezionati nel layout di piastra o nella tabella pozzetti. 




del plot 

Nell'esperimento di esempio, rivedere la schermata Raw Data Plot (Plot dati non 

elaborati) per osservare un aumento stabile del segnale (nessun cambiamento brusco o 

flessione) dal filtro appropriato. 

1. Nel pannello di navigazione, selezionare Raw Data Plot (Plot dati non 

elaborati). 

2. Nella tabella pozzetti, selezionare i pozzetti che si desidera ispezionare. 

3. Trascinare il cursore Show Cycle (Indica ciclo) per visualizzare modifiche 

temporali in ogni filtro del profilo dei dati non elaborati. 

I filtri del sistema StepOne sono: 

Filtro 1 2 3 

Colorante 

• Colorante FAM 

• Colorante SYBR ® 

Green 

• Colorante JOE • Colorante ROX 

• Colorante VIC ® 

Note 

82 






La figura qui di seguito indica i dati non elaborati dell'esperimento di esempio di 


1 

2 

3 

Linee guida 

analisi 

Per ulteriori 

informazioni 

Per analizzare il proprio esperimento, ricercare in ogni filtro: 

• Crescita caratteristica del segnale 

• Assenza di cambiamenti bruschi o flessioni 

Per ulteriori informazioni sul Plot dei dati non elaborati, accedere alla voce Help (Guida) 

del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida)StepOne Help 


Note 




83


Visualizzazione del Plot multicomponente 


Il Plot multicomponente visualizza il contributo spettrale completo di ogni colorante in 

un pozzetto selezionato per tutta la durata della sessione di analisi PCR. 



Visualizzazione 

del Plot 

multicomponente 

Nell'esperimento di esempio, rivedere il Plot multicomponente per: 

• Colorante ROX (riferimento passivo) 

• Colorante FAM (reporter) 

• Picchi, flessioni e/o cambiamenti repentini 

• Amplificazione nei pozzetti di controllo negativo 

1. Nella colonna di navigazione, selezionare Multicomponent Plot (Plot 

multicomponente). 

2. Selezionare un solo pozzetto nel layout di piastra per visualizzare i dati 

corrispondenti nel Plot multicomponente. 

3. Nel menu a discesa Plot Color (Colore plot), selezionare Dye (Colorante). 

4. Fare clic su Show/Hide the plot legend (Mostra/Nascondi la legenda del 

plot). 

5. Controllare i segnali dei coloranti FAM e VIC ® . Nell'esperimento di esempio, i 

segnali dei coloranti FAM e VIC ® aumentano durante il processo PCR, il che 

indica una amplificazione normale. 

6. Controllare il segnale del colorante ROX ® . Nell'esperimento di esempio, il segnale 

del colorante ROX si mantiene costante durante il processo PCR, il che indica dati 

tipici. 

7. Selezionare i pozzetti di controllo negativo uno alla volta e controllare 

l'amplificazione. Nell'esperimento di esempio, non è presente amplificazione nei 

pozzetti di controllo negativo. 

Note 

84 






3 

4 

2 

1 

5 

5 

6 

Linee guida 

analisi 

Per ulteriori 

informazioni 

Per analizzare il proprio esperimento, ricercare: 

• Riferimento passivo – Il livello di fluorescenza del colorante di riferimento passivo 

deve mantenersi relativamente costante durante il processo PCR. 

• Colorante reporter – Il livello di fluorescenza del colorante reporter deve 

visualizzare un'area piana in corrispondenza della linea di base, seguita da un rapido 

aumento della fluorescenza con il procedere dell'amplificazione. 

• Eventuali irregolarità nel segnale – Non devono essere presenti picchi, flessioni e/o 

cambiamenti repentini nel segnale fluorescente. 

• Pozzetti di controllo negativi – Non deve essere presente amplificazione nei pozzetti 

di controllo negativo. 

Per ulteriori informazioni sul Plot multicomponente accedere alla voce Help (Guida) del 



Note 




85


Visualizzazione Plot di amplificazione 


Nel caso siano stati acquisiti dati in tempo reale per l'esperimento, rivedere i dati di 

amplificazione per comprendere con maggiore chiarezza gli indicatori attivati dai dati 

dell'esperimento. 

La schermata Amplification Plot (Plot di amplificazione) visualizza l'amplificazione di 

tutti i campioni nei pozzetti selezionati. Utilizzare i plot di amplificazione per verificare i 

risultati dell'esperimento. 

• ∆Rn rispetto al ciclo – Il ∆R n è la grandezza del segnale di fluorescenza 

normalizzato generato dalla sessione di analisi PCR e dai dati relativi a esso viene 

calcolato il C T . Questo plot visualizza il ∆R n come funzione del numero di cicli. È 

possibile utilizzare questo plot per identificare ed esaminare l'amplificazione non 

regolare e per visualizzare i valori soglia e linea di base per la sessione di analisi. 

• Rn rispetto al ciclo – L'R n rappresenta la fluorescenza del colorante reporter 

normalizzata. Questo plot visualizza il R n come funzione del numero di cicli. È 

possibile utilizzare questo plot per l'identificazione e l'esame dell'amplificazione 

non regolare. 

• C T rispetto al pozzetto – Il ciclo soglia (C T ) è il numero di cicli PCR al quale il 

livello di fluorescenza raggiunge la soglia. Questo plot visualizza C T come funzione 

della posizione del pozzetto. È possibile utilizzare questo plot per localizzare 

l'amplificazione anomala (outlier). 

È possibile visualizzare ciascun plot con le seguenti modalità grafiche: lineare oppure 

log10. 

Nota: Per ulteriori informazioni sui Plot di amplificazione, fare riferimento alla Guida 

della chimica Real-Time PCR Systems Chemistry Guide oppure alla Guida software 

StepOne software Help. 




dei risultati 

Nell'esperimento di esempio, rivedere il Plot di amplificazione per: 

• Valori corretti della linea di base e della soglia 

• Outlier 

1. Nella colonna di navigazione, selezionare Amplification Plot (Plot di 

amplificazione). 

2. Nel Plot di amplificazione: 

a. Nel menu a discesa Plot Type (Tipo plot), selezionare ∆Rn rispetto al ciclo. 

b. Nel menu a discesa Color Plot By (Plot colore da), selezionare Well 

(Pozzetto). 

c. Fare clic su Show/Hide the plot legend (Mostra/Nascondi la legenda del 

plot). 

Note 

86 






3. Visualizzare i valori della linea di base: 

a. Nel menu a discesa Graph Type (Tipo grafico), selezionare Linear (Lineare). 

b. Selezionare Baseline (Linea di base) per visualizzare il ciclo di avvio e quello 

finale. 

c. Verificare che la linea di base sia impostata correttamente. 

4. Visualizzare i valori soglia: 

a. Nel menu a discesa Graph Type (Tipo grafico), selezionare Log 

(Logaritmico). 

b. Nel menu a discesa Target, selezionare C__11711420_30-A. 

c. Selezionare Threshold (Soglia) per visualizzare la soglia. 

d. Verificare che la soglia sia impostata correttamente. Nell'esperimento di 

esempio, la soglia si trova nella fase esponenziale. 

5. Localizzare eventuali outlier: 

a. Nel menu a discesa Plot Type (Tipo plot), selezionare C T vs Well (Ct rispetto 

al pozzetto). 

b. Verificare che i pozzetti dei replicati presentino amplificazioni simili. 

L'esperimento di esempio non utilizza i pozzetti dei replicati. 

Note 




87



2 

1 

Linee guida 

analisi 

Per analizzare il proprio esperimento, ricercare: 

• Valori linea di base e soglia corretti – Il software StepOne calcola 

automaticamente i valori della linea di base e della soglia ipotizzando che i dati 

presentino una curva di amplificazione tipica. Una curva di amplificazione tipica 

presenta: 

– Fase di plateau (a) 

– Fase lineare (b) 

– Fase esponenziale (geometrica) (c) 

– Background (d) 

– Linea di base (le linee di base non indicate vengono calcolate per ogni singola 

curva) 

Note 

88 






a 

b 

Soglie 

c 

∆R n 

d 

IMPORTANTE! È possibile che l'errore sperimentale (come contaminazione oppure 

errori di pipettaggio) possa produrre curve di amplificazione atipiche che generano 

calcoli errati dei valori della linea di base e della soglia eseguiti dal software 

StepOne . Quindi, dopo il completamento dell'analisi, Applied Biosystems 

raccomanda l'esame della schermata Amplification Plot (Plot di amplificazione) e la 

rivisualizzazione dei valori di linea di base e di soglia per ogni pozzetto. Per 

ulteriori informazioni, vedere la Guida software StepOne software Help. 

• Outlier 

Nel caso l'esperimento non sia conforme alle linee guida di cui sopra, risolvere il 

problema come segue: 

• Regolare manualmente la linea di base e/o la soglia (vedere la Guida software 

StepOne software Help). 

oppure 

• Omettere un pozzetto facendo clic sul pulsante destro sul pozzetto nel layout di 

piastra e selezionando Omit (Ometti). 

Note 




89



Come visualizzare plot multipli simultaneamente 

I plot multipli visualizzano fino a quattro plot per una analisi simultanea. È possibile 

visualizzare ogni plot singolarmente, due plot come righe o colonne oppure tutti i plot in 

una matrice 2 ✕ 2. 

Per rivedere i risultati nei plot multipli: 

1. Nella colonna di navigazione, selezionare Multiple Plots View (Visualizza 

plot multipli). 

2. Fare clic su per visualizzare due plot in parallelo. 

3. Nel plot superiore, selezionare Amplification Plot (Plot di amplificazione) (∆R n 

rispetto al ciclo) per visualizzare i risultati della sessione di amplificazione per 

ogni pozzetto selezionato nel layout di piastra. 

4. Nel plot inferiore, selezionare Raw Data Plot (Plot dei dati non elaborati) per 

visualizzare i dati non elaborati per ogni pozzetto selezionato nel layout di piastra. 

2 

3 

1 

4 

Note 

90 





Visualizzazione delle impostazioni di analisi 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sul Plot di amplificazione o sulla visualizzazione dei plot 

multipli accedere alla voce Help (Guida) del software StepOne facendo clic su o 



Nel caso non si sia soddisfatti della modalità con la quale il software StepOne richiede i 

genotipi o le soglie degli indicatori CQ, rivedere e regolare le impostazioni di analisi e/o 

le richieste come necessario. 



Modifica delle 

impostazioni di 

analisi 

Nell'esperimento di esempio, rivedere e regolare le impostazioni di analisi come 

desiderato per imparare le modalità in cui le impostazioni di richiesta, del C T e degli 

indicatori contribuiscono all'analisi dei dati di genotipizzazione. 

1. Nell'esperimento, fare clic su Analysis Settings (Impostazioni di analisi). 

2. Selezionare C__11711420_30 dalla tabella Select a SNP Assay (Seleziona un 

saggio SNP). 

3. Fare clic su Edit Default Settings (Modifica impostazioni predefinite). 

4. Nel caso siano state eseguite richieste manuali, selezionare Keep Manual Calls 

from Previous Analysis (Mantieni richieste manuali dall'analisi precedente) 

nella casella di dialogo Edit Default SNP Assay Settings (Modifica impostazioni 

saggi SNP predefinite). 

5. Nel campo Quality Value (Valore qualità), immettere un valore percentuale per 

applicarlo come intervallo di qualità per i campioni autocalling. A un valore 

maggiore corrisponde una richiesta di alleli più rigorosa. 

6. Fare clic su Save Changes (Salva modifiche) per salvare le impostazioni. 

7. Regolare le impostazioni del C T : 

a. Selezionare la scheda Ct Settings (Impostazioni Ct). 

b. Selezionare l'allele A dalla tabella Select an Allele (Seleziona un allele), quindi 

deselezionare Use Default Settings (Utilizza impostazioni predefinite), 

c. Deselezionare Automatic Threshold (Soglia automatica), quindi immettere 

un nuovo valore di soglia. 

d. Deselezionare Automatic Baseline (Linea di base automatica), quindi 

immettere nuovi valori della linea di base. 

e. Ripetere i passaggi 7b fino a 7d per l'allele C. 

Nota: Per ulteriori informazioni sull'impostazione dei cicli soglia per le 

esecuzioni di genotipizzazione, vedere la Guida software StepOne software 

Help. 

Note 




91



8. Regolare le impostazioni degli indicatori: 

a. Selezionare la scheda Flag Settings (Impostazioni indicatori). 

b. Nella colonna Use (Utilizza), selezionare la casella di controllo di ogni 

indicatore che si vuole abilitare. 

c. Regolare i valori per gli indicatori abilitati come necessario. 

d. Nel caso si desideri un indicatore CQ abilitato per omettere automaticamente i 

pozzetti che risultino positivi per le condizioni definite, selezionare la casella di 

controllo Reject Well (Rifiuta pozzetto) per l'indicatore. 

Nota: Gli indicatori CQ consentono di segnalare condizioni e omettere pozzetti in 

base a criteri ben definiti (ad esempio, quando un pozzetto presenta dati mancanti). 

Per ulteriori informazioni, vedere la Guida software StepOne software Help. 

9. Fare clic su Apply Analysis Settings (Applica impostazioni di analisi). 

10. Fare clic su Reanalyze (Rianalizza) per analizzare i dati utilizzando le nuove 

impostazioni. 

La figura qui di seguito indica le impostazioni di analisi per l'esperimento di esempio di 


Note 

92 






10 1 

7 

8 

3 

2 

4 

5 

6 9 

Linee guida 

analisi 

Per ulteriori 

informazioni 


• Nel caso l'esperimento consista in due soli cluster, attivare l'algoritmo di richiesta 2- 

Cluster selezionando 2-Cluster Calling Enabled (Richiesta 2-Cluster abilitata) 

dalla finestra di dialogo Edit Default SNP Assay Settings (Modifica impostazioni 

SNP predefinite). 

• Le impostazioni C T sono disponibili solo per esperimenti che includono dati di 

amplificazione. Gli esperimenti che consistono unicamente in letture pre-PCR e 

post-PCR non utilizzano il sistema del ciclo soglia (C T ) per l'analisi. 

• È possibile richiedere i dati dei campioni: 

– Automaticamente, utilizzando l'Autocaller (vedere pagina 94) 

– Manualmente, utilizzando la barra degli strumenti e lo scatterplot (vedere 

pagina 95) 

Per ulteriori informazioni sulle impostazioni di analisi, accedere alla voce Help (Guida) 

del software StepOne facendo clic su o selezionando Help (Guida)StepOne Help 


Note 




93



Assegnazione richieste automatica 


2. Selezionare il saggio SNP desiderato dalla tabella Select a SNP Assay (Seleziona un 

saggio SNP). 

3. Fare clic su Edit Default SNP Assay Settings (Modifica impostazioni saggio SNP 

predefinito). 

4. Nel caso siano state eseguite richieste automatiche, selezionare Keep Manual Calls 

from Previous Analysis (Mantieni le richieste manuali dalla precedente 

analisi). 

5. Selezionare Autocaller Enabled (Autocaller abilitato) per attivare l'analisi 

automatica. 

6. Se si prevede che i dati analizzati consistano unicamente in due cluster, selezionare 

Richiesta 2-Cluster abilitata. 

7. Nel campo Quality Value (Valore qualità), immettere un valore percentuale per 

applicarlo come intervallo di qualità per i campioni autocalling. (A un valore 

maggiore corrisponde una richiesta di alleli più rigorosa.) 

8. Fare clic su Save Changes (Salva modifiche) per salvare le impostazioni. 

9. (Opzionale) Assegnare gli indicatori: 


b. Assegnare gli indicatori come desiderato. 

Nota: Nella assegnazione degli indicatori, è possibile segnalare condizioni e 

omettere pozzetti in base a criteri ben definiti (ad esempio, quando un pozzetto 

presenta dati mancanti). Per ulteriori informazioni, vedere la Guida software 


c. Fare clic su Apply Analysis Settings (Applica impostazioni di analisi) per 

chiudere la finestra di dialogo Analysis Settings (Impostazioni di analisi). 


impostazioni. 

Note 

94 






Assegnazione richieste manuale 


2. Selezionare il saggio SNP desiderato dalla tabella Select a SNP Assay (Seleziona un 

saggio SNP). 

3. Specificare le impostazioni di analisi dell'evidenziatore: 

a. Fare clic su Edit Default SNP Assay Settings (Modifica impostazioni saggio 

SNP predefinito). 

b. Deselezionare l'Autocaller abilitato. 

c. Fare clic su Save Changes (Salva modifiche) per salvare le impostazioni. 

4. (Opzionale) Assegnare gli indicatori: 


b. Assegnare gli indicatori come desiderato. 

Nota: Nella assegnazione degli indicatori, è possibile segnalare condizioni e 

omettere pozzetti in base a criteri ben definiti (ad esempio, quando un pozzetto 

presenta dati mancanti). Per ulteriori informazioni, vedere la Guida software 


c. Fare clic su Apply Analysis Settings (Applica impostazioni di analisi). 


impostazioni. 

6. Nella colonna di navigazione, selezionare Allelic Discrimination Plot (Plot di 

discriminazione allelica). 

7. Selezionare un evidenziatore dal menu saggi SNP. Simboli a forma di X (✕ – 

Indeterminato) che rappresentano l'evidenziatore selezionato vengono visualizzati 

nel Plot di discriminazione allelica. 

8. Per assegnare richieste: 

a. Fare clic su (strumento di selezione). 

b. Fare clic-trascinare una casella intorno ai datapoint desiderati nel plot. 

c. Nel menu Apply Call (Applica richiesta), selezionare la richiesta desiderata. 

d. Ripetere i passaggi 8b e 8c per applicare le richieste ai datapoint rimanenti. 

9. Nel caso siano in atto richieste di assegnazione per SNP multipli, selezionare un 

evidenziatore differente dal menu a discesa dei saggi SNP e ripetere il passaggio 8. 

Note 




95


Pubblicazione dei dati 

Pubblicazione dei dati 

È possibile pubblicare i dati dell'esperimento in numerosi modi: 

• Salvare il plot come un file immagine 

• Stampare il plot 

• Stampare il layout di piastra 

• Creare diapositive 

• Stampare un rapporto 

• Esportare i dati 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sulla pubblicazione dei dati, accedere alla voce Help (Guida) 

del software StepOne facendo clic su oppure selezionando Help 


Note 

96 




Appendice A 

Flussi di lavoro degli esperimenti 

alternativi 

L'appendice comprende: 

■ Flusso di lavoro impostazione avanzata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 

■ Flusso di lavoro avvio rapido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 

■ Flusso di lavoro del templato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 

■ Flusso di lavoro esportazione/importazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 



PCR System premendo F1, facendo clic nella barra degli strumenti oppure 


Note 




97

Appendice A Flussi di lavoro degli esperimenti alternativi 

Flusso di lavoro impostazione avanzata 


Una volta acquisita familiarità con l'utilizzo del software StepOne , è possibile utilizzare 

il flusso di lavoro avanzato per creare esperimenti di genotipizzazione senza l'aiuto del 

Design Wizard. 

Informazioni 

sull'impostazione 

avanzata 

Come creare un 

esperimento 

L'impostazione avanzata consolida la maggior parte delle operazioni eseguite dal Design 

Wizard. L'impostazione avanzata consente di oltrepasare la maggior parte del Capitolo 2, 

che spiega come creare un esperimento utilizzando il Design Wizard. 

1. Nella schermata home del software StepOne , fare clic su sotto la 

colonna Setup (Imposta) 

2. Fare clic su Advanced Setup (Impostazione avanzata). 

3. Immettere le proprietà per l'esperimento di esempio: 

a. Fare clic sul campo Experiment Name (Nome esperimento), quindi 

immettere Genotyping Example (Esempio genotipizzazione). 

b. Fare clic sul campo Barcode (Codice a barre), quindi immettere Example 

(Esempio). 

c. Fare clic sul campo User Name (Nome utente) , quindi immettere Example 

User (Utente esempio). 

d. Fare clic sul campo Comments (Commenti), quindi immettere Genotyping 

Getting Started Guide (Guida introduttiva genotipizzazione). 

e. Selezionare Genotyping (Genotipizzazione) per il tipo di esperimento. 

f. Selezionare TaqMan ® Reagents (Reagenti TaqMan) per i reagenti. 

g. Selezionare Standard (~2 ore per il completamento di un'esecuzione) per la 


h. Selezionare Pre-PCR Read and Amplification (Lettura e amplificazione 

pre-PCR) per aggiungere le fasi al metodo di esecuzione. 

Note 

98 






3a 

3b 

3c 

3d 

3e 

3f 

3g 

3h 

4. Nella colonna di nvigazione, fare clic su Plate Setup (Imposta piastra). 

5. Creare il saggio rs8039 SNP al layout di piastra: 

a. Fare clic su Create New SNP Assay (Crea nuovo saggio SNP). 

b. Fare clic sul campo SNP Assay Name (Nome saggio SNP), immettere rs8039. 

c. Fare clic su OK. 

Note 




99



6. Impostare i non noti: 

a. Nel layout di piastra, selezionare le righe A e B. 

b. Nell'elenco SNP Assays (Saggi SNP), selezionare la casella di controllo Assign 

(Assegna) per il saggio SNP rs8039 per applicare il saggio ai pozzetti 

selezionati. 

c. Fare clic sul menu a discesa Task (Attività) per il saggio SNP rs8039, quindi 

selezionare Unknown (Non nota) per applicare l'attività ai pozzetti selezionati. 

7. Nel layout di piastra, selezionare i pozzetti A1 e A2. 

8. Fare clic sul menu a discesa Task (Attività) per il saggio SNP rs8039, quindi 

selezionare Negative Control (Controllo negativo) per applicare l'attività ai 

pozzetti selezionati. 

9. Creare e applicare i campioni al layout di piastra: 

a. Fare clic su Create New Sample (Crea nuovo campione) ripetutamente fino a 

quando l'elenco Samples (Campioni) contenga 20 campioni. 

b. Nel layout di piastra, selezionare il pozzetto A4. 

c. Selezionare la casella di controllo Assign (Assegna) per il campione 1 per 

applicare il saggio al campione nel pozzetto selezionato. 

d. Ripetere i passaggi da 9b a 9c per applicare i campioni come mostrato qui di 

seguito. 

Note 

100 






5 

7 

6b 

6c/8 

9b 

9a 

9c 

10. Nella colonna di navigazione, fare clic su Run Method (Metodo di 

esecuzione), quindi impostare il metodo di esecuzione: 

a. Fare clic sul volume/pozzetto di reazione, quindi immettere 25. 

b. Fare clic sulla lettura Pre-PCR (Fase di attesa), fare clic su Add Stage 

(Aggiungi fase), quindi selezionare Holding (Attesa). 

c. Selezionare la prima fase (50 °C/00:02:00) della nuova attesa, quindi fare clic 

su Delete Selected (Cancella selezionate) per cancellare la fase extra. 

d. Fare clic sul campo Number of Cycles (Numero di cicli) della fase ciclica, 

quindi immettere 50. 

e. Fare clic sull'impostazione della temperatura del primo passaggio della fase 

ciclica (95 °C/00:00:15), quindi immettere 92 °C. 

Note 




101



10a 

10b 

10c 

10d 

10e 

11. Fare clic su Save (Salva), quindi fare clic su Save (Salva) nella finestra di 

dialogo Save Experiment (Salva esperimento) per salvare l'esperimento col nome di 

Genotyping Example.eds. 

12. Preparare le reazioni come spiegato nel Capitolo 3, "Preparazione delle reazioni," a 

pagina 33. 

13. Eseguire l'esperimento come spiegato nel Capitolo 4, "Esecuzione 

dell'esperimento," a pagina 43. 

14. Analizzare l'esperimento come spiegato nel Capitolo 5, "Analisi dell'esperimento," 

a pagina 67. 

Note 

102 





Flusso di lavoro avvio rapido 


Quando viene creato un esperimento di genotipizzazione utilizzando l'avvio rapido, è 

possibile eseguire le reazioni sullo strumento senza immettere alcuna informazione di 

impostazione della piastra di reazione. 

Infomazioni 


di avvio rapido 


esperimento 

Il software StepOne include una modalità di avvio rapido che consente di oltrepassare 

gran parte del Capitolo 2. Nel caso le attività richieste per l'impostazione di un 

esperimento siano adeguate alle proprie esigenze, considerare l'utilizzo dell'avvio rapido 

per eseguire gli esperimenti immediatamente e modificare tali attività in seguito. 


pagina 33. 

2. Nella schermata Home, fare clic su QuickStart (Avvio rapido). 

3. Immettere le proprietà per l'esperimento di esempio: 

a. Fare clic sul campo Enter Experiment Name (Immetti nome esperimento), 

quindi immettere Genotyping Example (Esempio genotipizzazione). 

b. Selezionare Genotyping (Genotipizzazione) per il tipo di esperimento. 

c. Selezionare TaqMan ® Reagents (Reagenti TaqMan) per i reagenti. 

d. Selezionare Standard (~2 ore per il completamento di un'esecuzione) per la 


e. Selezionare Pre-PCR Read and Amplification (Lettura e amplificazione 

pre-PCR) per aggiungere le fasi al metodo di esecuzione. 

Note 




103



3a 

3b 

3c 

3d 

3e 

4. Selezionare la scheda Run Method (Metodo di esecuzione), quindi impostare il 

metodo di esecuzione: 

a. Fare clic sul volume/pozzetto di reazione, quindi immettere 25. 

b. Fare clic sulla lettura Pre-PCR (Fase di attesa), fare clic su Add Stage 

(Aggiungi fase), quindi selezionare Holding (Attesa). 

c. Selezionare la prima fase (50 °C/00:02:00) della nuova attesa, quindi fare clic 

su Delete Selected (Cancella selezionate) per cancellare la fase extra. 

d. Fare clic sul campo Number of Cycles (Numero di cicli) della fase ciclica, 

quindi immettere 50. 

e. Fare clic sull'impostazione della temperatura del primo passaggio della fase 

ciclica (95 °C/00:00:15), quindi immettere 92 °C. 

Note 

104 






4a 

4b 

4c 

4d 

4e 


pagina 33. 

6. Caricare le reazioni nel Sistema StepOne come spiegato in “Caricamento della 

piastra di reazione” a pagina 46. 

7. Nel software StepOne , fare clic su START RUN (AVVIA ESECUZIONE) . 

Mentre è in atto l'esecuzione da parte del Sistema StepOne , impostare il layout di 

piastra come spiegato nei passaggi 8 attraverso 13. 

8. Mentre è in atto l'esecuzione della piastra da parte del Sistema StepOne , fare clic 

su Plate Layout (Layout piastra) nella colonna di navigazione. 

9. Creare il saggio SNP rs8039 al layout di piastra: 

a. Fare clic su Create New SNP Assay (Crea nuovo saggio SNP). 

b. Fare clic sul campo SNP Assay Name (Nome saggio SNP), immettere rs8039. 

c. Fare clic su OK. 

Note 




105



10. Impostare i non noti: 

a. Nel layout di piastra, selezionare le righe A e B. 

b. Nell'elenco SNP Assays (Saggi SNP), selezionare la casella di controllo Assign 

(Assegna) per il saggio SNP rs8039 per applicare il saggio ai pozzetti 

selezionati. 

c. Fare clic sul menu a discesa Task (Attività) per il saggio SNP rs8039, quindi 

selezionare Unknown (Non nota) per applicare l'attività ai pozzetti selezionati. 

11. Nel layout di piastra, selezionare i pozzetti A1 e A2. 

12. Fare clic sul menu a discesa Task (Attività) per il saggio SNP rs8039, quindi 

selezionare Negative Control (Controllo negativo) per applicare l'attività ai 

pozzetti selezionati. 

13. Creare e applicare i campioni al layout di piastra: 

a. Fare clic su Create New Sample (Crea nuovo campione) ripetutamente fino a 

quando l'elenco Samples (Campioni) contenga 20 campioni. 

b. Nel layout di piastra, selezionare il pozzetto A4. 

c. Selezionare la casella di controllo Assign (Assegna) per il campione 1 per 

applicare il saggio al campione nel pozzetto selezionato. 

d. Ripetere i passaggi da 13a a 13c per applicare i campioni come mostrato qui di 

seguito. 

Note 

106 






9a 

11 

10b 

10c/ 

12 

13b 

13a 

13c 

14. Mentre è in atto il completamento dell'esecuzione da parte del Sistema StepOne , 

analizzare l'esperimento come spiegato nel Capitolo 5, "Analisi dell'esperimento," a 

pagina 67. 

Note 




107


Flusso di lavoro del templato 

Flusso di lavoro del templato 

Quando viene creato un templato per un esperimento, è possibile impostare molti 

esperimenti con le stesse informazioni di impostazione. 


templati degli 

esperimenti 


esperimento 

Il software StepOne consente la creazione di templati per la generazione degli 

esperimenti. I templati degli esperimenti sono utili come dispositivo di salvataggio 

temporale per gli esperimenti in cui i campioni vengono eseguiti su layout di piastra 

identici, utilizzando le stesse condizioni di esecuzione. 

1. Creare un esperimento come descritto nel Capitolo 2, "Disegno dell'esperimento," a 

pagina 13. 

2. Selezionare FileSave As Template (Salva con nome di templato), quindi fare 

clic su Save (Salva) nella finestra di dialogo Save Experiment (Salva esperimento) 

per salvare l'esperimento con nome di Genotyping Example.edt. 

3. Fare clic su Close (Chiudi). 

4. Creare un esperimento utilizzando il templato: 

a. Nella schermata Home, fare clic su , quindi fare clic 

su Template (Templato). 

b. Nella finestra di dialogo Open (Apri), selezionare il file Example 

Genotyping.edt, quindi fare clic su Open (Apri). 

c. Modificare l'esperimento utilizzando gli strumenti dell'impostazione avanzata. 

d. Dai file dell'elenco a discesa dei tipi, selezionare i file Experiment Document 

Template (*.edt). 

e. Fare clic su Save (Salva), immettere un nome per il file dell'esperimento, 

quindi fare clic su Save (Salva) per salvare l'esperimento. 


pagina 33. 




a pagina 67. 

8. Ripetere i passaggi 4 attraverso 7 come necessario per la creazione di più 

esperimenti dal templato. 

Note 

108 





Flusso di lavoro esportazione/importazione 


Quando viene creato un esperimento di genotipizzazione utilizzando un flusso di lavoro 

esportazione/importazione, è possibile impostare un nuovo esperimento utilizzando i dati 

esportati da altri esperimenti. 

Informazioni 


Importazione/ 

Esportazione 


esperimento 

Il software StepOne può importare disegni sperimentali dai file di testo ASCII 

contenenti informazioni di impostazione dell'esperimento nel formato di layout di piastra 

del software StepOne . La funzione importazione costituisce uno strumento utile quando 

vengono eseguiti esperimenti multipli poiché essa rende automatiche molte delle attività 

spiegate nel capitolo 2. 

1. Creare un esperimento come descritto nel Capitolo 2, "Disegno dell'esperimento," a 

pagina 13. 

2. Esportare le informazioni di impostazione mentre un esperimento è aperto: 

a. Selezionare FileExport (Esporta). 

b. Selezionare Setup (Imposta) nella scheda Export Properties (Proprietà di 

esportazione). 

c. Selezionare One File (Un solo file) nel menu a discesa. 

d. Selezionare (*.txt) nel menu a discesa File Type (Tipo file). 

e. Selezionare Open file(s) (Apri file) quando l'esportazione è completa. 

f. Fare clic su Start Export (Avvia esportazione), quindi fare clic su Close 

Export Tool (Chiudi strumento di esportazione) quando indicato. 

Note 




109



2b 

2c 

2d 

2e 

2f 

z 

3. Utilizzare il file esportato come un templato e creare l'impostazione di piastra 

desiderata: 

a. Utilizzando una applicazione con foglio elettronico (come il software 

Microsoft Excel ® ), aprire il file di testo esportato. 

b. Sostituire i parametri del file di testo come necessario. Una volta finito, salvare 

il file come un file di testo delimitato da tabulazioni. 

IMPORTANTE! È necessario formattare il file di testo secondo il layout di piastra 

del software StepOne . Per ulteriori informazioni sul formato del layout di piastra, 

accedere alla voce Help (Guida) facendo clic nella barra degli strumenti, oppure 

selezionando Help (Guida)Help Topics (Argomenti guida). 

4. Nel software StepOne , fare clic su al di sotto della colonna Setup 

(Imposta), quindi fare clic su Advanced Setup (Impostazione avanzata). 

5. Importare le informazioni di impostazione: 

a. Selezionare FileImport (Importa). 

b. Fare clic su Browse (Sfoglia), selezionare il file 

Genotyping_Example_data.txt, quindi fare clic su Select (Seleziona). 

c. Fare clic su Start Import (Avvia importazione). 

Note 

110 







pagina 33. 




a pagina 67. 

9. Ripetere i passaggi 3 attraverso 8 come necessario per la creazione di più 

esperimenti dal file esportato. 

Note 




111



Note 

112 




Bibliografia 

Afonina, I., Zivarts, M., Kutyavin, I., et al., 1997. Efficient priming of PCR with short 

oligonucleotides conjugated to a minor groove binder. Nucleic Acids Res. 25:2657–2660. 

Kutyavin, I.V., Lukhtanov, E.A., Gamper, H.B., and Meyer, R.B. 1997. Oligonucleotides 

with conjugated dihydropyrroloindole tripeptides: base composition and backbone 

effects on hybridization. Nucleic Acids Res. 25:3718–3723. 

Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false positives with PCR. Nature 

339:237–238. 

Lakowicz, J.R. 1983. Energy Transfer. In Principles of Fluorescence Spectroscopy, New 

York: Plenum Press 303–339. 

Lee, L. G., Connell, C. R., and Block, W. 1993. Allelic discrimination by nick-translation 

PCR with fluorogenic probes. Nucleic Acids Res. 21:3761–3766. 

Livak, K.J., Marmaro, J., and Todd, J.A. 1995. Towards fully automated genome-wide 

polymorphism screening [letter]. Nat. Genet. 9:341–342. 

Longo, M.C., Berninger, M.S., and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to 

control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125–128. 

Mullis, K.B. and Faloona, F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a 

polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155:335–350. 

Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al., 1985. Enzymatic amplification of ß-globin 

genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. 

Science 230:1350–1354. 




113

Bibliografia 

114 




Glossario 

acquisizione dati 

Processo durante la sessione analitica in cui un componente dello strumento rileva i dati 

sulla fluorescenza provenienti da ogni pozzetto della piastra di reazione. Lo strumento 

trasforma il segnale in dati elettronici e i dati vengono salvati nel file dell'esperimento. Un 

punto di acquisizione dati viene indicato da un'icona nel profilo termico: 

• Acquisizione dati attivata: 

• Acquisizione dati disattivata: 

agente bloccante 

IPC 

Reagente aggiunto alle reazioni PCR per bloccare l'amplificazione del controllo positivo 

interno (IPC). 

AIF Abbreviazione per File informazioni del saggio (AIF, Assay Information File). 

allele 

amplicone 

amplificazione 

Assay Mix 

Auto∆ 

Rispetto a un determinato target, ognuna delle diverse sequenze che si verificano nella 

popolazione. 

Segmento di DNA amplificato durante la PCR. 

Parte della sessione dello strumento durante la quale si verifica la PCR per la produzione 

dell'amplificazione del target. Per gli esperimenti di quantificazione, i dati sulla 

fluorescenza acquisiti durante l'amplificazione vengono visualizzati in un plot di 

amplificazione e utilizzati per calcolare i risultati. Se l'amplificazione viene inclusa nella 

sessione dello Strumento StepOne per la genotipizzazione o per gli esperimenti di 

presenza/assenza, i dati sulla fluorescenza acquisiti durante l'amplificazione vengono 

visualizzati in un plot di amplificazione ed è possibile utilizzarli per la risoluzione dei 

problemi. 

Componente della reazione PCR in TaqMan ® Gene Expression Assays e TaqMan ® SNP 

Genotyping Assays di Applied Biosystems consistente in primer disegnati per 

l'amplificazione di un target e una sonda TaqMan ® disegnata per il rilevamento 

dell'amplificazione del target. 

Impostazione per aumentare o diminuire la temperatura e/o il tempo ad ogni ciclo 

successivo in una fase ciclica. Quando Auto∆ è abilitato, le impostazioni vengono 

indicate da un'icona nel profilo termico: 

• Auto∆ attivato: 

• Auto∆ disattivato: 

calibratore 

calibrazione 

spaziale 

Vedere campione di riferimento. 

Tipo di calibrazione del Sistema StepOne in cui il sistema mappa le posizioni dei 

pozzetti nel blocco campione. I dati della calibrazione spirale vengono utilizzati in 

maniera tale che il software possa associare gli aumenti di fluorescenza durante una 

sessione analitica a pozzetti specifici nella piastra di reazione. 




115

Glossario 

campione 

campione di 

riferimento 

Campione o 

Standard (10✕) 

chimica 

Il templato in corso di test. 

In esperimenti con curva standard relativa e C T (∆∆C T ) comparativo, il campione viene 

utilizzato come base per i risultati di quantificazione relativa. Noto anche come 

calibratore. 

Componente della reazione visualizzato sulla scheda Reaction Mix Calculations (Calcoli 

miscela di reazione) della schermata Reaction Setup (Impostazione reazione). Il software 

presuppone che il campione o lo standard aggiunto alla miscela di reazione sia a una 

concentrazione 10✕. Ad esempio, se il volume della reazione è 20 µl, il volume calcolato 

del campione o dello standard per la reazione 1 è di 2 µl. 

Vedere reagenti. 

ciclo soglia Vedere ciclo soglia (C T ). 

ciclo soglia (C T ) 

coefficienti di 

regressione 

colorante 

colorante di 

sistema 

Il numero del ciclo PCR in cui il ∆R n incontra la soglia nel plot di amplificazione. 

Valori calcolati dalla linea di regressione nella curva standard, inclusi il valore R 2 , la 

pendenza e l'intercetta y. È possibile utilizzare i valori del coefficiente di regressione per 

valutare la qualità dei risultati provenienti dagli standard. Vedere anche curva standard. 

Reagente che contiene il colorante del sistema. I coloranti vengono utilizzati per eseguire 

una calibrazione di colorante sul Sistema StepOne . Vedere anche colorante del sistema. 

Colorante prodotto da Applied Biosystems e precalibrato sul Sistema StepOne . 

Coloranti di sistema: 

• Colorante FAM 

• Colorante JOE 

• Colorante ROX 

• Colorante SYBR ® Green 

• Colorante VIC ® 

colorante 

personalizzato 

Colorante non prodotto da AppliedBiosystems. È possibile utilizzare coloranti 

personalizzati per eseguire gli esperimenti PCR in tempo reale sul Sistema StepOne . 

Prima di utilizzare coloranti personalizzati, eseguire una calibrazione specifica per il 

colorante. 

IMPORTANTE! Applied Biosystems non raccomanda l'uso del colorante TAMRA 

come reporter o quencher con il Sistema StepOne . 

colore del target 

Colore assegnato a un target per identificare il target nel layout piastra e nei plot di analisi. 

116 




Glossario 

Concentrazione del 

campione diluito 

(10✕ per Miscela di 

reazione) 

configurazione colocata 

configurazione 

indipendente 

controllo endogeno 

controllo negativo 

(NC, Negative 

Control) 

controllo positivo 

controllo positivo 

interno (IPC) 

controllo senza 


(NAC, No 

Amplification 

Control) 

controllo senza 

templato (NTC, No 

Template Control) 

C T 

C T automatico 

Campo software visualizzato sulla scheda Sample Dilution Calculations (Calcoli 

diluizione campione) della schermata Reaction Setup (Impostazione reazione). Per questo 

campo, immettere la concentrazione del campione che si desidera utilizzare da 

aggiungere alla miscela di reazione per tutti i campioni nell'esperimento. “10✕ per 

Miscela di reazione” indica che il software presuppone che il componente campione o 

standard della miscela di rezione si trovi in concentrazione 10✕. Ad esempio, se la 

concentrazione del campione diluito è di 50,0 ng/µl (10✕), la concentrazione finale del 

campione nella reazione è di 5 ng/µl (1✕). 

Disposizione del sistema in cui lo Strumento StepOne è collegato direttamente a un 

computer co-locato dal cavo giallo del Sistema StepOne . In questa configurazione, lo 

Strumento StepOne viene controllato attraverso il software StepOne presente sul 

computer co-locato. 

Disposizione del sistema in cui lo Strumento StepOne non è collegato a un computer dal 

cavo giallo del Sistema StepOne . Viene invece utilizzata un'unità USB ( ) per il 

trasferimento dei dati tra i componenti del Sistema StepOne . In questa configurazione, 

lo Strumento StepOne viene controllato attraverso il touchscreen dello strumento stesso. 

Target che deve essere agli stessi livelli in tutti i campioni da testare. Utilizzato negli 

esperimenti con curva standard relativa e C T (∆∆C T ) comparativo per la normalizzazione 

dei segnali di fluorescenza per il target in corso di quantificazione. Noto anche come gene 

di riferimento. 

In esperimenti del Sistema StepOne , l'operazione assegnata ai target o ai saggi SNP in 

pozzetti che contengono acqua o buffer invece di un templato di campione. Nei pozzetti 

di controllo negativi non deve verificarsi alcuna amplificazione del target. 

Negli esperimenti di genotipizzazione, l'operazione per il saggio SNP nei pozzetti che 

contengono un templato di campione con un genotipo noto. 

Negli esperimenti di presenza/assenza, templato di DNA sintetico di piccole dimensioni 

che viene aggiunto alle reazioni della PCR. È possibile utilizzare l'IPC per distinguere tra 

i risultati negativi e le reazioni influenzate dagli inibitori della PCR, dall'impostazione 

errata del saggio o da un problema del reagente o dello strumento. 

Vedere pozzetti IPC bloccati a controllo negativo. 

Vedere controllo negativo (NC, Negative Control). 

Abbreviazione per ciclo soglia. 

Impostazione di analisi in cui il software calcola automaticamente la soglia e la linea di 

base nel plot di amplificazione. Il software utilizza la soglia e la linea di base per calcolare 

il ciclo soglia (C T ). 




117

Glossario 

C T manuale 

curva di 

dissociazione 

curva di melting 

curva standard 

Impostazione di analisi in cui viene immesso il valore soglia e viene selezionato se 

utilizzare calcoli con linea di base automatica o linea di base manuale. Il software utilizza 

il valore soglia immesso e la linea di base per calcolare il ciclo soglia (C T ). 

Vedere curva di melting. 

Visualizzazione dei dati acquisiti durante la fase della curva di melting. I picchi nelle 

curva di melting possono indicare la temperatura di melting (Tm) del target o possono 

identificare un'amplificazione della PCR non specifica. È possibile visualizzare la curva 

di melting come reporter normalizzato (R n ) rispetto alla temperatura o come reporter 

derivativo (−R n ′) rispetto alla temperatura. 

Negli esperimenti con curva standard e curva standard relativa: 

[1] La linea meglio adeguata in un plot dei valori C T provenienti dalle reazioni standard 

riportate rispetto alle quantità standard. Vedere anche linea di regressione. 

[2] Un set di standard contenenti un range di quantità note. I dati provenienti dalle 

reazioni di curva standard vengono utilizzati per la generazione della curva standard. La 

curva standard viene definita dal numero di punti nelle serie, dal numero dei replicati 

standard, dalla quantità di partenza e dal fattore seriale. Vedere anche serie di diluizioni 

standard. 

delta R n (∆R n ) 

design wizard 

diluente 

DNA campione 

(10✕) 

EFF% 

efficienza di 


(EFF%) 

Abbreviazione per reporter normalizzato baseline-corrected. 

Funzione del software StepOne che aiuta nell'impostazione di un esperimento, 

indicando le migliori scelte da eseguire dal momento dell'immissione del disegno 

dell'esperimento. 

Reagente utilizzato per la diluizione di un campione o di uno standard prima di 

aggiungerlo alla reazione della PCR. Può essere rappresentato da acqua o da un buffer 

(soluzione tampone). 

Componente della reazione visualizzato sulla schermata Reaction Setup (Impostazione 

reazione). Il software presuppone che il DNA del campione aggiunto alla miscela di 

reazione sia a una concentrazione 10✕. Ad esempio, se il volume della reazione è 20 µl, 

il volume calcolato del campione per la reazione 1 è di 2 µl. 

Vedere efficienza di amplificazione (EFF%). 

Calcolo dell'efficienza dell'amplificazione della PCR. L'efficienza di amplificazione 

viene calcolata utilizzando la pendenza della linea di regressione nella curva standard. 

Una pendenza vicina a −3,3 indica un'efficienza di amplificazione PCR ottimale, del 

100%. Fattori che influenzano l'efficienza di amplificazione: 

• Range delle quantità degli standard - Per misurazioni dell'efficienza più accurate 

e precise, utilizzare un range di quantità degli standard ampio, da 5 a 6 log (da 10 5 a 

10 6 volte). 

• Numero di replicati degli standard- Per misurazioni dell'efficienza più accurate, 

includere i replicati per diminuire gli effetti delle inesattezze relative al pipettaggio. 

• Inibitori della PCR - La presenza di inibitori della PCR nella reazione può ridurre 

l'efficienza di amplificazione. 

118 




Glossario 

esperimento 

Si riferisce all'intero processo di esecuzione di una sessione utilizzando il Sistema 

StepOne , includendo impostazione, esecuzione e analisi. I tipi di esperimenti eseguibili 

utilizzando il Sistema StepOne sono: 

• Quantificazione – curva standard 

• Quantificazione – curva standard relativa 

• Quantificazione - C T comparativo (∆∆C T ) 

• Curva di melting 

• Genotipizzazione 

• Presenza/assenza 

esperimento endpoint 

fase 

fase ciclica 

fase della curva di 

melting 

fase di sosta 

fattore di diluizione. 

fattore seriale 

file informazioni del 

saggio (AIF, Assay 

Information File) 

forward primer 

gene di riferimento 

gruppo di replicati 

ID refSNP 

Esperimento in cui i dati sulla fluorescenza acquisiti in una lettura post-PCR vengono 

utilizzati per calcolare i risultati per gli esperimenti di genotipizzazione o di 

presenza/assenza. 

Componente del profilo termico. Una fase consiste di uno o più passaggi. 

Fase nel profilo termico che viene ripetuta. Se per eseguire la PCR viene utilizzata la fase 

ciclica, questa viene denominata fase di amplificazione. 

Fase nel profilo termico con un incremento della temperatura per la generazione di una 

curva di melting. 

Fase nel profilo termico che include uno o più passaggi. È possibile, ad esempio, 

aggiungere una fase di sosta al profilo termico per attivare enzimi, inattivare enzimi o 

incubare una reazione. 

Vedere fattore seriale. 

Valore numerico che definisce la sequenza delle quantità nella curva standard. Il fattore 

seriale e la quantità di partenza vengono utilizzati per il calcolo della quantità standard 

per ogni punto nella curva standard. Ad esempio, se la curva standard viene definita con 

un fattore seriale di 1:10 o 10, la differenza tra 2 punti adiacenti nella curva viene 

decuplicata. 

File dati su CD spedito insieme a ogni ordine di saggi. Il nome del file include il numero 

del codice a barre presente sulla piastra. Le informazioni presenti nell'AIF sono fornite in 

un formato delimitato da tabulazioni. 

Oligonucleotide all'estremità 5′ del target. Reverse primer e forward primer vengono 

utilizzati insieme nelle reazioni PCR per l'amplificazione del target. 

Vedere controllo endogeno. 

Set di reazioni identiche in un esperimento. 

Numero che identifica il numero ID del cluster di riferimento SNP (refSNP). Generato dal 

Single Nucleotide Polymorphism Database of Nucleotide Sequence Variation (dbSNP). 

Può essere utilizzato per ricercare nello Store di Applied Biosystem un SNP Genotyping 

Assay di Applied Biosystems Noto anche come Numero rs. 




119

Glossario 

ID saggio Valore assegnato da Applied Biosystems a TaqMan ® Gene Expression Assays e TaqMan ® 

SNP Genotyping Assays. 

impostazione 

avanzata 

intercetta y 

IPC 

IPC bloccato 

IPC+ 

layout piastra 

lettura end-point 

lettura post-PCR 

lettura pre-PCR 

libreria campioni 

Funzione in software StepOne che consente l'impostazione degli esperimenti in base al 

proprio disegno. 

Coefficiente di regressione calcolato dalla linea di regressione nella curva standard. L' 

intercetta y indica il ciclo soglia (C T ) atteso per un campione con quantità uguale a 1 (ad 

esempio, 1 ng/µl). 

Abbreviazione per controllo positivo interno (IPC, Internal Positive Control) Inoltre, in 

esperimenti di presenza/assenza, l'operazione per il target IPC nei pozzetti che 

contengono un templato IPC. 

In esperimenti di presenza/assenza, l'operazione assegnata al target IPC in pozzetti che 

contengono un'agente bloccante IPC invece di un templato di campione. Vedere anche 

pozzetti IPC bloccati a controllo negativo. 

Richiesta di presenza/assenza quando il controllo positivo interno (IPC) è riuscito. 

Illustrazione della griglia di pozzetti 6 × 8 del contenuto assegnato nella piastra di 

reazione. Nel software, è possibile utilizzare il layout piastra come strumento di selezione 

per assegnare il contenuto dei pozzetti, per visualizzare le assegnazione dei pozzetti e per 

visualizzare i risultati. Il layout piastra viene visualizzato nelle schermate del Design 

Wizard, in quelle di Advanced Setup (Impostazioni avanzate) e in quelle delle esecuzioni 

e delle analisi. Il layout piastra può essere stampato, incluso in un report, esportato e 

salvato come slide per una presentazione. 

Vedere lettura post-PCR. 

Utilizzata negli esperimenti di genotipizzazione e di presenza/assenza, la parte della 

sessione analitica dello strumento che si verifica dopo l'amplificazione. Negli esperimenti 

di genotipizzazione, i dati sulla fluorescenza acquisiti durante la lettura post-PCR 

vengono visualizzati nel plot di discriminazione allelica e utilizzati per fare richieste di 

alleli. Negli esperimenti di presenza/assenza, i dati sulla fluorescenza acquisiti durante la 

lettura post-PCR vengono visualizzati nel plot di presenza/assenza e utilizzati per fare 

richieste di rilevamento. Chiamata anche lettura end-point. 

Utilizzata negli esperimenti di genotipizzazione e di presenza/assenza, la parte della 

sessione analitica dello strumento che si verifica prima dell'amplificazione. I dati sulla 

fluorescenza acquisiti durante la lettura pre-PCR vengono utilizzati per normalizzare i 

dati sulla fluorescenza post-lettura. 

Acquisizione di campioni nel software StepOne . La libreria campioni contiene il nome 

e il colore del campione. 

libreria saggi SNP Acquisizione di saggi SNP nel software StepOne . 

libreria target Acquisizione di target nel software StepOne . 

120 




Glossario 

linea di base 

linea di base 

automatica 

linea di base 

manuale 

linea di regressione 

metodo C T 

comparativo (∆∆C T ) 

metodo della curva 

standard 

metodo della curva 

standard relativa 

metodo di 

esecuzione 

metodo di 

quantificazione 

miscela di primer 

miscela di reazione 

miscela 

primer/sonda 

Nel plot di amplificazione, linea adeguata ai livelli di fluorescenza per un range definito 

di cicli. In caso di utilizzo dell'impostazione di analisi con linea di base manuale, per la 

determinazione della linea di base Applied Biosystem raccomanda di selezionare cicli 

precoci della PCR. 

Impostazione di analisi in cui il software calcola i valori di inizio e di fine della linea di 

base per il plot di amplificazione. Il software utilizza la linea di base e la soglia per 

calcolare il ciclo soglia (C T ). 

Impostazione di analisi in cui vengono immessi i valori di inizio e di fine della linea di 

base per il plot di amplificazione. Il software utilizza la linea di base e la soglia per 

calcolare il valori del C T . 

Negli esperimenti con curva standard e curva standard relativa, la migliore linea adeguata 

alla curva standard. Formula della linea di regressione: 

C T = m [log (Qtà)] + b 

dove m rappresenta la pendenza, b l'intercetta y e Qtà la quantità standard. 

Vedere anche coefficienti di regressione. 

Metodo di quantificazione per esperimenti di quantificazione. Con il metodo C T 

comparativo (∆∆C T ), vengono utilizzati i risultati provenienti da un campione di 

riferimento e da un controllo endogeno per determinare le quantità relative di un target 

nei campioni. 

Metodo di quantificazione per esperimenti di quantificazione. Con il metodo della curva 

standard, vengono utilizzati i risultati provenienti dagli standard per determinare le 

quantità relative di un target nei campioni. 

Metodo di quantificazione per esperimenti di quantificazione. Con il metodo della curva 

standard relativa, vengono utilizzati i risultati provenienti dagli standard, da un campione 

di riferimento e da un controllo endogeno per determinare le quantità relative di un target 

nei campioni. 

Definizione del volume della reazione e del profilo termico per la sessione analitica dello 

strumento. 

Con gli esperimenti di quantificazione, il metodo utilizzato per determinare la quantità di 

target nei campioni. Per gli esperimenti di quantificazione, esistono tre tipi di metodi di 

quantificazione disponibili: curva standard, C T comparativo (∆∆C T ) e curva standard 

relativa. 

Componente della reazione PCR contenente il forward primer e il reverse primer 

disegnati per amplificare il target. 

Soluzione contenente tutti i componenti necessari per eseguire la reazione PCR, ad 

eccezione del templato (campione, standard o controllo). 

Componente della reazione PCR che consiste nei primer disegnati per amplificare il target 

e una sonda TaqMan ® disegnata per rilevare l'amplificazione del target. 




121

Glossario 

miscela sonda 

monitoraggio 

remoto 

nome 


numero rs 

ometti pozzetto 

operazione 

Componente della reazione PCR contenente una sonda TaqMan ® disegnata per rilevare 

l'amplificazione del target. 

Funzione software che consente la visualizzazione dello stato di uno strumento in rete, 

l'invio di esperimenti allo strumento e il download degli esperimenti eseguiti al proprio 

computer. 

Immesso durante l'impostazione dell'esperimento, il nome che viene utilizzato per 

identificare l'esperimento. I nomi degli esperimenti non possono superare i 100 caratteri 

e non possono includere alcuno dei seguenti caratteri: slash (/), backslash (\), maggiore di 

(>), minore di (

Glossario 

Plot di 


Visualizzazione dei dati acquisiti durante la fase ciclica dell'amplificazione della PCR. È 

visualizzabile come: 

• Reporter normalizzato baseline-corretcted (∆R n ) rispetto al ciclo 

• Reporter normalizzato (R n ) rispetto al ciclo 

• Ciclo soglia (C T ) rispetto al pozzetto 

Plot di 

discriminazione 

allelica 

Plot 

multicomponente 

pozzetti IPC a 

controllo negativo 

pozzetti IPC 

bloccati a controllo 

negativo 

profilo termico 

punto 

quantità 

quantità di partenza 

quantità 

normalizzata 

quantità standard 

Visualizzazione dei dati acquisiti durante la lettura post-PCR. Il plot di discriminazione 

allelica è una manifestazione grafica del segnale del reporter normalizzato proveniente 

dalla sonda dell'allele 1, riportato rispetto al segnale del reporter normalizzato 

proveniente dalla sonda dell'allele 2. 

Visualizzazione dei dati acquisiti durante la fase ciclica della PCR in tempo reale. Il plot 

multicomponente mostra la fluorescenza per tutti i cicli nella sessione analitica. 

In esperimenti di presenza/assenza, i pozzetti che contengono un templato IPC e buffer o 

acqua invece di un templato di campione nella reazione PCR. Solo il templato IPC 

dovrebbe amplificarsi nei pozzetti IPC a controllo negativo, in quanto la reazione non 

contiene templato di campione. Vedere anche IPC+. 

In esperimenti di presenza/assenza, i pozzetti che contengono agente bloccante IPC 

invece di un templato di campione nella reazione PCR. Nei pozzetti IPC bloccati a 

controllo negativo non deve verificarsi alcuna reazione di amplificazione in quanto la 

reazione non contiene alcun templato di campione e l'amplificazione dell'IPC è bloccata. 

Chiamati anche Controllo senza amplificazione (NAC, No Amplification Control) 

Parte del metodo di esecuzione che specifica temperatura, tempo, rampa e punti di 

acquisizione dati per tutti i passaggi e le fasi della sessione analitica dello strumento. 

Uno standard in una curva standard. La quantità di standard per ogni punto nella curva 

standard viene calcolato in base alla quantità di partenza e al fattore seriale. 

Negli esperimenti di quantificazione, la quantità di target presente nei campioni. La 

quantità assoluta può riferirsi al numero di copie, alla massa, alla molarità o alla carica 

virale. La quantità relativa si riferisce a n volte la differenza tra la quantità normalizzata 

di target nel campione e la quantità normalizzata di target nel campione di riferimento. 

Quando viene definita una curva standard o una serie di diluizioni standard, corrisponde 

alla quantità maggiore o minore. 

Quantità di target divisa per la quantità di controllo endogeno. 

Quantità nota nella reazione PCR. 

Per gli esperimenti con curva standard, la quantità nota di target. Le unità per la quantità 

standard possono essere per la massa, il numero di copie, la carica virale o altre unità per 

la misurazione della quantità di target. 

Per gli esperimenti con curva standard relativa, quantità nota nello standard. Ad esempio, 

la quantità nota può riferirsi alla quantità di cDNA o alla quantità di stock. Le unità non 

sono rilevanti per gli esperimenti di curva standard relativa in quanto si annullano nei 

calcoli. 




123

Glossario 

quencher 

Molecola legata all'estremità 3′ delle sonde TaqMan ® per impedire che il reporter emetta 

un segnale fluorescente quando la sonda è intatta. Con i reagenti TaqMan ® , è possibile 

utilizzare come quencher il quencher non fluorescente-minor groove binder (NFQ- 

MGB). Con i reagenti SYBR Green, non viene utilizzato alcun quencher. 

IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'uso del colorante TAMRA come 

reporter o quencher con il Sistema StepOne . 

quencher non 

fluorescente-minor 

groove binder 

(NFQ-MGB) 

QuickStart (Avvio 

rapido) 

rampa 

reagenti 

Molecole legate all'estremità 3′ delle sonde TaqMan ® . Quando la sonda è intatta, il 

quencher non fluorescente (NFQ) impedisce l'emissione del segnale di fluorescenza al 

colorante del reporter. L'NFQ non è fluorescente e quindi, producendo minori segnali di 

background, porta a una migliore precisione nella quantificazione. La minor groove 

binder (MGB) aumenta la temperatura di melting (Tm) senza aumentare la lunghezza 

della sonda. Consente inoltre il disegno di sonde più corte. 

Funzione software StepOne che consente l'esecuzione dell'esperimento senza immettere 

le informazioni relative alle impostazioni della piastra. 

La velocità con cui cambia la temperatura durante la sessione analitica dello strumento. 

Ad eccezione del passaggio della curva di melting, la rampa viene definita da valore 

percentuale. Per il passaggio della curva di melting, la rampa viene definita da un 

incremento di temperatura. Nella visualizzazione grafica del profilo termico, la rampa 

viene indicata da una linea diagonale. 

I componenti della reazione PCR che vengono utilizzati per amplificare il target e per 

rilevare l'amplificazione. Tipi di reagenti utilizzati sul Sistema StepOne : 

• Reagenti TaqMan ® 

• Reagenti SYBR ® Green 

• Altri reagenti 

Reagenti SYBR ® 

Green 

Reagenti TaqMan ® 

reazione 

campione/saggio 

SNP 

reazione 

campione/target 

replicati 

reporter 

Componenti della reazione PCR che consistono in due primer disegnati per amplificare il 

target e un colorante SYBR ® Green per il rilevamento del DNA a doppia elica. 

Componenti della reazione PCR che consistono nei primer disegnati per amplificare il 

target e una sonda TaqMan ® disegnata per il rilevamento dell'amplificazione del target. 

Combinazione di campione e saggio SNP in una reazione PCR. Ogni reazione PCR può 

contenere un solo campione e un solo saggio SNP. 

Combinazione di campione e saggio target in una reazione PCR. Nel Design Wizard, ogni 

reazione PCR può contenere un solo campione e un solo saggio target. 

Numero totale di reazioni identiche contenenti componenti identici e volumi identici. 

Colorante fluorescente utilizzato per rilevare l'amplificazione. Se si utilizzano reagenti 

TaqMan ® , il colorante reporter viene collegato all'estremità 5′. Se si utilizzano reagenti 

SYBR ® Green, il colorante reporter è il colorante SYBR ® Green. 

124 




Glossario 

reporter derivativo 

(−R n ′) 

reporter 

normalizzato (Rn) 

Reporter 

normalizzato 

baseline-corretcted 

(∆R n ) 

reverse primer 

riferimento passivo 

rifiuta pozzetto 

R n 

saggi inventariati 

saggi prodotti su 

richiesta 

saggio 

saggio SNP 

sconosciuti 

serie 

Visualizzato nell'asse y della curva di melting. Il segnale di reporter derivativo è il primoderivativo 

negativo della fluorescenza normalizzata proveniente dal reporter. 

Segnale della fluorescenza proveniente dal colorante del reporter, normalizzato al segnale 

della fluorescenza del riferimento passivo. 

La grandezza del segnale di fluorescenza normalizzato generato dal reporter durante 

l'amplificazione della PCR. 

∆R n = R n (end-point) − R n (linea di base), dove R n = reporter normalizzato. 

Oligonucleotide all'estremità 3′ del target. Reverse primer e forward primer vengono 

utilizzati insieme nelle reazioni PCR per l'amplificazione del target. 

Colorante che produce un segnale fluorescente. Dal momento che il segnale di riferimento 

passivo deve essere uniforme per tutti i pozzetti, viene utilizzato per normalizzare il 

segnale del colorante del reporter per rispondere delle fluttuazioni di fluorescenza 

provocate dalle differenze minori in concentrazioni o volume esistenti da pozzetto a 

pozzetto. La normalizzazione al segnale di riferimento passivo consente una elevata 

precisione dei dati. 

Azione eseguita dal software durante l'analisi per rimuovere uno o più pozzetti 

dall'esecuzione di ulteriori analisi se al pozzetto è applicato un indicatore specifico. 

Abbreviazione per reporter normalizzato. 

TaqMan ® Genomic Assays prodotti precedentemente, che hanno passato le specifiche del 

controllo di qualità e sono conservati nell'inventario. 

TaqMan ® Genomic Assays che vengono prodotti al momento dell'ordine. Solo i saggi che 

superano le specifiche del controllo di qualità della produzione vengono spediti. 

Nel Sistema StepOne , una reazione PCR che contiene i primer per l'amplificazione di 

un target e un reagente per il rilevamento del target amplificato. 

Utilizzato negli esperimenti di genotipizzazione, reazione PCR che contiene i primer per 

l'amplificazione di un SNP e due sonde per il rilevamento di alleli diversi. 

Negli esperimenti di quantificazione, l'operazione per il target nei pozzetti che 

contengono un templato di campione con quantità target sconosciute. 

Negli esperimenti di genotipizzazione, l'operazione per il saggio SNP nei pozzetti che 

contengono un templato di campione con un genotipo sconosciuto. 

Negli esperimenti di presenza/assenza, l'operazione per il target nei pozzetti che 

contengono un templato di campione in cui la presenza del target non è nota. 

Vedere serie di diluizioni standard. 




125

Glossario 

serie di diluizioni 

standard 

SNP 

soglia 

standard 

target 

temperatura di 

melting (Tm) 

templato 

Negli esperimenti con curva standard e curva standard relativa, un set di standard 

contenenti un range di quantità note. La serie di diluizioni standard viene preparata da 

standard diluiti serialmente. Ad esempio, lo soluzione standard stock viene utilizzata per 

preparare il primo punto di diluizione, il primo punto di diluizione viene utilizzato per 

preparare il secondo punto di diluizione e così via. I volumi necessari per la preparazione 

di una serie di diluizioni standard vengono calcolati dal numero di punti di diluizione, dal 

numero dei replicati standard, dalla quantità di partenza, dal fattore seriale e dalla 

concentrazione standard nello stock. Vedere anche curva standard. 

Abbreviazione per polimorfismo di un singolo nucleotide (SNP, Single Nucleotide 

Polymorphism) L'SNP può consistere nella differenza di una base o in un indel (da 

insertion/deletion, cioè inserimento/soppressione) 

Il livello di fluorescenza al di sopra della linea di base ed entro l'area di crescita 

esponenziale del plot di amplificazione. È possibile determinare la soglia 

automaticamente (vedere C T automatico) o impostarla manualmente (vedere C T 

manuale). 

Campione che contiene quantità di standard note. Le reazioni standard vengono utilizzate 

negli esperimenti di quantificazione per la generazione di curve standard. Vedere anche 

curva standard e serie di diluizioni standard. 

La sequenza di acido nucleico che si desidera amplificare e rilevare. 

Punto nella curva di melting in cui i livelli della fluorescenza raggiungono il picco, ad 

indicare che il DNA a doppia elica amplificato si dissocia in DNA a singola elica. 

Tipo di acido nucleico da aggiungere alla reazione PCR. Il templato raccomandato varia 

in base al tipo di esperimento. 

tipo di esperimento Tipi di esperimenti in esecuzione utilizzando il Sistema StepOne : 

• Curva standard 

• C T comparativo (∆∆C T ) 

• Curva standard relativa 

• Curva di melting (non disponibile nel Design Wizard) 

• Genotipizzazione 

• Presenza/assenza 

Il tipo di esperimento selezionato influenza le schermate di impostazione, di esecuzione 

e di analisi. 

Tm 

touchscreen 

trascrittasi inversa 

Abbreviazione per temperatura di melting (Tm). 

Display a sfioramento dello strumento per il controllo dello strumento stesso. 

Componente della reazione PCR che converte l'RNA in cDNA. La trascrittasi inversa 

viene aggiunta alla reazione PCR per eseguire il passaggio 1 della RT-PCR. 

126 




Glossario 

Valore R 2 

velocità di rampa 

Coefficiente di regressione calcolato dalla linea di regressione nella curva standard. Il 

valore R 2 indica la vicinanza di accordo tra la linea di regressione della curva standard e 

i datapoint del C T individuale provenienti dalle reazioni standard. Un valore di 1,00 indica 

un perfetto accordo tra la linea di regressione e i datapoint. 

Velocità alla quale si verifica la rampa di temperatura durante la sessione analitica dello 

strumento. Le velocità di rampa disponibili includono la Rapida e la standard. 




127

Glossario 

128 




Indice 

Numerico 

5′ Saggio nucleasico 5 

A 

acquisizione dati 115 

addestramento, informazioni su viii 

agente bloccante IPC 115 

AIF. VedereFile informazioni del saggio. 

allele 115 

amplicone 115 

Amplification Plot (Plot di amplificazione) 86, 123 

visualizzazione dopo una sessione di analisi 86–89 

amplificazione 115 

curva 88 

indicatore NOAMP 78 

monitoraggio durante una sessione di analisi 55 

visualizzazione dopo una sessione di analisi 86–89 

analisi dell'esperimento. Vedere anche la risoluzione 

problemi. 

analisi 68 

esportazione dati 96 

flusso di lavoro 68 

linee guida 72, 75, 79, 81, 83, 85, 88, 93 

stampa dei dati 96 

visualizzazione del Plot di discriminazione allelica 70 

visualizzazione delle impostazioni di analisi 91 

visualizzazione layout piastra 74 

visualizzazione Plot di amplificazione 86 

visualizzazione Plot multicomponente 84 

visualizzazione QC Summary (Riepilogo CQ) 80 

visualizzazione Raw Data Plot (Plot dati non 

elaborati) 82 

visualizzazione tabella well (pozzetto) 77 

Applied Biosystems 

Assistenza tecnica viii 

contattare viii 

feedback clienti sulla documentazione viii 

reparto Sviluppo Informazioni viii 


Vedere Sistema StepOne 

Assay Mix 36, 115 

Assistenza tecnica, contattare viii 

ATTENZIONE, descrizione ix 

Auto∆ 115 

AVVERTENZA, descrizione ix 

avvio dell'esecuzione 

co-locato 49 

indipendente 50 

C 

calibratore. Vedere campione di riferimento. 

calibrazione spaziale 115 

campione 116 

campione di riferimento 116 

Campione o Standard (105) 116 

campioni non noti 22, 74, 125 

caricamento della piastra di reazione 38 

categoria di installazione xviii 

categoria sovraccarico di tensione (classificazione) xviii 

chimica. Vedere reagenti. 

ciclo soglia (C T ) 116 

ciclo soglia. Vedere ciclo soglia. 

coefficienti di regressione 116 

Vedere anche curva standard. 

co-locato 

avvio di una esecuzione 49 

layout 117 

monitoraggio di una esecuzione 53 

trasferimento dati 64 

colorante 116 

Vedere anche colorante del sistema. 

colorante di sistema 116 

colorante personalizzato 116 

colore del target 116 

comandi menu, convenzioni per la descrizione v 

concentrazione del campione diluito 

(10✕ per miscela di reazione) 117 

controllo 

negativo 22, 23, 72, 74, 85 

positivo 22, 23, 72 

controllo endogeno 117 

Vedere anche gene di riferimento. 

controllo negativo 74, 85, 117 

applicazione 22, 23 

indicatore AMPNC 78 

verifica 72, 77 

controllo positivo 117 

applicazione 22, 23 

indicatore PCFAIL 78 

verifica 72, 77, 79 

controllo positivo interno (IPC) 117 

controllo senza amplificazione (NAC, No Amplification 

Control) Vedere pozzetti IPC bloccati a 

controllo negativo. 

controllo senza templato (NTC, No Template Control). 

Vedere controllo negativo (NC, Negative Control). 



129

Indice 

convenzioni 

IMPORTANTE! vi 

in questa guida v 

messaggi di attenzione per l'utente vi 

Note vi 

per la descrizione dei comandi menu v 

sicurezza ix 

testo in corsivo v 

testo in grassetto v 

convenzioni del testo v 

creazione di un esperimento 

esperimento di esempio 15 

esportazione 96 

stampa 27, 96 

trasferimento. Vedere trasferimento dati. 

C T automatico 117 

C T manuale 118 

C T . Vedere ciclo soglia. 

curva di dissociazione. Vedere curva di melting. 

curva di melting 118 

curva standard 118 

Vedere anche linea di regressione e serie di diluizioni 

standard. 

curve. Vedere curva di amplificazione. 

D 

delta Rn (∆Rn) 118 

design wizard 118 

Schermata Experiment Properties (Proprietà 

dell'esperimento) 16 

Schermata Materials List (Elenco materiali) 28 

Schermata Methods and Materials (Metodi e 

materiali) 17 

Schermata Reaction Setup (Impostazione 

reazione) 26 

Schermata Run Method (Metodo di esecuzione) 24 

Schermata Samples and Replicates (Campioni e 

replicati) 22 

schermata SNP Assays (Saggi SNP) 19 

termine 31 

diluente 118 

disegno dell'esperimento 

creazione nuovo 15 

definizione dei metodi e dei materiali. 17 

definizione delle proprietà dell'esperimento 16 


impostazione dei campioni e dei replicati. 22 

impostazione dei saggi SNP 19 

impostazione del metodo di esecuzione 24 

impostazione delle reazioni 26 

linee guida 17, 18, 21, 23, 25, 28, 30, 32 

ordine materiali 28 

termine del flusso di lavoro del design wizard 31 

DNA campione (10✕) 118 

documentazione, correlata vii 

E 

EFF%. Vedere efficienza di amplificazione (EFF%). 

efficienza di amplificazione (EFF%) 118 

ergonomica, sicurezza xix 

esecuzione dell'esperimento 

abilitazione delle impostazioni di notifica 47–49 

avvio 49 


monitoraggio 53 

preparazione per 45 


esperimento 119 

esperimento di esempio 

analisi 68 

dati 69, 70, 74, 77, 80, 82, 84, 86, 91 

descrizione 10 

disegno 14, 17, 19, 22, 24, 26, 47 

esecuzione 44 


layout piastra 10 

posizione dei dati 10 

preparazione reazioni 34 

esperimento end-point 2, 4, 119 

esportazione dati 96 

etichette di sicurezza, sugli strumenti xii 

F 

fase 119 

fase ciclica 119 

fase della curva di melting 119 

fase di sosta 119 

fattore di diluizione. Vedere fattore seriale. 

fattore seriale 119 

feedback clienti, sui documenti Applied Biosystems viii 

file informazioni del saggio (AIF, Assay Information 

File) 19, 119 

fluorescenza 

indicatore NOISE 79 

indicatore NOSIGNAL 78 

indicatore OFFSCALE 78 

indicatore SPIKE 79 

fluorescenza non specifica 6 

flussi di lavoro degli esperimenti alternativi. Vedere flussi 

di lavoro. 

flusso di lavoro 

Avvio rapido 103 

Design Wizard 11 

Esportazione/Importazione 109 

Impostazione avanzata 98 

Templato 108 

Flusso di lavoro avvio rapido 103, 124 

flusso di lavoro del design wizard 11 

Flusso di lavoro del templato 108 

Flusso di lavoro esportazione/importazione 109 

130 


genotipizzazione

Indice 

Flusso di lavoro impostazione avanzata 98 

flusso di lavoro impostazione avanzata 9, 98, 120 

forward primer 119 

funzionamento dello strumento, sicurezza xiv 

G 

gene di riferimento. Vedere controllo endogeno. 

gruppo di replicati 119 

Guida on-line. Vedere Sistema Help (Guida) 

I 

icone di pericolo. Vedere simboli di sicurezza, sugli 

strumenti 

ID refSNP 119 

ID saggio 120 

IMPORTANTE, descrizione ix 

impostazione avanzata 120 

impostazioni di analisi 91–93 

impostazioni di notifica 47–49 

indicatore 

AMPNC 78 

BADROX 78 

BLFAIL 79 

CLUSTER 78 

CTFAIL 79 

EXPFAIL 79 

NOAMP 78 

NOISE 79 

NOSIGNAL 78 

OFFSCALE 78 

PCFAIL 78 

SMCLUSTER 78 

SPIKE 79 

THOLDFAIL 79 

indicatore AMPNC 78 

indicatore BADROX 78, 80 

indicatore BLFAIL 79 

indicatore CLUSTER 78 

indicatore CTFAIL 79 

indicatore EXPFAIL 79 

indicatore no signal 78 

indicatore NOAMP 78 

indicatore NOISE 79 

indicatore NOSIGNAL 78 

indicatore OFFSCALE 78 

indicatore PCFAIL 78 

indicatore SMCLUSTER 78 

indicatore SPIKE 79 

indicatore THOLDFAIL 79 

indicatori 78, 80 

indipendente 

avvio di una esecuzione 50 

layout 117 

monitoraggio di una esecuzione 62 


intercetta y 120 

IPC 120 

IPC bloccato 120 

Vedere anche pozzetti IPC bloccati a controllo 

negativo. 

IPC+ 120 

ipotesi assunte per l'uso della guida v 

L 

layout piastra 74, 120 

lettura end-point Vedere lettura post-PCR. 

lettura post-PCR 120 

lettura pre-PCR 120 

libreria campioni 120 

libreria target 120 

linea di base 

automatica 121 

informazioni su 88, 121 

regolazione 91 

linea di base automatica 121 

linea di base manuale 121 

linea di regressione 121 

Vedere anche coefficienti di regressione. 

linee guida 

analisi 72, 75, 79, 81, 83, 85, 88, 93 

disegno 17, 18, 21, 23, 25, 28, 30, 32 

esecuzione 48 

preparazione 35, 37, 40 

sicurezza chimica xiv 

sicurezza rifiuti chimici xvi 

smaltimento rifiuti chimici xvi 

linee guida analisi 72, 75, 79, 81, 83, 85, 88, 93 

linee guida esecuzione 48 

linee guida per la preparazione 35, 37, 40 

M 

materiali di consumo 3, 28, 35, 36, 38 

Vedere anche materiali necessari. 

materiali necessari 28, 35, 36, 38 

messaggi di attenzione per l'utente, descritti vi 

metodo C T comparativo (∆∆C T ) 121 

metodo della curva standard 121 

metodo della curva standard relativa 121 

metodo di esecuzione 121 

impostazione 24 

monitoraggio 57 

metodo di quantificazione 121 

miscela di primer 121 

miscela di reazione 121 

impostazione 26 

ordine 28 



131

Indice 

preparazione 36 

miscela primer/sonda 121 

miscela sonda 122 

monitoraggio dell'esecuzione 

configurazione co-locata 53 

indipendente 62 

Plot della temperatura 56 

Plot di amplificazione 55 

remoto 59 

visualizzazione metodo di esecuzione 57 

monitoraggio remoto 122 

movimenti ripetitivi, sicurezza xix 

MSDS 

come ottenerle xv 

descrizione xv 

MSDS, come ottenerle viii 

N 

nome dell'esperimento 122 

norme 

EMC xx 

sicurezza xx 

norme di compatibilità elettromagnetica. Vederenorme 

EMC 

norme di sicurezza xx 

norme EMC xx 

numero rs. Vedere ID refSNP. 

O 

ometti pozzetto 122 

omissione pozzetti 77, 80 

operazione 122 

outlier 122 

P 

passaggio 122 

PCR in tempo reale 122 

pendenza 122 

Vedere anche efficienza di amplificazione (EFF%). 

pericoli. Vedere sicurezza 

PERICOLO, descrizione ix 

piastra di reazione 

caricamento 46 

compatibile 

ordine 28 

preparazione 38 

scaricamento 63 

Plot della temperatura 56, 122 

Plot di amplificazione 

monitoraggio durante una sessione di analisi 55 

visualizzazione dopo una sessione di analisi 91 

Plot di discriminazione allelica 6, 70, 123 

assegnazione richieste manuale 95 

valutazione dei risultati 70–73 

Plot multicomponente 84, 123 

plot multipli, visualizzazione 90 

polimorfismo di un singolo nucleotide 4 

pozzetti 

controllo negativo 22, 74 

controllo positivo 22, 74 

layout piastra 74 

non noti 74 

sconosciuti 22 

selezione 75 

tabella well (pozzetto) 77 

pozzetti IPC a controllo negativo 123 

Vedere anche IPC+. 

pozzetti IPC bloccati a controllo negativo 123 

preparazione dell'esperimento 

diluizioni del campione 35 


linee guida 35, 37, 40 

miscela di reazione 36 

per ulteriori informazioni 34 

piastra di reazione 38 

preparazione per l'esecuzione 34 

profili rifiuti, descrizione xvii 

profilo termico 123 

punto 123 

Q 

quantità 123 

quantità di partenza 123 

quantità normalizzata 123 

quantità standard 123 

quencher 124 

quencher non fluorescente-minor groove binder 

(NFQ-MGB) 124 

R 

rampa 124 

Raw Data Plot (Plot dati non elaborati) 82, 122 

reagenti 124 

ordine 28 

Reagenti TaqMan ® 17 

reagenti TaqMan ® 4–6 

Reagenti SYBR ® Green 124 

reagenti TaqMan ® 124 

reazione campione/saggio SNP 124 

reazione campione/target 124 

remoto 


reparto Sviluppo Informazioni, contatto viii 

replicati 124 

reporter 124 

reporter derivativo (- Rn′) 125 

132 


genotipizzazione

Indice 

reporter normalizzato (Rn) 125 

Reporter normalizzato baseline-corrected (∆Rn) 125 

reverse primer 125 

richiesta allele 

automatica 94 

manuale 95 

richiesta allele automatica 94 

richiesta allele manuale 95 

riferimento passivo 125 

indicatore BADROX 78 

rifiuta pozzetto 125 

rifiuti a rischio biologico, manipolazione xvii 

rifiuti radioattivi, manipolazione xvii 

Rischi xix 

risoluzione problemi 

indicatori 78 

regolazione linea di base 91 

regolazione soglia 91 

visualizzazione delle impostazioni di analisi 91 

visualizzazione Plot di amplificazione 86 

visualizzazione Plot multicomponente 84 

visualizzazione QC Summary (Riepilogo CQ) 80 

visualizzazione Raw Data Plot (Plot dati non 

elaborati) 82 

risultati 

assegnazione richieste automatica 94 

assegnazione richieste manuale 95 

risultati, interpretazione 68 

Rn. Vedere reporter normalizzato. 125 

S 

Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan ® 4 

saggi inventariati 125 

saggi prodotti su richiesta 125 

saggio 125 

saggio più/meno 

richieste risultati 90 

saggio SNP 4, 125 

scaricamento della piastra di reazione 63 

Schermata Experiment Properties (Proprietà 

dell'esperimento) 16 

Schermata Materials List (Elenco materiali) 28 

Schermata Methods and Materials (Metodi e 

materiali) 17 

schermata QC Summary (Riepilogo CQ) 80 

Schermata Reaction Setup (Impostazione reazione) 26 

Schermata Run Method (Metodo di esecuzione) 24 

Schermata Samples and Replicates (Campioni e 

replicati) 22 

schermata SNP Assays (Saggi SNP) 19 

schermate di analisi 

Amplification Plot (Plot di amplificazione) 86–89 

layout piastra 74–76 

Plot di discriminazione allelica 70–73 

Plot multicomponente 84–85 

Raw Data Plot (Plot dati non elaborati) 82–83 

schermata QC Summary (Riepilogo CQ) 80–81 

tabella well (pozzetto) 77–80 

Visualizzazione plot multipli 90 

selezione pozzetti 75 

serie di diluizioni standard 126 

Vedere anche curva standard. 

serie. Vedere serie di diluizioni standard. 

sicurezza 

chimica xiv 

convenzioni ix 

elettrica xvii 

ergonomico xix 

funzionamento dello strumento xiv 

linee guida xiv, xvi, xvii 

movimenti ripetitivi xix 

norme xx 

prima di mettere in funzione lo strumento xiii 

rifiuti chimici xvi 

rischi biologici xix 

spostamento e sollevamento dello strumento xiii 

spostamento/sollevamento xiii 

stazione di lavoro xix 

sicurezza chimica xiv 

sicurezza dalle sostanze chimiche xiv 

sicurezza della stazione di lavoro xix 

sicurezza elettrica xvii 

sicurezza rifiuti chimici xvi 

simboli di pericolo. Vedere simboli di sicurezza, sugli 

strumenti 

simboli di sicurezza, sugli strumentisimboli di pericolo. 

Vedere simboli di sicurezza, sugli strumenti 

simboli, sicurezza xi 

Sistema Help (Guida), accesso viii 

Sistema StepOne 

acquisizione dati 2 

informazioni su 2 

layout 117 

materiali di consumo 

sistema StepOne 

reagenti 4 

smaltimento rifiuti, linee guida xvii 

SNP 126 

soglia 126 

soglia, regolazione 91 

Sonde MGB TaqMan ® 5 

spostamento e sollevamento, sicurezza xiii 

stampa dei dati 96 

standard 126 

Vedere anche curva standard e serie di diluizioni 

standard. 



133

Indice 

T 

tabella well (pozzetto) 77 

target 126 

temperatura di melting (Tm) 126 

templato 126 

templato, preparazione 35 

testo in corsivo, quando utilizzarlo v 

testo in grassetto, quando utilizzarlo v 

tipo di esperimento 126 

Tm. Vedere anche temperatura di melting. 126 

touchscreen 126 

trascrittasi inversa 126 

trasferimento dati 50, 64 

U 

utilizzo della guida 

come tutorial 8 

per i propri esperimenti 9 

V 

Valore R2 127 

velocità di rampa 18, 127 

134 


genotipizzazione

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06/2010 

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