Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Applied Biosystems StepOne 

Real-Time PCR System 

Guida reagenti

Applied Biosystems StepOne 

Real-Time PCR System 

Guida reagenti

© Copyright 2006, 2010 Applied Biosystems. All rights reserved. 

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The StepOne Real-Time PCR System is covered by US patents and corresponding claims in their non-US counterparts, owned by Applied Biosystems. 

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Applera, Applied Biosystems, AB (Design), MicroAmp, Primer Express, and VIC are registered trademarks, and FAM, JOE, MultiScribe, NED, ROX, 

StepOne, TAMRA, and TET are trademarks of Applied Biosystems or its subsidiaries in the U.S. and/or certain other countries. 

AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. 

SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. 

All other trademarks are the sole property of their respective owners. 

N. di cat. 4377717 Rev. B 

06/2010 

RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Indice 

Front Cover 

Premessa 

Come utilizzare questa guida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii 

Come ottenere ulteriori informazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix 

Come ottenere assistenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi 

Capitolo 1 

Introduzione 

Informazioni sul sistema StepOne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2 

Preparazione degli esperimenti sul sistema StepOne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4 

Selezione del tipo di esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5 

Selezione del tipo di reagente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6 

Selezione del tipo di saggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7 

Capitolo 2 

Descrizione generale dei reagenti 

Descrizione generale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2 

Reagenti TaqMan ® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2 

Reagenti SYBR ® Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4 

Selezione del tipo di reagente appropriato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-6 

Riduzione al minimo delle contaminazione da DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-8 

Capitolo 3 

Esperimenti di quantificazione 

Sezione 3.1: Informazioni sugli esperimenti di quantificazione . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3 


Selezione di un metodo di quantificazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5 

Selezione della RT-PCR one-step o two-step . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8 

Selezione PCR singleplex o multiplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10 

Selezione del tipo di reagente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13 

Selezione del tipo di saggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13 

Sezione 3.2: Linee guida disegno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17 

Saggi inventariati/prodotti su ordine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18 

Saggi di espressione genica TaqMan ® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18 

Saggi di espressione genica TaqMan ® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20 

Selezione della Master Mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21 

Disegno dell'esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22 

Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System 

CONFIDENTIAL — For AB Internal Use Only. Do Not Distribute. 

iii

Saggi personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22 

Disegno dei primer e delle sonde utilizzando il software Primer Express ® . . . . . . 3-23 

Selezione dei reagenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-25 

Utilizzo delle condizioni di ciclo termico raccomandate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-27 

Ottimizzazione delle concentrazioni primer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-30 

Ottimizzazione della concentrazione della sonda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-34 

Per ulteriori informazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-36 

Capitolo 4 

Esperimenti di genotipizzazione 

Sezione 4.1: Informazioni sugli esperimenti di genotipizzazione . . . . . . . . . . . . . . . 4-3 


Selezione del tipo di saggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6 

Sezione 4.2: Linee guida disegno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9 

Saggi pre-disegnati/convalidati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10 

Saggi genotipizzazione SNP TaqMan ® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10 

Saggi genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan ® . . . . . . . . . . . . . . . 4-11 

Reagenti per i saggi pre-sviluppati TaqMan ® per discriminazione allelica . . . . . . 4-12 




Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan ® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15 



Capitolo 5 

Esperimenti di presenza/assenza 

Sezione 5.1: Informazioni sugli esperimenti di presenza/assenza . . . . . . . . . . . . . . 5-3 


Selezione del tipo di saggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-5 

Sezione 5.2: Linee guida disegno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9 

Saggi inventariati/prodotti su ordine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10 

Saggi di espressione genica TaqMan ® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10 

Saggi di espressione genica TaqMan ® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12 

Reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan ® . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-13 




iv 


CONFIDENTIAL — For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

Appendice A Formula 

Formula per esperimenti con C T comparativo (ΔΔC T ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-1 

Appendice B Limitazione dei primer nella PCR multiplex 

Appendice C Linee guida disegno saggi 

Bibliografia 

Glossario 

Indice 



v

vi 



Premessa 

Come utilizzare questa guida 

Scopo della 

guida 

A chi si rivolge 

Ipotesi assunte 

Convenzioni 

del testo 

La guida fornisce le informazioni sui reagenti che è possibile utilizzare sul sistema 

PCR Real-Time StepOne Applied Biosystems (sistema StepOne ). Informazioni 

contenute nella guida: 

• Introduzione ai reagenti TaqMan ® e SYBR ® Green 

• Descrizioni e linee guida disegno per i seguenti tipi di esperimento: 

– Esperimenti di quantificazione 

– Esperimenti di genotipizzazione 

– Esperimenti di presenza/assenza 

Questa guida è pubblicata per il personale di laboratorio e per i ricercatori principali 

che eseguono esperimenti con curva standard con il sistema StepOne. 

La guida prevede che l'utente: 

• Abbia una conoscenza professionale del processo della reazione a catena della 

polimerasi (PCR). 

• Conosca le modalità di manipolazione dei campioni DNA e/o RNA e della loro 

preparazione per la PCR. 

La guida utilizza le seguenti convenzioni: 

• Il testo in Grassetto indica un azione dell'utente. Ad esempio: 

Digitare 0, quindi premere Enter (Invio) per ognuno dei campi rimanenti. 

• Il testo in Corsivo indica parole nuove o importanti e viene utilizzato anche per 

enfatizzare. Ad esempio: 

Prima di un'analisi, preparare sempre matrice fresca. 

• Un simbolo di freccia a destra () separa i comandi successivi selezionati da un 

menu a discesa o da un menu a scelta rapida. Ad esempio: 

Selezionare FileOpen (Apri). 


RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire. 

vii

Premessa 

Messaggi di 

attenzione per 

l'utente 

Messaggi di 

sicurezza 

Nella documentazione per l'utente Applied Biosystems compaiono due tipi di 

messaggi di attenzione. Ciascun messaggio presuppone un particolare livello di 

osservanza o l'esecuzione di una particolare operazione da parte dell'utente, secondo 

quanto descritto qui di seguito: 

Nota: – Fornisce informazioni che potrebbero essere di interesse o di aiuto ma non 

di importanza critica per l'uso del prodotto. 

IMPORTANTE! – Fornisce informazioni necessarie per il corretto funzionamento 

dello strumento, per l'uso accurato del kit reagenti o per l'uso sicuro di un prodotto 

chimico. 

Alcuni esempi dei messaggi di attenzione sono indicati qui di seguito: 

Nota: La funzione Calibrate (Calibra) è anche disponibile nella Control Console 

(Console di comando). 

IMPORTANTE! Per verificare la propria connessione client, è necessario un ID 

utente valido. 

Nella documentazione per l'utente di Applied Biosystems appaiono quattro diversi 

messaggi di attenzione in punti del documento dove risulta necessario essere ben 

consapevoli della possibilità di pericoli rilevanti. Ciascun 

messaggio—IMPORTANTE, ATTENZIONE, AVVERTENZA, 

PERICOLO—presuppone un particolare livello di osservanza o l'esecuzione di una 

particolare operazione da parte dell'utente, secondo quanto descritto qui di seguito. 

Definizioni 

IMPORTANTE! – Indica informazioni necessarie per il corretto funzionamento dello 

strumento, per l'uso accurato del kit reagenti o per l'uso sicuro di un prodotto 

chimico. 

– Indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non 

evitata, potrebbe causare lesioni di minore o moderata entità. Può inoltre essere 

utilizzata per mettere in guardia l'utente nei confronti di pratiche non sicure. 

– Indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non 

evitata, potrebbe causare lesioni gravi o morte. 

– Indica una situazione di pericolo incombente che, se non evitata, 

causerà morte o lesioni gravi. Questo messaggio viene utilizzato esclusivamente 

nelle situazioni di estremo pericolo. 

Ad eccezione di IMPORTANTE, ogni messaggio di sicurezza in un documento 

Applied Biosystems appare accanto a un figura di triangolo aperto contenente un 

simbolo di pericolo. Questi simboli di pericolo sono identici a quelli posizionati sugli 

strumenti Applied Biosystems. 

viii 



Premessa 

Esempi 

IMPORTANTE! Creare un foglio elettronico separato di immissione campioni per 

ogni piastra di reazione a 96-pozzetti. 

PERICOLO CHIMICO. TaqMan ® Universal PCR Master 

Mix può provocare irritazione degli occhi e della pelle. L'esposizione può provocare 

problemi in caso di ingestione o inalazione. Leggere la scheda di sicurezza dei 

materiali (MSDS) e attenersi rigorosamente alle istruzioni relative alla 

manipolazione di questa sostanza. Indossare un'adeguata protezione oculare, 

indumenti e guanti di protezione. 

PERICOLO DI INFORTUNIO. Durante il funzionamento 

dello strumento, il pannello di copertura riscaldato e il blocco campione possono 

raggiungere temperature che superano anche i 100 °C. 

PERICOLO ELETTRICO. La continuità del circuito di messa a 

terra è vitale per il funzionamento in sicurezza. Non mettere mai in funzione il 

sistema con il conduttore di messa a terra scollegato. 

Come ottenere ulteriori informazioni 

Documentazione 

correlata 

La documentazione seguente è allegata al sistema StepOne: 

Documento 

n. di cat. 

inglese 

n. di cat. 

italiano 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting 

Started Guide for Genotyping Experiments 

4376786 4377729 


Started Guide for Presence/Absence Experiments 


Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative C T 

Experiments 

4376787 

4376785 

— 

4377742 


Started Guide for Standard Curve Experiments 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System 

Installation, Maintenance, and Networking Guide 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System 

Installation Quick Reference Card 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Site 

Preparation Guide 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Software 

Help 

4376784 4377736 

4376782 4377798 

4376783 4377792 

4376768 4378359 

— — 



ix

Premessa 

La documentazione di supporto seguente è disponibile presso Applied Biosystems: 

Documento 

n. di cat. 

Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol 4375575 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation 

Performance Verification Protocol 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation 

Qualification-Operation Qualification Protocol 

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Planned Maintenance 

Protocol 

4376791 

4376790 

4376788 

Custom TaqMan ® Gene Expression Assays Protocol 4334429 

Custom TaqMan ® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines 4367671 

Custom TaqMan ® SNP Genotyping Assays Protocol 4334431 

Power SYBR ® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol 4367218 

Pre-Developed TaqMan ® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol 4312214 

Primer Express ® Software Version 3.0 Getting Started Guide 4362460 

SYBR ® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol 4304965 

SYBR ® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol 4310251 

TaqMan ® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol 4362038 

TaqMan ® Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol 4308335 

TaqMan ® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol 4351891 

TaqMan ® Gene Expression Assays Protocol 4333458 

TaqMan ® SNP Genotyping Assays Protocol 4332856 

TaqMan ® Universal PCR Master Mix Protocol 4304449 

User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression 4303859 

Using TaqMan ® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous 

Control for Experimental Studies Application Note 

127AP08 

Nota: Per ulteriori documentazioni, consultare “Come ottenere assistenza” a 

pagina xi. 

Informazioni dalla 

Guida Software 

(Help) 

La Guida (Help) software del sistema PCR Real-Time StepOne Applied 

Biosystems (software StepOne ) descrive la modalità di utilizzo di ogni funzione 

dell'interfaccia utente. Accedere alla voce Help (Guida) dal software StepOne in uno 

dei modi seguenti: 

• Premere F1. 

• Fare clic su nella barra degli strumenti. 

• Selezionare Help (Guida)StepOne Help (Guida StepOne). 

x 



Premessa 

Per trovare argomenti di interesse nella voce Help (Guida): 

• Esaminare l'indice. 

• Cercare un argomento specifico. 

• Cercare un indice alfabetico. 

Invio di commenti 

Applied Biosystems è lieta di ricevere i commenti e i suggerimenti dei clienti allo 

scopo di migliorare la propria documentazione per l'utente. È possibile inviare 

commenti tramite e-mail a: 

techpubs@appliedbiosystems.com 

IMPORTANTE! Utilizzare l'indirizzo e-mail sopra indicato esclusivamente per 

inoltrare commenti e suggerimenti relativi alla documentazione. Per ordinare 

documenti, scaricare file PDF o per aiuto su questioni tecniche, visitare il sito web 

all'indirizzo http://www.appliedbiosystems.com, quindi fare clic sul link per il 

Support (assistenza). (Vedere “Come ottenere assistenza” qui di seguito). 

Come ottenere assistenza 

Per le informazioni relative a servizi e assistenza tecnica più recenti per tutte le sedi, 

visitare il sito web all'indirizzo http://www.appliedbiosystems.com, quindi fare clic 

sul link Support. 

Nella pagina dell'assistenza clienti, è possibile: 

• Ricercare argomenti attraverso le domande frequenti (FAQ) 

• Inviare una domanda direttamente al servizio di assistenza tecnica 

• Ordinare documenti per l'utente Applied Biosystems, MSDS, certificati di 

analisi e altri documenti correlati 

• Scaricare documenti in PDF 

• Ottenere informazioni sull'addestramento del cliente 

• Scaricare aggiornamenti e patch del software 

Inoltre, la pagina dell'assistenza clienti fornisce l'accesso ai numeri di telefono e di 

fax in tutto il mondo per contattare l'assistenza tecnica e i punti vendita 

Applied Biosystems. 

IMPORTANTE! Contattare il Servizio clienti Applied Biosystems (Customer Care 

Center) quando suggerito da questa guida o in caso di necessità per programmare le 

operazioni di manutenzione (quali, manutenzione pianificata annuale o 

verifica/calibrazione della temperatura) per il proprio strumento StepOne . 

Per ottenere un numero di telefono o un indirizzo e-mail del servizio clienti, andare 

su http://www.appliedbiosystems.com/support/contact. 



xi

Premessa 

xii 



Introduzione 1 

1 

Questo capitolo comprende i paragrafi: 

Informazioni sul sistema StepOne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2 

Preparazione degli esperimenti sul sistema StepOne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4 

Selezione del tipo di esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5 

Selezione del tipo di reagente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6 

Selezione del tipo di saggio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7 



1-1

Capitolo 1 

Introduzione 

Informazioni sul sistema StepOne 

Il sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System (sistema 

StepOne ) utilizza reagenti fluorescenti della reazione a catena della polimerasi 

(PCR) per fornire: 

• Rilevamento quantitativo delle sequenze target dell'acido nucleico (target) 

utilizzando l'analisi in tempo reale. 

• Rilevamento qualitativo delle sequenze target dell'acido nucleico (target) 

utilizzando analisi end-point e con curva di melting. 

Informazioni 

sull'acquisizione 

dei dati 

Il sistema StepOne acquisisce dati di fluorescenza non elaborati in punti diversi 

durante una PCR, in dipendenza del tipo di esecuzione: 

Tipo di esecuzione 

Punto di acquisizione dati 

Sessioni di 

analisi in 

tempo reale 

Sessioni di 

analisi endpoint 

Curva standard 


relativa 

C T comparativo 

(ΔΔC T ) 

Genotipizzazione 

Presenza/assenza 

Lo strumento acquisisce dati dopo ogni fase di 

estensione della PCR. 

Lo strumento acquisisce dati prima e dopo la 

PCR. Lo strumento può inoltre acquisire dati 

durante la sessione di analisi (in tempo reale); 

l'acquisizione di dati durante la sessione di 

analisi è utile per la risoluzione di eventuali 

problemi. 

Lo strumento acquisisce dati prima e dopo la 

PCR. 

Indipendentemente dal tipo di esecuzione, un punto di acquisizione dati o di lettura 

consiste in tre fasi: 

1. Eccitazione – Lo strumento StepOne illumina tutti i pozzetti della piastra di 

reazione all'interno dello strumento StepOne, eccitando i fluorofori in ogni 

reazione. 

2. Emissione – L'ottica dello strumento StepOne focalizza la fluorescenza residua 

emessa dai pozzetti della piastra di reazione. L'immagine risultante acquisita dal 

dispositivo consiste unicamente nella luce che corrisponde al range delle 

lunghezze d'onda di emissione. 

3. Acquisizione – Lo strumento StepOne assembla una rappresentazione digitale 

della fluorescenza residua acquisita durante un intervallo dalla durata fissa. Il 

software StepOne memorizza l'immagine fluorescente non elaborata per 

l'analisi. 

1-2 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System 


Capitolo 1 

Introduzione 

Dopo una sessione di analisi, il software StepOne utilizza i dati di calibrazione 

(spaziale, del fluorocromo e di background) per determinare la posizione e l'intensità 

dei segnali fluorescenti in ogni lettura, il fluorocromo associato a ogni segnale 

fluorescente e il significato del segnale. 

Materiali di 

consumo 

supportati 

Il sistema StepOne supporta i materiali di consumo elencati qui di seguito. È 

possibile utilizzare tali materiali di consumo sia con i reagenti/protocolli standard sia 

con quelli veloci. 

Materiale di consumo 

• MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plates 

• MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film 

• MicroAmp Fast 8-Tube Strips 

• MicroAmp Optical 8-Cap Strips 

Numero di 

catalogo 

• 4375816 

• 4375323 

• 4358293 

• 4323032 

• MicroAmp ® Fast Reaction Tubes with Caps • 4358297 

• MicroAmp Fast 48-Well Trays 

• MicroAmp 48-Well Base Adaptor 

• MicroAmp Splash Free 96-Well Base 

• 4375282 

• 4375284 

• 4312063 

G 

D 

E 

F 

A 

C 

B 

A 

C 

B 

C 

# Materiale di consumo 

A 

B 

C 

D 

E 

F 

G 

MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plate 

MicroAmp Fast 48-Well Tray 

MicroAmp Splash Free 96-Well Base 

MicroAmp Optical 8-Cap Strip 

MicroAmp Fast 8-Tube Strip 

MicroAmp ® Fast Reaction Tubes with Caps 

MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film 



1-3

Capitolo 1 

Introduzione 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sugli argomenti trattati in questa guida, accedere alla voce 

Help (Guida) nel software del sistema Real-Time PCR StepOne Applied 

Biosystems premendo F1, facendo clic su nella barra degli strumenti oppure 

selezionando Help (Guida)StepOne Help (Guida StepOne). 

Preparazione degli esperimenti sul sistema StepOne 

Flusso di lavoro 

generale 

Informazioni 

contenute nella 

guida: 

Prima dell'esecuzione degli esperimenti sul sistema StepOne, eseguire la 

preparazione degli esperimenti come segue: 

1. Selezionare un tipo di esperimento (pagina 1-5). 

2. Selezionare il tipo di reagente (pagina 1-6). 

3. Selezionare il tipo di saggio (pagina 1-7). 

Questo capitolo fonisce informazioni generali sui tipi di esperimento, i tipi di 

reagente e i tipi di saggio che è possibile utilizzare con il sistema StepOne. 

I capitoli seguenti forniscono informazioni specifiche: 

Capitolo 

Capitolo 2, Descrizione generale 

dei reagenti 

Capitolo 3, Esperimenti di 

quantificazione 


genotipizzazione 


presenza/assenza 

Descrizione 

• Descrive e compara i reagenti TaqMan ® e 

SYBR ® Green. 

• Fornisce informazioni sulla riduzione al minimo 

della contaminazione di DNA. 

• Spiega la modalità di funzionamento del tipo di 

esperimento. 

• Fornisce un flusso di lavoro specifico per il tipo di 

esperimento. 

• Fornisce le linee guida per il disegno per ogni tipo 

di saggio. 



Capitolo 1 

Introduzione 

Selezione del tipo di esperimento 

È possibile eseguire i seguenti tipi di esperimento sul sistema StepOne: 

• Quantificazione, inclusi: 

– Curva standard 

– Curva standard relativa 

– C T comparativo (ΔΔC T ) 

• Genotipizzazione 

• Presenza/assenza 

Nota: Sul sistema StepOne è inoltre possible eseguire l'analisi della curva di melting. 

Esperimenti endpoint 

rispetto a 

quelli in tempo 

reale 

È possibile categorizzare i tre tipi di esperimento in esperimenti in tempo reale e endpoint, 

come descritto qui di seguito. 

Categoria 

Proprietà 

Tipo di 

esperimento 

Tempo reale • Lo strumento monitora gli sviluppi della PCR 

durante il suo svolgimento. ‡ 

• I dati vengono acquisiti durante lo sviluppo 

della PCR. 

• Le reazioni sono caratterizzate dal punto 

temporale durante la fase ciclica in cui 

l'amplificazione di un target viene rilevata la 

prima volta. § 

End-point • I dati vengono acquisiti al termine del 

processo PCR. 

• Le reazioni sono caratterizzate dalla quantità 

del target accumulata al termine della PCR. § 

• Il datapoint rappresenta l'intensità 

normalizzata del fluorocromo reporter oppure 

dell'R n . 

Nota: È possibile che alcuni esperimenti endpoint 

includano datapoint pre-PCR. In caso 

affermativo, il sistema calcola il valore del delta 

R n (ΔR n ) attraverso la formula seguente: 

Quantificazione 



‡ Kwok and Higuchi, 1989. 

§ Saiki et al., 1985. 

R n post-PCR – R n pre-PCR = ΔR n 



1-5

Capitolo 1 

Introduzione 

Selezione del tipo di reagente 

È possibile utilizzare i seguenti tipi di reagenti (chimiche) sul sistema Step One: 

• Reagenti TaqMan ® 

• Reagenti SYBR ® Green 

• Altri reagenti fluorescenti 

Reagenti TaqMan 

I reagenti TaqMan includono i saggi TaqMan ® (miscele pre-formulate contenenti i 

set di sonde e primers) e le Master Mix TaqMan ® . È possibile utilizzare i reagenti 

TaqMan per i seguenti tipi di esperimento: 







IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'uso del fluorocromo TAMRA 

come reporter o quencher con il sistema StepOne. 

Reagenti SYBR 

Green 

I reagenti SYBR Green includono primer e Master Mix contenenti il fluorocromo 

SYBR ® Green. È possibile utilizzare i reagenti SYBR Green per gli esperimenti di 

quantificazione: 

• Curva standard 

• Curva standard relativa 

• C T comparativo (ΔΔC T ) 

Nota: Non è possibile eseguire PCR multiplex utilizzando reagenti SYBR Green. 

Per ulteriori informazioni, vedere “Selezione PCR singleplex o multiplex” a 

pagina 3-10. 

Altri reagenti 

È possibile utilizzare altri reagenti fluorescenti sul sistema StepOne, ma: 

• Il software StepOne calcola automaticamente i volumi di reazione per i reagenti 

TaqMan e SYBR Green, ma non fa altrettanto per gli altri reagenti. 

• È necessario disegnare il proprio esperimento utilizzando il flusso di lavoro 

dell'impostazione avanzata invece del flusso di lavoro del Design Wizard. 



Capitolo 1 

Introduzione 

Selezione del tipo di saggio 

Nel software StepOne, è possibile selezionare i seguenti tipi di saggi per esperimenti 

di quantificazione, presenza assenza e di genotipizzazione: 

Tipo di esperimento Tipo di saggio Vedere... 

Quantificazione ‡ 


• Inventariati/Prodotti su ordine 

• Personalizzati 

qui di seguito 

Genotipizzazione • Pre-disegnati/Convalidati 

• Personalizzati 

• Disegnati dall'utente 

pagina 1-8 

‡ Gli esperimenti di quantificazione includono quelli con curva standard, curva standard 

relativa e con C T comparativo. 

Esperimenti di 

quantificazione e 

di presenza/ 

assenza 

Saggi inventariati/prodotti su ordine 

Per gli esperimenti di quantificazione o di presenza/assenza, selezionare il tipo di 

saggio inventariato/prodotto su ordine nel software StepOne utilizzato: 

• Saggi di espressione genica TaqMan®, inventariati – Sonda TaqMan MGB 

(minor groove binder) marcata con fluorocromo FAM e set di primers predisegnati 

venduti pronti all'uso. L'Assay Mix è disponibile in una provetta 205 , 

singola e pre-formulata. 

• Saggi di espressione genica TaqMan ® , prodotti su ordine – Sonda TaqMan 

MGB marcata con fluorocromo FAM e set di primers prodotti al momento 

dell'ordine. L'Assay Mix è disponibile in una provetta 205, singola e preformulata. 

• Saggi di espressione genica personalizzati TaqMan ® – Sonda TaqMan 

marcata con fluorocromo FAM e set di primers disegnati, sintetizzati e formulati 

dall'assistenza saggi genomici personalizzati TaqMan ® sulla base delle 

informazioni di sequenza inoltrate. L'Assay Mix è disponibile in una provetta 

20✕ oppure in una provetta 60✕ singola e pre-formulata. 

Nota: Per selezionare il tipo di saggio nel software StepOne, andare alla schermata 

Reaction Setup (Impostazione reazione) sia nel flusso di lavoro del Design Wizard 

sia in quello di impostazione avanzata, quindi selezionare Inventoried/Made to 

Order (Inventariato/Prodotto su ordine) nel menu a discesa Assay Type (Tipo di 

saggio). 



1-7

Capitolo 1 

Introduzione 

Saggi personalizzati 

Per gli esperimenti di quantificazione e di presenza/assenza, selezionare il tipo 

personalizzato nel software StepOne nel caso sia in atto il disegno dei propri saggi 

(primer e sonde) con il software Primer Express ® e i reagenti TaqMan o SYBR 

Green. Nel disegno dei propri saggi, seguire le linee guida per il disegno dei saggi 

Applied Biosystems per l'ottimizzazione dei risultati. 



Nota: Per selezionare il tipo di saggio nel software StepOne, andare alla schermata 

Reaction Setup (Impostazione reazione) sia nel flusso di lavoro del Design Wizard 

sia in quello di impostazione avanzata, quindi selezionare Custom (Personalizzato) 

nel menu a discesa Assay Type (Tipo di saggio). 

Esperimenti di 


Saggi pre-disegnati/Convalidati 

Per gli esperimenti di genotipizzazione, il tipo di saggio pre-disegnato/convalidato 

include: 

• Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan ® – Sonde TaqMan MGB (minor 

groove binder) marcate con fluorocromi FAM e VIC e set di primers predisegnati 

etichettati con fluorocromo FAM e VIC® disponibili in due 

categorie: 

– Saggi di genotipizzazione TaqMan® convalidati e codificati SNP, 

acquistabili standardizzati (inventariati). L'Assay Mix è disponibile in una 

provetta 20✕, singola e pre-formulata. 

– Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan ® pre-disegnati, prodotti al momento 

dell'ordine (Prodotti su ordine). L'Assay Mix è disponibile in una provetta 

20✕, singola e pre-formulata. 

• Saggi di genotipizzazione TaqMan ® per il metabolismo di farmaci –Sonde 

TaqMan MGB marcate in FAM e in VIC e primers pre-disegnati etichettati con 

fluorocromo FAM e VIC acquistabili standardizzati (inventariati). L'Assay Mix 

è disponibile in una provetta 20✕, singola e pre-formulata. 

• Saggi TaqMan ® pre-sviluppati per discriminazione allelica (PDAR 

TaqMan ® per AD) – Sonde TaqMan MGB marcate in FAM e in VIC e primers 

pre-disegnati etichettati con fluorocromo FAM e VIC acquistabili standardizzati 

(inventariati). L'Assay Mix è disponibile in una provetta 10✕, singola e preformulata. 

Nota: Per selezionare un saggio SNP nel software StepOne, andare alla schermata 

SNP Assays (Saggi SNP) nel flusso di lavoro del Design Wizard oppure alla 

schermata Plate Setup (Imposta piastra) nel flusso di lavoro avanzato. Nella 

schermata SNP Assays (Saggi SNP) o nella schermata Plate Setup (Imposta piastra), 

è possibile selezionare un saggio dalla libreria oppure creare un nuovo saggio. 



Capitolo 1 

Introduzione 


Per gli esperimenti di genotipizzazione, il tipo di saggio personalizzato include i 

saggi di genotipizzazione SNP TaqMan ® personalizzati. I saggi di genotipizzazione 

SNP TaqMan personalizzati sono costituiti da set di sonde TaqMan MGB e primer 

marcati in FAM e in VIC disegnati, sintetizzati e formulati dall'assistenza saggi 

genomici personalizzati TaqMan ® sulla base delle informazioni di sequenza 

inoltrate. L'Assay Mix è disponibile in una provetta 40✕ oppure in una provetta 80✕ 

singola e pre-formulata. 






Saggi disegnati dall'utente 

Per disegnare le proprie sonde e e i primer per saggi SNP, fare riferimento alla guida 

Primer Express ® Software Version 3.0 Getting Started Guide. 





1-9

Capitolo 1 

Introduzione 



Descrizione generale dei reagenti 2 

2 


Descrizione generale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2 

Reagenti TaqMan ® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2 

Reagenti SYBR ® Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4 

Selezione del tipo di reagente appropriato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-6 

Riduzione al minimo delle contaminazione da DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-8 



2-1

Capitolo 2 


Descrizione generale 

Applied Biosystems ha sviluppato due tipi di reagenti (chimiche) che è possibile 

utilizzare per la rilevazione dei prodotti della PCR sul sistema PCR Real-Time 

StepOne Applied Biosystems: 

• Reagenti TaqMan ® (qui di seguito) 

• Reagenti SYBR ® Green (pagina 2-4) 

Reagenti TaqMan ® 

Tipi di 

esperimento 

Sviluppo dei 

reagenti TaqMan 

Come agiscono i 


I reagenti TaqMan ® includono i saggi TaqMan ® (miscele pre-formulate contenenti 

set di sonde e primer) e le Master Mix TaqMan ® . I saggi sono specifici per il target di 

interesse. Le Master Mix contengono i componenti rimanenti necessari per la 

reazione PCR. È possibile utilizzare i reagenti TaqMan per i seguenti tipi di 

esperimento: 









Inizialmente, venivano utilizzati i fluorocromi intercalanti per misurare i prodotti 

della PCR in tempo reale. Lo svantaggio principale di questo metodo di rilevamento 

consiste nel fatto che esso rileva l'accumulo sia dei prodotti specifici sia dei prodotti 

non specifici della PCR. 

I sistemi per PCR in tempo reale sono stati migliorati con l'introduzione di sonde 

fluorogeniche-marcate che utilizzano l'attività 5′ nucleasica della Taq DNA 

polimerasi. La disponibilità di tali sonde fluorogeniche ha reso possibile lo sviluppo 

di un metodo in tempo reale per il rilevamento dei soli prodotti specifici di 

amplificazione. 

I reagenti TaqMan utilizzano una sonda fluorogenica per il rilevamento di uno 

specifico prodotto della PCR accumulatosi durante la PCR. Questo è il modo in cui 

essa agisce: 

1. Viene costruita una sonda oligonucleotidica con un fluorocromo reporter 

fluorescente legato all'estremità 5′ e un quencher sulla estremità 3′. 

Quando la sonda è intatta, la vicinanza del quencher riduce fortemente la 

fluorescenza emessa dal fluorocromo reporter mediante il trasferimento spaziale 

dell'energia di risonanza di fluorescenza (FRET; Förster resonance, Förster, V. 

T. 1948). 



Capitolo 2 


2. Qualora sia presente il target, la sonda esegue un annealing nella zona tra i 

primer e viene spaccata dall'attività 5′ nucleasica della Taq DNA polimerasi 

durante l'estensione. 

3. Tale scissione della sonda: 

– Separa il fluorocromo reporter dal quencher, aumentando il segnale del 

fluorocromo reporter. 

– Rimuove la sonda dall'elica del target, consentendo all'estensione del primer 

di continuare fino al termine dell'elica del templato. Perciò, l'inclusione della 

sonda non inibisce il processo della PCR nel complesso. 

4. Altre molecole di fluorocromo reporter vengono separate dalle rispettive sonde 

in ogni ciclo, con un aumento dell'intensità della fluorescenza proporzionale alla 

quantità di amplicone prodotto. Tanto più alto il numero di copie iniziali di 

DNA target, tanto prima si osserverà un aumento significativo della 

fluorescenza. 

Figura 2-1 illustra il processo. 

POLIMERIZZAZIONE 

RIMOZIONE ELICA 

SCISSIONE 

POLIMERIZZAZIONE COMPLETATA 

FORWARD 

PRIME 

5' 

3' 

R 

SONDA 

R = REPORTER 

Q Q = QUENCHER 

3' 

5' 

5' 

3' 

R 

Q 

3' 

5' 

5' 

3' 

R 

Q 

3' 

5' 

5' 

3' 

R 

Q 

3' 

5' 

5' 

REVERSE PRIMER 

3' 

5' 

5' 

3' 

5' 

5' 

3' 

5' 

5' 

3' 

5' 

Fase 1: Un reporter (R) e 

un quencher (Q) vengono 

legati alle estremità 5′ e 3′ 

di una sonda TaqMan ® . 

Fase 2: Quando entrambe 

le etichette sono legate alla 

sonda, l'emissione del 

fluorocromo reporter viene 

attenuata. 

Fase 3: Durante ogni ciclo 

di estensione, la Taq DNA 

polimerasi separa il 

fluorocromo reporter dalla 

sonda. 

Fase 4: Una volta 

separato dal quencher, il 

fluorocromo reporter 

emette la caratteristica 

fluorescenza. 

Figura 2-1 

Come agiscono i reagenti TaqMan 

Sonde TaqMan 

MGB 

Applied Biosystems raccomanda l'utilizzo generale delle sonde TaqMan ® MGB, 

specialmente quando le sonde convenzionali TaqMan ® superano i 30 nucleotidi. 

Le sonde TaqMan MGB contengono: 

• Un fluorocromo reporter alla estremità 5′ – Genera un segnale quando viene 

separato dall'attività 5′ nucleasica della DNA polimerasi. 

• Un quencher non fluorescente (NFQ) alla estremità 3′ – Consente ai sistemi 

PCR in tempo reale di eseguire la misurazione degli apporti del fluorocromo 

reporter più precisamente grazie alla non fluorescenza del quencher. 

• Un minor groove binder (MGB) alla estremità 3′ – Aumenta la temperatura 

di melting (Tm) delle sonde senza aumentare la lunghezza della sonda (Afonina 

et al., 1997; Kutyavin et al., 1997), consentendo in tal modo il disegno di sonde 

più corte. Di conseguenza, le sonde MGB TaqMan presentano una maggiore 

differenza nei valori della Tm tra le sonde abbinate e non abbinate; differenze 

maggiori nei valori della Tm forniscono una genotipizzazione accurata. 



2-3

Capitolo 2 


Applied Biosystems offre le seguenti sonde TaqMan MGB pre-disegnate con NFQ 

per l'utilizzo con il sistema StepOne : 

Etichetta fluorocromo 5' 

Etichetta 

fluorocromo 3' 

Altre 

caratteristiche 

Saggi TaqMan ® 

(sonda MGB 

TaqMan ® ) 


TaqMan ® (sonda 

MGB TaqMan ® ) 

Sonde personalizzate 

Espressione genica Fluorocromo FAM NFQ MGB 

Genotipizzazione SNP Fluorocromi FAM e VIC ® NFQ MGB 

Espressione genica Fluorocromo FAM NFQ MGB 

Genotipizzazione SNP Fluorocromi FAM e VIC ® NFQ MGB 

Sonda MGB 

Fluorocromo FAM , TET , NFQ MGB 

personalizzata TaqMan ® NED o VIC ® 



Reagenti SYBR ® Green 

Tipi di 

esperimento 

Sviluppo dei 

reagenti SYBR 

Green 

I reagenti SYBR ® Green includono primer e Master Mix contenenti il fluorocromo 

SYBR ® Green. È possibile utilizzare i reagenti SYBR Green per gli esperimenti di 

quantificazione: 




Nota: Non è possibile eseguire PCR multiplex utilizzando reagenti SYBR Green. 

Per ulteriori informazioni, vedere “Selezione PCR singleplex o multiplex” a 

pagina 3-10. 

È possibile dividere le piccole molecole che si legano al DNA a doppia elica in due 

classi: quelle che si intercalano nel DNA e quelle che si legano al minor groove del 

DNA. Higuchi (Higuchi et al., 1992) ha utilizzato l'intercalante bromuro di etidio per 

il rilevamento in tempo reale della PCR. L'Hoechst 33258 rappresenta un esempio di 

fluorocromo che si lega al minor groove la cui fluorescenza aumenta quando esso si 

lega al DNA a doppia elica (Higuchi et al., 1993). 

Senza tener conto del metodo di binding, è necessario che il fluorocromo che si lega 

al DNA per il rilevamento in tempo reale dei prodotti della PCR presenti almeno le 

seguenti due caratteristiche: 

• Aumento della fluorescenza quando esso si lega al DNA a doppia elica 

• Assenza di inibizione della PCR 

Applied Biosystems ha sviluppato le condizioni che consentono l'utilizzo del 

fluorocromo SYBR ® Green I nella PCR in assenza di inibizione della PCR e con una 

sensibilità di rilevamento aumentata in confronto al bromuro di etidio. 



Capitolo 2 


Come agiscono i 

reagenti SYBR 

Green 

I reagenti SYBR Green utilizzano il fluorocromo SYBR Green I per il rilevamento 

dei prodotti della PCR attraverso il legame al DNA a doppia elica durante la PCR. 

Questo è il modo in cui essa agisce: 

1. Quando la Master Mix PCR SYBR ® Green viene aggiunta a un campione, il 

fluorocromo SYBR Green I si lega immediatamente a tutti i DNA a doppia 

elica. 

2. Durante la PCR, la DNA polimerasi AmpliTaq Gold ® amplifica il target, 

creando il prodotto della PCR, o “amplicone.” 

3. Il fluorocromo SYBR Green I quindi si lega ad ogni nuova copia di DNA a 

doppia elica. 

4. Con il progredire della PCR, viene creata una maggiore quantità di amplicone. 

Poichè il fluorocromo SYBR Green I si lega a tutto il DNA a doppia elica, si 

ottiene un aumento di intensità della fluorescenza proporzionale alla quantità di 

prodotto della PCR a doppia elica che viene prodotto. 

Figure 2-2 qui di seguito si illustra il processo. 

Fase 1: Impostazione reazione 

Il colorante SYBR® Green 1 dà 

luogo a fluorescenza quando si lega 

al DNA a doppia elica. 

Fase 2: Denaturazione 

Quando il DNA viene denaturato, 

il fluorocromo SYBR® Green 1 viene 

rilasciato e la fluorescenza 

drasticamente ridotta. 

FORWARD 

PRIMER 

REVERSE 

PRIMER 

Fase 3: Polimerizzazione 

Durante l'estensione, i primer 

si legano al DNA e viene generato 

il prodotto della PCR. 

Fase 4: Polimerizzazione completata 

Il colorante SYBR® Green 1 si lega 

al prodotto a doppia elica, con un 

netto aumento della fluorescenza 

rilevata dallo strumento. 

Figura 2-2 

Come agiscono i reagenti SYBR Green 



2-5

Capitolo 2 


Selezione del tipo di reagente appropriato 

È possibile utilizzare i reagenti TaqMan e SYBR Green per i tipi di esperimento 

elencati qui di seguito. 

Tipo di esperimento 

Tipo di reagente 

Quantificazione ‡ 

(Capitolo 3) 


(Capitolo 4) 

Presenza/ 

Assenza 

(Capitolo 5) 

Reagenti SYBR ® Green Sì Non 

raccomandato 

Non 

raccomandato 

Reagenti TaqMan ® Sì Sì Sì 

‡ Include gli esperimenti con curva standard, con curva standard relativa e con C T 

comparativo. 



Capitolo 2 


Considerazioni 

per gli 

esperimenti di 


È possibile eseguire gli esperimenti di quantificazione sia con reagenti TaqMan sia 

con reagenti SYBR Green Nella scelta tra due tipi di reagenti considerare che: 

Tipo di reagente 

Reagenti o kit TaqMan ® 

Descrizione 

I reagenti TaqMan utilizzano una sonda 

fluorogenica per l'abilitazione al 

rilevamento di uno specifico prodotto della 

PCR accumulatosi durante i cicli PCR. 

Vantaggi 

• Con una sonda aumenta la specificità. 

L'ibridazione specifica tra la sonda e il 

target genera il segnale di fluorescenza. 

• Rende possibili le multiplex. 

• Sono disponibili saggi pre-formulati, 

ottimizzati per l'utilizzo sotto condizioni 

universali di ciclo termico. 

• È possibile utlilizzarli sia nella RT-PCR 

in 1 fase sia nella RT-PCR in 2 fasi. 

Limitazioni 

Richiede la sintesi di una sonda unica 


Descrizione 

I reagenti SYBR Green utilizzano il 

fluorocromo SYBR ® Green I, un 

fluorocromo legante il DNA a doppia elica, 

per il rilevamento dei prodotti della PCR 

accumulatisi durante i cicli PCR. 

Vantaggi 

• Economico (non è necessaria alcuna 

sonda). 

• Consente la misurazione della Tm di 

tutti i prodotti della PCR per l'analisi 

della curva di melting. 

• È possibile utlilizzarlo sia nella RT-PCR 

in 1 fase sia nella RT-PCR in 2 fasi. 

Limitazioni 

Si fissa non specificamente alle sequenze 

di DNA a doppia elica. Per prevenire falsi 

segnali positivi, verificare la formazione di 

un prodotto non specifico utilizzando la 

curva di melting oppure l'analisi del gel. 

PCR e rilevamento di cDNA 

a. Componenti del saggio 

Forward primer 

b. Templato denaturato e annealing dei componenti del saggio 


c. Generazione del segnale 

FORWARD 

PRIMER 

3' 

5' 

3' 

3' 

3' 

3' 

3' 

Templato di cDNA 


REVERSE 

PRIMER 

F 

F 

F 

Processo 

Sonda 

Sonda 

Q 

Q 

MGB 

MGB 

Reverse primer 

Q 

MGB 

5' 

3' 

5' 

5' 

5' 

5' 

5' 


cDNA 


RP 

F 

Q 

MGB 

Fase 1: Impostazione reazione 

Il colorante SYBR® Green 1 dà 

luogo a fluorescenza quando si lega 

al DNA a doppia elica. 

Fase 2: Denaturazione 

Quando il DNA viene denaturato, 

il fluorocromo SYBR® Green 1 viene 

rilasciato e la fluorescenza 

drasticamente ridotta. 

Fase 3: Polimerizzazione 

Durante l'estensione, i primer 

si legano al DNA e viene generato 

il prodotto della PCR. 

Fase 4: Polimerizzazione completata 

Il colorante SYBR® Green 1 si lega 

al prodotto a doppia elica, con un 

netto aumento della fluorescenza 

rilevata dallo strumento. 

LEGENDA 

Random Primer 

Colorante FAM 

Quencher 

Minor Groove 

Binder 

AmpliTaq Gold® 

DNA Polymerase 

Sonda 

Primer 

Templato 

Primer esteso 





2-7

Capitolo 2 


Riduzione al minimo delle contaminazione da DNA 

La capacità di amplificazione del DNA del processo PCR rende necessarie prassi 

speciali di laboratorio quando vengono eseguiti esperimenti utilizzando reagenti 

TaqMan o SYBR Green. La contaminazione potenziale può essere introdotta per 

mezzo di campioni con alte concentrazioni di DNA, sia da controlli del templato 

DNA sia dal carryover PCR. 

Inoltre, a causa della natura non specifica del fluorocromo SYBR Green I, verrà 

rilevato eventuale DNA a doppia elica. Nell'utilizzo dei reagenti SYBR Green, 

verificare la formazione di prodotto non specifico utilizzando la curva di melting o 

l'analisi del gel. Prevenire la contaminazione con DNA target. I saggi di espressione 

genica che rilevano le giunzioni esone-esone riducono al minimo l'effetto delle 

contaminazioni da gDNA (DNA genomico). 

Utilizzo dell'UNG 

per la riduzione al 

minimo della 

riamplificazione 

dei prodotti da 

carryover 

L'AmpErase ® uracil-N-glycosylase (UNG) è un enzima ricombinante di 26-kDa 

codificato dal gene dell'uracil-N-glycosylase di Escherichia coli . Questo gene è 

stato inserito in un host E. coli per dirigere l'espressione della forma nativa 

dell'enzima (Kwok and Higuchi, 1989). 

L'UNG agisce su DNA a singola o a doppia elica contenente dU.. Esso agisce 

idrolizzando i legami uracil-glycosidic in aree di DNA contenenti dU. L'enzima 

provoca il rilascio di uracile, creando in tal modo una area apyrimidic alcalinosensibile 

nel DNA. L'enzima non presenta attività su RNA o DNA contenente dT 

(Longo et al., 1990). 

Saggi TaqMan 

Per i saggi TaqMan ® , il trattamento con AmpErase ® UNG può prevenire la 

riamplificazione di prodotti PCR da carryover provenienti da precedenti reazioni. 

Quando dUTP sostituisce dTTP nell'amplificazione PCR, il trattamento con 

AmpErase UNG può rimuovere fino a 200.000 copie di amplicone per 50-μl di 

reazione. 

Nota: La TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix è disponibile con o senza 

AmpErase UNG. Nel caso si utilizzi la TaqMan ® Fast Universal PCR Master Mix 

(2✕), No AmpErase ® UNG, è necessario acquistare l'AmpErase UNG 

separatamente. 

Saggi con fluorocromo SYBR Green I 

Per i saggi con fluorocromo SYBR Green I, il trattamento con AmpErase UNG può 

prevenire la riamplificazione di prodotti PCR da carryover provenienti da precedenti 

reazioni PCR. Anche se la Master Mix Power SYBR ® Green PCR e la Master Mix 

SYBR ® Green PCR non contengono AmpErase UNG, esse contengono dUTP e sono 

perciò compatibili con AmpErase UNG. Nel caso si sospetti una contaminazione da 

carryover PCR, utilizzare AmpErase UNG per risolvere il problema. 

Nota: È possibile acquistare AmpErase UNG individualmente o come parte del kit 

SYBR ® Green PCR Core Reagents kit. 



Capitolo 2 


Prassi generali 

PCR 

Utilizzare le seguenti precauzioni per ridurre al minimo la contaminazione del 

campione e il carryover dei prodotti della PCR. 

• Nella preparazione dei campioni per l'amplificazione PCR indossare un camice 

da laboratorio pulito (non utilizzato precedentemente nella manipolazione di 

prodotti della PCR amplificati oppure durante la preparazione del campione). 

Sostituire i guanti nel caso se ne sospetti la contaminazione. 

• Mantenere aree separate, attrezzatura dedicata e forniture per: 

– Preparazione dei campioni. 

– Impostazione PCR. Non portare mai i prodotti della PCR amplificati 

nell'area impostazione PCR. 

– Amplificazione PCR. 

– Analisi dei prodotti della PCR. 

• Aprire e chiudere tutte le provette dei campioni con cautela. Evitare di spruzzare 

o di schizzare i campioni PCR. 

• Utilizzare pipettatori positive-displacement o air-displacement con puntali confiltro. 

Sostituire i puntali dopo ogni utilizzo. 

• Mantenere le reazioni e i componenti tappati il più possibile. 

• Pulire i banchi da laboratorio e le attrezzature periodicamente con una soluzione 

di candeggina al 10% o di etanolo al 70%. 



2-9

Capitolo 2 




Esperimenti di quantificazione 3 

3 


Sezione 3.1 Informazioni sugli esperimenti di quantificazione . . . . . . . . . . . . . . . 3-3 

Sezione 3.2 Linee guida disegno. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17 



3-1

Capitolo 3 




Capitolo 3 


Sezione 3.1 Informazioni sugli esperimenti di 


Questa sezione comprende i paragrafi: 


Selezione di un metodo di quantificazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5 

Selezione della RT-PCR one-step o two-step . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8 

Selezione PCR singleplex o multiplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10 

Selezione del tipo di reagente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13 

Selezione del tipo di saggio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13 



3-3

Capitolo 3 



Che cos'è un 

esperimento di 

quantificazione? 

Come si svolgono 

gli esperimenti di 



Un esperimento di quantificazione consiste in un esperimento in tempo reale che 

misura la quantità di una sequenza di acido nucleico target (target) durante ogni ciclo 

di amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR). Il target può essere 

DNA, cDNA o RNA. 

In questa guida vengono discussi tre tipi di esperimenti di quantificazione: 

• Curva standard (pagina 3-5) 

• Curva standard relativa (pagina 3-5) 

• C T comparativo (ΔΔC T ) (pagina 3-6) 

Negli esperimenti di quantificazione in tempo reale, le reazioni sono caratterizzate 

dal punto temporale durante la fase ciclica in cui l'amplificazione di un prodotto PCR 

raggiunge un livello fisso di fluorescenza, piuttosto che dalla quantità finale di 

prodotto della PCR accumulato dopo un numero fisso di cicli. Un plot di 

amplificazione visualizza graficamente la fluorescenza rilevata nel numero di cicli 

eseguiti. 

Nei cicli iniziali della PCR, non si verifica alcuna modifica significativa nel segnale 

di fluorescenza. Tale range pre-definito di cicli PCR è chiamato linea di base. 

Innanzitutto, il software genera un plot di amplificazione sottratto della linea di base 

attraverso il calcolo della tendenza matematica del segnale del reporter fluorescente 

normalizzato (valori Rn corrispondenti ai cicli della linea di base). Successivamente, 

un algoritmo ricerca il punto nel plot di amplificazione nel quale il segnale del 

reporter fluorescente normalizzato corretto con la linea di base (valore delta Rn 

[ΔRn]) interseca la soglia. Il ciclo frazionario nel quale il valore ΔRn interseca la 

soglia viene definito C T . 

Prima dell'esecuzione degli esperimenti di quantificazione sul sistema PCR Real- 

Time StepOne Applied Biosystems, prepararsi per l'esperimento come segue: 

1. Selezionare un metodo di quantificazione (pagina 3-5). 

2. Selezionare la RT-PCR in 1 fase o in 2 fasi (pagina 3-8). 

3. Selezionare reazioni PCR singleplex o multiplex (pagina 3-10). 

4. Selezionare il tipo di reagente (pagina 3-13). 

5. Selezionare il tipo di saggio (pagina 3-13). 

6. Rivedere le linee guida per il tipo di saggio selezionato (Sezione 3.2 a 

pagina 3-17). 



Capitolo 3 


Selezione di un metodo di quantificazione 

Informazioni sugli 

esperimenti con 

curva standard 

Gli esperimenti con curva standard determinano la quantità assoluta di un target in 

un campione. Per l'ottenimento dei risultati viene utilizzata una curva standard 

costruita da una serie di diluizioni di una quantità nota. 

Componenti 

Le reazioni PCR per gli esperimenti con curva standard includono i seguenti 

componenti: 

• Campione – Il campione nel quale la quantità del target è non nota. 

• Standard – Un campione dalla quantità nota. 

• Serie di diluizioni standard – Un set di diluizioni dello standard (ad esempio, 

1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) utilizzate per la costruzione di una curva standard. 

• Replicati – Reazioni identiche contenenti componenti e volumi identici. 

• Controlli negativi – Campioni contenenti acqua o buffer invece del templato; 

conosciuti anche come no template controls (controlli assenza templato) (NTC). 

I controlli negativi non devono amplificarsi. 




relativa 

Gli esperimenti con curva standard relativa determinano la modifica di espressione 

di un target in un campione rispetto allo stesso target in un campione di riferimento. 

Per l'ottenimento dei risultati viene utilizzata una curva standard costruita da una 

serie di diluizioni di una quantità nota. 

Gli esperimenti con curva standard relativa vengono utilizzati comunemente per: 

• Comparare i livelli di espressione di un gene in tessuti differenti. 

• Comparare i livelli di espressione di un gene in un campione trattato rispetto ad 

uno non trattato. 

• Comparare i livelli di espressione di alleli wild-type rispetto ad alleli mutati. 

Componenti 

Le reazioni PCR per gli esperimenti con curva standard relativa includono i seguenti 

componenti: 


• Campione di riferimento – Il campione utilizzato come base per i risultati 

comparativi. Ad esempio, in uno studio sugli effetti dei farmaci sull'espressione 

genica, un controllo non trattato costituisce un campione di riferimento 

appropriato. 

• Standard – Un campione dalla quantità nota. 



3-5

Capitolo 3 


• Serie di diluizioni standard – Un set di diluizioni dello standard (ad esempio, 

1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) utilizzate per la costruzione di una curva standard. Per 

tutti i campioni, la quantità target viene determinata per interpolazione dalla 

curva standard e successivamente dividendo per la quantità target del campione 

di riferimento. Poiché il campione di riferimento è il campione 1✕, tutte le altre 

quantità vengono espresse come n-volte la differenza relativa ad esso. Inoltre, 

l'unità dalla curva standard viene cancellata poiché la quantità del campione 

viene divisa per la quantità del campione di riferimento. Di conseguenza, ciò 

che si richiede degli standard è che siano note le diluizioni relative di essi. È 

possibile utilizzare qualunque stock di cDNA, RNA o DNA contenente il target 

appropriato per la preparazione degli standard. 

• Controllo endogeno – Un gene presente in tutti i campioni a un livello di 

espressione consistente. Il controllo endogeno viene utilizzato per normalizzare 

possibili variazioni nella quantità di cDNA aggiunta ad ogni reazione derivanti 

da inaccuratezza nel pipettaggio. 








Gli esperimenti con C T (ΔΔC T ) comparativo determinano la modifica di espressione 

di un target in un campione relativa allo stesso target in un campione di riferimento. 

Per l'ottenimento dei risultati vengono utilizzate formule aritmetiche (vedere 

“Formula per esperimenti con C T comparativo (ΔΔC T )” a pagina A-1). 

Gli esperimenti con C T comparativo vengono comunemente utilizzati per: 

• Comparare i livelli di espressione di un gene in tessuti differenti. 

• Comparare i livelli di espressione di un gene in un campione trattato rispetto ad 

uno non trattato. 

• Comparare i livelli di espressione di alleli wild-type rispetto ad alleli mutati. 

Componenti 

Le reazioni PCR per gli esperimenti con C T comparativo includono i seguenti 

componenti: 


• Campione di riferimento – Il campione utilizzato come base per i risultati 

comparativi. Ad esempio, in uno studio sugli effetti dei farmaci sull'espressione 

genica, un controllo non trattato costituisce un campione di riferimento 

appropriato. 

• Controllo endogeno – Un gene presente in tutti i campioni a un livello di 

espressione consistente. Il controllo endogeno viene utilizzato per normalizzare 

possibili variazioni nella quantità di cDNA aggiunta ad ogni reazione derivanti 

da inaccuratezza nel pipettaggio. 







Capitolo 3 


Confronto dei 

metodi di 


Nella scelta tra esperimenti con curva standard, curva standard relativa e esperimenti 

con C T comparativo, tenere in considerazione: 

Tipo di 

esperimento 

Descrizione Vantaggio Limitazione 


Utilizzare una curva standard 

per determinare la quantità 

assoluta di target in un 

campione. Utilizzata 

tipicamente per la 

quantificazione della carica 

virale. 

Consente il confronto con 

quantità standard note. 

È necessario costruire una 

curva standard per ogni target 

e questo richiede una quantità 

maggiore di reagenti e di 

spazio nella piastra di reazione. 


relativa 

Utilizzare una curva standard 

per determinare la modifica di 

espressione di un target in un 

campione relativa allo stesso 

target in un campione di 

riferimento. Metodo migliore 

per quei saggi che hanno 

efficienza di PCR sub-ottimale. 

Richiede la una minima 

validazione poiché non è 

necessario che le efficienze 

PCR del target e del controllo 

endogeno siano equivalenti. 

È necessario costruire una 

curva standard per ogni target 

e questo richiede una quantità 

maggiore di reagenti e di 

spazio nella piastra di reazione. 


(ΔΔC T ) 

Utilizzare formule aritmetiche 

per determinare la modifica di 

espressione di un target in un 

campione rispetto allo stesso 

target in un campione di 

riferimento. I migliori risultati si 

ottengono per misurazioni di 

massa dell'espressione genica 

di molti geni in molti campioni. 

• È possibile determinare i 

livelli relativi di target nei 

campioni senza l'utilizzo di 

una curva standard, 

assunto che le efficienze del 

target e del controllo 

endogeno siano 

relativamente equivalenti. 

• Utilizzo del reagente ridotto. 

• Maggiore spazio disponibile 

nella piastra di reazione. 

• Saggi sub-ottimali (bassa 

efficienza PCR) possono 

produrre risultati inaccurati. 

• Prima dell'utilizzo del 

metodo con C T 

comparativo, Applied 

Biosystems raccomanda 

che venga determinato che 

l'efficienza PCR per il 

saggio target sia 

approssimativamente 

uguale a quella del saggio 

controllo endogeno. 

Per ulteriori 

informazioni 

Per ulteriori informazioni sui metodi di quantificazione, fare riferimento al User 

Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression. 



3-7

Capitolo 3 


Selezione della RT-PCR one-step o two-step 

Viene utilizzata la trascrizione inversa-reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) 

per la quantificazione dell'RNA. La RT-PCR può essere eseguita come procedura in 

1 fase o in 2 fasi. 

Informazioni sulla 

RT-PCR in 1 fase 

Nella RT-PCR in 1 fase, la trascrizione inversa e la PCR vengono eseguite in un 

singolo sistema buffer (Figura 3-1). La reazione procede senza aggiunta di reagenti 

tra le fasi RT e PCR. La RT-PCR in 1 fase offre la convenienza di una preparazione a 

provetta singola per l'amplificazione RT e PCR. Comunque, non è possibile 

utilizzare l'enzima di prevenzione da carryover, AmpErase ® uracil-N-glycosylase 

(UNG), con una RT-PCR in 1 fase. Nella RT-PCR in 1 fase, la presenza dell'UNG 

distruggerebbe il cDNA appena prodotto. Per informazioni sull'UNG, vedere 

“Utilizzo dell'UNG per la riduzione al minimo della riamplificazione dei prodotti da 

carryover” a pagina 2-8. 

Provetta 

singola 

Figura 3-1 

Rappresentazione schematica di RT-PCR in 1 fase 


RT-PCR in 2 fasi 

L'RT-PCR in 2 fasi viene eseguita in due reazioni separate: una per l'RT e una per la 

PCR (Figura 3-2). L'RT-PCR in 2 fasi è utile per il rilevamento di trascitti multipli da 

una singola reazione cDNA oppure per la conservazione di cDNA per un utilizzo 

successivo. Nell'esecuzione di una PCR utilizzando dUTP come una delle basi, è 

possibile utilizzare l'enzima AmpErase ® UNG per prevenire la contaminazione da 

carryover. Per informazioni sull'UNG, vedere “Utilizzo dell'UNG per la riduzione al 

minimo della riamplificazione dei prodotti da carryover” a pagina 2-8. 



Capitolo 3 


Provetta 1 

Oligo d(T) o hexamer random 

Provetta 2 

Fase PCR 

Figura 3-2 

Rappresentazione schematica di RT-PCR in 2 fasi 

Primer utilizzati 

per la sintesi del 

cDNA 

Per la RT-PCR in 1 fase, è possibile utilizzare reverse primer specifici per la 

sequenza per la sintesi del cDNA. 

Per la RT-PCR in 2 fasi, è possibile utilizzare i seguenti primer per la sintesi del 

cDNA. 

• Oligo d(T) 16 

• Random primer 

• Reverse primer specifici per la sequenza 

La scelta dei primer per la trascrizione inversa può essere effettuata con maggiore 

efficacia dopo aver valutato sperimentalmente tutti e tre i sistemi di priming. Per 

sequenze brevi di RNA non contenenti alcun hairpin loop, uno qualunque dei tre 

sistemi di priming funziona ugualmente bene. Per trascritti di RNA più lunghi o 

sequenze contenenti hairpin loop, tenere in considerazione le seguenti linee guida: 

Primer 

Linee guida selezione 

Oligo d(T) 16 • Da utilizzare solo per la retrotrascrizione di mRNA eucariotici e 

retrovirus con code poly-A 

• Evitare lunghi trascritti di mRNA e ampliconi lunghi più di 

2 kilobasi a monte della coda di Poly-A 

Random primer • Da utilizzare con trascritti inversi lunghi oppure con trascritti 

inversi contenenti hairpin loop 

• Da utilizzare per la trascrizione tutti gli RNA (rRNA, mRNA e 

tRNA) 


specifici per la 

sequenza 

• Da uilizzare unicamente per la trascrizione inversa di 

contenenti sequenze complementari 

• Da utilizzare nella RT-PCR in 1 fase 



3-9

Capitolo 3 


Confronto dei 

metodi RT-PCR 

Metodo Primer per la sintesi del cDNA Commenti 

RT-PCR 

in 1 fase 

Reverse primer specifico per la 

sequenza 

Richiede miscela di reazione 

singola. 

Non è possibile utilizzare 

AmpErase ® UNG 


in 2 fasi 

Random esameri 

Oligo d(T) 16 

Reverse primer specifici per la 

sequenza 

Il cDNA può essere conservato per 

un utilizzo successivo 

È possibile utilizzare AmpErase ® 

UNG 

Richiede due miscele di reazione. 

Selezione PCR singleplex o multiplex 

È possibile eseguire una reazione PCR utilizzando: 

• PCR singleplex – Per esperimenti con curva standard, curva standard relativa e 

con C T comparativo. Nella PCR singleplex è presente un singolo set di primer 

nella provetta di reazione o nel pozzetto. È possibile amplificare un solo target o 

controllo endogeno per reazione. 

oppure 

• PCR multiplex – Per esperimenti con C T comparativo. Nella PCR multiplex, 

sono presenti due o più set di primer nella provetta o nel pozzetto di reazione. 

Ogni set amplifica un target specifico o un controllo endogeno. Tipicamente, 

una sonda etichettata con fluorocromo FAM rileva il target e una sonda 

etichettata con fluorocromo VIC ® rileva il controllo endogeno. 

IMPORTANTE! Non è possibile utilizzare reagenti SYBR ® Green per la PCR 

multiplex. 

IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'uso del fluorocromo 

TAMRA come reporter o quencher con il sistema StepOne. 

Singleplex PCR 

Multiplex PCR 

Set primer del target 

Set primer di controllo 

endogeno 

cDNA 

GR2331 

PCR multiplex 

per esperimenti 

con C T 

comparativo 

Allo scopo di eseguire una PCR multiplex per esperimenti con C T comparativo, è 

necessario: 

• Verificare che il controllo endogeno selezionato sia più abbondante (C T più 

basso) di tutti i target che si sta cercando di quantificare sotto tutte le condizioni. 

• Eseguire il saggio di controllo endogeno come un saggio limitato per il primer. 

È necessario che il saggio di controllo endogeno (per il templato più 

abbondante) in ogni reazione sia limitato per il primer per evitare la PCR 

competitiva che potrebbe alterare il C T del templato meno abbondante. 



Capitolo 3 


Limitazione primer nella PCR multiplex 

Per generare un saggio multiplex accurato, è importante che l'amplificazione di una 

sola specie non sia dominante sull'altra. In caso contrario, è possibile che 

l'amplificazione di una specie altamente abbondante impedisca la efficiente 

amplificazione della specie meno abbondante. 

In caso di mancata amplificazione efficiente della specie meno abbondante, è 

possibile che l'esperimento produca risultati non accurati oppure, in casi gravi, è 

possibile che il rilevamento della specie meno abbondante sia completamente inibito. 

È possibile evitare questa situazione limitando la concentrazione dei primer utilizzati 

per amplificare la specie più abbondante, “spegnendo” in tal modo l'amplificazione 

subito dopo che sia stato stabilito il C T . Comunque, è possibile che un saggio limitato 

per il primer sia più suscettibile a fluttuazioni in condizioni di reazione rispetto al 

saggio target non limitato per il target di cui è in atto la normalizzazione. Per ulteriori 

informazioni, vedere Appendice B, “Limitazione dei primer nella PCR multiplex.” 

PCR singleplex rispetto a PCR multiplex 

La limitazione dei primer nella PCR multiplex diventa progressivamente più 

complessa con l'aumentare del numero dei target che si desidera quantificare. 

Quando si analizzano numeri multipli di target, è possibile che sia più efficace 

l'utilizzo della PCR singleplex per le seguenti ragioni: 

• Nella PCR multiplex, è possibile che sia difficile trovare un controllo endogeno 

adeguato, cioè che: 

– Sia più abbondante rispetto a tutti i target di cui è in atto la quantificazione. 

– Non modifichi i livelli di espressione con le condizioni sperimentali o nel 

passaggio da un campione all'altro. 

È necessario prima che vengano eseguiti tutti i saggi target e i saggi controllo 

endogeno sia nel formato multiplex sia in quello singleplex, quindi comparare i 

valori C T derivanti da entrambi i formati per determinare se ci siano eventuali 

effetti relativi all'esecuzione multiplex sui valori C T . 

• Nella PCR singleplex, è possibile utilizzare come controllo endogeno 

qualunque target che non provochi modifiche dei livelli di espressione con le 

condizioni sperimentali o nel passaggio da un campione all'altro. Quindi, quanti 

più target siano in formato singleplex, tanto maggiore sarà la probabilità di 

avere uno o più controlli endogeni adeguati rispetto a quelli per normalizzare i 

rimanenti target. 

Nella scelta tra una PCR multiplex e una PCR singleplex per gli esperimenti con C T 

comparativo considerare quanto segue: 



3-11

Capitolo 3 


PCR Descrizione Vantaggio Limitazione 

Singleplex 

Una reazione in cui un 

target singolo o un 

controllo endogeno 

viene amplificato nel 

pozzetto o nella 

provetta di reazione. 

• Non è richiesta alcuna 

ottimizzazione per i saggi 

TaqMan ® . 

• È possibile utilizzare come 

controllo endogeno qualunque 

target che non subisca modifiche 

dei livelli di espressione con le 

condizioni sperimentali o nel 

passaggio da un campione 

all'altro. 

• Flessibilità nell'utilizzo dei reagenti 

TaqMan ® o SYBR ® Green. 

• Richiede il campione sia per il 

target sia per il controllo 

endogeno. 

Multiplex 

Una reazione in cui più 

di un target o controllo 

endogeno vengono 

amplificati nel pozzetto 

o nella provetta di 

reazione. 

• Riduce sia i costi di esecuzione 

sia la dipendenza da un accurato 

pipettaggio quando viene diviso 

un campione in due provette 

separate. 

• È necessario che il controllo 

endogeno venga eseguito come 

un saggio limitato per il primer. 

• Richiede validazione e 

ottimizzazione. 

• È possibile che non sia altrettanto 

efficace quanto una PCR 

singleplex quando viene 

analizzato un numero multiplo di 

target. 

• Non è possibile utilizzare reagenti 

SYBR ® Green. 



Capitolo 3 


Selezione del tipo di reagente 


rispetto ai 

reagenti SYBR 

Green 

È possibile eseguire gli esperimenti di quantificazione sul sistema StepOne con: 



Per informazioni sulla scelta tra reagenti TaqMan e reagenti SYBR Green, vedere 

“Considerazioni per gli esperimenti di quantificazione” a pagina 2-7. 


Per disegnare i propri esperimenti con il software StepOne, è possibile selezionare i 

seguenti tipi di saggi per gli esperimenti di quantificazione: 

• Inventariati/Prodotti su ordine (pagina 3-14) 

• Personalizzati (pagina 3-15) 

Questa sezione elenca i prodotti disponibili per ogni tipo di saggio. 

Nota: I saggi sono specifici per il target di interesse. Le Master Mix contengono i 

componenti rimanenti necessari per la reazione PCR. 



3-13

Capitolo 3 


Saggi 

inventariati/ 

prodotti su ordine 

Prodotto 

TaqMan ® Gene 

Expression Assays 

TaqMan ® Endogenous 

Control Assays 

Nota: I saggi di controllo 

endogeno TaqMan 

vengono inclusi come 

saggi di espressione 

genica TaqMan 

inventariati. 

Custom TaqMan ® Gene 


TaqMan ® 2✕ Universal 

PCR Master Mix (con o 

senza AmpErase ® UNG) 

TaqMan ® Fast Universal 

PCR Master Mix (2✕), No 


Attributi 

• Pre-disegnati, set di primer e sonde specifici per gene per 

geni umani, di topo, ratto, Arabidopsis, Drosophila, C. 

elegans, C. familiares (cane) e Rhesus. 

• Formato conveniente a provetta singola disponibile come 

saggi inventariati o prodotti su ordine. 

• Saggi di controllo endogeno pronti per l'uso, pre-formulati, 

ottimizzati. 

• Quantificazione di espressione genica efficace in termini di 

costo per uomo, topo, ratto, Arabidopsis, Drosophila e 

alcune specie eucariotiche. 

• Scelta della marcatura con fluorocromo FAM o con 

fluorocromo VIC ® (limitata per i primer). 

• Qualunque specie o organismo. 

• Target della scelta. 

• Formato conveniente provetta-singola. 

• Fornisce una prestazione ottimale per i saggi TaqMan ® che 

utilizzano cDNA o DNA come templato. 

• Contiene componenti che garantiscono una prestazione 

eccellente del saggio. 

• L'utilizzo di un solo reagente per tutti i saggi semplifica il 

processo di implementazione del saggio. 

• Fornisce gli stessi attributi elencati sopra per la Master Mix 

PCR Universal TaqMan ® 2✕. 

• Consente l'esecuzione degli esperimenti di quantificazione 

sul sistema StepOne in circa 35 minuti. 



Per le linee guida sul disegno degli esperimenti con saggi inventariati/prodotti su 

ordine, vedere pagina 3-18. 



Capitolo 3 


Saggi 

personalizzati 

Prodotto 

Custom TaqMan ® Probes 

and Primers 

Primer Express ® 

Software 

TaqMan ® 2✕ Universal 

PCR Master Mix (con o 


TaqMan ® Fast Universal 

PCR Master Mix (2✕), No 


Power SYBR ® Green 

PCR Master Mix 

SYBR ® Green PCR 

Master Mix 

Attributi 


• Scelta di fluorocromo, quencher e scale di sintesi. 

• Da utilizzare con il software Primer Express ® e le linee 

guida disegno saggi Applied Biosystems. 

Software per il disegno dei primer e delle sonde per la PCR in 

tempo reale. 







• Fornisce gli stessi attributi elencati sopra per la Master Mix 

PCR Universal TaqMan ® 2✕. 

• Consente l'esecuzione degli esperimenti di quantificazione 

sul sistema StepOne in circa 35 minuti. 

• La quantificazione altamente sensibile abilita il rilevamento 

di un basso numero di copie (due copie di un gene target). 

• Rileva il DNA a doppia elica, quindi non sono necessarie 

sonde specifiche. 

• Contiene la DNA polimerasi AmpliTaq Gold ® LD per ridurre 

al minimo la formazione del prodotto non specifico (incluso 

primer-dimer). 



• Rileva il DNA a doppia elica, quindi non sono necessarie 

sonde specifiche. 

• Per applicazioni standard quando non viene richiesta alta 

sensibilità. 

• Contiene DNA polimerasi AmpliTaq Gold ® per ridurre al 

minimo la formazione del prodotto non specifico (incluso 

primer-dimer). 





Per le linee guida sul disegno dei propri esperimenti con saggi personalizzati, vedere 

pagina 3-22. 



3-15

Capitolo 3 




Capitolo 3 


Sezione 3.2 Linee guida disegno 


Saggi inventariati/prodotti su ordine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18 

Saggi di espressione genica TaqMan ® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18 

Saggi di espressione genica TaqMan ® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20 

Selezione della Master Mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21 

Disegno dell'esperimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22 

Saggi personalizzati. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22 

Disegno dei primer e delle sonde utilizzando il software Primer Express ® . . . . 3-23 

Selezione dei reagenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-25 

Utilizzo delle condizioni di ciclo termico raccomandate . . . . . . . . . . . . . . 3-27 

Ottimizzazione delle concentrazioni primer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-30 

Ottimizzazione della concentrazione della sonda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-34 

Per ulteriori informazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-36 



3-17

Capitolo 3 




Nel caso venga selezionato il tipo di saggio inventariato/prodotto su ordine nel 

software StepOne , Applied Biosystems raccomanda di attenersi al flusso di lavoro 

indicato qui di seguito: 

1. Selezionare il saggio: 

• Saggi di espressione genica TaqMan ® (qui di seguito). 

• Saggi di espressione genica TaqMan ® personalizzati (pagina 3-20). 

2. Selezionare la Master Mix (pagina 3-21). 

3. Disegnare l'esperimento utilizzando il software StepOne (pagina 3-22). 

Saggi di espressione genica TaqMan ® 

Descrizione del 

prodotto 

Proprietà del 

prodotto 

I saggi di espressione genica TaqMan ® costituiscono una collezione completa di set 

di primer e sonde inventariati e prodotti su ordine che è possibile utilizzare per 

eseguire esperimenti di quantificazione su geni umani, di topo, ratto, Arabidopsis, 

Drosophila, C. elegans, C. familiares (cane) e Rhesus. 

Ogni saggio viene disegnato utilizzando un disegno automatico e una pipeline a 

qualità controllata. I saggi inventariati vengono prodotti e collocati nell'inventario; i 

saggi prodotti su ordine vengono pre-disegnati e prodotti al momento dell'ordine. 

Tutti i saggi di espressione genica TaqMan: 

• Richiedono tre componenti: 

– Da 1 a 100 ng di campione di cDNA (convertito da RNA) per pozzetto, con 

tutti i pozzetti di uno studio che presentano la stessa quantità di cDNA. 

– 20✕ Assay Mix di espressione genica (specifica per ogni target). Ogni Assay 

Mix consiste in due primer PCR non etichettati e in una sonda MGB (minor 

groove binder) TaqMan ® etichettata con fluorocromo FAM in una miscela 

pre-formulata 20✕. 1Le concentrazioni finali ✕ sono 250 nM per la sonda e 

900 nM per ogni primer. 

– TaqMan ® Universal PCR Master Mix (2✕) (con o senza AmpErase ® UNG) 

oppure TaqMan ® Fast Universal PCR Master Mix, No AmpErase ® UNG. 

• Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con una Master Mix TaqMan ® , 

utilizzando condizioni universali di ciclo termico. 

• Richiedono per l'ottenimento dei risultati una sola fase di amplificazione PCR e 

una lettura simultanea in tempo reale. 

• Quando possibile, amplificare il cDNA target senza amplificare il DNA 

genomico (suffisso m nell'ID del saggio) attraverso il disegno di sonde che 

attraversano le giunzioni esone-esone. 



Capitolo 3 


Saggi disponibili 

I saggi di espressione genicaTaqMan sono disponibili per geni umani, di topo, ratto, 

Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (cane) e Rhesus. I numeri di 

catalogo sono: 

• N. di cat. 4331182 per i saggi inventariati 

• N. di cat. 4351372 per i saggi prodotti su ordine 

Il prefisso del nome del saggio indica le specie per le quali è stato disegnato il 

saggio: Hs per Homo sapiens (umano), Mm per Mus musculus (topo), Rn per Rattus 

norvegicus (ratto), At per Arabidopsis thaliana, Dm per Drosophila melanogaster, 

Ce per C. elegans, Cf per C. familiares (cane), e Rh per Rhesus. 

Il suffisso del nome del saggio indica il posizionamento del saggio, come descritto 

nella tabella qui di seguito. 

Suffisso 

_m 

_s 

_g 

_mH 

_sH 

_gH 

_u 

Descrizione 

La sonda del saggio attraversa una giunzione esonica; il saggio non rileva 

DNA genomico. 

I primer e le sonde del saggio vengono disegnate all'interno di un singolo 

esone; il saggio può rilevare DNA genomico. 

È possibile che i primer e le sonde del saggio siano all'interno di un singolo 


Il saggio è stato disegnato per un trascritto appartenente a una famiglia di 

geni con alta omologia di sequenza. Il saggio fornisce una differenza tra 10 C T 

e 15 C T tra il gene del target e il gene con la omologia di sequenza più vicina. 

Quindi, il saggio rileva un trascritto del target con discriminazione (sensibilità) 

maggiore da 1000 a 3000 volte rispetto alla trascrizione omologa più vicina, 

qualora esse siano presenti nello stesso numero di copie in un campione. 

L'amplicone del saggio attraversa un giunzione esonica e la sonda risiede 

completamente in uno degli esone formati. 

Saggi di controllo endogeno TaqMan ® 

I saggi di controllo endogeno TaqMan ® vengono inclusi come saggi di espressione 

genica TaqMan inventariati (N.di cat. 4331182). I saggi di controllo endogeno 

TaqMan sono: 

• Disponibili come un saggio di espressione genica TaqMan con una sonda MGB 

TaqMan etichettata con fluorocromo FAM in una provetta 20✕ singola, 

preformulata. 

• Disponibili per tutte le specie umana, topo e ratto, sia con sonde MGB TaqMan 

marcate con fluorocromo VIC ® sia con sonde marcate con fluorocromo FAM . 

I controlli endogeni TaqMan con etichette con fluorocromo VIC sono limitati 

per i primer. 





3-19

Capitolo 3 


Per ulteriori 

informazioni 

• Per informazioni sui più recenti prodotti disponibili e sugli utilizzi specifici dei 

prodotti, fare riferimento al sito web Applied Biosystems: 

http://www.appliedbiosystems.com/ 

a. Nella pagina Home, sotto TaqMan ® Products (Prodotti TaqMan), 

selezionare TaqMan ® Gene Expression Assays (Saggi di espressione 

genica TaqMan). 

b. Nella pagina Gene Expression Assays & Arrays (Saggi e array di 

espressione genica), sotto Individual Assays (Saggi individuali), 



• Per informazioni sui saggi di controllo endogeno TaqMan personalizzati, fare 

riferimento alla nota applicativa Using TaqMan ® Endogenous Control Assays to 

Select an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note. 

• Per informazioni sulla preparazione di reazioni PCR utilizzando i saggi di 

espressione genica TaqMan, fare riferimento al protocollo TaqMan ® Gene 

Expression Assays Protocol. 

Saggi di espressione genica TaqMan ® personalizzati 


prodotto 


prodotto 

I saggi di espressione genica TaqMan ® personalizzati consistono in set di sonde 

TaqMan e primer disegnati, sintetizzati e formulati dall'assistenza saggi genomici 

TaqMan ® sulla base delle informazioni di sequenza inoltrate. I saggi di espressione 

genica TaqMan personalizzati consentono l'esecuzione di esperimenti di 

quantificazione su qualunque gene o variante accoppiata in qualunque organismo. 

I saggi utilizzano reagenti TaqMan per amplificare e rilevare il target in campioni di 

cDNA. Tutti i saggi vengono sviluppati utilizzando il software di disegno saggi 

proprietario. 

Tutti i saggi di espressione genica TaqMan personalizzati: 

• Richiedono la creazione di un submission file (utilizzando software liberi File 

Builder) con la sequenza target e inoltrare il file all'assistenza saggi genomici 

TaqMan personalizzati. 




– Saggio di espressione genica 20✕ oppure saggio di espressione genica 60✕ 

(specifico per ogni target). Ogni saggio consiste in due primer specifici per il 

target e in una sonda MGB TaqMan etichettata con fluorocromo FAM in 

una miscela pre-formulata 20✕ o 60✕. 1Le concentrazioni finali ✕ sono 

250 nM per la sonda e 900 nM per ogni primer. 

– TaqMan ® Universal PCR Master Mix (2✕) (con o senza AmpErase ® UNG) 

oppure TaqMan ® Fast Universal PCR Master Mix, No AmpErase ® UNG 

• Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con una Master Mix TaqMan, 

utilizzando condizioni universali di ciclo termico. 

• Richiedono per l'ottenimento dei risultati una sola fase di amplificazione PCR e 

una lettura simultanea in tempo reale. 



Capitolo 3 


Per ulteriori 

informazioni 







b. Nella pagina Gene Expression Assays & Arrays (Saggi e array di 


selezionare Custom TaqMan ® Gene Expression Assays (Saggi di 

espressione genica TaqMan personalizzati). 

• Per informazioni sull'ordine di saggi di espressione genica TaqMan 

personalizzati, fare riferimento al protocollo Custom TaqMan ® Genomic Assays 

Protocol: Linee guida submission. 


espressione genica TaqMan personalizzati, fare riferimento al protocollo 

Custom TaqMan ® Gene Expression Assays Protocol. 

Selezione della Master Mix 

Master Mix 

disponibili 

I saggi inventariati/prodotti su ordine per gli esperimenti di quantificazione Applied 

Biosystems vengono disegnati per l'utilizzo con le seguenti Master Mix TaqMan ® : 

Master Mix 

TaqMan ® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase ® UNG, 

250 reazioni 

Numero di 

catalogo 

4352042 

TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix, 200 reazioni 4304437 


10-Pack, TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix 4305719 

TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase ® UNG, 200 

reazioni 


reazioni 

10-Pack, TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase ® 

UNG 

4324018 

4326614 

4324020 

Per ulteriori 

informazioni 

Per informazioni sull'utilizzo dei reagenti TaqMan, fare riferimento a: 

• Protocollo TaqMan ® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol 

• Protocollo TaqMan ® Universal PCR Master Mix Protocol 



3-21

Capitolo 3 


Disegno dell'esperimento 

Utilizzo del 

software 

StepOne 

Per ulteriori 

informazioni 

Per i saggi inventariati/prodotti su ordine Applied Biosystems, utilizzare il software 

StepOne per il disegno dei propri esperimenti di quantificazione. Il software StepOne 

calcola automaticamente i volumi per: 

• Componenti miscela di reazione 

• Diluizioni del campione 

• Serie di diluizioni standard (Solo per esperimenti con curva standard e curva 

standard relativa) 

Nota: Per selezionare il tipo di saggio inventariato/prodotto su ordine nel software 

StepOne, andare alla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione) sia nel 

flusso di lavoro del Design Wizard sia in quello di impostazione avanzata, quindi 

selezionare Inventoried/Made to Order (Inventariato/Prodotto su ordine) nel 

menu a discesa Assay Type (Tipo di saggio). 

Per informazioni sul disegno e sulla esecuzione degli esperimenti di quantificazione 

sul sistema StepOne, fare riferimento a: 

• Guida introduttiva del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR 

System per gli esperimenti con curva standard 

• Guida introduttiva del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR 

System per gli esperimenti con curva standard relativa e C T comparativo 



Nel caso venga selezionato il tipo di saggio personalizzato nel software StepOne 

per un esperimento di quantizzazione (il disegno dei propri primer e delle proprie 

sonde), Applied Biosystems raccomanda di attenersi al flusso di lavoro per le linee 

guida disegno saggi Applied Biosystems: 

1. Disegnare i primer e le sonde utilizzando il software Primer Express ® (qui di 

seguito). 

2. Selezionare i reagenti appropriati (pagina 3-25). 



3. Utilizzare le condizioni di ciclo termico raccomandate (pagina 3-27). 



Capitolo 3 


4. Iniziare con le concentrazioni dei primer e delle sonde predefinite. Se 

necessario, ottimizzare le concentrazioni dei primer (pagina 3-30) e le 

concentrazioni delle sonde (pagina 3-34). 

IMPORTANTE! Questi passaggi forniscono un sistema rapido e attendibile per il 

disegno e l'ottimizzazione dei saggi solo quando utilizzati nella loro interezza. 

Adottare il sistema nella sua globalità per ottenere il più alto livello di successo. Per 

una descrizione più dettagliata delle linee guida per il disegno di saggi Applied 

Biosystems, vedere Appendice C. 

Nota: Per selezionare il tipo di saggio personalizzato nel software StepOne, andare 

alla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione) sia nel flusso di lavoro del 

Design Wizard sia in quello di impostazione avanzata, quindi selezionare Custom 

(Personalizzato) nel menu a discesa Assay Type (Tipo di saggio). 

Disegno dei primer e delle sonde utilizzando il software Primer Express ® 

Il software Primer Express ® utilizza i parametri raccomandati per la selezione di 

sonde e primer sulla base della sequenza DNA fornita. 

Nel caso sia in atto il disegno del proprio saggio, attenersi al riepilogo delle linee 

guida per il disegno del primer e della sonda per gli esperimenti di quantificazione a 

pagina 3-25. Per una discussione dettagliata di queste linee guida vedere 

“Informazioni sulle linee guida disegno primer e sonda.” a pagina 3-24. 



Nota: Sebbene non sia richiesta alcuna sonda per il rilevamento del fluorocromo 

SYBR ® Green I, è preferibile utilizzare il software Primer Express per la selezione di 

due primers e di una sonda nel disegno di un saggio per i reagenti SYBR ® Green. 

Anche se non sarà utilizzata alcuna sonda, i primer dovranno rispettare tutti i criteri 

richiesti; se è necessario convertire i saggi in reagenti TaqMan per ottenere maggiore 

specificità, è possibile trovare immediatamente la sonda nel documento originale del 

software Primer Express. 

Selezione di 

un'area 

dell'amplicone 

per i saggi di 


La selezione di una area ottimale per l'amplicone garantisce l'amplificazione del 

target mRNA/cDNA senza la co-amplificazione della sequenza genomica, di pseudogeni 

o altri geni correlati. I reagenti SYBR Green sono utili per individuare le aree 

dell'amplicone per l'espressione genica. 

Linee guida 

• L'amplicone dovrebbe attraversare uno o più intron per consentire 

l'amplificazione del gene target nel DNA genomico. 

• La coppia di primer dovrebbe essere specifica per il gene target per evitare 

l'amplificazione di pseudo-geni o di altri geni correlati. 

• Disegnare i primer utilizzando le linee guida del software Primer Express. 

• Nel caso non fosse trovata una sequenza ottimale, è necessario esaminare la 

sequenza e ridisegnare l'amplicone oppure semplicemente individuare altre 

aree. 



3-23

Capitolo 3 


Se il gene studiato non presenta intron, non è possibile disegnare un amplicone che 

amplifichi la sequenza mRNA senza amplificare la sequenza genomica. In tal caso, 

eseguire un controllo del campione RNA di cui non sia stata eseguita la trascrizione 

inversa (controlli meno RT). 

Informazioni sulle 

linee guida 

disegno primer e 

sonda. 

Selezioned di piccoli ampliconi 

Un importante parametro predefinito nel software Primer Express è costituito dalla 

selezione di ampliconi nel range delle coppie di basi 50-150. Gli ampliconi piccoli 

sono favoriti poiché promuovono una amplificazione ad alta efficienza. 

Inoltre, i saggi ad alta efficienza abilitano l'esecuzione della quantificazione relativa 

utilizzando il metodo con C T comparativo (ΔΔC T ) (Livak and Schmittgen, 2001). 

Questo metodo aumenta la resa del campione eliminando la necessità di curve 

standard nell'osservazione dei livelli di espressione di un target relativamente a un 

campione di riferimento. 

Contenuto G/C 

Quando possibile, selezionare i primer e le sonde in una area con contenuto G/C da 

30 a 80%. È possibile che le aree con contenuto G/C >80% non siano sottoposte a 

denaturazione ottimale durante il ciclo termico, ottenendo così una reazione meno 

efficiente. Le sequenze ricche di G/C sono suscettibili di interazioni non specifiche 

che possono ridurre l'efficienza della reazione e produrre un segnale non specifico 

nei saggi utilizzando reagenti SYBR Green. Evitare sequenze di primer e sonde 

contenenti stringhe di quattro o più basi G. 

Temperatura di melting 

Quando vengono selezionati primer e sonde con la temperatura di melting 

raccomandata (Tm), è possibile utilizzare condizioni di ciclo termico universali. 

Applied Biosystems raccomanda che la Tm della sonda sia 10 °C più alta di quella 

dei primer. 

Estremità 5′ delle sonde 

Il software Primer Express non seleziona sonde con una G sulla estremità 5′. 

L'effetto quenching di una base G in questa posizione sarà presente anche dopo la 

scissione della sonda, con ridotti valori di fluorescenza (ΔRn) che possono 

influenzare la prestazione del saggio. L'occorrenza di avere basi G in posizioni 

prossime alla estremità 5′, ma non su di essa, non ha mostrato di compromettere la 

prestazione del saggio. 

Estremità 3′ dei primer 

Per ridurre la possibilità di formazione di prodotto non specifico, verificare che le 

ultime cinque basi della estremità 3′ dei primer non contengano più di due basi C e/o 

G. In alcune circostanze, come una sequenza di template ricca di G/C, è possibile che 

sia necessario ridurre questa raccomandazione per mantenere l'amplicone sotto le 

150 coppie di basi in lunghezza. In generale, evitare le estremità 3′ dei primer 

estremamente ricche di basi G e/o C. 



Capitolo 3 


Riepilogo delle 

linee guida per il 

disegno di primer 

e sonde MGB 

Linee guida sonde 

Linee guida primer 

Selezionare prima la sonda, quindi disegnare i primer il più possibile vicino alla sonda 

evitando la sovrapposizione con la sonda (fortemente raccomandati ampliconi con 

lunghezze comprese tra 50 e 150 paia di basi. 

Mantenere il contenuto di G/C nel range da 30 a 80%. 

Evitare stringhe di un nucleotide identico, specialmente il guaninico, nel cui caso è da 

evitare l'esecuzione di quattro o più G. 

Nel caso di utilizzo del software Primer 

Express ® , è necessario mantenere la Tm tra 

68 e 70 °C. 

Assenza G sull'estremità 5′. 

Rendere le sonde MGB TaqMan ® il più 

corte possibile ma non più corte di 

13 nucleotidi. 

Nel caso di utilizzo del software Primer 

Express ® , è necessario mantenere la Tm tra 

58 e 60 °C. 

È necessario che i cinque nucleotidi alla 

estremità 3′ presentino non più di due basi 

G e/o C. 

Selezione dei reagenti 

Sono disponibili diversi reagenti TaqMan e SYBR Green per gli esperimenti di 

quantificazione. I reagenti utilizzati dipendono dal target: 

• DNA o cDNA (qui di seguito). 

• RNA utilizzando una RT-PCR in 1 fase (pagina 3-26). 

• RNA utilizzando una RT-PCR in 2 fasi (pagina 3-26). 

Nota: Nel caso si utilizzino reagenti SYBR Green, Applied Biosystems raccomanda 

fortemente i reagenti Power SYBR Green. 


DNA o cDNA 

Reagente 

Kit 

Numero di 

catalogo 


TaqMan ® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No 

AmpErase ® UNG, 250 reazioni 

4352042 

TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix, 200 

reazioni 

4304437 

TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix, 2000 

reazioni 

4326708 


TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix, No 


TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix, No 


10-Pack, TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix, 

No AmpErase ® UNG 

4324018 

4326614 

4324020 

TaqMan ® PCR Core Reagents Kit, 200 reazioni N808-0228 



3-25

Capitolo 3 


Reagente 

Reagenti SYBR ® 

Green 

Kit 

Power SYBR ® Green PCR Master Mix (1 mL), 

40 reazioni 

Power SYBR ® Green PCR Master Mix (5-mL), 

200 reazioni 

Power SYBR ® Green PCR Master Mix 

(10 × 5-mL), 2000 reazioni 

Power SYBR ® Green PCR Master Mix (50 mL), 

2000 reazioni 

Numero di 

catalogo 

4368577 

4367659 

4368708 

4367660 

SYBR ® Green PCR Master Mix (1-mL), 40 reazioni 4344463 

SYBR ® Green PCR Master Mix (5-mL), 

200 reazioni 

SYBR ® Green PCR Master Mix (50-mL), 

2000 reazioni 

4309155 

4334973 

SYBR ® Green PCR Core Reagents, 200 reazioni 4304886 


RNA utilizzando 

la RT-PCR 

in 1 fase 

Reagente 


Kit 

TaqMan ® One-Step RT-PCR Master Mix Reagents 

Kit 

Numero di 

catalogo 

4309169 

TaqMan ® EZ RT-PCR Core Reagents 

N808-0236 

Nota: Utilizzare i reagenti TaqMan ® EZ RT-PCR 

Core nel caso in cui sia necessaria una fase RT ad 

alta temperatura. 

Reagenti SYBR ® 

Green 

Power SYBR ® Green RT-PCR Reagents Kit 4368711 

SYBR ® Green RT-PCR Reagents 4310179 




in 2 fasi 

Reagente Fase Kit 

Reagenti Solo fase PCR TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master 

TaqMan ® Mix 

TaqMan ® Fast Universal PCR Master 

Mix (2✕), No AmpErase ® UNG 

Numero di 

catalogo 

4304437 

4352042 

Solo fase RT 

High-Capacity cDNA Reverse 

Transcription Kit 

TaqMan ® Reverse Transcription 

Reagents 

4374966 

N808-234 

Sia fase RT sia 

fase PCR 

TaqMan ® Gold RT PCR kit N808-232 



Capitolo 3 


Reagente Fase Kit 

Numero di 

catalogo 

Reagenti 

SYBR ® Green 

Solo fase PCR 

Power SYBR ® Green PCR Master 

Mix 

4367659 

SYBR ® Green PCR Master Mix 4309155 

Solo fase RT 

Sia fase RT sia 

fase PCR 

High-Capacity cDNA Reverse 

Transcription Kit 

TaqMan ® Reverse Transcription 

Reagents 

Power SYBR ® Green RT-PCR 

Reagents Kit 

4374966 

N808-234 

4368711 

SYBR ® Green RT-PCR Reagents 4310179 


DNA polimerasi 

AmpliTaq Gold 


trascrittasi 

inversa 

MultiScribe 

L'utilizzo della DNA polimerasi hot start AmpliTaq Gold ® è parte integrante delle 

linee guida disegno saggi Applied Biosystems sia per i reagenti TaqMan sia per i 

reagenti SYBR Green. La DNA polimerasi AmpliTaq Gold garantisce una reazione 

robusta e può drasticamente ridurre la quantità di prodotto non specifico formatosi. 

Un ulteriore beneficio è costituito dalla semplificazione dell'impostazione del 

saggio, che è possibile eseguire a temperatura ambiente. 

Nota: La DNA polimerasi inclusa nella Master Mix TaqMan Fast Universal PCR 

(2✕), No AmpErase UNG, è in grado di eseguire una PCR hot-start molto veloce. 

La prestazione è simile a quella della DNA polimerasi AmpliTaq Gold. 

La trascrittasi inversa MultiScribe consiste in una trascrittasi inversa di un virus 

Moloney Murine Leukemia (MuLV) ricombinante che esegue la trascrizione inversa 

dell'RNA in DNA complementare (cDNA). 

Utilizzo delle condizioni di ciclo termico raccomandate 

Utilizzare le condizioni di ciclo termico raccomandate per il campione: 

• DNA o cDNA (qui di seguito). 

• RNA utilizzando una RT-PCR in 1 fase (pagina 3-28). 

• RNA utilizzando una RT-PCR in 2 fasi (pagina 3-29). 

Nota: Le condizioni di ciclo termico per i reagenti veloci differiscono dalle 

condizioni di ciclo termico per i reagenti standard. 



3-27

Capitolo 3 



DNA o cDNA 

Per la Master Mix TaqMan Fast Universal PCR (2✕), No AmpErase UNG, attenersi 

alle seguenti condizioni: 

Tempi e temperature 

Fasi iniziali 

PCR (40 cicli) 

Attivazione ‡ 


Attivazione 

Melting 

Annealing/ 

Estensione 

ATTESA ATTESA CICLO 

2 min a 50 °C 20 sec a 95 °C 3 sec a 95 °C 30 sec a 60 °C 

‡ Richiesta solo se viene aggiunta alle reazioni AmpErase ® UNG. 

Per la Master Mix TaqMan 2✕ Universal PCR e la Master Mix Power SYBR Green 

PCR, attenersi alle seguenti condizioni: 

Tempi e Temperature 

Fasi iniziali 




Attivazione della 


AmpliTaq Gold ® 

Melting 

Annealing/ 

Estensione 


2 min a 50 °C 10 min a 95 °C 15 sec a 95 °C 1 min a 60 °C 

‡ Richiesta solo se viene aggiunta alle reazioni AmpErase ® UNG oppure se essa viene inclusa 

alla Master Mix. 




in 1 fase 

Per la Master Mix TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit oppure 

Power SYBR Green RT-PCR Reagents Kit, attenersi alle seguenti condizioni: 


Fasi iniziali 


Trascrizione 

inversa 

Attivazione della 


AmpliTaq Gold ® 

Melting 

Annealing/ 

Estensione 

ATTESA ATTESA 40 CICLI 


Nota: Queste condizioni non vengono applicate al kit TaqMan EZ RT-PCR. Vedere 

il protocollo TaqMan ® EZ RT-PCR Kit Protocol per le condizioni appropriate. 



Capitolo 3 





in 2 fasi 

Per il kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription, attenersi alle seguenti 

condizioni: 

Fase 


Fase 1 Fase 2 

1. Fase RT 

ATTESA 

ATTESA 

10 min a 25 °C 120 min a 37 °C 

Dopo aver eseguito la trascrizione inversa dell'RNA in cDNA (fase RT), è possibile 

conservare i campioni oppure utilizzarli per la fase PCR successiva descritta qui di 

seguito. 

IMPORTANTE! Per la maggior parte delle applicazioni e nel caso siano richieste 

grandi quantità di cDNA, Applied Biosystems raccomanda 120 minuti a 37 °C per la 

trascrizione inversa per ottenere una conversione ottimale. 

Per la Master Mix TaqMan 2✕ Universal PCR (con AmpErase UNG), oppure 

Master Mix Power SYBR Green PCR, attenersi alle seguenti condizioni: 

Fase 


Fasi iniziali 


2. Fase PCR 

Attivazione 

AmpErase ® 

UNG 

Attivazione 

della DNA 

polimerasi 

AmpliTaq 

Gold ® 

Melting 

Annealing/ 

Estensione 





3-29

Capitolo 3 


Per la Master Mix TaqMan Fast Universal PCR (2✕), No AmpErase UNG, attenersi 

alle seguenti condizioni: 

Fase 


Fasi iniziali 


2. Fase PCR 


AmpErase ® 

UNG 

Attivazione 

della DNA 

polimerasi 

AmpliTaq 

Gold ® 

Melting 

Annealing/Est 

ensione 


2 min a 50 °C 20 sec a 95 °C 3 sec a 95 °C 30 sec a 60 °C 

‡ Richiesta solo se viene aggiunta alle reazioni AmpErase ® UNG. 

Ottimizzazione delle concentrazioni primer 

Variando indipendentemente le concentrazioni del forward primer e del reverse 

primer, è possibile identificare le concentrazioni che forniscono una prestazione 

ottimale del saggio. I primer sono sempre in ampio eccesso molare durante la fase 

esponenziale dell'amplificazione PCR. 

Nel caso si utilizzi la Master Mix TaqMan 2✕ Universal PCR, Applied Biosystems 

raccomanda le concentrazioni dei primer elencate in “Concentrazioni primer 

predefinite” qui di seguito. Seguono discussioni dettagliate per: 

• Matrice ottimizzazione primer (qui di seguito) 

• Reagenti TaqMan (qui di seguito) 

• Reagenti SYBR Green (pagina 3-32) 

Concentrazioni 

primer predefinite 

Le concentrazioni dei primer iniziali raccomandate elencate nella tabella qui di 

seguito sono per saggi di quantificazione DNA e cDNA. 

Reagente 

Forward Primer 

Concentrazioni (nM) 

Reverse Primer 

Reagenti TaqMan ® 900 900 

Reagenti SYBR ® Green 50 50 



Capitolo 3 


Matrice 

ottimizzazione 

primer 


Una matrice di ottimizzazione primer consente di determinare che la minima 

concentrazione di primer produce il minimo C T e il massimo ΔR n . 

Una matrice di ottimizzazione primer può essere di aiuto nella compensazione del 

legame non specifico dei prime, con riduzione possibile della quantità del primer 

disponibile a legarsi alla sua area specifica. 

Per i saggi di quantificazione, è possibile ottenere la prestazione ottimale 

selezionando le concentrazioni dei primer che forniscono il più basso C T e il più alto 

ΔRn per una quantità fissata di templato target. 

Nota: Sebbene i valori C T costituiscano i parametri sulla base dei quali vengono 

assegnati i valori quantitativi nei saggi di quantificazione in tempo reale, i valori ΔRn 

possono essere altrettanto importanti quando si cerca di ottenere la massima 

sensibilità e riproducibilità. 

I risultati di un esperimento tipico della matrice di ottimizzazione primer dei reagenti 

TaqMan sono mostrati in Figura 3-3 a pagina 3-32: 

• LaFigura 3-3a mostra i plot di amplificazione per tutte le combinazioni delle 

concentrazioni dei primer in una visualizzazione lineare. 

• LaFigura 3-3b mostra gli stessi dati nel formato di visualizzazione logaritmica. 

La combinazione di forward primer e reverse primer di 50-nM (Plot gruppo C) 

fornisce sia il più basso ΔRn sia il più alto C T . Tutte le altre combinazioni di primer 

contenenti una concentrazione di 150-nM sia del forward primer sia del reverse 

primer (Plot gruppo B) forniscono un ΔRn ridotto. Tutte le combinazioni dei primer 

contenenti almeno 300-nM di forward primer e reverse primer (Plot gruppo A) 

forniscono sia il più alto ΔRn sia il più basso C T ; come risultato, qualunque dei 

gruppi dei plot A o B fornisce una prestazione ottimale. 



3-31

ΔRn 

ΔRn 

Capitolo 3 


a) Visualizzazione lineare 

} Plot Group A 

} Plot Group B 

} Plot Group C 

Cycle Ciclo 

b) Visualizzazione logaritmica 

} Plot Group A 

} Plot Group B 

} Plot Group C 

Cycle 

Ciclo 

Figura 3-3 Risultati sperimentali di ottimizzazione primer che mostrano i plot di 

amplificazione (visualizzazioni lineare e logaritmica) delle combinazioni dei 

primer 

Chiave gruppo Plot: 

A: Combinazioni contenenti almeno 300 nM di forward primer e reverse primer 

B: Combinazioni contenenti almeno 150 nM di forward primer e reverse primer 

C: Combinazioni contenenti almeno 50 nM di forward primer e reverse primer 

Reagenti SYBR 

Green 

L'ottimizzazione delle concentrazioni di primer è leggermente più complessa per i 

saggi di quantificazione utilizzando i reagenti SYBR Green. È necessario eseguire la 

stessa matrice di ottimizzazione primer dei reagenti TaqMan; comunque, è 

necessario includere i controlli negativi per i reagenti SYBR Green. Le 

concentrazioni dei primer selezionate forniscono un basso C T e un alto ΔRn quando 

eseguite rispetto al templato target, ma non danno luogo a formazione di prodotti non 

specifici con controlli negativi. 



Capitolo 3 


Le curve di melting o l'analisi del gel possono essere estremamente utili nel 

selezionare le concentrazioni ottimali dei primer per i saggi di quantificazione 

utilizzando i reagenti SYBR Green. La Figura 3-4 a pagina 3-33 mostra i risultati 

relativi a una matrice di ottimizzazione dei primer con le concentrazioni primer di 

900-nM di forward primer e reverse primer: 

• La Figura 3-4a mostra forte amplificazione dei pozzetti di controllo negativo, 

che indica che è in atto una significativa amplificazione non specifica. 

• La Figura 3-4b mostra che la temperatura di melting del prodotto generato in 

assenza del templato è più bassa della temperatura di melting del prodotto 

specifico generato con il templato, il che indica che è in atto una significativa 

amplificazione non secifica. 

I risultati mostrati in Figura 3-4 sono tipici della formazione di primer-dimer. Questi 

risultati indicano che le concentrazioni di primer più basse possono fornire i risultati 

migliori. Inotre, è possibile ridisegnare un altro set di primer al target di interesse. 

a) Plot di amplificazione, visualizzazione lineare 

Amplificazione target 

NC (amplificazione 

non specifica) 

Numero di ciclo 

b) Analisi curva di melting 

Derivativa 

(Fluorescenza non elaborata) 

NC 

(amplificazione 

non specifica) 

Target 

Amplificazione 

Temperatura ( C) 

Figura 3-4 Dati di amplificazione utilizzando reagenti SYBR ® Green 

(a) Plot di amplificazione (visualizzazione lineare) che dimostra sospetta 

amplificazione non specifica nei pozzetti di controllo negativo (NC). 

(b) Analisi della curva di melting che conferma che il prodotto nei pozzetti NC 

presenta una temperatura di melting diversa dal prodotto specifico. 



3-33

Capitolo 3 


Ottimizzazione della concentrazione della sonda 

Per il rilevamento con sonde TaqMan ® , la concentrazione sonde raccomandata di 

250 nM garantisce una eccellente prestazione del saggio. Comunque, in dipendenza 

dei requisiti del saggio, un esperimento di ottimizzazione sonde può mostrarsi utile. 

Nota: Per il rilevamento del fluorocromo SYBR Green I non è necessaria alcuna 

sonda. 

Concentrazioni 

sonde 

raccomandate 

Le concetrazioni delle sonde raccomandate per saggi di quantificazione DNA e 

cDNA utilizzando reagenti TaqMan sono di 250 nM. La Figura 3-5 mostra i risultati 

di un esperimento di ottimizzazione sonde in cui la concentrazione di sonde viene 

variata da 50 a 250 nM: 

• La Figura 3-5a mostra un aumento del ΔRn con l'aumento della concentrazione 

delle sonde. 

• La Figura 3-5b mostra che il valore C T si modifica con concentrazioni di sonda 

sufficenti. 

Per garantire la migliore riproducibilità, specialmente quando si vogliono rilevare 

bassi numeri di copie di un target, evitare concentrazioni con limitazione di sonde. 

Eseguire il saggio con una concentrazione delle sonde di 250 nM. Utilizzando una 

concentrazione di 250-nM, è possibile evitare la limitazione delle sonde e garantire 

ampi valori del ΔRn. Ampi valori del ΔRn indicano un saggio robusto in esecuzione 

con alta efficacia, fornendo alta generazione di prodotti e consentendo una accurata 

misurazione del picco. 



ΔRn 

ΔRn 

Capitolo 3 


a) Visualizzazione lineare 

250 nM Probe 

150 nM Probe 

100 nM Probe 

50 nM Probe 

Cycle Ciclo 

b) Visualizzazione logaritmica 

250 nM Probe 

150 nM Probe 

100 nM Probe 

50 nM Probe 

Ciclo Cycle 

Figura 3-5 Plot di amplificazione (visualizzazioni lineare e logaritmica) della 

titolazione della concentrazione della sonda da 50 a 250 nM 



3-35

Capitolo 3 


Per ulteriori informazioni 

Per informazioni su: 

• Utilizzo dei reagenti TaqMan, fare riferimento a: 

– Protocollo TaqMan ® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol 

– Protocollo TaqMan ® Universal PCR Master Mix Protocol 

• Utilizzo dei reagenti SYBR Green, fare riferimento a: 

– ProtocolloPower SYBR ® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol 

– ProtocolloSYBR ® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol 

– ProtocolloSYBR ® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol 

• Esecuzione degli esperimenti di quantificazione sul sistema StepOne, fare 

riferimento a: 

– Guida introduttiva del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time 

PCR System per gli esperimenti con curva standard 

– Guida introduttiva del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time 

PCR System per gli esperimenti con curva standard relativa e C T 

comparativo 

• Esecuzione degli esperimenti di presenza/assenza sul sistema StepOne, fare 

riferimento alla guida introduttiva Applied Biosystems StepOne Real-Time 

PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments. 



Esperimenti di genotipizzazione 4 

4 


Sezione 4.1 Informazioni sugli esperimenti di genotipizzazione . . . . . . . . . . . . . . 4-3 

Sezione 4.2 Linee guida disegno. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9 



4-1

Capitolo 4 




Capitolo 4 









4-3

Capitolo 4 



Che cos'è un 


genotipizzazione? 

Un esperimento di genotipizzazione è un esperimento end-point utilizzato per la 

determinazione del genotipo di campioni non noti. Con questo tipo di esperimento, è 

possibile differenziare un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP). 

Un esperimento di genotipizzazione determina se i campioni non noti siano: 

• Omozigoti (campioni che presentano solo l'allele 1) 

• Omozigoti (campioni che presentano solo l'allele 2) 

• Eterozigoti (campioni che presentano sia l'allele 1 sia l'allele 2) 

Componenti 

Le reazioni PCR per gli esperimenti di genotipizzazione includono i seguenti 

componenti: 

• Campione – Il campione nel quale il genotipo del target è non noto. 

• (Opzionale) Replicati – Reazioni identiche contenenti componenti e volumi 

identici. 




• (Opzionale) Controlli positivi – Campioni contenenti genotipi noti (omozigoti 

per l'allele 1, omozigoti per l'allele 2 e eterozigoti per gli alleli 1 e 2). 

Strumenti 

Gli esperimenti di genotipizzazione richiedono due fasi: ciclo termico 

(amplificazione PCR) seguito da rilevamento end-point dei segnali end-point 

risultanti. È possibile eseguire la fase di ciclo termico (amplificazione PCR) sul 

sistema PCR in tempo reale StepOne Applied Biosystems oppure su un termociclatore 

indipendente. 

In caso si utilizzi il sistema StepOne : 

• È possibile analizzare la PCR, con conseguenti vantaggi per la risoluzione di 

eventuali problemi. 

• Eseguire la lettura della piastra end-point separatamente. 

Come si svolgono 



Negli esperimenti di genotipizzazione, la PCR include una sonda specifica marcata 

con fluorocromo fluorescente per ogni allele. Le sonde contengono reporter 

fluorescenti differenti per differenziare ciascun allele. 

È possibile utilizzare sonde minor groove binder (MGB) TaqMan ® sul sistema 

StepOne. Ogni sonda MGB TaqMan ® contiene: 

• Un fluorocromo reporter alla estremità 5′ di ogni sonda 

– Il fluorocromo VIC ® è legato alla estremità 5′ della sonda dell'allele 1 

– Il fluorocromo FAM è legato alla estremità 5′ della sonda dell'allele 2 



Capitolo 4 


• Un minor groove binder (MGB) 

Questa modifica aumenta la temperatura di melting (Tm) delle sonde senza 

aumentarne la lunghezza (Afonina et al., 1997; Kutyavin et al., 1997), 

consentendo in tal modo il disegno di sonde più corte. Di conseguenza, le sonde 

MGB TaqMan presentano una maggiore differenza nei valori della Tm tra le 

sonde appaiate e non appaiate; differenze maggiori nei valori della Tm 

forniscono una genotipizzazione accurata. 

• Un quencher non fluorescente (NFQ) alla estremità 3′ della sonda. 

A causa della non fluorescenza del quencher, i sistemi PCR in tempo reale 

riescono a misurare gli apporti dei fluorocromi reporter con maggiore 

accuratezza. 

Durante la PCR, ogni sonda esegue un annealing specificamente alla sua sequenza 

complementare tra le regioni del forward primer e del reverse primer. La DNA 

polimerasi AmpliTaq Gold ® può degradare unicamente sonde che ibridano alla 

sequenza dell'allele (abbinamento). La scissione separa il fluorocromo reporter dal 

fluorocromo quencher, aumentando la fluorescenza del fluorocromo reporter. Perciò, 

i segnali di fluorescenza generati durante l'amplificazione PCR indicano gli alleli 

presenti nel campione. 

Mismatch tra sonda e sequenze alleliche 

I mismatch tra una sonda e l'allele (Figura 4-1) riducono l'efficienza dell'ibridazione 

della sonda. Inoltre, è probabile che la DNA polimerasi AmpliTaq Gold scalzi la 

sonda non ibridata piuttosto che degradarla per rilasciare il fluorocromo reporter. 

Allele 

1 

V 

appaiamento 

Q 

F Q 

Mancato appaiamento 

V 

F 

Legenda 

Fluorocromo 

VIC 

Fluorocromo 

FAM 

Allele 

2 

F 

Q 

V 

Q 

Q 

Quencher 

AmpliTaq 

Gold DNA 

Polymerase 

appaiamento 

Mancato appaiamento 

GR1556 

Figura 4-1 Risultati dell'appaiamento e del mancato appaiamento tra le 

sequenze dell'allele e della sonda negli esperimenti di genotipizzazione. 



4-5

Capitolo 4 


Tabella 4-1 riepiloga i possibili risultati dell'esempio di esperimento di 

genotipizzazione mostrato sopra. 

Tabella 4-1 Risultati esperimento di genotipizzazione 

Un aumento sostanziale di… 

Indica… 

Fluorescenza unicamente del fluorocromo Omozigosità per l'allele 1. 

VIC ® 

Fluorescenza unicamente del fluorocromo 

FAM Omozigosità per l'allele 2. 

Entrambi i segnali fluorescenti 

Eterozigosità. 


Prima dell'esecuzione degli esperimenti di genotipizzazione sul sistema StepOne, 

prepararsi per l'esperimento come segue: 

1. Selezionare il tipo di saggio (qui di seguito). 


pagina 4-9). 



seguenti tipi di saggi per gli esperimenti di genotipizzazione. 

• Pre-disegnati/Convalidati (qui di seguito) 





Nota: I reagenti TaqMan ® Fast e I reagenti SYBR ® Green non vengono supportati 

per gli esperimenti di genotipizzazione. 



Capitolo 4 


Saggi predisegnati/ 

convalidati 

Prodotto 

TaqMan ® SNP 

Genotyping Assays 

TaqMan ® Drug 

Metabolism Genotyping 

Assays 

Pre-Developed TaqMan ® 

Assay Reagents for 

Allelic Discrimination 

Master Mix TaqMan ® 2✕ 

Universal PCR (con o 


Attributi 

• Saggi pre-disegnati per la copertura di marcatori ad alta 

densità su tutto il genoma. 

• Per studi di screening, di associazione, di regioni 

candidate, di geni candidati o di mappatura fine. 


• Rilevano i polimorfismi in 220 geni che codificano per vari 

enzimi del metabolismo di farmaci e trasportatori di 

farmaci. 

• Per lo studio dei polimorfismi di un singolo nucleotide 

(SNP), inserzioni/delezioni (in/del) e polimorfismi multinucleotidi 

(MNP). 

• Eseguono la genotipizzazione di campioni di DNA purificati 

per mutazioni specifiche; la maggior parte dei saggi 

discriminano tra due alleli dei polimorfismi di un singolo 

nucleotide (SNP). 

• Aggiunto minor groove binder (MGB) per una migliore 

esecuzione della genotipizzazione. 

• Incluso DNA di controllo dell'allele 1 e dell'allele 2 per 

consentire la generazione di ciascun segnale omozigote in 

ciascuna esecuzione. 

• Il sistema a provetta chiusa non richiede alcuna 

manipolazione post-PCR o gel. 







Per le linee guida sul disegno dei propri esperimenti con saggi predisegnati/convalidati, 

vedere pagina 4-10. 

Saggi 


Prodotto 

Custom TaqMan ® SNP 

Genotyping Assays 

Master Mix TaqMan ® 2✕ 

Universal PCR (con o 


Attributi 

• Ogni polimorfismo di un singolo nucleotide (SNP) in 

qualsiasi organismo. 

• Rilevano inserimenti/delezioni (in/dels) di basi fino a 

numero massimo di sei. 

• Rilevano polimorfismi multi-nucleotidi (MNP) di basi fino a 

numero massimo di sei. 









pagina 4-14. 



4-7

Capitolo 4 




Capitolo 4 




Saggi pre-disegnati/convalidati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10 

Saggi genotipizzazione SNP TaqMan ® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10 

Saggi genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan ® . . . . . . . . . . 4-11 

Reagenti per i saggi pre-sviluppati TaqMan ® per discriminazione allelica . . . . 4-12 




Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan ® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . 4-15 





4-9

Capitolo 4 


Saggi pre-disegnati/convalidati 


Nel caso sia in atto il disegno di un esperimento di genotipizzazione utilizzando 

saggi pre-disegnati/convalidati Applied Biosystems, Applied Biosystems 

raccomanda di attenersi al flusso di lavoro indicato qui di seguito. 


• Saggi genotipizzazione SNP TaqMan ® (qui di seguito). 

• Saggi genotipizzazione metabolismo dei farmaci TaqMan ® (pagina 4-11). 

• Reagenti saggi pre-sviluppati TaqMan ® per discriminazione allelica 

(pagina 4-12). 



Saggi genotipizzazione SNP TaqMan ® 


prodotto 


prodotto 

I saggi di genotipizzazione SNP TaqMan ® consistono in una collezione completa di 

set di sonde e primer per la genotipizzazione di polimorfismi di un singolo 

nucleotide (SNP) per studi umani. 

I saggi utilizzano reagenti TaqMan ® per amplificare e rilevare gli alleli SNP specifici 

in campioni di DNA genomico purificati. Tutti i saggi vengono disegnati utilizzando 

software e pipeline bioinformatici Applied Biosystems e le informazioni genomiche 

provengono da Celera Genomics e da banche dati pubbliche. 

Tutti i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan: 


– Da 1 a 20 ng di campione di DNA genomico purificato 

– Assay Mix di genotipizzazione SNP 20✕, 40✕ o 80✕ (specifica per ogni 

polimorfismo). Ogni saggio consiste in forward primer e reverse primer 

specifici per la sequenza per l'amplificazione dell'SNP di interesse e in due 

sonde MGB TaqMan: Una sonda marcata con fluorocromo VIC ® rileva la 

sequenza dell'allele 1; una sonda marcata con fluorocromo FAM rileva la 

sequenza dell'allele 2. 

– Master Mix TaqMan ® 2✕ Universal PCR (con o senza AmpErase ® UNG) 

Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con la TaqMan Universal PCR Master 

Mix 2✕ (con o senza AmpErase UNG), utilizzando condizioni universali di ciclo 

termico. 

• Richiedono l'amplificazione PCR e la lettura end-point per l'ottenimento dei 

risultati. 



Capitolo 4 



I saggi di genotipizzazione SNP TaqMan sono disponibili in due categorie: 

Categoria 

Saggi di 

genotipizzazione SNP 

TaqMan ® convalidati e 

codificati 

Saggi di 

genotipizzazione SNP 

pre-disegnati TaqMan ® 

Descrizione 

• ~5000 saggi SNP in scala piccola, ~2000 dei quali sono 

saggi per SNP codificanti. 

• Inventariati (mantenuti in inventario per l'acquisto 

standardizzato). 

• Più di 4,5 milioni di saggi SNP pre-disegnati, inclusi 3,5 

milioni di saggi HapMap e ~68.000 saggi per SNP 

codificanti. 

• Disponibili in scala piccola, media e grande. 

• Prodotti su ordine (prodotti al momento dell'ordine). 

Per ulteriori 

informazioni 





selezionare TaqMan ® SNP Genotyping Assays (Saggi di 

genotipizzazione SNP TaqMan). 

b. Nella pagina SNP Genotyping Assays (Saggi genotipizzazione SNP), sotto 

Pre-Designed/Validated Assays (Saggi pre-disegnati/convalidati), 

selezionare TaqMan ® SNP Genotyping Assays (Saggi genotipizzazione 

SNP TaqMan). 


genotipizzazione SNP TaqMan, fare riferimento al protocollo TaqMan ® SNP 

Genotyping Assays Protocol. 

Saggi genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan ® 


prodotto 


prodotto 

I saggi di genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan ® consistono in una 

collezione completa di set di primer e sonde inventariati per la genotipizzazione SNP, 

inserimenti e delezioni (in/dels) e polimorfismi multi-nucleotidi (MNP) nei geni 

correlati al metabolismo di farmaci. 

I saggi utilizzano reagenti TaqMan per amplificare e rilevare i polimorfismi specifici 

in campioni di DNA genomico purificati. Tutti i saggi vengono disegnati utilizzando 

software e pipeline bioinformatici Applied Biosystems e le informazioni genomiche 

provengono da banche dati SNP pubbliche e da assemblies pubblici di genoma. 

Tutti i saggi genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan: 


– Da 3 a 30 ng di campione di DNA genomico purificato 

– Assay Mix genotipizzazione del metabolismo di farmaci 20✕ (specifica per 

ogni polimorfismo). Ogni saggio consiste in forward primer e reverse primer 

specifici per la sequenza per l'amplificazione della sequenza polimorfica di 

interesse e in due sonde MGB TaqMan: Una sonda marcata con fluorocromo 

VIC rileva la sequenza dell'allele 1; una sonda marcata con fluorocromo 

FAM rileva la sequenza dell'allele 2. 



4-11

Capitolo 4 


– TaqMan ® Universal PCR Master Mix 2✕ (con o senza AmpErase ® UNG) 

• Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con la Master Mix TaqMan 2✕ 

Universal PCR (con o senza AmpErase UNG), utilizzando condizioni universali 

di ciclo termico. 


risultati. 

Per ulteriori 

informazioni 









selezionare TaqMan ® Drug Metabolism Genotyping Assays (Saggi 

genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan). 


genotipizzazione SNP TaqMan, fare riferimento al protocollo TaqMan ® Drug 

Metabolism Genotyping Assays Protocol. 

Reagenti per i saggi pre-sviluppati TaqMan ® per discriminazione allelica 


prodotto 


prodotto 

Per ulteriori 

informazioni 

I reagenti per i saggi pre-sviluppati TaqMan ® per discriminazione allelica (PDAR 

TaqMan ® per DA) consistono in saggi inventariati ottimizzati per la discriminazione 

di alleli specifici. 

I PDAR TaqMan per DA richiedono quattro componenti: 

• Da 2 a 20 ng di campione di DNA genomico purificato 

• Assay Mix di discriminazione allelica 10✕ (specifica per ogni polimorfismo). 

Ogni saggio consiste in forward primer e reverse primer specifici per la 

sequenza per l'amplificazione della sequenza polimorfica di interesse e in due 

sonde MGB TaqMan: Una sonda marcata con fluorocromo VIC rileva la 

sequenza dell'allele 1; una sonda marcata con fluorocromo FAM rileva la 

sequenza dell'allele 2. 

• TaqMan ® Universal PCR Master Mix 2✕ (con o senza AmpErase ® UNG) 

Nota: Viene incluso con ogni saggio il DNA di controllo dell'allele 1 e dell'allele 2 

per consentire la generazione di ogni segnale omozigote in ciascuna esecuzione. 









Capitolo 4 





selezionare TaqMan ® Pre-Developed Assay Reagents for Allelic 

Discrimination (Reagenti saggi pre-sviluppati TaqMan per 

discriminazione allelica) (PDAR TaqMan ® per AD). 

• Per informazioni sulla preparazione di reazioni PCR utilizzando i PDAR per 

discriminazione allelica TaqMan, fare riferimento al protocollo Pre-Developed 

TaqMan ® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol. 

Master Mix 

disponibili 

I saggi pre-disegnati/convalidati per gli esperimenti di genotipizzazione Applied 


• I PDAR per AD TaqMan contengono TaqMan ® Universal PCR Master Mix 2✕ 

(con o senza AmpErase ® UNG) 

• È possibile utilizzare i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan e i saggi di 

genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati con: 

Master Mix 

Numero di 

catalogo 




TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase ® 

UNG, 200 reazioni 

TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase ® 

UNG, 2000 reazioni 

10-Pack, TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix, No 


4324018 

4326614 

4324020 

Nota: Gli esperimenti di genotipizzazione non vengono supportati utilizzando 

Universal Fast PCR Master Mix TaqMan ® . 

Per ulteriori 

informazioni 

Per informazioni sull'utilizzo di Master Mix TaqMan, fare riferimento al protocollo 

TaqMan ® Universal PCR Master Mix Protocol. 



4-13

Capitolo 4 



Utilizzo del 

software 

StepOne 

Per ulteriori 

informazioni 

Per i saggi pre-disegnati/convalidati Applied Biosystems, utilizzare il software 

StepOne per il disegno dei propri esperimenti di genotipizzazione. Il software 

StepOne calcola automaticamente i volumi per: 








Per informazioni sul disegno e sull'esecuzione degli esperimenti di genotipizzazione 

sul sistema StepOne, fare riferimento alla Guida introduttiva del sistema Applied 

Biosystems StepOne Real-Time PCR System per gli esperimenti di 

genotipizzazione. 



Nel caso sia in atto il disegno di un esperimento di genotipizzazione utilizzando 

saggi personalizzati Applied Biosystems, Applied Biosystems raccomanda di 

attenersi al flusso di lavoro indicato qui di seguito: 

1. Ordine del saggio: Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan ® personalizzati (qui 

di seguito). 

2. Selezione della Master Mix (pagina 4-16). 

3. Disegno dell'esperimento utilizzando il software StepOne (pagina 4-17). 



Capitolo 4 


Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan ® personalizzati 


prodotto 

I saggi di genotipizzazione SNP TaqMan ® personalizzati consistono in set di sonde 

TaqMan e primer disegnati, sintetizzati e formulati dall'assistenza saggi genomici 

TaqMan ® sulla base delle informazioni di sequenza immesse. I saggi di 

genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati consentono di: 

Azione 

Eseguire studi di genotipizzazione con 

eventuali possibili polimorfismi di un 

singolo nucleotide (SNP) in eventuali 

organismi 

Rilevare inserimenti/delezioni (in/dels) di 

basi fino a numero massimo di sei per studi 

di genotipizzazione 

Rilevare polimorfismi multi-nucleotidi 

(MNP) di basi fino a numero massimo di sei 

per studi di genotipizzazione 

Esempio 

AGTTCATCCATGGTCA --> 

AGTTCATACATGGTCA 

Annotato come: AGTTCAT[C/A]CATGGTCA 

AGTTCATCCATGGTCA --> 

AGTTCATGGTCA 

Annotato come: AGTTCAT[CCAT/*]GGTCA 

AGTTCATCCGGTCA --> 

AGTTCATATGGTCA 

Annotato come: AGTTCAT[CC/AT]GGTCA 

I saggi utilizzano reagenti TaqMan per amplificare e rilevare i polimorfismi specifici 

in DNA genomico purificato (gDNA). Tutti i saggi vengono sviluppati utilizzando il 

software di disegno saggi proprietario. 


prodotto 

Tutti i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati: 

• Richiedono la creazione di un submission file (utilizzando il software File 

Builder) con la propria sequenza SNP target e l'inoltro del file all'assistenza 

saggi genomici TaqMan ® . 


– Da 1 a 20 ng di campione di gDNA purificato per pozzetto 

Nota: È possibile utilizzare campioni di cDNA; comunque, Applied 

Biosystems non fornisce raccomandazioni allo stato attuale per un utilizzo di 

cDNA con i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati. 

– Saggio di genotipizzazione SNP 40✕ o saggio di genotipizzazione SNP 80✕ 

(specifico per ogni polimorfismo). Ogni saggio consiste in forward primer e 

reverse primer specifici per la sequenza per l'amplificazione dell'SNP di 

interesse e in due sonde MGB TaqMan: Una sonda marcata con fluorocromo 

VIC rileva la sequenza dell'allele 1; una sonda marcata con fluorocromo 

FAM rileva la sequenza dell'allele 2. 

– TaqMan ® Universal PCR Master Mix 2✕ (con o senza AmpErase ® UNG) 

• Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con la TaqMan ® Universal PCR 

Master Mix 2✕ (con o senza AmpErase UNG), utilizzando condizioni 

universali di ciclo termico. 


risultati. 



4-15

Capitolo 4 


Per ulteriori 

informazioni 








Custom Assays (Saggi personalizzati), selezionare Custom TaqMan ® 

SNP Genotyping Assays (Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan 

personalizzati). 

• Per informazioni sull'ordine di saggi di genotipizzazione SNP TaqMan 


Protocol: Submission Guidelines. 


genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati, fare riferimento al protocollo 

Custom TaqMan ® SNP Genotyping Assays Protocol. 


Master Mix 

disponibili 

I saggi prodotti su ordine per gli esperimenti di genotipizzazione Applied 

Biosystems vengono disegnati per l'utilizzo con le seguenti Master Mix TaqMan: 

Master Mix 

Numero di 

catalogo 





reazioni 


reazioni 


UNG 

4324018 

4326614 

4324020 

Nota: Gli esperimenti di genotipizzazione non vengono supportati utilizzando 

Master Mix PCR veloci TaqMan ® . 

Per ulteriori 

informazioni 

Per informazioni sull'utilizzo di Master Mix TaqMan, fare riferimento al protocollo 

TaqMan ® Universal PCR Master Mix Protocol. 



Capitolo 4 



Utilizzo del 

software 

StepOne 

Per ulteriori 

informazioni 

Per i saggi personalizzati Applied Biosystems, utilizzare il software StepOne per il 

disegno dei propri esperimenti di genotipizzazione. Il software StepOne calcola 

automaticamente i volumi per: 








Per informazioni sul disegno e sull'esecuzione degli esperimenti di genotipizzazione 

sul sistema StepOne, fare riferimento alla Guida introduttiva del sistema Applied 

Biosystems StepOne Real-Time PCR System per gli esperimenti di 

genotipizzazione. 



4-17

Capitolo 4 




Esperimenti di presenza/assenza 5 

5 


Sezione 5.1 Informazioni sugli esperimenti di presenza/assenza . . . . . . . . . . . . . . 5-3 

Sezione 5.2 Linee guida disegno. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9 



5-1

Capitolo 5 




Capitolo 5 



presenza/assenza 






5-3

Capitolo 5 



Cos'è un 


presenza/ 

assenza? 

Un esperimento di presenza/assenza consiste in un esperimento end-point che indica 

la presenza o l'assenza di una specifica sequenza dell'acido nucleico (target) in un 

campione. La quantità attuale del target non viene determinata. 

Gli esperimenti di presenza/assenza vengono comunemente utilizzati per rilevare la 

presenza o l'assenza di un patogeno, come un patogeno virale o batterico. Ad 

esempio, è possibile utilizzare un esperimento di presenza/assenza per determinare 

se batteri Salmonella siano presenti nella carne di un hamburger. I risultati 

indicheranno se i batteri Salmonella siano presenti o non presenti; la quantità di 

batteri non viene determinata. 

Componenti 

Le reazioni PCR per gli esperimenti di presenza/assenza includono i seguenti 

componenti: 

• Campione – Il campione nel quale la presenza di un target è non nota. 


• Controllo positivo interno (IPC) – Un templato di DNA sintetico di piccole 

dimensioni aggiunto alle reazioni PCR. È possibile utilizzare l'IPC per 

distinguere tra i risultati negativi e le reazioni influenzate dagli inibitori della 

PCR, dall'impostazione errata del saggio o da un problema del reagente o dello 

strumento. 

• Pozzetti IPC bloccati a controllo negativo – Pozzetti che contengono agente 

bloccante IPC invece del campione nella reazione PCR. Nei pozzetti IPC 

bloccati a controllo negativo non deve verificarsi alcuna reazione di 

amplificazione in quanto la reazione non contiene alcun campione e 

l'amplificazione dell'IPC è bloccata. 

• Pozzetti IPC a controllo negativo – Pozzetti che contengono templato IPC e 

buffer o acqua invece del campione nella reazione PCR. Solo il templato IPC 

dovrebbe amplificarsi nei pozzetti IPC a controllo negativo, in quanto la 

reazione non contiene campione. 

Nota: È possibile eseguire gli esperimenti di presenza/assenza senza un IPC; 

comunque, l'IPC garantisce che una PCR non riuscita non venga confusa con un 

risultato negativo di un test. 

Rilevazione endpoint 

e lettura 

della piastra 

post-PCR 

Gli esperimenti di presenza/assenza consistono in esperimenti end-point, nei quali i 

dati di fluorescenza vengono acquisiti dopo il completamento della PCR. 

Come assistenza nella risoluzione problemi per gli esperimenti di presenza/assenza, 

è possibile utilizzare il sistema PCR Real-Time StepOne Applied Biosystems per 

eseguire la PCR in tempo reale. Nel caso venga utilizzato il sistema StepOne per 

l'amplificazione PCR, eseguire le sessioni di lettura pre-PCR e post-PCR 

separatamente. 



Capitolo 5 


Svolgimento degli 

esperimenti 

di presenza/ 

assenza 

Durante la PCR, le sonde fluorogeniche eseguono un annealing al target 

complementare tra le regioni del forward primer e del reverse primer sul DNA del 

templato. Quindi durante l'estensione, la DNA polimerasi AmpliTaq Gold ® degrada 

le sonde ibridate in ogni campione contenente il target. La degradazione di ogni 

sonda appaiata separa il fluorocromo reporter dal fluorocromo quencher, con 

aumento della fluorescenza del reporter. 

Dopo la PCR ciclica, lo strumento StepOne legge la fluorescenza generata durante 

l'amplificazione PCR. I segnali fluorescenti vengono utilizzati per il rilevamento 

della presenza o dell'assenza del target in ogni campione. I segnali reporter vengono 

normalizzati alla emissione di un riferimento passivo, come segue: 

R n (TT) = Intensità di emissione della sequenza del templato 

target 

Intensità di emissione del riferimento passivo 

R n (IPC) = Intensità di emissione del controllo positivo interno 

Intensità di emissione del riferimento passivo 

Incorporamento di un IPC 

Un IPC è costituito da un secondo set di sonde TaqMan ® e primer aggiunto alla 

piastra di reazione per il rilevamento di acido nucleico costitutivo, a basso numero di 

copie. L'IPC e il target vengono amplificati simultaneamente nello stesso pozzetto di 

reazione. Qualora un pozzetto non presenti amplificazione, il software StepOne 

utilizza il segnale positivo proveniente dall'IPC per confermare la mancata 

amplificazione del pozzetto a causa di una mancanza di templato target, piuttosto che 

a causa di un errore di pipettaggio o inibizione. 





Prima dell'esecuzione degli esperimenti di presenza/assenza sul sistema StepOne, 

prepararsi per l'esperimento come segue: 

1. Selezionare il tipo di saggio (qui di seguito). 


pagina 5-9). 



seguenti tipi di saggi per gli esperimenti di presenza/assenza: 

• Inventariati/Prodotti su ordine (pagina 5-6) 




5-5

Capitolo 5 





Nota: I reagenti TaqMan ® veloci e i reagenti SYBR ® Green non vengono supportati 

per gli esperimenti di presenza/assenza. 

Saggi 

inventariati/ 

prodotti su ordine 

Prodotto 

TaqMan ® Gene 


TaqMan ® Endogenous 

Control Assays 

Nota: I saggi di controllo 

endogeno TaqMan 

vengono inclusi come 

saggi di espressione 

genica TaqMan 

inventariati. 

Custom TaqMan ® Gene 


TaqMan ® Universal PCR 

Master Mix 2✕ (con o 


Attributi 

• Pre-disegnati, set di primer e sonde specifici per gene per 

geni umani, di topo, ratto, Arabidopsis, Drosophila, C. 

elegans, C. familiares (cane) e Rhesus. 

• Formato conveniente a provetta singola disponibile come 

saggi inventariati o prodotti su ordine. 

• Saggi di controllo endogeno pronti per l'uso, pre-formulati, 

ottimizzati. 

• Quantificazione di espressione genica efficace in termini di 

costo per uomo, topo, ratto, Arabidopsis, Drosophila e 

alcune specie eucariotiche. 

• Scelta delle etichette con fluorocromo FAM o con 

fluorocromo VIC ® (con primer limitanti). 


• Target della scelta. 










Per le linee guida sul disegno degli esperimenti con saggi inventariati/prodotti su 

ordine, vedere pagina 5-10. 



Capitolo 5 


Saggi 


Prodotto 

Custom TaqMan ® Probes 

and Primers 

Primer Express ® 

Software 

TaqMan ® Universal PCR 

Master Mix 2✕ (con o 


Attributi 

• Alcune specie o organismo. 

• Scelta delle etichette con fluorocromo, di quencher e scale 

di sintesi. 



Software per il disegno dei primer e delle sonde per la PCR in 

tempo reale. 










pagina 5-15. 



5-7

Capitolo 5 




Capitolo 5 




Saggi inventariati/prodotti su ordine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10 

Saggi di espressione genica TaqMan ® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10 

Saggi di espressione genica TaqMan ® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12 

Reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan ® . . . . . . . . . . . . . . 5-13 






5-9

Capitolo 5 




Nel caso venga selezionato il tipo di saggio inventariato/prodotto su ordine nel 

software StepOne , Applied Biosystems raccomanda di attenersi al flusso di lavoro 

indicato qui di seguito: 


• Saggi di espressione genica TaqMan ® (qui di seguito). 

• Saggi di espressione genica TaqMan ® personalizzati (pagina 5-12). 

2. Utilizzare i reagenti di controllo positivo interno esogeno IPC TaqMan ® 







Saggi di espressione genica TaqMan ® 


prodotto 


prodotto 

I saggi di espressione genica TaqMan ® costituiscono una collezione completa di set 

di primer e sonde inventariati e prodotti su ordine che è possibile utilizzare per 

eseguire esperimenti di presenza/assenza su geni umani, di topo, ratto, Arabidopsis, 

Drosophila, C. elegans, C. familiares (cane) e Rhesus. 

Ogni saggio viene disegnato utilizzando un disegno automatico e una pipeline a 

qualità controllata. I saggi inventariati vengono prodotti e collocati nell'inventario; i 

saggi prodotti su ordine vengono pre-disegnati e prodotti al momento dell'ordine. 

Tutti i saggi di espressione genica TaqMan: 




– Assay Mix di espressione genica 20✕ (specifica per ogni target). Ogni Assay 

Mix consiste in due primer PCR non etichettati e in una sonda MGB 

TaqMan ® etichettata con fluorocromo FAM in una miscela pre-formulata 

20✕. Le concentrazioni finali 1✕ sono 250 nM per la sonda e 900 nM per 

ogni primer. 

– TaqMan ® Universal PCR Master Mix (con o senza AmpErase ® UNG) 

• Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con la TaqMan ® Universal PCR 

Master Mix (con o senza AmpErase UNG), utilizzando condizioni universali di 

ciclo termico. 

• Quando possibile, amplificare il cDNA target senza amplificare il DNA 

genomico (suffisso m nell'ID del saggio) attraverso il disegno di sonde che 

attraversano le giunzioni esone-esone. 



Capitolo 5 



I saggi di espressione genicaTaqMan sono disponibili per geni umani, di topo, ratto, 

Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (cane) e Rhesus. I numeri di 

catalogo sono: 

• N. di cat. 4331182 per i saggi inventariati 

• N. di cat. 4351372 per i saggi prodotti su ordine 

Il prefisso del nome del saggio indica le specie per le quali è stato disegnato il 

saggio: Hs per Homo sapiens (umano), Mm per Mus musculus (topo), Rn per Rattus 

norvegicus (ratto), At per Arabidopsis thaliana, Dm per Drosophila melanogaster, 

Ce per C. elegans, Cf per C. familiares (cane), e Rh per Rhesus. 

Il suffisso del nome del saggio indica il posizionamento del saggio, come descritto 

nella tabella qui di seguito. 

Suffisso 

_m 

_s 

_g 

_mH 

_sH 

_gH 

_u 

Descrizione 

La sonda del saggio attraversa una giunzione esonica; il saggio non rileva 

DNA genomico. 

I primer e le sonde del saggio vengono disegnate all'interno di un singolo 


È possibile che i primer e le sonde del saggio siano all'interno di un singolo 


Il saggio è stato disegnato a una trascrizione appartenente a una famiglia di 

geni con alta omologia di sequenza. Il saggio fornisce una differenza tra 10 C T 

e 15 C T tra il gene del target e il gene con la omologia di sequenza più vicina. 

Quindi, il saggio rileva la trascrizione del target con discriminazione 

(sensibilità) maggiore da 1000 a 3000 volte rispetto al trascritto omologa più 

vicina, qualora esse siano presenti nello stesso numero di copie in un 

campione. 

L'amplicone del saggio attraversa una giunzione esonica e la sonda risiede 

completamente in uno degli esone formati. 

Saggi di controllo endogeno TaqMan ® 

I saggi di controllo endogeno TaqMan ® vengono inclusi come saggi di espressione 

genica TaqMan inventariati (N.di cat. 4331182). I saggi di controllo endogeno 

TaqMan sono: 

• Disponibili come saggi di espressione genica con sonda TaqMan MGB marcata 

con fluorocromo FAM in una provetta 20✕ singola, preformulata. 

• Disponibili per tutte le specie umana, topo e ratto, sia con sonde MGB TaqMan 

marcate con fluorocromo VIC ® sia con sonde marcate con fluorocromo FAM . 

I controlli endogeni TaqMan con marcati con VIC hanno concentrazioni 

limitanti di primers. 





5-11

Capitolo 5 


Per ulteriori 

informazioni 







b. Nella pagina Gene Expression Assays & Arrays (Saggi e matrici di 




• Per informazioni sui saggi di controllo endogeno TaqMan personalizzati, fare 

riferimento alla nota applicativa Using TaqMan ® Endogenous Control Assays to 

Select an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note. 


espressione genica TaqMan, fare riferimento al protocollo TaqMan ® Gene 

Expression Assays Protocol. 

Saggi di espressione genica TaqMan ® personalizzati 


prodotto 


prodotto 

I saggi di espressione genica TaqMan ® personalizzati consistono in set di primers e 

sonde TaqMan disegnati, sintetizzati e formulati dall'assistenza saggi genomici 

TaqMan ® sulla base delle informazioni di sequenza inoltrate. I saggi di espressione 

genica TaqMan consentono l'esecuzione di esperimenti di presenza/assenza su 

qualunque gene o variante di splicing in qualunque organismo. 

I saggi utilizzano reagenti TaqMan per amplificare e rilevare il target in campioni di 

cDNA. Tutti i saggi vengono sviluppati utilizzando il software di disegno saggi 

proprietario. 

Tutti i saggi di espressione genica TaqMan personalizzati: 

• Richiedono la creazione di un submission file (utilizzando il software File 

Builder) con la sequenza target e l'inoltro del file all'assistenza saggi genomici 

TaqMan personalizzati. 




– Saggio di espressione genica 20✕ oppure saggio di espressione genica 60✕ 

(specifico per ogni target). Ogni saggio consiste in due primer specifici per il 

target e in una sonda MGB TaqMan marcata con fluorocromo FAM in una 

miscela pre-formulata 20✕ o 60✕. Le concentrazioni finali 1✕ sono 250 nM 

per la sonda e 900 nM per ogni primer. 

– TaqMan ® Universal PCR Master Mix (con o senza AmpErase ® UNG) 

• Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con la TaqMan Universal PCR 

Master Mix (con o senza AmpErase UNG), utilizzando condizioni universali di 

ciclo termico. 



Capitolo 5 


Per ulteriori 

informazioni 







b. Nella pagina Gene Expression Assays & Arrays (Saggi e matrici di 


selezionare Custom TaqMan ® Gene Expression Assays (Saggi di 

espressione genica TaqMan personalizzati). 

• Per informazioni sull'ordine di saggi di espressione genica TaqMan 


Protocol: Submission Guidelines. 


espressione genica TaqMan personalizzati, fare riferimento al protocollo 

Custom TaqMan ® Gene Expression Assays Protocol. 

Reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan ® 


prodotto 


prodotto 

I reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan ® Applied Biosystems 

contengono: 

• Un controllo positivo interno (IPC) con primer e sonda pre-disegnati 

• Templato DNA IPC 

• Controllo bloccante IPC 

I reagenti vengono disegnati per: 

• Distinguere i tipi di risultati negativi: 

– Un segnale negativo per il target e un segnale positivo per l'IPC indica che 

non è presente target. 

– Un segnale negativo per il target e un segnale negativo per l'IPC suggerisce 

una inibizione della PCR. 

• Evitare l'amplificazione dei controlli endogeni. 

• Permettere la co-amplificazione dell'IPC e del target senza compromettere 

l'amplificazione del target. 

• Rilevare l'IPC utilizzando una sonda etichettata con fluorocromo VIC ® . 

• Rilevare il target utilizzando una sonda etichettata con fluorocromo FAM . 

I kit di reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan: 

• Richiedono i seguenti componenti: 

– Campione DNA 

– Saggio TaqMan per il target di interesse 

– TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix 

• Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con la TaqMan ® 2✕ Universal 

PCR Master Mix , utilizzando condizioni universali di ciclo termico. 



5-13

Capitolo 5 


Kit disponibili 

Sono disponibili i seguenti kit di reagenti di controllo positivo interno esogeno 

TaqMan di Applied Biosystems: 

TaqMan ® Exogenous Internal Positive Control Reagents with 

TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix (con fluorocromo VIC ® ) 

Kit 

TaqMan ® Exogenous Internal Positive Control Reagents 

Nota: Nel caso si utilizzi questo kit, è necessario acquistare uno di 

questi reagenti TaqMan ® separatamente: 

• TaqMan ® 2✕ Universal PCR Master Mix (N. di cat. 4304437) 

• TaqMan ® PCR Core Reagents Kit (N. di cat. N808-0228) 

Numero di 

catalogo 

4308320 

4308323 

Per ulteriori 

informazioni 

Per informazioni sulla preparazione delle reazioni PCR utilizzando reagenti di 

controllo positivo interno esogeno TaqMan, fare riferimento al protocollo TaqMan ® 

Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol. 


Master Mix 

disponibili 

I saggi inventariati/prodotti su ordine per gli esperimenti di presenza/assenza Applied 


Master Mix 

Numero di 

catalogo 





reazioni 


reazioni 


UNG 

4324018 

4326614 

4324020 

TaqMan ® PCR Core Reagents Kit N808-0228 

Nota: In caso di acquisto di reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan ® 

con kit Master Mix TaqMan ® 2✕ Universal PCR (N. di cat. 4308320), non è 

necessario acquistare la Master Mix separatamente. 

Nota: Gli esperimenti di presenza/assenza non vengono supportati utilizzando la 

Master Mix TaqMan ® Universal PCR veloce. 

Per ulteriori 

informazioni 

Per informazioni sull'utilizzo di reagenti TaqMan, fare riferimento al protocollo 

TaqMan ® Fast Universal PCR Master Mix. 



Capitolo 5 



Utilizzo del 

software 

StepOne 

Per ulteriori 

informazioni 

Per i saggi inventariati/prodotti su ordine Applied Biosystems, utilizzare il software 

StepOne per il disegno dei propri esperimenti di presenza/assenza. Il software 

StepOne calcola automaticamente i volumi per: 


• Controlli e campioni 


Nota: Per selezionare il tipo di saggio inventariato/prodotto su ordine nel software 

StepOne, andare alla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione) sia nel 

flusso di lavoro del Design Wizard sia in quello di impostazione avanzata, quindi 

selezionare Inventoried/Made to Order (Inventariato/Prodotto su ordine) nel 

menu a discesa Assay Type (Tipo di saggio). 

Per informazioni sul disegno e sull'esecuzione degli esperimenti di presenza/assenza 

sul sistema StepOne, fare riferimento alla guida Applied Biosystems StepOne Real- 

Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments. 



Nel caso venga selezionato il tipo di saggio personalizzato nel software StepOne 

per un esperimento di presenza/assenza (il disegno dei propri primer e delle proprie 

sonde), Applied Biosystems raccomanda di attenersi al flusso di lavoro per le linee 

guida disegno saggi Applied Biosystems: 

1. Disegnare i primer e le sonde utilizzando il software Primer Express ® 


2. Selezionare i reagenti appropriati (pagina 3-25). 



Nota: I reagenti TaqMan ® veloci e i reagenti SYBR ® Green non vengono 

supportati per gli esperimenti di presenza/assenza. 

3. Utilizzare le condizioni di ciclo termico raccomandate (pagina 3-27). 

4. Iniziare con le concentrazioni dei primer e delle sonde predefinite. Se 

necessario, ottimizzare le concentrazioni dei primer (pagina 3-30) e le 

concentrazioni delle sonde (pagina 3-34). 



Adottare il sistema nella sua globalità per ottenere il più alto livello di successo. Per 

una descrizione più dettagliata delle linee guida per il disegno di saggi Applied 

Biosystems, vedere Appendice C. 

Nota: Per selezionare il tipo di saggio personalizzato nel software StepOne, andare 

alla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione) sia nel flusso di lavoro del 

Design Wizard sia in quello di impostazione avanzata, quindi selezionare Custom 

(Personalizzato) nel menu a discesa Assay Type (Tipo di saggio). 



5-15

Capitolo 5 




Formula 

A 

A 

Formula per esperimenti con C T comparativo (ΔΔC T ) 

Formula 

La quantità di target, normalizzata a un controllo endogeno e rispetto a un campione 

di riferimento, viene calcolata nel modo seguente: 

2 – ΔΔ C T 

Derivazione della 

formula 

L'equazione che descrive l'amplificazione esponenziale della PCR è: 

X n = X o ( 1 + E X ) 

× 

n 

dove: 

• x n = numero di molecole target al ciclo n 

• x o = numero iniziale di molecole target 

• E x = efficienza dell'amplificazione del target 

• n = numero di cicli 

• X o =numero iniziale delle molecole target 

Il ciclo soglia (C T ) indica il numero di ciclo frazionario al quale la quantità di target 

amplificato raggiunge una soglia specifica. Perciò, 

C 

X T = X o × ( 1 + E X ) T X 

= 

, 

K X 

dove: 

• x T = numero soglia di molecole target 

• C T, X = ciclo soglia per l'amplificazione del target 

• K X = costante 

Una equazione simile per la reazione di controllo endogeno è: 

C 

R T = R o × ( 1 + E R ) T R 

= 

, 

K R 

dove: 

• R T = numero soglia delle molecole di riferimento 

• R o = numero iniziale delle molecole di riferimento 

• E R = efficienza dell'amplificazione di riferimento 

• C T, R = ciclo soglia per l'amplificazione di riferimento 

• K R = costante 



A-1

Appendice A 

Formula 

Dividendo X T per R T si ottiene la seguente espressione: 

X 

----- T 

R T 

= 

X o ( 1 E X ) C TX , 

× + 

--------------------------------------- = 

R o ( 1 E R ) C TR , 

× + 

K 

----- X 

= K 

K R 

I valori esatti di X T e R T dipendono da un certo numero di fattori, tra i quali: 

• fluorocromo reporter utilizzato nella sonda 

• Effetti del contesto di sequenza sulle proprietà di fluorescenza della sonda 

• Efficienza della scissione della sonda 

• Purezza della sonda 

• Impostazione della soglia di fluorescenza. 

Quindi, non è necessario che la costante K sia uguale ad 1. 

Assumendo che le efficienze del target e del riferimento siano le stesse: 

E X = E R = E 

oppure 

X o 

C 

----- 

T, X – C T, 

R 

× ( 1 + E ) = K 

R o 

X N ( 1 E ) C T 

× + = K 

Δ 

dove: 

• X N = X O /R O , la quantità normalizzata di target 

• ΔC T = C T, X – C T, R , la differenza nei cicli soglia per il target e il riferimento 

Riordinando si ottiene la seguente espressione: 

X N = K × ( 1 + E) 

–ΔC T 

Il passaggio finale è dividere l'X N di un campione qualunque (q) per l'X N del 

campione di riferimento (cb): 

X 

----------- N, 

q 

X N, 

cb 

–Δ 

C Tq , 

K × ( 1 + E ) 

= ----------------------------------------- = 

( 1 + E ) 

–ΔC K × ( 1 + E ) 

T, 

cb 

–ΔΔC T 

dove: 

• ΔΔC T = ΔC T, q – ΔC T, cb 

A-2 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System 


Appendice A 

Formula 

Per gli ampliconi disegnati e ottimizzati secondo le linee guida disegno saggi 

Applied Biosystems (dimensione amplicone

Appendice A 

Formula 

A-4 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System 


Limitazione dei primer nella PCR multiplex B 

B 

Per generare un saggio multiplex accurato, è importante che l'amplificazione di una 

specie non sia dominante sull'altra. In caso contrario, è possibile che l'amplificazione 

di una specie altamente abbondante impedisca la efficiente amplificazione della 

specie meno abbondante. Qualora la specie meno abbondante non venga amplificata 

con efficienza, è possibile che l'esperimento produca risultati non accurati, oppure, in 

casi gravi, che il rilevamento della specie meno abbondante venga inibito 

completamente. È possibile evitare questa situazione limitando la concentrazione dei 

primer utilizzati per amplificare la specie più abbondante, “spegnendo” in tal modo 

l'amplificazione subito dopo che sia stato stabilito il C T . 

La limitazione dei primer produce effetti sui componenti di reazione comuni a 

entrambi i saggi non esauriti, consentendo all'amplificazione della specie meno 

abbondante di andare avanti con alta efficienza. Qualora la specie più abbondante sia 

non nota, è necessario determinarla prima dell'esecuzione della PCR multiplex 

attraverso l'esecuzione di entrambi i target in provette separate. È necessario limitare 

i primer per entrambe le amplificazioni qualora nessuna specie sia più abbondante in 

maniera consistente. 

Considerazione 

dell'abbondanza 

relativa del target 

e del riferimento 

Nell'applicazione della limitazione dei primer alle amplificazioni del target e del 

controllo endogeno, è necessario considerare l'abbondanza relativa delle due specie. 

Per gli esperimenti di quantificazione, è possibile utilizzare rRNA come controllo 

endogeno. La concentrazione dell'rRNA nell'RNA totale è sempre maggiore della 

concentrazione di qualunque mRNA target. Perciò, nell'amplificazione sia del target 

sia dell'rRNA nelle reazioni multiplex, è necessario limitare le concentrazioni solo 

dei primer rRNA. 



B-1

Appendice B 

Limitazione dei primer nella PCR multiplex 

Matrice 

limitazione primer 

Per la definizione delle concentrazioni di limitazione primer, eseguire una matrice 

delle concentrazioni di forward primer e reverse primer utilizzando il valore del 

templato iniziale minimo. Lo scopo è di identificare le concentrazioni dei primer che 

riducono il valore ΔRn del saggio senza influire sul valore C T . La tabella qui di 

seguito illustra una matrice raccomandata di forward e reverse primer con 

concentrazioni variabili tra 20 e 100 nM. 

Nota: Sebbene tutti i criteri di disegno seguenti facilitino l'identificazione delle 

concentrazioni di limitazione dei primer, ciò potrebbe essere non possibile per tutti i 

saggi. Se un esperimento di limitazione dei primer non permette l'identificazione 

delle concentrazioni di limitazione dei primer, è necessario ridisegnare almeno un 

primer oppure eseguire le reazioni in provette separate. 

Forward: 

Reverse: 

100 nM 

100 nM 

100 nM 

80 nM 

100 nM 

60 nM 

100 nM 

40 nM 

100 nM 

20 nM 

Forward: 

Reverse: 

80 nM 

100 nM 

80 nM 

80 nM 

80 nM 

60 nM 

80 nM 

40 nM 

80 nM 

20 nM 

Forward: 

Reverse: 

60 nM 

100 nM 

60 nM 

80 nM 

60 nM 

60 nM 

60 nM 

40 nM 

60 nM 

20 nM 

Forward: 

Reverse: 

40 nM 

100 nM 

40 nM 

80 nM 

40 nM 

60 nM 

40 nM 

40 nM 

40 nM 

20 nM 

Forward: 

Reverse: 

20 nM 

100 nM 

20 nM 

80 nM 

20 nM 

60 nM 

20 nM 

40 nM 

20 nM 

20 nM 

Esempio 

I risultati di un esperimento con matrice limitazione dei primer vengono mostrati 

nella Figura B-1 a pagina B-3: 

• La Figura B-1a mostra che solo se si abbassano le concentrazioni dei primer qui 

sotto circa 50 nM, il valore di Ct risulta influenzato significativamente. L'area 

plateau mostra la zona nella quale è possibile trovare le adeguate concentrazioni 

di limitazione dei primer In tale area, il CT (e quindi il corrispondente valore di 

quantificazione) resta invariato, mentre il valore ΔRn e la corrispondente 

generazione di prodotti vengono ridotti in modo significativo. 

• La Figura B-1b mostra la relazione corrispondente tra le concentrazioni dei 

primer e il ΔRn. La figura dimostra che è possibile raggiungere una generazione 

di prodotti più bassa diminuendo le concentrazioni del forward primer e del 

reverse primer. 

Per questo esempio, una selezione appropriata delle concentrazioni di limitazione dei 

primer è di almeno 50 nM per il forward primer e il reverse primer. È necessario 

mantenere la concentrazione della sonda a un livello ottimale anche quando un 

saggio è limitato per il primer per garantire che il segnale prodotto sia ampio 

abbastanza da consentire al software un multicomponenting accurato. 

B-2 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System 


Appendice B 


Figura B-1 Risultati esperimento con matrice di limitazione dei primer 

(a) Mostra come il valore C T sia influenzato dalle variazioni delle concentrazioni di 

forward primer e reverse primer. La zona plateau indica l'area in cui il valore C T 

rimane costante. 

(b) Mostra una riduzione dei ΔRn valori con la diminuzione della concentrazione 

dei primer. 



B-3

Appendice B 


B-4 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System 


Linee guida disegno saggi 

C 

C 

Informazioni sulle 

linee guida 

disegno saggi 

Conclusioni per 



Nel caso sia in atto il disegno dei propri saggi (primer e sonde), Applied Biosystems 

raccomanda di attenersi alle linee guida disegno saggi Applied Biosystems. Le linee 

guida disegno saggi specificano: 

1. Disegno primer e sonde utilizzando il software Primer Express ® – Il 

software Primer Express utilizza un set di parametri predefiniti per la selezione 

automatica dei set di primer e sonde. 

2. Selezione reagenti appropriati – Sono disponibili diversi reagenti TaqMan ® e 

SYBR ® Green. I reagenti utilizzati dipendono dal tipo di saggio. 

3. Utilizzo delle condizioni di ciclo termico raccomandate – Utilizzare le 

condizioni di ciclo termico raccomandate per il campione (DNA/cDNA, RNA 

per PCR in 1fase e RNA per PCR in 2 fasi). 

Nota: Le condizioni di ciclo termico per i reagenti fast differiscono dalle 

condizioni di ciclo termico per i reagenti standard. 

4. Utilizzo delle concentrazioni predefinite dei primer e delle sonde o 

ottimizzazione delle concentrazioni dei primer e delle sonde – Nel caso si 

utilizzino le linee guida disegno saggi Applied Biosystems, è possibile 

utilizzare concentrazioni di sonde e di primer predefinite per saggi ottimizzati 

non-multiplex oppure è possibile ottimizzare le concentrazioni dei primer e 

delle sonde. 



Adottare il sistema nella sua globalità per ottenere il più alto livello di successo. 

Nota: Le linee guida disegno saggi Applied Biosystems non garantiscono che tutti i 

saggi forniscano lo stesso livello di prestazioni e sensibilità. Anche i più scrupolosi 

parametri di disegno non possono tenere in considerazione tutte le possibili 

variazioni tra tra due sistemi diversi di saggi. 

In generale, è possibile giungere alle seguenti conclusioni quando vengono utilizzate 

le linee guida disegno saggi per gli esperimenti di quantificazione. 

• Per la maggior parte dei saggi TaqMan, una concentrazione primer di 900-nM e 

di sonde di 250-nM comporta un saggio altamente riproducibile e sensibile 

quando si utilizza DNA o cDNA come templato. 

• A causa della natura non specifica del suo rilevamento, oltrepassare 

l'ottimizzazione dei primer con fluorocromo SYBR ® Green I con molta cautela. 

Comunque, se vengono seguite tutte le linee guida, concentrazioni di forward 

primer e di reverse primer di 50-nM forniscono generalmente una 

amplificazione robusta con un buon livello di specificità quando si utilizza 

DNA o cDNA come templato. Verificare questo assunto controllando la 

formazione di prodotti non specifici sia con la curva di melting sia con l'analisi 

del gel. 



C-1

Appendice C 

Linee guida disegno saggi 

• La maggior parte dei saggi TaqMan abilita il rilevamento e la quantificazione 

accurata di un target fino a un numero di copie

Bibliografia 

Afonina, I., Zivarts, M., Kutyavin, I., et al. 1997. Efficient priming of PCR with 

short oligonucleotides conjugated to a minor groove binder. Nucleic Acids Res. 

25:2657–2660. 

Förster, V. T. 1948. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann. 

Physics (Leipzig) 2:55–75. 

Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., and Griffith, R. 1992. Simultaneous 

amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10:413–417. 

Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R. 1993. Kinetic PCR:Real time 

monitoring of DNA amplification reazioni. Biotechnology 11:1026–1030. 

Kutyavin, I.V., Lukhtanov, E.A., Gamper, H.B., and Meyer, R.B. 1997. 

Oligonucleotides with conjugated dihydropyrroloindole tripeptides: base 

composition and backbone effects on hybridization. Nucleic Acids Res. 

25:3718–3723. 

Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false positives with PCR. Nature 

339:237–238. 

Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of Relative Gene Expression Data 

Using Real-Time Quantitative PCR and the 2 –ΔΔC T Method. Methods 25:402–408. 

Longo, M.C., Berninger, M.S., and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA 

glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reazioni. Gene 

93:125–128. 

Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of β-globin 

genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. 

Science 230:1350–1354. 



Bibliografia-1

Bibliografia 

Bibliografia-2 



Glossario 

acquisizione dati 

Processo durante la sessione analitica in cui un componente dello strumento 

rileva i dati della fluorescenza provenienti da ogni pozzetto della piastra di 

reazione. Lo strumento trasforma il segnale in dati elettronici e i dati vengono 

salvati nel file dell'esperimento. Un punto di acquisizione dati viene indicato da 

un'icona nel profilo termico: 

• Acquisizione dati attivata: 

• Acquisizione dati disattivata: 

agente bloccante IPC 

AIF 

allele 

amplicone 

amplificazione 

Assay Mix 

AutoΔ 

Reagente aggiunto alle reazioni PCR per bloccare l'amplificazione del 

controllo positivo interno (IPC). 

Abbreviazione per file con le informazioni del saggio (AIF, Assay Information 

File). 

Rispetto a un determinato target, ognuna delle diverse sequenze che si 

verificano nella popolazione. 

Segmento di DNA amplificato durante la PCR. 

Parte della sessione strumentale durante la quale si verifica la PCR per la 

produzione dell'amplificazione del target. Per gli esperimenti di 

quantificazione, i dati sulla fluorescenza acquisiti durante l'amplificazione 

vengono visualizzati in un plot di amplificazione e utilizzati per calcolare i 

risultati. Se l'amplificazione viene inclusa nella sessione dello strumento 

StepOne per la genotipizzazione o per gli esperimenti di presenza/assenza, i 

dati sulla fluorescenza acquisiti durante l'amplificazione vengono visualizzati 

in un plot di amplificazione ed è possibile utilizzarli per la risoluzione dei 

problemi. 

Componente della reazione PCR in TaqMan ® Gene Expression Assays e 

TaqMan ® SNP Genotyping Assays di Applied Biosystems consistente in primer 

disegnati per l'amplificazione di un target e una sonda TaqMan ® disegnata per 

il rilevamento dell'amplificazione del target. 

Impostazione per aumentare o diminuire la temperatura e/o il tempo ad ogni 

ciclo successivo in una fase ciclica. Quando AutoΔ è abilitato, le impostazioni 

vengono indicate da un'icona nel profilo termico: 

• AutoΔ attivato: 

• AutoΔ disattivato: 



Glossario-1

Glossario 

Avvio rapido 

calibratore 

calibrazione spaziale 

campione 

campione di riferimento 

Campione o Standard 

(10✕) 

chimica 

Funzione nel sistema StepOne che consente l'esecuzione dell'esperimento 

senza immettere le informazioni relative alle impostazioni della piastra. 

Vedere campione di riferimento. 

Tipo di calibrazione del sistema StepOne in cui il sistema mappa le posizioni 

dei pozzetti nel blocco campione. I dati della calibrazione spaziale vengono 

utilizzati in maniera tale che il software possa associare gli aumenti di 

fluorescenza durante una sessione analitica a pozzetti specifici nella piastra di 

reazione. 

Il templato in corso di test. 

In esperimenti con curva standard relativa e C T (ΔΔC T ) comparativo, il 

campione di riferimento viene utilizzato come base per i risultati di 

quantificazione relativa. Noto anche come calibratore. 

Componente della reazione visualizzato sulla scheda Reaction Mix 

Calculations (Calcoli miscela di reazione) della schermata Reaction Setup 

(Impostazione reazione). Il software presuppone che il campione o lo standard 

aggiunto alla miscela di reazione sia a una concentrazione 10✕. Ad esempio, se 

il volume della reazione è 20 μl, il volume calcolato del campione o dello 

standard per la reazione 1 è di 2 μl. 

Vedere reagenti. 

ciclo soglia Vedere ciclo soglia (C T ). 

ciclo soglia (C T ) 

coefficienti di 

regressione 

colore del target 

Concentrazione del 

campione diluito (10✕ 

per Miscela di reazione) 

Il numero del ciclo PCR in cui il ΔRn incontra la soglia nel plot di 

amplificazione. 

Valori calcolati dalla linea di regressione nella curva standard, inclusi il valore 

R 2 , la pendenza e l'intercetta y. È possibile utilizzare i valori del coefficiente di 

regressione per valutare la qualità dei risultati provenienti dagli standard. 

Vedere anche curva standard. 

Colore assegnato a un target per identificare il target nel layout piastra e nei plot 

di analisi. 

Campo del software visualizzato sulla scheda Sample Dilution Calculations 

(Calcoli diluizione campione) della schermata Reaction Setup (Impostazione 

reazione). Per questo campo, immettere la concentrazione del campione che si 

desidera utilizzare da aggiungere alla miscela di reazione per tutti i campioni 

nell'esperimento. “10✕ per Miscela di reazione” indica che il software 

presuppone che il componente campione o standard della miscela di reazione si 

trovi in concentrazione 10✕. Ad esempio, se la concentrazione del campione 

diluito è di 50,0 ng/μl (10✕), la concentrazione finale del campione nella 

reazione è di 5 ng/μl (1✕). 

Glossario-2 



Glossario 

configurazione co-locata 

configurazione 

indipendente 

controllo endogeno 

controllo negativo (NC) 

controllo positivo 

controllo positivo interno 

(IPC) 

controllo senza 

amplificazione (NAC, No 

Amplification Control) 

controllo senza templato 

(NTC, No Template 

Control) 

C T 

C T automatico 

C T manuale 

curva di dissociazione 

Disposizione del sistema in cui lo strumento StepOne è collegato direttamente 

a un computer co-locato dal cavo giallo del sistema StepOne . In questa 

configurazione, lo strumento StepOne viene controllato attraverso il software 

StepOne presente sul computer co-locato. 

Disposizione del sistema in cui lo strumento StepOne non è collegato a un 

computer dal cavo giallo del sistema StepOne . Viene invece utilizzata un'unità 

USB ( ) per il trasferimento dei dati tra i componenti del sistema StepOne . 

In questa configurazione, lo strumento StepOne viene controllato attraverso 

il touchscreen dello strumento stesso. 

Target che deve essere agli stessi livelli in tutti i campioni da testare. Utilizzato 

negli esperimenti con curva standard relativa e C T (ΔΔC T ) comparativo per la 

normalizzazione dei segnali di fluorescenza per il target in corso di 

quantificazione. Noto anche come gene di riferimento. 

In esperimenti del sistema StepOne , la task assegnata ai target o ai saggi SNP 

in pozzetti che contengono acqua o buffer invece di un templato di campione. 

Nei pozzetti di controllo negativi non deve verificarsi alcuna amplificazione del 

target. 

Negli esperimenti di genotipizzazione, la task per il saggio SNP nei pozzetti che 

contengono un templato di campione con un genotipo noto. 

Negli esperimenti di presenza/assenza, templato di DNA sintetico di piccole 

dimensioni che viene aggiunto alle reazioni della PCR. È possibile utilizzare 

l'IPC per distinguere tra i risultati negativi e le reazioni influenzate dagli 

inibitori della PCR, dall'impostazione errata del saggio o da un problema del 

reagente o dello strumento. 

Vedere pozzetti IPC bloccati a controllo negativo. 

Vedere controllo negativo (NC, Negative Control). 

Abbreviazione per ciclo soglia. 

Impostazione di analisi in cui il software calcola automaticamente la soglia e la 

linea di base nel plot di amplificazione. Il software utilizza la soglia e la linea 

di base per calcolare il ciclo soglia (C T ). 

Impostazione di analisi in cui viene immesso il valore soglia e viene selezionato 

se utilizzare calcoli con linea di base automatica o linea di base manuale. Il 

software utilizza il valore soglia immesso e la linea di base per calcolare il ciclo 

soglia (C T ). 

Vedere curva di melting. 



Glossario-3

Glossario 

curva di melting 


delta Rn (ΔRn) 

design wizard 

diluente 

DNA campione (10✕) 

EFF% 

efficienza di 

amplificazione (EFF%) 

Visualizzazione dei dati acquisiti durante la fase della curva di melting. I picchi 

nelle curva di melting possono indicare la temperatura di melting (Tm) del 

target o possono identificare un'amplificazione della PCR non specifica. È 

possibile visualizzare la curva di melting come reporter normalizzato (Rn) 

rispetto alla temperatura o come reporter derivativo (−Rn′) rispetto alla 

temperatura. 

Negli esperimenti con curva standard e curva standard relativa: 

• La linea meglio interpolata in un plot dei valori C T provenienti dalle 

reazioni standard riportate rispetto alle quantità standard. Vedere anche 

linea di regressione. 

• Un set di standard contenenti un range di quantità note. I dati provenienti 

dalle reazioni di curva standard vengono utilizzati per la generazione 

della curva standard. La curva standard viene definita dal numero di punti 

nelle serie, dal numero dei replicati standard, dalla quantità di partenza e 

dal fattore seriale. Vedere anche serie di diluizioni standard. 

Abbreviazione per reporter normalizzato corretto sulla linea di base. 

Funzione del software StepOne che aiuta nell'impostazione di un 

esperimento, indicando le migliori scelte da eseguire dal momento 

dell'immissione del disegno dell'esperimento. 

Reagente utilizzato per la diluizione di un campione o di uno standard prima di 

aggiungerlo alla reazione della PCR. Può essere rappresentato da acqua o da un 

buffer (soluzione tampone). 

Componente della reazione visualizzato sulla schermata Reaction Setup 

(Impostazione reazione). Il software presuppone che il DNA del campione 

aggiunto alla miscela di reazione sia a una concentrazione 10✕. Ad esempio, se 

il volume della reazione è 20 μl, il volume calcolato del campione per la 

reazione 1 è di 2 μl. 

Vedere efficienza di amplificazione (EFF%). 

Calcolo dell'efficienza dell'amplificazione della PCR. L'efficienza di 

amplificazione viene calcolata utilizzando la pendenza della linea di 

regressione nella curva standard. Una pendenza prossima a 

−3,3 indica una efficienza di amplificazione PCR ottimale, del 100%. Fattori 

che influenzano l'efficienza di amplificazione: 

• Range delle quantità degli standard - Per misurazioni dell'efficienza 

più accurate e precise, utilizzare un range di quantità degli standard 

ampio, da 5 a 6 log (da 10 5 a 10 6 volte). 

• Numero di replicati degli standard- Per misurazioni dell'efficienza più 

accurate, includere i replicati per diminuire gli effetti delle inesattezze 

relative al pipettaggio. 

• Inibitori della PCR - La presenza di inibitori della PCR nella reazione 

può ridurre l'efficienza di amplificazione. 

Glossario-4 



Glossario 

esperimento 

Si riferisce all'intero processo di esecuzione di una sessione utilizzando il 

sistema StepOne , includendo impostazione, esecuzione e analisi. I tipi di 

esperimenti eseguibili utilizzando il sistema StepOne sono: 

• Quantificazione – curva standard 

• Quantificazione – curva standard relativa 

• Quantificazione – C T comparativo (ΔΔC T ) 

• Curva di melting 


• Presenza/Assenza 

esperimento end-point 

fase ciclica 

fase della curva di 

melting 

fase di sosta 

fase o stage 

fattore di diluizione 

fattore seriale 

file con le informazioni 

del saggio (AIF, Assay 

Information File) 

fluorocromi puri 

Esperimento in cui i dati sulla fluorescenza acquisiti in una lettura post-PCR 

vengono utilizzati per calcolare i risultati per gli esperimenti di 

genotipizzazione o di presenza/assenza. 

Fase nel profilo termico che viene ripetuta. Se per eseguire la PCR viene 

utilizzata la fase ciclica, questa viene denominata fase di amplificazione. 

Fase nel profilo termico con un incremento della temperatura per la 

generazione di una curva di melting. 

Fase nel profilo termico che include uno o più passaggi. È possibile, ad 

esempio, aggiungere una fase di sosta al profilo termico per attivare enzimi, 

inattivare enzimi o incubare una reazione. 

Componente del profilo termico. Una fase consiste di uno o più passaggi. 

Vedere fattore seriale. 

Valore numerico che definisce la sequenza delle quantità nella curva standard. 

Il fattore seriale e la quantità di partenza vengono utilizzati per il calcolo della 

quantità standard per ogni punto nella curva standard. Ad esempio, se la curva 

standard viene definita con un fattore seriale di 1:10 o 10, la differenza tra 2 

punti adiacenti nella curva viene decuplicata. 

File dati su CD spedito insieme a ogni ordine di saggi. Il nome del file include 

il numero del codice a barre presente sulla piastra di reazione. Le informazioni 

presenti nell'AIF sono fornite in un formato delimitato da tabulazioni. 

Reagente che contiene il fluorocromo del sistema. I fluorocromi vengono 

utilizzati per eseguire una calibrazione di fluorocromo sul sistema StepOne . 

Vedere anche fluorocromo del sistema. 



Glossario-5

Glossario 

fluorocromo di sistema 

fluorocromo prodotto da Applied Biosystems e precalibrato sul sistema 

StepOne . fluorocromi di sistema: 

• fluorocromo FAM 

• fluorocromo JOE 

• fluorocromo ROX 

• fluorocromo SYBR ® Green 

• fluorocromo VIC ® 

IMPORTANTE! Applied Biosystems non raccomanda l'uso del fluorocromo 

TAMRA come reporter o quencher con il sistema StepOne . 

fluorocromo 

personalizzato 

fluorocromo non prodotto da AppliedBiosystems. È possibile utilizzare 

fluorocromi personalizzati per eseguire gli esperimenti PCR in tempo reale sul 

sistema StepOne . Prima di utilizzare fluorocromi personalizzati, eseguire una 

calibrazione specifica per il fluorocromo. 



forward primer 

gene di riferimento 

gruppo di replicati 

ID refSNP 

ID saggio 

impostazione avanzata 

intercetta y 

IPC 

IPC bloccato 

Oligonucleotide all'estremità 5′ del target. Reverse primer e forward primer 

vengono utilizzati insieme nelle reazioni PCR per l'amplificazione del target. 

Vedere controllo endogeno. 

Set di reazioni identiche in un esperimento. 

Numero che identifica l'ID del cluster di riferimento SNP (refSNP). Generato 

dal Single Nucleotide Polymorphism Database of Nucleotide Sequence 

Variation (dbSNP). Può essere utilizzato per ricercare nello Store di Applied 

Biosystem un SNP Genotyping Assay di Applied Biosystems Noto anche come 

Numero rs. 

Valore assegnato da Applied Biosystems a TaqMan ® Gene Expression Assays 

e TaqMan ® SNP Genotyping Assays. 

Funzione nel software StepOne che consente l'impostazione degli esperimenti 

in base al proprio disegno. 

Coefficiente di regressione calcolato dalla linea di regressione nella curva 

standard. L'intercetta y di questa linea costituisce il valore di y nel punto in cui 

la linea interseca l'asse y. 

Abbreviazione per controllo positivo interno (IPC, Internal Positive Control) 

Inoltre, in esperimenti di presenza/assenza, la task per il target IPC nei pozzetti 

che contengono un templato IPC. 

In esperimenti di presenza/assenza, la task e assegnata al target IPC in pozzetti 

che contengono un'agente bloccante IPC invece di un templato di campione. 

Vedere anche pozzetti IPC bloccati a controllo negativo. 

Glossario-6 



Glossario 

IPC+ 

layout piastra 

lettura end-point 

lettura post-PCR 

lettura pre-PCR 

libreria campioni 

Richiesta di presenza/assenza quando il controllo positivo interno (IPC) è 

riuscito. 

Illustrazione della griglia di pozzetti 6 × 8 del contenuto assegnato nella piastra 

di reazione. Nel software, è possibile utilizzare il layout piastra come strumento 

di selezione per assegnare il contenuto dei pozzetti, per visualizzare le 

assegnazione dei pozzetti e per visualizzare i risultati. Il layout piastra viene 

visualizzato nelle schermate del Design Wizard, in quelle di Advanced Setup 

(Impostazioni avanzate) e in quelle delle esecuzioni e delle analisi. Il layout 

piastra può essere stampato, incluso in un report, esportato e salvato come slide 

per una presentazione. 

Vedere lettura post-PCR. 

Utilizzata negli esperimenti di genotipizzazione e di presenza/assenza, la parte 

della sessione analitica dello strumento che si verifica dopo l'amplificazione. 

Negli esperimenti di genotipizzazione, i dati sulla fluorescenza acquisiti 

durante la lettura post-PCR vengono visualizzati nel plot di discriminazione 

allelica e utilizzati per fare richieste di alleli. Negli esperimenti di 

presenza/assenza, i dati sulla fluorescenza acquisiti durante la lettura post-PCR 

vengono visualizzati nel plot di presenza/assenza e utilizzati per fare richieste 

di rilevamento. Chiamata anche lettura end-point. 

Utilizzata negli esperimenti di genotipizzazione e di presenza/assenza, la parte 

della sessione analitica dello strumento che si verifica prima 

dell'amplificazione. I dati sulla fluorescenza acquisiti durante la lettura pre- 

PCR vengono utilizzati per normalizzare i dati sulla fluorescenza post-lettura. 

Acquisizione di campioni nel software StepOne . La libreria campioni 

contiene il nome e il colore del campione. 

libreria saggi SNP Acquisizione di saggi SNP nel software StepOne . 

libreria target Acquisizione di target nel software StepOne . 

linea di base 

linea di base automatica 

linea di base manuale 

Nel plot di amplificazione, linea adeguata ai livelli di fluorescenza per un range 

definito di cicli. In caso di utilizzo dell'impostazione di analisi con linea di base 

manuale, per la determinazione della linea di base Applied Biosystem 

raccomanda di selezionare cicli precoci della PCR. 

Impostazione di analisi in cui il software calcola i valori di inizio e di fine della 

linea di base per il plot di amplificazione. Il software utilizza la linea di base e 

la soglia per calcolare il ciclo soglia (C T ). 

Impostazione di analisi in cui vengono immessi i valori di inizio e di fine della 

linea di base per il plot di amplificazione. Il software utilizza la linea di base e 

la soglia per calcolare il valori del C T . 



Glossario-7

Glossario 

linea di regressione 

metodo C T comparativo 

(ΔΔC T ) 

metodo della curva 

standard 

metodo della curva 

standard relativa 

metodo di esecuzione 

metodo di 


miscela di primer 

miscela di reazione 

miscela primer/sonda 

miscela sonda 

monitoraggio remoto 

nome dell'esperimento 

Negli esperimenti con curva standard e curva standard relativa, la migliore linea 

adeguata alla curva standard. Formula della linea di regressione: 

C T = m [log (Qtà)] + b 

dove m rappresenta la pendenza, b l'intercetta y e Qtà la quantità standard. 

Vedere anche coefficienti di regressione. 

Metodo di quantificazione per esperimenti di quantificazione. Con il metodo 

C T comparativo (ΔΔC T ), vengono utilizzati i risultati provenienti da un 

campione di riferimento e da un controllo endogeno per determinare le quantità 

relative di un target nei campioni. 


della curva standard, vengono utilizzati i risultati provenienti dagli standard per 

determinare le quantità relative di un target nei campioni. 


della curva standard relativa, vengono utilizzati i risultati provenienti dagli 

standard, da un campione di riferimento e da un controllo endogeno per 

determinare le quantità relative di un target nei campioni. 

Definizione del volume della reazione e del profilo termico per la sessione 

analitica dello strumento. 

Con gli esperimenti di quantificazione, il metodo utilizzato per determinare la 

quantità di target nei campioni. Per gli esperimenti di quantificazione, esistono 

tre tipi di metodi di quantificazione disponibili: curva standard, C T comparativo 

(ΔΔC T ) e curva standard relativa. 

Componente della reazione PCR contenente il forward primer e il reverse 

primer disegnati per amplificare il target. 

Soluzione contenente tutti i componenti necessari per eseguire la reazione PCR, 

ad eccezione del templato (campione, standard o controllo). 

Componente della reazione PCR che consiste nei primer disegnati per 

amplificare il target e una sonda TaqMan ® disegnata per rilevare 

l'amplificazione del target. 

Componente della reazione PCR contenente una sonda TaqMan ® disegnata per 

rilevare l'amplificazione del target. 

Funzione software che consente la visualizzazione dello stato di uno strumento 

in rete, l'invio di esperimenti allo strumento e il download degli esperimenti 

eseguiti al proprio computer. 

Immesso durante l'impostazione dell'esperimento, il nome che viene utilizzato 

per identificare l'esperimento. I nomi degli esperimenti non possono superare i 

100 caratteri e non possono includere alcuno dei seguenti caratteri: slash (/), 

backslash (\), maggiore di (>), minore di (

Glossario 

numero rs 

ometti pozzetto 

outlier 

passaggio 

PCR in tempo reale 

pendenza 

plot dati non elaborati 

plot della temperatura 

plot di amplificazione 

Vedere ID refSNP. 

Azione che viene eseguita dopo l'analisi per omettere uno o più pozzetti da tutte 

le analisi prima di analizzare nuovamente i dati. 

Per un gruppo di dati, dato significativamente più piccolo o più grande rispetto 

agli altri. 

Componente del profilo termico. Un passaggio viene definito dalla 

temperatura, dal tempo, dalla rampa e dallo stato di acquisizione dei dati. Per le 

fasi cicliche, un passaggio viene anche definito dallo stato AutoΔ. 

Procedura di acquisizione di dati sulla fluorescenza durante l'amplificazione 

della PCR. I dati della PCR in tempo reale vengono utilizzati per calcolare i 

risultati per gli esperimenti di quantificazione o per risolvere i problemi dei 

risultati per gli esperimenti di genotipizzazione o di presenza/assenza. 


standard. La pendenza indica l'efficienza dell'amplificazione PCR per il saggio. 

Una pendenza di −3,3 indica un'efficienza di amplificazione del 100%. Vedere 

anche efficienza di amplificazione (EFF%). 

Visualizzazione dell'ampiezza della fluorescenza per i pozzetti selezionati per 

tutti i filtri. Visualizza l'ampiezza della fluorescenza proveniente da tutti i dati 

acquisiti nella sessione analitica. 

Visualizzazione delle temperature per il campione, il pannello di copertura 

dello strumento e il blocco dello strumento durante la sessione analitica dello 

strumento. 

Visualizzazione dei dati acquisiti durante la fase ciclica dell'amplificazione 

della PCR. È visualizzabile come: 

• Reporter normalizzato baseline-corretcted (ΔRn) rispetto al ciclo 

• Reporter normalizzato (Rn) rispetto al ciclo 

• Ciclo soglia (C T ) rispetto al pozzetto 

plot di discriminazione 

allelica 

plot multicomponente 

pozzetti IPC a controllo 

negativo 

Visualizzazione dei dati acquisiti durante la lettura post-PCR. Il plot di 

discriminazione allelica è una manifestazione grafica del segnale del reporter 

normalizzato proveniente dalla sonda dell'allele 1, riportato rispetto al segnale 

del reporter normalizzato proveniente dalla sonda dell'allele 2. 

Visualizzazione dei dati acquisiti durante la fase ciclica della PCR in tempo 

reale. Il plot multicomponente mostra la fluorescenza per tutti i cicli nella 

sessione analitica. 

In esperimenti di presenza/assenza, i pozzetti che contengono un templato IPC 

e buffer o acqua invece di un templato di campione nella reazione PCR. Solo il 

templato IPC dovrebbe amplificarsi nei pozzetti IPC a controllo negativo, in 

quanto la reazione non contiene templato di campione. Vedere anche IPC+. 



Glossario-9

Glossario 

pozzetti IPC bloccati a 

controllo negativo 

profilo termico 

punto 

quantità 

quantità di partenza 

quantità normalizzata 

quantità standard 

In esperimenti di presenza/assenza, i pozzetti che contengono agente bloccante 

IPC invece di un templato di campione nella reazione PCR. Nei pozzetti IPC 

bloccati a controllo negativo non deve verificarsi alcuna reazione di 

amplificazione in quanto la reazione non contiene alcun templato di campione 

e l'amplificazione dell'IPC è bloccata. Chiamati anche Controllo senza 

amplificazione (NAC, No Amplification Control) 

Parte del metodo di esecuzione che specifica temperatura, tempo, rampa e punti 

di acquisizione dati per tutti i passaggi e le fasi della sessione analitica dello 

strumento. 

Uno standard in una curva standard. La quantità di standard per ogni punto nella 

curva standard viene calcolato in base alla quantità di partenza e al fattore 

seriale. 

Negli esperimenti di quantificazione, la quantità di target presente nei 

campioni. La quantità assoluta può riferirsi al numero di copie, alla massa, alla 

molarità o alla carica virale. La quantità relativa si riferisce a n volte la 

differenza tra la quantità normalizzata di target nel campione e la quantità 

normalizzata di target nel campione di riferimento. 

Quando viene definita una curva standard o una serie di diluizioni standard, 

corrisponde alla quantità maggiore o minore. 

Quantità di target divisa per la quantità di controllo endogeno. 

Quantità nota nella reazione PCR. 

• Negli esperimenti con curva standard, la quantità nota di target. Le unità 

per la quantità standard possono essere per la massa, il numero di copie, 

la carica virale o altre unità per la misurazione della quantità di target. 

• Negli esperimenti con curva standard relativa, quantità nota nello 

standard. Ad esempio, la quantità nota può riferirsi alla quantità di cDNA 

o alla quantità di stock. Le unità non sono rilevanti per gli esperimenti di 

curva standard relativa in quanto si annullano nei calcoli. 

quencher 

Molecola legata all'estremità 3′ delle sonde TaqMan ® per impedire che il 

reporter emetta un segnale fluorescente quando la sonda è intatta. Con i reagenti 

TaqMan ® , è possibile utilizzare come quencher il quencher non fluorescenteminor 

groove binder (NFQ-MGB). Con i reagenti SYBR ® Green, non viene 

utilizzato alcun quencher. 



quencher non 

fluorescente-minor 

groove binder (NFQ- 

MGB) 

Molecole legate all'estremità 3′ delle sonde TaqMan ® . Quando la sonda è 

intatta, il quencher non fluorescente (NFQ) impedisce l'emissione del segnale 

di fluorescenza al fluorocromo del reporter. L'NFQ non è fluorescente e quindi, 

producendo minori segnali di background, porta a una migliore precisione nella 

quantificazione. Il minor groove binder (MGB) aumenta la temperatura di 

melting (Tm) senza aumentare la lunghezza della sonda. Consente inoltre il 

disegno di sonde più corte. 

Glossario-10 



Glossario 

rampa 

reagenti 

La velocità con cui cambia la temperatura durante la sessione analitica dello 

strumento. Ad eccezione del passaggio della curva di melting, la rampa viene 

definita da valore percentuale. Per il passaggio della curva di melting, la rampa 

viene definita da un incremento di temperatura. Nella visualizzazione grafica 

del profilo termico, la rampa viene indicata da una linea diagonale. 

I componenti della reazione PCR che vengono utilizzati per amplificare il target 

e per rilevare l'amplificazione. Tipi di reagenti utilizzati sul sistema StepOne : 



• Altri reagenti 



reazione 

campione/saggio SNP 

reazione 

campione/target 

replicati 

reporter 

reporter derivativo (−Rn′) 

reporter normalizzato 

(Rn) 

Reporter normalizzato 

corretto sulla linea di 

base (ΔRn) 

reverse primer 

Componenti della reazione PCR che consistono in due primer disegnati per 

amplificare il target e un fluorocromo SYBR ® Green per il rilevamento del 

DNA a doppia elica. 

Componenti della reazione PCR che consistono nei primer disegnati per 

amplificare il target e una sonda TaqMan ® disegnata per il rilevamento 

dell'amplificazione del target. 

Combinazione di campione e saggio SNP in una reazione PCR. Ogni reazione 

PCR può contenere un solo campione e un solo saggio SNP. 

Combinazione di campione e saggio target in una reazione PCR. Nel Design 

Wizard, ogni reazione PCR può contenere un solo campione e un solo saggio 

target. 

Numero totale di reazioni identiche contenenti componenti identici e volumi 

identici. 

fluorocromo fluorescente utilizzato per rilevare l'amplificazione. Se si 

utilizzano reagenti TaqMan ® , il fluorocromo reporter viene collegato 

all'estremità 5′. Se si utilizzano reagenti SYBR ® Green, il fluorocromo reporter 

è il fluorocromo SYBR ® Green. 

Visualizzato nell'asse y della curva di melting. Il segnale di reporter derivativo 

è la derivata prima negativa della fluorescenza normalizzata proveniente dal 

reporter. 

Segnale della fluorescenza proveniente dal fluorocromo del reporter, 

normalizzato al segnale della fluorescenza del riferimento passivo. 

La grandezza del segnale di fluorescenza normalizzato generato dal reporter 

durante l'amplificazione della PCR. 

ΔRn = Rn (end-point) − Rn (linea di base), dove Rn = reporter normalizzato. 

Oligonucleotide all'estremità 3′ del target. Reverse primer e forward primer 

vengono utilizzati insieme nelle reazioni PCR per l'amplificazione del target. 



Glossario-11

Glossario 

riferimento passivo 

rifiuta pozzetto 

Rn 

saggi inventariati 

saggi prodotti su 

richiesta 

saggio 

saggio SNP 

sconosciuti 

serie 

serie di diluizioni 

standard 

SNP 

fluorocromo che produce un segnale fluorescente. Dal momento che il segnale 

di riferimento passivo deve essere uniforme per tutti i pozzetti, viene utilizzato 

per normalizzare il segnale del fluorocromo del reporter per rispondere delle 

fluttuazioni di fluorescenza provocate dalle differenze minori in concentrazioni 

o volume esistenti da pozzetto a pozzetto. La normalizzazione al segnale di 

riferimento passivo consente una elevata precisione dei dati. 

Azione eseguita dal software durante l'analisi per rimuovere uno o più pozzetti 

dall'esecuzione di ulteriori analisi se al pozzetto è applicato un indicatore 

specifico. 

Abbreviazione per reporter normalizzato. 

TaqMan ® Genomic Assays prodotti precedentemente, che hanno passato le 

specifiche del controllo di qualità e sono conservati nell'inventario. 

TaqMan ® Genomic Assays che vengono prodotti al momento dell'ordine. Solo 

i saggi che superano le specifiche del controllo di qualità della produzione 

vengono spediti. 

Nel sistema StepOne , una reazione PCR che contiene i primer per 

l'amplificazione di un target e un reagente per il rilevamento del target 

amplificato. 

Utilizzato negli esperimenti di genotipizzazione, reazione PCR che contiene i 

primer per l'amplificazione di un SNP e due sonde per il rilevamento di alleli 

diversi. 

Negli esperimenti di quantificazione, l'operazione per il target nei pozzetti che 

contengono un templato di campione con quantità target sconosciute. 

Negli esperimenti di genotipizzazione, l'operazione per il saggio SNP nei 

pozzetti che contengono un templato di campione con un genotipo sconosciuto. 

Negli esperimenti di presenza/assenza, l'operazione per il target nei pozzetti che 

contengono un templato di campione in cui la presenza del target non è nota. 

Vedere serie di diluizioni standard. 

Negli esperimenti con curva standard e curva standard relativa, un set di 

standard contenenti un range di quantità note. La serie di diluizioni standard 

viene preparata da standard diluiti serialmente. Ad esempio, lo soluzione 

standard stock viene utilizzata per preparare il primo punto di diluizione, il 

primo punto di diluizione viene utilizzato per preparare il secondo punto di 

diluizione e così via. I volumi necessari per la preparazione di una serie di 

diluizioni standard vengono calcolati dal numero di punti di diluizione, dal 

numero dei replicati standard, dalla quantità di partenza, dal fattore seriale e 

dalla concentrazione standard nello stock. Vedere anche curva standard. 

Abbreviazione per polimorfismo di un singolo nucleotide (SNP, Single 

Nucleotide Polymorphism). L'SNP può consistere nella differenza di una base 

o in un indel (da insertion/deletion, cioè inserimento/soppressione). 

Glossario-12 



Glossario 

soglia 

standard 

target 

task 

Il livello di fluorescenza al di sopra della linea di base ed entro l'area di crescita 

esponenziale del plot di amplificazione. È possibile determinare la soglia 

automaticamente (vedere C T automatico) o impostarla manualmente (vedere C T 

manuale). 

Campione che contiene quantità di standard note. Le reazioni standard vengono 

utilizzate negli esperimenti di quantificazione per la generazione di curve 

standard. Vedere anche curva standard e serie di diluizioni standard. 

La sequenza di acido nucleico che si desidera amplificare e rilevare. 

Tipo di reazione eseguita nel pozzetto per il target o il saggio SNP. Le 

operazioni disponibili negli esperimenti del sistema StepOne sono: 

• Sconosciuta 

• Controllo negativo 

• Standard (esperimenti di curva standard e curva standard relativa) 

• Controllo positivo (esperimenti di genotipizzazione) 

• IPC (esperimenti di presenza/assenza) 

• IPC bloccato (esperimenti di presenza/assenza) 

temperatura di melting 

(Tm) 

templato 

tipo di esperimento 

Punto nella curva di melting in cui i livelli della fluorescenza raggiungono il 

picco, ad indicare che il DNA a doppia elica amplificato si dissocia in DNA a 

singola elica. 

Tipo di acido nucleico da aggiungere alla reazione PCR. Il templato 

raccomandato varia in base al tipo di esperimento. 

I tipi di esperimenti eseguibili utilizzando il sistema StepOne sono: 




• Curva di melting (non disponibile nel Design Wizard) 


• Presenza/Assenza 

Il tipo di esperimento selezionato influenza le schermate di impostazione, di 

esecuzione e di analisi. 

Tm 

touchscreen 

trascrittasi inversa 

Abbreviazione per temperatura di melting (Tm). 

Display a sfioramento dello strumento per il controllo dello strumento stesso. 

Componente della reazione PCR che converte l'RNA in cDNA. La trascrittasi 

inversa viene aggiunta alla reazione PCR per eseguire il passaggio 1 della RT- 

PCR. 



Glossario-13

Glossario 

Valore R 2 

velocità di rampa 


standard. Il valore R 2 indica la vicinanza di accordo tra la linea di regressione 

della curva standard e i datapoint del C T individuale provenienti dalle reazioni 

standard. Un valore di 1,00 indica un perfetto accordo tra la linea di regressione 

e i datapoint. 

Velocità alla quale si verifica la rampa di temperatura durante la sessione 

analitica dello strumento. Le velocità di rampa disponibili includono la Rapida 

e la standard. 

Glossario-14 



Indice 

A 

acquisizione dati 1-2 

altri reagenti fluorescenti 1-6 

ampliconi, selezione piccoli 3-24 

aree dell'amplicone 

contenuto G/C 3-24 

estremità del primer 3’ 3-24 

estremità della sonda 5’ 3-24 

individuazione 3-23 

selezione 3-23 

temperatura di melting 3-24 

B 

binding-fluorocromo, metodi di 2-4 

C 

campione 3-5, 3-6, 4-4, 5-4 

campione di riferimento 3-5, 3-6 

carryover, UNG per la riduzione al minimo 2-8 

condizioni ciclo termico 

quantificazione DNA/cDNA 3-28 

quantificazione RNA 3-28 

RT-PCR in 1 fase 3-28 

RT-PCR in 2 fasi 3-29 

contaminazione, DNA riduzione al minimo 2-8 

contenuto G/C e aree amplicone 3-24 

controlli negativi 3-5, 3-6, 4-4, 5-4 

controlli positivi 4-4 

controllo endogeno 3-6 

D 

disegno degli esperimenti 

genotipizzazione 4-14, 4-17 

presenza/assenza 5-15 

quantificazione 3-22 

E 

esperimenti con CT comparativo 

componenti 3-6 

informazioni su 3-6 

Vedere anche esperimenti di quantificazione 3-6 

esperimenti con curva standard 



vedere anche esperimenti di quantificazione 3-5 

esperimenti con curva standard relativa 



vedere anche esperimenti di quantificazione 3-5 

esperimenti di genotipizzazione 

come si svolgono 4-4 


conclusioni per le linee guida disegno saggi C-2 

descritti 4-4 

disegno 4-14, 4-17 

mancato abbinamento 4-5 

reagenti TaqMan 2-2 

selezione Master Mix 4-13, 4-16 

strumenti 4-4 

tipi di saggi 4-6 

esperimenti di presenza/assenza 

come si svolgono 5-5 


definiti 5-4 

disegno 5-15 

esecuzione senza un IPC 5-4 

incorporamento di un IPC 5-5 

linee guida disegno saggi per il tipo di saggio 

personalizzato 5-15 


selezione Master Mix 5-14 

selezione reagenti per il tipo di saggio 



esperimenti di quantificazione 

conclusioni per le linee guida disegno saggi C-1 

confronto 3-7 

CT comparativo 3-6 

curva standard 3-5 

curva standard relativa 3-5 

disegno 3-22 

linee guida disegno saggi per il tipo di saggio 


PCR in tempo reale 3-4 

reagenti SYBR Green 2-4, 3-32 


selezione del tipo di reagente 3-13 

selezione di un metodo di quantificazione 3-5 

selezione Master Mix 3-21 

selezione reagenti per il tipo di saggio 




Indice-1

Indice 

spiegati 3-4 


esperimenti end-point 

genotipizzazione 4-4 

presenza/assenza 5-4 

F 

flusso di lavoro del Design Wizard 1-6, 1-7, 1-8 

flusso di lavoro impostazione avanzata 1-6, 1-7, 1-8 

H 

hairpin loop e scelta del primer 3-9 

I 

IPC 5-4, 5-5 

L 

limitazione primer, saggi multiplex 3-10 

linee guida disegno saggi 

condizioni ciclo termico 3-27 

esperimenti di genotipizzazione C-2 

esperimenti di presenza/assenza 5-15 

esperimenti di quantificazione 3-22, C-1 

informazioni su C-1 

ottimizzazione concentrazione sonde 3-34 

ottimizzazione delle concentrazioni primer 3-30 

primer e sonda 3-23, 3-25 

selezione reagenti 3-25 

M 

mancato abbinamento, negli esperimenti di 

genotipizzazione 4-5 

master mix 

selezione per esperimenti di presenza/assenza 5-14 

selezione per esperimenti di quantificazione 3-21 

selezione per gli esperimenti di genotipizzazione 4-13, 

4-16 

materiali di consumo, supportati 1-3 

matrice primer 

definizione limiti B-2 

esempio di limitazione B-2 

modalità di utilizzo 3-31 

O 

ottimizzazione 3-34 

P 

PCR in tempo reale 

esperimenti di quantificazione 3-4 

Processo di rilevamento TaqMan 2-2 

PCR multiplex 

confronto singleplex 3-10 

descritta 3-10 

limitazione per i primer 3-10 

primer rRNA B-1 

PCR, prassi generali 2-9 

PDAR TaqMan per DA 4-12 

piccoli ampliconi, selezione 3-24 

primer 

concentrazioni predefinite 3-30 

hairpin loop 3-9 

riepilogo delle linee guida disegno 3-25 



prodotto non specifico, contaminazione con fluorocromo 

SYBR Green 2-8 

Q 

quantificazione DNA/cDNA, condizioni di ciclo 

termico 3-28 

quantificazione RNA 

condizioni ciclo termico 3-28, 3-29 



R 

reagenti 

altri fluorescenti 1-6 

considerazioni 2-7 

reagenti SYBR Green 1-6 

reagenti TaqMan 1-6, 2-2 

selezione 1-6, 2-6 

selezione tipo di saggio personalizzato 3-25 

reagenti di controllo positivo interno esogeno 

TaqMan 5-13 

reagenti Master Mix Universal 

benefici polimerasi 3-27 

reagenti SYBR Green 

come agiscono 2-5 

considerazioni per la selezione 2-7 

ottimizzazione esperimenti di quantificazione 3-32 

sviluppo 2-4 


come agiscono 2-2 

considerazioni per la selezione 2-7 

sviluppo 2-2 

tipi di esperimento 2-2 

replicati 3-5, 3-6, 4-4, 5-4 


confronto metodo 3-7, 3-10 

in 1 fase 3-8 

in 2 fasi 3-8 

Indice-2 



Indice 

RT-PCR in 1 fase 


primer utilizzati 3-9 


RT-PCR in 2 fasi 


primer utilizzati 3-9 


tipo di saggio pre-disegnato/convalidato 1-8 

tipo di saggio prodotto su ordine 1-7 

trascrittasi inversa MultiScribe, definita 3-27 

U 

UNG e riduzione al minimo carryover 2-8 

S 

saggi di controllo endogeno TaqMan 3-19 

saggi di espressione genica TaqMan 3-18, 5-10 

saggi di espressione genica TaqMan personalizzati 3-20, 

5-12 

saggi di genotipizzazione SNP TaqMan 

personalizzati 4-15 

saggi genotipizzazione del metabolismo di farmaci 

TaqMan 4-11 

saggi genotipizzazione SNP TaqMan 4-10 

serie di diluizioni standard 3-5, 3-6 

sistema StepOne 

acquisizione dati 1-2 

materiali di consumo 1-3 

tipi di esperimento 1-5 

tipi di reagente 1-6 


Software Primer Express 



piccoli ampliconi 3-24 

saggi SNP 1-9 

sonde 

ottimizzazione concentrazione sonde 3-34 

riepilogo delle linee guida disegno 3-25 

sonde MGB TaqMan disponibili 2-4 

sonde MGB TaqMan 2-3 

standard 3-5 

T 

temperatura di melting e aree amplicone 3-24 

tipi di saggi 

esperimenti di genotipizzazione 4-6 



saggi inventariati/prodotti su ordine 1-7 

saggi personalizzati 1-8, 1-9 

saggi pre-disegnati/convalidati 1-8 

selezione 1-7 

tipo di saggio inventariato 1-7 

tipo di saggio personalizzato 1-8, 1-9 





Indice-3

Indice 

Indice-4 



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06/2010 

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Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

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