Monitoraggio della contaminazione da Aflatossina M1nel latte bovino

Monitoraggio della contaminazione
da Aflatossina M1nel latte bovino
nella provincia di Rieti
Contributi pratici
Mario Ricciardi
AUSL Rieti
Valeria Moroni
TPALL
Nazzareno Pizzoli
C.LA.R.
Introduzione
Attualmente sono note più di trecento micotossine
e sono stati elencati numerosi generi
di funghi produttori di queste sostanze,
anche se la maggior parte delle ricerche sono
concentrate su aflatossine, ocratossine,
patulina, tricoteceni, zearalenone e fumonisina.
Anche se identificate e studiate di recente,
certamente hanno causato problemi
all’uomo e agli animali da sempre.
Nel corso dei secoli il problema della contaminazione
da micotossine ha progressivamente
mutato il suo profilo: infatti, mentre
nei tempi più antichi questo tipo di contaminazione
aveva ripercussioni pressoché limitate
alle aree di produzione dei raccolti,
con il progressivo incremento della globalizzazione,
la presenza di queste sostanze tossiche
in una vastissima gamma di derrate alimentari,
ha causato ripercussioni in svariati
segmenti del mercato internazionale e su
un’ampia varietà di operatori del settore alimentare.
Tutti i Paesi sono interessati dai problemi
connessi alla contaminazione da micotossine,
in particolare quelli caratterizzati
da sistemi agricoli scarsamente sviluppati.
I problemi non mancano, anche se a livello
più episodico e, almeno parzialmente controllabile,
anche nei Paesi con sistemi agricoli
avanzati.
Tra le micotossine, le aflatossine rappresentano
le sostanze più pericolose per la salute
umana ed animale.
Per l’Italia, l’aflatossina, è soprattutto un problema
connesso con l’importazione di derrate
da Paesi tropicali e subtropicali, con climi
piuttosto caldi e umidi, ma le condizioni
di crescita e produzione sono facilmente
riscontrabili anche sul territorio nazionale.
Infatti, la particolare condizione climatica
dell’estate del 2003 ha fatto sì che si creassero
le condizioni ideali per lo sviluppo, nelle
derrate cerealicole, dei funghi responsa-
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Contributi pratici
bili della produzione di aflatossina B1. Tale
situazione ha determinato, di riflesso, la presenza
ed il ritrovamento dell’aflatossina M1
nel latte e nei suoi derivati. Il problema dell’aflatossina
M1 nel latte ha creato una situazione
d’emergenza che ha coinvolto tutto il
comparto lattiero-caseario causando gravi
danni alla filiera del latte.
Mentre in passato il problema si era presentato
solo sporadicamente, in questo caso
il servizio veterinario si è trovato a gestire
una situazione in cui erano coinvolti la
quasi totalità degli allevatori. Tale fenomeno
ha condotto ad un’estensione ed intensificazione
dei controlli sul latte di massa e su
alcuni alimenti di uso zootecnico.
Dopo aver governato e superato l’emergenza
aflatossine, ora è necessario impegnarsi
nella prevenzione, che è la vera arma vincente
per garantire al cittadino prodotti di
qualità.
Scopo di questo lavoro è stato quello di
monitorare la contaminazione da aflatossina
M1 nel latte bovino nella provincia di
Rieti, in collaborazione con la Centrale del
latte di Rieti.
Le aflatossine
Tabella - Le alfatossine scoperte fino ad oggi
Alfatossine Chi le produce Dove si trovano
B1
B2
G1
G2
M1
M2
Funghi:
Aspergillus flavus
Aspergillus parasiticus
Funghi:
Aspergillus flavus
Aspergillus parasiticus
Funghi:
Aspergillus flavus
Funghi:
Aspergillus parasiticus
Gli stessi animali
che assumono alimenti
contaminati da B1 e B2
Le aflatossine, scoperte negli anni sessanta,
sono state per parecchio tempo oggetto di
studio da parte di molti ricercatori.
I primi casi di aflatossicosi animale risalgono
ai primi anni sessanta in Inghilterra con
più di 100.000 tacchini colpiti; la causa era
l’alimentazione con una farina di arachidi
contaminata da aflatossina B1.
Tale incidente attirò il mondo scientifico il
quale iniziò studi e ricerche che portarono
all’identificazione dei miceti produttori.
Il mutare delle condizioni climatiche sul territorio
nazionale, avvicinandosi sempre di
più a quelle dei climi tropicali e subtropicali,
ha creato le condizioni ideali per lo
sviluppo dei funghi responsabili della produzione
delle aflatossine, ciò ha indotto gli
operatori del settore a concentrare di più
l’attenzione sugli alimenti destinati all’alimentazione
degli animali da reddito.
Le aflatossine sono metaboliti secondari altamente
tossici, prodotti in opportune condizioni
microclimatiche, da funghi microscopici
appartenenti alla famiglia degli ascomiceti,
genere aspergillus, che si sviluppano
su numerosi substrati vegetali come cereali
(con particolare riferimento al mais),
semi oleaginosi (come le arachidi), spezie,
granaglie, frutta secca ed essiccata, sia durante
la coltivazione che durante il trasporto
e l’immagazzinamento.
Gli aspergilli sono delle muffe ubiquitarie
presenti nell’ambiente.
Le aflatossine ritrovate come contaminanti
naturali negli alimenti di origine vegetale
sono: la B1, B2, G1 e G2.
Le aflatossine B1 e B2 sono prodotte dalle
specie aspergillus flavus (maggiormente diffuso)
e aspergillus parasiticus (più comune
nei climi tropicali e subtropicali), mentre le
aflatossine G1 e G2 sono prodotte solo
dalla specie apergillus parasiticus.
Oltre alle aflatossine del gruppo B e G
hanno importanza quelle del gruppo M; le
aflatossine M1 e M2 sono metaboliti idrossilati
rispettivamente di B1 e B2 che si riscontrano
nel latte di lattifere alimentate con
mangimi contaminati da aflatossine B1 e B2.
L’aflatossina M1 è il 4-monoidrossiderivato
dell’aflatossina B1. Nella tabella sottostante,
i principali alimenti zootecnici, sono raggruppati
in categorie di rischio di contaminazione
da aflatossina B1.
Formaggi
Mangimi
Concentrati
Sottoprodotti
Latte e i suoi derivati
Tabella - Principali alimenti zootecnici per categorie di rischio di contaminazione da aflatossina B1
Classe di rischio > Alto Medio Basso
Alimentato
• Mais (granella)
e derivati
• Pannello in lino
• Pannello di cocco
• Arachidi
• Insilato di mais
• Pastone di mais
• Cotone
• Distillers
• Polpe
• Orzo, altri careali e derivati
• Fieni
• Soia
• Crusca
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Limiti di legge
In base alla normativa europea, per quanto
riguarda il contenuto di aflatossina M1 nel
latte (latte crudo, latte destinato alla fabbricazione
di prodotti a base di latte, latte
trattato termicamente) e i derivati del latte
“che siano essiccati, diluiti, lavorati o composti
da più di un ingrediente”, il tenore massimo
ammesso è di 50 ng/kg e di 10 ng/kg
sugli alimenti per l’infanzia. Per l’aflatossina
B1 il Decreto Legislativo n.149 del 10/05/2004
in attuazione delle direttive 2001/102/CE,
2002/32/CE e 2003/57/CE, relative alle sostanze
e ai prodotti indesiderabili nell’alimentazione
degli animali, stabilisce che per le bovine
da latte il limite nei mangimi è di 5 ppb
e nelle materie prime a rischio è di 20 ppb.
Disegno - Test Strip
Figura - Aflatoxin Test Strip
Unità di misura usate
Alimenti p.p.m. milligrammi/Kg p.p.b. microgrammi/Kg p.p.t. nanogrammi/Kg
Latte destinato
ad uso alimentare
AFMI < 0,05 AFMI < 50
Tutte le materie prime
(semi, farine, panelli,
foraggi, freschi e secchi, etc.)
Mangimi Complementari
(pellettati, miscele di farine
e mangimi, etc.)
Mangimi completi
(miscele di mangimi che bastano
ad assicurare una
razione giornaliera, unifeed)
Monitoraggio della contaminazione da aflatossina M1
nel latte bovino nella provincia di Rieti
Lo studio che è stato condotto è quello di
monitorare la contaminazione dell’aflatossina
M1 nel latte bovino nella provincia di
Rieti, durante il corso di tre anni, dall’anno
2004 all’anno 2006. Questo studio è stato
effettuato in collaborazione con la Centrale
del latte di Rieti, in quanto la maggior parte
del latte proveniente dagli allevamenti bovini
della provincia, confluisce nello stabilimento,
dove viene sottoposto ad analisi per
verificare la concentrazione dell’aflatossina
M1, al fine di garantire il rispetto dei limiti
di legge, a tutela del consumatore finale.
Ogni giorno alla centrale del latte giungono
mediamente tre autocisterne che raccolgono
complessivamente 28.000 litri di latte
proveniente dagli allevamenti della provincia.
Ciascuna autocisterna è costituita da tre
aree distinte e su ogni singolo scomparto
vengono effettuati i campionamenti del
latte. Il prelievo dei campioni di latte consta
delle seguenti fasi:
- agitazione della massa insufflando aria sterile
al fine di avere una massa omogenea
tra la parte magra e la parte grassa;
AFBI < 0,02 AFBI < 20
AFBI < 0,005 AFBI < 5
AFBI < 0,005 AFBI < 5
Nota bene: i limiti di legge indicati in tabella si riferiscono solo alle bovine da latte
- mediante un prelevatore viene raccolto all’interno
di un contenitore sterile il campione
di latte.
Da ogni singolo scomparto di ciascuna autocisterna
si preleva un campione di latte
da 500 ml. Da ognuno dei tre campioni di
ogni autocisterna si preleva una quantità di
latte per costituire il campione globale da
50 ml, sul quale verranno effettuate le analisi
per la ricerca dell’aflatossina M1, mediante
il test CHARM ROSA READER.
Test CHARM ROSA READER
Dal campione globale si prelevano 300 microlitri
di latte mediante una pipetta e s’inoculano
nel AFLATOXIN TEST STRIP, il quale viene
posto in incubazione per 15 min. a 38°C.
Il test strip è costituito da:
• anticorpi dell’aflatossina M1
(palline rosse nel disegno);
• linea T (test);
• linea C (controllo).
Il test è un saggio immunoenzimatico basato
su un legame antigene-anticorpo, con lo
stesso principio di funzionamento del test
ELISA. Una volta inoculati 300 microlitri di
latte, questo migra per capillarità lungo il
test strip. Le molecole libere di aflatossina
M1 presenti nel campione di latte si legano
agli anticorpi presenti sul test strip.Gli anticorpi
dell’aflatossina (palline rosse nel
disegno) fluiscono lungo lo strip e si legano
alla linea T del test e C del controllo.
C
T
Negative
Control line
Ab binding reagent
Test line
detoxified AFAb
binding reagent
Positive
C
Quando il campione di latte è negativo, un
maggior numero di anticorpi per l’aflatossina
si lega alla linea T del test e questa appare
più scura rispetto alla linea C.
Quando il campione di latte è positivo, il
legame alla linea T è inibito, gli anticorpi si
legano all’aflatossina M1 presente nel latte
e si forma l’immunocomplesso, il quale migra
lungo il test strip e nella linea C del controllo
avviene una reazione immunoenzimatica
(legame immunocomplesso-enzima)
determinando una reazione colorimetrica,
di conseguenza la linea C risulterà più scura
rispetto alla linea T.
T
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Contributi pratici
Il legame viene poi interpretato tramite il
lettore ROSA READER.
Il test strip dà una risposta di tipo qualitativo,
mentre il lettore rosa reader quantifica
la risposta qualitativa in termini di positività
o negatività del campione mettendo a
confronto la linea T del test e la linea C del
controllo. Al fine di ottenere un controllo
di qualità dell’aflatoxin test strip l’azienda
CHARM SCIENCES responsabile della fabbricazione
di tali test ha analizzato contemporaneamente
1167 campioni di latte
con la metodica HPLC e con l’aflatoxin test
e sono stati ottenuti dei valori medi con l’aflatoxin
test ai quali corrispondono valori
medi espressi in ppt ottenuti con il metodo
HPLC. Tali valori possono essere utilizzati
come indicazione per l’interpretazione
della lettura ottenuta con il rosa reader:
Dall’analisi di 233 campioni di latte è stato
ottenuto un valore medio di -603 con l’aflatoxin
test al quale corrisponde l’assenza
di AFM1 nel latte valore ottenuto con la metodica
HPLC.
Dall’analisi di 279 campioni è stato ottenuto
un valore medio di +2 con l’aflatoxin test
al quale corrisponde il valore di 25 ppt ottenuto
con la metodica HPLC.
Dall’analisi di 252 campioni è stato ottenuto
un valore medio di +414 con l’aflatoxin
test al quale corrisponde un valore di 50
ppt ottenuto con il metodo HPLC, limite stabilito
dalla legislazione comunitaria.
I valori arrivano fino a 100 ppt in quanto il
test è fabbricato da un’industria che a sede
negli Stati Uniti, dove il livello di accettabilità
per legge è dieci volte superiore (0,5
ppb) rispetto ai limiti fissati dalla legislazione
comunitaria.
Quando si eseguono le analisi su campioni
di latte per valutare la concentrazione di
AFM1 e si riscontrano valori positivi sospetti,
si inviano i campioni ai laboratori accreditati
per il controllo in HPLC (cromatografia
liquida ad alta pressione). Mensilmente
sia il lettore rosa reader che il test strip vengono
tarati utilizzando 100 ppt di aflatossina
pura diluita in 5 ml di latte.
Il monitoraggio della contaminazione da
AFM1 nel latte bovino è stato effettuato durante
un periodo di tre anni, dall’anno 2004
all’anno 2006.
I risultati delle analisi a cui sono stati sottoposti
campioni di latte bovino durante i tre
anni sono stati riportati nei seguenti grafici,
dove per ogni mese viene indicato il valore
medio di AFM1, il quale è stato ottenuto
effettuando per ogni mese una media
dei valori di AFM1 ottenuti sottoponendo
ogni giorno campioni di latte alle analisi
con l’aflatoxin test.
I valori di aflatossina M1 sono espressi in
ppt e corrispondono ai valori ottenuti con
l’aflatoxin test utilizzato nella centrale del
latte. In ciascun grafico si può osservare l’andamento
della contaminazione da aflatossina
M1 nel latte bovino proveniente dagli
allevamenti intensivi e tradizionali della provincia
di Rieti.
Dai grafici possiamo osservare che i due
periodi critici caratterizzati da un’elevata
concentrazione di aflatossina M1 nel latte
sono la primavera e fine estate. Durante la
primavera c’è una ricontaminazione dei prodotti
zootecnici contenuti nei silos in seguito
all’instaurarsi di determinate condizioni
ambientali quali temperatura ed umidità
elevate, fattori che favoriscono la produzione
da parte dei funghi aspergillus già
presenti nelle derrate di aflatossina B1.
media di
lettura:
assenza di
AFM1
-603, SD=233
Andamento della contaminazione da AFM1 nel latte bovino
media di
lettura:
media di
lettura:
media di
lettura:
media di
lettura:
25 ppt +2, SD = 279
50 ppt +414, SD = 252
75 ppt +670, SD = 221
100 ppt +943, SD = 182
Anno 2004
Anno 2005
Anno 2006
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Mentre il periodo di agosto-settembre si configurano come un
periodo a rischio in quanto:
• il mais della campagna precedente ancora in uso, sia esso
proveniente dagli stoccaggi aziendali, sia esso acquistato sul
mercato, è ormai rappresentato solo dagli avanzi (prodotti di
qualità inferiore), rimasti nei magazzini o nei silos di stoccaggio,
quindi, pur essendo commercializzabile (ovvero con un contenuto
di AFB1 inferiore alle 20 ppb) può contenere polveri e rotture
delle cariossidi con più alto contenuto di AFB1 che possono
poi nella bovina da latte trasformarsi in un contenuto di AFM1
nel latte che rischia di eccedere il limite di legge delle 50 ppt;
• il primo mais dell’annata in corso che arriva sul mercato è rappresentato
o da mais precoci, che per loro caratteristiche fisiologiche
subiscono maggiormente gli stress ambientali e climatici
o proprio da quei mais che, essendo coltivati in zone a ridotta
disponibilità idrica o con attacchi parassitari particolarmente
severi, raggiungono la maturazione prima degli altri di uguale
classe produttiva.
Nei grafici emerge che il rischio di contaminazione del latte nell’allevamento
tradizionale è minore rispetto a quello intensivo
per la differente tipologia di alimentazione.
Nell’allevamento intensivo gli animali vengono alimentati con unifeed,
ovvero mais, insilato di mais, fieno di qualità e scadente, farine
di graminacee, nuclei proteici e farine di soia, cotone e altri sottoprodotti
industriali.
Nell’allevamento tradizionale gli animali vengono invece alimentati
durante la stagione invernale con il fieno e durante la primavera
con foraggio fresco (erba) e mangimi.
Dall’osservazione dei grafici emerge che la concentrazione di AFM1
nel latte rientra al di sotto del limite di legge di 50 ppt e si nota che
dall’anno 2004 all’anno 2006 c’è stato un lento ma graduale miglioramento
della contaminazione del latte in seguito ad una costante
informazione degli allevatori sul rischio aflatossine e sulla corretta
gestione degli alimenti.
Mentre durante il periodo di agosto-settembre gli animali sono
stati alimentati con prodotti di qualità inferiore della campagna
precedente, rimasti nei magazzini o nei silos di stoccaggio, che,
pur essendo commercializzabile (ovvero con un contenuto di
AFB1 inferiore alle 20 ppb) possono contenere polveri e rotture
delle cariossidi con più alto contenuto di AFB1 che possono poi
nella bovina da latte trasformarsi in un contenuto di AFM1 nel latte
che rischia di eccedere il limite di legge delle 50 ppt.
Inoltre è emerso che il rischio di contaminazione del latte nell’allevamento
tradizionale è minore rispetto a quello intensivo per la
differente tipologia di alimentazione.
Effettuando un confronto tra l’andamento della contaminazione di
aflatossina M1 nel latte bovino nell’anno 2004, 2005, 2006 è stato
riscontrato che c’è stato un lento ma graduale miglioramento della
contaminazione del latte in seguito ad una costante informazione
degli allevatori sul rischio aflatossine e sulla corretta gestione degli
alimenti zootecnici.
Per prevenire il rischio di contaminazione del latte la normativa vigente
prevede, per tutti i punti critici della filiera quali stabilimenti
e depositi di cereali, granella e farine, mangimifici, allevamento,
stabilimenti di lavorazione del latte, l’obbligo di adottare un piano
di autocontrollo, in cui sia prevista una sezione specifica per il controllo
delle aflatossine con l’indicazione della periodicità, del metodo
d’analisi e del sistema di rintracciabilità dei singoli conferenti.
Gli organi ufficiali dovranno verificare la presenza, l’attuazione e
l’efficacia delle procedure di autocontrollo e provvedere ad eseguire
eventualmente campioni ufficiali.
Conclusioni
Dallo studio condotto sul monitoraggio della contaminazione da
aflatossina M1 nel latte bovino nella provincia di Rieti, durante tre
anni, dall’anno 2004 all’anno 2006, è emerso che la concentrazione
di aflatossina M1 rientra al di sotto del valore soglia di 50 ppt.
Dall’osservazione dell’andamento della contaminazione da aflatossina
M1 nel latte bovino, sono stati individuati due periodi critici,
la primavera e fine estate, caratterizzati da un aumento della
concentrazione di aflatossina M1 nel latte; in quanto gli animali sono
stati alimentati durante la primavera con prodotti zootecnici
contenuti nei silos che hanno subito una ricontaminazione in seguito
all’instaurarsi di determinate condizioni ambientali quali temperatura
ed umidità elevate, fattori che favoriscono la produzione
da parte dei funghi aspergillus già presenti nelle derrate
di aflatossina B1.
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