Lezione 16 - Università degli Studi della Basilicata

In questa presentazione:
Microbiologia degli alimenti 1
Prof. Eugenio Parente
AA 2006-2007
Esercitazione in aula: metodi per lo
studio e la quantificazione della microflora
deteriorante negli alimenti
o Indicatori di cattiva igiene e agenti di deterioramento
Tenore in germi
Psicrotrofici
Pseudomonas
Coliformi ed Enterobacteriaceae
Sporigeni aerobi
Sporigeni anaerobi
Muffe e lieviti
o Microrganismi utili
Fermenti lattici
Microstafilococchi
o Indici di contaminazione con patogeni e patogeni
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
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Tenore in germi a 30°C
o viene considerato una misura della qualità
igienica di prodotti deteriorabili non fermentati
quali carne cruda e prodotti a base di carne,
prodotti vegetali, latte, etc.
o la conta viene in genere condotta per
inclusione in Plate Count Agar o Plate Count
Agar Standard (per il latte) con incubazione a
30°C per 48 h
o Il PCA viene sostituito da substrati privi di
zuccheri se la conta deve essere eseguita su
alimenti fermentati
Tenore in germi a 30°C
o Pro
• È un metodo semplice, ben
standardizzato, relativamente rapido
e poco costoso
o Contro
• Non permette di contare realmente
tutti i tipi di agenti di deterioramento
potenzialmente presenti
• Non sempre è facile contare
affidabilmente le colonie e la conta
è difficila da automatizzare
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Psicrotrofici
o La conta su PCA può
avvenire dopo incubazione a
7°C per 10 gg o 21°C per 25
h, in modo da rendere il
l’incubazione selettiva per gli
psicrotrofici
o Le colonie, in genere molto
piccole, possono essere
evidenziate aggiungendo
cloruro di trifeniltetrazolio
che, ridotto dai
microrganismi, diventa rosso
Pseudomonas
o Membri del genere
Pseudomonas possono
essere contati
selettivamente utilizzando
inibitori come la cetrimide,
l’acido nalidixico, la
fucimide e la cefaloridina
o Specie diverse del genere
Pseudomonas possono
essere contate
separatamente sulla base
della presenza di pigmenti
fluorescenti o visibili
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Coliformi ed Enterobacteriaceae
o Possono essere contati con metodi in
piastra e MPN utilizzando substrati
selettivi e/o differenziali
o La scelta del metodo dipende in parte
dalla sensibilità desiderata e dalla
matrice alimentare. In alcuni casi è
possibile contare contemporaneamente
coliformi ed Escherichia coli
Coliformi su Violet Red Bile Agar
o E’ selettivo per la presenza di
cristal violetto (inibisce i G+) e sali
biliari (inibiscono i microrganismi
di origine non fecale)
o E’ differenziale per la presenza di
lattosio e rosso neutro (la
produzione di acido determina il
viraggio a rosso)
o Per ottenere risultati affidabili è
necessario eseguire la conta
entro 24 h e contare solo le
colonie della morfologia adeguata
(rosso-porpora, 1-2 mm)
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Coliformi in Brilliant Green Bile
(2%) Broth
o La conta avviene per MPN
(Most Probable Number)
o Il substrato è selettivo per
la presenza di verde
brillante e sali biliari e
differenziale per la
presenza di lattosio: i tubi
sono positivi quando viene
prodotto gas
Sporigeni aerobi
o Il campione o la prima diluizione (in caso di
campioni solidi) viene trattato a 80°C per 30 min
per distruggere le cellule vegetative
o La conta viene realizzata per inclusione o per
spandimento in Dextrose Tryptone Agar,
contenente l’indicatore Porpora di bromocresolo
o Le colonie degli agenti del flat-sour sono gialle
sullo sfondo porpora del substrato
o L’incubazione può essere condotta a 55°C pr
48-72 h (termofili come G. stearothermophilus)
o a 35°C per 48 h (mesofili, come B. coagulans)
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Sporigeni anaerobi
o Il trattamento dei campioni è simile a quello
per gli sporigeni aerobi
o La conta viene in genere condotta in tubo,
MPN, utilizzando diversi substrati (brodi di
fegato, brodo al tioglicollato, reinforced
clostridial medium, etc.) degassati prima
dell’uso e coperti con tappo di paraffina dopo
l’inoculo, raramente si usano substrati solidi
o La conta di mesofili o termofili può essere
effettuata utilizzando 35°C o 55°C come
temperatura di incubazione
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Muffe e lieviti
o La conta viene condotta utilizzando substrati
selettivi per la presenza di acidi (Malt Extract
Agar a pH 3,5, Potato Dextrose Agar) o
antibiotici (Oxytetracycline Glucose Yeast
Extract Agar, Rose Bengal Clorapmphenicol
Agar)
o Muffe e lieviti possono essere contati
separatamente a causa della diversa
morfologia delle colonie
o L’incubazione è in genere 20-25°C per 3-5
gg, ma le piastre possono essere invase da
muffe
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Muffe su substrati solidi
Fermenti lattici
o Possono essere contati utilizzando substrati
selettivi (bassi pH, presenza di acido acetico,
di antibiotici), elettivi e/o differenziali
o Sono disponibili moltissimi substrati diversi
adatti a diverse esigenze e a diversi
microrganismi
o I substrati più noti sono M17 (per
streptococchi), Rogosa Agar (per le specie
più aciduriche), Tomato Juice Agar (per
alcune specie isolabili da prodotti vegetali)
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Micro-stafilococchi
o I substrati vengono resi selettivi per la
presenza di alte concentrazioni di NaCl (7.5-
10%) o di altri composti osmoticamente attivi,
o inibitori
o Possono essere aggiunti diversi sistemi
differenziali (rosso d’uovo per verificare la
presenza di lecitinasi e fosfatasi, sistemi
zucchero/indicatore, riduzione di sali come
potassio tellurito)
o I substrati più comuni sono Mannitol Salt
Agar, Tryptone Soya Broth con 7.5% NaCL,
Baird Parker agar, Kranep agar
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Stafilococchi su Baird-Parker
medium
o I substrato è inibitorio per la
presena di potassio tellurito
e di potassio cloruro
o La presenza di glicina
migliora il recupero delle
cellule danneggiate
o I micrococchi sono
fortemente inibiti
o Gli stafilococchi coagulasinegativi
formano colonie da
grigie a nere brillanti
o S. aureus forma colonie
nere circondate da un alone
di idrolisi del rosso d’uovo
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Spiral plater
o Un’apparecchiatura
semiautomatica distribuisce il
campione sulla superficie di una
piastra secondo una spirale di
Archimede
o Inoculo e diluizione avvengono
contemporaneamente (in pratica
usando un campione liquido si
realizzano diluizioni 10 -2 -10 -4 )
o Risparmio di manodopera,
spazio e materiale
o La conta può avvenire
utilizzando apparecchiature
automatiche
Petrifilm
o Il substrato è disposto fra
due fogli di materiale
plastico e viene inoculato
applicando l’inoculo o una
sua diluizione sulla
superficie
o L’ingombro è limitato e il
tempo per inoculare è
ridotto
o Esistono substrati per la
maggior parte degli
indicatori di cattiva igiene
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