Protocollo SAFE Elettroforesi Verticale su gel di acrilamide a ...

Laboratorio di Microbiologia IndustrialeUniversità degli Studi della BasilicataSAFE - Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed AmbientaliSchool of Agriculture, forest, Food and Environmental sciencesScopoProtocollo SAFEElettroforesi Verticale su gel di acrilamide a concentrazionecrescente di denaturanti condotta in paralleloSeparazione di frammenti di DNA in funzione della sequenzaReagenti------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1. Buffer TAE 50XSostanze1) Acido acetico glaciale: 57.1 mLIl prodotto puro è infiammabile e provoca gravi ustioni. Frasi R10, R35 (che corrispondonorispettivamente a H226, H314 ed H318).Lavorare sotto cappa ed usare guanti adatti. Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. In caso dicontatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare ilmedico. In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile,mostrargli l'etichetta). Frasi S23, S26 ed S45.2) EDTA 0,5M: 100 mLComposto da 18,612 grammi di EDTA ed acqua deionizzata.EDTAIl prodotto puro è irritante per gli occhi. Nocivo per gli organismi acquatici. Può provocare alungo termine effettivi negativi per l'ambiente acquatico Frasi R36 (H319), R 52 ed R 53(H412)In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua econsultare il medico. Non disperdere nell'ambiente. Frasi S26 e S61 (S61 corrisponde aP305+351+338).Preparazione dell’EDTA 0,5M: sciogliere l’EDTA in 70 mL di acqua deionizzata(correggere il pH ad 8) e portare a volume in pallone tarato.SAFEDGGEv1 sc/EP1

Laboratorio di Microbiologia IndustrialeUniversità degli Studi della BasilicataSAFE - Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed AmbientaliSchool of Agriculture, forest, Food and Environmental sciencesLa miscela di EDTA 0,5M è irritante per gli occhi. Frasi R36 (H319).In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua econsultare il medico. Frasi S263) TRIS base: 242 gIrritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Frasi R36, R37, R38 (H 319, H335 e H315).In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua econsultare il medico. Usare indumenti protettivi adatti. Frasi S26 ed S36.4) H 2 O deionizzata (sostanza non pericolosa).Preparazione della miscela: Buffer TAE 50X:Per la preparazione del Buffer TAE 50X (lavorando sotto cappa chimica) mettere in un becherTRIS, Acido Acetico, EDTA, agitare fino al completo discioglimento del TRIS. Trasferire lasoluzione in un pallone tarato e portare a volume con dH 2 O. Mettere il Buffer in una bottiglia eautoclavare a 120°C per 20-30 min. Stoccare a temperatura ambiente.La miscela provoca ustioni, è irritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Frasi R34,R36, R37 ed R38 (corrispondono rispettivamente a H314, H318, H319, H335 ed H315).Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. In caso di contatto con gli occhi, lavareimmediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Frasi S23, S26.La stima della durata totale dell'esposizione alle sostanze pure è circa 30 min. Un batch dibuffer è sufficiente per diverse separazioni elettroforetiche. La stima dell'esposizione allamiscela è di circa 5 min per batch. In entrambi i casi l'esposizione può essere annullatautilizzando i DPI opportuni------------------------------------------------------------------------------------------------------------------2X Dye solutionReagenti:1) Blu di bromofenolo (non pericoloso): 0,05 grammi2) Xylene cianolo: 0,05 grammiProvoca irritazione cutanea, grave irritazione oculare, può irritare le vie respiratorie. Frasi,R36, R37 ed R38 (corrispondenti a H319, H335ed H315).SAFEDGGEv1 sc/EP2

Laboratorio di Microbiologia IndustrialeUniversità degli Studi della BasilicataSAFE - Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed AmbientaliSchool of Agriculture, forest, Food and Environmental sciencesEvitare di respirare la polvere/i fumi/i gas/la nebbia/i vapori/gli aerosol. In caso di contatto congli occhi: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contattose è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Frasi P261, P305 + P352+ P338.3) Buffer TAE 1X (non pericoloso): 10 mL.Preparazione della miscela: 2X Dye solution: miscelare i reagenti e stoccare a temperaturaambiente.La miscela ottenuta non è pericolosa. La durata dell'esposizione a Xylene cianolo è breve,min. 5 min. durante la preparazione del reagente. L'esposizione può essere annullatautilizzando i DPI appropriati (occhiali, guanti maschera)------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Dcode Dye SolutionReagenti:1) Blu di bromo fenolo al 2% (la sostanza non è pericolosa): 0.25 mL2) Xylene cianolo al 2% (la sostanza non è pericolosa): 0,25 mL3) Glicerolo (la sostanza non è pericolosa): 7mL.4) H 2 O deionizzata (sostanza non pericolosa): 2,5mL.Preparazione della miscela: Dcode Dye Solution: miscelare i reagenti e stoccare atemperatura ambiente..La miscela ottenuta non è pericolosa.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------SAFEDGGEv1 sc/EP3

Laboratorio di Microbiologia IndustrialeUniversità degli Studi della BasilicataSAFE - Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed AmbientaliSchool of Agriculture, forest, Food and Environmental sciencesSoluzione denaturante al 100% all’8% di acrilammideReagenti:1) Acrilamide/bis acrilamide 40%: 20mLPuò provocare il cancro. Può provocare alterazioni genetiche ereditarie. Nocivo per inalazionee contatto con la pelle. Tossico per ingestione Può provocare alterazioni genetiche ereditarieper inalazione, a contatto con la pelle e per ingestione. Irritante per gli occhi e la pelle. Puòprovocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Possibile rischio di ridotta fertilità. Frasi:R45, R46, R20/21, R25, R46/23/24/25, R36/38, R43, R62 (H302, H315, H317, H319, H330,H334, H340, H350, H361f, H372).Evitare l'esposizione e procurarsi speciali istruzioni prima dell'uso. Usare indumenti protettiviadatti. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acquae consultare un medico. Usare guanti adatti. In caso di incidente o di malessere consultareimmediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). Frasi S53, S26,S36, S37 ed S45(P260, P201,P280, P284, P301, P310, P305, P351, P338).2) Formammide: 40 mLPuò danneggiare i bambini non ancora nati. R61 (H360D)Evitare l'esposizione - procurarsi speciali istruzioni prima dell'uso. In caso di incidente o dimalessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). Frasi S53ed S45 (P201, P308 + P313).3) Buffer TAE 50X: 2mLLa miscela provoca ustioni, è irritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Frasi R34,R36, R37 ed R38 (corrispondono rispettivamente a H314, H318, H319, H335 ed H315).Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. In caso di contatto con gli occhi, lavareimmediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Frasi S23, S26.4) Urea (sostanza non pericolosa): 42 g.5) H 2 O deionizzata (sostanza non pericolosa)Preparazione della miscela: soluzione denaturante al 100% all’8% di acrilammide:Scioglere 42 g grammi di urea in acrilamide, formammide e buffer TAE e portare a volumecon acqua deionizzata in pallone tarato. Degasare e filtrare con filtri da 0,45µm. Conservare inbottiglia scura a 4°C.SAFEDGGEv1 sc/EP4

Laboratorio di Microbiologia IndustrialeUniversità degli Studi della BasilicataSAFE - Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed AmbientaliSchool of Agriculture, forest, Food and Environmental sciencesLa miscela può provocare il cancro. Può provocare alterazioni genetiche ereditarie. Tossico peringestione. Può provocare alterazioni genetiche ereditarie per inalazione, a contatto con la pellee per ingestione. Irritante per gli occhi e la pelle. Può provocare sensibilizzazione per contattocon la pelle. Possibile rischio di ridotta fertilità. Può danneggiare i bambini non ancora nati.Frasi: R45, R46, R25, R46/23/24/25, R36/38, R62, R43, R61 (H302, H315, H317, H319,H330, H334, H340, H350, H361f, H372, H360D).Evitare l'esposizione e procurarsi speciali istruzioni prima dell'uso. Usare indumenti protettiviadatti. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acquae consultare un medico. Usare guanti adatti. In caso di incidente o di malessere consultareimmediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). Frasi S53, S26, S36, S37 edS45 (P260, P201,P280, P284, P301, P310, P305, P351, P338).L'esposizione all'acrilammide e alla formammide deve essere ridotta al minimo:a. lavorando sotto cappa apsiranteb. usando i DPI (maschera, guanti, camice, occhiali)c. usando dispositivi di pipettaggioIn condizioni normali l'esposizione durante la preparazione dei reagenti è di 5 min per batch.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Soluzione denaturante allo 0% all’8% di acrilammideReagenti:1) Acrilamide/bis acrilamide 40%: 20mLPuò provocare il cancro. Può provocare alterazioni genetiche ereditarie. Nocivo per inalazionee contatto con la pelle. Tossico per ingestione. Può provocare alterazioni genetiche ereditarieper inalazione, a contatto con la pelle e per ingestione. Irritante per gli occhi e la pelle. Puòprovocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Possibile rischio di ridotta fertilità. Frasi:R45, R46, R20/21, R25, R46/23/24/25, R36/38, R43, R62 (H302, H315, H317, H319, H330,H334, H340, H350, H361f, H372).Evitare l'esposizione e procurarsi speciali istruzioni prima dell'uso. Usare indumenti protettiviadatti. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acquae consultare un medico. Usare guanti adatti. In caso di incidente o di malessere consultareSAFEDGGEv1 sc/EP5

Laboratorio di Microbiologia IndustrialeUniversità degli Studi della BasilicataSAFE - Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed AmbientaliSchool of Agriculture, forest, Food and Environmental sciencesimmediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). Frasi S53, S26,S36, S37 ed S45(P260, P201,P280, P284, P301, P310, P305, P351, P338).2) Buffer TAE 50X: 2mLLa miscela provoca ustioni, è irritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Frasi R34,R36, R37 ed R38 (corrispondono rispettivamente a H314, H318, H319, H335 ed H315).Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. In caso di contatto con gli occhi, lavareimmediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Frasi S23, S26.3) H 2 O deionizzata (sostanza non pericolosa): 78 mL.Preparazione della miscela Soluzione denaturante allo 0% all’8% di acrilammide:Versare in una beuta acrilamide, TAE ed acqua deionizzata. Degasare e filtrare con filtri da0,45µm. Conservare in bottiglia scura a 4°C.La miscela può provocare il cancro. Può provocare alterazioni genetiche ereditarie. Tossico peringestione Può provocare alterazioni genetiche ereditarie per inalazione, a contatto con la pellee per ingestione. Irritante per gli occhi e la pelle. Può provocare sensibilizzazione per contattocon la pelle. Possibile rischio di ridotta fertilità. Frasi: R45, R46, R25, R46/23/24/25, R36/38,R62, R43, R61 (H302, H315, H317, H319, H330, H334, H340, H350, H361f, H372).Evitare l'esposizione e procurarsi speciali istruzioni prima dell'uso, Usare indumenti protettiviadatti. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acquae consultare un medico. Usare guanti adatti. In caso di incidente o di malessere consultareimmediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). Frasi S53, S26,S36, S37 ed S45(P260, P201,P280, P284, P301, P310, P305, P351, P338).L'esposizione all'acrilammide e alla formammide deve essere ridotta al minimo:a. lavorando sotto cappa apsiranteb. usando i DPI (maschera, guanti, camice, occhiali)c. usando dispositivi di pipettaggioIn condizioni normali l'esposizione durante la preparazione dei reagenti è di 5 min per batch.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------SAFEDGGEv1 sc/EP6

Laboratorio di Microbiologia IndustrialeUniversità degli Studi della BasilicataSAFE - Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed AmbientaliSchool of Agriculture, forest, Food and Environmental sciencesAmmonio persolfato al 10%Reagenti:1) Acqua deionizzata (non pericolosa): 1mL2) Ammonio persolfato: 0,1gProvoca grave irritazione oculare. Provoca irritazione cutanea. Può aggravare un incendio;comburente. Nocivo se ingerito. Può provocare una reazione allergica cutanea. Può provocaresintomi allergici o asmatici o difficoltà respiratorie se inalato. Può irritare le vie respiratorie.Frasi H319 H315 H272 H302 H317 H334 H335 (R 8 R22 R36/37/38 R42/43)Tenere/conservare lontano da indumenti/materiali combustibili. Evitare di respirare la polvere/ifumi/i gas/la nebbia/i vapori/gli aerosol. Indossare guanti di protezione. In caso di contatto congli occhi: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contattose è agevole farlo. Continuare a sciacquare. In caso di sintomi respiratori: contattare un centroantiveleni o un medico. P220 P261 P280 P305 + P351 + P338 P342 + P311 (S22, S24, S26,S37).Preparazione della miscela ammonio persolfato al 10%: sciogliere l’ammonio persolfato inacqua e stoccare in congelatore per una settimana.La miscela Può provocare una reazione allergica cutanea. Può provocare sintomi allergici oasmatici o difficoltà respiratorie se inalato. Frasi H317 H334 (R42/43).Evitare di respirare la polvere/i fumi/i gas/la nebbia/i vapori/gli aerosol. Indossare guanti diprotezione. Frasi P261 P280 (S22, S24, S37).------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TemedLiquido e vapori facilmente infiammabili. Nocivo se ingerito. Provoca gravi ustioni cutanee egravi lesioni oculari. Nocivo se inalato. Frasi: H225-H302-H314-H332.Tenere lontano da fonti di calore/scintille/fiamme libere /superfici riscaldate - Non fumare.Indossare guanti/indumenti protettivi/Proteggere gli occhi/Proteggere il viso. in caso dicontatto con gli occhi: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventualilenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Contattare immediatamente uncentro antiveleni o un medico. Frasi: P210-P280-P305 + P351 + P338-P310.Per la colorazione del gelSYBR SafeProvoca una debole irritazione cutanea. Provoca irritazioni oculari. Può irritare le vierespiratorie. Liquido combustibile. Frasi: H316, H320, H335, H227.SAFEDGGEv1 sc/EP7

Laboratorio di Microbiologia IndustrialeUniversità degli Studi della BasilicataSAFE - Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed AmbientaliSchool of Agriculture, forest, Food and Environmental sciencesIn caso di malessere, contattare un centro antiveleni o un medico. In caso diinalazione:trasportare l'infortunato all’aria aperta e mantenerlo a riposo in posizione chefavorisca la respirazione. Evitare di respirare la polvere/i fumi/i gas/la nebbia/i vapori/gliaerosol. In caso di contatto con gli occhi: sciacquare accuratamente per parecchi minuti.Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Se l'irritazionedegli occhi persiste, consultare un medico. In caso di irritazione della pelle: consultare unmedico. Lavare accuratamente le mani dopo l'uso. Frasi: P312, P304+P340, P261, P305 +P351+ P338, P337 + P313, P332 + P313, P264.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Precauzioni durante la preparazione del gelI tubi devono essere privi di materiali prima dell’introduzione delle soluzioni di acrilamide alfine di evitare che quest’ultima schizzi. Assicurarsi che i tubi siano liberi da qualsiasi materialespingendo acqua con la siringa. Rimuovere eventuali residui di acqua. L'acrilamide è unasostanza molto pericolosa. Usare cautela: indossare guanti e occhiali di protezione in ognimomento. Evitare il contatto con la pelle.Informazioni generali sulla sicurezzaLeggere il manuale prima di utilizzare il sistema DCode. Per assistenza tecnica, contattarel'ufficio Bio-Rad locale o negli Stati Uniti, contattare l'Assistenza Tecnica al numero 1-800-4BIORAD (1-800-424-6723). L’Alimentazione al sistema DCode è fornita da un alimentatoreesterno. Questo alimentatore deve essere fornito di messa a terra isolata. Tutti gli alimentatoriBio-Rad soddisfano questo importante requisito di sicurezza. Indipendentemente da qualealimentazione elettrica si utilizzi, i parametri di funzionamento massimi previsti per il sistemasono:• Limite massimo di tensione di 500 V• Limite Potenza massima 50 wattLa corrente alternata per il controllo della temperatura del sistema, e per l’elettroforesi, èfornita dall’alimentatore esterno attraverso l'unità posta sul coperchio, che fornisce un bloccodi sicurezza. La corrente è interrotta quando il coperchio è rimosso. Non tentare di aggirarequesto blocco di sicurezza. Scollegare sempre il cavo di alimentazione dell'unità e il cavodell’alimentatore esterno prima di rimuovere il coperchio, o quando si lavora con la cella.Precauzioni durante il set-up• Non usare vicino a materiali infiammabili.• Controllare sempre il sistema Dcode prima dell'uso che non vi siano componentidanneggiati.• Posizionare sempre il sistema DCode a livello del banco.• Posizionare sempre il coperchio sul serbatoio contenente il tampone con corrente alternata ealimentazione disconnessa.• Collegare sempre correttamente il sistema.SAFEDGGEv1 sc/EP8

Laboratorio di Microbiologia IndustrialeUniversità degli Studi della BasilicataSAFE - Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed AmbientaliSchool of Agriculture, forest, Food and Environmental sciencesPrecauzioni durante la corsa• Non far funzionare la pompa in assenza di tampone. Aggiungere sempre buffer fino alla linea"Fill" durante il pre-raffreddamento e / o il preriscaldamento del buffer. Tenere sempre ilbuffer sotto il livello "max" durante l'elettroforesi.• Non toccare alcuna superficie bagnata se non sono scollegate tutte le fonti elettriche.• Non mettere nulla sulla superficie superiore del modulo di sistema DCode.Precauzioni dopo la corsa• Spegnere gli interruttori di alimentazione e scollegare tutti i cavi. Lasciare che il tubo diriscaldamento si raffreddi (circa 1 minuto) prima di rimuoverlo dal serbatoio. Il tubo diceramica può essere molto caldo dopo lo spegnimento quindi non toccarlo subito dopo averspento l'alimentazione.• Non raffreddare il tubo di ceramica caldo in liquidi freddi.• Conservare sempre il modulo di controllo elettroforesi / temperatura sul supporto inalluminio.SicurezzaQuesto strumento è per il solo uso di laboratorio. Questo prodotto è conforme alla "classe A"standard per le emissioni elettromagnetiche delle apparecchiature di laboratorio. E 'possibileche le emissioni di questo prodotto possano interferire con alcuni apparecchi sensibili, comequelli elettrodomestici, quando è posizionato nelle vicinanze o nello stesso circuito. L'utentedeve essere consapevole di questo potenziale ed adottare le misure appropriate per evitareinterferenze.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------SAFEDGGEv1 sc/EP9

Laboratorio di Microbiologia IndustrialeUniversità degli Studi della BasilicataSAFE - Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed AmbientaliSchool of Agriculture, forest, Food and Environmental sciencesEtichette delle miscele per la DGGE in paralleloMiscela: TAE 50XPreparato il: Da: Scade il:Frasi di rischio:R34, R36 , R37 edR38 (H314, H319,H335 ed H315).Consigli di prudenza:S23, S26.Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. In caso dicontatto con gli occhi, lavare immediatamente eabbondantemente con acqua e consultare un medico.Miscela: 2X Dye solutionPreparato il: Da: Scade il:NON PERICOLOSOMiscela: Dcode Dye SolutionPreparato il: Da: Scade il:NON PERICOLOSOAmmonio Persolfato al 10%Preparato il: Da: Scade il:Indicazioni di pericolo:H317 H334 (R42/43).Consigli di prudenza: P261P280 (S22, S24, S37).Evitare di respirare la polvere/i fumi/i gas/la nebbia/ivapori/gli aerosol. Indossare guanti di protezione.SAFEDGGEv1 sc/EP10

Laboratorio di Microbiologia IndustrialeUniversità degli Studi della BasilicataSAFE - Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed AmbientaliSchool of Agriculture, forest, Food and Environmental sciencesSoluzione denaturante al 100% all’8% di acrilammidePreparato il: Da: Scade il:Frasi di rischio: R45,R46, R25, R46/23/24/25,R36/38, R62, R43, R61(H302, H315, H317,H319, H330, H334,H340, H350, H361f,H372, H360D).Consigli di prudenza:S53, S26,S36, S37 edS45 (P260, P201,P280,P284, P301, P310, P305,P351, P338).Evitare l'esposizione e procurarsi speciali istruzioniprima dell'uso. Usare indumenti protettivi adatti. Incaso di contatto con gli occhi lavare immediatamentee abbondantemente con acqua e consultare unmedico. Usare guanti adatti. In caso di incidente o dimalessere consultare immediatamente il medico (sepossibile, mostrargli l'etichetta).Soluzione denaturante allo 0% all’8% di acrilammidePreparato il: Da: Scade il:Frasi di rischio: R45,R46, R25, R46/23/24/25,R36/38, R62, R43(H302, H315, H317,H319, H330, H334,H340, H350, H361f,H372).Consigli di prudenza:S53, S26,S36, S37 edS45 (P260, P201,P280,P284, P301, P310, P305,P351, P338).Evitare l'esposizione e procurarsi speciali istruzioniprima dell'uso. Usare indumenti protettivi adatti. Incaso di contatto con gli occhi lavare immediatamentee abbondantemente con acqua e consultare unmedico. Usare guanti adatti. In caso di incidente o dimalessere consultare immediatamente il medico (sepossibile, mostrargli l'etichetta).SAFEDGGEv1 sc/EP11