Lezione 2 - Università degli Studi della Basilicata

Microbiologia degli alimenti 1Prof. Eugenio ParenteAA 2008-2009Lezione 2: crescita esopravvivenza dei microrganismi1

In questa presentazione:o Richiami sulla curva di crescita deimicrorganismi e sulla cinetica dicrescitao La modellazione della crescitao Stress e danno subletale. Cellule vitalinon coltivabilio Quorum sensingo Sporeo La morte dei microrganismi10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 22

La crescita per scissione binaria10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 3ATTENZIONE QUESTA FIGURA E’ TRATTA DA MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.J., PARKER, J. (2004)BROCK. BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI. VOLUME 1. CASA EDITRICE AMBROSIANA, ED E’COPERTA DA COPYRIGHTLa maggior parte dei microrganismi di interesse alimentare si riproduce per scissione binaria. 1 celluladiventa due cellule in un intervallo di tempo che si chiama tempo medio di generazione. Se l’intervallomedio di generazione è costante le cellule si moltiplicano con progressione geometrica.Entro certi limiti anche la moltiplicazione delle cellule che si riproducono per gemmazione può essereequiparata alla crescita per scissione binaria, anche se la cellula figlia, la gemma, quando si distaccadalla cellula madre può essere più piccola di quest’ultima.Nei microrganismi miceliari è possibile calcolare un tempo di duplicazione per la biomassa, non per lesingole cellule.3

Stima del tempo di generazione10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 4ATTENZIONE QUESTA FIGURA E’ TRATTA DA MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.J.,PARKER, J. (2004) BROCK. BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI. VOLUME 1. CASAEDITRICE AMBROSIANA, ED E’ COPERTA DA COPYRIGHTNella fase esponenziale di crescita, quando la crescita è bilanciata, se si mette inrelazione il logaritmo della biomassa (o di un suo componente) o del numero di cellulecon il tempo si ottiene una linea retta, dalla cui pendenza è possibile calcolare lavelocità specifica di crescita. Da quest’ultima con semplici calcoli è possibile ottenereil tempo medio di generazione.4

La curva di crescita10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 5ATTENZIONE QUESTA FIGURA E’ TRATTA DA MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.J.,PARKER, J. (2004) BROCK. BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI. VOLUME 1. CASAEDITRICE AMBROSIANA, ED E’ COPERATA DA COPYRIGHTIn realtà nella maggior parte dei casi la velocità specifica di crescita è costante soloper un periodo di tempo molto limitato.In una coltura batch (cioè in una coltura in cui una popolazione microbica vengainoculata in un determinato substrato e lasciata crescere fino all’esaurimento dellacrescita senza ulteriori aggiunte o sottrazioni di substrato) i microrganismiattraversano diverse fasi:a.Fase lag o di adattamento. La velocità specifica di crescita misurata sulla base delnumero di cellule è 0, anche se la biomassa può diminuire o aumentare lievemente.La cellula si adatta al nuovo ambiente mediante la sintesi di enzimi, l’aggiustamentodel numero di ribosomi per unità di massa, etc.b.Fase di accellerazione: la velocità specifica di crescita aumenta fino a raggiungereil massimoc.Fase log o esponenziale; la velocità specifica di crescita è costante, la crescita èbilanciata, il numero di cellule, la biomassa e la velocità assoluta di crescitaaumentano in modo esponenzialed.Fase di decelerazione: la velocità di crescita specifica diminuisce in seguito ad unavarietà di fenomeni (esaurimento dei nutrienti, accumulo di sostanze di rifuito,creazione di un ambiente ostile, etc.)e.Fase stazionaria: la velocità specifica di crescita è 0, ma la cellula può subireadattamenti anche notevoli della sua composizione per prepararsi a resistere acondizioni prolungate di starvation (carenza di nutrienti) o di stressf.Fase di morte: il numero di cellule vitali diminuisce e la biomassa può andareincontro a lisiNel mondo reale, inclusi gli alimenti, i microrganismi sono più spesso in fase lag o infase stazionaria che in fase di crescita esponenziale.5

I modelli come rappresentazionidella realtàFenomeno biologicoModello logico-verbaleModello (icono)graficoModello matematicoModello fisico10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 6La microbiologia predittiva è la branca della microbiologia che usa modelli matematiciper descrivere fenomeni come la crescita e la morte dei microrganismi.Per comprendere la realtà, per poter fare delle previsioni, per poter ottimizzareprocessi e per una varietà di altri motivi abbiamo bisogno di esprimere i fenomeni,inclusa la crescita o la morte dei microrganismi, sotto forma di modelli.Un modello logico-verbale descrive verbalmente un fenomeno e le relazioniprincipali fra le variabili di stato ma non fornisce dettagli sulle relazioni numeriche.Esempio: in assenza di limitazioni i microrganismi crescono in manieraesponenziale...Un modello iconografico usa una rappresentazione ad icone per mostrare lerelazioni fra le variabili più importanti in un fenomeno: in questa lezione verrannomostrati alcuni diagrammi di flusso di modelliUn modello fisico usa analogie con leggi della chimica o della fisica perrappresentare il fenomeno. Esempio: per rappresentare la crescita esponenziale diuna popolazione microbica si può rappresentare il fenomeno della crescita come unareazione autocatalitica di ordine 1.Un modello matematico traduce il modello fisico in un sistema di equazioni(generalmente un sistema di equazioni differenziali).6

Tipi di modellio modelli statici: descrivono lo statodelle variabili del sistema in un datomomento del tempoo modelli statici comparativi:comparano lo stato delle variabili delsistema in più momenti nel tempoo modelli dinamici: descrivono ladinamica del sistema nel tempo10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 77

Un modello statico.• Rappresenta lo stato del sistema in un datomomento.• Può essere rappresentato sotto forma ditabella o di graficoBiomass and residual glucose at 24 h2520X, S (g/L)1510XS50A B C DSample10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 88

Un modello statico comparativo.• Rappresenta lo stato del sistema in vari istanti nel tempo.• Può essere rappresentato sotto forma di tabella o di grafico.• Le linee che uniscono i punti sono il risultato di un sempliceprocesso di interpolazione• Anche se conosciamo l’andamento del processo nel tempo nonne conosciamo la dinamicabiomass vs time12108x (g/L)64x200 2 4 6 8 10time (h)10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 99

Cosa può essere necessarioprevedere?ooooDato un certo livello di contaminazione al tempo t=0 e dato uninsieme di condizioni ecologiche permissive per la crescita qualesarà il livello di contaminazione al tempo t=x?Dato un certo livello di contaminazione e dato un trattamento fisico ochimico, quale sarà il livello di contaminazione residuo al tempo t=x?Dato un insieme di condizioni ecologiche o di trattamentitecnologiche, quale sarà la probabilità che si verifichi crescita osopravvivenzaDato un processo di trasformazione quale sarà la probabilità che siecceda un certo criterio microbiologico?10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 13Sarebbe opportuno che qualsiasi previsione fosse accompagnata da dati sulla sua affidabilità o daintervalli fiduciari sulle previsioni13

Una curva di crescita, dati grezzitimelogc0 2.693.898 3.854.914 4.135.931 4.536.948 5.137.966 5.858.983 6.269.998 7.0611.864 8.512.881 10.5313.898 10.5516.881 10.3818.914 9.7722.982 8.7710-03-2009 Mal1 - Lezione 2 15Crescita di un pool di ceppi di Salmonella in funzione del tempo in un determinato set di condizioni.15

Tre modelli10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 16Fit 2 è una Gompertz, 3 un D-model, la linea nera potrebbe essere un modello trifasico16

Modellazione della fase lag: la duratadella fase lag della popolazione10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 17La stima della durata della fase lag è quella che presenta di solito i maggiori problemi17

Modellazione della fase lag:eterogeneità della fase lag dellesingole cellule10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 18Se si assume che in realtà la durata della fase lage della popolazione sia il risultato dell’eterogeneitàdella durata della prima divisione cellulare, mentre tutte le successive avvengono con la stessavelocità, si possono adottare modelli stocastici per prevedere la durata della faase lag dellapopolazione, come integrale della durata delle singole cellule18

L’interfaccia fra la crescita el’assenza di crescita10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 19Prevedere accuratamente i limiti per la crescita estrappolando modeli basati su curve di crescita èdifficile, perché potrebbero essere necessari esperimenti molto lunghi (anche >90 gg). I limiti per lacrescita vengono più spesso valutati con modelli probabilistici, con i quali viene soltanto valutato se unadata condizione determina o meno crescita o sopravvivenza.19

Un software per modelli primari: Microfit10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 20Oltre che utilizzando fogli di calcolo o programmi di statistica di uso generale, i parametri dei modellipossono essere calcolati utilizzando software specifici. MicroFit è un programma del genere. E’disponibile una versione del programma sotto forma di foglio di Macro di Excel (Dmfit)20

Cinetiche di disattivazioneooQuando le condizioni non sono permissive per la crescita ilnumero di cellule vitali diminuisce progressivamenteGeneralmente la cinetica di disattivazione non è lineare10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 21Disattivazione di Listeria in Chorizo: insistono molti fattori, competizione, disidratazione, pH,antimicrobici21

Modelli di secondo livello: polinomialiQuando la conoscenza del meccanismo fisico è insufficiente, è in generepossibile (quando la relazione fra ! e " è continua) approssimare, almenolocalmente, la relazione reale con una funzione arbitraria che costituisceun modello empirico del fenomeno:! # g(", $) + %dove $ è il vettore dei parametri del modello. I livelli delle variabili xvengono in genere codificati (o standardizzati) utilizzando la relazione:x i = (" i - " i0 )/S idove x i è il livello codificato, " i il livello non codificato corrispondente, " i0 ilcentro del disegno e S i la sua scala. la relazione polinomiale per duevariabili di input può essere scritta come:g(", $) = $ 0 + ($ 1 x 1 + $ 2 x 2 ) + ($ 11 x 12+ $ 22 x 22+ $ 12 x 1 x 2 ) + ($ 111 x 13+$ 222 x 23+ $ 112 x 12 x 2 + $ 122 x 1 x 22 ) + etc...10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 22In questa presentazione non è possibile scendere nei dettagli dei disegni sperimentali(in genere fattoriali più o meno complessi) necessari per stimare le relazionipolinomiali. I modelli di questo tipo sono tuttavia abbastanza flessibili, anche se ingenere forniscono risultati assurdi appena al di fuori dell’intervallo sperimentale (èdifficile estrapolare)22

Modelli di secondo livello: polinomialiGianotti et al. 199710-03-2009 Mal1 - Lezione 2 23In questa presentazione non è possibile scendere nei dettagli dei disegni sperimentali(in genere fattoriali più o meno complessi) necessari per stimare le relazioni23

Modelli di secondo livello: funzioninon lineariµ max(T, pH) = CTPM(T, pH) = µ opt"( T)# ( pH)$ T < T min0.0&µ max= % T min< T < T maxµ opt"(T)&' T > T max0.0$ pH < pH min0.0&µ max= % pH min< pH < pH maxµ opt#(pH)&' pH > pH max0.0)(T ( T"(T) =max)(T ( T min) 2,+*(T opt( T min)[(T opt( T min)(T ( T opt) ( (T opt( T max)(T opt+ T min( 2T) .]-( ) =# pH) ( pH ( pH min)(pH ( pH max) ,+*(pH ( pH min)(pH ( pH max) ( (pH ( pH opt) 2 .-!CTPM Rosso et al. 199510-03-2009 Mal1 - Lezione 2 24In questa presentazione non è possibile scendere nei dettagli dei disegni sperimentali(in genere fattoriali più o meno complessi) necessari per stimare le relazioni24

Modelli di secondo livello: funzioninon lineariCTPM Rosso et al. 199510-03-2009 Mal1 - Lezione 2 2525

Un modello secondarioprobabilistico# P &logit(P) = ln%( = b$ 1" P '0+ b 1T " T min( ) + b 2 ( pH " pH min ) + b 3 ( a W" a W min )!P è la probabilità di crescita o di sopravvivenza(compresa fra 0 e 1)10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 2626

Esempi di modelli di terzo livello: PMP10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 27Ora il rpogramma è on-line27

PMP on line10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 2828



ComBase Predictor10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 3131



ComBase Browser10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 3434

ComBase Browser10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 3535

PMIP: Predictive MicrobiologyInformation Portal10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 3636

Modelli empirici e modellimeccanicisticiUn modello empirico è costituito daun’espressione matematica adatta a fornire unaricostruzione del fenomeno:• i suoi parametri non hanno necessariamenteun significato biologico;• permette l’interpolazione e la ricostruzione deidati sperimentali ma non aumenta lacomprensione del fenomeno• spesso è poco applicabile al di fuoridell’intervallo sperimentale per il quale è statosviluppato10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 37I modelli empirici vengono talvolta definiti anche modelli statistici mentre quellimeccanicistici vengono definiti modelli sistematici37

Modelli empirici e modellimeccanicisticiUn modello meccanicistico è costituito daun’espressione matematica derivata (anche peranalogia) da leggi fisiche o chimiche:• i suoi parametri hanno un significato biologico;• oltre a permettere l’interpolazione e laricostruzione dei dati sperimentali aumenta lacomprensione del fenomeno• i suoi risultati sono generalmente più semplici daestrapolare10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 3838

La modellazione della crescita microbica:modelli empirici primariL’equazione logistica modificata:4 N 1Aln2/ =3 N 0 & , 4 . µ)#0 max% 1+exp*.( 5 - ) + 2'"$ + At(!L’equazione di Gompertz modificata:4ln23NN01 & , µ/ = A.exp%- exp*0 $ +. eAmax( 5 - t))#+ 1'"(!Zwietering MH, Jongenburger I, Rombouts FM, van’t Riet K (1990) Appl.Envinron. Microbiol. 56: 1875-188110-03-2009 Mal1 - Lezione 2 39A = asintoto, popolazione massima!max= pendenza massimalag= intercetta con l’asse delle x della tangente al punto di flessoEntrambi i modelli sono riparametrizzati per mettere in evidenza dei parametriimportanti per descrivere la crescita microbica e per eliminare alcune correlazioni fra iparametri originali dei modelli che ne renderebbero impossibile una stimaindipendente. Per esempio in entrambi i modelli i valori della velocità specifica dicrescita massima sono fortemente correlati con il valore iniziale della popolazione.I modelli sono qui espressi in forma esplicita, anche se possono essere espressicome equazioni differenziali. Nella forma differenziale il legame di dipendenza fravariabili di stato e parametri è molto più evidente.39

I problemi dei modelli empirici primari1. sono modelli non strutturati: la cellulamicrobica viene assunta come un’entitàcostante; in realtà la composizione e lo statofisiologico della cellula cambiano durante lacrescita;2. l’ambiente esterno viene assunto comecostante e in genere si assume che i nutrientinon siano limitanti; in realtà:a. solo alcune condizioni esterne sonocostanti;b. alcune condizioni esterne possono variaresignificativamente anche come risultatodella crescita10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 40In linea di massima i modelli empirici primari funzionano piuttosto bene e sono statimolto utilizzati, anche se si discostano notevolmente dalla realtà. Infatti se sianalizzano il modello logistico e il modello di Gompertz si può osservare facilmenteche ! non è costante, mentre la teoria prevede che lo sia almeno per un breveintervallo. Inoltre il modello logistico produce una sigmoide assolutamente simmetrica,difficile da ritrovare in realtà.E’ possibile utilizzare reti neuronali artificiali supervisionate per serie storiche perdeterminare parametri della curva di crescita e reti neuronali supervisionate permettere creare modelli di secondo ordine: le reti possono fornire risultati migliori intermini di adattamento e generalizzazione ma è necessaria una grande quantità didati per addestrarle. Inoltre si comportano come black boxes.40

Un modello dinamico della crescitamicrobica1. la crescita microbica può essere descrittacome un processo autocatalitico con unavelocità specifica m variabile. Il numero di cellulex (o la biomassa) cresce x 0 e x max mentre tcresce da 0 a ".dxdt= µ( x)!xBaranyi J et al. (1993) Food Microbiol. 10:43-59Baranyi J, Roberts TA (1994) Int. J. Food Microbiol. 23:277-29410-03-2009 Mal1 - Lezione 2 41si tratta di un modello non-autonomo: la variabile di stato dipende da se stessamu di x è differenziabile in tutto l’intervallo e la sua derivata è negativa41

Un modello dinamico della crescita microbica(Baranyi et al. 1993, Baranyi & Roberts 1994)2. se le cellule vengono trasferite da un ambiente E 1ad un ambiente E 2 esse cresceranno inizialmentead una velocità inferiore a quella possibile in E 2 acausa della necessità di adattarsi alla nuovacondizionedxdt= "( t)! µ ( x)! xdove a(t) varia fra 0 e 1 e dipende da E 1 ed E 2 edallo stato dell’inoculo e costituisce una funzione diaggiustamento fra i due ambienti. !(x) dipende soloda E 2 .10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 4242

Un modello dinamico della crescita microbica(Baranyi et al. 1993, Baranyi & Roberts 1994)3. assumiamo che l’adattamento dipenda da uncomposto essenziale, P, che questa dipendenzaabbia una cinetica di Michaelis e Menten, e che P siaccumuli con una cinetica di primo ordine con unacostante di velocità & dipende da E 2P(t)dP!(t)==" ! PK P(t)dtP +10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 43questa è l’espressione più generale perché ammette che l’ambiente E2 possacambiare nel tempo; si ammette che Kp sia indipendente dall’ambiente. Nel lavoro del1993 alfa di t viene stimato come t^n/(lambda^n+t^n) con n=443

Un modello dinamico della crescita microbica(Baranyi et al. 1993, Baranyi & Roberts 1994)4. lo stato fisiologico della cellula può esseredefinito dalla quantità:con dei sempliciP(t)q( t)= riarrangiamenti sipuò dimostrare che:K P!(t)=KP(t)=+ P(t)KKPP(t)KPP(t)+KPq(t)=1 q(t)P P +10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 44Questa è l’espressione più generale perché ammette che l’ambiente E2 possacambiare nel tempo44

Un modello dinamico della crescita microbica(Baranyi et al. 1993, Baranyi & Roberts 1994)5. datocheqq(0)q(0)+ e! t( t)= q(0)"e allora: "(t ) =#!tse l’ambiente è costante, allora & è costante ed èpossibile definire:* 1 'ln(1 +q(0)%) &!$ ln!(")h!0 0# == =10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 45La prima espressione deriva dall’integrazione di dP/dt=ni*P; q(t) tende all’infinito maquesto è irrilevante; volendo lo si può limitare in funzione di qualche fattore esterno;quello che conta è che q 0esprime lo stato della cellula all’inizio dell’incubazione (se èbasso il lag sarà lungo) e &' la velocità della transizione dalla fase lagall’esponenziale.45

Un modello dinamico della crescita microbica(Baranyi et al. 1993, Baranyi & Roberts 1994)6. !(x) può assumere diverse forme:a. curve diRichards (m=1logistica)µ( x)& ,= µ max$ 1-*$ % +xxmax)'(m#!!"b. equazione diMonodµ( x)= µ maxKSS +S10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 4646

Un modello dinamico della crescita microbica(Baranyi et al. 1993, Baranyi & Roberts 1994)7. assumendo un ambiente costante e µ(x)definito da una curva di Richards il modello puòessere integrato per stimare y=ln(x):m(µ max ( A(t)1 & e ' 1#y( t)= y0 + µmaxA(t)' ln$1+m(ymax' y0) !m % e "con:A(t)= t'(t1 & e + q+ ln$( % 1+q00#!"10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 47Nel lavoro del 1994 q0 viene stimato a 0.0425; ni dovrebbe essere dello stesso ordinedi mumax.47

Modelli di secondo livello: polinomialiQuando la conoscenza del meccanismo fisico è insufficiente, è in generepossibile (quando la relazione fra ! e " è continua) approssimare, almenolocalmente, la relazione reale con una funzione arbitraria che costituisceun modello empirico del fenomeno:! # g(", $) + %dove $ è il vettore dei parametri del modello. I livelli delle variabili xvengono in genere codificati (o standardizzati) utilizzando la relazione:x i = (" i - " i0 )/S idove x i è il livello codificato, " i il livello non codificato corrispondente, " i0 ilcentro del disegno e S i la sua scala. la relazione polinomiale per duevariabili di input può essere scritta come:g(", $) = $ 0 + ($ 1 x 1 + $ 2 x 2 ) + ($ 11 x 12+ $ 22 x 22+ $ 12 x 1 x 2 ) + ($ 111 x 13+$ 222 x 23+ $ 112 x 12 x 2 + $ 122 x 1 x 22 ) + etc...10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 48In questa presentazione non è possibile scendere nei dettagli dei disegni sperimentali(in genere fattoriali più o meno complessi) necessari per stimare le relazionipolinomiali. I modelli di questo tipo sono tuttavia abbastanza flessibili, anche se ingenere forniscono risultati assurdi appena al di fuori dell’intervallo sperimentale (èdifficile estrapolare)48

Modelli di secondo livello: polinomialiGianotti et al. 199710-03-2009 Mal1 - Lezione 2 49In questa presentazione non è possibile scendere nei dettagli dei disegni sperimentali(in genere fattoriali più o meno complessi) necessari per stimare le relazioni49

Modelli di secondo livello: funzioninon lineariµ max(T, pH) = CTPM(T, pH) = µ opt"( T)# ( pH)$ T < T min0.0&µ max= % T min< T < T maxµ opt"(T)&' T > T max0.0$ pH < pH min0.0&µ max= % pH min< pH < pH maxµ opt#(pH)&' pH > pH max0.0)(T ( T"(T) =max)(T ( T min) 2,+*(T opt( T min)[(T opt( T min)(T ( T opt) ( (T opt( T max)(T opt+ T min( 2T) .]-( ) =# pH) ( pH ( pH min)(pH ( pH max) ,+*(pH ( pH min)(pH ( pH max) ( (pH ( pH opt) 2 .-!CTPM Rosso et al. 199510-03-2009 Mal1 - Lezione 2 50In questa presentazione non è possibile scendere nei dettagli dei disegni sperimentali(in genere fattoriali più o meno complessi) necessari per stimare le relazioni50

Modelli di secondo livello: funzioninon lineariCTPM Rosso et al. 199510-03-2009 Mal1 - Lezione 2 5151

Modelli di secondo livello: funzioninon lineariGänzle et al. 199810-03-2009 Mal1 - Lezione 2 52In questa presentazione non è possibile scendere nei dettagli dei disegni sperimentali(in genere fattoriali più o meno complessi) necessari per stimare le relazioni52

Modelli di secondo livello: funzioninon lineariGänzle et al. 199810-03-2009 Mal1 - Lezione 2 53A e B Lb. sanfranciscensis C C. milleri53

Risposte alle condizioni ambientaliCondizioniletaliCondizionisub-letaliCondizionisubottimaliLivello di un fattore chimico o fisicoRange per la crescitaadattamento (aumento della resistenza allo stress)Stress sub-letale (crescita su substrati non-selettivi)Cellule VNC (recupero su substrati non-selettivi + antiossidanti)Stress letale, le cellule perdono irreversibilmente la capacità di moltiplicarsi10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 54In realtà esiste una sorta di continuum fra le condizioni che consentono la crescita di un microrganismoe quelle che ne determinano la morte: All’interno del range di condizioni che permettono la crescita, lavelocità di crescita specifica, partendo dal minimo, cresce fino a che non si raggiunge l’optimum, poidiminuisce. Immediatamente al di fuori del range di condizioni che permette la crescita la cellula non èin grado di crescere e inizia a subire stress subletali: un’esposizione prolungata a queste condizioni puòdeterminare la morte della cellula (cioè la perdita irreversibile della capacità di riprodursi). Le cellule chesi trovano esposte a danni subletali diventano in genere incapaci di riprodursi sui substrati selettivi suiquali sono in grado di riproduri le cellule sane. La crescita in condizioni subottimali permette alla celluladi adattarsi e di sopravvivere meglio in condizioni letali e subletali. Talvolta anche quando si trova incondizioni subletali la cellula, pur non essendo in grado di crescere, è in grado di sintetizzare proteine ealtre sostanze che ne migliorano la resistenza allo stress.Adattato da Ray B. 2004, fig 9.5 pag 11854

Vita, danno subletale, morteStato delle celluleVitali, nondanneggiateCrescita suterreni nonselettiviSìCrescita suterreni selettiviSìMembranacellulareintegraSìAttivitàmetabolicaSìVitali, danneggiatea livello subletaleSìSì, doporesuscitazioneSìSìVitali, noncoltivabiliSì, doporesuscitazioneNoSìSìMorteNoNoNoNo10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 5555

Adattamento allo stressStress:•Acido•Termico• Alte T°C• Basse T°C•Osmotico•Nutrizionale•Ossidativo•Sostanze tossiche•Alte pressioni•Altri10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 56La figura è tratta da Hill et al. Int. Dairy J. (2002) 12:273-283I microrganismi negli alimenti sono esposti ad una varietà di stress chimici o fisici. Se l’entità dellostress eccede una certa soglia la cellula perde irreversibilmente la capacità di moltiplicarsi (cioè muore).Livelli di stress più bassi possono causare danni subletali che rendono le cellule temporaneamenteincapaci di riprodursi (vedi dopo). A questi livelli e a livelli ancora più bassi la cellula può adattarsiattivando un certo numero di meccanismi di protezione.Tutte le cellule, per esempio, sono in grado di attivare una risposta allo stress generalizzata (GSR) infase stazionaria. Infatti, le cellule in fase stazionaria sono più resistenti delle cellule in fasseesponenziale a stress chimici e fisici. Molti microrganismi hanno meccanismi di risposta allo stressspecifici e generalizzati che possono essere attivati anche in fase esponenziale in seguitoall’esposizione a stress subletali.56

Effetto della fase di crescita10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 57La figura è tratta da Hill et al. Int. Dairy J. (2002) 12:273-283In questo esperimento, cellule di Listeria monocytogenes, un microrganismi patogeno, vengonoesposte ad uno stress letale (brusca esposizione a pH 3,5). I cerchi bianchi mostrano la curva dicrescita. I cerchi neri mostrano la percentuale di sopravvivenza dopo esposizione allo stress.57

Effetto dell’adattamento allo stressacido10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 58La figura è tratta da Hill et al. Int. Dairy J. (2002) 12:273-283La figura mostra la sopravvivenza dopo esposizione ad uno stress acido di cellule non adattate eadattate di L. monocytogenes58

Danno subletale e recupero10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 59La figura è tratta da Ray 2003 Fundamentals food microbiologyL’effetto più importante di stress subletali è il danneggiamento delle cellule microbiche che diventanotemporaneamente incapaci di riprodursi (allungamento della fase lag per poter riparare i danni causatidallo stress) o perdono la capacità di crescere su terreni selettivi che permetterebbero la crescita dicellule non danneggiate. In generale il danno irreversibile (la morte) viene valutato effettuando delleconte contemporaneamente su terreni non selettivi, che consentono il recupero delle cellule stressate(ma vive) e non stressate, e su terreni moderatamente selettivi (per esempio per aggiunta di sale) checonsentono la crescita delle sole cellule non danneggiate a livello subletale. Se il danno è temporaneole cellule possono ripararlo acquisendo la capacità di crescere anche in presenza di agenti selettivi(vedi figura a destra).59

Uso di coloranti fluorescenti per lavisualizzazione di cellule vive e morte10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 60Oggi sono disponibili una varietà di fluorocromi che consentono di visualizzare in maniera differenzialecellule vive e morte. Nella figura sono mostrate cellule di microrganismi probiotici colorate con ilcolorante LIVE/DEAD baclight, che colora di rosso le cellule morte (con membrana danneggiata) e divede le cellule vive. Esistono numerosi altri coloranti che permettono di valutare attività metabolica, pHintracellulare o presenza di gradienti transmembrana. Queste tecniche possono formire risultati miglioridi quelle basate sulla coltivazione interreni selettivi o meno.60

Cellule vitali e non coltivabili10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 61La figura è tratta da Ray 2003 Fundamentals food microbiologyIn seguito ad esposizione prolungata ad ambienti poveri di nutrienti o ad abbassamenti bruschi dellatemperatura o esposizione a danni osmotici le cellule possono entrare in uno stato temporaneo di noncoltivabilità (in genere le cellule diventano più piccole e quasi inattive da un punto di vista metabolico).Le cellule vitali ma non coltivabili (VNC) possono essere “resuscitate” riportandole nelle condizioniiniziali o aggiungendo ai substrati di coltura sostanze che neutralizzano le specie reattive dell’ossigeno(ROS), come il sodio piruvato. Questo fenomeno è stato osservato per Salmonella, Escherichia, Vibrioe Campylobacter, generi che includono specie patogene. La vitalità delle cellule non coltivabili puòessere valutata colorandole con coloranti fluorescenti che mostrano la presenza di piccole attivitàmetaboliche61

Crescita in biofilm10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 62I microrganismi possono crescere su superfici formando dei biofilm. I biofilm possono comprendereassociazioni complesse di microrganismi che si ataccano alle superfici (anche accciaio inossidabile)producendo materiale polisaccaridico. Microrganismi in biofilm sono particolarmente difficili daallontanare dalle superfici e possono essere molto resistenti agli stress e all’azione di detergenti esanificanti.62

Conseguenze dello stress e dellanon coltivabilitào Microrganismi stressati a livello subletale potrebberonon essere in grado di crescere in terreni selettivifornendo falsi risultati negativi nei test microbiologici(uso di tecniche di recupero) pur essendo in grado ditornare vitali se le condizioni stressanti vengonorimosse o attenuateo Cellule che mostrano una risposta generalizzata allostress o un risposta adattiva in fase logaritmicapotrebbero superare gli stress imposti dallatecnologia di trasformazione, specialmente nei“minimally processed foods”, e deteriorare gli alimentio renderli pericolosi da un punto di vista igienico10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 6363

Quorum sensingo Il quorum sensing è la capacità che hannoalcuni microrganismi di regolare l’espressionegenica in funzione della densità cellulareo Il meccanismo è mediato dall’accumulo nelsubstrato di prodotti a basso peso molecolare• Gram-positivi: peptidi• Gram-negativi: AHL (N-acil-omoserina lattoni)10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 6464

Un prototipo diquorum sensing:regolazione dellabioluminescenza inVibrio fischeri10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 66A basse densità cellulari l’espressione dell’operone lux è debole e insufficiente per l’emissione dellabioluminescenza; con la crescita si accumula la molecola segnale, OHHL, N-3-(oxoesanoil)-Lomoserinalattone, che diffonde attraverso la membrana, si lega a luxR che a sua volta si lega sullasequenza bersaglio e stimola la trascrizione dell’operone, incluso il gene luxI che codifica per l’enzimache sintetizza OHHL, causando un’espressione esplosiva dei geni.Da Whitehead et al. 200166

Visualizzazione di colonie cheproducono AHL10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 67I substrati contengono mutanti di microrganismi che rispondono al quorum-sensing ma che sono statiprivati della capacità di produrre AHL autonomamente. In particolare, a destra, C. violaceum, cheproduce violaceina in risposta alla presenza di AHL67

Perché è importante il quorumsensing?o E’ implicato nell’espressione dellavirulenza di alcuni patogeni opportunisti(Pseudomomas aeruginosa, Serratiamarcescens)o Alcune vie metaboliche regolate da AHLsono importanti per il deterioramentodegli alimenti10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 68Sembra possibile svilupapre composti che blocchino la comunicazione mediata da AHL inibendo latrascrizione dei geni importanti per la virulenza o per il deterioramento degli alimenti: a causa dellabassissima concentrazione alla quale agiscono questi composti potrebbero essere usati per il controllonaturale della crescita microbica68

Stadi della formazione di un’endospora10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 69ATTENZIONE QUESTA FIGURA E’ TRATTA DA MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.J., PARKER, J.(2004) BROCK. BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI. VOLUME 1. CASA EDITRICE AMBROSIANA, EDE’ COPERTA DA COPYRIGHTAlcuni batteri sono in grado di produrre forme dormienti estremamente resistenti alle condizioni distress (in particolare all’essiccazione, alle alte temperature e alle radiazioni), che si formano all’internodella cellula madre in seguito ad un complesso fenomeno di differenziazione: le endospore. Il processodi formazione delle endospore richiede numerosi passaggi . Nello stadio VI si sviluppa la resistenza alcalore e agli agenti chimici. La resistenza delle endospore alle condizioni avverse è dovuta a:a. Forte disidratazioneb. Presenza di una parete spessac. Abbondanza nel core di piccole proteine solubili in ambiente acido (SASP) che legano fortemente ilDNA proteggendolo dall’effetto di radiazioni e da altri danni fisici e chimicid. Attività metabolica praticamente assente.Altri gruppi di microrganismi sono in grado di produrre forme dormienti più resistenti delle cellulevegetative (cisti prodotte da alcuni batteri, molti tipi di spore sessuali di funghi, clamidospore, sclerozi),in genere caratterizzate da pareti spesse e forte disidratazione. Nessuna è però resistente come leendospore batteriche.69

Resistenza termica di spore10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 7070

Cinetica di morte termica: curve disopravvivenza10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 71ATTENZIONE QUESTA FIGURA E’ TRATTA DA MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.J.,PARKER, J. (2004) BROCK. BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI. VOLUME 1. CASAEDITRICE AMBROSIANA, ED E’ COPERTA DA COPYRIGHTEffetto della temperatura sulla vitalità di un batterio mesofilo. Il tempo diriduzione decimale, D, è stato ottenuto per lo stesso batterio a tretemperature diverse. D è il tempo al quale solo il 10% della popolazioneoriginale rimane vitale dopo l’esposizione ad una data temperatura. I valori di Dmostrati nella figura sono:70°C = 3 min60°C = 12 min50°C = 42 min71

Relazione fra D e temperatura: curva dimorte termica10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 72ATTENZIONE QUESTA FIGURA E’ TRATTA DA MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.J.,PARKER, J. (2004) BROCK. BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI. VOLUME 1. CASAEDITRICE AMBROSIANA, ED E’ COPERTA DA COPYRIGHTLa relazione fra temperatura di trattamento e tasso di morte è mostrata per 2organismi, un mesofilo (a) e un termofilo (b). Z è l’incremento in temperaturanecessario a diminuire D di 10 volte..72

Variabilità della resistenza termica in unapopolazione di cellule vegetativeo Una cinetica di primoordine assume che tuttele cellule o sporeabbiano un’identicaresistenza termicao Nella realtà siosservano spessocurve non lineari, chepotrebbero esseredovute alla presenza diuna distribuzione diresistenza termica nellapopolazione10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 73Da van Boekel et al. (2002) IJFM 74:139-159Nella figura in altro rappresentazione schematica della funzione di densità di probabilità dei tempi diinattivazione termica in una popolazione. Nella figura in basso la curva di sopravvivenzacorrispondente.L’argomento sarà ripreso nella lezione sui trattamenti termici73

Rappresentazione schematica diun’autoclave10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 74ATTENZIONE QUESTA FIGURA E’ TRATTA DA MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.J.,PARKER, J. (2004) BROCK. BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI. VOLUME 1. CASAEDITRICE AMBROSIANA, ED E’ COPERTA DA COPYRIGHTFigure: 20-03aCaption:Use of the autoclave for sterilization. (a) The flow of steam through anautoclave.74

Rappresentazione della relazione fratempo e temperatura in un’autoclave10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 75ATTENZIONE QUESTA FIGURA E’ TRATTA DA MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.J.,PARKER, J. (2004) BROCK. BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI. VOLUME 1. CASAEDITRICE AMBROSIANA, ED E’ COPERTA DA COPYRIGHTFigure: 20-03bCaption:Use of the autoclave for sterilization. (b) A typical autoclave cycle. Shown isthe sterilization of a fairly bulky object. The temperature of the object risesmore slowly than the temperature of the autoclave.75

Relazione fra la dose di radiazioni (inGrays) e la sopravvivenza di microrganismi10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 76ATTENZIONE QUESTA FIGURA E’ TRATTA DA MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.J.,PARKER, J. (2004) BROCK. BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI. VOLUME 1. CASAEDITRICE AMBROSIANA, ED E’ COPERTA DA COPYRIGHTAnche la cinetica di morte per irraggiamento segue una cinetica semilogaritmica.76

Agenti antimicrobici10-03-2009 Mal1 - Lezione 2 77ATTENZIONE QUESTA FIGURA E’ TRATTA DA MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.J.,PARKER, J. (2004) BROCK. BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI. VOLUME 1. CASAEDITRICE AMBROSIANA, ED E’ COPERTA DA COPYRIGHTEffetto di agenti batteriostatici, battericidi e batterioliici sulla conta totale esulla conta vitale77

Lezione 2 - Università degli Studi della Basilicata

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