Dott.ssa Roberta Pacifici

Dott.ssa Roberta PacificiReparto Farmacodipendenza, Tossicodipendenza e DopingIstituto Superiore di Sanità

L’ANALISI DELLE SOSTANZED’ABUSO NELLE MATRICIBIOLOGICHETossicologiaClinicaTossicologiaForenseIstituto Superiore di Sanità – Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

Analisi finalizzate ate allaTOSSICOLOGIA CLINICADiagnosi, trattamento tossicodipendenti afferenti alle strutture pubbliche e privateTOSSICOLOGIA FORENSEAnalisi per scopi amministrativi o medico-legali:‣ Commissioni medico-legali: disabilità alla guida.‣ Prefettura: verifica trattamenti alternativi alle sanzioni previste dal DPR 309/1990.‣ Determinazione requisiti psicofisici per il rilascio del porto d’armi (GU 304/1991).‣ Forze d’ordine: accertamento stato ebbrezza o assunzione sostanze stupefacentinella guida (L. 214/2003 ART. 186-187).‣ Enti pubblici e/o privati: accertamenti sui lavoratori le cui mansioni comportanorischi per la sicurezza, l’incolumità e la salute di terzi (Provv.18/09/2008, G.U. n.236)).Istituto Superiore di Sanità – Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

OBIETTIVITOSSICOLOGIA CLINICAARRIVARE ALLA GIUSTA DIAGNOSI (INTOSSICAZIONE O NO,TOSSICODIPENDENZA O NO)TRATTARE IL PAZIENTE IN MANIERA CORRETTASALVARE IL PAZIENTEPREVENIRE LA RECIDIVATOSSICOLOGIA FORENSEFORNIRE ALLA MAGISTRATURA TUTTI GLI ELEMENTI PER UNGIUSTO GIUDIZIO

CONSEGUENZE DEGLI ERRORI ANALITICITOSSICOLOGIA CLINICA‣ DIAGNOSI SBAGLIATA‣ ERRATO INTERVENTO TERAPEUTICO (nessuno, sbagliato,troppo breve, troppo lungo, etc.)‣ UN CASO CLINICO PUO’ DIVENTARE UN CASO FORENSETOSSICOLOGIA FORENSE‣ CONSEGUENZE GIUDIZIARIE SIA PER LAUTORE DEL REATO SIAPER LA PARTE LESA‣ INDAGINI SUCCESSIVE FALSATE‣ RIPERCUSSIONI SUL RAPPORTO/AMBIENTE DI LAVORO

ANALISI DI SCREENINGTECNICHEIMMUNOCHIMICHEIstituto Superiore di Sanità – Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

METODI IMMUNOCHIMICISENSIBILITA’ E SPECIFICITA’sono o funzione dell’anticorpo utilizzato:POLICLONALEMONOCLONALEIstituto Superiore di Sanità – Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

CUT - OFFE’ un valore di riferimento espresso inconcentrazione, al di sopra del quale ilrisultato di un test analitico è giudicatopositivo e al di sotto del quale il test ègiudicato negativoIstituto Superiore di Sanità – Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

CRITERI DI SCELTA DEL CUT-OFFCRITERIO ANALITICOCUT-OFF = primo calibratore positivoCRITERIO AMMINISTRATIVOCUT-OFF > primo calibratore positivoIl valore scelto deve permettere la conferma cromatografica delrisultatoCUT-OFF uguale stessa regione, paese, UEPer evitare disparità di trattamento all’utente dovuta alle diversespecifiche della metodica.Istituto Superiore di Sanità – Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

Le positività alle analisi di screeningdevono essere sempre confermate

ANALISI DI CONFERMALe analisi di conferma servono a verificare chenon ci siano falsi positivi a causa della nonspecificità dei test iniziali identificare i singoli analitiDEVONO avere la sensibilità uguale o maggiore al valore sogliadeI test iniziali essere quantitative basarsi su principi fisici e chimici diversi da quelli deitest inizialiIstituto Superiore di Sanità – Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

ANALISI DI CONFERMATECNICHECROMATOGRAFICHEOG CGC/MSLC/MSIstituto Superiore di Sanità – Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

Matrici biologicheUrineCapelliSangueSaliva

FINALITÀ DIAGNOSTICA

PERCHE’ UTILIZZARE MATRICI NONCONVENZIONALI NELLE ANALISIFARMACOTOSSICOLOGICHE?• Per incrementare il tempo di determinazioneDopo somministrazione ed in funzione dellecaratteristiche farmacocinetiche una droga e/i suoimetaboliti possono essere rilevati in:Sangue hSudore hSaliva hUrina giorniCapelli mesi

FINALITÀ DIAGNOSTICHE“Attualità d’uso e sostanze illecite”Matrice biologicaSANGUE - SALIVA

LE GHIANDOLE SALIVARI1321. Ghiandola parotidea; 2. ghiandola sottolinguale;3. ghiandola sottomandibolare

COMPOSIZIONE DELLA SALIVAParametri Saliva PlasmaVolumeVelocità di produzione500-1500 ml/day0.6 (0.1-1.8) ml/minpH 6.7(5.6-7.9) 7.44.3% of bodyweightAcqua [%] 98 (97-99.5) 91.5 (90-93)Proteine totali [g/100 ml] 0.3 (0.15-0.64) 7.3 (6-8)Albumina [g/100 ml] 4.5 (4-5)Mucina [g/100 ml] 0.27 (0.08-0.6) 08 0 Aminoacidi [mg/100 ml] 0.1-40 0.98Elettroliti [mMol/l]Potassio 8-40 3.5-5.5Sodio 5-100 135-155Calcio 1.5-2 4.5-5.25.Fosfato 5.5-14 1.2-2.2Cloro 5-70 100-106Colesterolo [mg/100 ml] 7.5 (3-15) 150-300Sostanza secca [g/l] 6 (3.8) 80

ANALISI DELLE DROGHE NELLA SALIVAVANTAGGI: IL CAMPIONE DI SALIVA SI RACCOGLIE CON FACILITA’ IL MONITORAGGIO DELLA CONCENTRAZIONE DELLA DROGANELLA SALIVA E’ IMPORTANTE IN SPECIAL MODO NELLESITUAZIONI IN CUI E’ NECESSARIO OTTENERE IL CAMPIONEBIOLOGICO SENZA METTERE A DISAGIO IL PAZIENTE OMETTERLO A RISHIO DI INFEZIONE L’ATTIVITA’ FARMACOLOGICA DIPENDE DALLA FRAZIONELIBERA DEL FARMACO NEL PLASMA: QUESTA FRAZIONE E’NORMALMENTE ESCRETA DALLE GHIANDOLE SALIVARI NELLASALIVA

ANALISI DELLE DROGHE NELLA SALIVASVANTAGGI: VOLUME RACCOLTO LIMITATO, A MENO CHE NONSIA STIMOLATA LA SALIVAZIONE; LA CONTAMINAZIONE ORALE DIPENDE DALLAMODALITA’ DI ASSUNZIONE (FUMO, INGESTIONEORALE) LA MODALITA’ DI RACCOLTA DEL CAMPIONE PUO’INFLUENZARE LA CONCENTRAZIONE SALIVAREDELLA DROGA COME RISULTATO DI UNAVARIAZIONE DEL pH e DEL FLUSSO SALIVARE

Farmacocinetica dell’MDMA in salivasalivaplasmasalivaconc. (μ μg/L)50403020100MDA0 5 10 15 20 25Time (h)1086420conc. (μ μg/L)plasmaconc. (μg/L)▲saliva ■ plasma400025035002003000250015020001500100100050500000 5 10 15 20 25Time (h)(μg/L)conc.Curva delle concentrazioni plasmatiche e salivari diMDMA ed MDA in funzione del tempo (dose: 100 mgMDMA)

Rapporto S/P ed influenza del pH della salivaS/P rat tio3025201510500 5 10 15 20 25Time (h)Rapporto S/P nelle 24 h doposomministrazione di MDMAS/P ratio302010livary pHsal7.77.57.37.16.96.7*0 5 10 15 20 25Time (h)06.2 6.6 7.0 7.4 7.8salivary pHI cambi di pH salivare spieganoIl valore elevato dei rapportiProfilo del pH salivare nellecondizioni di trattamentoplaceboMDMA

Test On-site per la determinazione dell’MDMA nella salivaN o. of cases8765432100 1.5 4 6 10 24negative casespositive casesDrugwipe® sulla saliva raccolta direttamentesulla linguaA causa dell’elevato numerodi falsi positiviTime (h)f casesNo. o8765432100 1.5 4 6 10 24negative casespositive casesDrugwipe® su 2 μl di saliva applicatidirettamente sul test in laboratorioMiglioramento dei risultatiTime (h)

PROVENIENZA (%) DEI 18 LABORATORI CHEHANNO PARTECIPATO NEL 2008-2011ALL’ORAVEQ1134

Nell’ultimo esercizioo effettuato (febbraio 2011),sono stati inviati 3 campioni (S8, S9, S10) ai 18Laboratori partecipanti.S8 era un campione BIANCOS9 conteneva COCAINA (20 ng/ml), BENZOILECGONINA(15 ng/mg)S3 conteneva THC (15 ng/ml)

Risultati parziali di 10 LaboratoriS8 : campione BIANCO 1 FP a cocainaS9: COCAINA (20 ng/ml), 1 FN a benzoilecgoninarange di conc. dei lab. Partecipanti 6.0-73.0 ng/mlBENZOILECGONINA (15 ng/mg)g)range di conc. dei lab. Partecipanti 6.0-38.4 ng/mlS10: THC (15 ng/ml) 2 FP a cocainaS10: THC (15 ng/ml) 2 FP a cocainarange di conc. dei lab. Partecipanti 5.0-33.0 ng/ml

LE GHIANDOLE SUDORIPARE‣ Il sudore è costituitoessenzialmente da unasoluzione salina diluitacontenente diversesostanze organiche edinorganiche.‣La secrezione delleghiandole è stimolata dalcalore, dall’assunzioneassunzione dideterminate sostanze,da stimoli ormonali epsichici.

COMPOSIZIONE DEL SUDOREParametri Sudore PlasmaVolume Fino a 5 L 4.3% del peso corporeoVelocità di produzioneFino a 3 L/hpH 5.8 (fino a 6.7 dopo esercizio fisico) 7.4[%] 99 (98-99.5) 91.5(90-93)Albumina [g/100 ml] ++ 4.5(4-5)Gamma gloguline ++Elettroliti [mMol/l]Potassio 4.7 (2.5-9.3) 3.5-5.5Sodio 68 (30-110) 135-155Calcio + 4.5-5.2Fosfato + 1.2-2.22.2Cloro + 100-106Prodotti di scartoUrea, acido lattico

ANALISI DELLE DROGHE NEL SUDORE

VANTAGGI:ANALISI DELLE DROGHE NEL SUDORE• La raccolta del campione non è invasiva• L’analisi del sudore è in grado di fornire informazionisia sul consumo recente di droga, che una stima diesposizione nel corso di un periodo più lungo(settimane), a seconda del dispositivo utilizzato per laraccolta;• L’adulterazione del campione è piuttosto difficileSVANTAGGI:• Volume raccolto piuttosto limitato (da pochi µL inVolume raccolto piuttosto limitato (da pochi µL incondizioni normali fino a 1-5 mL quando il sudore vienestimolato dall’esercizio fisico);• Difficile fornire un risultato quantitativo a causa delfatto che il volume di sudore raccolto non è misurabile

MDMA E SUDORE600meanMDMA am mountng/patch50040030020010000 4 8 12 16 20 24Time (h)Concentrazione media in funzione del tempo di MDMA contenuta incerotti applicati sul dorso di 9 volontari e rimossi a differentiintervalli di tempo

Assorbimento di MDMA attraverso la cuteI volontari hanno mostrato unaVolunteer 5riduzione delle concentrazioni di300MDMA a 10 h. Il fenomenopotrebbe essere legato ad un200riassorbimento dell’MDMA100attraverso la pelle.0Uno studio pilota haconfermatoquesta ipotesing /p patchVl t 50 4 8 12 16 20 24Time(h)MDMA ng / patch24020016012080400VlA Vol.AVol.B 200-20-40-60-80-1000 4 8 12 16 20 24Time (h)% chang geAssorbimento attraverso la pelle di200 ng di MDMA aggiunto a cerottiapplicati sulla schiena di 2 volontari

PERFORMANCE DELLE METODOLOGIE ANALITICHEng MDMA/pa atch6005004003002001000Confronto delle curve cinetichedell’ MDMA in funzione delGC-MSIMMUNOASSAYtempo (immunochimico vsGC/MS)0 4 8 12 16 20 24Time (h)f casesNr o98765432100 1.5 4 6 10 24Time (h)negative casespositive casesPerformance del test on-siteDrugwipe® applicato per 10sec nelle ascelle di 9 volontari( somministrazione di 100 mgMDMA)

FINALITÀ DIAGNOSTICHE“Stato di assuntore cronico”Matrice biologicaURINA(prelievi seriati a sorpresa)

Tempi di permanenza delle sostanze nelle urinesostanza T. Min (ore) TM T. Max (giorni) (i i)Amfetamina 2-7 2-4Cannabinoidi 6-18 Consumatori occasionali: fino a 10 giorniConsumatori cronici: anche 30 giorniMetaboliti cocaina 1-4 2-4Metadone 2 2-6Metamfetamina 1-3 2-4MDMA (ecstasy) 1 2-3Oppiacei 2 2-3

FINALITÀ DIAGNOSTICHE“Comportamenti pregressi di abuso”Matrice biologicaCAPELLI

INCORPORAZIONE DI DROGHE NEI CAPELLI DURANTE LA CRESCITABULBO DEL PELO

CAPELLI:Correlazione crescita/assunzione, velocità dicrescita media = 1 cm/mese.È possibile fare una datazione del consumo.ALTRE FORMAZIONI PILIFERE:Crescono più lentamente dei capelli ed hannofase più lunga di quiescenza.Non è possibile fare una datazione del consumo

Matrici biologicheCapelliVANTAGGI:PRELIEVO NON INVASIVOPOSSIBILITA’ DI RILEVARE L’ASSUNZIONE DELLE SOSTANZE DOPO SETTIMANE O MESISVANTAGGI:DIFFICILE INTERPRETAZIONE DEL DATO ANALITICOINTERFERENZE: * USO DI PARTICOLARI DETERGENTI* TINTURE PER CAPELLINON ESISTONO PROCEDURE STANDARDIZZATE PER: * PRELIEVO DELLA MATRICE* ESTRAZIONE DELLA MATRICEIstituto Superiore di Sanità – Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’Proposta di linee guida per l’analisi difarmaci e sostanze d’abuso nei capelliSimona Pichini, Alessandro Palmeri, Manuela Pellegrini,Piergiorgio g Zuccaro e Roberta PacificiLaboratorio di Biochimica ClinicaISSN 1123-3117Rapporti ISTISAN99/24

PRINCIPALI FATTORI DI VARIABILITA’LEGATI ALLA NATURA DELLA MATRICECHERATINICA I meccanismi di incorporazione della droga dentro i capelli; La natura del legame della droga con la matrice cheratinica; Lo stato solido e la disomogeneità del capello; La velocità di crescita dei capelli; La pigmentazione dei capelli; Il trattamento cosmetico dei capelli; L’esposizione in vivo dei capelli a contaminazioni esterne.

EFFETTO DELLA PIGMENTAZIONE DEI CAPELLISULLA INCORPORAZIONE DELLA DROGACAPELLI BIANCHICAPELLI PIGMENTATIConc. Droga nei BIANCHIConc. Droga nei PIGMENTATI= M 0,700CI SONO GRANDI DIFFERENZE TRA SOGGETTI PER LA STESSASOSTANZA, MENTRE IL RAPPORTO E’ SIMILE PER DIFFERENTISOSTANZE NELLO STESSO SOGGETTODa: M. Rothe et al. Forensic Sci Int 1997

EFFETTO DEL TRATTAMENTO COSMETICO DEI CAPELLISULLE ANALISI DELLE DROGHEDECOLORAZIONETINTURAPERMANENTEI prodotti usati sono delle basi forti che possonoalterare/danneggiare la struttura tt del capelloIL RISULTATO PUÒ ESSERE:• perdita della droga incorporata nella matrice cheratinica (falso negativo)• più facile incorporazione della droga in condizioni di contaminazioneambientale (falso positivo)Istituto Superiore di Sanità – Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

PROCEDURE ANALITICHE PER LA DETERMINAZIONEDELLE SOSTANZE D’ABUSO NEI CAPELLIPrelievo dei capelliDecontaminazione i del campioneTrattamento meccanico del campioneDigestioneeEstrazioneAnalisiIstituto Superiore di Sanità – Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

SCELTA DELLE METODICHEIMMUNOCHIMICHEScelta del test immunochimico infunzione della specificità per lasostanza presente nella matricecheratinica.

SOSTANZE D’ABUSO E METABOLITI PRESENTI IN URINA E CAPELLISOSTANZA URINE CAPELLIEcstasy HMMA MDMAMDMAMDMACocaina BZE CocainaCocainaBZEEroinaM-glucuronide MAMMMHMetadone EDDP MetadoneEMDPEDDPMetadoneTHC TH-COOH THCTHCNicotina Cotinina NicotinaNicotinaCotinina

VALIDAZIONE DELLA METODICA IMMUNOCHIMICAPER L’ANALISI IN MATRICE CHERATINICA• Verifica della linearità della curva di taratura inmatrice cheratinica (effetto matrice);• Verifica della sensibilità (percentuale di veri positivi);• Verifica della specificità (percentuale di falsi positivi);• Costruzione curva ROC (relative operating curve).Istituto Superiore di Sanità – Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

ANALISI DI CONFERMAGC/MSLC/MSIstituto Superiore di Sanità – Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

PRESENTAZIONE DEI DATIIl risultato finale delle analisi va espresso in:μg g di xenobiotico / mg di capelliAccanto al risultato quantitativo andrà sempreespressa la lunghezza in cm del segmento analizzato ela sua distanza dalla base del cuoio capelluto.Istituto Superiore di Sanità – Reparto Farmacodipendenza Tossicodipendenza e Doping

PROVENIENZA (%) DEI 41 LABORATORICHE HANNO PARTECIPATO NEL 2002-2010 ALL’HAIRVEQ62%33%5%

FALSI POSITIVI E FALSI NEGATIVI: ANNI 2002-2010N°454035302520151050S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23 S24 S25 S26 S27ID CAMPIONEFALSI POSITIVIFALSI NEGATIVI

ISPOSTE% DI R35302520151050FALSI POSITIVI: CAMPIONI BIANCHIS3 S7 S10 S18 S21 S22 S24 S26ID CAMPIONE

Analisi dell’MDMA nei capelli (I)Buona correlazione tra laconcentrazione di droga nelsegmento prossimale (1 cm) e ledosi consumate nell’ultimo meseMDMA conc. ng/mg840Last month0 5 10 15Tablets/monthr 2 = 092 0.92r 2 = 0.45MDMA co onc. ng/mg840Last 6 months0 5 10 15Tablets/monthr 2 = 0.56r 2 = 0.16c. ng/mgMDMA conc840Last 12 months0 5 10 15Tablets/monthr 2 = 0.11r 2 = 0.04Concentrazione dell’MDMA in diversi sementi di capelli comeConcentrazione dell MDMA in diversi sementi di capelli comefunzione delle dosi mensili consumate

Analisi dell’MDMA nei capelli (II)Subject n.3MDMA co onc. ng/mg25 2.52.01.51.00.50.00.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5Tablets/monthMDMA nei diversi segmenti di capelli di un consumatore come funzionedelle dosi consumate mensilmente (riportate in una agenda)I problemi nel ricordare le dosi assunte nell’ultimoanno potrebbero spiegare la mancanza di correlazionetra concentrazioni i di MDMA nei segmenti distali e ledosi dichiarate

ACCERTAMENTO TOSSICOLOGICO- ANALITICO DI ΙΙ LIVELLOMATRICE CHERATINICAProvv. 18/09/2008Lunghezza : 5 cm (4-6 mesi)Peso : 200 mgModalità di prelievo : 2 aliquote (A e B)Alternativa ti : peli pubici i 200 mgCONCENTRAZIONE SOGLIA (CUT-OFF) NEI TEST SU MATRICE PILIFERAClasse di sostanzaOPPIACEI METABOLITI (morfina, codeina, 6-monoacetilmorfina)Concentrazione ng/mgCOCAINA E METABOLITI 0,20,05 (benzoilecgonina)CANNABINOIDI METABOLITI 0,1AMFETAMINA/METAMFETAMINA 0,2MDMA-MDA-MDEA 0,2METADONE 02 0,2BUPRENORFINA 0,050,2

CRITICITA’ANALISI DELLA MATRICE CHERATINICA NEGLI ACCERTAMENTIDI SECONDO LIVELLOG.U.235 08/10/08 … Deve essere premesso che l’analisi del previsto campionedi capelli (della lunghezza definita di 5 cm) fornisce indicazioni circal’esposizione cronica o ripetuta del soggetto a sostanze stupefacenti o psicotropein un periodo di circa 4, 6 mesi antecedentemente il prelievo.Al fine di dimostrare un uso cronico di droghe attraverso l’ analisi del capello ènecessaria UN’ANALISI SEGMENTALE DEL CAMPIONE (per esempio,capelli della lunghezza di 5 cm devono essere suddivisi in almeno tre frammentiche devono dare risultati analitici sovrapponibili).L’analisi di un unico segmento, anche se riferito a diversi mesi (come appunto 5o più centimetri), non da certezza di un uso ripetuto, ma può anche indicare unuso singolo di droghe o per un periodo di tempo molto limitato.Stramesi C Polla M Vignali C et al Forensic Sci Int 2008; 176: 34-7Stramesi C, Polla M, Vignali C, et al. Forensic Sci Int 2008; 176: 34-7Henderson L, Harkey MR, Zhou C, et al. J Anal Toxicol 1996; 20 :1-12

Per Partecipare Ai ProgrammiORALVEQ ed HAIRVEQContattare tt il Reparto Farmacodipendenza d Tossicodipenza e DopingDell’ Istituto Superiore di SanitàTel. 0649902634Fax. 0649902016E-mail: osservatorio.fad@iss.it