confronti multipli e contrasti tra medie - Scuola di Scienze Ambientali

Dall’ANOVA eseguita su tutti e 5 i gruppi risulta cheAnalisi varianza: ad un fattore Tutti i gruppiOrigine SS df MS F Signific. F critTra gruppi 1077,32 4 269,33 49,368024 6,7374E-16 2,578737In gruppi 245,5 45 5,4555556Totale 1322,82 49Si conclude che ci sono differenze significative dovute ai differenti terreni di coltura.Per eseguire confronti appaiati tra medie, prestabiliti a priori, dobbiamo individuare un valore dettoLSD (Least Significant Difference) e verificare se la differenza tra due medie superi (in valoreassoluto) o no questo valore. Questo valore critico è ottenuto utilizzando la seguente formula:t [v] *2MS withinnAttenzione: v è il numero di df associato alla MS within risultante dall'analisi di tutti i gruppi. Lo stesso dicasiper la MS within .medie= 70,1 59,3 58,2 64,1 582% Glucose 2% Fruct. 2% Sucr Glu+Fruc2 * 5.45LSD = t 0,05 [45] * control 10,8 11,9 6 12,1102% Gluc. - 1,1 4,8 1,3LSD = 2,014 * 1,04 = 2,10 2% Fruct. - 5,9 0,22% Sucr - 6,1Glu+Fruc -Dato che il valore delle minima differenza significativa è di 2,10, quando si osservano differenze tradue medie superiori a questo valore minimo possiamo dire che esse sono significative e quindiimputabili al trattamento utilizzato nella crescita dei piselli. Il fatto che l’ANOVA eseguita su tutti igruppi aveva come risultato il rigetto dell’ipotesi nulla risulta pertanto dovuto all’effettosignificativo che i tre zuccheri e la miscela dei due hanno sulla crescita dei piselli. Le rispettivemedie sono, infatti, risultate significativamente inferiori a quella del controllo. In particolare,glucosio, fruttosio e la loro miscela sono gli zuccheri che hanno prodotto, in uguale misura, cresciteinferiori, mentre il saccarosio ha un effetto meno limitante, ma sempre significativo rispetto alcontrollo.Quando si fanno esperimenti programmati è sempre consigliabile avere gruppi con ugualenumerosità. Quando ciò non sia possibile occorre modificare la formula per ottenere il valore delLSD 1 1t [v] *MSwithinn n 1 2 In questo caso però otteniamo un valore di LSD per ogni confronto a due a due.Contrasti pianificati (a priori )Supponiamo ora di aver deciso, a priori, di voler testare la differenza tra il controllo e tutti glizuccheri, quindi dei disaccaridi (saccarosio) contro monosaccaridi( glucosio, fruttosio e miscela deidue), dei due monosaccaridi contro la loro miscela ed, infine tra i due monosaccaridi.71

In questo caso dobbiamo ricorrere a dei confronti ortogonali (contrasti) i quali presentano duelimitazioni: 1) il numero dei confronti, k

control gluc frut suc mix4 -1 -1 -1 -1 control versus all sugar0 -1 1 0 0 monosac (glu) vs monosac (frut)0 1 -1 0 0 0control gluc frut suc mix0 -1 -1 3 -1 monosac versus disac0 -1 -1 0 2 monosac versus mix0 1 1 0 -2 0control gluc frut suc mix0 -1 -1 3 -1 monosac versus disac0 -1 1 0 0 monosac (glu) vs monosac (frut)0 1 -1 0 0 0control gluc frut suc mix0 -1 -1 0 2 monosac versus mix0 -1 1 0 0 monosac (glu) vs monosac (frut)0 1 -1 0 0 0In questo caso i confronti sono risultati essere ortogonali per cui, dopo aver verificato conl’ANOVA se esiste una differenza significativa tra le medie dei 5 gruppi possiamo procedere con iconfronti prestabiliti al fine di evidenziare quali sono i gruppi che hanno prodotto questa differenzasignificativaAnalisi varianza: ad un fattore Tutti i gruppiOrigine SS df MS F Signific. F 0.01(4, 45)Tra gruppi 1077,32 4 269,33 49,36802444 6,7374E-16 2,58In gruppi 245,5 45 5,4555556Totale 1322,82 49Si conclude che ci sono differenze significative dovute ai differenti terreni di coltura,Per i confronti pianificati si può procedere con una semplice ANOVA 1 tenendo presente chela MS within è quella che risulta dall'analisi di tutti i gruppi: 5,4555556ANALISI VARIANZA i) control versus all sugarOrigine SS df MS F Signific. F 0.01(1, 45)Tra gruppi 832,32 1 832,32 152,5637475 4,6798E-16 4,1In gruppi 245,5 45 5,4555556Totale 1077,82 46Si conclude che ci sono differenze altamente ( 0,001)significative dovute ai differenti terreni dicoltura.ANALISI VARIANZA ii) Disaccharides versus monosaccharidesOrigine dellavariazione SQ gdl MQ F Valore di significatività F 0.01(1, 45)Tra gruppi 235,2 1 235,2 43,11202 4,49728E-08 4,1In gruppi 245,5 45 5,455556Totale 480,7 46Si conclude che ci sono differenze altamente ( 0,001)significative tra l’effetto prodotto dal disaccaride equelli dei monosaccaridi.1 L’Anova è stata fatta utilizzando l’opzione Analisi dati (Analisi varianza: ad un fattore) di excel, ma il calcolo di F èstato fatto “manualmente” sostituendo l’appropriato valore di MS within. Esistono comunque software che eseguono inautomatico i vari contrasti. In questo caso dobbiamo solamente specificare i contrasti che ci interessano con i relativicoefficienti di comparazione lineare.73

ANALISI VARIANZAiii) Monosaccharides versus mixtureOrigine dellavariazione SQ gdl MQ F Valore di significatività F 0.01(1, 45)Tra gruppi 3,75 1 3,75 0,687373 0,411435717 4,1In gruppi 245,5 45 5,455556Totale 249,25 46Si conclude che non ci sono differenze significative tra l’effetto prodotto dai monosaccaridi e quello della loromiscela.ANALISI VARIANZA iv) Monosaccharide (glu) vs monosaccharide (frut)Origine dellaValore divariazione SQ gdl MQ F significatività F 0.01(1, 45)Tra gruppi 6,05 1 6,05 1,108961 0,297929729 4,1In gruppi 245,5 45 5,455556Totale 61,75 19Si conclude che non ci sono differenze significative dovute tra l’effetto prodotto dai due monosaccaridi.Avendo eseguito tutti i contrasti possibili (4) ed essendo soddisfatta la condizione di ortogonalitàrisulta che abbiamo eseguito anche una scomposizione delle variabilità tra gruppi totale per cui lasomma delle devianze (SQ) osservate nei quattro confronti deve essere a quella osservatanell’ANOVA di tutti i 5 gruppi (lo stesso dicasi per la somma dei gdl).SQ gdlcontrol versus all sugars 832,32 1monosaccharides versus disaccharides 235,2 1monosaccharides versus mixture 3,75 1monosaccharide (glu) vs monosaccharide (frut) 6,05 1All groups 1077,32 4Ovviamente, non era necessario eseguire tutti i confronti ortogonali possibili (4), ma potevamolimitarci anche ad alcuni di essi, ovvero a quelli che pensavamo essere di nostro interesse.Nel caso avessi voluto fare altri confronti come ad esempio i 3 zuccheri puri con la loro mistura,questo non sarebbe risultato ortogonale con i due monosaccaridi contro la loro misturaNon ortogonalecontrol gluc frut suc mix0 -1 -1 -1 3 pure sugar vs mixture0 -1 -1 0 2 monosac versus mix0 1 1 0 6 8In questo caso, ovvero in confronti non ortogonali occorre sviluppare altri metodi, ad esempio:Dunn-Sidak, Bonferroni o metodo sequenziale di Dunn-Sidak (vedi Sokal pag. 521)74

Confronti non pianificati (Post Hoc)Sono quelli che si eseguono dopo aver visto i risultati delle medie e dell'ANOVA.Per confronti appaiati in tutte le possibili combinazioni (spesso indicati come multiplecomparisons) si usano metodi simili a quello riportato per trovare LSD, detti MSD (MinimumSignificant Difference) che differiscono tra loro sostanzialmente per la distribuzione a cui fariferimento, ovvero la distribuzione di Q. In questo caso il valore relativo alla differenza tra duemedie che deve essere superato perché esse risultino statisticamente significative èMSD= Q(valore critico) * SE (standard error)Esiste una gran confusione di sigle dovuta al fatto che a volte si fa riferimento alla statisticautlizzata, per esempio MSR (Minimum Significant Range) che si basa su un valore critico di Qdetto studentized range, a volte invece si fa riferimento all'autore del metodo.Se i gruppi sono bilanciati i test più diffusi sono due: quello di Tukey (detto T- method o Tukey'sHonestly Significant Difference, abbreviato con Tukey HSD) e quello di Student-Newan-Keul(SNK). Entrambi si basano sulla distribuzione dello studentized range, ma differiscono per il fattoche il primo prevede un unico valore di Q, il secondo più valori di Q che dipendono dalla distanzadelle medie da confrontare, ovvero si devono ordinare le medie in ordine crescente e considerarel'intervallo che c'è tra le medie prese in considerazione. Un altro metodo, sempre per gruppibilanciati, è quello di Welsch.Se consideriamo i dati dell’esempio precedente (tabella 1) e se volessimo testare l'ipotesi chel'aggiunta di zuccheri produca un qualche effetto sulla crescita cellulare, ma al momento nonavessimo nessuna idea sul tipo di effetto prodotto dai differenti zuccheri, potremmo analizzarequesti dati con un test a posteriori.Student-Newan-Keul (SNK).Se consideriamo i dati della tabella iniziale e se volessimo testare l'ipotesi che l'aggiunta di zuccheriproduca un qualche effetto sulla crescita cellulare, ma al momento non avessimo nessuna idea sultipo di effetto prodotto dai differenti zuccheri, potremmo analizzare questi dati con un test aposteriori.Dall'ANOVA unifattoriale fatta su tutti i 5 (a) gruppi di n = 10 osservazioni e con MS within =5,455556 risulta che esiste una differenza significativa tra le medie dei 5 gruppi.Ordinando le medie in ordine crescente:1%Gluc.+ k = 2 k = 3 k = 4 k = 52%Fruct. 2%Fruct. 2%Gluc. 2%Sucr. Control58 58,2 59,3 64,1 70,1e utilizzando la formula:MS withinSNK= Q [k,v] * nDove è il livello di significatività (che può essere 0,05 o 0,01); k è la posizione che occupa unadata media ordinata in maniera crescente rispetto alla prima (più piccola) e v = n T - a = 45 (ovvero idf di Ms within ). Abbiamo pertanto 4 valori di Q 2 da utilizzare nella formula per il calcolo delminimum significant range (qui indicato con SNK)Q 0,05[2, 45] = 2,858 Q 0,05[3, 45] = 3,44 Q 0,05[4, 45] = 3,845 Q 0,05[5, 45] = 4,102SNK = 2,11 SNK = 2,54 SNK = 2,84 SNK = 3,03Risulta pertanto che il valore di minimum significant range che deve essere superato perché ladifferenza tra due medie contigue risulti significativa è di 2,11. mentre quelli tra due medie chedistano di 3, 4 e 5 posizioni rispettivamente sono 2,54; 2,84; 3,03.2 I valori di Q sono valori tabulati75

1 a 2 a 3 a 4 a 5 a1%Gluc.+2%Fruct. 2%Fruct. 2%Gluc. 2%Sucr. Control1%Gluc.+2%Fruct. 0,2 1,3 6,1 12,1 SKN2%Fruct. 2,11 1,1 5,9 11,92%Gluc. 2,54 2,11 4,8 10,82%Sucr. 2,84 2,54 2,11 6Control 3,03 2,84 2,54 2,11differenza tra mediePossiamo quindi concludere che tutti gli zuccheri producono un effetto significativo rispetto alcontrollo. Il massimo effetto risulta essere prodotto, in ugual misura, dai due monosaccaridi e dallaloro miscela, mentre un effetto minore, ma pur sempre significativo rispetto al controllo è prodottodal disaccaride (saccarosio).Se avessimo usato il Tukey HSD test avremmo avuto un unico valore tabulare di Q [a,v], dove a èil numero di gruppi. Per un il livello di significatività di 0,05, questo valore è 4,025, per cui ilvalore critico con cui confrontare le differenze tra le varie medie è:MSD (Tukey) = 4,025 * 0,738617327 = 2,97In questo caso le conclusioni sarebbero risultate identiche a quelle ottenute con il precedentemetodo.Se i gruppi sono sbilanciati esistono altri metodi:-T'-method (detto anche Tuckey's-B) che usa,come valore critico Q, lo studentized augmentedrange;- GT2-method (conosciuto anche con il nome del suo ideatore Hochberg, che utilizza lostudentized maximum modulus;-Tukey-Kramer,che utilizza lo studentized range ma nel calcolare SE (standard error) considerail valore medio di n.Secondo Dunnett i primi due metodi sarebbero troppo conservativi, mentre l'ultimo, sempreconservativo, ma forse rispecchia di più il livello di significatività di alfa. Nel dubbio fare tutti i tested eventualmente considerare quello che da i valori più bassi di MSD.Contrasti non pianificatiE' possibile anche analizzare dei contrasti non pianificati a priori senza limitazioni di numero,ovvero k> a*(a -1) / 2, che coinvolgono sempre due set .Il metodo di Scheffe è il più potente quando i gruppi (a) e le osservazioni (n) bilanciate di ognigruppo sono poche, e quando molti dei coefficienti lineari sono diversi da 0.Diversamente, e con gruppi solo leggermente sbilanciati, il T-method è il migliore, mentre congruppisbilanciati (un forte sbilanciamento è comunque altamente sconsigliato) si usa il GT2-method.In alcuni casi si potrebbe voler analizzare contrasti tra più di due set (ovvero raggruppamenti digruppi). Un caso potrebbe essere quello del nostro esempio dove, a posteriori, si nota che ilcontrollo differisce dal saccarosio e questi a loro volta differiscono dagli altri tre zuccheri cheformano un set omogeneo. In questo caso si potrebbero analizzare contemporaneamente tre set. Unmetodo per testare "tutti i possibili set" (ovvero tutte le possibili coppie di medie, e tutti i possibili76

contrasti tra gruppi di medie) è quello proposto da Gabriel con il nome di sum of squaressimultaneous test procedure, abbreviato con SS-STP.Per una trattazione di questi test si rimanda a test specialistici (vedi Sokal pag. 240), anche perché illoro svolgimento richiede dei software statistici appropriati.RiassuntoNel ANOVA tipo I siamo spesso interessati, nel caso i fattori fissi abbiano più di due livelli, avedere quali sono i livelli che differiscono* In case of planned (or a priori) comparisons and equal sample sizes, LSD method is used. In caseof unplanned (or Post-Hoc or multiple) comparisons there are the hereafter listed MSD methods,also named MSR when the critical value Q (called studentized range) is used. For equal sizesamples there is another MSR method called Student-Newman-keul (SNK).77