Principio di funzionamento dei test cromatografici di ... - Ce.Do.S.T.Ar.

Tecniche combinateLa La cromatografia cromatografia èè una unatecnica tecnica di di separazioneViene Viene accoppiata accoppiata con con una unatecnica tecnica di di rivelazione(spettrofotometrica (spettrofotometrica o spettrometrica spettrometrica MS) MS)Aumento Aumento del delpotere informativo informativo di di tecniche tecniche combinate combinate

Tecniche combinateTutte le Linee Guida più recenti,oltre che vari testi di Leggestabiliscono oggi chela cromatografia deve essere abbinataalla tecnica di rivelazione MS.Perchè la tecnica di rivelazione MS è la migliore?

Principi della cromatografiaCromatografia Cromatografia su su colonna colonnaUnaUnamiscelamiscelavienevieneseparataseparataininbasebaseall'affinitàall'affinitàdeideidiversidiversicomponenticomponentiversoversounaunafasefasestazionariastazionariaimmobilizzataimmobilizzataininunaunacolonnacolonnaededunaunafasefasemobilemobilechechefluiscefluisceinincontinuocontinuoattraversoattraversodidiessaessaInInquestoquestoesempio:esempio:ililcomponentecomponenteazzurroazzurrohahamaggioremaggioreaffinitàaffinitàperperlalafasefasemobilemobileeequindiquindiesceesceperperprimoprimodalladallacolonna,colonna,quelloquellogiallogiallohahamaggioremaggioreaffinitàaffinitàperperlalafasefasestazionariastazionariaededesceesceperperultimo,ultimo,quelloquellorossorossohahacomportamentocomportamentointermediointermedio

Principali tipi di cromatografiaFase stazionariasolida (separazione per adsorbimento)liquida (separazione per ripartizione)Fase mobilegassosa (Gas-cromatografia)liquida (Cromatografia Liquida)LC o HPLC(High Performance Liquid Chromatography)

CromatogrammaAÈÈunungraficograficochecheriportariportasull'assesull'assedelledelleXXililtempotemponecessarionecessarioadaduscireusciredalladallacolonnacolonna(tempo(tempodidiritenzione)ritenzione)eesull'assesull'assedelledelleYYunaunagrandezzagrandezzafisicafisicaAcaratteristicacaratteristicadelladellasostanzasostanzaeemisuratamisuratadadaununopportunoopportunorivelatorerivelatoret R

CromatografiaNellaNellacolonnacolonnacromatograficacromatograficaavvieneavvienelalaseparazioneseparazionedeideicomposticompostididiinteresseinteresse(t(t R).R).LaLagrandezzagrandezzaAAdipendedipendedaldaltipotipodidirivelatorerivelatore(detector)(detector)

Il problema dei RIVELATORI........Il Il rivelatore UV-VISVISAA==ASSORBANZAASSORBANZAconconunounospettrofotometrospettrofotometroadadunaunaopportunaopportunaλλdotatodotatodidicellacellaaaflussoflussoeecollegatocollegatoall'uscitaall'uscitadelladellacolonnacolonnacromatograficacromatograficasisievidenziaevidenzial'uscital'uscitadidiunaunasostanzasostanzaperò.....però.....sostanzesostanzediversediversechechecoeluisconocoeluisconopossonopossonoassorbireassorbireallaallastessastessaλλIl Il rivelatore rivelatore UV-VIS UV-VIS èè poco poco specifico specificoperchè perchèil il riconoscimento riconoscimento avviene avviene su su una una singola singola λλ(oltre(oltrechechesulsult R t)R)

Rivelatore fluorimetricoLaLafluorescenzafluorescenzaèèililfenomenofenomenoperpercuicuialcunealcunemolecolemolecolesonosonocapacicapacididiassorbireassorbireunaunacertacertaλλ(λ(λeccitazione)eccitazione)eeriemettereriemettereadadunaunaλλmaggioremaggiore(λ(λemissione)emissione)IlIlrivelatorerivelatorefluorimetricofluorimetricoèèpiù piùspecificospecificodidiquelloquelloUV-VISUV-VISperchèperchèililriconoscimentoriconoscimentoavvieneavvienesusu2 2diverse diverseλλ(oltre(oltrechechesulsult R t)R)mamanonnonèèancoraancorasufficientesufficienteperperunaunaattribuzioneattribuzionesicura......sicura......

Rivelatori in 3D.....Il grande passo avanti è avere unrivelatore capace di fare unoSCAN completodella molecola in uscitadalla colonnain modo da non “confonderla”più con altreLoSPETTRO DELLA SOSTANZAaggiunge al cromatogrammauna vera e propria3° dimensione

Rivelatore a FOTODIODIDiode Array Detector (DAD)REMEDi BIORADInInquestoquestocasocasoilildetectordetectoresegueesegueunounoSPETTRO SPETTROUVUVdelladellasostanzasostanzaininuscitauscitadalladallacolonnacolonna

Cromatogramma ottenuto con rivelatore DADOgniOgnisostanzasostanzavienevienericonosciutariconosciutaininbasebaseaa22t R trelativiRrelativiaa22ISISededininbasebasealalsuosuospettro spettroUV UVfra fra205 205e e300 300nm.nm.perperconfrontoconfrontoconconlolospettrospettroteoricoteoricocontenutocontenutonellanella“biblioteca“biblioteca”biblioteca”fornitafornitadaldalsoftwaresoftware?mamaililsoftwaresoftwarenonnonriconoscericonoscelolospettrospettroUVUVdidi22sostanzesostanzechechecoeluiscono......coeluiscono......(qui(quiperperesempioesempiocatinonecatinoneeecatina)catina)

Rivelatore a spettrometria di massaMSLaLamolecolamolecolaininuscitauscitadalladallacolonnacolonnacromatograficacromatograficavienevieneionizzataionizzataee(spesso)(spesso)frammentataframmentataL'analisiL'analisididimassamassadelladellamolecolamolecolasolo soloionizzata ionizzatadàdàinformazioniinformazioniunivocheunivochesulsulsuosuoPESO PESOMOLECOLARE MOLECOLARE(formula(formulabruta)bruta)L'analisiL'analisididimassamassadeideiframmenti frammentidàdàinformazioniinformazioniunivocheunivochesullasullaSTRUTTURA STRUTTURACHIMICACHIMICApoichépoichéogniognimolecolamolecolasisiframmentaframmentaininmodomodocaratteristicocaratteristiconeineisuoisuoilegamilegamipiùpiùdebolideboli

Rivelatore a spettrometria di massaMSAldo PolettiniIlIlrivelatorerivelatoreMS,MS,applicatoapplicatoallaallaGCGCooallaallaLCLCdàdàinformazioniinformazioniililpiùpiùdelledellevoltevolteDEFINITIVEDEFINITIVEsull'identitàsull'identitàdidiunaunamolecolamolecola

Rivelatore a spettrometria di massaGC-MS e LC-MSIl rivelatore MS è il “gold standard”Inizialmente è stato utilizzato come rivelatoredi Gas-cromatografia (GC-MS)In GC le molecole “viaggiano” nella colonnaed escono da questain fase vapore. Questo rende più facile la ionizzazione cheavviene ad alto vuoto.L'interfacciamento con la cromatografia liquida(HPLC o LC)è più recente (LC-MS)

GC-MSRichiesta e accettata come tecnica di conferma per droghed'abuso per la sua alta specificitàPresente nelle Linee Guida di Istituzioni e Società Scientifichedi tutto il mondo non solo di Tossicologia Forense ma ormaianche di Tossicologia Clinica

GC-MSDa Da ogni ogni picco picco gas-cromatografico (GC) (GC)uno uno spettro MS MSPotere Potere informativoMS MS >> >> RIVELATORI CONVENZIONALI

GC-MSIonizzazione elettronicaLaLaionizzazioneionizzazioneavvieneavvieneperperbombardamentobombardamentodelladellamolecolamolecolaMconconelettroni elettroniee -ad -adalta altaE E(70eV)(70eV)LaLamolecolamolecolaprimaprimasisiionizzaionizzapoipoisisiframmentaframmenta

GC-MSIonizzazione elettronica●Tipi di ioni– Molecolari– Frammenti– Di trasposizione– Metastabili– Negativi– A carica multiplaInInGC-MSGC-MSsisiottengonoottengonopochipochiioniioniaacaricacaricamultiplamultipla

GC-MS/MSLa Ionizzazione Elettronicaè una tecnica di ionizzazione “ hard ”perchè ad alta Energia(provoca estesa frammentazione nella maggior partedelle molecole).Lo step di frammentazione può essere comunqueripetuto per ottenere “frammenti di frammenti”MS/MS o MS TANDEMIn teoria si può concepire un esperimento di MS n.

GC-MSSpettro MSGliGliioniionisonosonoseparatiseparatiininbasebasealalrapporto rapportom/z.m/z.SiSiritrovaritrovaloloioneionenonnonframmentatoframmentato(IONE (IONEMOLECOLARE)MOLECOLARE)edediiframmentiframmenticaratteristicicaratteristicidelladellamolecolamolecolaconconvalorevaloredidim/zm/zinferioreinferiore

GC-MSRicerca in “libreria”AldoPolettiniNelNelcasocasodidimolecolemolecolecomplesse,complesse,l'attribuzionel'attribuzionedelladellastrutturastrutturaèèpossibilepossibiledaldalconfrontoconfrontoconconBIBLIOTECHE BIBLIOTECHEDI DISPETTRI SPETTRIMSMSforniteforniteconconililsoftwaresoftwaredellodellostrumento.strumento.PoichéPoichéininGCGCsisiusausasempresempreEIEIaa7070eV,eV,gliglispettrispettriottenutiottenuticonconqualunquequalunquestrumentostrumentosonosonougualiuguali(FINGERPRINT(FINGERPRINTdelladellamolecola)molecola)eeperfettamenteperfettamenteconfrontabiliconfrontabilifrafraloroloroeeconconlalabibliotecabiblioteca

GC-MSUn esempio.....●●●●●●CONFERMA DI OPPIACEIMatrice: siero,urine, sangue intero, matrici nonconvenzionali....I glucuronidi non si possono vedere in GC-MSSenza idrolisi si vedono codeina e morfina libereCon idrolisi enzimatica o chimica si vedonocodeina e morfina totaliEstrazione dalla matrice biologica (LLE oSPE)

GC-MSUn esempio.....●ESTRAZIONE LIQUIDO-LIQUIDO● Urine, sangue o plasma diluiti con tampone a pH 8-9●Sistemi solventi:– diclorometano/metanolo 9:1– diclorometano/isobutanolo 9:1– etilacetato/cloroformio/esano 7:2:1

GC-MSUn esempio.....●ESTRAZIONE SOLIDO-LIQUIDO● Fase solida: reversed phase C2, C8,C18● Fase solida: mixed modeFasiFasicopolimerichecopolimericheconconmeccanismomeccanismoidrofobicoidrofobicoeedidiscambioscambioionicoionico

GC-MSUn esempio.....●Fase organica da LLE o eluato da SPE– portato a secco– derivatizzato per rendere gli analiti più volatiliAdatti Adatti alla alla gas-cromatografia

Uno step indispensabile in GC-MSLa derivatizzazione dei gruppi polariRicordiamoRicordiamochecheininGCGClelemolecolemolecole“viaggiano”“viaggiano”ininfasefasedidivapore.vapore.IIgruppigruppipolari polaricomecome-OH-OHrendonorendonolelesostanzesostanzealto-bollentialto-bollenti.bollenti.PerPervaporizzarevaporizzarelelemolecolemolecolepolaripolarioccorreoccorreununriscaldamentoriscaldamentospintospintochechepuòpuòprovocarneprovocarnelaladecomposizionedecomposizionetermica.termica.La Laderivatizzazione derivatizzazione“maschera“maschera”maschera” i igruppi gruppipolaripolarirendendo rendendole lemolecole molecolepiù piùvolatilivolatili

GC-MSIl processo completo●●●●●●●Campione biologicoAggiunta di Standard Interno (analogo o deuterato)Idrolisi enzimatica (β-glucuronidasi 65°C. 2h.)Purificazione SPE O LLEDerivatizzazioneAnalisiInterpretazione dei risultati

GC-MSIl risultato

GC-MSIl risultato

HS-GCGC-MSIl metodo di elezione per la conferma dell'etanolo nei liquidibiologici è la Gas-Cromatografia in Spazio di Testa (HeadSpace GC).Se si ricercano sostanze volatili(etanolo)disciolte in una matrice meno volatile(sangue, urina)conviene iniettare in colonnanon la fase liquida(che dovrebbe essere lungamentepretrattata)ma il vapore in equilibrio con il liquidomantenuto in vial termostatata.Lo Spazio di Testa è dunque un sistema di iniezionesistema di iniezionee può essere abbinato a un detector MS o convenzionale

LC-MSEvitare Evitare la la derivatizzazione dei dei composti composti polari polari ...... ......●●La LC-MS consente di separare e caratterizzare un numerodi composti molto più elevato della GC-MSFornisce informazioni su Peso Molecolare e struttura deicomposti separati in LC

LC-MSIl problema dell'interfacciaLaLaLCLClavoralavoraadadalta altapressionepressione(High(HighPressurePressureLiquidLiquidChromatography)Chromatography)IlIlrivelatorerivelatoreMSMSlavoralavoraadadalto altovuotovuotoComeComepuòpuòavvenireavvenirelalaionizzazioneionizzazionedi diuna unafase fasecondensata?condensata?Aldo Polettini

LC-MSIonizzazione a pressione atmosfericaNelle interfaccia API (Atmospheric Pressure Ionization) laionizzazione avviene per elettronebulizzazione: gli ioni si formanoda soluzioni che vengono finemente nebulizzate attraverso uncapillare tenuto ad alto potenziale.Le più usate sono:Electrospray (ESI)Ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI)Fotoionizzazione a pressione atmosferica (APPI)

LC-MSIonizzazione a pressione atmosfericaAmbitiAmbitididiapplicazioneapplicazionedidiGC-MSGC-MSededLC-MSLC-MSininfunzionefunzionedelladellapolaritàpolarità(asse(assex)x)eedeldelpesopesomolecolaremolecolare(asse(assey)y)delledellesostanzesostanzericercatericercateAldo Polettini

LC-MSIonizzazione a pressione atmosferica

LC-MSIonizzazione elettrosprayESI●La produzione di ioni gassosi attraverso electrospray passaattraverso 3 stadi● 1 - Produzione di goccioline cariche nella regione vicinaall'uscita del capillare ES● 2 - Rapida diminuzione delle dimensioni delle gocciolinecariche per evaporazione del solvente e conseguenteaumento della repulsione elettrostatica● 3 - “scoppio” delle goccioline con produzione di ioni in fasegas

LC-MSESIUnUngasgasriscaldatoriscaldato(N(N 2)2)facilitafacilital'evaporazionel'evaporazionedeldelsolventesolventeeel'ingressol'ingressodeglidegliioniioninelnelcapillarecapillarechecheintroduceintroducenell'analizzatorenell'analizzatore

LC-MSEffetto matriceL'effetto di soppressione del segnale dovuto alla matrice èconseguenza della competizione fra l'analita ed i componentidella matrice per il raggiungimento della superfice dellegoccioline cariche per l'emissione degli ioni in fase gas.

LC-MSNell'analisi Nell'analisi quantitativa quantitativa èè preferibile preferibile disporre disporre di diSTANDARD STANDARD INTERNI INTERNI DEUTERATIDEUTERATIper per correggere correggere gli gli effetti effetti matrice. matrice.Uno Uno standard standard interno interno deuterato, deuterato,aggiunto aggiunto alla alla miscela miscela in in concentrazione concentrazione nota, nota,si si comporta comporta nella nella sorgente sorgenteesattamente esattamente come come la la sostanza sostanza incognita incognita e e si si distingue distingue da da essa essaper per un un rapporto rapporto m/z m/z più piùalto(+1 (+1 se se monodeuterato, monodeuterato, +2 +2 se se bideuterato bideuterato ecc.) ecc.)

LC-MSESIFormazione di ioni multicaricaLa ESI può dislocare sulla molecola un numero di caricheanche molto elevato.La spettrometria di massa misura il rapporto m/z degli ioni.Uno ione di massa 5000 uma con 5 cariche viene rivelato am/z = 1000.Ciò permette di estendere il range di massa degli analizzatori.

LC-MSESI●Spettri di massa che danno informazioni sul pesomolecolare– Elevata sensibilità– Adatta per analiti volatili ma anche polari o ionici– Permette l'analisi di molecole ad alto peso molecolaretramite la formazione di ioni multicaricama..... ma.....limitato limitato l'uso l'uso di di tamponi tamponi non non volatili volatiliionizzazione inibita inibita da da tamponi tamponi fortemente salini salinicondizioni condizioni analitiche analitiche variabili variabili (biblioteche non non confrontabili)e soprattutto....limitate limitate le le frammentazioni

LC-MS/MSLa ESI è una tecnica di ionizzazione “soft”(provoca scarsa frammentazione).Per avere informazioni strutturaliè necessario attivarela frammentazione dello ione molecolaretramite un secondo step (MS/MS)

LC-MS/MSTRIPLO QUADRUPOLO33quadrupoliquadrupolicollegaticollegatiQ1,Q2,Q3Q1,Q2,Q3IlIlquadrupolo,quadrupolo,opportunamenteopportunamenteattraversatoattraversatodadacorrentecorrentecontinuacontinuaeeradiofrequenzaradiofrequenzacreacreaununcampocampoelettricoelettricostaticostaticoededalternatoalternatoiningradogradodidiaccelerareacceleraregligliioniionieedidisepararlisepararliininbasebasealalrapportorapportom/zm/z

LC-MS/MSTRIPLO QUADRUPOLOIlIlprimoprimoquadrupoloquadrupoloselezionaselezionaunounooopiùpiùioni ioniprecursori,precursori,ililsecondosecondofunzionafunzionadadacellacelladidicollisione,collisione,ililterzoterzoselezionaselezionaunounooopiùpiùioni ioniprodottoprodotto

Full Scan-MS/MSSe si analizzano tutti i precursori(variando il primo quadrupolo)e tutti i relativi prodotti(variando il terzo quadrupolo),si ottiene uno spettro “full scan”.Questo è utile nelloSCREENING TOSSICOLOGICO

Deconvoluzione degli spettriI software sono in grado di elaborare spettri complessi,provenienti anche da molecole che coeluisconofacendo la deconvoluzione degli spettri.Trova gli ioni le cui abbondanze individuali crescono ediminuiscono in modo sincrono all'uscita dalla colonna(indicando che essi provengono dalla stessa molecola)Questi ioni vengono raggruppati per produrre unospettro ricostruitoper ciascun composto.Lo spettro ricostruito viene confrontato con quellidella biblioteca

Deconvoluzione degli spettriIn questo esempio, l'algoritmo di deconvoluzioneè stato in grado di riconoscerela cocaina in una zone molto “affollata”del cromatogramma

Screening cromatografico?La possibilità di “risolvere” spettri sovrapposti(molecole che coeluiscono)ha avuto applicazioni nello screening tossicologico.Si è proposto addirittura di applicare il rivelatore MS ad unaLC ultra fast(corsa cromatografica 1-3 min.)evitando lo screening immunochimico.

LC-MS/MSPer la conferma (si sa cosa cercare) sono più utiliconfigurazioni più selettive del Full Scan

LC-MS/MSQ1Q1variabile:variabile:tantitantiioniioniprecursoriprecursoriQ2Q2solosoloRf:Rf:nonnonselezionaselezionam/zm/zmamafunzionafunzionasolosolodadacellacelladidicollisionecollisioneQ3Q3statico:statico:ununsolosoloioneioneprodottoprodotto

LC-MS/MSQ1Q1statico:statico:ununsolosoloioneioneprecursoreprecursoreQ2Q2solosoloRf:Rf:nonnonselezionaselezionam/zm/zmamafunzionafunzionasolosolodadacellacelladidicollisionecollisioneQ3Q3variabile:variabile:tantitantiioniioniprodottoprodottodall'unicodall'unicoioneioneprecursoreprecursore

LC-MS/MSQ1Q1eeQ3Q3variabilivariabilisincronicamentesincronicamenteconcon∆m∆mcostantecostanteQ2Q2solosoloRf:Rf:nonnonselezionaselezionam/zm/zmamafunzionafunzionasolosolodadacellacelladidicollisionecollisione∆m=∆m=m 1-m1-m 2(esempio 2(esempio∆m=45∆m=45perditaperditadidiCHCH 2NH2NH 2CH2CH 3per3perevidenziareevidenziareAMPAMPededMDA)MDA)

LC-MS/MSQ1 statico: un solo ione precursoreQ2 solo Rf: non seleziona m/z ma funziona solo da cella di collisioneQ3 statico: un solo ione prodotto dall'unico ione precursoreÈ IL METODO PIÙ SPECIFICO: OGNI MOLECOLA VIENE IDENTIFICATAIN BASE AD UNA SPECIFICA TRANSIZIONE DI MASSA

LC-MS/MSLeLetransizionitransizioni“caratterizzanti”.....“caratterizzanti”.....

CONCLUSIONI●●●●●La tecnica LC-MS/MS ha una sensibilità e specificità adeguata allaconferma di droghe nei campioni biologiciRispetto alla GC-MS ha un più ampio range di utilizzoSi possono analizzare sostanze polari senza derivatizzazioneLa parte preparativa è più semplice e veloce che nella GC-MSPer questo c'è un crescente interesse da parte dei Laboratori diTossicologia Clinica verso questa tecnica e le Ditte produttrici sistanno dotando di biblioteche di spettri sempre più estese