CHIMICA BIOLOGICA - Corso di Laurea in Biologia - Università ...

1CHIMICABIOLOGICAESPERIENZE DI LABORATORIOLaboratorio di Chimica BiologicaCorso di Studio in Scienze Biologiche (Laurea triennale)Facoltà di Scienze MFN – Università degli Studi di GenovaAnno Accademico 2006-2007Sperimentazione e redazione a cura di:Prof. Alessandro MorelliProf.ssa Isabella PanfoliDott.ssa Silvia RaveraDott.ssa. Daniela Calzia

2INTRODUZIONEIn questo laboratorio lo studente potrà eseguire alcuni semplici esperimenti:• Determinazione dello spettro d’assorbimento del coenzima piridinico NADH (forma ridotta) e NAD +(forma ossidata).• Misura dell’attività enzimatica a substrato soprasaturante dell’enzima Glucosio-6-fosfato deidrogenasi(Glucose-6-phosphate: NADP oxidoreductase; G6PD; 1.1.1.49), presente nel lievito (Saccharomycescerevisiae).• Determinazione del flusso glicolitico (consumo di glucosio e formazione di etanolo) nel lievitoSaccharomyces cerevisiae.• Determinazione della costante di Michaelis-Menten (per il substrato glucosio-6.fosfato) dell’enzimaGlucosio-6-P deidrogenasi, utilizzando il metodo di linearizzazione grafica di Lineweaver-Burk.• Analisi qualitativa e quantitativa, con tecniche cromatografiche ed enzimatiche, di un campionecontenente concentrazioni incognite di ATP, ADP ed AMP.Il metabolismo cellulare ha caratteristiche universali. Per esempio la glicolisi anaerobica, che è possibileosservare nel materiale biologico consegnato allo studente, avviene praticamente in tutte le specie.L’esperienze di questo laboratorio vengono condotte con cellule di lievito (le stesse usate per scopialimentari, dal corredo genetico triploide) che presentano un accentuato metabolismo anaerobico. Sonoinoltre cellule particolarmente semplici, pur essendo eucariote a tutti gli effetti (sono infatti dotate di nucleo,di reticolo endoplasmatico, di mitocondri).Lo studente potrà verificare che:1) il glucosio assunto è generalmente degradato in percentuale elevata ad etanolo ed anidride carbonica,grazie alla glicolisi anaerobica;2) il glucosio può anche essere metabolizzato in forma aerobica (glicolisi + ciclo di Krebs- associato allafosforilazione ossidativa), ma questo avviene in misura ridotta nel tipo di lievito da noi utilizzato.L’osservazione e la misura del flusso metabolico della glicolisi anaerobica non rappresenta, ovviamente,l’unica finalità di questo laboratorio. Lo studente è chiamato a prendere confidenza con manipolazionibiochimiche semplici per realizzare alcune esperienze analitiche di tipo qualitativo e quantitativo,nell’ambito delle microquantità dei composti analizzati, utilizzando anche enzimi purificati, reperibili incommercio, per l’esecuzione di reazioni in vitro.Strumentazione Le osservazioni biochimiche richiedono spesso l’utilizzo dello spettrofotometro. Qui ne vengonorichiamati i principali aspetti applicativi.Questo strumento può essere più o meno complesso, ma essenzialmente è costituito da: una sorgente di luce(lampada), che nel nostro caso emette luce nel visibile e nell’ultravioletto (UV), un filtro, una cuvetta, e unrivelatore fotosensibile per analizzare la luce trasmessa (assorbanza).La legge fisica che governa l’assorbimento della “luce”, è quella di Lambert-Beer, ed è espressa con laseguente equazione:ove:A =A = ε λ M × M × s ( Legge di Lambert-Beer)assorbanza, o densità ottica (OD); indica la quantità di luce assorbita dal campione ad unaparticolare lunghezza d’onda. Durante questo corso si utilizzeranno coenzimi piridinici, chepresentano nella forma ridotta un incremento massimo a 340 nm. Tali coenzimi sono largamenteutilizzati nelle determinazioni biochimiche quantitative.

1°GiornoDETERMINAZIONE DELLO SPETTRO D’ASSORBIMENTO DELCOENZIMA PIRIDINICO NADH (forma ridotta) NAD + (forma ossidata).Questo ciclo di esperienze prevede un ampio impiego dei coenzimi piridinici (NAD + e NADP + ), i qualipresentano un particolare spettro di assorbimento in forma ossidata (identico per NAD + e NADP + ) chedifferisce dallo spettro di assorbimento delle forme ridotte (NADH e NADPH). Infatti entrambi i coenzimisono caratterizzati, nella forma ridotta, da una banda di assorbimento con massimo a 340 nm, che è assentenelle forme ossidate (v. Fig. 1). Quindi, se nella cuvetta dello spettrofotometro NAD + o NADP + partecipanoa reazioni nelle quali sono trasformati in NADH o NADPH si osserverà un incremento di densità ottica a340 nm. Viceversa, se il NADH od il NADPH sono ossidati a NAD + o NADP + , si osserverà un decrementodella densità ottica.4(densità O.D.otticaunitàarbitrarie)= NAD e NADP(forme ossidate)……………= NADH e NADPH(forme ridotte)Massimo di assorbimento di⇓NADH e NADPH⇑ ⇑ λ260 340 nm (lunghezza d’onda )Figura 1 : Spettri di assorbimento dei coenzimi piridiniciIl coefficiente di estinzione molare (ε λ M) dei coenzimi piridinici ridotti è 6220 M -1 cm -1 ad una lunghezzad’onda di 340 nm.Una soluzione 1 M dei coenzimi piridinici è illeggibile, perché l’assorbanza supera di molto il limite di 1.2OD, imposto dall’attendibilità dello strumento. Però anche una soluzione 1 millimolare di NADH (oNADPH) è ancora troppo concentrata, poichè presenta un’OD pari a 6,220; pertanto si utilizzerannosoluzioni ancora più diluite. Infatti diluendo quest’ultima ancora per 6,22 volte (ovvero se ad 1 ml disoluzione 1 mM sono aggiunti 5,2 ml di H 2 O) si otterrà un’assorbanza di 1 O.D, valore ormai leggibile allostrumento.Per conoscere la concentrazione (in µmoli/ml, quindi la millimolarità) di una soluzione a concentrazioneincognita presente nella cuvetta dello spettrofotometro è sufficiente dividere l’ OD per 6,22 (se lo spessoredi soluzione attraversato dal raggio di luce monocromatico è 1 cm. (Nei laboratori è quasi sempre utilizzatotale spessore).

5Parte pratica:Allo studente verrà fornita una soluzione di NADH ad una concentrazione incognita. Di norma si risale adessa effettuando la misura della OD allo spettrofotometro, ad opportuna diluizione (se necessaria),direttamente a lunghezza d’onda a 340 nm.Per acquisire confidenza con questo tipo di determinazione quantitativa, inizialmente lo studente ricavasperimentalmente l’intero Spettro di Assorbimento, effettuando più misure dell’OD a varie lunghezze d’ondada 240 nm a 420 nm .In particolare si determinerà l’OD diun’aliquota della soluzione a 240, 260, 280, 300, (lunghezze d’ondadell’ultravioletto) 320, 330, 340, 360, 380, 400, 420 nm (lunghezze d’onda del visibile); al termine delleletture si aggiungeranno …..µl di perossido di idrogeno (acqua ossigenata) che determinerà l’ossidazione delNADH a NAD + . Dopo alcuni minuti si dovranno effettuare nuovamente le misure alle stesse lunghezzed’onda.I dati così ottenuti dovranno essere riportati in un grafico (su carta millimetrata), in cui in ordinate saràindicata l’assorbanza, espressa in OD, e in ascissa la lunghezza d’onda, espressa in nm.Questa esperienza permetterà allo studente di verificare nella pratica che solo le forme ridotte dei coenzimipiridinici assorbono a 340 nm. E si osserverà la persistenza dell’assorbimento a 260 nm che è dovutoall’adenina, che non subisce modifiche nel corso dell’ossidazione da parte dell H 2 O 2 .Per calcolare la Concentrazione Molare di NADH presente nella cuvetta, basterà applicare la Legge diLambert-Beer; perciò visto che: A = ε λ M × M × s, per risalire all’incognita M sarà sufficiente estrapolareM da tale equazione e sostituire ad A l’OD letta allo spettrofotometro, a ε λ M il valore del coefficiente diestinzione molare del NADH a 340 nm, ed a s il valore del cammino ottico.DETERMINAZIONE DELL’ATTIVITA’ DELL’ENZIMA G6PD PRESENTEIN DIVERSI PREPARATI BIOLOGICIAttività di un enzimaVengono qui si seguito riportati alcune proprietà fondamentali dell’Enzimologia; si rimanda ai libri di testodi Biochimica per una esauriente trattazione.In una cellula sono presenti migliaia di proteine enzimatiche, che sono distinte macromolecole proteiche(enzimi) in grado (ciascuno) di catalizzare una specifica reazione chimica. Per la determinazione di unaspecifica attività enzimatica in un lisato cellulare, che teoricamente ne contiene migliaia, si colloca unapiccola aliquota del lisato stesso in una soluzione che contiene quantità soprasaturanti dei substratidell’enzima che si vuole analizzare. In tali condizioni potrà essere operativo solo l’enzima che trova i(l)propri(o) substrati(o), e taceranno gli altri enzimi, che al contrario ne sono privi.Si otterrà la così detta velocità massima V max . Occorre far riferimento alle seguente equazione:V max = k 3 [ E ]V max = velocità massima, in µmoli/minuto secondo in 1 ml di soluzione.k 3 = numero di turnover, cioè le moli di substrato elaborate da una mole di enzima in 1 secondoche coincide, ovviamente, con le µmoli di substrato elaborate da 1 µmole di enzima in secondo.[ E ] = concentrazione dell’enzima, in µmoli/ml .

E’ possibile determinare l’attività di un enzima in un preparato biologico con tecniche di vario tipo. Per talemisura è necessario che il preparato sia “nativo”, ovvero non deve aver subito processi denaturanti, in mododa mantenere il più possibile intatte le funzioni delle varie proteine in essi contenute tra cui, ovviamente, leproteine dotate di attività enzimatica.Per misurare la concentrazione di qualsiasi componente endocellulare occorre rompere la membrana (e laparte dove presente), in modo che le cellule riversino il loro contenuto nella soluzione. Tale processo vienedenominato omogenizzazione, e sarà affrontato in forme più esaurienti nel Laboratorio di FisiologiaGenerale. In questa sede verrà semplicemente preparato:1) un lisato di lievito mediante rottura meccanica della parete cellulare. Si tenga presente che le celluledi lievito presentano una ottima resistenza: infatti possiedono una parete, oltre alla classica membranacitoplasmatica. Quindi la cellula è circondata da due “barriere”: la membrana plasmatica, più interna,che contiene il citosol, ed una parete, più esterna. Tale parete è particolarmente resistente, presentandouna struttura portante a base di chitina. In pratica è sufficiente l’agitazione meccanica delle cellule conpalline di vetro per avere un buon grado di rottura delle stesse. L’avvenuta lisi cellulare è verificabiledirettamente al microscopio ottico.2) un omogenato di epatociti bovini3) un omogenato di tessuto muscolare murino6L’enzima Glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) è largamente distribuito in tutte le cellule (è il primoenzima dello Shunt dei pentosi-fosfato che, tra l’altro, garantisce alla cellula la sintesi degli zuccheri a 5atomi di carbonio, che entrano nella composizione degli acidi nucleici).Per quanto riguarda l’attività G6PD non esistono problemi di equilibrio chimico, per riprodurre la reazionein vitro (schematizzata a pag 6). Infatti è sufficiente che l’enzima si trovi in presenza dei due substrati (G6Pe NADP - questo ultimo è definito comunemente coenzima) e la reazione procede perché caratterizzata da un∆G° largamente negativo.Definizione di unità enzimaticaSi definisce unità di enzima quella quantità di enzima che (ad una temperatura prefissata,nel nostro caso, per semplicità, la temperatura ambiente) elabora 1 µmole di substrato in unminuto primo.Parte pratica:Preparazione dell’estratto nativo (lisato cellulare)In una provetta conica di plastica da 10 ml si aggiungono:Lievito fresco........................................................ 0,8 gr.H 2 O distillata........................................................ 0,8 mlSferette di vetro.................................................... q.b. a 2,5 mlSi agita la provetta con Vortex per 10 min.Per verificare il grado di lisi cellulare si può prelevare un’aliquota del lisato (p.e. 20 µl), diluita 50 volte conacqua deionizzata. Si deposita una goccia di campione su vetrino e si applica il vetrino coprioggetto:l’osservazione viene effettuata al microscopio ottico, con obiettivo ad immersione, a 1000 ingrandimenti.Può essere considerata soddisfacente una lisi dell’80 %.

7Per calcolare quante unità dell’enzima G6PD sono presenti in 1 ml del ns. lisato cellulare o negliomogenati, si immette una piccola aliquota del campione in una cuvetta da spettrofotometro, in presenza deirispettivi substrati e si registra (nel tempo) l’incremento di densità ottica a 340 nm., dovuta al NADPH che siforma nel corso della reazione. La concentrazione di tale enzima nel lisato di lievito è alquanto elevata percui occorre effettuare una diluizione di 1.000 volte.Dosaggio della G6PD:La reazione enzimatica che viene messa in condizione di avvenire (grazie al piccola aliquota di lisatointrodotta nella cuvetta) è quella che porta all’incontro di Glucosio-6-P con NADP + .Si realizza così l’ossidazione del Glucosio-6-P ad acido 6-fosfo-gluconico (è in sostanza il gruppo aldeidicoin posizione 1 del glucosio-6-P che viene ossidato a gruppo acido), ad opera del NADP + che si riduce aNADPH (producendo 1 equivalente di protoni, che genera acidità).Inizialmente (nel caso del saggio sul lievito) si diluisce il lisato 1000 volte. Per farlo consigliamo di eseguirela diluizione portando un’aliquota iniziale di……..ml di lisato ad un volume finale di 10 ml. Per poirealizzare il dosaggio, si aggiungono in cuvetta le soluzioni indicate di seguito:Si sottolinea che per una corretta riuscita dell’esperienza il lisato va aggiunto per ultimo, subito prima dieseguire la misurazione.NADP + NADPH + H +G6PDGlucosio 6-Pac.6-P-gluconicoSostanze M iniziale M finale Lievito lisato Epatociti MuscoloTRIS-HCl pH=8 1M 85 mMMgCl 2 0.5 M 7 mMGlucosio-6-P 0.1 M 1 mMNADP 10 mM 1 mMCampione 0.2 ml (Dx1000) 0.05 ml 0.05 mlH 2 0Volume finale 1 ml 1 ml 1mlSi agita la soluzione e si esegue una lettura ogni minuto. Non occorre una preventiva lettura, primadell’aggiunta del lisato cellulare, perché questa è una misura cinetica, e quindi saranno misurate dellevariazioni di OD, per una reazione che, teoricamente, si svolge a velocità costante. L’ OD aumenterà per ilNADPH che via-via si forma. Si registra la lettura dell’OD ogni minuto, e si calcola immediatamente ladifferenza. Si osserverà che la O.D. aumenta costantemente. Con un’osservazione complessiva di 10 minuti,si può eseguire una corretta determinazione dell’attività enzimatica. Se nell’arco dei 10 minuti la differenza(al minuto) si è mantenuta all’incirca costante, si può dividere il ∆O.D. complessivo per 10 (tempo inminuti complessivo dell’osservazione) e si avrà il ∆O.D. riferito al minuto primo. Dividendo tale valoreper 6,220 (l’assorbimento di 1 µmole/ml) si otterranno le unità di enzima presenti in cuvetta, ovverole µmoli prodotte, nella cuvetta, in 1 minuto. E’ conveniente esprimere tale unità in concentrazione

8dell’enzima, ovvero in unità internazionali/ml (IU/ml). Essendo 1 ml il volume della cuvetta, leIU calcolate totali coincidono con le IU/ml..Per sapere quante unità internazionali di G6PD sono presenti in 1 ml di lisato cellulare bisogna applicare ilmetodo delle diluizioni scalari. Questo metodo tiene conto delle diluizioni effettuate in ogni singolopassaggio durante l’esecuzione dell’esperimento. Questo significa, in generale, che il valore dell’assorbanzadopo essere stato diviso per il valore del coefficiente di estinzione molare, deve essere moltiplicato per ilrapporto tra il volume totale e il volume del campione per ogni passaggio.Dividendo il ∆ O.D./min (dovuto alla riduzione del coenzima piridinico NADP) per 6,220, si ottengonole µmoli/ml min, ovvero le Unità internazionali (UI) di enzima presenti in cuvetta, quindi presenti in 1ml. Occorre domandarsi quale diluizione ha subito l’aliquota del campione immesso in cuvetta:corrisponderà al Volume Finale diviso il Volume Iniziale, ovvero 1000 / 200 (se sono stati usati 200 µl).Moltiplicando le UI/ml (in cuvetta) per 1000/200 si otterranno le unità presenti nella soluzione diluita 1000xdel lisato dalla quale provengono i 200 µl. Se si moltiplica ancora per 1000 si otterrano le unità/ml nellisato iniziale. Moltiplicando ancora per 2 (perché le cellule sono state diluite 2 volte durante la preparazionedel lisato) si otterranno la UI/ml di lievito. Quindi alla fine dei calcoli (schematizzati di seguito) si otterrannole UI presenti in 1 ml di cellule pure.∆OD——— x6,2201.000———20010000x ———10x 2 = …..UI/mlmM del NADPHpresenti incuvetta=IU presenti incuvettaDiluizionesubita dai 200µl di estrattotrasferiti incuvettaDiluizioneiniziale subitadal lisatoDiluizionedellecellule dilievitoIn definitiva:IU/ml (in cuvetta) × 5× 1.000 × 2 = Unità Internazionali / ml di “cellule”

92° GiornoFERMENTAZIONE ALCOLICA IN CELLULE DI LIEVITOGeneralità e finalità dell’esperimentoQuesta esperienza permette allo studente di osservare l’andamento di un intero processo metabolico. Inparticolare, si studierà il consumo di glucosio da parte del lievito (S. cerevisiae), con la conseguenteproduzione di CO 2 ed etanolo, ad opera dei 12 enzimi in successione che rendono operativo l’interoprocesso della glicolisi anaerobica che, nel lievito, è nota come fermentazione alcolica. ( Si ricorda che laglicolisi, nella generalità delle altre cellule, porta invece alla formazione di lattato). Lo studente potràosservare la presenza della CO 2 sottoforma di effervescenza, mentre il glucosio e l’etanolo sarannodeterminati quantitativamente mediante saggi enzimatici.Durante questa esperienza sarà anche possibile verificare la stechiometria della glicolisi:CH 2 OHH C O H CH 3H12 reazioniC OH H C 2 CH 2 OH + 2 CO 2enzimaticheOH C C OH etanoloHOHα-D-glucosioOvvero per 1 mole di glucosio scomparso si formano, in teoria, 2 moli di etanolo e 2 moli di anidridecarbonica.Questo si verificherebbe, nel lievito, se fosse operativa unicamente la sopra-schematizzata fermentazionealcolica. Nella realtà esistono molti altri metabolismi, di entità di gran lunga minore. Per esempio è operativolo Shunt dei pentoso-fosfati (il cui primo enzima è la Glucosio-6-fosfato deidrogenasi-G6PD, che è statodosato durante la prima esperienza). Tale Shunt preleva un intermedio della glicolisi, e quindi contribuiscead abbassare la resa in etanolo. Anche il glicerolo-3-P (un intermedio della glicolisi) viene prelevato nellacellula per la fornitura del glicerolo durante la sintesi dei trigliceridi, infatti nel lievito per ogni mole diglucosio metabolizzato, circa 0,3 moli sono “dirottate” verso glicerolo.Esistono quindi una serie di “prelievi” di intermedi della glicolisi all’interno della cellula, che ne modificanola resa, infatti le moli di etanolo formate, per ogni mole di glucosio consumato, oscillano tra le 1,2 e le 1,4soltanto (anziché le 2 stechiometriche).L’etanolo, che manca ancora all’appello perciò, rispecchia probabilmente la avvenuta conversione diintermedi della glicolisi in: 1) prodotti di biosintesi (p. es. lipidi e/o amminoacidi); 2) prodotti didegradazione completa (CO 2 ed H 2 O) per un modesto contributo dei processi che avvengono in aerobiosi(ciclo di Krebs e fosforilazione ossidativa), oltre, naturalmente, alla formazione dei prodottiprecedentemente citati (glicerolo e metaboliti dello Shunt).Parte pratica:L’esperimento prevede di incubare il lievito con un’opportuna soluzione contenente vari metaboliti,compreso il glucosio, per osservare la formazione di etanolo e CO 2 , nell’arco di trenta minuti (con prelieviogni 10 minuti): appena aggiunto il glucosio si effettuerà subito il prelievo di un’aliquota (tempo 0) per leanalisi successive, mentre il resto della soluzione verrà incubato a 37°C. Dall’ “incubazione” si preleveranno

10quindi altre aliquote, ai tempi 10 – 20 - 30 minuti. Perciò, alla fine, si disporrà di 4 campioni (tempi 0- 10 - 20 - 30 min), nei quali sarà possibile determinare il glucosio (che progressivamente diminuisce) el’etanolo (che progressivamente aumenta) perché prodotto dalle cellule stesse.Bisogna però sottolineare che il campione incubato come tale non è idoneo alla misura della concentrazionedei metaboliti, perciò occorrerà provocarne la denaturazione, cioè eliminare le proteine in esso contenute,comprendenti tutto il patrimonio enzimatico, per arrestare tutti i processi biochimici cellulari. Per questoscopo solitamente si utilizza l’acido perclorico.Perciò, prima di iniziare con l’incubazione, si contrassegnano 4 provette Eppendorf con la scritta 0, 10, 20,30 e in ciascuna si trasferiscono 0,1 ml di acido perclorico (PCA) 5 M.Si allestisce quindi l’incubazione. Si pesano in una provetta conica di plastica 0,5 grammi di lievito fresco,al quale vengono successivamente aggiunti gli altri componenti, secondo lo schema sottostante:ATTENZIONE: è fondamentale aggiungere il glucosio per ultimo, e solo quando si è pronti ad effettuare ilprelievo denominato tempo zero, altrimenti il lievito comincerà a metabolizzare il glucosio e non siriuscirebbe a “fotografare” correttamente il tempo zero (massima concentrazione di glucosio, minimaconcentrazione di etanolo).mMml(millimolarità finale)Lievito 0,5 gr ∼ 0,5H 2 O - -----KCl 100 mM 24 -----+NH 4 CH 3 COO - 100 mM 20 -----glucosio 1 M 100 ----- ← aggiunto per ultimoNaH 2 PO 4 100mM (opzionale) 2 ------___________________________Totale 10,000Alcuni gruppi di lavoro possono incubare il lievito con aggiunta di Na fosfato 2mM finale, questo aumenteràdel doppio la resa della glicolisi.La provetta conica presenta un anello in rilievo in corrispondenza del volume max = 10 ml. E’ utileverificare nel suo complesso la correttezza dei volumi aggiunti. Infatti è sufficiente verificare che, alla fine,il volume corrisponda a 10 ml.Si chiude quindi la provetta con tappo di plastica e la si capovolge più volte per rendere la sospensioneomogenea. Si preleva quindi 1 ml della soluzione “incubazione” ormai pronta, trasferendo tale aliquotanella provetta Eppendorf, contenente l’acido perclorico, contrassegnata con Tempo = 0. Tappare e agitareimmediatamente tale provetta del tempo 0 con energia, per disperdere bene i componenti della sospensione.La provetta conica “incubazione”, con i restanti 9 ml va subito incubata in bagno termostatato a 37°C. Siprenda nota del tempo di incubazione, per effettuare i 3 prelievi ai tempi programmati (10, 20, 30 min).Terminata l’incubazione, ed effettuati i restanti tre prelievi 10, 20, 30 min, si disporrà dei quattro prelieviacidificati con acido perclorico e si procederà al loro processamento in parallelo.I campioni sono centrifugati a 5000 giri al minuto per 10 minuti. Si presti attenzione ad equilibrare il rotoredisponendo i campioni in modo tale che il baricentro coincida con l’asse di rotazione del rotore stesso.OCCORRE CONTRASSEGNARE I CAMPIONI PER EVITARE SCAMBI DI PROVETTE TRA I GRUPPI DI LAVORO!Questa operazione è indispensabile per separare le proteine, ormai denaturate, dal resto della soluzione checonterrà anche il glucosio e l’etanolo. Le proteine precipiteranno sul fondo formando il pellet, mentre il restodella soluzione formerà il sovranatante. Dopo aver recuperato i campioni occorrerà verificare la presenza delpellet; se dovesse esistere ancora torbidità occorre ricentrifugare.Si prelevano 0,8 ml di sopranatante da ogni provetta e si trasferiscono in altre 4 provette Eppendorfopportunamente contrassegnate.

11A queste aliquote si aggiunge carbonato di potassio (K 2 CO 3 ) 2 M che forma, insieme al PCA, il saleinsolubile KClO 4 , allontanando così lo ione perclorico e riportando il pH alla neutralità. Dovrebbero esseresufficienti 95 µl.ATTENZIONE: appena si aggiungerà il carbonato di potassio si formerà all’interno della eppendorf dellaCO 2 , per questo è consigliabile mantenere le provette aperte fino a che l’effervescenza non sarà finita,altrimenti la pressione esercitata dal contenitore lo farà scoppiare.Occorre, poi, verificare che il pH sia effettivamente neutro trasferendo 1-2 µl della soluzione appenaneutralizzata su cartina universale indicatrice di pH. Se il pH risultasse ancora acido si deve aggiungereancora una piccola quantità (2 µl) di K 2 CO 3 2 M fino a pH neutro (in genere occorrono al massimo circa100 µl totali di K 2 CO 3 2 M).Si centrifuga nuovamente per allontanare il sale, anche se questo sedimenterebbe da solo, grazie alla forza digravità.I campioni sono quindi pronti per l‘analisi dei metaboliti in esso contenuti.Data l’elevata concentrazione dei metaboliti presenti negli estratti (come si potrà constatare a consuntivo) èopportuno effettuare le diluizioni 20 X con acqua degli stessi. A tal fine si depositano in 4 provetteEppendorf ………. ml H 2 O, e si aggiungono ……… ml dei rispettivi estratti, sapendo che il volume finale èdi 1 ml. Ricordarsi, come al solito, di agitare i campioni. Tali campioni diluiti 20 X sono utilizzati perl’analisi di Glucosio ed Etanolo.A) Determinazione enzimatica del glucosioPer catalizzare le reazioni sotto specificate si utilizzano enzimi purificati, reperibili in commercio. Siricostruiscono in vitro (nella cuvetta dello spettrofotometro) due reazioni che portano alla formazione diNADPH:ATP ADP NADP+ NADPH + H +HKG6PDGlucosio Glucosio 6-P 6-P-gluconatoMg 2+L’ATP è aggiunto in eccesso rispetto al glucosio. Ilglucosio presente (introdotto col campione) formeràuna quantità stechiometrica di glucosio 6-P inpresenza dell’enzima purificato esocinasi (HK). Se incuvetta si aggiunge anche un eccesso di NADP el’enzima glucosio 6-P deidrogenasi purificata(G6PD) si ottiene la formazione stechiometrica diNADPH, il quale, a differenza del NADP, assorbeluce a 340 nm con un coefficiente di estinzionemolare = 6.220 M -1 x cm -1 . Le micromoli di NADPHformate corrispondono alle micromoli di glucosiopresenti nell’aliquota di estratto introdotto in cuvetta.N.B.: in realtà con questo sistema viene determinatoanche il glucosio 6-P endocellulare, che è perògeneralmente presente in quantità trascurabile.Il dosaggio è effettuato a pH = 8. Si ricordino leproprietà degli agenti tamponanti, per esempio l’acidoacetico esprime azione tamponante in un ambito di pHFig 2: Proprietà di sostanze tampone

che corrisponde al valore del rispettivo pK a ± 1, ad esempio per l’acido acetico il pK a è 4,8.Si tenga presente l’utile quadro riassuntivo riprodotto dal Catalogo SIGMA (Fig. 2 - pag. 10) dal quale sideduce che il TRIS (pK a = 8,1) è un tampone idoneo TRIZMA = TRIS).In pratica, nella cuvetta dello spettrofotometro si mescoleranno, sino al volume finale di 1 ml:mM f mlTampone TRIS-HCl 1,0 M pH 8,0 .......................................... 50 ---------Estratto diluito x 20 (che contiene il glucosio da determinare) 0.020ATP 50 mM ......................................................................... . 2.5 --------NADP 10 mM ......................................................................... 0.2 --------MgCl 2 0,5 M (indispensabile) .......................................... 5 --------H 2 O ................................................................................................ 0,847Volume finale (in cuvetta) ....... 0,997(NB: per calcolare i volumi a partire dalle due molarità considerare il volume finale uguale a 1ml)Si agitano per bene le cuvette e si misura l’estinzione contro aria.Si aggiungono poi : 2 µl di HK a 2 mg/ml (cioè 4 µg) e In realtà si aggiungono 3 µl della2 µl di G6PD a 1 mg /ml (cioè 2 µg) miscela: HK/G6PD.(con l’aggiunta degli enzimi il volume finale totale è 1,00 ml).Si agitano nuovamente le cuvette (importante), che vengono collocate nello spettrofotometro. Si osservaun rapido aumento nella densità ottica: si legge il valore finale e costante nel tempo, dal quale andrà sottrattala lettura eseguita prima dell’aggiunta degli enzimi.Occorre registrare le O.D. del tempo zero (per ciascuno dei quattro campioni) e le rispettive O.D. dopol’aggiunta degli enzimi. La differenza (∆ O.D.) è proporzionale alla quantità di glucosio presente (si puòimmediatamente constatare che le prove 10, 20, e 30 minuti contengono meno glucosio del tempo 0).Il campione “t =0” dovrebbe avere un ∆ O.D.= ---------- ; mentre la prova 10 minuti dovrebbe avere ∆ OD = ------La prova 20 minuti un ∆ OD = -------- e quella a 30 minuti un ∆OD= -------. I valori di ∆OD sonoproporzionali al glucosio presente. Tali ∆OD devono decrescere, con il decorrere dell’incubazione, aconferma del fatto che il glucosio viene progressivamente consumato.Dal ∆ OD si può risalire alla concentrazione del glucosio, applicando il metodo delle “diluizioni scalari” (v.pag.7). La concentrazione del glucosio al t = 0 dovrebbe corrispondere al glucosio “teorico”: laconcentrazione teorica iniziale del glucosio è 100 mM (glucosio aggiunto). Occorre anche tener conto delglucosio endogeno, che dovrebbe essere dell’ordine del 10 mM. In definitiva, il glucosio iniziale puòoscillare tra i 105 ed i 120 mM. Questa è un’utile verifica interna. E’ accettabile uno scarto del 10%.La concentrazione di glucosio dovrebbe scendere (nella “prova” 30 minuti) a 55 mM circa, con unconsumo, quindi, di circa 60 mM.Se le cellule di lievito sono state incubate con Na Fosfato si dovrebbe osservare un forte aumento delmetabolismo, dell’ordine del 100 %.12B) Determinazione enzimatica dell’etanoloLa concentrazione di etanolo presente nei vari estratti perclorici è determinabile mediante l’utilizzo dellareazione catalizzata dall’enzima alcool deidrogenasi (ADH). Occorre tener presente che l’equilibrio dellareazione catalizzata dall’enzima ADH è spostato verso la formazione dell’etanolo, e non viceversa. Si puòovviare al problema sottraendo l’acetaldeide mano a mano che si forma. Infatti, perché l’etanolo presente nelcampione da analizzare sia completamente rimosso e ossidato ad acetaldeide, occorre far avvenire lareazione in un tampone a base di semicarbazide (idrazin-carbossiammide), che forma il semicarbazone con

13il gruppo carbonilico dell’acetaldeide. Ovviamente la reazione in questo verso è più lenta. Da acetaldeidead etanolo invece, la reazione decorre spontaneamente.La reazione che avverrà in cuvetta è la seguente:NAD + NADH + H +ADHetanolo acetaldeide ∆G° = + 5.400 cal/moleNella cuvetta dello spettrofotometro si mescolano, sino al volume finale di 1 ml:mM f mlTRIS-HCl-1M pH=8.............................................................. 50 ---------Semicarbazide 100 mM.......................................................... 6.2 ---------NAD + 50 mM ....................................................................... 2.00 ---------Campione (estratto perclorico neutralizzato diluito 20 X) .. 0.020H 2 O ....................................................................................… ---------Tot. 0,998(NB: per calcolare i volumi a partire dalle due molarità considerare il volume finale uguale a 1ml)Si aggiungono 2 µl di ADH (5 mg/ml) , cioè 25 µg.Si colloca la cuvetta nello spettrofotometro e si osserva l’aumento di densità ottica. Si legge il valore finale,dal quale andrà sottratta la lettura eseguita prima dell’aggiunta dell’enzima.Dai ∆OD ottenuti si risale, con il metodo delle diluizioni scalari (v. pag. 7), alle concentrazioni dei rispettivicomposti presenti nell’incubazione originale delle cellule di lievito.Il campione t = 0 dovrebbe contenere circa 12 mM etanolo (endogeno), che dovrebbe salire a 55 mM nelcampione 10’, a 73 mM nel campione 20’ e a 85 mM nel campione 30’.Calcoli stechiometriciE’ possibile risalire alla concentrazione del glucosio e dell’etanolo nella sospensione del lievito. Si partedalle concentrazioni dei rispettivi metaboliti rilevate nella cuvetta dello spettrofotometro, e si risale allaconcentrazione nell’incubazione mediante il metodo delle “diluizioni scalari”, già applicato durante ildosaggio della G6PD. In pratica occorre tener conto delle diluizioni successive che hanno subito i prelievidell’incubazione.Metodo delle “diluizioni scalari”Le considerazioni che seguono si riferiscono al glucosio, ma sono riferibili, ovviamente, anche agli altrimetaboliti.Dividendo il ∆ O.D. dovuto alla ossidazione (o riduzione) del coenzima piridinicio NADPH per 6,220,si ottengono le µmoli/ml, ovvero la mM in vaschetta. Ricordiamo che il glucosio, reagendo, produce unastechiometrica quantità di NADPH.Occorre domandarsi quale diluizione ha subito l’aliquota del campione immesso in cuvetta: corrisponderà alVolume Finale diviso il Volume Iniziale, ovvero 1000 / 20 (se sono stati usati 20 µl di campione che sonostati immessi, e quindi diluiti, in cuvetta).Moltiplicando tale mM (in cuvetta) per 1000/20 si otterrà la millimolarità della soluzione dalla qualeprovengono i 20 µl di campione, ovvero l’estratto neutralizzato con K 2 CO 3 .Si procede ora a ritroso per tener conto delle diluizioni successive.Occorre moltiplicare per 20 se sono state effettuate diluizioni 20 X di tali estratti.Gli estratti neutralizzati hanno subito a loro volta una certa diluizione: 800 µl di sopranatante acido è statodiluito con 95 µl di K 2 CO 3 . Pertanto la diluizione subita corrisponde a 895 / 800, e moltiplicando per tale

14rapporto si otterrà la concentrazione del glucosio (sempre in mM) nella soluzione di provenienza,cioè nel sopranatante acido.Infine, tale sopranatante acido deriva da una diluizione con acido perclorico della sospensione iniziale(incubazione): sono stati prelevati 1000 µl, che sono stati diluiti con 100 µl di acido perclorico. Quindi 1000µl sono stati portati a 1100 µl. Moltiplicando per 1100 / 1000 si otterrà la mM del glucosio nell’incubazioneoriginale.Ricapitolando:∆OD——— x6.2201.000———20× 20 ×895——— x8001100——— =1000mMmM delNADPHinvaschettaDiluizionesubita dai20 µl diestratto 20xtrasfe- ritiin vaschettaDiluizione20x dell’estrattoneutralizzatoDiluizionesubitadall’estrattoacido peraggiunta diK 2 CO 3Diluizione subitadall’aliquota diincubazione inizialeper aggiunta diHClO 4 .millimolaritàdel glucosionell’incubazioneQuindi il ∆ O.D, moltiplicato per tutti i fattori sopra riportati, fornisce la mM di glucosio nella incubazioneoriginale (quella con il lievito vivo, dalla quale sono state prelevate le aliquote!), ovviamente riferita al untempo particolare di una dato prelievo. F indica il coefficiente che deriva dalla riunione di tutti i fattoricostanti, che risulta uguale a 197,94. Quindi:>>>>>>> ∆ O.D. x F = mM glucosio o etanolo [F = 197,84 ]

151 µmole di glucosio genera 2 µmoli di etanolo. Quindi su ∼60 mM glucosio consumato sidovrebbe ottenere (con 100 % di fermentazione alcolica) una produzione ∼120 mM di etanolo.Invece lo studente otterrà un valore ~73 mM etanolo, ovvero solo il 60 % del teorico.Quindi ~ 40% del glucosio scomparso non ha formato etanolo. Ciò è del tutto plausibile. Infatti possonoesistere altre vie metaboliche che utilizzano il glucosio. Per esempio parte del glucosio consumato (~ 15 %)produce glicerolo. Variando opportunamente le condizioni di incubazione (p.e. innalzando il pH) si puòaddirittura verificare che la formazione di glicerolo prevale sulla formazione di etanolo. Inoltre esiste unaquota modesta del glucosio utilizzato (1-5 %) che è metabolizzato via Shunt dei Pentosi.I valori sopra riportati sono solo indicativi e non fanno testo. I 12 passaggi enzimatici dellafermentazione alcolica sono influenzati da diversi fattori. Per esempio:- stato di conservazione del campione- pH,- la freschezza delle cellule di lievito, ecc.

163° GiornoCINETICA ENZIMATICA: DETERMINAZIONE DELLA COSTANTE DIMICHAELIS -MENTENIntroduzioneSul significato dei parametri cinetici di un enzima, occorre che lo studente richiami alcuni concetti-basedell’enzimologia (v. libri di teso di Biochimica).Ricordiamo brevemente che, per una reazione catalizzata da un enzima, vale la relazione:V max v = velocità della reazionev = V max = velocità massima della reazione ( aK Msubstrato soprasaturante)1 + [ S ] = concentrazione del substrato[ S ] K M = costante di Michaelis-MentenPer una reazione a cinetica ”normale”, in un grafico con v (velocità della reazione) in funzione di [S], siottiene un’iperbole.Per verificare la legge di MIchaelis-Menten si può utilizzare il metodo della linearizzazione grafica diLineweaver-Burk: in pratica si riporta su grafico 1/v in funzione di 1/[S]. Tali reciproci di v ed [ S ]scaturiscono dalla relazione sopra citata espressa in forma inversa:1 1 K M 1= + ×v V max V max [ S ]I punti ottenuti dalle misure eseguite allo spettrofotometro sono riportati sul grafico dei doppi reciproci. Segiacciono su di una retta, significa che l’enzima ha cinetica “normale”, ovvero iperbolica.Esecuzione delle misureQueste osservazioni vengono eseguite sull’enzima G6PD in quanto è un enzima assai diffuso nelle cellulesia di organismi superiori che in batteri.La misura è effettuata usando l’enzima puro, ma si potrebbe anche eseguire direttamente su un lisato dilievito1:2, diluito ancora x 1.000.Si preparano 6 cuvette nelle quali l’unica variabile è la concentrazione del substrato (glucosio-6-P). Lequantità sono riportate in µl. I volumi dell’ H 2 O sono calcolati in modo da portare il volume finale a 1 ml.mM (finali) di G6P 0,05 0,07 0,1 0,2 0,4 1µl da aggiungere in cuvettaGlucosio-6-fosfato 10 mM 5 7 10 20 40 100TRIS-HCl 1 M pH 8 85 85 85 85 85 85MgCl 2 0,5 M 14 14 14 14 14 14NADP 10 mM 100 100 100 100 100 100Lisato 1.000x 200 200 200 200 200 200H 2 O 596 594 591 581 561 501

17Le reazioni “partono “ per aggiunta di lisato (che contiene anche l’enzima G6PD che si vuoldeterminare. Occorre registrare sul protocollo le letture (in aumento a 340 nm) calcolando la differenza diminuto in minuto. Mediare opportunamente in un intervallo di almeno 4 minuti. A tempi più lunghi si puòosservare un decremento della velocità di reazione per calo del substrato o inibizione da prodotti. In teoriapotrebbe rendersi necessaria la estrapolazione dei valori della velocità al tempo iniziale.Preparare una tabella per ottenere i valori da riportare nel grafico dei doppi reciproci :mM (finali) di G6P 0,05 0,07 0,1 0,2 0,4 11/mM 20 14,28 10 5 2,5 1v (∆OD x 1000/min)* 5,33 5,670 8,02 11 12,41 13,58v (nmoli/min) 0,857 0,911 1,290 1,767 1,996 2,1831/v 1,166 1,097 0,775 0,565 0,501 0,458* E’ più pratico fare i calcoli con OD moltiplicato x 1000 [p. es. 0,1 OD vengono registraticome 100 “punti”. Dalla divisione di tali “punti “ per 6,22 si ottengono lenmoli/min (nano moli/minuto) prodotte per ml di soluzione anziché le µ moli/ prodotte al minuto perml di soluzione].Si dimensiona opportunamente un grafico con 1/ v in ordinate ed 1/ mM in ascisse. Si riportano i valori di1/v in ordinate in funzione dei valori di 1/mM di G6P in ascisse. Si traccia la retta che meglio interpola ipunti). Si ha un’intercetta sull’asse delle ordinate: questa corrisponde ad 1/V Max. E’ plausibile un valore di0,4 min/nmoli. Quindi l’inverso dovrebbe corrispondere ad una V Max = 2,5 nmoli/min (0,0025µmoli/min.ml) che, moltiplicato per 5 x 1000 x 2, fornisce un valore di 25 µmoli/min.ml di lievito, ovvero25 UI/ml di lievito. E’ utile confrontare questo valore con quello ottenuto con una sola misura, a saturazionesia di G6P che di NADP (v. pag. 13). Il valore è dello stesso ordine di grandezza. Non deve esserenecessariamente coincidente in quanto si tratta di preparazioni diverse.Per il calcolo della K M , che è l’obiettivo di questoesperimento, si misura l’intercetta sull’asse delle ascisse,che corrisponde a −1 / K M (è plausibile un valore di9,75 mM -1 ). K M risulta, quindi uguale all’inverso di 9,75.In definitiva K M = 0,102 mM.E’ noto che la K M è espressione della costante didissociazione del complesso enzima substrato. In questoesperimento è stata misurata la K M dell’enzima G6PDper il substrato G6P, in condizioni di saturazione diNADP. E’ degno di nota che questa informazioneimportante sulle proprietà di una proteina enzimatica siastata ottenuta con il preparato grezzo, contenentemigliaia di altre attività enzimatiche. Trattasi quindi diuna misura sperimentale facilmente accessible.Si può osservare che il valore di K M è relativamenteelevato, rispetto alle K M di altri enzimi.Se si considera che la concentrazione endocellulare del suosubstrato, il G6P, è intorno a 2÷5, si comprende che l’enzima è poco operativo nelle condizioniendocellulari.In conclusione il livello modesto dello Shunt dei pentosi fofato è in linea sia con l’accertata bassa attivitàendocelluare dell’enzima G6PD, che con la sua modesta affinità per il substrato.

184° GiornoANALISI DEL CAMPIONE CONTENENTE ATP;ADP;AMPOgni studente riceverà un campione a concentrazione incognita di ATP, ADP ed AMP e dovrà accertare lapresenza di tali nucleotidi, mediante analisi qualitativa con TLC. Il campione può contenere da uno a tre ditali nucleotidi. Potrà poi essere condotta un’analisi su base quantitativa utilizzando dosaggi enzimatici.L’analisi dell’ATP utilizza lo stesso sistema utilizzato per il dosaggio del glucosio, solo che in questo caso ilglucosio è in eccesso.ADP ed AMP sono determinati contemporaneamente in una singola cuvetta. Si utilizzano gli enzimiPiruvato Cinasi (PK) e Lattico deidrogenasi (LDH), per la determinazione dell’ADP. Si passa poi alladeterminazione dell’AMP per aggiunta di miocinasi (MK). Nella cuvetta avvengono le seguenti reazioni:ADP ATP NADH NAD +PKLDHFosfoenol piruvato Piruvato LattatoSi opera in eccesso di fosfoenol piruvato (PEP), con una quota adeguata di NADH, che fornisca 0,8 ÷ 1,0O.D. a 340 nm. Si legge l’O.D. iniziale; si aggiungono quindi i due enzimi PK ed LDH ; il NADH chescompare corrisponde stechiometricamente all’ADP presente.In 2 min si registra il ∆ O.D.; quindi si aggiunge nella medesima cuvetta poco ATP e l’enzima miocinasi(MK). Se è presente AMP si registrerà un ulteriore decremento dell’assorbimento a 340 nm. Infatti l’AMPreagisce con l’ATP secondo la reazione:AMP + ATPMK2 ADPL’ADP così formato verrà nuovamente registrato dallo spettrofotometro, perchè sono ancora operative lereazioni prima riportate, essendo ancora presenti i reattivi e gli enzimi che consentono di determinarel’ADP. Quindi avremo un ulteriore decremento, se nel campione incognito è presente anche l’AMP.Si tenga presente per i calcoli la stechiometria: l’ADP formato per azione della miocinasi risulterà doppiorispetto all’AMP presente; quindi il valore registrato dallo strumento andrà opportunamente diviso per sueper risalire alla effettiva concentrazione di AMP.Analisi qualitativa dei nucleotidi purinici mediante cromatografia su strato sottile (TLC)Si utilizzano lastre di polietilene (materiale inerte) portanti un sottile strato (0,1 mm) di Poli Etilen Imminocellulosa (PEI) impregnato di indicatore di fluorescenza. Si traccia con una matita a 2 cm dal bordo unalinea “di partenza”. In essa si depositano da 2 a 6 µl di soluzione, contenenti almeno 2 nanomoli, meglio 10,del nucleotide standard o della soluzione da analizzareLo studente riceve una soluzione standard che contiene i tre nucleotidi ATP, ADP, AMP, che è 5 mM inciascuno dei tre. Depositandone 2 µl, si depositano in pratica 10 nmoli di ciascun nucleotide. Vengonodepositati anche 2 µl di campione da analizzare. Dopo aver asciugato le macchie (con l’ausilio di unacorrente di aria tiepida) nella vasca da TLC viene collocata la lastrina che alla base risulterà immersa nelsolvente con la seguente composizione:NaCl 1M a pH 7.2Il solvente sale per capillarità e la cromatografia procede sino a 4-5 cm dal bordo superiore. Si asporta aquesto punto la lastra dalla vasca cromatografica e la si asciuga. Quindi la lastra viene irradiata con unalampada UV che rivela la presenza dei nucleotidi fluorescenti. Con una matita si tracciano i contorni dellemacchie. Per semplificare la procedura di standarizzazione viene applicata una sola macchia contenente tuttie tre i nucleotidi che si desidera analizzare:

l’ATP si sposta di meno (R f = 0,2); l’ADP “corre” di più (R f = 0,43) e l’AMP “corre” ancor di più (R f= 0,6) (v. Fig. 4) Ovvero, più il nucleotide è fosforilato, minore è il suo spostamento perché il supporto dinatura basica tratterrà maggiormente i composti più acidi, cioè maggiormente fosforilati.Per maggior chiarezza è qui riportato uno schema di deposizione dei campioni sulla lastra di PEI perTLC.Fig. 4 - Cromatografia su strato sottile dei nucleotidi adenilici19Fronte di avanzamentodel solventeAMPADPdirezione di migrazionedel solventeCampione 1 = ATP, AMPCampione 2 = ADP, AMPCampione 3 = ATP, ADPATP⇑ ⇑ 1 ⇑ 2 ⇑ 3Standard Campioni incognitideposizione dei campioniEsecuzione dell’analisiLo studente riceverà 0,2 ml di soluzione in una provetta tipo Eppendorf, contenente da 0,5 a 5 µmoli Totalidi ogni singolo nucleotide (ATP, ADP, AMP). Possono essere presenti tutti e tre, in quantità diverse, oppureanche soltanto uno o due dei tre. Si procederà all’analisi qualitativa, depositando 2 µl del campioneincognito su lastrina da TLC (PEI cellulosa), accanto alla miscela standard. Per irradiazione con raggi UV sipotranno rilevare le macchie dei composti presenti.Si passa quindi all’analisi quantitativa. A tal fine occorre diluire il campione iniziale da 0,2 ml portando ilvolume ad 1 ml con H 2 O (dopo il modesto prelievo per l’analisi qualitativa). In pratica si aggiungono0,800 ml di acqua con la pipetta pneumatica da 1 ml e si agita. A questo punto ogni nucleotide ècontenuto, se presente, in una concentrazione compresa tra 0,5 e 5 µmoli per ml (cioè 0,5 ÷ 5,0 mM).Analisi dell’ATPSi predispone la cuvetta come precedentemente specificato per l’analisi del glucosio e si aggiungono 20 µldella soluzione diluita a concentrazione incognita di ATP (al posto di 0,020 ml di estratto perclorico diluito20x). Si immette anche il glucosio in eccesso. In definitiva le condizioni di dosaggio sono le seguenti:mlTampone TRIS-HCl 1,0 M pH 8,0 ................................................. 0,050Campione (che contiene l’ATP da determinare) ......………………. 0,020Glucosio 0,1 M ................................................................................. 0,050NADP 10 mM ............................................................................... 0,020MgCl 2 0,5 M (indispensabile) ..................................................... 0,010H 2 O ................................................................................................ 0,847Volume finale (in cuvetta) ....... 0,997

20Lo studente può verificare teoricamente che il ∆ O.D. potrà variare da 0,062 (per 0,5 µmoli consegnate) a0,622 (per 5 µmoli consegnate). Il ∆ O.D. registrato, diviso per 6,220, fornirà le µmoli presenti in cuvetta.Moltiplicando per 50 (valore che considera la diluizione subita dal campione in cuvetta) si otterranno leµmoli totali, che lo studente ha ricevuto con la Eppendorf.Questo è il valore da riportare nella relazione, per il singolo nucleotide ATP, indicando ovviamente zero seeventualmente è assente (si tenga presente che è possibile riscontrare tracce anche in caso di assenza, inquanto i componenti che ha ricevuto lo studente non sono puri al 100 % ). La eventuale assenza dinucleotidi riceverà conferma dall’analisi qualitativa TLC.Analisi dell’ADPIn una cuvetta da spettrofotometro si aggiungono iseguenti volumi :TRIS 1,0 M - pH 8,0 ................... 0,050 mlCampione .................................... 0,030 mlNADH 5 mM .............................. 0,030 mlPEP 0,1 M .................................... 0,010 mlMgCl 2 0,5 M ............................... 0,010 mlH 2 O .............................................. 0,866 mlTot.0,996 mlSi agita e si registra l’O.D. iniziale a 340 nm;quindi si aggiungono 2 µl di Piruvato cinasi e 2 µldi LDH. Dopo circa 2 minuti si legge allospettrofotometro l’O.D. finale. Il ∆ O.D. (indecremento) corrisponde all’ADP presente nelcampione. La quantità precisa verrà ricavata con uncalcolo identico a quello utilizzato per ricavarel’ATP.Analisi dell’AMPNella stessa cuvetta, dopo aver eseguito la determinazione dell’ADP, si aggiungono 4 µl di ATP 50 mM(0,2 µmoli totali), si agita e si attende circa 2 minuti per dar modo alle eventuali impurezze di ADPcontenute nell’ATP aggiunto di reagire con la PK etc. Si legge nuovamente l’O.D. iniziale e si aggiungono2 µl di Miocinasi. Dopo 2 minuti si può leggere il valore di O.D. Il ∆ O.D. (in decremento) corrisponde aldoppio dell’AMP presente.Se l’OD scende al di sotto di ∼ 0,18 occorre fare attenzione : il NADH aggiunto risulta insufficiente e difatto è stato quasi tutto ossidato a NAD. In tal caso occorre ripetere le misure per ADP ed AMP, utilizzandosolo 10 µl del campione (ricordandosi poi di moltiplicare per 100 anziché per 50). L’AMP potrebbe infattirichiedere un O.D. maggiore di quello disponibile, anche perchè ossida - con la catena di reazionirealizzata in cuvetta - una quantità doppia di NADH rispetto a quello ossidato dall’ADP. Infatti, con 5µmoli (quantità massima) di AMP il ∆ O.D. teorico con 20 µl di campione sarebbe 1,244. In presenzaeventuale di altre 5 µmoli di ADP (la quantità massima), il ∆ O.D. teorico con 20 µl sarebbe 1,244 + 0,622(max per ADP)= 1,866; ben superiore ai teorici (O.D. = 0,933, disponibili con 0,030 ml di NADH 5 mM).∆ O.D. dovuto all’ADP ed il ∆ O.D. dovuto all’AMP (quest’ultimo dev’essere opportunamenteIldiviso per due ) debbono essere divisi per 6,22 e moltiplicati per 50 per avere la concentrazione espressa inmillimolarità (mM) del campione, che corrisponde alle µmoli / ml, ovvero alle umoli totali ricevute dallostudente. Si moltiplicherà invece per 100 se in cuvetta sono stati trasferiti 10 µl di campione.

21N.B. Ciascuno gruppo di lavoro è tenuto a redigerela relazione con l’analisi dei dati ottenuti, da consegnareuna settimana dopo la conclusione del laboratorio.Nella relazione non devono essere descritte la procedureeseguite, ma riportate soltanto le letture eseguite allostrumento, con le osservazioni essenziali circa i processiosservati. Occorre altresì allegare i grafici ottenuti conle misure cinetiche, con le relative elaborazioninumeriche.Ogni studente consegnerà, alla fine del turno, la schedache gli verrà consegnata dal docente (che può ancheritagliare dalla presente pagina), dove indicherà ilnumero del campione incognito ricevuto, ed i risultatiottenuti (espressi in µmoli totali) mediante l’analisicromatografica ed enzimatica del campione aconcentrazioni incognite di nucleotidi adenilici.Nella relazione non dovranno comparire i dati relativialla prova incognita.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------LABORATORIO DI BIOLOGIA SPERIMENTALE IIsettore : Chimica BiologicaRISULTATI DELL ‘ ANALISI DEI NUCLEOTIDI ADENILICI :Nome e Cognome : .................................................................................n° del campione : ........ ........................ATP ADP AMP

µ moli ...................... ............................ .............................22Data ................................. Firma .........................................................