D.Daffonchio - Gruppo di Ricerca Italiano Fitofarmaci e Ambiente

•Tipologie di GMP resistenti ad erbicidi ed autoprotette•Le GMP influenzano lastruttura e la funzionalità dellecomunità microbichenell’ambiente?•I transgeni possono esseretrasferiti dalle GMP aimicrorganismi nei sistemiambientali complessi?QUALI SONO I RISCHI DIIMPATTO AMBIENTALE?• Case studies: mais, colza, erbamedica, patata• Considerazioni ambientali• Metodi di studio HGT• Case studies: barbabietola nptII,tabacco transplastomico aadA• Considerazioni ambientaliCONSIDERAZIONI FINALI

GMP RESISTENTI AD ERBICIDIED AUTOPROTETTE

COSTRUZIONE E TIPI DI GMPDNA donatore: Costrutto transgenico in E. coli-Transgene; -Promotore eucariota; -Terminatore eucariota; -Enhancers, ecc.;-Marcatori di selezione; -Sistemi di autoexcisione markersTessuto vegetalericeventeTrasformazione mediante:•Agrobacterium tumefaciens•Particle gunTrasformazione mediante:•Particle gun•Iniezioni con femtosiringheGMP “nucleari”GMP “transplastomiche”

SOIA RESISTENTE ALGLYPHOSATEConsiderata lapossibilità di HGTdi geni diresistenza adantibiotici, latendenza è dieliminarli daicostrutti. Adesempio nel casodella soiaresistente alglyphosateprodotta dallaMonsanto il genenptII per laresistenza allakanamicina non èpresente nelcostrutto finale.nptIIPlasmidePV-GMGT04Transgene nella linea40-3-2 di soiaDNA soia

MAIS Bt AUTOPROTETTO CONTRO Ostrinia nubilalisIl mais Bt è autoprotetto daOstrinia nubilalis grazie alclonaggio nel suo genomadel gene cry1Ab del batterioBacillus thuringiensisB. thuringiensis subsp. thuringiensis berliner 1715SporaCristallo insetticidaMembranaRecettoreB. thuringiensis forma uncristallo parasporale proteicola tossina Cry tossica permolte specie di insetti.L’attività insetticida èprincipalmente dovuta alcristallo parasporale proteicoche si accumula fino al 25%del peso secco della cellula.

MAIS Bt AUTOPROTETTOCONTRO Ostrinia nubilalisRilevamentomediante PCR deitransgeni del maisBt 176 autoprotettoda Ostrinianubilalis

MAIS Bt AUTOPROTETTO CONTRO Ostrinia nubilalisRagione bassa espressione:instabilità mRNA a causa di:•molti poliA e segnali di tagliomRNA.•segnali prematuri diterminazione di trascrizione.•Strutture secondarie•sequenze di splicing•i geni cry ricchi in A/T•differenze di ‘codon usage’Modifica della sequenza permutagenesi o sintesi chimica haaumentato di circa 100 volte ilivelli di espressione (250-2000ng/mg proteine).+ bla (amp)Ulteriori miglioramenti attraversoclonaggio dei geni cry nei plastidisenza significative modifichedella sequenza (espressione fino a50000 ng/mg di proteina).

PATATA T4La patata T4 rilascia nella rizosfera il lisozima del fago T4 e quindi migliora ilcontrollo di batteri fitopatogeni come Erwinia carotovoraCassetta NptII (Kan R )Promotore35S CaMVPeptide segnale α-amilasi di orzo:secrezione apoplastoLisozima T4TerminatoreNos 3’E’ stato messo a punto un metodoper misurare il tasso di morte deibatteri esposti alle radici della patataT4Il saggio si basa sulla colorazionedifferenziale tra cellule vive e morte

PATATA T4Il numero di cellule batteriche morte sullasuperficie radicale della patata T4 è moltomaggiore di quello sulla Patata wild typeTale differenza si manifesta in tutte le fasidella crescita della piantaINDUZIONE DI RESISTENZE?

INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSINGMolti microrganismi attivano alcune vie metaboliche inclusi alcuni meccanismi dipatogenesi solo quando sono in concentrazione elevata nel sistema e superano uncerto numero di cellule per unità di volume o superficieQuesto meccanismo denominato “Quorum sensing” è mediato nei batteri gram- daalcune molecole segnale sintetizzate in piccole concentrazioni da ciascuna celluladella popolazione: gli acyl-homoserin lattoni (AHL)N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactoneAHLAd es. in Erwinia carotovora pv.carotovora l’espressione dellepectinasi che iniziano il processodi patogenesi è mediato dagliAHL

INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSINGAlcuni microrganismicome molti Bacillusthuringiensis sono ingrado di produrreenzimi le AHLlattonasicheinattivano gli AHLpermettendo ladistruzione dei segnalichimici che medianola patogenesiTest conChromobacteriumviolaceum

INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSINGBiosaggio per misurare l’attività didegradazione degli AHL in E.coliricombinante clonato con un’AHL-lattonasiCeppi di Erwinia carotovora clonaticon un’AHL-lattonasi perdono lavirulenza rispetto ai ceppi wild type

INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSINGSono state costruite GMP(tabacco e patata) clonatecon AHL-lattonasi per essereautoprotette nei confronti dipatogeni batterici.L’espressione di aiiAveniva rilevata in tutti icostrutti soprattutto inquelli con il peptidesegnale

INATTIVAZIONE DEI SEGNALI DI QUORUM SENSINGLe GMP (tabacco e patata) clonate con AHL-lattonasi sono molto resistenti adErwinia carotovora anche quando inoculata a livelli massicci.Tabacco aiiAWild TypeWild TypePatate aiiALa strategia di inibizione dei meccanismi di “Quorum sensing” dovrebbestimolare in maniera minore lo sviluppo di resistenti in quanto il patogeno non èeliminato ma solo inibito in una sua attività

•Le GMP influenzano lastruttura e la funzionalità dellecomunità microbichenell’ambiente?•I transgeni possono esseretrasferiti dalle GMP aimicrorganismi nei sistemiambientali complessi?QUALI SONO I RISCHI DIIMPATTO AMBIENTALE?• Case studies: mais, colza, erbamedica, patata• Metodi di studio HGT• Case studies: barbabietola nptII,tabacco transplastomico aadA

GMP E BIODIVERSITA’MICRORGANISMI

MAIS BTTransgeni nel mais Bt:•Cry1Ab: attività insetticida•Bar: resistenza gluphosinate• bla TEM1: resistenza ampicillinaCry1Ab è espressa nei tessuti verdi fino a 4.000 ng/mg di proteineKoziel et al., 1993 Bio/Technology, 11:194-200?Cry1Ab è rilasciata negli essudati radicali e può persistere nel suoloSaxena et al., 1999 Nature, 402:480; Saxena and Stotzky 2000, FEMS Microbiol. Ecol. 33:35-39Il mais Bt ha un maggiore contenuto di lignina rispetto all’isogenico non BtSaxena and Stotzky 2001, Am. J. Bot. 88:1704-1706I residui di mais Bt sono meno degradabili in suoloStotzky 2003 ESF-AIGM 30

MAIS BT E DIVERSITA’ MICROBICAPHYTOSPHEREINSECT GUTENSILED MAIZE SILAGE CORNFERMENTED FLOURRHIZOSPHERECOW RUMENLa diversa composizione dei tessuti e degli essudati può influenzare lastruttura della comunità microbica?

RIZOSFERA

RIZOSFERA MAIS BT•Cariche batteriche•Profili catabolici comunità•Tipizzazione molecolare batteri isolatiSuoloParNO DIFFERENZE SIGNIFICATIVEBtPC3 = 5.6%•Analisi struttura della comunitàmicrobica totale medianteARISAPC1 = 42.6%PC2 = 9.4%DIFFERENZE SIGNIFICATIVELa comunità batterica rizosferica del mais Bt è diversa da quella della controparte non transgenicaLe differenze sembrano essere in parte imputabili al pattern di essudazione

MAIS INSILATO

INSILATO MAIS BT•Cariche batteriche•Tipizzazione molecolare LAB isolatiNO DIFFERENZE SIGNIFICATIVE•ARISA ed LH-PCR evidenziano comunità batteriche differenti tra insilatipreparati con mais Bt e il parentale•ARISA fingerprintingBtParB7•LH-PCR fingerprintingI0I2 I7 I13I20I30B30B2 B7B13B20B20BtB0I2I30IsoPC3 = 9.0 %I13I20I7I0PC2 (34.7 %)PC3(5.3 %)B0PC1 (47.6 %)B13PC1 = 36.7 %B30B2PC2 = 14.8 %

MAIS INSILATO: LH-PCR DELLA COMUNITA’ BATTERICA250 275 300 325 350 375 400 42520001000020001000020001000020000 d2 d7 d13 dLH-PCR della comunitàbatterica totale esovrapposizione con iLABisolatiPar maisBt maisEnterobacter sp.Bacillus megateriumBacillus coagulansLactobacillus brevisW. confusa or P. acidilacticiW. confusa or P. pentosaceusW. confusa or L. fermentumEnterococcus faecium1000020001000020001000020 d30 dL’LH-PCR mostrala successione deiLABSeguiti daEnterobacter eBacillus

RUMINE BOVINO

RISA DELLE POPOLAZIONI BATTERICHE RUMINALIAt0 At1 At2 At2 Bt0 Bt1 Bt2 Ct0 Ct1 Bt2 Ct0 Ct2 Dt0 Dt0 Dt1 Dt2•Quattro bovine di razza frisona in asciutta alimetate con maisinsilato Bt e Parentale non transgenico•Contenuto ruminale analizzato mediante RISA

DIFFERENZE TRA LE DIETE DIETE E TRA GLI ANIMALIDIETECampionidall’animale che hasubito dislocazionedell’abomasoANIMALIABCNo differenze trale dieteDBtIsoDifferenze tra glianimali•L’analisi statistica dei profili RISA della microflora adesaall’alimento digerito differenzia la microflora batterica nei diversianimali ma non differenzia le diete

POPOLAZIONE BATTERICA IN OGNI ANIMALEMaisBtIsoL’analisi cluster dei profili RISA della microflora adesa all’alimento digerito inciascun animale differenzia le popolazioni selezionate dalle due diete

In tutti gli ambienti analizzati il mais transgenico Btseleziona popolazioni batteriche diverse rispetto allacontroparte non transgenicaRisultati simili sono stati osservati con altre GMP comecolza resistemte al glufosinate e erba medica che produceuna lignino perossidasi Mn-dipendente funginaDi Giovanni et al., 2000 Microb.Ecol. 37:129-139Profili DGGE rRNA 16S rizosfera COLZAProfili catabolici isolati rizosfera ERBA MEDICA

Rimane comunque da stabilire se queste differenze sono determinatedall’”effetto transgene” piuttosto che dall’”effetto cultivar”I fattori ambientali (cultivar, suolo,stagione, ecc.) influenzano lacomposizione della comunità battericarizosferica della patata più del lisozima delfago T4 prodotto dalle variantitransgenicheHeuer et al., 2002 AEM 68:1325-1335

HGT GMP-MICRORGANISMI

INTERAZIONI GMP E MICRORGANISMIRILEVANZA HGT•Antibiotico resistenza• Resistenza erbicidi•Modello di studio speciazione ebarriere evolutivePRESUNTI HGT INTERDOMINIO•Es. Glutamina sintetasi II diBradirhizobium japonicum sembraderivare da un eucariota(Carlson e Chelm 1986. Nature 322:568-570)COME SI STUDIA?Il processo più probabile di HGT tra GMPe batteri è la trasformazione naturaleHGT tra GMP e batteri dimostrato per igeni nptII (Kan R ) e aadA (Spe R )

MARKER RESCUE TRANSFORMATION(Gebhard and Smalla, 1998; De Vries and Wackernagel, 1998; Nielsen et al., 2000)GMPTrasformazione naturale ericombinazione omologaLa ricombinazione omologa tra ungene selezionabile presente nellaGMP e una sequenza riceventeinattiva presente nel microrganismopermette di rilevare l’evento di HGTe stabilirne le frequenzeBATTERINATURALMENTECOMPETENTI•Acinetobacter naturalmente competente• npt II gene• ∆npt II

HGT da GMP“nucleari”HGT da GMP“transplastomiche”HGT da GMP“transplastomiche”in residuosfera

+COSTRUTTOBARBABIETOLAOltre ai frammentiattesi possono esseretrasferiti altresequenze di DNA(Gebhard and Smalla, 1998)=TRASFORMANTICOSTRUTTO RICEVENTE(Acinetobacter sp. BD413)

CEPPI REPORTER DI Acinetobacter sp. BD413/ADP1Progetto EUTRANSBAC QLK3-CT-2001-02242Gene Flow from Transgenic Plants: Evaluation and Biotechnology Φ# $%&# $%& Φ!!"" #"!!"" ' '((( )*+)#"

LOCALIZZAZIONE HGT IN SITU# $%&TRASFORMANTI?ANALISI IN SITUMARKER RESCUETRANSFORMATIONNlinkeraminoacidicoDOMINIOANTIBIOTICORESISTENZAAadANlinkeraminoacidicoDOMINIOANTIBIOTICORESISTENZAAadALOCALIZZAZIONEDOMINIOFLUORESCENTEGfpDOMINIOFLUORESCENTEGfpCCGage 2002 J.Bacteriol. 184:7042-7046

HGT GMP-MICRORGANISMIL’HGT GMP-MICRORGANISMIPUO’ AVVENIREMA QUALI SONO I RISCHI REALI?PROBLEMAD’INDAGINESPERIMENTALEFITNESSESELEZIONE

BIBLIOGRAFIADong et al., 2001. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase. Nature 411:813-817Dong et al., 2000. AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora. PNAS 97:3526-3531.Lee et al., 2002. Genes Encoding the N-Acyl Homoserine Lactone-Degrading Enzyme Are Widespread in Many Subspecies of Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. 68:3919-3024.Ahrenholtz et al., 2000. Increased Killing of Bacillus subtilis on the Hair Roots of Transgenic T4 Lysozyme-Producing Potatoes. Appl. Environ. Microbiol. 66:1862-1865.Daffonchio D, Cherif A and Borin S 2000 Homoduplex and heteroduplex polymorphisms of the amplified ribosomal 16S-23S internal transcribed spacers describe genetic relationships in the “Bacillus cereus group”.Appl. Environ. 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RINGRAZIAMENTI• A. Rizzi, C. Bertolini, L. Brusetti, S.Borin, A. Bona, P. Francia, A.Pagliuca, M. Pajoro, M. Di Donato,D. Mora, D. Cittaro, V. Garavaglia,C. Sorlini• A. Abruzzese, G. Sacchi• A.Tamburini, G. Succi• C. Viti, L. Giovannetti• M. Bazzicalupo, E. Biondi• K. M. Nielsen• P. Simonet, A. Pontiroli• C. TebbeDISTAM, Università di MilanoDIPROVE, Università di MilanoIST. ZOOTECNIA, Università di MilanoDIBA, Università di FirenzeDBAG, Università di FirenzeDEPT. OF FARMACY, Università di TromsoUMR CNRS 5557, Università di Lione 1FAL, Braunschweig•EU TRANSBAC QLK3-CT-2001-02242 Gene Flow from Transgenic Plants: Evaluation and Biotechnology•MIUR COFIN 2000 Study of soil microbial community: effects of transgenic plants on soil microflora•MINISTERO DELL’AMBIENTE-CNR Biodiversità e organismi geneticamente modificati